BRPI0200488B1

BRPI0200488B1 - método papa produzir ácido l-glutâmico pela fermentação

Info

Publication number: BRPI0200488B1
Application number: BRPI0200488A
Authority: BR
Inventors: Hiroshi Ueda; Masakazu Sato; Takayuki Koda
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-19
Publication date: 2015-09-08
Also published as: EP1233069A2; ES2246356T3; ATE305049T1; BR0200488A; DE60206204D1; EP1233069A3; AU783270B2; JP2002238593A; RU2282662C2; US7319025B2; EP1233069B1; PE20020886A1; CN1408878A; USRE41800E1; MY131468A; KR20020068293A; CN1295343C; JP4599726B2; AU1566002A; DE60206204T2

Abstract

"método para produzir acido l-glutâmico pela fermentação". um método para produzir ácido l-glutâmico pela fermentação, que compreende cultivar um microorganismo tendo capacidade produtora de ácido l-glutâmico em um meio liquido do qual o ph é ajustado a uma condição sob a qual o ácido l-glutâmico produzido pelos microorganismos é deixado ser precipitado, para permitir que o ácido l-glutâmico seja produzido e acumulado com a precipitação de ácido l-glutâmico associada, em que uma operação que causa a existência de cristais de ácido l-glutâmico no meio é realizada quando uma concentração do ácido l-glutâmico no meio é mais baixa do que a concentração na qual a cristalização espontânea ocorre.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR ÁCIDO L-GLUTÂMICO PELA FERMENTAÇÃO”.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a um método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação. O ácido L-glutâmico é amplamente usado como uma matéria prima de temperos e assim por diante. O ácido L-glutâmico é produzido principalmente pela fermentação utilizando as chamadas bactérias corineformes produtoras de ácido L-glutâmico pertencentes aos gêneros Brevibacterium, Corynebacterium ou Microbacterium ou cepas mutantes destes (Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, pp. 195 a 215, 1986). Como métodos para produzir o ácido L-glutâmico pela fermentação usando-se outras cepas bacterianas, existe um método conhecido que usa um microorganismo pertencente ao gênero Bacillus, Streptomyces, Penicillium ou coisa parecida (Patente U.S. N2 3.220.929), um método usando um microorganismo pertencente ao gênero Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida, ou coisa parecida (Patente U.S. N2 3.563.857), um método que usa um microorganismo pertencente ao gênero Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (correntemente chamado de Enterobacter aerogenes) ou coisa parecida (Pedido de Patente Japonesa (Kokoku) N2 32-9393), um método que usa uma cepa mutante da Escherichia coli (Pedido de Patente Japonês aberto ao público (Kokai) N2 5-244970) e assim por diante. Além disso, os inventores da presente invenção propuseram um método para produzir ácido L-glutâmico pelo uso de um microorganismo pertencente ao gênero Klebsiella, Erwinia ou Pantoea (Pedido de Patente Japonês aberto ao público N2 2000-106869).

Além disso, foram divulgadas várias técnicas para melhorar a capacidade produtora de ácido L-glutâmico realçando-se as atividades das enzimas biossintéticas do ácido L-glutâmico através do uso de técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, foi reportado que a introdução de um gene que codifica a citrato sintase derivado da Escherichia coli ou da Corynebacterium glutamicum foi eficaz para o realce da capacidade produtora de ácido L-glutâmico nas bactérias Corynebacterium ou Brevibacterium (Pedido de Patente Japonês (Kokoku) Ns 7-121228). Além disso, o Pedido de Patente Japonês aberto ao público Ns 61-268185 divulga uma célula que abriga DNA recombinante contendo um gene da glutamato desidrogenase derivado das bactérias Corynebacterium. Além disso, o Pedido de Patente Japonês aberto ao público Ne 63-214189 divulgam a técnica para aumentar a capacidade produtora de ácido L-glutâmico pela amplificação de um gene da glutamato desidrogenase, um gene da isocitrato desidrogenase, um gene da aconitato hidratase e um gene da citrato sintase.

Embora a produtividade do ácido L-glutâmico tenha sido consideravelmente aumentada pelo cruzamento anteriormente mencionado de microorganismos ou melhora dos métodos de produção, o desenvolvimento de métodos para produzir mais eficientemente o ácido L-glutâmico a um custo mais baixo é requerido para atingir aumento adicional da demanda no futuro. É conhecido um método em que a fermentação é realizada conforme o L-aminoácido acumulado na cultura é cristalizado (Pedido de Patente Japonês aberto ao público Ns 62-288). Neste método, a concentração de L-aminoácido na cultura é mantida abaixo de um certo nível pela precipitação do L-aminoácido acumulado na cultura. Especificamente, o L-triptofano, a L-tirosina ou a L-leucina são precipitados durante a fermentação ajustando-se a temperatura e o pH da cultura ou adicionando-se um tensoativo ao meio.

Embora um método de realizar a fermentação com precipitação de L-aminoácido associada seja conhecido como descrito acima, os aminoácidos adequados para este método são aqueles que apresentam uma solubilidade em água relativamente baixa e nenhum exemplo de aplicação do método a aminoácidos altamente solúveis em água, tais como o ácido L-glutâmico é conhecido. Além disso, o meio deve ter pH baixo para precipitar o ácido L-glutâmico. Entretanto, as bactérias produtoras de ácido L-glutâmico tais como aquelas mencionadas acima não podem desenvolver-se sob uma condição ácida e portanto a fermentação do ácido L-glutâmico é realizada sob condições neutras (Patentes U.S. N- 3.220.929 e 3.023.474; K. C. Chao & J. W. Foster, J. Bacteriol., 77, pp. 715 a 725 (1959)). Assim, a produção de ácido L-glutâmico pela fermentação associada com precipitação não é conhecida. Além disso, é conhecido que o cultivo da maioria das bactérias acidófilas é inibido pelos ácidos orgânicos tais como o ácido acético, o ácido lático e o ácido succínico (Yasuro Oshima Ed., “Extreme Environment Microorganism Handbook”, p. 231, Science Foram; R. M. Borichewski, J. Bacteriol., 93, pp. 597 a 599 (1967) etc.). Portanto, é considerado que muitos microorganismos sejam suscetíveis ao ácido L-glutâmico, que é também um ácido orgânico, sob condições ácidas e não existe nenhum relato de que a pesquisa de microorganismos que apresentem capacidade produtora de ácido L-glutâmico sob condições ácidas tenha sido tentada.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Sob as circunstâncias descritas acima, um objetivo da presente invenção é fornecer um método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação, com a precipitação do ácido L-glutâmico associada. Os inventores da presente invenção verificaram que, em um método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação, que compreende cultivar um microorganismo tendo a capacidade produtora de ácido L-glutâmico, para permitir que o ácido L-glutâmico seja produzido e acumulado em um meio com a precipitação de ácido L-glutâmico associada, uma produção de ácido L-glutâmico quando a existência de cristais é artificialmente causada antes que a cristalização espontânea ocorra é melhor do que aquela quando a cristalização espontânea do ácido L-glutâmico produzido pelo microorganismo é deixada ocorrer. Desta maneira, realizaram a presente invenção. A presente invenção fornece os seguintes. (1) um método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação, que compreende cultivar um microorganismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico em um meio líquido, do qual o pH é ajustado a uma condição sob a qual o ácido L-glutâmico produzido pelo microorganismo é deixado ser precipitado, para permitir que o ácido L-glutâmico seja produzido e acumulado com a precipitação do ácido L-glutâmico associada, em que uma operação que causa a existência de cristais de ácido L-glutâmico no meio é realizada quando uma concentração de ácido L-glutâmico no meio é mais baixa do que a concentração na qual a cristalização espontânea ocorre. (2) O método de acordo com (1), em que a operação que causa a existência de cristais de ácido L-glutâmico no meio é a adição de cristais de ácido L-glutâmico. (3) O método de acordo com (2), em que os cristais são a- cristais. (4) O método de acordo com (3), em que uma quantidade dos cristais adicionados ao meio é 0,2 g/litro ou mais. (5) O método de acordo com qualquer um de (1) a (4), em que o microorganismo pertence ao gênero Enterobacíer. (6) O método de acordo com (5), em que o microorganismo é Enterobacíer agglomerans. (7) O método de acordo com qualquer um de (1) a (6), em que o microorganismo pode metabolizar uma fonte de carbono em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturação e a fonte de carbono, em um pH específico e tem uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade que exceda a concentração de saturação do ácido L-glutâmico no meio líquido no pH. (8) O método de acordo com (7), em que o pH específico é 5,0 ou menos.

