CN1275620A - 发酵制备L－氨基酸的方法及编码accDA基因的核苷酸序列 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及编码accDA基因的核苷酸序列,及用棒杆菌经发酵制备L－氨基酸,尤其是L－赖氨酸的方法,在所述棒杆菌中accDA基因被扩增。
Description
本发明提供了编码accDA基因的核苷酸序列，及通过用其中accDA基因被扩增的棒杆菌发酵制备L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸的方法。
L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸用于动物饲料，人的内服药及制药工业。
已知那些氨基酸由棒状细菌，尤其是谷氨酸棒杆菌的菌株发酵生产。由于其非常之重要性，一直尝试改进制备方法。改进的方法可涉及与发酵过程相关的措施，如搅拌及氧补给，或营养培养基基的组分如发酵期糖的浓度，或如经离子交换层析加工产物形式，或微生物自身的内在性质。
为改进那些微生物的性质，可使用诱变，选择及突变体选择方法，以此获得对抗代谢物如赖氨酸同源物S-[2-氨乙基]-半胱氨酸有抗性的菌株，或在调节方面重要氨基酸的营养缺陷体，并产生L-氨基酸。
几年来，通过扩增氨基酸生物合成的各个基因，并研究对L-氨基酸生产的影响，重组DNA技术已被用于改进谷氨酸棒杆菌的L-氨基酸生产菌株。此方面的文章见于Kinoshita(“谷氨酸细菌”，见工业微生物学，Demain和Solomon编辑，Benjamin Cummings，英国伦敦，1985，115-142)，Hilliger(BioTec 2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸6，261-272(1994)，Jetten和Sinskey(Critical Reviews inBiotechnology 15，73-103(1995)和Sahm et al.(纽约科学院年报782，25-39(1996)。
乙酰辅酶A羧化酶催化乙酰辅酶A羧化为丙二酸单酰辅酶A。源自E.coli的此酶由4个亚单位组成。accB基因编码生物素羧基载体蛋白，accC基因编码生物素羧化酶，accA和accD基因编码转羧酶(Cronan和Rock，膜脂的生物合成，见《大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌》(F.C.Weidhardt编辑)1996，PP.612-636，美国微生物学会)，由于此酶羧化酰基辅酶A形式的酰基，因此其也称为酰基辅酶A羧化酶。
谷氨酸棒杆菌的accBC基因的的核苷酸序列已由Jager等测定(Archives of Microbiology 166，76-82(1996))，且通常可从欧洲分子生物学实验室(EMBL，Heidelberg，Germany)的数据库获得，登记号为U35023。accBC基因编码乙酰辅酶A羧化酶的携带生物素羧基载体蛋白结构域及生物素羧化酶结构域的亚单位。
本发明的目的是提供一种新的通过发酵制备L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸的改良方法。
L-氨基酸尤其L-赖氨酸用于动物的饲料，人内服药及制药工业。因而提供新改进的制备L-氨基酸的方法通常是令人感兴趣的。
应了解后文提及的任何L-赖氨酸或赖氨酸不只意味着其本体，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了来自棒杆菌的一优选重组DNA，其能在棒状微生物中复制，且至少含有示于SEQ ID NO：1的编码accDA基因的核苷酸序列。
本发明还提供了如权利要求1所述的能复制的DNA，其具有：
(i)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，
(ii)至少一个在遗传密码简并区内相应于(i)序列的序列，或
(iii)至少一个与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的序列，且任选地
(iv)在(i)内的中性有义突变。
本发明还提供了通过导入所述能复制的DNA而转化的棒状微生物，尤其棒杆菌属。
本发明还涉及用棒杆菌经发酵制备L-氨基酸的方法，所述棒杆菌尤其是已产生L-氨基酸，且其中编码accDA基因的核苷酸序列是扩增的，尤其是过量表达的。
最后，本发明还提供了一种在棒杆菌中，通过本发明的新accDA基因和已知accBC基因的联合过量表达而扩增酰基辅酶A羧化酶的方法。
在此，术语“扩增”指通过增加基因的拷贝数应用强启动子或应用编码具有高活性的相应酶的基因或任选的这些措施的结合，从而增加微生物中由相应DNA编码的一或多种酶的细胞内活性。
本发明提供的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素中，或从甘油和乙醇中生产L-氨基酸。尤其是棒状细菌特别是棒杆菌属。在棒杆菌属中，特别提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌属尤其谷氨酸棒杆菌的菌株是下列的已知野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌 ATTC13032
醋谷氨酸棒杆菌 ATTC15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌 ATTC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
黄色短杆菌 ATCC14067
乳发酵短杆菌 ATCC13869和
扩展短杆菌 ATCC14020及产生L-氨基酸的突变株以及由其产生的菌株如：
谷氨酸棒杆菌 FERM-P1709
黄色短杆菌 FERM-P1708
乳发酵短杆菌 FERM-P1712
谷氨酸棒杆菌 FERM 6463及
谷氨酸棒杆菌 FERM-P6464。
