JP2001224390A - ｐｔｓＨ−遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 - Google Patents
ｐｔｓＨ−遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列Info
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- C12N9/10—Transferases (2.)
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
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-
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 ｐｔｓＨ−遺伝子を強化させるコリネフォル
ム細菌の使用下での、ｐｔｓＨをコードするヌクレオチ
ド配列及びＬ−アミノ酸の発酵的製造法。 【解決手段】 コリネフォルム細菌から単離された特定
の配列を持つポリヌクレオチドをプライマーとして、
ａ）少なくとも、リン酸転移酵素系の成分Ｈをコードす
る遺伝子を強化、殊に過剰発現するＬ−アミノ酸を生産
するコリネフォルム細菌の発酵、ｂ）培地又は細菌の細
胞中でのＬ−アミノ酸の富化及びｃ）Ｌ−アミノ酸の単
離を実施するＬ−アミノ酸の発酵的製造法に用いる。 【効果】 コリネフォルム細菌により、ｐｔｓＨ−遺伝
子の過剰発現により、Ｌ−アミノ酸、殊にＬ−リシンの
生産性が改善される。
ム細菌の使用下での、ｐｔｓＨをコードするヌクレオチ
ド配列及びＬ−アミノ酸の発酵的製造法。 【解決手段】 コリネフォルム細菌から単離された特定
の配列を持つポリヌクレオチドをプライマーとして、
ａ）少なくとも、リン酸転移酵素系の成分Ｈをコードす
る遺伝子を強化、殊に過剰発現するＬ−アミノ酸を生産
するコリネフォルム細菌の発酵、ｂ）培地又は細菌の細
胞中でのＬ−アミノ酸の富化及びｃ）Ｌ−アミノ酸の単
離を実施するＬ−アミノ酸の発酵的製造法に用いる。 【効果】 コリネフォルム細菌により、ｐｔｓＨ−遺伝
子の過剰発現により、Ｌ−アミノ酸、殊にＬ−リシンの
生産性が改善される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明の対象は、ｐｔｓＨ−
遺伝子を強化させるコリネフォルム細菌の使用下での、
ｐｔｓＨをコードするヌクレオチド配列及びＬ−アミノ
酸、殊にＬ−リシンの発酵的製造法である。
遺伝子を強化させるコリネフォルム細菌の使用下での、
ｐｔｓＨをコードするヌクレオチド配列及びＬ−アミノ
酸、殊にＬ−リシンの発酵的製造法である。
【０００２】
【従来の技術】Ｌ−アミノ酸、殊にＬ−リシンは、人の
医薬及び製薬工業、殊に動物飼料において使用されてい
る。
医薬及び製薬工業、殊に動物飼料において使用されてい
る。
【０００３】Ｌ−アミノ酸が、コリネフォルム細菌、殊
にコリネバクテリウム・グルタミクムの菌株の発酵によ
って製造されることは公知である。重要性が大きいた
め、製造法の改善について絶えず研究がなされている。
方法の改善は、発酵技術的手段、例えば撹拌及び酸素の
供給又は培養基の組成、例えば発酵の間の糖類濃度又は
例えばイオン交換クロマトグラフィーによる生成物形に
するための後加工又は微生物自体の正味効率特性に関係
することがある。
にコリネバクテリウム・グルタミクムの菌株の発酵によ
って製造されることは公知である。重要性が大きいた
め、製造法の改善について絶えず研究がなされている。
方法の改善は、発酵技術的手段、例えば撹拌及び酸素の
供給又は培養基の組成、例えば発酵の間の糖類濃度又は
例えばイオン交換クロマトグラフィーによる生成物形に
するための後加工又は微生物自体の正味効率特性に関係
することがある。
【０００４】前記微生物の効率特性の改善のためには、
突然変異誘発、選択及び突然変異体選択の方法が使用さ
れている。こうして、代謝拮抗物質、例えばリシン−類
似のＳ−（２−アミノエチル）−システインに対して耐
性であるか又は調節に重要な代謝産物の栄養素要求体で
あり、Ｌ−リシンを生産する菌株が得られる。
突然変異誘発、選択及び突然変異体選択の方法が使用さ
れている。こうして、代謝拮抗物質、例えばリシン−類
似のＳ−（２−アミノエチル）−システインに対して耐
性であるか又は調節に重要な代謝産物の栄養素要求体で
あり、Ｌ−リシンを生産する菌株が得られる。
【０００５】数年来、同様に、Ｌ−アミノ酸を生産す
る、コリネバクテリウムの菌株が、Ｌ−アミノ酸の個々
の生合成遺伝子を増幅し、Ｌ−アミノ酸製造に対する効
果を試験することによって、菌株改善のための組換えＤ
ＮＡ技術の方法に使用されている。これについての概論
は、就中、キノシタ（「Ｇｌｕｔａｍｉｃ ＡｃｉｄＢ
ａｃｔｅｒｉａ」；Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｄｅｍａ
ｉｎ及びＳｏｌｏｍｏｎ（編）、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃ
ｕｍｍｉｎｇｓ、英国、ロンドン、１９８５、１１５〜
１４２）、Ｈｉｌｌｉｇｅｒ（ＢｉｏＴｅｃ ２、４０
〜４４（１９９１））、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ（Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄｓ ６：２６１〜２７２（１９９４））、Ｊ
ｅｔｔｅｎ及びＳｉｎｓｋｅｙ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒ
ｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １
５、７３〜１０３（１９９５））及びＳａｈｍ他（Ａｎ
ｎｕａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａ
ｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７８２、２５〜３９
（１９９６））に見られる。
る、コリネバクテリウムの菌株が、Ｌ−アミノ酸の個々
の生合成遺伝子を増幅し、Ｌ−アミノ酸製造に対する効
果を試験することによって、菌株改善のための組換えＤ
ＮＡ技術の方法に使用されている。これについての概論
は、就中、キノシタ（「Ｇｌｕｔａｍｉｃ ＡｃｉｄＢ
ａｃｔｅｒｉａ」；Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓ
ｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、Ｄｅｍａ
ｉｎ及びＳｏｌｏｍｏｎ（編）、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｃ
ｕｍｍｉｎｇｓ、英国、ロンドン、１９８５、１１５〜
１４２）、Ｈｉｌｌｉｇｅｒ（ＢｉｏＴｅｃ ２、４０
〜４４（１９９１））、Ｅｇｇｅｌｉｎｇ（Ａｍｉｎｏ
Ａｃｉｄｓ ６：２６１〜２７２（１９９４））、Ｊ
ｅｔｔｅｎ及びＳｉｎｓｋｅｙ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒ
ｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １
５、７３〜１０３（１９９５））及びＳａｈｍ他（Ａｎ
ｎｕａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａ
ｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７８２、２５〜３９
（１９９６））に見られる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】発明者らは、Ｌ−アミ
ノ酸、殊にＬ−リシンの改善された発酵的製造の新規手
段を提供することを課題とした。
ノ酸、殊にＬ−リシンの改善された発酵的製造の新規手
段を提供することを課題とした。
【０００７】
【課題を解決するための手段】前記課題は、本発明によ
り解決された。
り解決された。
【０００８】発明の説明 Ｌ−アミノ酸、殊にＬ−リシンは、人の医薬、製薬工業
及び動物飼料において使用されている。従って、Ｌ−ア
ミノ酸、殊にＬ−リシンの製造のための新規の改善され
た方法を提供することに一般的な関心がある。
及び動物飼料において使用されている。従って、Ｌ−ア
ミノ酸、殊にＬ−リシンの製造のための新規の改善され
た方法を提供することに一般的な関心がある。
【０００９】以下にＬ−リシン又はリシンと称する場合
には、塩基だけでなく塩、例えばリシン−モノヒドロク
ロリド又はリシン−硫酸塩のことでもある。
には、塩基だけでなく塩、例えばリシン−モノヒドロク
ロリド又はリシン−硫酸塩のことでもある。
【００１０】本発明の対象は、 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
コードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％までが
同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）又はｂ）のポリヌクレオチドに対して相補的で
あるポリヌクレオチド、及び ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチド配列の少な
くとも１５個の連続したヌクレオチドを有するポリヌク
レオチドのグループから選択されたポリヌクレオチド配
列を有するコリネフォルム細菌から単離されたポリヌク
レオチドである。
コードするポリヌクレオチドと少なくとも７０％までが
同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）又はｂ）のポリヌクレオチドに対して相補的で
あるポリヌクレオチド、及び ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチド配列の少な
くとも１５個の連続したヌクレオチドを有するポリヌク
レオチドのグループから選択されたポリヌクレオチド配
列を有するコリネフォルム細菌から単離されたポリヌク
レオチドである。
【００１１】同様に、本発明の対象は、コリネフォルム
細菌中に複製可能な、有利に組換え型のＤＮＡであるポ
リヌクレオチドである。
細菌中に複製可能な、有利に組換え型のＤＮＡであるポ
リヌクレオチドである。
【００１２】同様に、本発明の対象は、ＲＮＡであるポ
リヌクレオチドである。
リヌクレオチドである。
【００１３】同様に、本発明の対象は、（ｉ）配列番号
１で示されるヌクレオチド配列、又は（ｉｉ）遺伝子コ
ードの縮重の領域内の配列（ｉ）に相応する少なくとも
１種の配列、又は（ｉｉｉ）配列（ｉ）又は（ｉｉ）に
対して相補的な配列とハイブリッド形成する少なくとも
１種の配列及び場合により（ｉｖ）（ｉ）における機能
的に中立なセンス突然変異を含む、有利に複製可能なＤ
ＮＡであるポリヌクレオチドである。
１で示されるヌクレオチド配列、又は（ｉｉ）遺伝子コ
ードの縮重の領域内の配列（ｉ）に相応する少なくとも
１種の配列、又は（ｉｉｉ）配列（ｉ）又は（ｉｉ）に
対して相補的な配列とハイブリッド形成する少なくとも
１種の配列及び場合により（ｉｖ）（ｉ）における機能
的に中立なセンス突然変異を含む、有利に複製可能なＤ
ＮＡであるポリヌクレオチドである。