De acordo com os métodos da presente invenção, o ácido L-glutâmico pode ser eficientemente produzido. Da mesma maneira, em uma forma de realização preferida, os α-cristais que são preferíveis como um produto, podem ser produzidos.

BREVE EXPLANAÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um mapa da enzima de restrição de um fragmento de DNA derivado da Enterobacter agglomerans em pTWVEKlOl. A Figura 2 mostra a comparação de uma seqüência de aminoácido deduzida de uma seqüência de nucleotídeo de um gene sucA derivado da Enterobacter agglomerans (SEQ ID NO: 1) e aquela derivada da Escherichia coli (superior: Enterobacter agglomerans, coluna: Escherichia coli (SEQ ID NO: 5), o mesmo deve-se aplicar às seguintes). A Figura 3 mostra a comparação de uma seqüência de aminoácido deduzida de uma seqüência de nucleotídeo de um gene sucB derivado da Enterobacter agglomerans (SEQ ID NO: 2) e aquela derivada da Escherichia coli (SEQ ID NO: 6). A Figura 4 mostra a comparação de uma seqüência de aminoácido deduzida de uma seqüência de nucleotídeo de um gene sucC derivado da Enterobacter agglomerans (SEQ ID NO: 3) e aquela derivada da Escherichia coli (SEQ ID NO: 7). A Figura 5 mostra a comparação de uma seqüência de aminoácido deduzida de uma seqüência de nucleotídeo de um gene sdhB derivado da Enterobacter agglomerans (SEQ ID NO: 4) e aquela derivada da Escherichia coli (SEQ ID NO: 8). A Figura 6 mostra a construção de um plasmídeo pMWCPG contendo um gene gltA, um gene ppc e um gene gdhA. A Figura 7 mostra a construção de um plasmídeo RSF-Tet contendo uma origem de replicação de um plasmídeo RSF1010 de faixa de hospedeiro ampla e um gene de resistência à tetraciclina. A Figura 8 mostra a construção de um plasmídeo RSFCPG contendo uma origem de replicação de um plasmídeo RSF1010 de faixa de hospedeiro ampla, um gene de resistência à tetraciclina, um gene gltA, um gene ppc e um gene gdhA. A Figura 9 mostra a construção de um plasmídeo pSTVCB contendo um gene gltA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A seguir, a presente invenção será explicada em detalhes. O método de produção de acordo com a presente invenção é um método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação, que compreende cultivar um microorganismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico em um meio líquido do qual o pH é ajustado a uma condição sob a qual o ácido L-glutâmico produzido pelo microorganismo é deixado ser precipitado para permitir que o ácido L-glutâmico seja produzido e acumulado com a precipitação do ácido L-glutâmico associada, em que uma operação que causa a existência de cristais do ácido L-glutâmico no meio é realizada quando uma concentração de ácido L-glutâmico no meio é mais baixa do que a concentração na qual a cristalização espontânea ocorre.

Os termos “cristalização espontânea” aqui usados significa que devido ao acúmulo de ácido L-glutâmico pelo microorganismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico, uma concentração de ácido L-glutâmico no meio excede uma concentração de saturação e o ácido L-glutâmico espontaneamente precipita no meio. A operação que causa a existência de cristais de ácido L- glutâmico no meio significa uma operação pela qual a existência dos cristais é artificialmente causada. Os exemplos da operação incluem a adição dos cristais ao meio e a precipitação forçada pela diminuição, durante a cultura, do pH de um meio no qual uma certa quantidade de ácido L-glutâmico foi dissolvido no início da cultura. A quantidade de cristais que devam existir no meio é usualmente de 0,01 a 10 g/litro. A ocasião na qual os cristais devam existir é preferivelmente quando a quantidade acumulada de ácido L-glutâmico no meio aumenta em tomo da concentração de saturação (por exemplo, 25 g/litro ou mais no pH 4,5). A quantidade de cristais existentes no meio e a concentração de ácido L-glutâmico podem ser determinadas por métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica. A quantidade existente dos cristais de ácido L-glutâmico pode ser determinada deixando-se o meio repousar e isolando-se os cristais do meio pela decantação. A concentração de ácido L-glutâmico no meio significa uma concentração de ácido L-glutâmico dissolvido. Quando os cristais precipitam no meio, a concentração é uma concentração determinada de uma solução clarificada obtida pela separação dos sólidos por centrifugação (ou filtração). A operação que causa a existência de cristais de ácido L-glutâmico é preferivelmente a adição de cristais de ácido L-glutâmico.

Quanto aos cristais de ácido L-glutâmico, existe a forma oc e a forma β de cristais (H. Takahashi, T. Takenishi, N. Nagashima, Bull. Chem. Soc. Japan, 35, 923 (1962); J. D. Bemal, Z. Krist., 78, 363 (1931); S. Hirokawa, Acta Cryst., 8, 637 (1955)). Quando é intencionado obter-se a forma a de cristais, os cristais a serem adicionados são preferivelmente da forma a.

Uma quantidade preferida de cristais varia dependendo de condições tais como a forma cristalina dos cristais. Se os cristais são da forma a, esta é usualmente de 0,2 g/litro ou mais. Se esta for mais do que esta concentração, os cristais da forma α podem ser obtidos com boa reprodutibilidade. Por causa da sua forma, os cristais da forma α podem ser manuseados mais facilmente comparados com os cristais da forma β. O microorganismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico usado no primeiro método da presente invenção e no segundo método de produção da presente invenção é um microorganismo que acumula uma quantidade significante de ácido L-glutâmico em um meio quando é cultivado no meio. Os exemplos deste incluem microorganismos pertencentes ao gênero Enterobacter. Preferido é o Enterobacter agglomerans.

Além disso, o microorganismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico usado no método de produção da presente invenção é preferivelmente um microorganismo que possa metabolizar uma fonte de carbono em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação e a fonte de carbono, em um pH específico e tenha uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade que exceda a concentração de saturação do ácido L-glutâmico no meio líquido no pH anteriormente mencionado (daqui por diante também chamado de “microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico”). O pH específico anteriormente mencionado é preferivelmente um pH no qual o ácido L-glutâmico precipita no meio e tal pH é usualmente 5,0 ou menos. A “concentração de saturação” significa uma concentração de ácido L-glutâmico dissolvida no meio líquido quando o meio líquido está saturado com ácido L-glutâmico.

Quando um microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico é usado, o pH adequado para a produção de ácido L-glutâmico é preferivelmente um pH no qual o ácido L-glutâmico precipita no meio. Realizando-se a cultura neste pH o ácido L-glutâmico é produzido e acumulado no meio com a sua precipitação associada. O microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico pode ser obtido como segue. Uma amostra contendo microorganismos é inoculada em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação e uma fonte de carbono, em um pH específico e uma cepa que metabolize a fonte de carbono é selecionada. Embora o pH específico não seja particularmente limitado, é usualmente cerca de 5,0 ou menos, preferivelmente cerca de 4,5 ou menos, mais preferivelmente cerca de 4,3 ou menos. O microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico é usado para a produção de ácido L-glutâmico pela fermentação com precipitação do ácido L-glutâmico associada. Se o pH for muito alto, toma-se difícil permitir que o microorganismo produza o ácido L-glutâmico em uma quantidade suficiente para a precipitação. Portanto, o pH está preferivelmente na faixa anteriormente mencionada.

Se o pH de uma solução aquosa contendo ácido L-glutâmico for diminuída, a solubilidade do ácido L-glutâmico cai significantemente em tomo do pKa do grupo γ-carboxila (4,25, 25°C). A solubilidade toma-se a mais baixa no ponto isoelétrico (pH 3,2) e o ácido L-glutâmico que excede a quantidade correspondente à concentração de saturação é precipitado. Embora dependa da composição do meio, o ácido L-glutâmico é dissolvido em uma quantidade de 10 a 20 g/litro no pH 3,2, de 30 a 40 g/litro no pH 4,0 e de 50 a 60 g/litro no pH 4,7, a cerca de 30°C. Usualmente, o pH não necessita ser feito a 3,0 ou mais baixo, porque o efeito de precipitação do ácido L-glutâmico atinge o seu limite superior quando pH vai abaixo de um certo valor. Entretanto, o pH pode ser 3,0 ou menos.