本发明人已成功地从谷氨酸棒杆菌中分离出新accDA基因。通过首先在E.coli中构建此微生物的基因文库，从谷氨酸棒杆菌中分离accDA基因或其它基因。基因文库的构建由通常熟知的教材或手册中的方法进行，例如Winnacker的名为《从基因到克隆，基因技术导论》(Verlag Chemie，Weinheim，德国，1990)的教科书，或Sambrook等的名为《分子克隆实验手册》(冷泉港实验室出版社，1989)的手册。一非常熟知的基因文库是由Kohara等(Cell 50，495-508(1987))在λ载体中构建的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子和普通遗传学252，255-265(1996))阐述了用粘粒载体SuperCos I(Wahl et al.，美国科学院院刊84，2160-2164)在E.coliK-12菌株NM 554(Raleigh et al.，核酸研究16，1563-1575(1988))中构建的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3)，317-326)阐述了用粘粒pHC 79(Hohn and Collins，基因11，291-298(1980))构建的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。E.coli中的谷氨酸棒杆菌的基因文库也可用如pBR322(Bolivar，生命科学25，807-818(1979))或pUC 9(Viera et al.，基因19，259-268(1982))的质粒构建。限制及重组缺陷的E.coli菌株是尤其合适的宿主。例如Grant等阐述的菌株DH5αmcr(美国科学院院刊87，4645-4649(1990))。用粘粒克隆的长DNA片段接着可被亚克隆入适于测序的通用载体，并随之测序，如Sanger等所述(美国科学院院刊74，5463-5467(1977))。
以此方式可获得源自谷氨酸棒杆菌的编码accDA基因的新DNA序列，且如SEQ ID NO：1是本发明的一部分。accDA基因的编码区(cds)在SEQ ID NO：2中示出。相应蛋白质的氨基酸序列也经上述方法衍生自本发明的DNA序列。所得accDA基因产物的氨基酸序列在SEQ ID NO：3中示出。
由于遗传密码的简并性，得自SEQ ID NO：1的编码DNA序列也是本发明的一部分。相似地，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，保守氨基酸取代，如在蛋白质中用甘氨酸和丙氨酸互换，或用天冬氨酸和谷氨酸互换，此互换本领域技术人员已知是有义突变，其不引起蛋白活性基本改变，即它们是中性的。也知在蛋白质N和/或C末端的改变基本上不削弱其功能，或者甚至能稳定蛋白质。本领域技术人员可在Ben-Bassat等(细菌学杂志169，751-757(1987))，O＇Regan等(基因77，237-251(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质3，240-247(1994))，Hochuli等(Bio/Technology 6，1321-1325(1988))及熟知的关于遗传及分子生物学的教材中发现关于此主题的信息。
本发明人已发现accDA基因在棒杆菌中的过量表达增进L-赖氨酸生产。
可以通过增加相应基因的拷贝数达到过量表达，或者可以突变位于结构基因上游的启动子和调节区。掺入结构基因上游的表达盒以相同的方式起作用。在发酵生产L-赖氨酸期间，通过以诱导型启动子的方式增加表达也是可能的。也可以通过延长mRNA寿命的方法改善表达。另外也可通过阻止酶蛋白质的降解增加酶活性。基因或者基因构建体可以以可变拷贝数存在于质粒中或者整合进染色体，并扩增。另外，基因的过量表达也可以通过改变营养培养基的组成与培养技术来完成。
在这一点上，本领域技术人员将会从以下文献中得到指导：Martin等(生物/技术5，137-146(1987))，Guerrero等(基因138，35-41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6，428-430(1988))，Eikmanns等(基因102，93-98(1991))，欧洲专利EPS O 472 869，美国专利4,601,893，Schwarzer和Piihler(生物/技术9，84-87(1991)，Reinscheid等(应用和环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001-1007(1993))，专利申请WO 96/15246，Malumbres等(基因134，15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891，Jensen和Hammer(生物技术和生物工程58，191-195(1998))，Makrides(微生物学回顾60：512-538(1996))和已知的遗传学与分子生物学教科书。
能过量表达accDA基因的质粒的一实例是pZ1accDA(图1)，其包含在菌株MH20-22B/pZ1accDA中。质粒pZ1accDA是E.coli-谷氨酸棒杆菌穿梭载体，其携带accDA基因并基于质粒pZ1(Menkel etal.，应用和环境微生物学55(3)，684-688(1989))。其他能在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒载体，如pEKEx1(Eikmanns et al.，基因102，93-98(1991))或pZ8-1(EP 0 375 889)可以相同方式应用。
本发明人也已发现除本发明的新accDA基因之外的已知accBC基因在棒杆菌中的过量表达也增进酰基辅酶A羧化酶的产生，accDA基因和accBC基因联合过量表达的质粒例如是pEK0accBCaccDA(图2)，质粒pEK0accBCaccDA是一E.coli-谷氨酸棒杆菌穿梭载体，其携带accBC和accDA基因，并基于质粒pEK0(Eikmanns et al.，基因102 93-98(1991))。其它能在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒载体，如pEKx1(Eikmanns et al.，基因102，93-98(1991))或pZ8-1(EP 0375 889)可以相同方式应用。
