KR20010049429A

KR20010049429A - 발효에 의한 Ｌ-아미노산의 제조 방법 및 ａｃｃＤＡ유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열

Info

Publication number: KR20010049429A
Application number: KR1020000028677A
Authority: KR
Inventors: 틸크이폰네; 에겔링로타르; 아이크만스베른하르트; 삼헤르만; 멕켈베티나
Original assignee: 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트; 아달베르트 베. 플라텐타이히, 하; 포르슝스젠트룸 율리히 게엠베하
Priority date: 1999-05-27
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2001-06-15
Also published as: US6808914B2; EP1055725A3; BR0002493A; ZA200002658B; HU0002022D0; CA2307327A1; EP1055725A2; CN1275620A; AU3644900A; ID26143A; EP1055725B1; HUP0002022A2; US6361986B1; DE50004129D1; SK7442000A3; ATE252635T1; US20020142405A1; JP2001008693A; ES2208178T3; DE19924365A1

Abstract

본 발명은 accDA 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 accDA 유전자가 증폭되는 코리네박테리아를 사용하는 발효에 의한 L-아미노산, 특히 L-리신의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

발효에 의한 Ｌ-아미노산의 제조 방법 및 ａｃｃＤＡ 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열{Process for the preparation of L-amino acids by fermentation and nucleotide sequences coding for the accDA gene}

〈110〉 Degussa-Huls Aktiengesellschaft

Forschungszentrum Julich GmbH

〈120〉 Process for the preparation of L-amino acids by fermentation and

nucleotide sequences coding for the accDA gene

〈130〉 5-1999-024333-4; 5-1998-082611-0

〈150〉 DE 199 24 365.4

〈151〉 1999-05-27

〈160〉 3

〈170〉 KOPATIN 1.5

〈210〉 1

〈211〉 2123

〈212〉 DNA

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈220〉

〈221〉 gene

〈222〉 (508)..(1980)

〈223〉 accDA

〈400〉 1

ctcgagcggg agtcggtgat cggccactct ctaagcaatg ccggctttaa aataaagcaa 60

cttatatgtt tctcaccaca tctggccgac gaccacgaag tatgttgtcg atcacagcta 120

aacgtgtgaa tgtgaagtta cctaactcac attgcaatgc gatagcgatt tggaaaactc 180

actcccccca atatcttaac ttaaacttaa aagtagtgtt ttacctgcat ttataaaagt 240

tcccgatcta ccccctcttt accccgaaat accccttttg caaagattgc aaacacaaca 300

gtgcaatagt taacgggctt cacacgtcac cattctgtcc ggttttaggc tatgttcggg 360

acgtctaggc aaaaagtagt tttgtgagat gaaacgcata atccgtcatt ttttacgcaa 420

tcgatagcct aaattgggct tagatcttcc gcctctaaat aggtatgcag agacattcga 480

attaattaac aaagccattt ttcggccgtg gagaagcgtt ttccgactat ggtgtggggc 540

atggaacaca cttcagcatt gacgctcata gactcggttt tggaccctga cagcttcatt 600

tcttggaatg aaactcccca atatgacaac ctcaatcaag gctatgcaga gaccttggag 660

cgggctcgaa gcaaggccaa atgcgatgaa tcggtaatta ctggagaagg caccgtggag 720

ggcattccgg tagccgttat tttgtccgat ttttccttcc tcggcggttc tttgggcacg 780

gtcgcgtcgg tgcgcatcat gaaggcgatt caccgcgcca cagagctgaa actcccactg 840

ctggtctccc ctgcttccgg tggtgcgcgc atgcaggaag acaatcgagc ttttgtcatg 900

atggtgtcca taaccgcggc tgtgcagcgt caccgcgagg cgcatttgcc gttcctggtg 960

tatttgcgca atcccacgat gggtggcgcc atggcctcgt ggggttcatc tgggcatctc 1020

acttttgcgg aacccggcgc gcagataggt ttcctgggtc ctcgcgtggt ggagttaacc 1080

actgggcatg cgcttccaga cggtgtgcag caggcggaga atttggtgaa aactggtgtg 1140

attgatggaa ttgtgtcgcc actccaattg cgtgcagcgg tggcaaaaac cctcaaggtt 1200

attcagccgg tagaggcaac ggatcgtttt tctccaacaa ctcctggcgt ggcacttccg 1260

gtgatggagg cgattgcgcg ttctcgtgac ccgcagaggc ctggaatcgg ggagattatg 1320

gaaacgttgg gggcagacgt cgtcaagctt tctggtgcgc gtgctggcgc attgagcccg 1380

gctgtgcgcg ttgccctggc gcgcatcggg ggccggcccg tggtgctgat tgggcaggat 1440

cgccgcttca cgcttgggcc gcaggagctg cgttttgcgc gtcgtggcat ttcgctggcg 1500

cgcgagctaa acctgccgat cgtgtccatc atcgacacct ccggcgccga attgtcgcag 1560

gcggctgagg agctcggcat cgcaagctcg attgcgcgca ccttgtccaa gcttatcgac 1620

gctcccctcc ccaccgtttc ggtcattatt ggtcagggcg ttggcggtgg cgcgctggcc 1680

atgctgcccg ccgatctggt ctacgcggcc gaaaacgcgt ggctgtccgc attgccacca 1740

gagggcgcct cggccatcct cttccgcgac accaaccacg ccgcggaaat catagagcga 1800

caaggcgtgc aggcgcacgc acttttaagc caagggctta tcgacgggat cgtcgccgaa 1860

accgagcact ttgttgaaga aattctcggc acaatcagca acgccctctc cgaattggat 1920

aacaatccgg agagggcggg acgcgacagt cgcttcacac gatttgagcg tttagcgcag 1980

taaagaaaat tatgcgctga tcaaatcgat gatgaacacc agggtacggc cagacagtgg 2040

gtggccggaa ccctcagggc cgtaagcagc ctctggcgga atggtcagct gacgacgtcc 2100

gccgaccttc atgcctggaa ttc 2123

〈210〉 2

〈211〉 1473

〈212〉 DNA

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈220〉

〈221〉 CDS

〈222〉 (1)..(1473)