Além disso, a expressão que um microorganismo “pode metabolizar uma fonte de carbono” significa que pode proliferar ou pode consumir uma fonte de carbono mesmo que não possa proliferar, isto é, indica que cataboliza uma fonte de carbono tal como açúcares ou ácidos orgânicos. Especificamente, por exemplo, se um microorganismo prolifera quando é cultivado em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturação no pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particular e preferivelmente pH 4,0, em uma temperatura apropriada, por exemplo, 28°C, 37°C ou 50°C, durante 2 a 4 dias, este microorganismo pode metabolizar a fonte de carbono no meio. Além disso, por exemplo, se um microorganismo consome uma fonte de carbono mesmo que o microorganismo não prolifere, quando é cultivado em um meio líquido sintético contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação no pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particular e preferivelmente pH 4,0, em uma temperatura apropriada, por exemplo, 28°C, 37°C ou 50°C, durante 2 a 4 dias, o microorganismo é um microorganismo que pode metabolizar a fonte de carbono no meio. O microorganismo que pode metabolizar uma fonte de carbono inclui um microorganismo que pode desenvolver no meio líquido anteriormente mencionado.

Além disso, a expressão que um microorganismo “pode desenvolver” significa que o mesmo pode proliferar ou pode produzir ácido L-glutâmico mesmo que não possa proliferar. Especificamente, por exemplo, se um microorganismo prolifera quando é cultivado em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturação no pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particular e preferivelmente pH 4,0, em uma temperatura apropriada, por exemplo, 28°C, 37°C ou 50°C, durante 2 a 4 dias, este microorganismo pode desenvolver-se no meio. Além disso, por exemplo, se um microorganismo aumenta uma quantidade de ácido L-glutâmico em um meio líquido sintético mesmo que o microorganismo não prolifere, quando o microorganismo é cultivado no meio líquido sintético contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação no pH 5,0 a 4,0, preferivelmente pH 4,5 a 4,0, mais preferivelmente pH 4,3 a 4,0, particular e preferivelmente pH 4,0, em uma temperatura apropriada, por exemplo, 28°C, 37°C ou 50°C, durante 2 a 4 dias, este microorganismo é um microorganismo que pode desenvolver-se no meio. A seleção descrita acima pode ser repetida duas ou mais vezes sob as mesmas condições ou com mudança do pH ou da concentração de ácido L-glutâmico. Uma seleção para um estágio anterior pode ser realizada em um meio contendo ácido L-glutâmico em uma concentração mais baixa do que a concentração de saturação e depois disso uma seleção subsequente pode ser realizada em um meio contendo ácido L-glutâmico em uma concentração de saturação. Além disso, as cepas com propriedades favoráveis tais como taxa de proliferação superior podem ser selecionadas. O microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico é um microorganismo que tenha uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade que exceda a quantidade correspondente à concentração de saturação do ácido L-glutâmico em um meio líquido, além das propriedades descritas acima. O pH do meio líquido anteriormente mencionado é preferivelmente o mesmo ou próximo daquele do meio usado para avaliar um microorganismo tendo as propriedades anteriormente mencionadas. Usualmente, um microorganismo toma-se suscetível ao ácido L-glutâmico em uma concentração alta conforme o pH toma-se mais baixo. Portanto, é preferido que o pH não seja baixo em vista da resistência ao ácido L-glutâmico, mas o pH baixo é preferido em vista da produção de ácido L-glutâmico com a sua precipitação associada. Para satisfazer estas condições, o pH pode estar na faixa de 3 a 5, preferivelmente de 4 a 5, mais preferivelmente de 4 a 4,7, ainda mais preferivelmente de 4 a 4,5, particular e preferivelmente de 4,0 a 4,3.

Como o microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico ou os materiais de reprodução para estes, podem ser mencionados, por exemplo, os microorganismos pertencentes aos gêneros Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Alicyclobacillus, Bacillus, Saccharomyces ou coisa parecida. Entre estes, os microorganismos pertencentes ao gênero Enterobacter são preferidos. A seguir, o microorganismo da presente invenção será explicado principalmente para os microorganismos pertencentes ao gênero Enterobacter. Entretanto, o microorganismo não está limitado àqueles pertencentes ao gênero Enterobacter e aqueles pertencentes a outros gêneros podem ser similarmente usados.

Como um microorganismo pertencente ao Enterobacter, pode ser especificamente mencionado o Enterobacter agglomerans, preferivelmente o Enterobacter agglomerans da cepa AJ13355. Esta cepa foi isolada do solo em Iwata-shi, Shizuoka, Japão como uma cepa que pode proliferar em um meio contendo ácido L-glutâmico e uma fonte de carbono em pH baixo.

As propriedades fisiológicas da AJ 13355 estão mostradas abaixo: (1) Marcação Gram: negativo (2) Comportamento contra oxigênio: anaeróbica facultativa (3) Catalase: positivo (4) Oxidase: negativo (5) Capacidade redutora de nitrato: negativo (6) Teste de Voges-Proskauer: positivo (7) Teste de Vermelho de Metila: negativo (8) Urease: negativo (9) Produção de indol: positivo (10) Motilidade: capaz de mover-se (11) Produção de H2S no meio TSI: fracamente ativa (12) β-Galactosidase: positivo (13) Propriedade assimiladora de sacarídeo: Arabinose: positivo Sacarose: positivo Lactose: positivo Xilose: positivo Sorbitol: positivo Inositol: positivo Trealose: positivo Maltose: positivo Glicose: positivo Adonitol: negativo Rafinose: positivo Salicina: negativo Melibiose: positivo (14) Propriedade assimiladora de glicerose: positivo (15) Propriedade assimiladora de ácido orgânico: Ácido cítrico: positivo Ácido tartárico: negativo Ácido glicônico: positivo Ácido acético: positivo Ácido malônico: negativo (16) Arginina desidratase: negativo (17) Omitina descarboxilase: negativo (18) Lisina descarboxilase: negativo (19) Fenilalanina desaminase: negativo (20) Formação de pigmento: amarelo (21) Capacidade de liquefação de gelatina: positivo (22) pH de desenvolvimento: desenvolvimento possível no pH 4, bom desenvolvimento no pH 4,5 a 7,0 (23) Temperatura de desenvolvimento: bom desenvolvimento a 25°C, bom desenvolvimento a 30°C, bom desenvolvimento a 37°C, desenvolvimento possível a 42°C, desenvolvimento impossível a 45°C.

Com base nestas propriedades bacteriológicas, a AJ13355 foi determinada como Enterobacter agglomerans. A Enterobacter agglomerans AJ13355 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (agora International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science anda Technology) em 19 de fevereiro de 1998 e recebeu um número de acesso de FERM P-16644. Esta foi depois transferida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapest em 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6614. O microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico pode ser um microorganismo tendo originalmente capacidade produtora de ácido L-glutâmico ou um que tenha capacidade produtora de ácido L-glutâmico comunicada ou realçada pelo cruzamento através do uso de tratamento de mutagênese, técnicas de DNA recombinante ou coisa parecida. A capacidade produtora de ácido L-glutâmico pode ser comunicada ou realçada, por exemplo, aumentando-se a atividade de uma enzima que catalise uma reação para a biossíntese de ácido L-glutâmico. A capacidade produtora de ácido L-glutâmico também pode ser realçada diminuindo-se ou eliminando-se a atividade de uma enzima que catalise uma reação que ramifica do caminho biossintético do ácido L-glutâmico e gera um composto outro que não o ácido L-glutâmico.

Como exemplos da enzima que catalisa a reação para a biossíntese de ácido L-glutâmico podem ser mencionados a glutamato desidrogenase (a seguir, também chamada de “GDH”), glutamina sintetase, glutamato sintase, isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase (a seguir, também chamada de “CS”), fosfoenolpiruvato carboxilase (a seguir também chamada de “PEPC”), piruvato desidrogenase, piruvato cinase, enolase, fosfogliceromutase, fosfoglicerato cinase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, triosefosfato isomerase, frutose bisfosfato aldolase, fosfoírutocinase, glicose fosfato isomerase e assim por diante. Entre estas enzimas, uma, duas ou três de CS, PEPC e GDH são preferidas. Além disso, é preferido que as atividades de todas as três enzimas, CS, PEPC e GDH sejam realçadas no microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico. Em particular, a CS da Brevebacterium lactofermentum é preferida, porque não sofre da inibição pelo ácido a-cetoglutárico, ácido L-glutâmico e NADH.