另外，对L-氨基酸生产有利的是不仅accDA基因而且一或多种生物合成途径的酶的过量表达，这样，例如对于L-赖氨酸的制备，有可能·同时过量表达编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP-B 0 197 335)，或·同时扩增赋予S-(2-氨乙基)-半胱氨酸抗性的DNA片段(EP-A 0 088 166)。另外，切断非所需二级反应以及过量表达accDA基因也可有利于L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸的生产(为产生相应的L-氨基酸可以更有利地阻断不需要的次级反应(Nakayama：″生产氨基酸的微生物的培育″，见《微生物产物的过量产生》，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编者)，学院出版社，伦敦，英国，1982)。
为生产L-赖氨酸，根据本发明制备的微生物可采用分批或流加方法或重复流加方法连续培养或不连续培养。已知培养方法总结在以下教科书中：Chmiel(Bioprozesstechnik 1.Einfhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
所使用的培养基必须完全满足特定菌株的需要。各种微生物的培养基在美国细菌学会的“普通细菌学方法手册”(华盛顿D.C.，美国)中有描述。可以利用的碳源包括糖和碳水化合物，如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素；油和脂肪，如大豆油，向日葵油，花生油和椰子油；脂肪酸，如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸；醇，如甘油和乙醇，以及有机酸，如乙酸。这些物质可以单独使用或者混合使用。可以利用的氮源包括含氮有机化合物，如蛋白胨，酵母膏，肉膏，麦芽汁，玉米浆，大豆粉和尿素；或者无机化合物，如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可以单独使用或者混合使用。可以利用的磷源是磷酸二氢钾或者磷酸氢二钾或者相应的含钠盐。培养基必须还含有生长必需的金属盐，如硫酸镁或者硫酸铁。最后，除了以上所述的物质外，对促生长必需的物质如氨基酸和维生素也可以使用。合适的前体也可以添加至培养基中。所述的营养物质可以以单批或者在培养期间适当流加至培养基中。
碱性化合物，如氢氧化钠，氢氧化钾，氨或氨水，或者酸性化合物，如磷酸或者硫酸，用来适当地控制培养物的pH值。消泡剂，如脂肪酸聚乙二醇酯，可以用来控制起泡。合适的选择性作用物质，如抗生素，可以添加至培养基中，以保持质粒稳定性。氧气或含氧的气体混合物，如空气，引入培养基，以保持需氧条件。培养温度通常从20℃至45℃，优选地为25℃至40℃。培养继续至形成最大量的所需L-氨基酸。这一目标通常在10小时至160小时之内实现。
L-赖氨酸可以采用阴离子交换层析和随后的茚三酮衍生化分析，如Spackman等所描述的(分析化学，30，1190(1958))。
下列微生物已经按照布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)：·谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pZ1accDA，保藏号为DSM 12785。·谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pEK0accBCaccDA，保藏号为DSM12787。
本发明的方法可用于经发酵棒杆菌制备L-氨基酸，尤其是L-天冬氨酸，L-天冬酰胺、L-高丝氨酸，L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸。其尤其用于制备L-赖氨酸。
实施例
通过以下实施例，对本发明进一步详加例证。
实施例1
accDA基因的克隆及测序。
如Bormann等(分子微生物学6(3)，317-326)所述，用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291-298(1980))构建谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。
将选择的粘粒用限制酶EcoRI和XhoI，根据限制酶生产者(Boehringer Mannheim)的指导进行消化。形成的DNA片段与也已用限制酶EcoRI和XhoI处理的载体pUC 18(Norrander et al.，基因26，101-106(1983))混合，在用T4 DNA连接酶处理后，克隆入E.coli菌株DH 5αmcr(Grant et al.，美国科学院院刊87，4645-4645(1990))，如Sambrook等所述(分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室)。如Sambrook等所述(分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室)，在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂上选择转化体。将质粒DNA从转化体中分离，并称之为pUCaccDA，然后用由Promega(Heidelberg，德国)提供的试剂盒(Erase-a-Base)，经外切核酸酶III消化制备亚克隆，将所述亚克隆通过Sanger等所述的双脱氧链终止测序法(美国科学院院刊74，5463-5467(1977))进行测序。测序是用自动阅读测序试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)进行。用Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)的自动激光荧光(A.L.F)测序仪进行凝胶电泳分析，用HUSAR软件程序包(Release 4.0，EMBL，Heidelberg，德国)分析所得核苷酸序列，此核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，对核苷酸序列的分析示出一1473碱基对的开放读框，其被称为accDA基因。谷氨酸棒杆菌的accDA基因编码484个氨基酸的多肽。