〈223〉 accDA

〈400〉 2

gtg gag aag cgt ttt ccg act atg gtg tgg ggc atg gaa cac act tca 48

Val Glu Lys Arg Phe Pro Thr Met Val Trp Gly Met Glu His Thr Ser

1 5 10 15

gca ttg acg ctc ata gac tcg gtt ttg gac cct gac agc ttc att tct 96

Ala Leu Thr Leu Ile Asp Ser Val Leu Asp Pro Asp Ser Phe Ile Ser

20 25 30

tgg aat gaa act ccc caa tat gac aac ctc aat caa ggc tat gca gag 144

Trp Asn Glu Thr Pro Gln Tyr Asp Asn Leu Asn Gln Gly Tyr Ala Glu

35 40 45

acc ttg gag cgg gct cga agc aag gcc aaa tgc gat gaa tcg gta att 192

Thr Leu Glu Arg Ala Arg Ser Lys Ala Lys Cys Asp Glu Ser Val Ile

50 55 60

act gga gaa ggc acc gtg gag ggc att ccg gta gcc gtt att ttg tcc 240

Thr Gly Glu Gly Thr Val Glu Gly Ile Pro Val Ala Val Ile Leu Ser

65 70 75 80

gat ttt tcc ttc ctc ggc ggt tct ttg ggc acg gtc gcg tcg gtg cgc 288

Asp Phe Ser Phe Leu Gly Gly Ser Leu Gly Thr Val Ala Ser Val Arg

85 90 95

atc atg aag gcg att cac cgc gcc aca gag ctg aaa ctc cca ctg ctg 336

Ile Met Lys Ala Ile His Arg Ala Thr Glu Leu Lys Leu Pro Leu Leu

100 105 110

gtc tcc cct gct tcc ggt ggt gcg cgc atg cag gaa gac aat cga gct 384

Val Ser Pro Ala Ser Gly Gly Ala Arg Met Gln Glu Asp Asn Arg Ala

115 120 125

ttt gtc atg atg gtg tcc ata acc gcg gct gtg cag cgt cac cgc gag 432

Phe Val Met Met Val Ser Ile Thr Ala Ala Val Gln Arg His Arg Glu

130 135 140

gcg cat ttg ccg ttc ctg gtg tat ttg cgc aat ccc acg atg ggt ggc 480

Ala His Leu Pro Phe Leu Val Tyr Leu Arg Asn Pro Thr Met Gly Gly

145 150 155 160

gcc atg gcc tcg tgg ggt tca tct ggg cat ctc act ttt gcg gaa ccc 528

Ala Met Ala Ser Trp Gly Ser Ser Gly His Leu Thr Phe Ala Glu Pro

165 170 175

ggc gcg cag ata ggt ttc ctg ggt cct cgc gtg gtg gag tta acc act 576

Gly Ala Gln Ile Gly Phe Leu Gly Pro Arg Val Val Glu Leu Thr Thr

180 185 190

ggg cat gcg ctt cca gac ggt gtg cag cag gcg gag aat ttg gtg aaa 624

Gly His Ala Leu Pro Asp Gly Val Gln Gln Ala Glu Asn Leu Val Lys

195 200 205

act ggt gtg att gat gga att gtg tcg cca ctc caa ttg cgt gca gcg 672

Thr Gly Val Ile Asp Gly Ile Val Ser Pro Leu Gln Leu Arg Ala Ala

210 215 220

gtg gca aaa acc ctc aag gtt att cag ccg gta gag gca acg gat cgt 720

Val Ala Lys Thr Leu Lys Val Ile Gln Pro Val Glu Ala Thr Asp Arg

225 230 235 240

ttt tct cca aca act cct ggc gtg gca ctt ccg gtg atg gag gcg att 768

Phe Ser Pro Thr Thr Pro Gly Val Ala Leu Pro Val Met Glu Ala Ile

245 250 255

gcg cgt tct cgt gac ccg cag agg cct gga atc ggg gag att atg gaa 816

Ala Arg Ser Arg Asp Pro Gln Arg Pro Gly Ile Gly Glu Ile Met Glu

260 265 270

acg ttg ggg gca gac gtc gtc aag ctt tct ggt gcg cgt gct ggc gca 864

Thr Leu Gly Ala Asp Val Val Lys Leu Ser Gly Ala Arg Ala Gly Ala

275 280 285

ttg agc ccg gct gtg cgc gtt gcc ctg gcg cgc atc ggg ggc cgg ccc 912

Leu Ser Pro Ala Val Arg Val Ala Leu Ala Arg Ile Gly Gly Arg Pro

290 295 300

gtg gtg ctg att ggg cag gat cgc cgc ttc acg ctt ggg ccg cag gag 960

Val Val Leu Ile Gly Gln Asp Arg Arg Phe Thr Leu Gly Pro Gln Glu

305 310 315 320

ctg cgt ttt gcg cgt cgt ggc att tcg ctg gcg cgc gag cta aac ctg 1008

Leu Arg Phe Ala Arg Arg Gly Ile Ser Leu Ala Arg Glu Leu Asn Leu

325 330 335

ccg atc gtg tcc atc atc gac acc tcc ggc gcc gaa ttg tcg cag gcg 1056

Pro Ile Val Ser Ile Ile Asp Thr Ser Gly Ala Glu Leu Ser Gln Ala

340 345 350

gct gag gag ctc ggc atc gca agc tcg att gcg cgc acc ttg tcc aag 1104

Ala Glu Glu Leu Gly Ile Ala Ser Ser Ile Ala Arg Thr Leu Ser Lys

355 360 365

ctt atc gac gct ccc ctc ccc acc gtt tcg gtc att att ggt cag ggc 1152

Leu Ile Asp Ala Pro Leu Pro Thr Val Ser Val Ile Ile Gly Gln Gly

370 375 380

gtt ggc ggt ggc gcg ctg gcc atg ctg ccc gcc gat ctg gtc tac gcg 1200