De modo a realçar a atividade de CS, PEPC ou GDH, por exemplo, um gene codificador para CS, PEPC ou GDH pode ser clonado em um plasmídeo apropriado e um microorganismo hospedeiro pode ser transformado com o plasmídeo obtido. O número de cópia do gene que codifica a CS, PEPC ou GDH (daqui em diante, abreviado como “gene gltA”, “gene ppc” e “gene gdhA”, respectivamente) na célula da cepa transformada aumenta, resultando no aumento da atividade de CS, PEPC ou GDH.

Os genes gltA, ppc e gdhA clonados são introduzidos na cepa precursora de partida anteriormente mencionada sozinhos ou em combinação de dois ou três tipos arbitrários deles. Quando dois ou três tipos dos genes são introduzidos, dois ou três tipos dos genes podem ser clonados em um tipo de plasmídeo e introduzidos no hospedeiro ou separadamente clonados em dois ou três tipos de plasmídeos que possam coexistir e introduzidos no hospedeiro.

Dois ou mais tipos de genes que codificam uma enzima do mesmo tipo, mas derivada de microorganismos diferentes, podem ser introduzidos no mesmo hospedeiro.

Os plasmídeos descritos acima não são particularmente limitados contanto que sejam autonomamente replicáveis em uma célula de um microorganismo pertencente, por exemplo, ao gênero Enterobacíer ou coisa parecida. Entretanto, podem ser mencionados, por exemplo, pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pACYC177, pACYC184 e assim por diante. Além destes, os vetores de DNA de fago também podem ser usados. A transformação pode ser realizada, por exemplo, pelo método de D. M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), pelo método em que a permeabilidade das células da bactéria receptora para o DNA é aumentada tratando-se as células com cloreto de cálcio (Mandei M. e Higa A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), eletroporação (Miller J. Η., “A Short Course in Bacterial Genetics”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992) ou coisa parecida.

A atividade de CS, PEPC ou GDH também pode ser aumentada permitindo-se que cópias múltiplas do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA estejam presentes no DNA cromossômico da cepa precursora de partida anteriormente mencionada a ser um hospedeiro. De modo a introduzir cópias múltiplas do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA no DNA cromossômico de um microorganismo pertencente ao gênero Enterobacíer ou coisa parecida, uma seqüência, da qual cópias múltiplas estão presentes no DNA cromossômico, tal como DNA repetitivo e repetições invertidas presentes nos términos de um elemento transponível, pode ser usada. Altemativamente, cópias múltiplas dos genes podem ser introduzidas no DNA cromossômico utilizando-se a transferência de um transposon contendo o gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA. Como um resultado, o número de cópia do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA em uma célula da cepa transformada é aumentado e assim a atividade de CS, PEPC ou GDH é aumentada.

Como organismos usados como uma fonte do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA dos quais o número de cópia deva ser aumentado, qualquer organismo pode ser usado contanto que tenha atividade de CS, PEPC ou GDH. Inter alia, as bactérias, que sejam procariotas, por exemplo, aquelas pertencentes aos gêneros Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium ou Bacillus são preferidos. Como exemplos específicos podem ser mencionados Escherichia coli, Brevibacterium lactofermentum e assim por diante. O gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA podem ser obtidos a partir do DNA cromossômico dos microorganismos descritos acima. O gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA podem ser obtidos usando-se uma cepa mutante que seja deficiente na atividade de CS, PEPC ou GDH para isolar um fragmento de DNA que suplemente a sua auxotrofia a partir do DNA cromossômico dos microorganismos anteriormente mencionados. Além, visto que as seqüências de nucleotídeo destes genes das bactérias Escherichia e Corynebacterium já foram elucidadas (Biochemistry, 22, pp. 5243 a 5249, (1983); J. Biochem., 95, pp. 909 a 916, (1984); Gene, 27, pp. 193 a 199, (1984); Microbiology, 140, pp. 1817 a 1828, (1994); Mol. Gen. Genet., 218, pp. 330 a 339, (1989); Molecular Microbiology, 6, pp. 317 a 326, (1992)), também podem ser obtidas por PCR utilizando-se iniciadores sintetizados com base em cada seqüência de nucleotídeo e DNA cromossômico como um padrão. A atividade de CS, PEPC ou GDH também pode ser aumentada realçando-se a expressão do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA, além da amplificação anteriormente mencionada dos genes. Por exemplo, a expressão pode ser realçada substituindo-se um promotor para o gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA com um outro promotor mais forte. Por exemplo, o promotor lac, o promotor trp, o promotor trc, o promotor tac, o promotor PR e o promotor PL do fago lambda e assim por diante são conhecidos como promotores fortes. O gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA dos quais o promotor é substituído são clonados em um plasmídeo e introduzidos no microorganismo hospedeiro ou introduzidos no DNA cromossômico do microorganismo hospedeiro usando-se o DNA repetitivo, a repetição invertida, o transposon ou coisa parecida. A atividade de CS, PEPC ou GBH também pode ser aumentada substituindo-se o promotor do gene gltA, do gene ppc ou do gene gdhA no cromossoma por um outro promotor mais forte (ver a WO 87/03.006 e o Pedido de Patente Japonês aberto ao público N2 61-268183) ou inserindo-se um promotor forte à montante da seqüência codificadora de cada gene (ver, Gene, 29, pp. 231 a 241 (1984)). Especificamente, a recombinação homóloga pode ser realizada entre o gene gltA, o gene ppc ou o gene gdhA dos quais o promotor é substituído com um mais forte ou DNA contendo uma parte deste e o gene correspondente no cromossoma.

Os exemplos da enzima que catalisa a reação com as ramificações do caminho biossintético do ácido L-glutâmico e gera um composto outro que não o ácido L-glutâmico incluem a-cetoglutarato desidrogenase (a seguir, também chamado de “aKGDH”), isocitrato liase, fosfato acetiltransferase, acetato cinase, ácido acetoidróxi sintase, acetolactato sintase, formiato acetiltransferase, lactato desidrogenase, glutamato descarboxilase, 1-pirrolina desidrogenase e assim por diante. Entre estas enzimas, a aKGDH é preferida.

De modo a diminuir ou eliminar as atividades das enzimas anteriormente mencionadas em um microorganismo pertencente ao gênero Enterobacter ou coisa parecida, mutações para diminuir ou eliminar a atividade intracelular das enzimas podem ser introduzidas nos genes das enzimas anteriormente mencionadas por um método de tratamento de mutagênese usual ou um método de engenharia genética.

Os exemplos de método de tratamento de mutagênese incluem por exemplo, métodos que utilizam irradiação com raio X ou raio ultravioleta, os métodos que utilizam tratamento com um agente de mutagênese tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina e assim por diante. O local de um gene onde a mutação é introduzida pode estar em uma região codificadora que codifica uma proteína de enzima ou uma região para regular a expressão tal como um promotor.

Os exemplos dos métodos de engenharia genética incluem por exemplo, métodos que utilizam a recombinação de gene, transdução, fusão de célula e assim por diante. Por exemplo, um gene de resistência a medicamento é inserido em um gene alvo clonado para preparar um gene que tenha perdido a sua função (gene defeituoso). Subseqüentemente, este gene defeituoso é introduzido em uma célula de um microorganismo hospedeiro e o gene alvo no cromossoma é substituído com o gene defeituoso anteriormente mencionado utilizando-se a recombinação homóloga (rompimento de gene). A diminuição ou deficiência da atividade intracelular da enzima alvo e o grau de diminuição da atividade podem ser confirmados medindo-se a atividade da enzima de um extrato celular ou uma fração purificada deste obtidos de uma cepa candidata e comparando-os com aqueles de uma cepa selvagem. Por exemplo, a atividade de aKGDH pode ser medida pelo método de Reed et al., (Reed L. J. e Mukheijee B. B., Methods in Enzymology, 13, pp. 55 a 61 (1969)).

Dependendo da enzima alvo, uma cepa mutante alvo pode ser selecionada com base em um fenótipo da cepa mutante. Por exemplo, uma cepa mutante em que a atividade de aKGDH é eliminada ou diminuída não pode proliferar ou apresenta uma taxa de proliferação acentuadamente reduzida em um meio mínimo contendo glicose ou um meio mínimo contendo ácido acético ou ácido L-glutâmico como uma fonte de carbono exclusiva sob uma condição de cultura aeróbica. Entretanto, a proliferação normal é capacitada mesmo sob a mesma condição pela adição de ácido succínico ou lisina, metionina e ácido diaminopimélico a um meio mínimo contendo glicose. Pela utilização deste fenômeno como indicadores, uma cepa mutante com atividade de aKGDH diminuída ou deficiente na atividade pode ser selecionada.