实施例2
accDA基因在谷氨酸棒杆菌中的表达
accDA基因被亚克隆入载体pZ1(Menkel et al.，应用和环境微生物学55，684-688(1989))中以在谷氨酸棒杆菌中表达，通过用限制酶ClaI切割质粒pUCaccDA(参见实施例1)进行亚克隆。如实施例1所述分离所得1.6kb片段，用Klenow聚合酶和碱性磷酸酶处理，并用于与预先已用ScaI线性化的pZ1连接。将连接混合物用于转化E.coli DH 5αmcr(Grant et al.，美国科学院院刊87，4645-4645(1990))，并在含卡那霉素(50μg/ml)的LB琼脂上选择转化体，得到7.7kb穿梭载体pZ1accDA(图1)。如Haynes所述(FEMS微生物学通讯61，329-334(1989))，通过电穿孔将其掺入菌株DSM 5715中，并在LBHIS琼脂上选择转化体(Liebl et al.，FEMS微生物学通讯65，299-304(1989))给出谷氨酸棒杆菌菌株DSM 5715/pZ1accDA。
实施例3
用菌株DSM 5715/pZ1accDA制备L-赖氨酸
在CgIII培养基(Keilnauer et al.，细菌学杂志175，5595-5603(1993))中预培养之后，将菌株DSM5715/pZ1accDA在生产培养基CgXII(Keilnauer et al.，细菌学杂志175，5595-5603(1993))中培养。加入4％的葡萄糖和50mg/l的硫酸卡那霉素。
在培养48小时后，测定在660nm的光密度以及产生的L-赖氨酸的浓度，试验结果见于表1。
表1
| 菌株 | OD | L-赖氨酸(g/l) |
| DSM 5715 | 31.4 | 7.2 |
| DSM 5715/pZ1accDA | 43.1 | 8.0 |
实施例4
accBC和accDA的联合表达
(i)构建表达载体pEK0accBC accDA
用限制酶AgeI和SmaI消化含accBC的质粒pWJ71(Jager et al.，Archives of Microbiology 166，76-82(1996))，然后用Klenow聚合酶和碱性磷酸酶处理。在一平行操作中，质粒pUCaccDA用EcoRI/XhoI消化，然后用Klenow聚合酶和碱性磷酸酶处理。如Sambrook等所述(分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室)，通过制备分离将携带accDA的2.1kb片段从琼脂糖凝胶中分离。将所述片段与已如上述制备的载体pWJ71连接，通过KpnI/SalI消化将携带accBCaccDA的4.6kb片段从所得质粒中切割出，并再经制备琼脂糖凝胶电泳分离。为将此片段与谷氨酸棒杆菌/E.coli穿梭载体pEK0(Eikmanns et al.，Gene 102，93-98(1991))连接，将pEK0用限制酶KpnI和SalI消化，然后用Klenow聚合酶和碱性磷酸酶处理。将此方法制备的载体与携带accBCaccDA的4.6kb片段连接。所得载体pEK0accBCaccDA示于图2。如实施例2所述，通过电穿孔将此载体掺入菌株ATCC13032，得到谷氨酸棒杆菌菌株ATCC 13032/pEK0accBCaccDA。
(ii)酰基辅酶A羧化酶活性的测定
在CGIII培养基(Keilhauer et al.，细菌学杂志175，5595-5603(1993))中预培养之后，将菌株谷氨酸棒杆菌ATCC13032/pEK0accBCaccDA在CGXII培养基中培养，该培养基见Keilhauer等所述(Keilhauer et al.，细菌学杂志175，5595-5603(1993))。经离心收集细胞，并将沉淀细胞用60mM Tris-HCl(pH7.2)洗一次，并在相同缓冲液中重悬浮，通过10分钟超声处理将细胞消化(Branson Sonifier W-250，Branson Sonic Power Co.Danbury，USA)然后在4℃离心30分钟分离出细胞碎片，并将上清液在酶测试中用作粗提物。酶测试的反应混合物含有60mM Tris-HCl(pH7.2)，65mM KHCO3，1mM ATP，1.5mM MgCl2，4mM酰基辅酶A(选择乙酰辅酶A或丙酰辅酶A)，和4mg粗提物，反应体积1ml。将测试混合物在30℃温育，然后在15，30，45及60秒取100μl样品，并通过HPLC分析(Kimura et al.，细菌学杂志179，7098-7102(1997))测定丙二酸单酰辅酶A或甲基丙二酸单酰辅酶A的浓度。如表2所示，菌株谷氨酸棒杆菌ATCC 13032/pEK0accBCaccDA呈现对乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的高酰基辅酶A羧化酶活性，而对照菌株对乙酰辅酶A和丙酰辅酶A仅呈低酰基辅酶A羧化酶活性。
表2.谷氨酸棒杆菌中酰基辅酶A羧化酶的比活性(μmol/min.mg蛋白)。
| 酰基辅酶A羧化酶对底物活性 | ||
| 菌株 | 乙酰辅酶A | 丙酰辅酶A |
| ATCC 13032/pEK0accBCaccDA | 0.048 | 0.124 |
| ATCC 13032/pEK0 | 0.011 | 0.018 |
本说明书有以下附图：图1：质粒pZ1accDA的图谱。图2：质粒pEK0accBCaccDA的图谱。
序列表<110>德古萨-于尔斯股份公司