Val Gly Gly Gly Ala Leu Ala Met Leu Pro Ala Asp Leu Val Tyr Ala

385 390 395 400

gcc gaa aac gcg tgg ctg tcc gca ttg cca cca gag ggc gcc tcg gcc 1248

Ala Glu Asn Ala Trp Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ala

405 410 415

atc ctc ttc cgc gac acc aac cac gcc gcg gaa atc ata gag cga caa 1296

Ile Leu Phe Arg Asp Thr Asn His Ala Ala Glu Ile Ile Glu Arg Gln

420 425 430

ggc gtg cag gcg cac gca ctt tta agc caa ggg ctt atc gac ggg atc 1344

Gly Val Gln Ala His Ala Leu Leu Ser Gln Gly Leu Ile Asp Gly Ile

435 440 445

gtc gcc gaa acc gag cac ttt gtt gaa gaa att ctc ggc aca atc agc 1392

Val Ala Glu Thr Glu His Phe Val Glu Glu Ile Leu Gly Thr Ile Ser

450 455 460

aac gcc ctc tcc gaa ttg gat aac aat ccg gag agg gcg gga cgc gac 1440

Asn Ala Leu Ser Glu Leu Asp Asn Asn Pro Glu Arg Ala Gly Arg Asp

465 470 475 480

agt cgc ttc aca cga ttt gag cgt tta gcg cag 1473

Ser Arg Phe Thr Arg Phe Glu Arg Leu Ala Gln

485 490

〈210〉 3

〈211〉 491

〈212〉 PRT

〈213〉 Corynebacterium glutamicum

〈400〉 3

Val Glu Lys Arg Phe Pro Thr Met Val Trp Gly Met Glu His Thr Ser

1 5 10 15

Ala Leu Thr Leu Ile Asp Ser Val Leu Asp Pro Asp Ser Phe Ile Ser

20 25 30

Trp Asn Glu Thr Pro Gln Tyr Asp Asn Leu Asn Gln Gly Tyr Ala Glu

35 40 45

Thr Leu Glu Arg Ala Arg Ser Lys Ala Lys Cys Asp Glu Ser Val Ile

50 55 60

Thr Gly Glu Gly Thr Val Glu Gly Ile Pro Val Ala Val Ile Leu Ser

65 70 75 80

Asp Phe Ser Phe Leu Gly Gly Ser Leu Gly Thr Val Ala Ser Val Arg

85 90 95

Ile Met Lys Ala Ile His Arg Ala Thr Glu Leu Lys Leu Pro Leu Leu

100 105 110

Val Ser Pro Ala Ser Gly Gly Ala Arg Met Gln Glu Asp Asn Arg Ala

115 120 125

Phe Val Met Met Val Ser Ile Thr Ala Ala Val Gln Arg His Arg Glu

130 135 140

Ala His Leu Pro Phe Leu Val Tyr Leu Arg Asn Pro Thr Met Gly Gly

145 150 155 160

Ala Met Ala Ser Trp Gly Ser Ser Gly His Leu Thr Phe Ala Glu Pro

165 170 175

Gly Ala Gln Ile Gly Phe Leu Gly Pro Arg Val Val Glu Leu Thr Thr

180 185 190

Gly His Ala Leu Pro Asp Gly Val Gln Gln Ala Glu Asn Leu Val Lys

195 200 205

Thr Gly Val Ile Asp Gly Ile Val Ser Pro Leu Gln Leu Arg Ala Ala

210 215 220

Val Ala Lys Thr Leu Lys Val Ile Gln Pro Val Glu Ala Thr Asp Arg

225 230 235 240

Phe Ser Pro Thr Thr Pro Gly Val Ala Leu Pro Val Met Glu Ala Ile

245 250 255

Ala Arg Ser Arg Asp Pro Gln Arg Pro Gly Ile Gly Glu Ile Met Glu

260 265 270

Thr Leu Gly Ala Asp Val Val Lys Leu Ser Gly Ala Arg Ala Gly Ala

275 280 285

Leu Ser Pro Ala Val Arg Val Ala Leu Ala Arg Ile Gly Gly Arg Pro

290 295 300

Val Val Leu Ile Gly Gln Asp Arg Arg Phe Thr Leu Gly Pro Gln Glu

305 310 315 320

Leu Arg Phe Ala Arg Arg Gly Ile Ser Leu Ala Arg Glu Leu Asn Leu

325 330 335

Pro Ile Val Ser Ile Ile Asp Thr Ser Gly Ala Glu Leu Ser Gln Ala

340 345 350

Ala Glu Glu Leu Gly Ile Ala Ser Ser Ile Ala Arg Thr Leu Ser Lys

355 360 365

Leu Ile Asp Ala Pro Leu Pro Thr Val Ser Val Ile Ile Gly Gln Gly

370 375 380

Val Gly Gly Gly Ala Leu Ala Met Leu Pro Ala Asp Leu Val Tyr Ala

385 390 395 400

Ala Glu Asn Ala Trp Leu Ser Ala Leu Pro Pro Glu Gly Ala Ser Ala

405 410 415

Ile Leu Phe Arg Asp Thr Asn His Ala Ala Glu Ile Ile Glu Arg Gln

420 425 430

Gly Val Gln Ala His Ala Leu Leu Ser Gln Gly Leu Ile Asp Gly Ile

435 440 445

Val Ala Glu Thr Glu His Phe Val Glu Glu Ile Leu Gly Thr Ile Ser

450 455 460

Asn Ala Leu Ser Glu Leu Asp Asn Asn Pro Glu Arg Ala Gly Arg Asp

465 470 475 480

Ser Arg Phe Thr Arg Phe Glu Arg Leu Ala Gln

485 490

본 발명은 accDA 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 accDA 유전자가 증폭되어진 코리네박테리아(corynebacteria)를 사용하는 발효에 의한 L-아미노산, 특히 L-리신의 제조 방법을 제공한다.

L-아미노산, 특히 L-리신은 동물 사료, 사람의 의약품 및 약제 산업에 사용된다.

공지된 바와 같이, 이들 아미노산은 코리네박테리아 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 발효에 의해 생성된다. 이들의 지대한 중요성 때문에, 상기 제조 방법을 개선하기 위한 시도가 계속적으로 행해지고 있다. 상기 방법에 대한 개선은, 발효 기술(예: 교반 및 산소 공급), 영양 배지의 조성(예: 발효중의 당의 농도), 제품 형으로의 후처리(예: 이온 교환 크로마토그래피), 또는 미생물 자체의 고유 생산성 특징과 관련된 수단에 관한 것이다.

이들 미생물의 생산성 특징은, 돌연변이유발법, 선별법 및 돌연변이체 선택법을 사용하여, 항대사물질(예: 리신 동족체 S-(2-아미노에틸)시스테인)에 내성을 갖거나 중요한 조절 아미노산에 대한 영양요구성이며, L-아미노산을 생산하는 균주를 수득함으로써 개선될 수 있다.

각각의 아미노산 생합성 유전자를 증폭시키고 L-리신 생성에 미치는 효과를 연구하여 L-아미노산 생산-코리네박테리움 균주를 개량하기 위해, 수 년간 재조합 DNA 기술을 사용하여 왔다. 이에 관한 연구 결과가 특히 다음 문헌[Kinoshita, "Glutamic Acid Bacteria" in : Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamin Chummings, London, UK, 1985, 115-142; Hilliger(BioTec 2, 40-44 (1991); Eggeling (Amino Acids 6, 261-272 (1994); Jetten and Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995); Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)]에 공개되어 있다.

효소 아세틸-CoA 카복실라제는 아세틸-CoA의 말로닐-CoA로의 카복실화를 촉매화한다. 에스체리키아 콜라이(Escherichia coli)로 부터의 상기 효소는 4개의 아단위로 이루어진다. accB 유전자는 비오틴 카복실 운반체 단백질을 암호화하고, accC 유전자는 비오틴 카복실라제를 암호화하고, accA 및 accD 유전자는 트랜스카복실라제를 암호화한다[참조: Cronan and Rock, Biosynthesis of Membrane Lipids, in: Escherichia coli and Salmonella typhimurium (ed. F.C. Neidhardt), 1996, pp. 612-636, American Scociety for Microbiology]. 아실-CoA 형태로 아실 그룹을 카복실화하는 효소의 특성 때문에, 이를 아실-CoA 카복실라제로 칭한다.

코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터의 accBC 유전자의 뉴클레오티드 서열이 야거(Jager) 등[참조 문헌: Archives of Microbiology 166, 76-82 (1996)]에 의해 판정되었고, 일반적으로 독일 하이델베르크에 소재하는 European Molecular Biologies Laboratories(EMBL)의 데이타 뱅크로 부터 수탁 번호 제U35023호로 구입할 수 있다. accBC 유전자는, 비오틴 카복실 운반체 단백질 도메인 및 비오틴 카복실라제 도메인을 수반하는 아세틸-CoA 카복실라제의 아단위를 암호화한다.

본 발명자들이 이루고자 하는 목적은 발효에 의해 L-아미노산, 특히 L-리신의 제법을 개선한 새로운 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 플라스미드 pZ1accDA의 지도이다.

도 2는 플라스미드 pEK0accBCaccDA의 지도이다.

L-아미노산은 동물의 사료, 사람의 의약 및 약제 산업에서 사용된다. 따라서, L-아미노산의 제법을 개선한 새로운 방법을 제공하는 것은 일반적으로 중요하다.

후술되는 본원의 내용중에 L-리신 또는 리신이 언급되는 경우, 염기 뿐 아니라 염, 예를 들면 리신 모노하이드로클로라이드 또는 리신 설페이트를 의미하는 것으로 이해하여야 할 것이다.

바람직하게는, 본 발명은, 코리네형 미생물에서 복제할 수 있는 능력을 지니고 적어도 서열 1에 도시된 accDA 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 코리네박테리움으로 부터 기원하는 재조합 DNA를 제공한다.

또한, 본 발명은 (i) 서열 1에 도시된 뉴클레오티드 서열, (ii) 유전자 코드의 축퇴성 영역내의 상기 서열 (i)에 상응하는 하나 이상의 서열, 또는 (iii) 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 상보적인 서열과 하이브리드화할 수 있는 하나 이상의 서열, 및 임의로 (vi) 상기 서열 (i)중에 중성 센스 돌연변이를 포함하는, 청구범위 제1항에서 청구된 바와 같은 복제능을 지닌 DNA를 제공한다.

본 발명은 또한 복제능을 지닌 상기 DNA를 도입함으로써 형질전환된 코리네형 미생물, 특히 코리네박테리움 속을 제공한다.

또한, 본 발명은 특히 L-아미노산을 생산하며, accDA 유전자를 암호화하는 뉴글레오티드가 증폭, 특히 과발현되어진 코리네박테리아를 사용하여 발효에 의해 L-아미노산을 제조하는 방법에 관한 것이다.

최종적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 새로운 accDA 유전자 및 공지된 accBC 유전자의 공동 과발현을 이용한, 코리네박테리아에서의 아실-CoA 카복실라제의 증폭 방법을 제공한다.