Um método para preparar uma cepa deficiente no gene aKGDH da Brevibacterium lactofermentum pela utilização da recombinação homóloga é descrito em detalhes na WO 95/34672. Métodos similares podem ser aplicados a outros microorganismos.

Além disso, técnicas tais como a clonagem de genes e a digestão e ligação de DNA, a transformação e assim por diante estão descritas em detalhes em Molecular Cloning, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press (1989) e assim por diante.

Como um exemplo específico de uma cepa mutante deficiente na atividade de aKGDH ou com a atividade de aKGDH diminuída obtido como descrito acima, pode ser mencionada a Enterobacter agglomerans AJ13356. A Enterobacter agglomerans AJ12356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (agora International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science anda Technology) em 19 de fevereiro de 1998 e recebeu um número de acesso de FERM P-16645. Esta foi depois transferida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapest em 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6615. A Enterobacter agglomerans AJ12356 é deficiente na atividade de aKGDH como um resultado do rompimento do gene da subunidade aKGDH-El (sucA).

Quando a Enterobacter agglomerans, que é um exemplo do microorganismo usado na presente invenção, é cultivada em um meio contendo um sacarídeo, muco é extracelularmente secretado, ocasionalmente resultando em baixa eficiência de operação. Portanto, quando a Enterobacter agglomerans tendo tal propriedade de secretar muco é usada, é preferível usar uma cepa mutante que secrete menos muco comparado com uma cepa selvagem. Os exemplos de tratamento de mutagênese incluem por exemplo, métodos que utilizam irradiação com raio X ou raio ultravioleta, método que utiliza tratamento com um agente de mutagênese tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina e assim por diante. Uma cepa mutante com secreção diminuída de muco pode ser selecionada pela inoculação de células bacterianas mutagenizadas em um meio contendo um sacarídeo, por exemplo, placa de meio LB contendo 5 g/litro de glicose, cultivando-as com inclinação da placa em cerca de 45 graus e selecionando-se uma colônia que não apresente corrimento de muco.

Na presente invenção, a comunicação ou realce da capacidade produtora de ácido L-glutâmico e a comunicação de outras propriedades favoráveis tais como mutação para a secreção de menos muco descrita acima podem ser realizados em uma ordem arbitrária.

Cultivando-se os microorganismos tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico em um meio líquido que é ajustado à condição de pH que permite a precipitação do ácido L-glutâmico, o ácido L-glutâmico pode ser produzido e acumulado com a sua precipitação no meio associada.

Preferivelmente, cultivando-se o microorganismo acumulador de ácido L-glutâmico em um meio líquido que esteja ajustado à condição de pH que permita a precipitação do ácido L-glutâmico, o ácido L-glutâmico pode ser produzido e acumulado com a sua precipitação no meio associada. Além disso, é possível que a cultura seja iniciada em um pH neutro e o pH venha a estar na condição que permite a precipitação de ácido L-glutâmico quando a cultura é completada. A “condição que permite a precipitação do ácido L-glutâmico” aqui referida significa uma condição que permite a precipitação do ácido L-glutâmico quando o microorganismo acima mencionado produz e acumula ácido L-glutâmico. Por exemplo, esta é usualmente de 3 a 5 quando o microorganismo é uma bactéria Enterobacter. O microorganismo pode ser cultivado em pH adequado para o seu desenvolvimento no início e depois cultivado sob a condição que permita a precipitação de ácido L-glutâmico. Por exemplo, quando o meio contém uma fonte de açúcar que o microorganismo não pode assimilar sob a condição que permita a precipitação de ácido L-glutâmico ou um ácido orgânico que iniba o desenvolvimento do microorganismo sob a condição que permita a precipitação de ácido L-glutâmico, o microorganismo pode ser cultivado sob uma condição sob a qual o microorganismo possa assimilar a fonte de açúcar ou o desenvolvimento do microorganismo não é inibido pelo ácido orgânico para permitir que o microorganismo consuma a fonte de açúcar ou o ácido orgânico e depois cultivados sob a condição que permita a precipitação do ácido L-glutâmico.

Como o meio usado para a cultura, um meio nutriente usual contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, sais minerais e nutrientes traço orgânicos tais como aminoácidos e vitaminas como requerido pode ser usado contanto que o pH seja ajustado de modo a satisfazer a condição pré determinada. Um meio sintético ou um meio natural podem ser usados. A fonte de carbono e a fonte de nitrogênio usadas no meio podem ser qualquer uma contanto que possam ser usadas pela cepa a ser cultivada.

Como a fonte de carbono, sacarídeos tais como glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisado de amido e melaços são usados. Além disso, ácidos orgânicos tais como o ácido acético e o ácido cítrico podem ser usados cada um sozinho ou em combinação com uma outra fonte de carbono.

Como a fonte de nitrogênio, amônia, sais de amônio tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio e acetato de amônio, nitratos e assim por diante são usados.

Como os nutrientes traço orgânicos, aminoácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucléicos, aqueles contendo estas substâncias tais como peptona, ácido de casamino, extrato de levedura e produtos da decomposição da proteína de soja são usados. Quando uma cepa mutante auxotrófica que requer um aminoácido e assim por diante para a metabolização ou desenvolvimento é usada, o nutriente requerido deve ser suplementado.

Como sais minerais, fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês e assim por diante são usados. A cultura é usualmente realizada com aeração sob a condição de uma temperatura de cultura de 20 a 42°C e pH de 3 a 5, preferivelmente de 4 a 5 mais preferivelmente de 4,7, particular e preferivelmente de 4 a 4,5. Uma quantidade considerável de ácido L-glutâmico é usualmente acumulada depois da cultura durante cerca de 10 horas a cerca de 4 dias. Uma parte do ácido L-glutâmico acumulado que excede a concentração de saturação precipita no meio.

Depois de completar a cultura, o ácido L-glutâmico precipitado na cultura pode ser coletado por centrifugação, filtração ou coisa parecida. O ácido L-glutâmico dissolvido no meio também pode ser coletado por métodos conhecidos. Por exemplo, o ácido L-glutâmico pode ser isolado pela concentração do caldo de cultura para cristalizá-lo ou isolado pela cromatografia de troca iônica ou coisa parecida. Também é possível cristalizar o ácido L-glutâmico dissolvido no meio e depois coletar o ácido L-glutâmico precipitado no caldo de cultura junto com o ácido L-glutâmico cristalizado.

Quando o ácido L-glutâmico que excede uma concentração de saturação precipita, a concentração de ácido L-glutâmico dissolvido no meio é mantida em um nível constante. Portanto, a influência do ácido L-glutâmico em uma concentração alta sobre os microorganismos pode ser reduzida. Conseqüentemente, isto também toma possível reproduzir um microorganismo tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico ainda mais melhorada. Além disso, visto que o ácido L-glutâmico é precipitado como cristais, a acidificação do caldo de cultura pelo acúmulo de ácido L-glutâmico é suprimida e portanto a quantidade de álcali usada para manter o pH da cultura pode ser significantemente reduzida. Contanto que a presente invenção não esteja intencionada a estar ligada por qualquer teoria, a razão pelo qual o rendimento de ácido L-glutâmico é melhorado pela realização de uma operação que causa existência de cristais de ácido L-glutâmico no meio quando uma concentração de ácido L-glutâmico no meio é menor do que a concentração na qual a cristalização espontânea ocorre, no caso em que o ácido L-glutâmico precipita como descrito acima é considerado como segue.

Na fermentação de ácido L-glutâmico com a precipitação associada, a produção de ácido L-glutâmico tende a atingir o seu limite quando a cristalização espontânea ocorre. É presumido que isso seja por que uma concentração de ácido L-glutâmico é a mais alta nas superfícies das células quando a cristalização espontânea ocorre e a precipitação ocorre nas superfícies, impedindo deste modo o movimento de substâncias em tomo de uma membrana para reduzir a atividade de uma bactéria. Se a existência de cristais é artificialmente causada antes que a cristalização espontânea ocorra, os cristais servem como cristais de semente para causar a precipitação nas superfícies dos cristais, impedindo deste modo que a bactéria reduza a sua atividade.