于利希研究中心有限公司<120>发酵制备L-氨基酸的方法及编码accDA基因的核苷酸序列<130>990042BT<140><141><160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>2123<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>基因<222>(508)..(1980)<223>accDA<400>1ctcgagcggg agtcggtgat cggccactct ctaagcaatg ccggctttaa aataaagcaa 60cttatatgtt tctcaccaca tctggccgac gaccacgaag tatgttgtcg atcacagcta 120aacgtgtgaa tgtgaagtta cctaactcac attgcaatgc gatagcgatt tggaaaactc 180actcccccca atatcttaac ttaaacttaa aagtagtgtt ttacctgcat ttataaaagt 240tcccgatcta ccccctcttt accccgaaat accccttttg caaagattgc aaacacaaca 300gtgcaatagt taacgggctt cacacgtcac cattctgtcc ggttttaggc tatgttcggg 360acgtctaggc aaaaagtagt tttgtgagat gaaacgcata atccgtcatt ttttacgcaa 420tcgatagcct aaattgggct tagatcttcc gcctctaaat aggtatgcag agacattcga 480attaattaac aaagccattt ttcggccgtg gagaagcgtt ttccgactat ggtgtggggc 540atggaacaca cttcagcatt gacgctcata gactcggttt tggaccctga cagcttcatt 600tcttggaatg aaactcccca atatgacaac ctcaatcaag gctatgcaga gaccttggag 660cgggctcgaa gcaaggccaa atgcgatgaa tcggtaatta ctggagaagg caccgtggag 720ggcattccgg tagccgttat tttgtccgat ttttccttcc tcggcggttc tttgggcacg 780gtcgcgtcgg tgcgcatcat gaaggcgatt caccgcgcca cagagctgaa actcccactg 840ctggtctccc ctgcttccgg tggtgcgcgc atgcaggaag acaatcgagc ttttgtcatg 900atggtgtcca taaccgcggc tgtgcagcgt caccgcgagg cgcatttgcc gttcctggtg 960tatttgcgca atcccacgat gggtggcgcc atggcctcgt ggggttcatc tgggcatctc 1020acttttgcgg aacccggcgc gcagataggt ttcctgggtc ctcgcgtggt ggagttaacc 1080actgggcatg cgcttccaga cggtgtgcag caggcggaga atttggtgaa aactggtgtg 1140attgatggaa ttgtgtcgcc actccaattg cgtgcagcgg tggcaaaaac cctcaaggtt 1200attcagccgg tagaggcaac ggatcgtttt tctccaacaa ctcctggcgt ggcacttccg 1260gtgatggagg cgattgcgcg ttctcgtgac ccgcagaggc ctggaatcgg ggagattatg 1320gaaacgttgg gggcagacgt cgtcaagctt tctggtgcgc gtgctggcgc attgagcccg 1380gctgtgcgcg ttgccctggc gcgcatcggg ggccggcccg tggtgctgat tgggcaggat 1440cgccgcttca cgcttgggcc gcaggagctg cgttttgcgc gtcgtggcat ttcgctggcg 1500cgcgagctaa acctgccgat cgtgtccatc atcgacacct ccggcgccga attgtcgcag 1560gcggctgagg agctcggcat cgcaagctcg attgcgcgca ccttgtccaa gcttatcgac 1620gctcccctcc ccaccgtttc ggtcattatt ggtcagggcg ttggcggtgg cgcgctggcc 1680atgctgcccg ccgatctggt ctacgcggcc gaaaacgcgt ggctgtccgc attgccacca 1740gagggcgcct cggccatcct cttccgcgac accaaccacg ccgcggaaat catagagcga 1800caaggcgtgc aggcgcacgc acttttaagc caagggctta tcgacgggat cgtcgccgaa 1860accgagcact ttgttgaaga aattctcggc acaatcagca acgccctctc cgaattggat 1920aacaatccgg agagggcggg acgcgacagt cgcttcacac gatttgagcg tttagcgcag 1980taaagaaaat tatgcgctga tcaaatcgat gatgaacacc agggtacggc cagacagtgg 2040gtggccggaa ccctcagggc cgtaagcagc ctctggcgga atggtcagct gacgacgtcc 2100gccgaccttc atgcctggaa ttc 2123<210>2<211>1473<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(1)..(1473)<223>accDA<400>2gtg gag aag cgt ttt ccg act atg gtg tgg ggc atg gaa cac act tca 48Val Glu Lys Arg Phe Pro Thr Met Val Trp Gly Met Glu His Thr Ser1 5 10 15gca ttg acg ctc ata gac tcg gtt ttg gac cct gac agc ttc att tct 96Ala Leu Thr Leu Ile Asp Ser Val Leu Asp Pro Asp Ser Phe Ile Ser