【００１４】他の対象は、前記のポリヌクレオチドの１
種を含むベクター及び該ベクターを含み、ホスト細胞と
して機能するコリネフォルム細菌である。
種を含むベクター及び該ベクターを含み、ホスト細胞と
して機能するコリネフォルム細菌である。
【００１５】同様に、本質的に、配列番号１に相応する
ポリヌクレオチド配列を有する完全遺伝子を有する相応
する遺伝子バンクと、配列番号１による前記ポリヌクレ
オチドの配列又はそのフラグメントを有するプローブと
のハイブリッド形成を用いるスクリーニング及び前記Ｄ
ＮＡ配列の単離によって得られる、ポリヌクレオチド配
列からなるポリヌクレオチドである。
ポリヌクレオチド配列を有する完全遺伝子を有する相応
する遺伝子バンクと、配列番号１による前記ポリヌクレ
オチドの配列又はそのフラグメントを有するプローブと
のハイブリッド形成を用いるスクリーニング及び前記Ｄ
ＮＡ配列の単離によって得られる、ポリヌクレオチド配
列からなるポリヌクレオチドである。
【００１６】本発明によるポリヌクレオチド配列は、リ
ン酸転移酵素系の成分Ｈ（ｐｔｓＨ）をコードするｃＤ
ＮＡの全長を単離し、該ｃＤＮＡ又はリン酸転移酵素系
の成分Ｈの遺伝子の配列と、配列の高度な相似性を示す
遺伝子を単離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びＤＮＡ
のハイブリッド形成プローブとして適している。
ン酸転移酵素系の成分Ｈ（ｐｔｓＨ）をコードするｃＤ
ＮＡの全長を単離し、該ｃＤＮＡ又はリン酸転移酵素系
の成分Ｈの遺伝子の配列と、配列の高度な相似性を示す
遺伝子を単離するための、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びＤＮＡ
のハイブリッド形成プローブとして適している。
【００１７】更に、本発明によるポリヌクレオチド配列
は、ポリメラーゼ連鎖反応による、リン酸転移酵素系の
成分Ｈをコードする遺伝子のＤＮＡの製造のためのプラ
イマーとして適している。
は、ポリメラーゼ連鎖反応による、リン酸転移酵素系の
成分Ｈをコードする遺伝子のＤＮＡの製造のためのプラ
イマーとして適している。
【００１８】プローブ又はプライマーとして機能する前
記オリゴヌクレオチドは、少なくとも３０個、有利に少
なくとも２０個、なかでも特に有利に少なくとも１５個
の順次連なるヌクレオチドを有している。同様に、少な
くとも４０〜５０個のヌクレオチドの長さを有するオリ
ゴヌクレオチドも適している。
記オリゴヌクレオチドは、少なくとも３０個、有利に少
なくとも２０個、なかでも特に有利に少なくとも１５個
の順次連なるヌクレオチドを有している。同様に、少な
くとも４０〜５０個のヌクレオチドの長さを有するオリ
ゴヌクレオチドも適している。
【００１９】「単離」とは、その自然の周囲から分離さ
れることを意味する。
れることを意味する。
【００２０】「ポリヌクレオチド」とは、一般に、ポリ
リボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドに
関するものであるが、この場合、縮重されていないＲＮ
Ａ又はＤＮＡ又は縮重されたＲＮＡ又はＤＮＡのことで
あってもよい。
リボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドに
関するものであるが、この場合、縮重されていないＲＮ
Ａ又はＤＮＡ又は縮重されたＲＮＡ又はＤＮＡのことで
あってもよい。
【００２１】「ポリペプチド」とは、ペプチド又はペプ
チド結合を介して２つ又はそれ以上結合したアミノ酸を
含むタンパクのことである。
チド結合を介して２つ又はそれ以上結合したアミノ酸を
含むタンパクのことである。
【００２２】本発明によるポリペプチドは、配列番号２
によるポリペプチド、更に、リン酸転移酵素系の成分Ｈ
の生物活性有するもの並びに配列番号２によるポリペプ
チドと少なくとも７０％までが同一であり、有利に、配
列番号２によるポリペプチドと少なくとも８０％まで、
殊に少なくとも９０〜９５％までの同一性及び前記の活
性を示すものを含む。
によるポリペプチド、更に、リン酸転移酵素系の成分Ｈ
の生物活性有するもの並びに配列番号２によるポリペプ
チドと少なくとも７０％までが同一であり、有利に、配
列番号２によるポリペプチドと少なくとも８０％まで、
殊に少なくとも９０〜９５％までの同一性及び前記の活
性を示すものを含む。
【００２３】更に、本発明は、殊に既にＬ−アミノ酸を
生産し、ｐｔｓＨ−遺伝子をコードするヌクレオチド配
列を強化、殊に過剰発現するコリネフォルム細菌の使用
下での、Ｌ−アミノ酸、殊にＬ−リシンの発酵的製造法
に関するものである。
生産し、ｐｔｓＨ−遺伝子をコードするヌクレオチド配
列を強化、殊に過剰発現するコリネフォルム細菌の使用
下での、Ｌ−アミノ酸、殊にＬ−リシンの発酵的製造法
に関するものである。
【００２４】「強化」という概念は、前記の関係では、
例えば１種もしくはそれ以上の遺伝子の複製数を増大さ
せ、強力なプロモーターを使用するか又は高い活性を有
する相応する酵素をコードする遺伝子を使用するか、場
合によりこれらの手段を組合せることによって、相応す
るＤＮＡによってコードされる微生物中の１種又はそれ
以上の酵素の細胞内活性の向上を説明している。
例えば１種もしくはそれ以上の遺伝子の複製数を増大さ
せ、強力なプロモーターを使用するか又は高い活性を有
する相応する酵素をコードする遺伝子を使用するか、場
合によりこれらの手段を組合せることによって、相応す
るＤＮＡによってコードされる微生物中の１種又はそれ
以上の酵素の細胞内活性の向上を説明している。
【００２５】本発明の対象である微生物は、Ｌ−アミノ
酸、殊にＬ−リシンを、グルコース、サッカロース、ラ
クトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプ
ン、セルロース又はグリセリン及びエタノールから製造
することができる。コリネフォルム細菌の代表とは、殊
にコリネバクテリア属である。コリネバクテリウム属の
場合、殊にコリネバクテリウム・グルタミクム種が挙げ
られるが、これは、当業者の間では、Ｌ−アミノ酸を生
産する能力について知られている。
酸、殊にＬ−リシンを、グルコース、サッカロース、ラ
クトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、デンプ
ン、セルロース又はグリセリン及びエタノールから製造
することができる。コリネフォルム細菌の代表とは、殊
にコリネバクテリア属である。コリネバクテリウム属の
場合、殊にコリネバクテリウム・グルタミクム種が挙げ
られるが、これは、当業者の間では、Ｌ−アミノ酸を生
産する能力について知られている。
【００２６】コリネバクテリウム属、殊にコリネバクテ
リウム・グルタミクム種の適当な菌株は、例えば公知の
野生型菌株 コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ１
５８０６ コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・テルモアミノゲン ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１５３９ コリネバクテリウム・メラッセコラ ＡＴＣＣ１７９６
５ ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム ＡＴＣＣ
１３８６９及び ブレビバクテリウム・ジバリカツム ＡＴＣＣ１４０２
０ 及びこれらから製造されたＬ−リシン生産性突然変異体
もしくは菌株、例えば コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム・フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４及び コリネバクテリウム・グルタミクム ＤＳＭ５７１５ である。
リウム・グルタミクム種の適当な菌株は、例えば公知の
野生型菌株 コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２ コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ＡＴＣＣ１
５８０６ コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ＡＴＣＣ
１３８７０ コリネバクテリウム・テルモアミノゲン ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１５３９ コリネバクテリウム・メラッセコラ ＡＴＣＣ１７９６
５ ブレビバクテリウム・フラブム ＡＴＣＣ１４０６７ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム ＡＴＣＣ
１３８６９及び ブレビバクテリウム・ジバリカツム ＡＴＣＣ１４０２
０ 及びこれらから製造されたＬ−リシン生産性突然変異体
もしくは菌株、例えば コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ １
７０９ ブレビバクテリウム・フラブム ＦＥＲＭ−Ｐ １７０
８ ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンツム ＦＥＲＭ
−Ｐ １７１２ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６３ コリネバクテリウム・グルタミクム ＦＥＲＭ−Ｐ ６
４６４及び コリネバクテリウム・グルタミクム ＤＳＭ５７１５ である。
【００２７】発明者らは、リン酸転移酵素系の成分Ｈを
コードする新規ｐｔｓＨ−遺伝子をＣ．グルタミクムか
ら単離することに成功した。
コードする新規ｐｔｓＨ−遺伝子をＣ．グルタミクムか
ら単離することに成功した。
【００２８】Ｃ．グルタミクムからのｐｔｓＨ−遺伝子
あるいはまた別の遺伝子の単離のために、まず、前記微
生物の遺伝子バンクをＥ．Ｃｏｌｉに導入する。遺伝子
バンクの導入は、一般に公知の教科書及びハンドブック
に記載されている。例としては、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒの
教科書：Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌｏｎｅ，ＥｉｎｅＥｉ
ｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｇｅｎｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅ（Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎ
ｈｅｉｍ、ドイツ連邦共和国、１９９０）又はＳａｍｂ
ｒｏｏｋ他のハンドブック：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）が挙げられる。極
めてよく知られた遺伝子バンクは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−
１２菌株Ｗ３１１０のものであり、これはＫｏｈａｒａ
他（Ｃｅｌｌ ５０、４９５〜５０８（１９８７））に
よりλ−ベクターに導入された。Ｂａｔｈｅ他（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄＧｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、２５２：２５５〜２６５、１９９６）は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｋ−１２菌株ＮＭ５５４（Ｒａｌｅｉｇｈ他、１