EXEMPLOS A seguir, a presente invenção será mais especificamente explicada com referência aos seguintes exemplos. Nos exemplos, os aminoácidos são L-aminoácidos a menos que de outro modo indicado. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1 <1> Avaliação de microorganismo tendo resistência ao ácido L-glutâmico em ambiente ácido A avaliação de um microorganismo tendo resistência ao ácido L-glutâmico em ambiente ácido foi realizada como segue. Um (1) grama de cada uma de cerca de 500 amostras obtidas da natureza incluindo solo, frutas, corpos vegetais, água de rio e assim por diante foi colocado em suspensão em 5 ml de água esterilizada e 200 μΐ desta foram revestidos sobre 20 ml de meio sólido ajustado ao pH 4,0 com HC1. A composição do meio foi como segue: 3 g/litro de glicose, 1 g/litro de sulfato de amônio, 0,2 g/litro de sulfato de magnésio heptaidratado, 0,5 g/litro de diidrogenofosfato de potássio, 0,2 g/litro de cloreto de sódio, 0,1 g/litro de cloreto de cálcio diidratado, 0,01 g/litro de sulfato ferroso heptaidratado, 0,01 g/litro de sulfato de manganês tetraidratado, 0,72 mg/litro de sulfato de zinco diidratado, 0,64 mg/litro de sulfato de cobre pentaidratado, 0,72 mg/litro de cloreto de cobalto hexaidratado, 0,4 mg/litro de ácido bórico, 1,2 mg/litro de molibdato de sódio diidratado, 50 pg/litro de biotina, 50 pg/litro de pantotenato de cálcio, 50 pg/litro de ácido fólico, 50 pg/litro de inositol, 50 pg/litro de niacina, 50 pg/litro de ácido p-aminobenzóico, 50 pg/litro de cloridreto de piridoxina, 50 pg/litro de riboflavina, 50 pg/litro de cloridreto de tiamina, 50 mg/litro de cicloeximida e 20 g/litro de ágar. O meio plaqueado com as amostras acima foram incubados a 28°C, 37°C ou 50°C durante 2 a 4 dias e 378 cepas que formaram colônias foram obtidas.

Subseqüentemente, cada uma das cepas obtidas como acima descrito foi inoculada em um tubo de teste de 16,5 cm no comprimento e 14 mm no diâmetro contendo 3 ml de meio líquido (ajustado ao pH 4,0 com HC1) contendo uma concentração de saturação de ácido L-glutâmico e cultivada a 28°C, 37°C ou 50°C durante 24 horas a 3 dias com agitação. Depois, as cepas cultivadas foram selecionadas. A composição do meio anteriormente mencionado foi como segue: 40 g/litro de glicose, 20 g/litro de sulfato de amônio, 0,5 g/litro de sulfato de magnésio heptaidratado, 2 g/litro de diidrogenofosfato de potássio, 0,5 g/litro de cloreto de sódio, 0,25 g/litro de cloreto de cálcio diidratado, 0,02 g/litro de sulfato ferroso heptaidratado, 0,02 g/litro de sulfato de manganês tetraidratado, 0,72 mg/litro de sulfato de zinco diidratado, 0,64 mg/litro de sulfato de cobre pentaidratado, 0,72 mg/litro de cloreto de cobalto hexaidratado, 0,4 mg/litro de ácido bórico, 1,2 mg/litro de molibdato de sódio diidratado e 2 g/litro de extrato de levedura.

Assim, 78 cepas de microorganismos apresentando resistência ao ácido L-glutâmico em um ambiente ácido foram obtidas com sucesso. <2> Seleção de cenas que apresentam taxa de desenvolvimento superior de microorganismos tendo resistência ao ácido L-glutâmico em ambiente ácido.

Os vários microorganismos tendo resistência ao ácido L-glutâmico em um ambiente ácido obtidos como descrito acima são cada um inoculados em um tubo de teste de 16,5 cm no comprimento e 14 mm no diâmetro contendo 3 ml de meio (ajustado ao pH 4,0 com HC1) obtido pela adição de 20 g/litro de ácido glutâmico e 2 g/litro de glicose ao meio M9 (Sambrook, J., Fritsh, E. F. e Maniatis, T., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989) e a turbidez do meio foi medida no curso de tempo para selecionar cepas que apresentassem uma taxa de desenvolvimento favorável. Como um resultado, como uma cepa apresentando desenvolvimento favorável, a cepa AJ13355 foi obtida do solo em Iwata-shi, Shizuoka, Japão. Esta cepa foi determinada como Enterobacter agglomerans com base nas suas propriedades bacteriológicas acima descritas. <3> Aquisição de cena com menos secreção de muco a partir da cena AJ13555 da Enterobacter asslomerans Visto que a cepa AJ13555 da Enterobacter agglomerans secreta extracelularmente muco quando cultivada em um meio contendo um sacarídeo, a eficiência de operação não é favorável. Portanto, uma cepa com menos secreção de muco foi obtida pelo método da irradiação ultravioleta (Miller, J. H. et al., “A Short Course in Bacterial Genetics; Laboratory Manual”, p. 150, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.). A cepa AJ13555 da Enterobacter agglomerans foi irradiada com raio ultravioleta durante 2 minutos em uma posição a 60 cm distante de uma lâmpada de ultravioleta de 60 W e cultivada em meio LB durante a noite para fixar a mutação. A cepa mutagenizada foi diluída e inoculada em meio LB contendo 5 g/litro de glicose e 20 g/litro de ágar de modo que cerca de 100 colônias por placa emergiram e foram cultivadas a 30°C durante a noite com inclinação da placa em cerca de 45 graus e depois 20 colônias que não apresentaram corrimento de muco foram selecionadas.

Como uma cepa que satisfaz as condições de que nenhum reversor emergiu mesmo depois de 5 vezes de subcultura em meio LB contendo 5 g/litro de glicose e 20 g/litro de ágar e que e que foi observado desenvolvimento equivalente à cepa precursora em meio LB, meio LB contendo 5 g/litro de glicose e meio M9 (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, 2a Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989) suplementado com 20 g/litro de ácido L-glutâmico e 2 g/litro de glicose e ajustado ao pH 4,5 com HC1, a cepa SC 17 foi selecionada das cepas selecionadas acima. <4> Construção de bactéria produtora de ácido L-glutâmico a partir da cena SC 17 da Enterobacter aszlomerans (1) Preparação de cepa deficiente em aKGDH a partir da cepa SC 17 da Enterobacter agglomerans Uma cepa que foi deficiente em aKGDH e teve o sistema biossintético do ácido L-glutâmico realçado foi preparada a partir da cepa SC 17 da Enterobacter agglomerans. (i) Clonagem do gene aKGDH (a seguir, chamado de “sucAB”) da cepa AJ13355 da Enterobacter agglomerans. O gene sucAB da cepa AJ 13355 da Enterobacter agglomerans foi clonado selecionando-se um fragmento de DNA que complementasse a propriedade de desassimilação de ácido acético da cepa deficiente no gene da subunidade aKGDH-El (a seguir, chamado de “sucA”) da Escherichia coli do DNA cromossômico da cepa AJ13355 da Enterobacter agglomerans. O DNA cromossômico da cepa AJ13355 da Enterobacter agglomerans foi isolado por um método usualmente utilizado para extrair DNA cromossômico da Escherichia coli (Text for Bioengineering Experiments, editado pela Society for Bioscience and Bioengineering, Japão, pp. 97 e 98, Baifukan, 1992). O pTWV228 (resistente à ampicilina) usado como um vetor foi um produto comercial de Takara Shuzo Co., Ltd. O DNA cromossômico da cepa AJ 13355 digerido com EcoT22\ e o pTWV228 digerido com Pstl foram ligados usando-se T4 ligase e usados para transformar a cepa JRG465 da Escherichia coli deficiente em sucA (Herbert, J. et al., Mol. Gen. Genetics, 105, 182 (1969)). Uma cepa que desenvolve em um meio mínimo de acetato foi selecionada a partir das cepas transformantes obtidas acima e um plasmídeo foi extraído desta e designado como pTWVEKlOl. A cepa JRG465 da Escherichia coli que abriga o pTWVEKlOl recuperou a auxotrofia para o ácido succínico ou L-lisina e L-metionina, além da característica da propriedade desassimiladora de ácido acético. Isto sugere que o pTWVEKlOl continha o gene sucA da Enterobacter agglomerans. A Figura 1 mostra um mapa de enzima de restrição de um fragmento de DNA derivado da Enterobacter agglomerans no pTWVEKlOl. Na seqüência de nucleotídeo da porção tracejada na Figura 1, as seqüências de nucleotídeo consideradas serem duas ORFs de comprimento completo e duas seqüências de nucleotídeo consideradas serem seqüências parciais das ORFs foram descobertas. Como resultado da pesquisa de homologia para estas, foi revelado que as porções de cujas sequências de nucleotídeo foram determinadas continham uma seqüência parcial de extremidade 3’ do gene da proteína da succinato desidrogenase ferro-enxoffe (sdhB), o sucA de comprimento completo e o gene da subunidade aKGDH-E2 (gene sucB) e uma seqüência parcial da extremidade 5’ do gene da subunidade β da succinil CoA sintetase (gene sucC). Os resultados de comparação das sequências de aminoácido deduzidos destas seqüências de nucleotídeo com aquelas derivadas da Escheríchia coli (Eur. J. Biochem, 141, pp. 351 a 359 (1984); Eur. J. Biochem, 141, pp. 361 a 374 (1984); Biochemistiy, 24, pp. 6245 a 6252 (1985)) são apresentados nas figuras de 2 a 5. As seqüências de aminoácido codificadas por sucA, sucB e sucC ou partes dos mesmos derivadas da Enterobacter agglomerans são mostradas na SEQ Π) NOs: 1- 4 e aquelas derivadas da Escheríchia coli são mostradas na SEQ !D NOs: 5-8. Assim, as seqüências de aminoácido apresentaram homologia muito alta umas às outras. Além disso, foi descoberto que um cacho de sdhB-sucA-sucB-sucC foi constituído no cromossoma da Enterobacter agglomerans como na Escheríchia coli (Eur. J. Biochem, 141, pp. 351 a 359 (1984); Eur. J. Biochem, 141, pp. 361 a 374 (1984); Biochemistry, 24, pp. 6245 a 6252 (1985)). (ii) Aquisição de cepa deficiente em aKGDH derivada da cepa SC 17 da Enterobacter agglomerans A recombinação homóloga foi realizada usando-se o gene sucAB da Enterobacter agglomerans obtido como descrito acima para se obter uma cepa deficiente em aKGDH da Enterobacter agglomerans.