20 25 30tgg aat gaa act ccc caa tat gac aac ctc aat caa ggc tat gca gag 144Trp Asn Glu Thr Pro Gln Tyr Asp Asn Leu Asn Gln Gly Tyr Ala Glu
35 40 45acc ttg gag cgg gct cga agc aag gcc aaa tgc gat gaa tcg gta att 192Thr Leu Glu Arg Ala Arg Ser Lys Ala Lys Cys Asp Glu Ser Val Ile
50 55 60act gga gaa ggc acc gtg gag ggc att ccg gta gcc gtt att ttg tcc 240Thr Gly Glu Gly Thr Val Glu Gly Ile Pro Val Ala Val Ile Leu Ser65 70 75 80gat ttt tcc ttc ctc ggc ggt tct ttg ggc acg gtc gcg tcg gtg cgc 288Asp Phe Ser Phe Leu Gly Gly Ser Leu Gly Thr Val Ala Ser Val Arg
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100 105 110gtc tcc cct gct tcc ggt ggt gcg cgc atg cag gaa gac aat cga gct 384Val Ser Pro Ala Ser Gly Gly Ala Arg Met Gln Glu Asp Asn Arg Ala
115 120 125ttt gtc atg atg gtg tcc ata acc gcg gct gtg cag cgt cac cgc gag 432Phe Val Met Met Val Ser Ile Thr Ala Ala Val Gln Arg His Arg Glu
130 135 140gcg cat ttg ccg ttc ctg gtg tat ttg cgc aat ccc acg atg ggt ggc 480Ala His Leu Pro Phe Leu Val Tyr Leu Arg Asn Pro Thr Met Gly Gly145 150 155 160gcc atg gcc tcg tgg ggt tca tct ggg cat ctc act ttt gcg gaa ccc 528Ala Met Ala Ser Trp Gly Ser Ser Gly His Leu Thr Phe Ala Glu Pro
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180 185 190ggg cat gcg ctt cca gac ggt gtg cag cag gcg gag aat ttg gtg aaa 624Gly His Ala Leu Pro Asp Gly Val Gln Gln Ala Glu Asn Leu Val Lys
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210 215 220gtg gca aaa acc ctc aag gtt att cag ccg gta gag gca acg gat cgt 720Val Ala Lys Thr Leu Lys Val Ile Gln Pro Val Glu Ala Thr Asp Arg225 230 235 240ttt tct cca aca act cct ggc gtg gca ctt ccg gtg atg gag gcg att 768Phe Ser Pro Thr Thr Pro Gly Val Ala Leu Pro Val Met Glu Ala Ile
245 250 255gcg cgt tct cgt gac ccg cag agg cct gga atc ggg gag att atg gaa 816Ala Arg Ser Arg Asp Pro Gln Arg Pro Gly Ile Gly Glu Ile Met Glu
260 265 270acg ttg ggg gca gac gtc gtc aag ctt tct ggt gcg cgt gct ggc gca 864Thr Leu Gly Ala Asp Val Val Lys Leu Ser Gly Ala Arg Ala Gly Ala
275 280 285ttg agc ccg gct gtg cgc gtt gcc ctg gcg cgc atc ggg ggc cgg ccc 912Leu Ser Pro Ala Val Arg Val Ala Leu Ala Arg Ile Gly Gly Arg Pro
290 295 300gtg gtg ctg att ggg cag gat cgc cgc ttc acg ctt ggg ccg cag gag 960Val Val Leu Ile Gly Gln Asp Arg Arg Phe Thr Leu Gly Pro Gln Glu305 310 315 320ctg cgt ttt gcg cgt cgt ggc att tcg ctg gcg cgc gag cta aac ctg 1008Leu Arg Phe Ala Arg Arg Gly Ile Ser Leu Ala Arg Glu Leu Asn Leu
325 330 335ccg atc gtg tcc atc atc gac acc tcc ggc gcc gaa ttg tcg cag gcg 1056Pro Ile Val Ser Ile Ile Asp Thr Ser Gly Ala Glu Leu Ser Gln Ala