９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ １６：１５６３〜１５７５）中のコスミドベクター
ＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ（Ｗａｈｌ他、１９８７、Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｎｅｃｅｓ ＵＳＡ、８
４：２１６０〜２１６４）を用いて導入されたＣ．グル
タミクムＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子バンクを説明して
いる。他方で、Ｂｏｅｒｍａｎｎ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６（３）、３１７〜３
２６（１９９２））は、コスミド ｐＨＣ７９（Ｈｏｈ
ｎ ｕｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｇｅｎｅ １１、２９１
〜２９８（１９８０））の使用下でのＣ．グルタミクム
ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子バンクを説明している。
Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣ．グルタミクムの遺伝子バンクの製
造のためには、プラスミド、例えばｐＢＲ３２２（Ｂｏ
ｌｉｖａｒ他、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２５、８
０７〜８１８（１９７９））又はｐＵＣ9（Ｖｉｅｉｒ
ａ他、１９８２、Ｇｅｎｅ、１９：２５９〜２６８）を
使用することもできる。ホストとしては、制限欠陥及び
組換え欠陥であるＥ．ｃｏｌｉが特に適している。これ
についての例は、Ｇｒａｎｔ他（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ、８７（１９９０）
４６４５〜４６４９）によって説明されたＤＨ５αＭＣ
Ｒ菌株である。コスミドを用いてクローンされた長いＤ
ＮＡフラグメントは、例えばＳａｎｇｅｒ他（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃ
ａ、７４：５４６３〜５４６７、１９７７）により記載
されているように、引き続き、配列化に適する通常のベ
クター中に再度サブクローニングし、引き続き、配列さ
せることができる。
あるいはまた別の遺伝子の単離のために、まず、前記微
生物の遺伝子バンクをＥ．Ｃｏｌｉに導入する。遺伝子
バンクの導入は、一般に公知の教科書及びハンドブック
に記載されている。例としては、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒの
教科書：Ｇｅｎｅ ｕｎｄ Ｋｌｏｎｅ，ＥｉｎｅＥｉ
ｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｇｅｎｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅ（Ｖｅｒｌａｇ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗｅｉｎ
ｈｅｉｍ、ドイツ連邦共和国、１９９０）又はＳａｍｂ
ｒｏｏｋ他のハンドブック：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）が挙げられる。極
めてよく知られた遺伝子バンクは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−
１２菌株Ｗ３１１０のものであり、これはＫｏｈａｒａ
他（Ｃｅｌｌ ５０、４９５〜５０８（１９８７））に
よりλ−ベクターに導入された。Ｂａｔｈｅ他（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄＧｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、２５２：２５５〜２６５、１９９６）は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ Ｋ−１２菌株ＮＭ５５４（Ｒａｌｅｉｇｈ他、１
９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ １６：１５６３〜１５７５）中のコスミドベクター
ＳｕｐｅｒＣｏｓ Ｉ（Ｗａｈｌ他、１９８７、Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｎｅｃｅｓ ＵＳＡ、８
４：２１６０〜２１６４）を用いて導入されたＣ．グル
タミクムＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子バンクを説明して
いる。他方で、Ｂｏｅｒｍａｎｎ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６（３）、３１７〜３
２６（１９９２））は、コスミド ｐＨＣ７９（Ｈｏｈ
ｎ ｕｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｇｅｎｅ １１、２９１
〜２９８（１９８０））の使用下でのＣ．グルタミクム
ＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子バンクを説明している。
Ｅ．ｃｏｌｉ中のＣ．グルタミクムの遺伝子バンクの製
造のためには、プラスミド、例えばｐＢＲ３２２（Ｂｏ
ｌｉｖａｒ他、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２５、８
０７〜８１８（１９７９））又はｐＵＣ9（Ｖｉｅｉｒ
ａ他、１９８２、Ｇｅｎｅ、１９：２５９〜２６８）を
使用することもできる。ホストとしては、制限欠陥及び
組換え欠陥であるＥ．ｃｏｌｉが特に適している。これ
についての例は、Ｇｒａｎｔ他（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ
ｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＵＳＡ、８７（１９９０）
４６４５〜４６４９）によって説明されたＤＨ５αＭＣ
Ｒ菌株である。コスミドを用いてクローンされた長いＤ
ＮＡフラグメントは、例えばＳａｎｇｅｒ他（Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａ
ｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃ
ａ、７４：５４６３〜５４６７、１９７７）により記載
されているように、引き続き、配列化に適する通常のベ
クター中に再度サブクローニングし、引き続き、配列さ
せることができる。
【００２９】こうして、本発明の成分が配列番号１であ
る、ｐｔｓＨをコードする新規ＤＮＡ配列がＣ．グルタ
ミクムから得られた。更に、このＤＮＡ配列から上記の
方法で相応するタンパクのアミノ酸配列が導き出され
た。配列番号２には、得られたｐｔｓＨ−遺伝子生成物
のアミノ酸配列が表されている。
る、ｐｔｓＨをコードする新規ＤＮＡ配列がＣ．グルタ
ミクムから得られた。更に、このＤＮＡ配列から上記の
方法で相応するタンパクのアミノ酸配列が導き出され
た。配列番号２には、得られたｐｔｓＨ−遺伝子生成物
のアミノ酸配列が表されている。
【００３０】配列番号１から、遺伝子コードの縮重によ
って得られるコードかＤＮＡ配列は、同様に本発明の構
成要素である。当業者の間では、更に、タンパク中での
保存的アミノ酸代謝、例えばグリシンとアラニン又はア
スパラギン酸とグルタミン酸との代謝は、タンパクの活
性の根本的な変化にはつながらず、即ち、機能的に中立
である「センス突然変異」（ｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉ
ｏｎｓ）として公知である。更に、タンパクのＮ−末端
及び／又はＣ−末端における変化が、その機能を本質的
には損なわないか又はむしろ安定化させることがあると
いうことは公知である。これについての記載は、当業者
により、就中、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ他（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６９：７５１
〜７５７（１９８７））、Ｏ’Ｒｅｇａｎ他（Ｇｅｎｅ
７７：２３７〜２５１（１９８９））、Ｓａｈｉｎ−
Ｔｏｔｈ他（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３：
２４０〜２４７（１９９４））、Ｈｏｃｈｕｌｉ他（Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１３２１〜１３２５
（１９９８））並びに遺伝学及び分子生物学の公知の教
科書に見出される。相応する方法で配列番号２から得ら
れるアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ配列は、同様に本発明の構成要素である。
って得られるコードかＤＮＡ配列は、同様に本発明の構
成要素である。当業者の間では、更に、タンパク中での
保存的アミノ酸代謝、例えばグリシンとアラニン又はア
スパラギン酸とグルタミン酸との代謝は、タンパクの活
性の根本的な変化にはつながらず、即ち、機能的に中立
である「センス突然変異」（ｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｉ
ｏｎｓ）として公知である。更に、タンパクのＮ−末端
及び／又はＣ−末端における変化が、その機能を本質的
には損なわないか又はむしろ安定化させることがあると
いうことは公知である。これについての記載は、当業者
により、就中、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ他（Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １６９：７５１
〜７５７（１９８７））、Ｏ’Ｒｅｇａｎ他（Ｇｅｎｅ
７７：２３７〜２５１（１９８９））、Ｓａｈｉｎ−
Ｔｏｔｈ他（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３：
２４０〜２４７（１９９４））、Ｈｏｃｈｕｌｉ他（Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１３２１〜１３２５
（１９９８））並びに遺伝学及び分子生物学の公知の教
科書に見出される。相応する方法で配列番号２から得ら
れるアミノ酸配列及び該アミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ配列は、同様に本発明の構成要素である。
【００３１】同様に、配列番号１又は配列番号１の一部
とハイブリッド形成するＤＮＡ配列も本発明の構成要素
である。最終的に、配列番号１から得られるプライマー
の使用下にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製
造されるＤＮＡ配列は、本発明の構成要素である。この
種のオリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも１
５個のヌクレオチドの長さを有している。
とハイブリッド形成するＤＮＡ配列も本発明の構成要素
である。最終的に、配列番号１から得られるプライマー
の使用下にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製
造されるＤＮＡ配列は、本発明の構成要素である。この
種のオリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも１
５個のヌクレオチドの長さを有している。
【００３２】ハイブリッド形成を用いるＤＮＡ配列の同
定のためのマニュアルは、当業者により、就中、ベーリ
ンガー マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）（ドイツ連邦共和国、マンハイ
ム在、１９９３）の「ＴｈｅＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕ
ｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂ
ｒｉｄｄｉｚａｔｉｏｎ」及びＬｉｅｂｅｌ他（Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９
１）４１：２５５〜２６０）に見出される。ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ配列の増幅のため
のマニュアルは、当業者により、就中、Ｇａｉｔのハン
ドブック：Ｏｌｉｇｏｎｕｋｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃ
ｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、英国、オクスフォード在、１
９８４）及びＮｅｗｔｏｎ及びＧｒａｈａｍ：ＰＣＲ
（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅ
ｒｌａｇ、ドイツ連邦共和国、ハイデルベルグ在、１９
９４）に見出される。
定のためのマニュアルは、当業者により、就中、ベーリ
ンガー マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）（ドイツ連邦共和国、マンハイ
ム在、１９９３）の「ＴｈｅＤＩＧ Ｓｙｓｔｅｍ Ｕ
ｓｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂ
ｒｉｄｄｉｚａｔｉｏｎ」及びＬｉｅｂｅｌ他（Ｉｎｔ
ｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９９
１）４１：２５５〜２６０）に見出される。ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ配列の増幅のため
のマニュアルは、当業者により、就中、Ｇａｉｔのハン
ドブック：Ｏｌｉｇｏｎｕｋｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃ
ｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、英国、オクスフォード在、１
９８４）及びＮｅｗｔｏｎ及びＧｒａｈａｍ：ＰＣＲ
（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅ
ｒｌａｇ、ドイツ連邦共和国、ハイデルベルグ在、１９
９４）に見出される。
【００３３】発明者らは、コリネフォルム細菌が、ｐｔ
ｓＨ−遺伝子の過剰発現により、改善されて、Ｌ−アミ
ノ酸、殊にＬ−リシンを生産することを見出した。
ｓＨ−遺伝子の過剰発現により、改善されて、Ｌ−アミ
ノ酸、殊にＬ−リシンを生産することを見出した。
【００３４】過剰発現の達成のためには、相応する遺伝
子の複製数を増大させることができるか又はプロモータ
ー領域及び調節領域又は、構造遺伝子の手前に存在する
リボソーム結合部位を突然変異させることができる。同
様に、構造遺伝子の手前に組み込まれた発現カセットが
作用する。誘導可能なプロモーターによって、付加的
に、発酵的Ｌ−アミノ酸生産の過程で発現を増大させる
ことが可能である。ｍ−ＲＮＡの延命手段によって、同
様に、発現を改善することができる。更に、酵素タンパ
クの分解の防止によって、同様に、酵素活性が強化され
る。遺伝子又は遺伝子構成は、種々の複製数を有するプ
ラスミド中に存在していてもよいか又は染色体中に組み
込まれ、増幅されていてもよい。更にまた、当該遺伝子
の過剰発現は、培地組成の変更及び培養操作によって達
成することができる。
子の複製数を増大させることができるか又はプロモータ
ー領域及び調節領域又は、構造遺伝子の手前に存在する
リボソーム結合部位を突然変異させることができる。同
様に、構造遺伝子の手前に組み込まれた発現カセットが
作用する。誘導可能なプロモーターによって、付加的
に、発酵的Ｌ−アミノ酸生産の過程で発現を増大させる
ことが可能である。ｍ−ＲＮＡの延命手段によって、同
様に、発現を改善することができる。更に、酵素タンパ
クの分解の防止によって、同様に、酵素活性が強化され
る。遺伝子又は遺伝子構成は、種々の複製数を有するプ
ラスミド中に存在していてもよいか又は染色体中に組み
込まれ、増幅されていてもよい。更にまた、当該遺伝子
の過剰発現は、培地組成の変更及び培養操作によって達
成することができる。
【００３５】これについてのマニュアルは、当業者によ
り、Ｍａｒｔｉｎ他（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