Depois que o pTWVEKlOl foi digerido com Sphl para excisar um fragmento contendo sucA, o fragmento foi abruptamente terminado com o fragmento Klenow (Takara Shuzo Co., Ltd) e ligado com pBR322 digerido com EcóBl e abruptamente terminado com o fiagmento Klenow, usando-se a T4 DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd). O plasmídeo obtido foi digerido no sítio de reconhecimento da enzima de restrição BglΠ posicionado aproximadamente no centro de sucA usando-se a enzima, abruptamente terminada com o fragmento Klenow, e depois novamente ligado usando-se a Τ4 DNA ligase. Foi considerado que o gene sucA tomou-se não funcional porque uma mutação de mudança na matriz foi introduzida no sucA do plasmídeo recentemente construído através do procedimento acima. O plasmídeo construído como descrito acima foi digerido com uma enzima de restrição ApalA, e submetido à eletroforese em gel de agarose para recuperar um fragmento de DNA contendo sucA, no qual a mutação de mudança na matriz foi introduzida e um gene de resistência à tetraciclina derivado do pBR322. O fragmento de DNA recuperado foi novamente ligado usando-se a T4 DNA ligase para construir um plasmídeo para romper o gene aKGDH. O plasmídeo para romper o gene aKGDH obtido como descrito acima foi usado para transformar a cepa SC 17 da Enterobacter agglomerans pela eletroporação (Miller J. Η., “A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook”, p. 279, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992) e uma cepa em que o sucA no cromossoma foi substituído por um do tipo mutante do plasmídeo pela recombinação homóloga foi obtida usando-se a resistência à tetraciclina como um marcador. A cepa obtida foi designada como cepa SC17sucA.

De modo a confirmar que a cepa SC17sucA era deficiente na atividade de aKGDH, a atividade da enzima foi medida pelo método de Reed et al., (Reed L. J. e Mukheijee B. B., Methods in Enzymology, 13, pp. 55 a 61 (1969)) usando-se as células da cepa cultivada em meio LB para a fase de desenvolvimento logarítmico. Como um resultado, a atividade de aKGDH de 0,073 (AABS/min/mg de proteína) foi detectada a partir da cepa SCI7, ao passo que nenhuma atividade de aKGDH foi detectada a partir da cepa SC17sucA e assim foi confirmado que o sucA foi eliminado como pretendido. (2) Realce do sistema de biossíntese do ácido L-glutâmico da cepa SC17sucA da Enterobacter agglomerans.

Subseqüentemente, o gene da citrato sintase, o gene da fosfoenolpiruvato carboxilase e o gene da glutamato desidrogenase derivados da Escherichia coli foram introduzidos na cepa SC17sucA. (i) Preparação de plasmídeo tendo o gene glíA, o gene ppc e o gene gdhA derivados da Escherichia coli Os procedimentos de preparar um plasmídeo tendo o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA será explicado referindo-se às Figuras 6 e 7.

Um plasmídeo tendo o gene gdhA derivado da Escherichia coli pBRGDH (Pedido de Patente Japonês aberto ao público N2 7-203980) foi digerido com HindlII e Sphl, ambas as extremidades foram abruptamente terminadas pelo tratamento com a T4 DNA polimerase e depois o fragmento de DNA tendo o gene gdhA foi purificado e recuperado. Separadamente, um plasmídeo tendo o gene gltA e o gene ppc da Escherichia coli pMWCP (WO 97/08294), foi digerido com Xbal e depois ambas as extremidades foram abruptamente terminadas usando-se a T4 DNA polimerase. Este foi misturado com o fragmento de DNA purificado acima tendo o gene gdhA e ligado usando-se a T4 ligase para se obter um plasmídeo pMWCPG, que correspondeu ao pMWCP contendo ainda o gene gdhA (Figura 6).

Ao mesmo tempo, o plasmídeo pVIC40 (Pedido de Patente Japonês aberto ao público N2 8-047397) tendo a origem de replicação do plasmídeo de faixa hospedeira ampla RSF1010 foi digerido com Notl, tratado com T4 DNA polimerase e digerido com Pstl. O pBR322 foi digerido com EcoTIAl, tratado com T4 DNA polimerase e digerido com Pstl. Ambos os produtos foram misturados e ligados usando-se T4 ligase para se obter um plasmídeo RSF-Tet tendo a origem de replicação do TSF1010 e o gene da resistência à tetraciclina (Figura 7).

Subseqüentemente, o pMWCPG foi digerido com £coRI e Pstl, e um fragmento tendo o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA foi purificado e recuperado. O RSF-Tet foi similarmente digerido com EcoBA e Pstl, e um fragmento de DNA tendo a origem de replicação do RSF1010 foi purificado e recuperado. Ambos os produtos foram misturados e ligados usando-se a T4 ligase para se obter um plasmídeo RSFCPG, que correspondeu ao RSF-Tet contendo o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA (Figura 8). Foi confirmado que o plasmídeo RSFCPG obtido expressou o gene gltA, o gene ppc e o gene gdhA com base na suplementação da auxotrofia da cepa deficiente no gene gltA, no gene ppc ou no gene gdhA derivada da Escherichia coli e nas medições de cada atividade de enzima. (ii) Preparação de plasmídeo tendo o gene gltA derivado da Brevibacterium lactofermentum Um plasmídeo tendo o gene gltA derivado da Brevibacterium lactofermentum foi construído como segue. A PCR foi realizada usando-se os DNAs iniciadores que foram preparados com base na seqüência de nucleotídeo do gene gltA da Corynebacterium glutamicum (Microbiology, 140, pp. 1817 a 1828 (1994)) e DNA cromossômico da Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 como um padrão para se obter um fragmento de gene gltA de cerca de 3 kb. Este fragmento foi inserido em um plasmídeo pHSG399 (adquirido da Takara Shuzo Co., Ltd.) digerido com Smal para se obter um plasmídeo pHSGCB (Figura 9). Subseqüentemente, o pHSGCB foi digerido com Hindlll e o fragmento de gene gltA excisado de cerca de 3 kb foi inserido em um plasmídeo pSTV29 (adquirido da Takara Shuzo Co., Ltd.) digerido com Hindlll para se obter um plasmídeo pSTVCB expressado no gene gltA medindo-se a atividade da enzima na cepa AJ13355 da Enterobacter agglomerans.