340 345 350gct gag gag ctc ggc atc gca agc tcg att gcg cgc acc ttg tcc aag 1104Ala Glu Glu Leu Gly Ile Ala Ser Ser Ile Ala Arg Thr Leu Ser Lys
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370 375 380gtt ggc ggt ggc gcg ctg gcc atg ctg ccc gcc gat ctg gtc tac gcg 1200Val Gly Gly Gly Ala Leu Ala Met Leu Pro Ala Asp Leu Val Tyr Ala385 390 395 400gcc gaa aac gcg tgg ctg tcc gca ttg cca cca gag ggc gcc tcg gcc 1248Ala Glu Asn Ala Trp Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ala
405 410 415atc ctc ttc cgc gac acc aac cac gcc gcg gaa atc ata gag cga caa 1296Ile Leu Phe Arg Asp Thr Asn His Ala Ala Glu Ile Ile Glu Arg Gln
420 425 430ggc gtg cag gcg cac gca ctt tta agc caa ggg ctt atc gac ggg atc 1344Gly Val Gln Ala His Ala Leu Leu Ser Gln Gly Leu Ile Asp Gly Ile
435 440 445gtc gcc gaa acc gag cac ttt gtt gaa gaa att ctc ggc aca atc agc 1392Val Ala Glu Thr Glu His Phe Val Glu Glu Ile Leu Gly Thr Ile Ser
450 455 460aac gcc ctc tcc gaa ttg gat aac aat ccg gag agg gcg gga cgc gac 1440Asn Ala Leu Ser Glu Leu Asp Asn Asn Pro Glu Arg Ala Gly Arg Asp465 470 475 480agt cgc ttc aca cga ttt gag cgt tta gcg cag 1473Ser Arg Phe Thr Arg Phe Glu Arg Leu Ala Gln
485 490<210>3<211>491<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>3Val Glu Lys Arg Phe Pro Thr Met Val Trp Gly Met Glu His Thr Ser1 5 10 15Ala Leu Thr Leu Ile Asp Ser Val Leu Asp Pro Asp Ser Phe Ile Ser
20 25 30Trp Asn Glu Thr Pro Gln Tyr Asp Asn Leu Asn Gln Gly Tyr Ala Glu
35 40 45Thr Leu Glu Arg Ala Arg Ser Lys Ala Lys Cys Asp Glu Ser Val Ile
50 55 60Thr Gly Glu Gly Thr Val Glu Gly Ile Pro Val Ala Val Ile Leu Ser65 70 75 80Asp Phe Ser Phe Leu Gly Gly Ser Leu Gly Thr Val Ala Ser Val Arg
85 90 95Ile Met Lys Ala Ile His Arg Ala Thr Glu Leu Lys Leu Pro Leu Leu
100 105 110Val Ser Pro Ala Ser Gly Gly Ala Arg Met Gln Glu Asp Asn Arg Ala
115 120 125Phe Val Met Met Val Ser Ile Thr Ala Ala Val Gln Arg His Arg Glu
130 135 140Ala His Leu Pro Phe Leu Val Tyr Leu Arg Asn Pro Thr Met Gly Gly145 150 155 160Ala Met Ala Ser Trp Gly Ser Ser Gly His Leu Thr Phe Ala Glu Pro
165 170 175Gly Ala Gln Ile Gly Phe Leu Gly Pro Arg Val Val Glu Leu Thr Thr
180 185 190Gly His Ala Leu Pro Asp Gly Val Gln Gln Ala Glu Asn Leu Val Lys
195 200 205Thr Gly Val Ile Asp Gly Ile Val Ser Pro Leu Gln Leu Arg Ala Ala
210 215 220Val Ala Lys Thr Leu Lys Val Ile Gln Pro Val Glu Ala Thr Asp Arg225 230 235 240Phe Ser Pro Thr Thr Pro Gly Val Ala Leu Pro Val Met Glu Ala Ile
245 250 255Ala Arg Ser Arg Asp Pro Gln Arg Pro Gly Ile Gly Glu Ile Met Glu
260 265 270Thr Leu Gly Ala Asp Val Val Lys Leu Ser Gly Ala Arg Ala Gly Ala
275 280 285Leu Ser Pro Ala Val Arg Val Ala Leu Ala Arg Ile Gly Gly Arg Pro
