JP2005522180A - チロシン、桂皮酸およびパラ−ヒドロキシ桂皮酸の産生方法 - Google Patents
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Abstract
Description
i)チロシンアンモニアリアーゼ活性をコード化する少なくとも1つの遺伝子と、
ii)フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも1つの遺伝子と、
を含む組換え生物体を提供する工程、および
b)発酵可能な炭素基質の存在下で前記組換え生物体を増殖させ、それによってパラ−ヒドロキシ桂皮酸が産生される工程、
を含んで成る、パラ−ヒドロキシ桂皮酸の産生方法を提供する。
a)フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも1つの遺伝子を含む組み換え生物体を提供する工程と、
b)発酵可能な炭素基質の存在下で前記組換え生物体を増殖させ、それによってチロシンが産生される工程と、
を含んで成る、チロシンの産生方法を提供する。
i)チロシンアンモニアリアーゼ活性をコード化する少なくとも1つの遺伝子と、
ii)フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも1つの遺伝子と、
を含んで成る、組換え宿主を提供する。
本発明は、本出願の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列の説明からさらに完全に理解することができる。
1.小さな脂肪族の非極性または僅かに極性の残基:Ala、Ser、Thr(Pro、Gly);
2.極性の負に荷電した残基およびそれらのアミド:Asp、Asn、Glu、Gln;
3.極性の正に荷電した残基:His、Arg、Lys;
4.大きな脂肪族の非極性残基:Met、Leu、Ile、Val(Cys);および
5.大きな芳香族残基:Phe、Tyr、Trp
本発明において使用される重要な酵素は、当該分野において公知の多くの遺伝子によってコードされる。主要酵素はフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)およびチロシンアンモニアリアーゼ(TAL)である。
本発明は、フェニルアラニンのチロシンへの変換に有用なPAH活性を有する組換え生物体を提供する。この酵素は当該分野において公知であり、プロテオバクテリア(Proteobacteria)において報告されている(ジャオ(Zhao)ら著、「Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(全米科学アカデミー会報)」第91巻、p.1366(1994年))。例えば、緑膿菌は、哺乳動物のフェニルアラニンヒドロキシラーゼに相同なフェニルアラニンヒドロキシラーゼ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、およびチロシンヒドロキシラーゼを含む多遺伝子オペロンを有する(ジャオ(Zhao)ら著、「Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(全米科学アカデミー会報)」第91巻、p.1366(1994年))。
本発明の産生生物体には、PHCAまたはチロシンの産生に必要な遺伝子を発現することが可能な任意の生物体が含まれる。典型的に、産生生物体は微生物に限定される。
クロモバクテリウム・ビオラセウム(Chromobacterium violaceum)(配列番号1)のPAH遺伝子をクローニングし、緑膿菌およびDH5α大腸菌の両方において発現させた。クロモバクテリウム・ビオラセウム(配列番号1)のPAH遺伝子を含有する緑膿菌株によるチロシン、桂皮酸、およびPHCAの産生を実証した。緑膿菌は、桂皮酸をパラ−ヒドロキシ桂皮酸に変換するのに必要なp−450/p−450レダクターゼ酵素系を欠くことが実証されたため、これらの実験系において産生されるすべてのパラ−ヒドロキシ桂皮酸はフェニルアラニンからチロシン、次いでパラ−ヒドロキシ桂皮酸への炭素流の再指令から生じた。桂皮酸の産生は、PAL/TAL酵素によって保持されるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性の副産物である可能性がある。
実施例で使用した標準的な組換えDNAおよび分子クローニング技術は当該分野において周知であり、サンブルックJ.(Sambrook,J.)、フリッシュE.F.(Fritsch,E.F.)およびマニアティスT.(Maniatis,T.)著、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子クローニング:実験室マニュアル)」(コールド・スプリング・ハーバー実験室出版(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor)(1989年)(マニアティス))、ならびにT.J.シルハビー(T.J.Silhavy)、M.L.ベンナン(M.L.Bennan)、およびL.W.エンクイスト(L.W.Enquist)著、「Experiments with Gene Fusions(遺伝子融合の実験)」(コールド・スプリング・ハーバー実験室(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー(Cold Spring Harbor,NY)(1984年))、ならびにアウスベルF.M.(Ausubel,F.M.)ら著、「Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学最新プロトコル)」(グリーン・パブリッシング・アソシエーション・エンド・ワイリー・インターサイエンス(Greene Publishing Assoc.and Wiley−Interscience)より出版)(1987年))により記載されている。
全体を通して、緑膿菌ATCC15691をコントロールとして使用した。ATCC15691株は、生来のPAHオペロンを含有するが、PALまたはTALのいずれの酵素機能をも欠き、桂皮酸をパラ−ヒドロキシ桂皮酸に変換するのに必要なp−450/p−450レダクターゼ酵素系を欠く。また、緑膿菌ATCC15691をR.グルチニス由来の生来のPAL/TALで形質転換し、フェニルアラニンを桂皮酸に変換する能力を与えた。さらに、緑膿菌ATCC15691を、チロシンに対して増強された基質特異性を有する変異PAL/TAL酵素[配列番号23](R.グルチニスの野生型配列(配列番号4)に基づく)で形質転換した。さらに、C.ビオラセウム由来のPAHをコード化する遺伝子(配列番号1)およびR.グルチニス(R.glutinis)由来の野生型PALをコード化する遺伝子(配列番号3)を含有する緑膿菌ATCC15691形質転換体を作製した。同様の様式で、緑膿菌ATCC15691を、増強されたTAL活性を有するR.グルチニス由来の変異PAL/TALをコード化する遺伝子[配列番号23]およびC.ビオラセウム由来のPAHをコード化する遺伝子(配列番号1)で形質転換した。緑膿菌ATCC15691に加えて、大腸菌のフェニルアラニン過剰産生菌を、変異および野生型PAL/TAL遺伝子、ならびにC.ビオラセウム由来のPAH遺伝子で形質転換した。
コントロール=緑膿菌(ATCC15691)
TAL=R.グルチニス由来の改変されたPAL/TAL(配列番号23)を含有する緑膿菌(ATCC15691)
PAH/TAL=R.グルチニス由来の改変されたPAL/TAL(配列番号23)およびC.ビオラセウム由来のPAH(配列番号11)を含有する緑膿菌(ATCC15691)
緑膿菌のグリセロールストックのサンプルを、抗生物質を含まない寒天プレート上に拡げ、37℃で1晩インキュベートすると、コロニーは直径が少なくとも1.0mmであり稠密であった。細胞(約1.0〜3.0mg)をプレートから回収し、滅菌接種ループを使用してチューブに移した。必要なサンプルを得るには、通常、1枚のプレートから大きく3回スワイプすれば十分であった。次いで、回収した細胞を再懸濁し、滅菌水で1回洗浄し、水(500μl)中に再懸濁した。プラスミドDNA(約50ng、下記のプラスミド)を、細胞を含有するチューブに添加した。次いで、DNA/細胞懸濁液を、予め冷却したエレクトロポレーションキュベット(0.1cm、バイオ−ラド(Bio−Rad)、カリフォルニア州ハーキュリーズ(Hercules,CA))に移し、キュベットを氷上に保持した。各サンプルに、ジーンパルサー(Gene Pulser)(バイオ−ラド)(25μF、200om)中、18kV/cmで電気パルスを印加した。パルス印加直後、SOC培地(1.0ml)を各キュベットに添加した。次いで、細胞混合物をチューブに移し、振盪器に置いた(37℃、220rpmで1.0時間)。次いで、各形質転換反応のサンプル(100μl)を個別のLBプレート上にピペッティングし、37℃で1晩インキュベートした。