(iii) Introdução de RSFCPG e pSTVCB na cepa SC17sucA A cepa SC17sucA da Enterobacter agglomerans foi transformada com RFSCPG pela eletroporação para se obter uma cepa SC17sucA/RSFCPG transformante que apresenta resistência à tetraciclina. Além disso, a cepa SC17sucA/RSFCPG foi transformada com pSTVCB pela eletroporação para se obter uma cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB que apresenta resistência ao cloranfenicol. <5> Aquisição de cena com resistência melhorada ao ácido L-glutâmico em ambiente de pH baixo Uma cepa com resistência melhorada ao ácido L-glutâmico em uma concentração alta, em um ambiente de pH baixo (a seguir, também chamada de “cepa com resistência à concentração alta de Glu em pH baixo”) foi isolada da cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB da Enterobacter agglomerans. A cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi cultivada durante a noite a 30°C em meio LBG (10 g/litro de tripton, 5 g/litro de extrato de levedura, 10 g/litro de NaCl, 5 g/litro de glicose) e as células lavadas com solução salina foram apropriadamente diluídas e plaqueadas em uma placa de meio M9-E (4 g/litro de glicose, 17 g/litro de Na2HP04.12H20, 3 g/litro de KH2P04, 0,5 g/litro de NaCl, 1 g/litro de NIUCl, 10 mM de MgS04, 10 μΜ de CaCl2, 50 mg/litro de L-lisina, 50 mg/litro de ácido DL-diaminopimélico, 25 mg/litro de tetraciclina, 25 mg/litro de cloranfenicol, 30 g/litro de ácido L-glutâmico, ajustado ao pH 4,5 com amônia aquosa). Uma colônia emergida depois da cultura a 32°C durante 2 dias foi obtida como uma cepa com resistência à alta concentração de Glu no pH baixo.

Para a cepa obtida, o nível de desenvolvimento no meio líquido M9-E foi medido e a capacidade produtora de ácido L-glutâmico foi testada em um tubo de teste de volume grande de 50 ml contendo 5 ml do meio de teste da produção de ácido L-glutâmico (40 g/litro de glicose, 20 g/litro de sulfato de amônio, 0,5 g/litro de sulfato de magnésio heptaidratado, 2 g/litro de diidrogenofosfato de potássio, 0,5 g/litro de cloreto de sódio, 0,25 g/litro de cloreto de cálcio diidratado, 0,02 g/litro de sulfato ferroso heptaidratado, 0,02 g/litro de sulfato de manganês tetraidratado, 0,72 mg/litro de sulfato de zinco diidratado, 0,64 mg/litro de sulfato de cobre pentaidratado, 0,72 mg/litro de cloreto de cobalto hexaidratado, 0,4 mg/litro de ácido bórico, 1,2 mg/litro de molibdato de sódio diidratado, 2 g/litro de extrato de levedura, 200 mg/litro de cloridreto de L-lisina, 200 mg/litro de L-metionina, 200 mg/litro de ácido DL-a,8-diaminopimélico, 25 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol). Uma cepa que exibiu o melhor nível de desenvolvimento e a mesma capacidade produtora de g/litro de glicose como aquela da sua cepa precursora, a cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB foi designada como AJ13601 da Enterobacter agglomerans. A cepa AJ13601 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (agora International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology; Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japão) em 18 de agosto de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM P-17516. Esta foi depois transferida para um depósito internacional sob as condições do Tratado de Budapest em 6 de julho de 2000 e recebeu um número de acesso de FERM BP-7207. EXEMPLO 1 A cepa AJ13601 da Enterobacter agglomerans foi cultivada em meio LBG ágar (10 g/litro de tripton, 5 g/litro de extrato de levedura, 10 g/litro de NaCl e 15 g/litro de ágar) contendo 25 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol a 30°C durante 14 horas e as células em uma placa (diâmetro: 8,5 cm) foram coletadas e inoculadas em 300 ml de um meio de cultura contendo 50 g/litro de glicose, 4 g/litro de sulfato de amônio, 0,4 g/litro de sulfato de magnésio heptaidratado, 2 g/litro de diidrogeno fosfato de monopotássio, 10 mg/litro de sulfato ferroso heptaidratado, 10 mg/litro de sulfato de manganês pentaidratado, 4 g/litro de estrato de levedura, 400 mg/litro de cloridreto de L-lisina, 400 mg/litro de DL-metionina, 400 mg/litro de ácido DL-a,s-diaminopimélico, 25 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol em um fermentador de jarro de 1 litro de volume para realizar a cultura a 34°C no pH 6,0. O pH da cultura foi controlado pela adição de gás amônia. A cultura foi terminada em cerca de 16 horas depois do início da cultura em uma fase na qual a glicose no meio de cultura foi esgotada. 60 ml do caldo de cultura cultivado como descrito acima foram inoculados em 30 ml de um meio de cultura principal contendo 50 g/litro de glicose, 5 g/litro de sulfato de amônio, 0,4 g/litro de sulfato de magnésio heptaidratado, 5 g/litro de diidrogenofosfato de monopotássio, 20 mg/litro de sulfato ferroso heptaidratado, 20 mg/litro de sulfato de manganês pentaidratado, 6 g/litro de estrato de levedura, 800 mg/litro de cloridreto de L-lisina, 600 mg/litro de DL-metionina, 600 mg/litro de ácido DL-α,ε-diaminopimélico, 1,5 g/litro de cloreto de sódio, 0,75 g/litro de cloreto de cálcio diidratado, 25 mg/litro de cloridreto de tetraciclina e 25 mg/litro de cloranfenicol, em um jarro de 1 litro de volume para realizar a cultura a 34°C no pH 6,0. Conforme o ácido L-glutâmico é acumulado, o pH diminui espontaneamente para atingir o pH 4,5 em tomo de uma ou duas horas do início da cultura. Em seguida, o pH da cultura foi ajustado para o pH 4,5 pela adição de gás amônia. Depois que a glicose inicialmente adicionada foi esgotada, 700 g/litro de uma solução aquosa de glicose foi continuamente adicionado a uma razão de 6 ml/hora.

Quando a produção fermentativa de ácido L-glutâmico foi continuada como descrito acima, a concentração do ácido L-glutâmico acumulado no caldo de cultura em cerca de 14 horas depois do início da cultura foi de 45 a 55 g/litro.

Neste momento, os cristais de ácido L-glutâmico da forma α ou da forma β foram adicionados ao caldo de cultura como cristais secos da parte superior do fermentador de jarro, em uma quantidade variando de 0,008 a 1,0 (0,022 a 2,778 e g/litro com respeito à quantidade de meio no início da cultura), e a cultura foi continuada e terminada 36 horas depois do início da cultura. Uma quantidade considerável de cristais de ácido L-glutâmico precipitou no fermentador de jarro. Os cristais foram separados por decantação e secados durante a noite na temperatura ambiente. A forma cristalina (foram de retículo cristalino) dos cristais secos resultantes foi investigada pelo método de difração do pó de raio X. Os resultados estão apresentados na Tabela 1. O resultado de um experimento de controle no qual nenhum cristal foi adicionado durante a cultura também está apresentado na Tabela 1. TABELA 1 A partir dos resultados apresentados na Tabela 1, foi descoberto que o acúmuio de ácido L-glutâmico no momento do término da cultura quando cristais são adicionados foi aumentado comparado com quando absolutamente nenhum cristal é adicionado.

Da mesma forma, foi descoberto que se cristais de ácido L-glutâmico da forma α são adicionados, a proporção de precipitação de cristais do ácido L-glutâmico da forma α aumenta. Em particular, foi descoberto que se os cristais são adicionados em uma quantidade de 0,2 g/litro ou mais, os cristais de ácido L-glutâmico da forma α podem ser precipitados no meio com boa reprodutibilidade.

Claims

1. Método para produzir ácido L-glutâmico pela fermentação, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microorganismo pertencente ao gênero Enterobacter e tendo capacidade produtora de ácido L-glutâmico em um meio líquido, do qual o pH é ajustado a 5,0 ou menos, para permitir que o ácido L-glutâmico seja produzido e acumulado com a precipitação do ácido L-glutâmico associada, em que cristais de ácido L-glutâmico são adicionadas ao meio quando uma concentração de ácido L-glutâmico no meio é mais baixa do que a concentração na qual a cristalização espontânea ocorre.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os cristais são cristais a.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que uma quantidade dos cristais adicionados ao meio é 0,2 g/litro ou mais.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é Enterobacter agglomerans.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o microorganismo pode metabolizar uma fonte de carbono em um meio líquido contendo ácido L-glutâmico a uma concentração de saturação e a fonte de carbono, o meio líquido tendo um pH de 5 ou menos, e tem uma capacidade para acumular ácido L-glutâmico em uma quantidade que exceda a concentração de saturação do ácido L-glutâmico no meio líquido no pH.