290 295 300Val Val Leu Ile Gly Gln Asp Arg Arg Phe Thr Leu Gly Pro Gln Glu305 310 315 320Leu Arg Phe Ala Arg Arg Gly Ile Ser Leu Ala Arg Glu Leu Asn Leu
325 330 335Pro Ile Val Ser Ile Ile Asp Thr Ser Gly Ala Glu Leu Ser Gln Ala
340 345 350Ala Glu Glu Leu Gly Ile Ala Ser Ser Ile Ala Arg Thr Leu Ser Lys
355 360 365Leu Ile Asp Ala Pro Leu Pro Thr Val Ser Val Ile Ile Gly Gln Gly
370 375 380Val Gly Gly Gly Ala Leu Ala Met Leu Pro Ala Asp Leu Val Tyr Ala385 390 395 400Ala Glu Asn Ala Trp Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ala
405 410 415Ile Leu Phe Arg Asp Thr Asn His Ala Ala Glu Ile Ile Glu Arg Gln
420 425 430Gly Val Gln Ala His Ala Leu Leu Ser Gln Gly Leu Ile Asp Gly Ile
435 440 445Val Ala Glu Thr Glu His Phe Val Glu Glu Ile Leu Gly Thr Ile Ser
450 455 460Asn Ala Leu Ser Glu Leu Asp Asn Asn Pro Glu Arg Ala Gly Arg Asp465 470 475 480
26Ser Arg Phe Thr Arg Phe Glu Arg Leu Ala Gln
485 490
Claims (16)
1、源自棒杆菌并能在棒状微生物中复制并至少含有SEQ IDNO.1所示编码accDA基因的核苷酸序列的优选地重组的DNA。
2、如权利要求1的能复制的DNA，其具有：
(i)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，
(ii)至少一个在遗传密码简并区内相应于(i)序列的序列，或
(iii)至少一个与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的序列，且任选地
(iv)在(i)内的中性有义突变。
3、衍生自如权利要求1或2的核苷酸序列的蛋白质氨基酸序列，如SEQ ID NO.3所示。
4、通过导入一或多个如权利要求1或2的能复制的DNA而转化的棒状微生物，尤其是棒杆菌属。
5、具有如图1所示限制图谱的穿梭载体pZ1accD，保藏在谷氨酸棒杆菌中，保藏号DSM 12785。
6、一种通过棒杆菌的发酵制备L-氨基酸，尤其L-赖氨酸的方法，其中所用细菌中，accDA基因或编码其的核苷酸序列被扩增，且尤其是过量表达的。
7、如权利要求6的方法，其中所用细菌中，所需L-氨基酸的生物合成途径的其它基因被额外扩增。
8、如权利要求6的方法，其中所用细菌中，降低所需L-氨基酸生成的代谢途径至少被部分阻断。
9、如权利要求6-8的方法，其中使用质粒载体转化的菌株，且此载体携带编码accDA基因的核苷酸序列。
10、如权利要求9的方法，其中应用的是用质粒载体pZ1accDA转化的细菌，该质粒保藏在谷氨酸棒杆菌中，保藏号DSM 12785。
11、如前述一或多条权利要求的方法，其中应用产生L-天冬氨酸，L-天冬酰胺，L-高丝氨酸，L-苏氨酸，L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸的棒杆菌。
12、如权利要求6-10的一或多条要求的方法，其中应用产生L-赖氨酸的棒杆菌。
13、如权利要求6-11的一或多条要求的方法，其中除了accDA基因之外，accBC基因也是过量表达的。
14、如权利要求6的方法，其中编码二氢-2，6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因是同时过量表达的。
15、如权利要求6的方法，其中赋予S-(2-氨乙基)半胱氨酸抗性的DNA片段同时被扩增。
16、如前述一或多条权利要求的经发酵制备L-氨基酸的方法，其中进行以下步骤：
a)发酵产生所需L-氨基酸的棒杆菌，其中至少accDA基因被扩增，
b)在培养基中或在细菌的细胞中富集所需L-氨基酸，
c)分离所需氨基酸。
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| PB01 | Publication | ||
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: DEGUSSA Free format text: FORMER OWNER: DEGUSSA-HUELS AG |
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| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20030716 Address after: Dusseldorf, Germany Applicant after: Degussa AG Co-applicant after: Forschungszentrum Juelich Gmbh Address before: Federal Republic of Germany, Frankfurt on the riverside Applicant before: Degussa-Yuls Co., Ltd. Co-applicant before: Forschungszentrum Juelich Gmbh |
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |