KR20010086331A

KR20010086331A - ｐｔｓＨ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열

Info

Publication number: KR20010086331A
Application number: KR1020010002020A
Authority: KR
Inventors: 파르빅크미케; 뫼켈베티나; 페페를레발터
Original assignee: 추후; 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2000-01-13
Filing date: 2001-01-13
Publication date: 2001-09-10
Also published as: MXPA01000261A; JP2001224390A; EP1118666A3; CN1319667A; ZA200100332B; KR100762112B1; AU7254800A; SK362001A3; ID28932A; EP1118666A2; HUP0100131A2; CA2328583A1; DE10001101A1; BR0100063A; HU0100131D0; RU2268938C2

Abstract

본 발명은

(a) 서열 2의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,

(b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 및

(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 함유하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 분리된 폴리뉴클레오타이드, 포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분 H를 암호화하는 ptsH 유전자의 증강에 의한 L-아미노산의 발효적 제조 방법, 및 프라이머 또는 하이브리드화 프로브로서의 상기 폴리뉴클레오타이드의 용도에 관한 것이다.

Description

ｐｔｓＨ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열{New nucleotide sequences coding for the ptsH gene}

본 발명은, ptsH를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 ptsH 유전자가 증강된 코리네형 세균을 사용하는 L-아미노산, 특히 L-라이신의 발효적 제조 방법을 제공한다.

L-아미노산, 특히 L-라이신은 사람 의학 및 제약 산업, 및 특히 동물 영양학에서 사용된다.

L-아미노산은 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 균주의 발효에 의해 제조되는 것으로 공지되어 있다. 이들의 큰 중요성으로 인하여, 제조 방법을 개선시키기 위한 노력이 지속적으로 이루어져 왔다. 이러한 방법의 개선은 발효 기술을 포함하는 수단, 예를 들어, 교반 및 산소 공급, 또는 영양 배지의 조성, 예를 들어, 발효 동안의 당 농도, 또는 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물 형태의 후처리,또는 미생물 자체의 고유 성능 특성에 관한 것일 수 있다.

이들 미생물의 성능 특성을 개선시키기 위해, 돌연변이 유발, 선택 및 돌연변이체 선택 방법을 사용한다. 이러한 방식으로 수득된 균주는, 항대사물질, 예를 들어, 라이신 동족체 S-(2-아미노에틸) 시스테인에 대해 내성이거나, 조절상 중요한 대사물질에 대해 영양요구성이며, L-아미노산을 생산한다.

몇년 동안, 재조합 DNA 기술 방법이, 또한 L-아미노산에 대한 개개의 생합성 유전자를 증폭시키고 L-아미노산 생산에 대한 영향을 조사함으로써, L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 개선하는데 사용되어 왔다. 이와 관련하여, 특히 개관 논문[참조: Kinoshita , "Glutamic Acid Bacteria", Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon(Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142; Hilliger, BioTec 2, 40-44 (1991); Eggeling, Amino Acids 6:261-272(1994); Jetten 및 Sinskey, Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103(1995); 및 Sahm et al., Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39(1996)]에서 찾아볼 수 있다.

본 발명자들은, L-아미노산, 특히 L-라이신의 개선된 발효적 제조를 위한 신규한 수단을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 플라스미드 pCRB1-ptsHexp의 지도이다.

도 2는 플라스미드 pEC-K18mob2의 지도이다.

도 3은 플라스미드 pEC-K18mob2ptsHexp의 지도이다.

사용된 약어 및 명칭은 다음 의미를 갖는다:

Kan: 카나마이신에 대한 내성 유전자

Zeocin: 제오신 내성 유전자

ptsH: 씨. 글루타미쿰으로부터의 ptsH 유전자

ColE1: 플라스미드 ColE1의 복제 기점

lacZ-alpha: 이. 콜라이로부터의 lacZ 유전자 단편

lacZ-alpha': 이. 콜라이로부터의 lacZ 유전자 단편의 단편

per: pGA1으로부터의 복제수를 조절하는 유전자

oriV: pMB1으로부터의 ColE1-유사 기점

rep: 씨. 글루타미쿰 플라스미드 pGA1으로부터의 플라스미드-암호화 복제 영역

RP4mob: RP4 이동 부위

EcoRI: 제한 효소 EcoRI의 제한 부위

HindIII: 제한 효소 HindIII의 제한 부위

KpnI: 제한 효소 KpnI의 제한 부위

XbaI: 제한 효소 XbaI의 제한 부위

L-아미노산, 특히 L-라이신은 사람 의학 및 제약 산업, 및 특히 동물 영양학에서 사용된다. 따라서, L-아미노산, 특히 L-라이신의 제조를 위한 신규한 개선된 방법을 제공하는데 전반적인 관심이 있다.

용어 L-라이신 또는 라이신이 아래에서 언급될 경우, 이는 염기뿐만 아니라, 염, 예를 들어, 라이신 모노하이드로클로라이드 또는 라이신 설페이트를 의미한다.