본원중에서, "증폭"이란 용어는, 예를 들면 강한 프로모터를 사용하거나 고활성의 적당한 효소를 암호화하는 유전자를 사용하거나, 임의로 이들 수단을 결합하여 당해 유전자의 복사체 수를 증가시킴으로써, 적당한 DNA에 의해 암호화되는 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 미생물내에서 증가시키는 것을 의미한다.

본 발명이 제공하는 미생물은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 당밀, 전분 또는 셀룰로즈로 부터, 또는 글리세롤 및 에탄올로 부터 L-아미노산을 생산할 수 있다. 이러한 미생물의 대표적인 예는 코리네박테리아, 특히 코리네박테리움 속의 미생물이다. 코리네박테리움 속중에서도, 특히 L-아미노산을 생산할 수 있는 이의 능력에 대해 당업자에게 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 언급될 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적당한 균주로는 공지된 야생형 균주, 즉 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032, 코리네박테리움 아세토글루타미쿰(acetoglutamicum) ATCC 15806, 코리네박테리움 아세토아시도필룸(acetoacidophilum) ATCC 13870, 코리네박테리움 써모아미노게네스(thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(lactofermentum) ATCC 13869, 브레비박테리움 디바리카툼(divaricatum) ATCC 14020, 및 이들로 부터 제조된 L-아미노산-생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709, 브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708, 브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 1712, 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463 및 코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464가 있다.

본 발명자들은 코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터 새로운 accDA 유전자를 분리하는데 성공하였다. 이러한 accDA 또는 다른 유전자는, 먼저 이.콜라이내에서 이 미생물의 유전자 라이브러리를 작제함으로써 코리네박테리움 글루타미쿰으로 분리된다. 유전자 라이브러리의 작제법은 일반적으로 익히 공지된 교과서 및 논문집에 제공되어 있다. 언급될 수 있는 예로는 교과서[저자: Winnacker, 제목: From Genes to Clones, Introduction to Gene Technology (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990)] 또는 논문집[저자: Sambrook et al., 제목: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]가 있다. 매우 익히 공지된 유전자 라이브러리는 코하라(Kohara) 등[참조: Cell 50, 495-508 (1987)]에 의해 λ벡터내에 작제된 이.콜라이 K-12 균주 W3110의 라이브러리이다. 문헌[Bathe et al., Molecular and General Genetics 252, 255-265 (1996)]에는 코스미드 벡터 SuperCos I[참조: WahI et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 84, 2160-2164 (1987)]을 이용하여, 이.콜라이 K-12 균주 NM554[참조: Raleigh et al., Nucleic Acids Research 16, 1563-1575 (1988)]내에 작제된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 또한, 문헌[Bormann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326]에는 코스미드 pHC79[참조: Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)]을 사용한, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 또한, 이.콜라이내의 코리네박테리움 글루타미쿰의 유전자 라이브러리는 pBR322[Bolivar, Life Science 25, 807-818 (1979)] 또는 pUC9[Viera et al., Gene 19, 259-268(1982)]와 같은 플라스미드를 사용하여 작제할 수 있다. 제한- 및 재조합- 결함 이.콜라이 균주가 특히 적합한 균주이며, 이의 예로는 문헌[Grant et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 87, 4645-4649(1990)]에 기술된 DH5αmcr 균주가 있다. 이후, 코스미드를 사용하여 콜로닝된 장쇄 DNA 단편을 서열분석하기에 적합한 일반적인 벡터내에 서브클로닝한 다음, 이어서 문헌[Sanger et al., Proceedings of the National of Science of the United States of America USA 74, 5463-5467 (1997)]에 기술된 바와 같이 서열을 분석한다.

코리네박테리움 글루타미쿰으로 부터의 accDA 유전자를 암호화하는 신규한 DNA 서열을 상기한 방법으로 수득하며, 이는 서열 1로서 본 발명의 일부이다. accDA 유전자의 암호 영역(cds)는 서열 2에 도시되어 있다. 또한, 상응하는 단백질의 아미노산 서열은 상기한 방법에 의해 본 발명의 DNA 서열로 부터 유도된다. accDA 유전자 산물의 생성된 아미노산 서열은 서열 3에 도시되어 있다.

유전자 코드의 축퇴성 때문에, 서열 1로 부터 수득된 DNA 암호 서열도 또한 본 발명의 일부이다. 유사하게, 서열 1 또는 서열 1의 단편과 하이브리드화하는 DNA 서열도 본 발명의 일부이다. 또한, 보존적 아미노산 교환, 예를 들면 단백질에서의 알라닌과 글리신의 교환 또는 글루탐산과 아스파르트산의 교환은 당업자에게 있어 단백질 활성의 기초를 변화시키지 않는 센스 돌연변이로, 즉 중성적인 것으로 공지되어 있다. 또한, 단백질의 N 및/또는 C 말단에서의 변화가 단백질의 기능을 실질적으로 손상시키지 않거나, 또는 심지어 이를 안정화시킬 수 있다는 것이 공지되어 있다. 당업자는 특히 문헌[Ben-Bassat et al., Journal of Bacteriology 169, 751-757 (1987); O'Regan et al., Gene 77, 237-251 (1989), Sahin-Toth et al., Protein science 3, 240-247(1994), Hochuli et al., Bio/Technology 6, 1321-1325 (1988)] 및 익히 공지된 유전학 및 분자 생물학 교과서에서 상기 주제에 관한 정보를 발견할 수 있다. 서열 3으로 부터 상응하게 수득된 아미노산 서열도 또한 본 발명의 일부이다.

본 발명자들은 코리네박테리아내의 accDA 유전자의 과발현이 L-리신 생산을 향상시킴을 발견하였다.