アベル(Abell)ら著、「酵母ロドトルラ・グルチニス由来のフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(Phenylalanine Ammonia−lyase from Yeast Rhodotorula glutinis)」(Methods Enzymol.(メソッズ・エンザイモール)社、第142巻、p.242−248(1987年))に従い、分光光度計を使用して、精製された酵素のPALまたはTAL活性を測定した。PALの決定に関する分光光度アッセイは、1.0mMのL−フェニルアラニンおよび50mMTris−HCl(pH8.5)を含有する溶液に酵素を添加することによって開始した。次いで、9000cm−1のモル吸光係数を使用して、産物である桂皮酸の吸収をモニターすることによって、反応を追跡した。アッセイは、0.0075〜0.018/分の範囲の吸収の変化を生じる酵素の量を使用して、5分間行った。1単位の活性は、1分間当たりの1.0μmolフェニルアラニンの桂皮酸への脱アミノ化を示した。同様に、反応溶液中のチロシンを使用して、TAL活性を測定した。産生するパラ−ヒドロキシ桂皮酸の吸収を315nmで追跡し、PHCAに対する10,000cm−1の吸光係数を使用して活性を決定した。1単位の活性は、1分間当たりの1.0μmolチロシンのパラ−ヒドロキシ桂皮酸への脱アミノ化を示した。
8〜25%ネイティブファストゲルズ(PhastGels)を、レーンあたり4.0μgのタンパク質で行った。ファルマシア高分子量(Pharmacia High Molecular Weight)(HMW)マーカーおよびシグマ(Sigma)製1級PALを標準として使用した。
全細胞により形成される桂皮酸およびPHCAのレベルを測定するために、HPLCアッセイを開発した。典型的なアッセイでは、選択した培地中で増殖した培養物の遠心分離後、20〜1000μLの上清をリン酸で酸性化し、0.2または0.45ミクロンフィルターでろ過し、HPLCで分析し、増殖培地中のPHCAおよび桂皮酸の濃度を決定した。あるいは、遠心分離後、細胞を、1.0mMチロシンまたは1.0mMフェニルアラニンを含有する100mMTris−HCl(pH8.5)中に再懸濁し、室温で1.0〜16時間インキュベートした。次いで、この懸濁液のろ過したアリコート(20〜1000mL)を分析した。
オートサンプラーおよびダイオードアレイUV/可視検出器を具備したヒューレット・パッカード(Hewlett Packard)1090M HPLCシステムを、MAC−MODアナリティカル(Analytical)社製逆相ゾルバックス(Zorbax)SB−C8カラム(4.6 mm×250 mm)と共に使用した。40℃のカラム温度で、1分間あたり1.0mLの流速を行った。UV検出器を設定して、250、230、270、290および310nmの波長で溶出物をモニターした。
これらの分析に使用した緩衝液は、開始緩衝液としての50mMリン酸カリウム、pH7.0、続いて、モノ(Mono)Qカラムに対する溶出液としての400mMリン酸カリウム緩衝液pH7.2であった。
微生物におけるクロモバクテリウム・ビオラセウムフェニルアラニンヒドロキシラーゼのクローニングおよび発現
クロモバクテリウム・ビオラセウムDNAの増幅およびクローニングに対するフェニルアラニンヒドロキシラーゼ:
これらの研究では、クロモバクテリウム・ビオラセウムのPAH遺伝子(配列番号1)を緑膿菌(ATCC15691)およびDH5α大腸菌の両方にクローニングした。先に記載のC.ビオラセウムフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子のコーディング領域に隣接するデオキシヌクレオチド配列(A.オオニシ(A.Onishi)、L.J.リオッタ(L.J.Liotta)、S.J.ベンコビック(S.J.Benkovic)著、「大腸菌におけるクロモバクテリウム・ビオラセウムフェニルアラニンヒドロキシラーゼのクローニングおよび発現ならびに哺乳動物芳香族アミノ酸ヒドロキシラーゼとのアミノ酸配列の比較(Cloning and Expression of Chromobacterium violaceum phenylalanine hydroxylase in Escherichia coli and comparison of amino acid sequence with mammalian aromatic amino acid hydroylase)」J.Biol.Chem.(生物化学雑誌)第266巻、p.18454−18459(1991年))に基づいて、2つのオリゴヌクレオチドプライマー5’−TCCAGGAGCCCAGGATCCAACGATCGCGCCGA−3’[配列番号5](CVPH168と称する)および5’−GGACAAGCTTAATGATGCAGCGACACAT−3’[配列番号6](CVPH1170と称する)を合成した。各プライマーの5’末端に制限エンドヌクレアーゼ部位(BamHIまたはHindIII、上記のプライマーの下線を付した配列)を設計し、クローニングを容易にした。キアゲン・キット(Qiagen Kit)でC.ビオラセウムゲノムDNAを単離および精製し、DNAの複製を行った。増幅反応混合液(100μl)は、1.0mgのゲノムDNAテンプレート、100pmolの2種の各プライマー、10mM Tris−HCl(pH8.8)中2.5単位のTaqDNAポリメラーゼ(キアゲン(Qiagen))、0.2mMの4種の各dNTP、50mM KCl、1.5mM MgCl2、および0.01%ウシ血清アルブミンを含有した。30回のPCRサイクル(94℃、0.5分間;55℃、0.5分間および72℃、2.0分間)を実施した。正確に増幅されたDNAフラグメント(フラグメントのサイズに基づく)をTAベクター(インビトロゲン(Invitrogen)、カリフォルニア州カールスバット(Carlsbad,California))にクローニングし、配列分析に供した。このようにして、遺伝子を含有するいくらかのクローンを得た。
クローニングされたフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子を発現するために、ジーンクリーン(GeneClean)IIキット(バイオ101社(Bio101)、カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad,California))を使用して増幅された目的のDNAフラグメントを精製し、エンドヌクレアーゼBamHIおよびHindIII(プロメガ(Promega)、ウィスコンシン州マディソン(Madison,Wisconsin))で消化し、pET24a(ノボゲン(Novogen)、ウィスコンシン州マディソン(Madison,WI))、pQE30(キアゲン(Qiagen))およびpTrc99A(ファルマシア(Pharmacia)、ニュージャージー州ピスカタウェイ(Piscataway,NJ))などのプラスミドベクターのBamHIおよびHindIII部位にクローニングした。調製したベクターに対し、次の名称:pETDW(C.ビオラセウム由来のPAH遺伝子(配列番号1)を含有するPET24aベクター)、PQSW−PAH1170(同じ遺伝子を含有するpQE30ベクター)およびpTrc−PAH(PAH遺伝子を含有するpTrc99a)を使用した。エレクトロポレーションにより発現ベクターを形質転換したシュードモナスおよび大腸菌株を、イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)の非存在または存在下で、vpESW−PAH1170については25mg/mlのカナマイシンもしくはpQSE−PAH1170およびpTrc−PAHの両方については100mg/mlのアンピシリンのいずれかを含有するLB培地中、37℃で増殖させた。組換え体のフェニルアラニンヒドロキシラーゼの発現を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。均質化までのフェニルアラニンヒドロキシラーゼの精製は、1μg/mlのロイペプチンおよびペプスタチンAを含有する50mM酢酸緩衝液、pH6.0中の細胞懸濁液を18,000psiでフレンチプレッシャー(French Pressure)セルに通過させる(×2)ことによって達成した。次いで、プロテアーゼ阻害剤であるPMSFを抽出物に添加し、最終濃度を0.5mMとした。38,000×gで20分間の遠心分離により、細胞破砕物および封入体を除去した。次いで、上清を、細胞を含まない抽出物として使用した。
分光光度計でチロシンの産生をモニターすることにより、フェニルアラニン依存性DMPH4脱水素活性を測定した。L−フェニルアラニン(1.0mM、10mlの100mM溶液);ジチオトレイトール(DTT、6.0mM、6.0mlの1.0M溶液);Fe(NH4)2(SO4)2(10mM、10mlの100mM溶液)、6,7−ジメチルテトラヒドロプテリン(DMPH4)(120mM、10mlの12mM溶液)およびHEPES緩衝液(960mlの100mM、pH7.4)を含有する1.0mlの溶液に酵素溶液(1.0〜10ml)を添加することによって、アッセイを実施した。フェニルアラニンを上記の混合物に添加することによって反応を開始し、生成物であるチロシンの形成による275nmでの上昇をモニターすることによって、追跡した。約0.01/分で吸収の変化が生じる様な酵素量を使用して、アッセイを数分間行った。1700cm−1のモル吸光係数を使用して、活性を決定した。1単位の酵素活性は1分間あたり1.0μmolのチロシンを生じる。BCAタンパク質アッセイ(バイオ−ラッド・ラボラトリーズ(Bio−Rad Laboratories)、カリフォルニア州ハーキュリーズ(Hercules,California))によって、溶液中の酵素濃度を日常的に決定した。
HPLC方法により、インビボでのチロシン産生のアッセイを行った。フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子を含有する微生物を、補因子DMPH4および/またはFeSO4の存在あるいは非存在下で、対応する抗生物質を有するLB培地に接種した。細胞を37℃で1晩、振盪器に置いた。次いで、培養物を、2%グルコースを含有するM9倍値で洗浄(×3)し、同培地に再懸濁した。サンプル(1.0ml)を特定の時間間隔で採取し、調製し、HPLCで分析した。
クロモバクテリウム・ビオラセウムのフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子を含有する緑膿菌株によるチロシン、桂皮酸およびPHCAの産生
本実施例では、緑膿菌におけるC.ビオラセウム由来のフェニルアラニンヒドロキシラーゼの発現について説明する。
M9+グルコースにおける増殖後の組換え緑膿菌株によるチロシン、桂皮酸およびPHCAの産生
組換え体緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)株によるチロシン、桂皮酸およびPHCAの産生:
本研究で使用した組換え株は、実施例に1に記載のものである。実験手順は、本実施例において、限定M9培地で細胞を増殖させ、次いで、唯一の炭素減としてグルコースを添加し、24時間ではなく6時間後に分析のためにサンプルを採取することを除いて、実施例1の手順と同様であった。増殖培地をLB(実施例2)から限定M9+グルコース(実施例3)に変更することにより、産生される細胞塊が有意に減少し、従って、産生されるチロシン、桂皮酸およびPHCAの濃度について得られる値は、実施例1で得られる値よりも有意に低い。
フェニルアラニンの添加を伴うまたは伴わない緑膿菌TAL形質転換体によるチロシンおよびPHCA産生
緑膿菌は、フェニルアラニンのチロシンへの変換のためのPAHオペロンを含有する。チロシンへの炭素流を増加すること、従って産生されるPHCAの量を増加することに対する緑膿菌(P.aeruginosa)PAHオペロンの効果について研究するために、改変されたPAL/TAL遺伝子(配列番号23)によりこの株の形質転換体を調製した。形質転換体をLB培地中で増殖させ、次いで、2つのグループに分けた。一方のグループには、フェニルアラニン(0.1mM)を添加し、他方のグループには何らさらなるフェニルアラニンを添加しなかった。サンプルを6時間後に採取したが、これは表5に見ることができる。培地において検出されたチロシンのレベルは、コントロールの誘導されなかった細胞での約23Mからさらなるフェニルアラニンを伴うことなくIPTGで誘導された形質転換体による約66M、さらなるフェニルアラニンを添加された誘導された形質転換体による約350Mにまで増加した。コントロール細胞は、PHCAを何ら産生しなかったが、フェニルアラニンの添加を伴わないおよび伴う培養物では、それぞれ約10および13.0MのPHCAが検出された。
フェニルアラニンの添加を伴うまたは伴わない緑膿菌PAH形質転換体によるチロシンおよびPHCA産生
C.ビオラセウムPAH(配列番号1)で形質転換された緑膿菌を使用して、実験を実施し、それらがチロシンを産生する能力について調べた(表6)。細胞をLB培地中で増殖させ、次いで、2つのグループに分けた。一方のグループには、フェニルアラニン(0.1mM)を添加し、他方のグループには何らさらなるフェニルアラニンを添加しなかった。サンプルを6時間後に採取したが、これは表6に見ることができる。培地において検出されたチロシンのレベルは、コントロールの誘導されなかった細胞での約69.0Mからさらなるフェニルアラニンを伴うことなくIPTGで誘導された形質転換体による約174M、さらなるフェニルアラニンを添加された誘導された形質転換体による約424Mにまで増加した。PAL/TAL遺伝子が存在しないため、本研究では、研究過程でPHCAを産生した細胞は認められなかった(表6)。
フェニルアラニンの添加を伴うまたは伴わない緑膿菌PAH/TAL形質転換体によるチロシンおよびPHCA産生
形成されるチロシンおよびPHCAのレベルに対する内因性緑膿菌PAHオペロン、および改変されたPAL/TAL(配列番号23)に加えて、C.ビオラセウムPAHを組み入れることの組み合わされた効果について研究するために、以下の実験を実施した。緑膿菌をC.ビオラセウムPAH遺伝子(配列番号1)および改変されたPAL/TAL遺伝子(配列番号23)の両方で形質転換した。さらなるフェニルアラニンの存在および非存在下でLB培地において細胞を増殖させた。表7は得られた結果をまとめている。PHCAおよびチロシンの両方のレベルとも、さらなるフェニルアラニンを添加された誘導された細胞において増加した。チロシンとPHCAのレベルを比較すると、TAL経路を介するフェニルアラニンのPHCAへの完全な変換における律速段階は、PAL/TAL酵素であることは明らかであった。
フェニルアラニンの添加を伴うまたは伴わない緑膿菌PAH形質転換体によるチロシンおよびPHCA産生
Mg+2を補充したM9およびグルコース培地中で増殖する実施例5の形質転換体の挙動について調べるため、C.ビオラセウムPAHを含有する緑膿菌細胞を上記の培地中で増殖させ、チロシンおよびPHCAのレベルを測定した。表8に得られた結果をまとめている。コントロール(誘導なし)細胞は何らチロシンまたはPHCAを産生しなかった。さらなるフェニルアラニンの存在下で、誘導された細胞は約335Mのチロシンを産生したが、PHCAを産生しなかった。0.1mMのフェニルアラニンを添加すると、612Mのチロシンが産生された。しかし、PHCAは検出されなかった。
フェニルアラニンの添加を伴うまたは伴わない緑膿菌TAL形質転換体による桂皮酸およびPHCA産生
改変されたPAL/TAL遺伝子(配列番号23)を含有する実施例5において使用した緑膿菌細胞をM9+グルコース+Mg+2中で増殖させ、形成される桂皮酸およびPHCAのレベルを測定した。試験したすべての細胞において、桂皮酸のレベルは、PHCAについて観察されたレベルよりも高く、改変された酵素においてTAL活性よりも高いPALが存在することが証明された(表9)。
C.ビオラセウムPAH(配列番号1)および改変されたPAL/TAL遺伝子(配列番号23)の両方を含有する実施例6において使用された緑膿菌細胞を本実験で使用した。それらをM9+グルコースおよびMg+2中で増殖させ、24時間後の桂皮酸およびPHCAのレベルを測定した。すべての場合において、PHCAと比較した場合よりも高いレベルの桂皮酸が産生された(表10)。
フェニルアラニン過剰産生大腸菌における緑膿菌フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)オペロンのクローニングおよび発現
緑膿菌のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH):DNA増幅およびクローニング:
緑膿菌からフェニルアラニン過剰産生大腸菌株(ATCC31884)および大腸菌チロシン栄養要求性突然変異体株(AT2741)へのPAHオペロンの組み入れに使用するために、表11に列挙したプライマーを設計した。大腸菌宿主におけるPAHオペロンおよびその相補体を増幅するために、緑膿菌オペロンの以下のプライマーを設計し、使用した。
クローニングされたフェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子のオペロンを発現するために、ジーンクリーン(GeneClean)IIキット(バイオ101社、カリフォルニア州カールスバッド(Carlsbad,California))を使用して増幅された目的のDNAフラグメントを精製し、エンドヌクレアーゼ(プロメガ(Promega)、ウィスコンシン州マディソン(Madison,Wisconsin))で消化し、表12に見られるように、pD100(ATCC87222)、pKSM715(ATCC87161)およびpTrc99A(ファルマシア(Pharmacia)、ニュージャージー州ピスカタウェイ(Piscataway,NJ))などのプラスミドベクターの制限ヌクレアーゼ部位にクローニングした。
C.ビオラセウムPAHおよび緑膿菌PAHオペロンの様々な成分による形質転換後の大腸菌AT271Tyr−栄養要求性突然変異体株の増殖
M9培地+グルコースを含有する寒天プレートを調製した。チロシン栄養要求性突然変異体AT271株は、チロシン非存在下では、このプレート上で増殖することができない(コントロール−1を参照のこと)。1.0mMのチロシンを含有するフィルターディスクをプレートに添加する場合、ディスクの周囲に増殖が観察され、生物体のチロシン存在への依存性を示す(コントロール−2を参照のこと)。本研究で使用したAT271組換え株には、PhhA、PhhB、PhhC、PhhBC、PhhABC、PAHおよびPAH/PhhB/PhhCを含有する株が含まれる。3種の組換え体に対し、それぞれのプレートの中央にトリプシンディスクを配置した。PhhA、PhhB、PhhC、およびPhhBCを含有する株については、チロシンディスクの周辺にのみ増殖が認められ、これらの株がトリプシンを合成することができず、増殖のためにこの化合物の外部からの供給になお依存することを示す。しかし、PhhABC、PAHおよびPAH/PhhB/PhhCを含有する組換え体については、プレート全体に増殖が認められ、増殖のために要求されるチロシンを合成する生物体の能力および外部のチロシンを含有するディスクの必要がないことが証明された。
PAH遺伝子を含有するフェニルアラニン過剰産生大腸菌の形質転換体による増殖およびチロシン産生に対する鉄の影響
PAHの活性に対する鉄の影響、従ってチロシンの産生を調べるために、C.ビオラセウムのPAH遺伝子(PAH)[配列番号1]およびシュードモナスPAHオペロンのPhhA成分を含有する大腸菌株を、FeSO4またはFe(NH4)2(SO4)2(最終濃度1.0M)の添加を伴うおよび伴わないグルコースを有するM9培地中で増殖させた。2.0、6.0、16.0、および22時間目にサンプルを採取した。結果を表13に示す。得られた結果に基づいて、2つの鉄供給源のいずれの添加も、産生されるチロシンのレベルに有意なポジティブな影響を何ら有さないと結論された。
様々なフェニルアラニン過剰産生大腸菌株によって産生されるフェニルアラニンのレベルの決定
フェニルアラニン、またはチロシンによるDAHPシンターゼの阻害が除去され、フェニルアラニンによる酵素コリスミ酸ムターゼP−プレフェン酸デヒドラターゼの阻害が除去され、そして酵素DAHPシンターゼ、コリスミ酸ムターゼP−プレフェン酸デヒドラターゼおよびシキミ酸キナーゼのレベルの増強が達成されるフェニルアラニン過剰産生大腸菌株(ATCC31882、31883、31884)(トライブD.E.(Tribe,D.E.)「新規微生物および方法(Novel microorganism and method)」、米国特許第4681852号明細書、1987年)を、グルコースを含有するM9培地中に増殖させた場合のフェニルアラニン産生能について試験した。表14に見られるように、株ATCC31884は最も高いレベルのフェニルアラニン(870.54M)を産生した。
フェニルアラニン過剰産生大腸菌株(ATCC31884)による桂皮酸およびパラ−ヒドロキシ桂皮酸の産生
桂皮酸およびPHCAを産生させるためにロドトルラ・グルチニス(Rhodotorula glutinis)由来の生来のPAL/TAL酵素で形質転換されたATCC31884株の能力を試験するために、実験を実施した。大腸菌株(DH5α)をコントロールおよびまたPAL/TAL酵素組み入れ後の試験株として使用した。第3の株は、生来のPAL/TAL酵素を有するフェニルアラニン過剰産生菌の大腸菌ATCC31884であった。すべての株をM9+グルコース培地中で増殖させ、サンプルを採取(18時間後)し、前記のようにHPLC分析用に調製した。結果を表15に示す。生来のPAL/TALを含有するDH5α株によって産生されるPHCAおよび桂皮酸のレベル間に有意さが認めらなかったことに留意したことは興味深かった。しかし、PHCA(175M)に比べて、桂皮酸は、非常に高いレベル(約750M)でフェニルアラニン過剰産生ATCC31884株+PAL/TALによって産生された。これらの結果は、ロドトルラ・グラミニス(Rhodotorula graminis)の生来のPAL/TAL酵素におけるTAL活性と比較して、高いレベルのPAL活性が認められることのさらにもう1つの証拠を提供する。
Claims (12)
- a)
i)チロシンアンモニアリアーゼ活性をコード化する少なくとも1つの遺伝子と、
ii)フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも1つの遺伝子と、
を含む組換え生物体を提供する工程、および
b)発酵可能な炭素基質の存在下で前記組換え生物体を増殖させ、それによってパラ−ヒドロキシ桂皮酸が産生される工程、
を含んで成る、パラ−ヒドロキシ桂皮酸の産生方法。 - a)フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも1つの遺伝子を含む組み換え生物体を提供する工程と、
b)発酵可能な炭素基質の存在下で前記組換え生物体を増殖させ、それによってチロシンが産生される工程と、
を含んで成る、チロシンの産生方法。 - 前記発酵可能な炭素基質が、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルメート、および炭素含有アミン類から成る群より選択される、請求項1または2のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発酵可能な炭素基質がグルコースである、請求項1または2のいずれか1項に記載の方法。
- チロシンアンモニアリアーゼ活性をコード化する前記遺伝子が、配列番号4、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21および配列番号22から成る群より選択されるポリペプチドをコード化する、請求項1に記載の方法。
- フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する前記遺伝子がプロテオバクテリア(Proteobacteria)から単離される、請求項1または2のいずれか1項に記載の方法。
- 前記遺伝子が配列番号2に記載のフェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素をコード化する、請求項1または2のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換え生物体が、細菌、酵母、糸状菌類および藻類から成る群より選択される、請求項1または2のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換え生物体が、エシェリキア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、バチルス(Bacillus)、アシネトバクター(Acinetobacter)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、メチロバクター(Methylobacter)、ロドコッカス(Rhodococcus)、シュードモナス(Pseudomonas);シアノバクテリア(Cyanobacteria)、ロドバクター(Rhodobactor)、シネコシスチス(Synechocystis)、サッカロマイセス(Saccharomyces)、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)、カンジダ(Candida)、ハンセヌラ(Hansenula)、デバリオマイセス(Debaryomyces)、ケカビ(Mucor)、ピヒア(Pichia)、トルロプシス(Torulopsis)、アスペルギルス(Aspergillus)およびアースロボトリス(Arthrobotrys)から成る群より選択される、請求項8に記載の方法。
- i)チロシンアンモニアリアーゼ活性をコード化する少なくとも1つの遺伝子と、
ii)フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する少なくとも1つの遺伝子と、
を含んで成る、組換え宿主。 - 遺伝子が、配列番号4、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21および配列番号22から成る群より選択されるチロシンアンモニアリアーゼ酵素をコード化する、請求項10に記載の組換え宿主。
- フェニルアラニンヒドロキシラーゼ活性をコード化する遺伝子がプロトバクテリアから単離される、請求項10に記載の組換え宿主。
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