본 발명은

(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 함유하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는, 코리네형 세균으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은, 코리네형 세균내에서 복제할 수 있는 DNA, 바람직하게는 재조합 DNA인 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은, RNA인 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은

(i) 서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열,

(ii) 유전자 암호의 축퇴 영역내에서 (i)의 서열에 상응한 하나 이상의 서열, 또는

(iii) (i) 또는 (ii)의 서열에 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열, 및 임의로

(iv) (i)에서 기능적으로 중립인 센스 돌연변이를 함유하는, 바람직하게는 복제가능한 DNA인 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은, 위에서 언급한 폴리뉴클레오타이드 중 하나를 함유하는 벡터, 및 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포로서 작용하는 코리네형 세균을 제공한다.

또한, 본 발명은, 서열 1에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 완전한 유전자를 함유하는 적합한 유전자 뱅크와 서열 1에 따르는 상기한 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 프로브 또는 이의 단편과의 하이브리드화, 및 상기 언급된 DNA 서열의 분리에 의한 스크리닝에 의해 수득할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열을 실질적으로 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열은 포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분 H(ptsH)를 암호화하는 완전한 길이의 cDNA를 분리하고, 상기 cDNA 또는 포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분 H에 대한 유전자의 서열과 고도의 서열 유사성을 갖는 유전자를 분리하기 위한, RNA, cDNA 및 DNA에 대한 하이브리드화 프로브로서 적합하다.

또한, 본 발명에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열은, 폴리머라제 연쇄반응(Polymerase chain reaction: PCR)에 의해 포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분 H를 암호화하는 유전자의 DNA를 작제하기 위한 프라이머로서 적합하다.

프로브 또는 프라이머로서 작용하는 올리고뉴클레오타이드는 30개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 보다 특히 바람직하게는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 함유한다. 또한, 40개 내지 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 적합하다.

"분리된"은 이의 자연 환경으로부터 분리됨을 의미한다.

일반적으로, "폴리뉴클레오타이드"는 비변형된 RNA 또는 DNA, 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 폴리리보뉴클레오타이드 및 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다.

용어 "폴리펩타이드"는 펩타이드 결합을 통해 결합된 2개 이상의 아미노산을 함유하는 펩타이드 또는 단백질을 의미한다.

본 발명에 따르는 폴리펩타이드는 서열 2에 따르는 폴리펩타이드, 및 또한 포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분 H의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드, 및 또한 서열 2에 따르는 폴리펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상 동일한 폴리펩타이드, 및 특히 90 내지 95% 동일하면서 위에서 언급된 활성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.

또한, 본 발명은, 특히 L-아미노산을 미리 생산하고, ptsH 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 증강, 특히 과발현된 코리네형 세균을 사용하는, L-아미노산, 특히 L-라이신의 발효적 제조 방법에 관한 것이다.

이와 관련하여, 용어 "증강"은, 예를 들어, 유전자(들)의 복제수를 증가시키거나, 강한 프로모터를 사용하거나, 상응하는 고활성 효소를 암호화하는 유전자를 사용하고, 임의로 이들 수단을 병용함으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 미생물내에서 증대시킴을 의미한다.

본 발명에 의해 제공되는 미생물은 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분, 셀룰로즈, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-아미노산, 특히 L-라이신을 생산할 수 있다. 이들 미생물은 특히 코리네박테리움 속의 대표적인 코리네형 세균을 포함할 수 있다. 코리네박테리움 속 중에서도, L-아미노산을 생산하는 능력에 대해 당업자에게 공지되어 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 유형이 특별한 예이다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 유형의 적합한 균주의 예는 다음과 같은 익히 공지된 야생형 균주를 포함한다:

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032,

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC15806,

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC13870,

코리네박테리움 테르모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539,

코리네박테리움 멜라쎄콜라(Corynebacterium melassecola) ACTT17965,

브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC14067,

브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC14020, 및

이로부터 제조된 L-라이신 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들어,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708,

브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 1712,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715.

본 발명자들은, 포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분 H를 암호화하는 신규한 ptsH 유전자를 씨. 글루타미쿰로부터 분리하는데 성공하였다.

ptsH 유전자 또는 기타 유전자를 씨. 글루타미쿰으로부터 분리하기 위해, 상기 미생물의 유전자 뱅크를 먼저 이. 콜라이내에서 작제한다. 유전자 뱅크의 작제법은 일반적으로 공지된 교과서 및 편람에 기술되어 있다. 이의 예에는 교과서[참조: Winnacker, Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990] 또는 편람[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]이 있다. 매우 익히 공지된 유전자 뱅크는 문헌[참조: von Kohara et al., Cell 50, 495-508 (1987)]에 의해 λ-벡터내에서 작제된 이. 콜라이 K-12 균주 W3110의 유전자 뱅크이다. 문헌[참조: Bathe et al., Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996]에는 코스미드 벡터 SuperCos I[참고문헌: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164]을 사용하여, 이. 콜라이 K-12 균주 NM554[참고문헌: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575]내에서 작제된 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 뱅크가 기술되어 있다. 또한, 문헌[참조: Bormann et al., Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)]에는 코스미드 pHC79[참고문헌: Hohn 및 Collins, Gene 11, 291-298 (1980)]를 사용하는 씨. 글루타미쿰 ATCC13032의 유전자 뱅크가 기술되어 있다. 씨. 글루타미쿰의 유전자 뱅크를 이. 콜라이내에서 작제하기 위해, 플라스미드, 예를 들어, pBR322[참고문헌: Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)] 또는 pUC9[참고문헌: Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268]를 사용할 수 있다. 특히 적합한 숙주는 제한- 및 재조합-결함을 갖는 이. 콜라이 균주이다. 이의 예로서는, 문헌[참조: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649]에 의해 기술된 DH5αMCR 균주가 있다. 이어서, 코스미드를 사용하여 클로닝된 긴 DNA 단편을 서열화에 적합한 통상의 벡터내로 서브클로닝시킨 다음, 문헌[참조: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, 1977]에 기술된 바와 같이 서열화시킨다.

상기한 방법으로 씨. 글루타미쿰로부터 서열 1로서 수득된 ptsH 유전자를 암호화하는 신규한 DNA 서열은 본 발명의 일부를 구성한다. 또한, 상응하는 단백질의 아미노산 서열은 상술된 방법을 사용하여 본 발명의 DNA 서열로부터 유도한다. ptsH 유전자 산물의 생성된 아미노산 서열은 서열 2에 제시한다.

또한, 유전자 암호의 축퇴로 인해 서열 1로부터 발생하는 암호화 DNA 서열도 본 발명의 일부를 구성한다. 또한, 단백질내에서 보존적인 아미노산 대체, 즉 글라이신의 알라닌으로의 대체 또는 아스파르트산의 글루탐산으로의 대체는, 단백질의 활성에 근본적인 변화를 초래하지 않는, 즉 기능적으로 중립인 "센스 돌연변이"로서 숙련가들 사이에서 익히 공지되어 있다. 또한, 단백질의 N 및/또는 C 말단 상의 변화는, 이의 작용을 실질적으로 손상시키지 못하거나, 오히려 안정화시킬 수 있다는 것이 공지되어 있다. 숙련가는, 이와 관련된 정보를 특히 문헌[참조: Ben-Bassat et al., Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987); O'Regan et al., Gene 77:237-251 (1989); Sahin-Toth et al., Protein Sciences 3:240-247 (1994); Hochuli et al., Bio/Technology 6:1321-1325 (1988)], 및 유전학 및 분자 생물학의 익히 공지된 교과서에서 찾아볼 수 있다. 상응하는 방식으로 서열 2로부터 수득되는 아미노산 서열은 또한 본 발명의 일부를 구성한다.

유사하게는, 서열 1 또는 서열 1의 일부와 하이브리드화하는 DNA 서열은 본 발명의 일부를 구성한다. 마지막으로, 서열 1로부터 수득된 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 작제된 DNA 서열은 본 발명의 일부를 구성한다. 당해 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 15개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 갖는다.

숙련가는, 하이브리드화에 의한 DNA 서열 동정에 대한 지침을 특히 편람[참조: The DIG System Users Guide for Filter Hybridization, Firma Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Germany, 1993] 및 문헌[참조: Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41:255-260]에서 찾아볼 수 있다. 숙련가는, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한 DNA 서열의 증폭에 대한 지침을 특히 편람[참조: Gait, Oligonucleotide synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford, UK, 1984] 및 문헌[참조: Newton 및 Graham, PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994]에서 찾아볼 수 있다.

본 발명자들은, ptsH 유전자의 과발현 후, 코리네형 세균이 L-아미노산, 특히 L-라이신을 개선된 방식으로 생산한다는 것을 발견하였다.

과발현을 달성하기 위해, 상응하는 유전자의 복제수를 증가시키거나, 구조 유전자의 상류에 위치하는 프로모터 및 조절 영역 또는 리보좀 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상류에 삽입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 유도성 프로모터에 의해, 발효적 L-아미노산 생산 동안 발현을 증강시킬 수 있다. 또한, 발현은 m-RNA의 수명을 연장시키는 수단에 의해 향상된다. 또한, 효소 활성은, 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 증강된다. 유전자 또는 유전자 작제물은, 상이한 복제수를 갖는 플라스미드내에 존재하거나, 염색체내에 삽입되어 증폭될 수 있다. 또는, 목적하는 유전자의 과발현은, 배지의 조성 및 배양 수행 방식을 변화시킴으로써 달성할 수 있다.

숙련가는, 이와 관련된 지침을 특히 문헌[참조: Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41 (1994);Tsuchiya 및 Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); 유럽 특허 EPS 0 472 869; 미국 특허 제4,601,893호; Schwarzer 및 Puhler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991); Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); 특허원 제WO 96/15246호; Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993); 일본 특허 JP-A-10-229891; Jensen 및 Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998); Makrides, Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)], 및 유전학 및 분자생물학의 익히 공지된 교과서에서 찾아볼 수 있다.

예로써, 본 발명에 따르는 ptsH 유전자를, 플라스미드를 사용하여 과발현시킨다.

적합한 플라스미드는 코리네형 세균내에서 복제하는 플라스미드이다. 다수의 익히 공지된 플라스미드 벡터, 예를 들어, pZ1[참고문헌: Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64:549-554], pEKEx1[참고문헌: Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)] 또는 pHS2-1[참고문헌: Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)]이 잠재 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1을 기본으로 한다. 기타 플라스미드 벡터, 예를 들어, pCG4[참고문헌: US-A-4,489,160], pNG2[참고문헌: Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)] 또는 pAG1[참고문헌: US-A-5,158,891]을 기본으로 하는 플라스미드를 동일한 방식으로 사용할 수 있다.

기타 적합한 플라스미드 벡터는, hom-thrB 오페론의 복제 및 증폭을 위해, 예를 들어, 문헌[참조: Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]에 의해 기술된 바와 같이 염색체로의 삽입에 의한 유전자 증폭 방법을 사용할 수 있는 플라스미드 벡터를 포함한다. 상기 방법에서는, 완전한 유전자를 숙주(전형적으로는 이. 콜라이)내에서 복제할 수 있으나, 씨. 글루타미쿰내에서는 복제할 수 없는 플라스미드 벡터내에서 클로닝시킬 수 있다. 적합한 벡터의 예에는, pSUP301[참고문헌: Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)], pK18mob 또는 pK19mob[참고문헌: Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)], pGEM-T(제조원: Promega corporation; 미국 위스콘신주 매디슨 소재), pCR2.1-TOPO[참고문헌: Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; 미국 특허 제5,487,993호], PCR^RBlunt[제조원: Firma Invitrogen; 네덜란드 그로닝겐 소재; 참고문헌: Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234:534-541 (1993)] 또는 pEM1[참고문헌: Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516]이 있다. 다음, 증폭시킬 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터를 목적하는 균주 씨. 글루타미쿰내에 접합 또는 형질전환시킴으로써 전이시킨다. 접합 방법은, 예를 들어, 문헌[참조: Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]에 기술되어 있다. 형질전환 방법은, 예를 들어, 문헌[참조: Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988); Dunican 및 Shivnan, Bio/technology 7, 1067-1070 (1989); 및 Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기술되어 있다. "크로스 오버(cross over)" 이벤트를 사용하는 상동성 재조합 후, 생성된 균주는 관련 유전자의 2개 이상의 복사체를 함유한다.

따라서, 본 발명은, 또한 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주를 사용하고, 플라스미드 벡터가 포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분 H를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 보유하는, L-아미노산, 특히 L-라이신의 발효적 제조 방법을 제공한다.

또한, L-아미노산, 특히 L-라이신을 제조하는데 있어서, ptsH 유전자를 증강시키는 것 이외에, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로의 기타 유전자를 증강시켜, 당해 생합성 경로, 해당작용, 보충 반응 또는 아미노산 배출 중의 하나 이상의 효소를 과발현시키는 것이 유리할 수 있다.

L-라이신을 제조하기 위해서는, 예를 들어,

· 디하이드로피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자[참고문헌: EP-B 0 197 335],

· 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참고문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086],

· 트리오세포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자[참고문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086],

· 3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자[참고문헌: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:6076-6086],

· 포스포에놀피루베이트-당-포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분 M(ptsM)을 암호화하는 ptsM 유전자[참고문헌: Lee et al. (1994), FEMS Microbiology Letters 1-2, 137-145],

· 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[참고문헌: DE-A-198 31 609], 및

· 라이신 배출을 암호화하는 lysE 유전자[참고문헌: DE-A-195 48 222]로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 과발현시킬 수 있다.

추가로, L-아미노산, 특히 L-라이신을 제조하기 위해서는, ptsH 유전자 이외에,

· 포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자[참고문헌: 독일 특허 제199 50 409.1, DSM 13047] 및/또는

· 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자[참고문헌: 미국 특허 제09/396,478호, DSM 12969] 및/또는

· 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자[참고문헌: 독일 특허 제19846499.1호; DSM 13114]를 동시에 약화시키는 것이 유리할 수 있다.

추가로, L-아미노산, 특히 L-라이신을 제조하기 위해서는, pstH 유전자의 과발현 이외에, 목적하지 않는 부반응을 배제하는 것이 유리할 수 있다[참고문헌: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

본 발명에 따라 제조된 미생물은, L-아미노산, 특히 L-라이신을 제조하기 위해, 연속적으로, 또는 회분 공정(회분 배양)으로 또는 유가 또는 반복 유가 공정으로 회분식으로 배양할 수 있다. 익히 공지된 배양 방법의 요약은 교과서[참조: Chmiel, Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) 또는 Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기술되어 있다.

사용되는 배양 배지는 관련 균주의 요구 조건을 적합한 방식으로 충족시켜야만 한다. 다양한 미생물의 배양 배지는 편람[참조: "Manual of Methods for General Bacteriology", American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981]에 기술되어 있다. 적합한 탄소원으로서는 당 및 탄수화물, 예를 들어, 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈, 오일 및 지방, 예를 들어, 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유, 지방산, 예를 들어, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알콜, 예를 들어, 글리세롤 및 에탄올, 및 유기산, 예를 들어, 아세트산을 사용할 수 있다. 이들 물질은 단독으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 적합한 질소원으로서는 유기 질소-함유 화합물, 예를 들어, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 팽화수, 대두분 및 우레아, 또는 무기 화합물, 예를 들어, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 사용할 수 있다. 질소원은 단독으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 적합한 인 공급원으로서는 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨, 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 사용할 수 있다. 배양 배지는 또한 증식에 필수적인 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속 염을 함유하여야만 한다. 마지막으로, 상기 언급된 물질 이외에도 필수 성장-촉진제, 예를 들어, 아미노산 및 비타민을 사용할 수 있다. 추가로, 적합한 예비 단계를 또한 배양 배지에 가할 수 있다. 사용되는 물질은 단일 제제 형태로 배양물에 가하거나, 배양 동안 적합한 방식으로 공급할 수 있다.

염기성 화합물, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아 가스액, 또는 산성 화합물, 예를 들어, 인산 또는 황산을 사용하여, 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 소포제, 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여, 거품 형성을 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위해, 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들어, 항생제를 배지에 첨가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위해서는, 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예를 들어, 공기를 배양물에 유입할 수 있다. 배양 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. L-라이신 최대량이 형성될 때까지 계속 배양한다. 상기 목적은 일반적으로 10시간 내지 160시간내에 성취된다.

따라서, 본 발명은 또한

(a) 적어도 포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분 H를 암호화하는 ptsH 유전자를 증강, 특히 과발현시키는, L-아미노산 생산 코리네형 세균의 발효 단계,

(b) L-아미노산의 배지내 또는 세균의 세포내에서의 집적 단계, 및

(c) L-아미노산의 분리 단계를 수행함을 포함하는, L-아미노산, 특히 L-라이신의 발효적 제조 방법을 제공한다.

L-라이신의 분석은, 문헌[참조: Spackman et al., Analytical Chemistry, 30 (1958), 1190]에 기술된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서, 닌하이드린 유도체화에 의해 수행할 수 있다.

본 발명에 따르는 방법은, L-아미노산, 특히 L-라이신의 발효적 제조 방법에 사용된다.

실시예

본 발명은 이후 실시예의 내용을 통해 더욱 상세히 기술될 것이다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터의 게놈 코스미드 유전자 뱅크의 작제

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032로부터 염색체 DNA를 문헌[참조: Tauch et al., 1995, Plasmid 33:168-179]에 기술된 바와 같이 분리하고, 제한 효소 Sau3AI(제조원: Amersham Pharmacia; 독일 프라이벅 소재, product description Sau3AI, code no. 27-0913-02)을 사용하여 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 슈림프 알칼리성 포스파타제(제조원: Roche Molecular Biochemicals; 독일 만하임 소재, product description SAP, code no. 1758250)를 사용하여 탈인산화시킨다. 코스미드 벡터 SuperCos1(구입원: Stratagene; 미국 라 졸라 소재, product description SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, code no. 251301)[참고문헌: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164]의 DNA를 제한 효소 XbaI(제조원: Amersham Pharmacia; 독일 프라이벅 소재, product description XbaI, code no. 27-0948-02)으로 절단하고, 또한 슈림프 알칼리성 포스파타제로 탈인산화시킨다. 이후, 코스미드 DNA를 제한 효소 BamHI(제조원: Amersham Pharmacia; 독일 프라이벅 소재, product description BamHI, code no. 27-0868-04)으로 절단한다. 상기 방식으로 처리한 코스미드 DNA를 처리된 ATCC13032 DNA와 혼합한 다음, 상기 배취를 T4 DNA 리가제(제조원: Amersham Pharmacia; 독일 프라이벅 소재, product description T4-DNA-Ligase, code no. 27-0870-04)로 처리한다. 이후, 연결 혼합물을 Gigapack II XL Packing Extracts(제조원: Stratagene; 미국 라 졸라 소재, product description Gigapack II XL Packing Extract, code no. 200217)를 사용하여 파아지내로 팩킹한다. 이. 콜라이 균주 NM554[참고문헌: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575]를 감염시키기 위해서, 세포를 10mM MgSO₄에 현탁시킨 다음, 파아지 현탁액의 분취액과 혼합한다. 코스미드 뱅크의 감염 및 역가 분석을 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행하고, 이때 세포는 암피실린 100㎍/ml를 함유하는 LB 아가[참고문헌: Lennox, 1955, Virology, 1:190]에 플레이팅시킨다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 개별적인 재조합 클론을 선택한다.

실시예 2

ptsH 유전자의 분리 및 서열화

개별적인 콜로니의 코스미드 DNA를 제조업자의 지침에 따라서 Qiaprep Spin Miniprep Kit(product No. 27106, 제조원: Qiagen; 독일 힐덴 소재)를 사용하여 분리하고, 제한 효소 Sau3AI(제조원: Amersham Pharmacia; 독일 프라이벅 소재, product description Sau3AI, product No. 27-0913-02)으로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 슈림프 알칼리성 포스파타제(제조원: Roche Molecular Biochemicals; 독일 만하임 소재, product description SAP, product No. 1758250)로 탈인산화시킨다. 겔 전기영동으로 분리한 후, 1500 내지 2000bp 크기 영역의 코스미드 단편을 QiaExII Gel Extraction Kit(product No. 20021, 제조원: Qiagen; 독일 힐덴 소재)를 사용하여 분리한다. 서열화용 벡터 pZero-1의 DNA(구입원: Invitrogen; 네덜란드 그로닝겐 소재, product description Zero Background Cloning Kit, product No. K2500-01)를 제한 효소 BamHI(제조원: Amersham Pharmacia; 독일 프라이벅 소재, product description BamHI, product No. 27-0868-04)으로 절단한다. 서열화용 벡터 pZero-1내 코스미드 단편의 연결은 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행하고, DNA 혼합물은 T4 리가제(제조원: Pharmacia Biotech; 독일 프라이벅 소재)와 함께 밤새 배양한다. 이후, 상기 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH5αMCR[참고문헌: Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649]내로 미세천공[참고문헌: Tauch et al., 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7]시킨 다음, Zeocin 50㎍/ml을 함유하는 LB 아가[참고문헌: Lennox, 1955, Virology, 1:190] 상에 플레이팅시킨다. 재조합 클론의 플라스미드 작제는 Biorobot 9600(product No. 900200, 제조원: Qiagen; 독일 힐덴 소재)을 사용하여 수행한다. 서열화는, 문헌[참조: Zimmermann et al., 1990, Nucleic Acids Research, 18:1067]에 따라 변형된, 문헌[참조: Sanger et al., 1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74:5463-5467]에 따르는 디데옥시 쇄-종결 방법을 사용하여 수행한다. "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit"(제조원: PE Applied Biosystems, product No. 403044; 독일 바이터슈타트 소재)를 사용한다. 겔 전기영동에 의한 분리 및 서열화 반응의 분석은, "ABI Prism 377" 서열화 장치(제조원: PE Applied Biosystems; 독일 바이터슈타트 소재)를 사용하여 "Rotiphoresis NF 아크릴아미드/비스아크릴아미드" 겔(29:1)(product No. A124.1, 제조원: Roth; 독일 카를스루헤 소재)에서 수행한다.

수득된 미처리 서열 데이터를, Staden 프로그램 패키지[참고문헌: 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231] 97-0형을 사용하여 처리한다. pZero1 유도체의 개별적인 서열을 점착성 콘티그로 어셈블링한다. 컴퓨터-제어 암호화 영역 분석은 프로그램 XNIP[참고문헌: Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231]를 사용하여 실시한다. 추가의 분석은 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI; 미국 미들랜드주 베데스다 소재)의 비중복성 데이터뱅크에 대한 "BLAST search program"[참고문헌: Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402]을 사용하여 수행한다.

수득한 뉴클레오타이드 서열은 서열 1에 제시한다. 당해 뉴클레오타이드 서열을 분석한 결과, 오픈 리딩 프레임이 267개 염기쌍인 것으로 밝혀졌고, 이를 ptsH 유전자로 명명한다. ptsH 유전자는 89개 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화한다.

실시예 3

ptsH 유전자를 씨. 글루타미쿰내에서 증강시키기 위한 셔틀 벡터 pEC-K18mob2ptsHexp의 작제

3.1 pstH 유전자의 벡터 pCR^RBlunt II내로의 클로닝

염색체 DNA를 문헌[참조: Eikmanns et al., Microbiology 140:1817-1828 (1994)]의 방법에 따라 ATCC13032 균주로부터 분리한다. 실시예 2로부터 공지된 씨. 글루타미쿰에 대한 ptsH 유전자의 서열을 기본으로 하여, 하기 올리고뉴클레오타이드를 폴리머라제 연쇄 반응용으로 선택한다:

ptsHexp1:

5' ACC ACT GGT GCA ATC TCC AT 3'

ptsHexp2:

5' TTT ACT CAG CGT CAA GGT CC 3'

제시된 프라이머를 ARK Scientific GmbH Biosystems(독일 다름슈타트 소재)에 의해 합성하고, PCR 반응을, 문헌[참조: Innis et al., PCR protocols. A Guideto Methods and Applications, 1990, Academic Press]의 표준 PCR 방법에 따라 Pwo-폴리머라제(제조원: Roche Diagnostics GmbH, 독일 만하임 소재)를 사용하여 수행한다. 폴리머라제 연쇄 반응에 의해, 상기 프라이머를 사용하여, 잠재성 프로모터 영역을 갖는 ptsH 유전자를 보유하는 686bp DNA 단편을 증폭시킬 수 있다. 증폭된 DNA 단편의 DNA 서열을 서열화에 의해 분석한다.

증폭된 DNA 단편을, Zero Blunt™ Kit(제조원: Invitrogen Corporation; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재; catalogue no. K2700-20)를 사용하여 벡터 pCR^RBlunt II[참고문헌: Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234:534-541 (1993)]내에 연결시킨다.

이. 콜라이 균주 TOP10을 연결 혼합물과 함께 전기천공시킨다[참고문헌: Hanahan, DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I., IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985]. 플라스미드-보유 세포를, 카나마이신 25mg/ℓ가 보충된 LB 아가[참고문헌: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989] 상에 형질전환 혼합물을 플레이팅시킴으로써 선택한다. 플라스미드 DNA를, QIAprep Spin Miniprep Kit(제조원: Qiagen)를 사용하여 형질전환체로부터 분리한 다음, 제한 효소 EcoRI를 사용하여 제한시킨 후, 이어서 아가로스 겔 전기영동(0.8%)에 의해 분석한다. 당해 플라스미드를 pCRB1-ptsHexp로 명명하고, 도 1에 제시한다.

3.2 이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-K18mob2의 작제

이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터를 선행 기술에 따라 작제한다. 당해 벡터는 복제 이펙터 per를 포함한 플라스미드 pGA1의 복제 영역 rep[참고문헌: US-A-5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)], 트랜스포손 Tn5의 카나마이신 내성-제공 aph(3')-IIa 유전자[참고문헌: Beck et al., Gene 19, 327-336 (1982)], 플라스미드 pMB1의 복제 영역 oriV[참고문헌: Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)], lac 프로모터 및 다중 클로닝 부위(mcs)를 포함한 lacZα 유전자 단편[참고문헌: Norrander, J.M. et al., Gene 26, 101-106 (1983)] 및 플라스미드 RP4의 mob 영역[참고문헌: Simon et al., Biol/Technology 1:784-791 (1983)]을 함유한다. 작제된 벡터를 이. 콜라이 균주 DH5αmcr내로 형질전환시킨다[참고문헌: Hanahan, DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]. 플라스미드-보유 세포를, 카나마이신 25mg/ℓ가 보충된 LB 아가[참고문헌: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989] 상에 형질전환 혼합물을 플레이팅시킴으로써 선택한다. 플라스미드 DNA를, QIAprep Spin Miniprep Kit(제조원: Qiagen)를 사용하여 형질전환체로부터 분리한 다음, 제한 효소 EcoRI를 사용하여 제한시킨 후, 이어서 아가로스 겔 전기영동(0.8%)에 의해 분석한다. 당해 플라스미드를 pEC-K18mob2로 명명하고, 도 2에 제시한다.

하기 미생물은 부다페스트 조약에 따라 독일 브라운슈바익에 소재하는 기탁기관[German Collection for Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ)]에 수탁되었다:

·DSM 13245로서 씨. 글루타미쿰 균주 DMS 5715/pEC-K18mob2

3.3 이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-K18mob2내로의 ptsH의 클로닝

ptsH 유전자를 실시예 3.2에 기술된 이. 콜라이 - 씨. 글루타미쿰 셔틀 벡터 pEC-K18mob2내로 클로닝시키기 위해, pEC-K18mob2로부터의 플라스미드 DNA를 제한 엔도뉴클레아제 KpnI 및 XbaI으로 완전히 분해한 다음, 알칼리성 포스파타제(Alkaline phosphatase; 제조원: Roche Diagnostics GmbH; 독일 만하임 소재)로 처리한다.

벡터 pCRB1-ptsHexp를 에스케리키아 콜라이 Top10으로부터 분리하여, 제한 엔도뉴클레아제 KpnI 및 XbaI으로 완전히 분해한 다음, ptsH 유전자를 갖는 788bp 단편을 0.8% 아가로스 겔(QIAquick Gel Extraction Kit; 제조원: Qiagen; 독일 힐덴 소재)로부터 정제한다. 다음, ptsH 유전자를 갖는 단편을 벡터 pEC-K18mob2(T4-ligase; 제조원: Roche Diagnostics GmbH; 독일 만하임 소재)와 연결시킨다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 DH5αmcr내로 형질전환시킨다[참고문헌: Hanahan, DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]. 플라스미드-보유 세포를, 카나마이신 25mg/ℓ가 보충된 LB 아가[참고문헌: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989] 상에 형질전환 혼합물을 플레이팅시킴으로써 선택한다. 플라스미드 DNA를, QIAprep Spin Miniprep Kit(제조원: Qiagen; 독일 힐덴 소재)를 사용하여 형질전환체로부터 분리한 다음, 제한 효소 EcoRI를 사용하여 제한시킨 후, 이어서 아가로스 겔 전기영동(0.8%)에 의해 분석한다. 당해 플라스미드를 pEC-K18mob2ptsHexp로 명명하고, 도 3에 제시한다.

당해 균주를 이. 콜라이 DH5αmcr/pEC-K18mob2ptsHexp로 명명하고, 2000년 11월 28일에 순수한 배양물 형태로 부다페스트 조약하에 기탁번호 DSM 13878로 독일 브라운슈바익에 소재하는 기탁기관[German Collection for Microorganisms and Cell Cultures(DSMZ)]에 기탁하였다.

실시예 4

균주 DSN5715의 플라스미드 pEC-K18mob2ptsHexp로의 형질전환

균주 DSM5715를, 문헌[참조: Liebl et al., FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)]에 기술된 전기천공 방법을 사용하여 플라스미드 pEC-K18mob2ptsHexp로 형질전환시킨다. 형질전환체를, 25mg/ℓ 카나마이신이 보충된, 18.5g/ℓ　브레인-하트 인퓨젼 배양액, 0.5M 솔비톨, 5g/ℓ박토-트립톤, 2.5/ℓ 박토-효모 추출물, 5g/ℓ NaCl 및 18g/ℓ 박토-아가로 구성된 LBHIS 아가 상에서 선택한다. 33℃에서 2일 동안 배양한다.

플라스미드 DNA를 통상의 방법[참고문헌: Peters-Wendisch et al., 1998,Microbiology, 144, 915-927]에 의해 형질전환체로부터 분리하고, 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI으로 절단한 다음, 플라스미드를 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석한다. 수득된 균주를 DSM5715/pEC-K18mob2ptsHexp로 명명한다.

실시예 5

라이신의 제조

실시예 4에서 수득된 씨. 글루타미쿰 균주 DSM5715/pEC-K18mob2ptsHexp를 라이신 생산에 적합한 영양 배지내에서 배양한 다음, 배양물 상청액 중의 라이신 함량을 측정한다.

이를 위하여, 균주를, 먼저 적합한 항생제를 함유하는 아가 플레이트(카나마이신(25mg/ℓ)을 함유하는 브레인-하트 아가) 상에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 이들 아가 플레이트 배양물로부터 출발하여, 예비-배양물을 접종한다(에를렌마이어 플라스크 100ml당 배지 10ml). 예비-배양에 사용되는 배지는 고체 배지 Cg III이다.

Cg III 배지

NaCl 2.5g/ℓ

박토-펩톤 10g/ℓ

박토-효모 추출물 10g/ℓ

글루코즈(각각 오토클레이빙시킴) 2%(w/v)

pH는 7.4로 조정

카나마이신(25mg/ℓ)을 이에 가한다. 예비-배양물을 진탕기 상에서 240rpm으로 33℃에서 16시간 동안 배양한다. 본 배양물을 상기 예비-배양물로부터 접종하여, 본 배양물의 초기 OD(660nm)를 0.05로 만든다. MM 배지를 본 배양에 사용한다.

MM 배지

CSL(옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS(모르폴리노프로판 설폰산) 20g/ℓ

글루코즈(각각 오토클레이빙시킴) 100g/ℓ

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄* 7H₂O 1.0g/ℓ

CaCl₂* 2H₂O 10mg/ℓ

FeSO₄* 7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄* H₂O 5.0mg/ℓ

비오틴(여과-멸균) 0.3mg/ℓ

티아민 * HCl(여과-멸군) 0.2mg/ℓ

L-로이신(여과-멸균) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

CSL, MOPS 및 염 용액의 pH를, 암모니아 용액을 사용하여 7로 조정한 다음, 오토클레이빙시킨다. 멸균 기질 및 비타민 용액을 가한 다음, 건조-오토클레이빙시킨 CaCO₃를 가한다.

배플이 장착된 에를렌마이어 플라스크 100ml당 용적 10ml로 배양을 수행한다. 카나마이신(25mg/ℓ)을 가한다. 33℃ 및 80% 공기 습도에서 배양을 수행한다.

48시간 후 및 72시간 후에, Biomek 1000(제조원: Beckmann Instruments GmbH, 뮤니히 소재)을 사용하여, 측정 파장 660nm에서 OD를 측정한다. 형성된 라이신의 양을, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 사용하는 후-칼럼 유도체화에 의해 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-Biotronik; 독일 함부르크 소재)로 측정한다.

시험 결과를 표 1에 제시한다.

균주	OD(660nm)	라이신-HCl(g/ℓ)
DSM5715/pEC-K18mob2(48시간 후)	11.4	14.14
DSM5715/pEC-K18mob2ptsHexp(48시간 후)	10.7	15.98
DSM5715/pEC-K18mob2(72시간 후)	10.1	15.24
DSM5715/pEC-K18mob2ptsHexp(72시간 후)	10.0	17.13

본 발명에 의해, ptsH 유전자의 증폭에 의한 개선된 발효적 방법으로 L-아미노산을 제조할 수 있다.

Claims

(a) 서열 2의 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드,

(b) 서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

(c) 상기 (a) 또는 (b)의 폴리뉴클레오타이드와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 및

(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 폴리뉴클레오타이드 서열 중 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 함유하는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는, 코리네형 세균으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 코리네형 세균내에서 복제할 수 있는 DNA, 바람직하게는 재조합 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서,

(i) 서열 1에 제시된 뉴클레오타이드 서열,

(ii) 유전자 암호의 축퇴 영역내에서 (i)의 서열에 상응한 하나 이상의 서열, 또는

(iii) (i) 또는 (ii)의 서열에 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열, 및 임의로

(iv) (i)에서 기능적으로 중립인 센스 돌연변이를 함유하는 복제가능한 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서, 서열 2에 제시된 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 청구된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 벡터.
제6항에 청구된 바와 같은 벡터를 함유하는 코리네형 세균.
(a) 적어도 포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분 H를 암호화하는 ptsH 유전자를 증강, 특히 과발현시키는, L-아미노산 생산 코리네형 세균의 발효 단계,

(b) L-아미노산의 배지내 또는 세균의 세포내에서의 집적 단계, 및

(c) L-아미노산의 분리 단계를 수행함을 포함하는, L-아미노산의 발효적 제조 방법.
제8항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로 중 다른 유전자가 추가로 증강된 세균이 사용되는 방법.
제8항에 있어서, L-아미노산의 형성을 저하시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 차단된 세균이 사용되는 방법.
제8항에 있어서, 플라스미드 벡터로 형질전환된 균주가 사용되고, 플라스미드 벡터가 포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분 H를 암호화하는 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 방법.
제8항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, L-라이신을 생산하는 코리네형 세균이 사용되는 방법.
제9항에 있어서,

디하이드로피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자,

피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

트리오세포스페이트 이소머라제를 암호화하는 tpi 유전자,

글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

포스포에놀피루베이트-당-포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분 M(ptsM)을 암호화하는 ptsM 유전자,

3-포스포글리세레이트 키나제를 암호화하는 pgk 유전자, 및

라이신 배출을 암호화하는 lysE 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증강, 특히 과발현 또는 증폭시키는 방법.
제10항에 있어서, L-라이신의 제조를 위해,

포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자,

글루코즈-6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자, 및

피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자를 포함하는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 약화된 세균이 발효되는 방법.
제8항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미쿰 속의 미생물이 사용되는 방법.
폴리머라제 연쇄 반응에 의해 ptsH 유전자 산물을 암호화하는 유전자의 DNA를 작제하기 위한 프라이머로서의 제1항에 청구된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열의 용도.
하이브리드화 프로브로서의 제1항에 청구된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 서열의 용도.