과발현은, 적당한 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 또는 구조 유전자의 상부에 위치한 리보좀 결합 부위 또는 프로모터 및 조절 영역을 돌연변이시킴으로써 달성될 수 있다. 구조 유전자의 상부에 삽입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 추가로, 유도성 프로모터에 의해, 발효에 의한 L-리신 생산의 과정중에 당해 발현이 증가될 수 있다. mRNA의 수명을 연장시키는 수단도 또한 당해 발현을 증가시킬 수 있다. 또한, 효소 활성은 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 증가될 수 있다. 유전자 또는 유전자 작제물은 다양한 복사체 수의 플라스미드내에 위치하거나, 또는 염색체내에 통합되어 증폭될 수 있다. 달리, 배지의 조성 및 배양 기술을 변화시킴으로써 목적 유전자의 과발현을 달성할 수 있다.

당업자는 특히 문헌[Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41 1994); Tsuchiya and Morinaga Bio/Technology 6, 428-430 (1988); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); EP 0 472 869; US 4,601,893; Schwarzer and Puhler, Bioy/Technology 9, 84-87(1991), Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); WO 96/15246; Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993); JP-A-10-229891; Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998), Makrides, Microbiological Reviews 60, 512-538 (1996)] 및 유전학 및 분자 생물학에 관한 교과서에서 적당한 지침을 발견할 수 있다.

accDA 유전자가 과발현될 수 있는 플라스미드의 예는 pZ1accDA(도 1)이며, 이는 균주 MH20-22B/pZ1accDA내에 포함된다. 플라스미드 pZ1accDA는 이. 콜라이-코리네박테리움 글루타미쿰 왕복벡터로서, 이는 accDA 유전자를 수반하여, 플라스미드 pZ1[Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688(1989)]를 기초로 한다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제될 수 있는 다른 플라스미드 벡터, 예를 들면 pEKEx1[Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991)] 또는 pZ8-1[EP 0 375 889]가 동일한 방법으로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명자들은, 코리네박테리아내의 본 발명에 따른 신규한 accDA 유전자외에 공지된 accBC 유전자의 과발현이 아실-CoA 카복실라제 생성을 향상시킬 수 있다는 것을 발견하였다. accDA 유전자 및 accBC 유전자가 함께 과발현될 수 있는 플라스미드의 예는 pEK0accBCaccDA(도 2)이다. 플라스미드 pEK0accBCaccDA는 이.콜라이 - 코리네박테리움 글루타미쿰 왕복 벡터로서, 이는 accBC 및 accDA 유전자를 수반하며, 플라스미드 pEK0[Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991)]를 기초로 한다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서 복제될 수 있는 다른 플라스미드 벡터, 예를 들면 pEKEx1[Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991)] 또는 pZ8-1[EP 0 375 889]가 동일한 방법으로 사용될 수 있다.

또한, accDA 유전자 뿐 아니라 생합성 경로의 하나 이상의 효소를 과발현시키는 것이 L-아미노산의 생산에 유리할 수 있다. 따라서, L-리신을 제조하기 위하여, 예를 들면 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자[EP-B 0 197 335]를 동시에 과발현하거나, 또는 S-(2-아미노에틸)시스테인 내성을 부여하는 DNA 단편[EP-A 0 088 166]을 동시에 증폭시킬 수 있다.

더욱이, 바람직하지 않은 2차 반응을 차단할 뿐 아니라 accDA 유전자를 과발현시키는 것이 L-아미노산, 특히 L-리신의 생산에 있어 유리할 수 있다[참조 문헌: Nakayama, "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organism" in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

본 발명에 따라 제조된 미생물은, L-리신을 생산하기 위하여, 배치 공정, 공급 배치 공정 또는 반복적 공급 배치 공정에 의해 연속적으로 또는 불연속적으로 배양될 수 있다. 공지된 배양 방법의 요약은 크미엘(Chmiel)의 교과서[Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioengineering) (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 및 스토하스(Storhas)의 교과서[Bioreactors und periphere Einrichtungen (Bioreactors and Peripheral Equipment) (View Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)]에 제공되어 있다.

사용될 배양 배지는 특정 균주의 요구를 적당히 충족시켜야 한다. 각종 미생물의 배양 배지에 대한 기술은 논문집["Manual of Methods for General Bacteriology", the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981)]에서 찾아볼 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 당류와 탄수화물(예: 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈 프락토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈), 오일과 지방(예: 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코낫 지방), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올), 및 유기산(아세트산)이다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원은 유기 질소-함유 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침적액, 대두분, 요소), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인 공급원은 인산, 이수소인산 칼륨, 수소인산 이칼륨, 또는 상응하는 나트륨 염이다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속 염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유해야 한다. 최종적으로, 필수 성장-촉진 물질, 예를 들면 아미노산 및 비타민이 상기 언급된 물질에 추가하여 사용될 수 있다. 적당한 전구체가 배양 배지에 가해질 수 있다. 상기 공급 물질들은 상기 배지에 1회에 모두 가해지거나, 또는 배양중에 적당히 공급될 수 있다.

배지의 pH는 염기성 화합물, 예를 들면 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 수성 암모니아, 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적당히 사용하여 조절한다. 발포는 소포제, 예를 들면 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성은 적당히 선택적으로 작용하는 물질, 예를 들면 항생제를 배지에 가함으로써 유지될 수 있다. 호기성 조건은 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물(예: 공기)를 배지에 도입함으로써 유지될 수 있다. 배지의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 목적하는 L-아미노산의 형성이 최대에 이를 때까지, 배양을 계속한다. 이러한 목표는 통상적으로 10 시간 내지 160 시간내에 달성될 수 있다.

L-리신을, 음이온 교환 크로마토그래피에 이어, 닌하이드린 유도화를 통해 분석할 수 있다[참조 문헌: Spackman et al., Analytical Chemistry 30, 1190 (1958)].

하기 미생물은 부다페스트 조약하에 독일 브라운쉬바이크에 소재하는 국제기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikrorganismen und Zellkulturen(DSMZ)]에 기탁되었다:

·코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pZ1accDA(수탁번호: DSM 12785)

·코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pEK0accBCaccDA(수탁번호: DSM 12787).

본 발명에 따른 방법은, 코리네박테리아의 발효에 의해, L-아미노산, 특히 L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-호모세린, L-트레오닌, L-이소루이신 및 L-메티오닌을 제조하는데 사용된다. 이는 특히 L-리신의 제조에 사용된다.

실시예

본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명될 것이다.

실시예1

accDA 유전자의 클로닝 및 서열분석

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전자 라이브러리를 문헌[Bormann et al., Molecular Microbiology 6(3), 317-326]에 기술된 바와 같이 코스미드 pHC79[Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)]을 사용하여 작제한다.

선택된 코스미드를 제한 효소 EcoRI 및 XhoI을 사용하여 이들 제한 효소의 제조자[Boehringer Mannheim]에 의해 지시된 바와 같이 분해한다. 형성된 DNA 단편을 이미 제한 효소 EcoRI 및 XhoI로 처리한 벡터 pUC18[Norrander et al., Gene 26, 101-106 (1983)]와 혼합하고, T4 DAN 리가제로 처리한 후, 이. 콜라이 균주 DH5αmcr[Grant et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 87, 4645-4645 (1990)]내로 클로닝한다[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]. 형질전환체를 앰피실린 50㎍/ml을 함유하는 LB 아가상에서 선별한다[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]. 플라스미드 DNA를 형질전환체로 부터 분리하고, 이를 pUCaccDA로 칭한다. 이어서, 서브클론을, 상기 목적을 위하여 Promega(Heidelberg, Germany)에 의해 제공되는 키트(Erase-a-Base)를 사용하여 엑소뉴클리아제 III 분해를 통해 제조한다. 상기 서브클론을 상거(Sanger) 등의 디데옥시 쇄 종결법[Proceedings of the National Academy of Science USA 74, 5463-5467 (1997)]에 의해 서열분석한다. 이를 자동-판독 서열분석 키트[Auto-Read Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)]를 사용하여 수행한다. 겔 전기영동 분석을 자동 레이저 형광(A.L.F.) 서열분석기[제조원: Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Sweden)]를 사용하여 수행한다. 수득된 뉴클레오티드 서열을 HUSAR 소프트웨어 패키지(Release 4.0, EMBL, Heidelberg, Geremany)를 사용하여 분석한다. 뉴클레오티드 서열은 서열 1에 도시되어 있다. 뉴클레오티드 서열의 분석을 통해, 1473 염기쌍의 개방형 판독 프래임을 알 수 있으며, 이는 accDA 유전자로 칭해진다. 코리네박테리움 글루타미쿰로 부터의 accDA 유전자는 484개 아미노산의 폴리펩티드를 암호화한다.

실시예 2

코리네박테리움 글루타미쿰내에서의 accDA 유전자의 발현

accDA 유전자를 코리네박테리움 글루타미쿰내에서의 발현을 위해 벡터 pZ1[Menkel et al., Applied and Envirnmental Microbiology 55, 684-688 (1989)]내로 서브클로닝한다. 이는 제한 효소 ClaI으로 플라스미드 pUCaccDA(실시예 1 참조)를 절단함으로써 수행된다. 생성된 1.6kb 단편을 실시예 1에서와 같이 분리하고, 클레노우(Klenow) 폴리머라제 및 알카린 포스파타제로 처리하고, 사전에 ScaI으로 선형화된 pZ1 벡터에 결합시킨다. 결합 화합물을 사용하여 이. 콜라이 DH5αmcr[Grant et al., Proceedings of the National Academy of Science USA 87, 4645-4645 (1990)]을 형질전환시키고, 형질전환체를 카나마이신(50㎍/ml)을 함유한는 LB 아가상에서 선별하여, 7.7 kb 왕복 벡터 pZ1accDA(도 1)을 수득한다. 이를 문헌[Haynes, FEMS Microbiol. Letters 61, 329-334 (1989)]에 기술된 바와 같이 전기천공에 의해 균주 DSM 5715내로 삽입하고, 형질전환체를 LBHIS 아가[Liebl et al., FERMS Microbiology Letters 65, 299-304 (1989)]상에서 선별하여 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pZ1accDA를 수득한다.

실시예 3

균주 DSM5715/pZ1accDA를 사용하는 L-리신의 제조

배지 CgIII[Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)]에서 예비배양한 후, 균주 DSM5715/pZ1accDA를 생산 배지 CgXII[Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)]에서 배양한다. 글루코즈 4및 카나마이신 설페이트 50mg/l을 가한다.

48 시간 동안 항온처리한 후, 660nm에서의 흡광도 및 형성된 L-리신의 농도를 측정한다. 실험 결과는 표 1에 주어진다.

균주	OD	L-리신 (g/l)
DSM5715	31.4	7.2
DSM5715/pZ1accDA	43.1	8.0

실시예 4

accBC 및 accDA의 공동 발현

(i) 발현 벡터 pEK0accBCaccDA의 작제

accBC를 포함하는 플라스미드 pWJ71[Jager et al., Archives of Microbiology 166, 76-82 (1996)]를 제한 효소 AgeI 및 SmaI으로 분해한 후, 클레노우 폴리머라제 및 알카린 포스파타제로 처리한다. 병행해서, 플라스미드 pUCaccDA를 EcoRI/XhoI으로 분해한 후 클레노우 폴리머라제 및 알카린 포스파타제로 처리한다. accDA를 수반하는 2.1kb 단편을 아가로즈 겔로 부터 예비적 분리로 분리한다[참조 문헌: Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories]. 상기 단편을 이미 상기와 같이 제조된 벡터 pWJ71에 결합시킨다. accBCaccDA를 수반하는 4.6kb 단편을, 생성된 플라스미드로 부터 KpnI/SalI 분해로 절단해내고, 다시 예비적 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리한다. 이 단편을 코리네박테리움 글루타미쿰/이. 콜라이 왕복 벡터 pEK0[Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991)]에 결합시키기 위하여, pEK0을 제한 효소 KpnI 및 SalI으로 분해한 후, 클레노우 폴리머라제 및 알카린 포스파타제로 처리한다. 이러한 방법으로 제조괸 벡터를 accBCaccDA를 수반하는 4.6kb 단편에 결합시킨다. 생성된 벡터 pEK0accBCaccDA는 도 2에 도시되어 있다. 이 벡터를 실시예 2에 기술된 바와 같이 전기천공[Haynes, FERM Microbiol. Letters 61, 329-334 (1989)]을 사용하여 삽입시켜 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pEK0accBCaccDA를 수득한다.

(ii) 아실-CoA 카복실라제 활성의 측정

배지 CGIII[Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175, 5595-5603 (1993)]에서 예비배양한 후, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pEK0accBCaccDA를 배지 CGXII[참조 문헌: Keilhauer et al., Jouranl of Bacteriology 175, 5595-5603(1993)]에서 성장시킨다. 세포를 원심분리로 수거하고, 세포 펠릿을 60mM Tris-HCl(pH 7.2)로 1회 세척한 후, 동일한 완충액에 재현탁시킨다. 세포를 10분간의 초음파 처리[Branson sonifier W-250, Branson Sonic Power Co., Danbury, USA]로 분해한다. 이어서, 세포 부산물을 4℃에서 30분간 원심분리로 분리하고, 상층액을 효소 시험에서의 조 추출물로서 사용한다. 효소 시험을 위한 반응 혼합물은 반응 용량 1ml중의 조 추출물 4mg, 60mM Tris-HCl(pH 7.2), 65mM KHCO3, 1mM ATP, 1.5mM MgCl₂, 및 4mM 아실-CoA(아세틸-CoA 또는 프로피오닐-CoA의 선택)을 함유한다. 시험 혼합물을 30℃에서 항온처리하고, 100㎕ 샘플을 15, 30, 45 및 60초 후 취하여, 이중의 말로닐-CoA 또는 메틸말로닐-CoA의 농도를 HPLC 분석[Kimura et al., Journal of Bacteriology 179, 7098-7102 (1997)]으로 측정한다. 표 2에 주어진 바와 같이, 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pEK0accBCaccDA는 아세틸-CoA 및 프로피오닐-CoA 둘다에 대해 높은 아실-CoA 카보실라제 활성을 갖는 반면, 대조군 균주는 아세틸-CoA 및 프로피오닐-CoA 둘다에 대해 낮은 아실-CoA 카보실라제 활성을 갖는다.

	기질과의 아실-CoA 카복실라제 활성
균주	아세틸-CoA	프로피오닐-CoA
ATCC13032/pEK0accBCaccDA	0.048	0.124
ATCC13032/pEKO	0.011	0.018

본 발명을 통해 L-아미노산, 특히 L-리신을 제조할 수 있으며, 이러한 L-아미노산, 특히 L-리신은 동물 사료, 사람의 의약품 및 약제 산업에 사용될 수 있다.

Claims

코리네형 미생물에서 복제될 수 있고 적어도 서열 1의 accDA 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 코리네박테리움으로 부터 기원하는 바람직한 재조합 DNA.
제1항에 있어서, (i) 서열 1의 뉴클레오티드 서열,

(ii) 유전자 코드의 축퇴성 영역내의 서열 (i)에 상응하는 하나 이상의 서열, 또는

(iii) 서열 (i) 또는 (ii)에 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열, 및 임의로

(vi) 서열 (i)내에 중성 센스 돌연변이를 포함하는, 복제능을 갖는 DNA.
제1항 또는 제2항에서 청구된 뉴클레오티드 서열로 부터 유도된, 서열 3의 아미노산 서열을 갖는 단백질.
제1항 또는 제2항에서 청구된 바와 같은 복제능을 가진 DNA를 하나 이상 도입함으로써 형질전환된, 특히 코리네박테리움 속의 코리네형 미생물.
코리네박테리움 글루타미쿰중 수탁번호 DSM12785하에 기탁된, 도 1에 도시된 바와 같은 제한 지도를 갖는 왕복 벡터 pZ1accDA.
accDA 유전자 또는 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 증폭, 특히 과발현되는 코리네박테리아의 발효에 의한 L-아미노산, 특히 L-리신의 제조 방법.
제5항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로의 다른 유전자가 추가고 증폭되는 박테리아가 사용되는 방법.
제5항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 형성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 차단되는 박테리아가 사용되는 방법.
제5항 내지 제7항중의 어느 한항에 있어서, accDA 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 수반하는 플라스미드 벡터에 의해 형질전환된 균주가 사용되는 방법.
제8항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰중 수탁번호 DSM12785하에 기탁된 플라스미드 벡터 pZ1accDA에 의해 형질전환된 박테리아가 사용되는 방법.
제6항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-호모세린, L-트레오닌, L-이소루이신 및 L-메티오닌을 생산하는 코리네박테리아가 사용되는 방법.
제5항 내지 제10항중의 어느 한 항에 있어서, L-리신을 생산하는 코리네박테리아가 사용되는 방법.
제5항 내지 제11항중의 어느 한 항에 있어서, accDA 유전자에 부가하여 accBC 유전자가 과발현되는 방법.
제5항에 있어서, 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자가 동시에 과발현되는 방법.
제5항에 있어서, S-(2-아미노에틸)시스테인 내성을 부여하는 DNA 단편이 동시에 증폭되는 방법.
제6항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서, a) 적어도 accDA 유전자가 증폭되는, 목적하는 L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움의 발효 단계,

b) 배지 또는 박테리아 세포내에 목적하는 L-아미노산의 농축 단계, 및

c) 목적하는 L-아미노산의 분리 단계를 수행하여, 발효에 의해 L-아미노산을 제조하는 방법.