５、１３７〜１４６（１９８７））、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ
他（Ｇｅｎｅ １３８、３５〜４１（１９９４））、Ｔ
ｓｕｃｈｉｙａ及びＭｏｒｉｎａｇａ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ ６、４２８〜４３０（１９８８）），
Ｅｉｋｍａｎｎｓ他（Ｇｅｎｅ １０２、９３〜９８
（１９９１））、欧州特許第０４７２８６９号、米国特
許第４６０１８９３号、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ及びＰｕｅ
ｈｌｅｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，８４〜
８７（１９９１））、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ他（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０、１２６〜１３２（１９９
４））、ＬａＢａｒｒｅ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ａｃｈｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５、１００１〜１００
７（１９９３））、国際公開番号ＷＯ９６／１５２４６
号、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ他（Ｇｅｎｅ １３４、１５〜
２４（１９９３））、特開平１０−２２９８９１号公
報、Ｊｅｎｓｅｎ及びＨａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
５８、１９１〜１９５（１９９８））、Ｍａｋｒｉｄｅ
ｓ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
６０：５１２〜５３８（１９９６））並びに遺伝子学
及び分子生物学の公知の教科書に見出される。
り、Ｍａｒｔｉｎ他（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
５、１３７〜１４６（１９８７））、Ｇｕｅｒｒｅｒｏ
他（Ｇｅｎｅ １３８、３５〜４１（１９９４））、Ｔ
ｓｕｃｈｉｙａ及びＭｏｒｉｎａｇａ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ ６、４２８〜４３０（１９８８）），
Ｅｉｋｍａｎｎｓ他（Ｇｅｎｅ １０２、９３〜９８
（１９９１））、欧州特許第０４７２８６９号、米国特
許第４６０１８９３号、Ｓｃｈｗａｒｚｅｒ及びＰｕｅ
ｈｌｅｒ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９，８４〜
８７（１９９１））、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ他（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０、１２６〜１３２（１９９
４））、ＬａＢａｒｒｅ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂ
ａｃｈｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７５、１００１〜１００
７（１９９３））、国際公開番号ＷＯ９６／１５２４６
号、Ｍａｌｕｍｂｒｅｓ他（Ｇｅｎｅ １３４、１５〜
２４（１９９３））、特開平１０−２２９８９１号公
報、Ｊｅｎｓｅｎ及びＨａｍｍｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
５８、１９１〜１９５（１９９８））、Ｍａｋｒｉｄｅ
ｓ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
６０：５１２〜５３８（１９９６））並びに遺伝子学
及び分子生物学の公知の教科書に見出される。
【００３６】例えば、本発明によるｐｔｓＨ−遺伝子
は、プラスミドを用いて過剰発現させた。
は、プラスミドを用いて過剰発現させた。
【００３７】プラスミドとしては、コリネフォルム細菌
中に複製されるものが適している。多数の公知のプラス
ミドベクター、例えばｐＺ１（Ｍｅｎｋｅｌ他、Ａｐｐ
ｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）６４：５４９〜５５
４）、ｐＥＫＥｘ１（Ｅｉｋｍａｎｎｓ他、Ｇｅｎｅ１
０２：９３〜９８（１９９１））又はｐＨＳ２−１（Ｓ
ｏｎｎｅｎ他、Ｇｅｎｅ １０７：６９〜７４（１９９
１））は、潜在プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１又
はｐＧＡ１に基づいている。別のプラスミドベクター、
例えばｐＣＧ４（米国特許第４４８９１６０号）又はｐ
ＮＧ２（Ｓｅｒｗｏｌｄ−Ｄａｖｉｓ他、ＰＥＭＳ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６６、１１
９〜１２４（１９９０））又はｐＡＧ１（米国特許第５
１５８８９１号）に基づくものも、同様に使用できる。
中に複製されるものが適している。多数の公知のプラス
ミドベクター、例えばｐＺ１（Ｍｅｎｋｅｌ他、Ａｐｐ
ｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）６４：５４９〜５５
４）、ｐＥＫＥｘ１（Ｅｉｋｍａｎｎｓ他、Ｇｅｎｅ１
０２：９３〜９８（１９９１））又はｐＨＳ２−１（Ｓ
ｏｎｎｅｎ他、Ｇｅｎｅ １０７：６９〜７４（１９９
１））は、潜在プラスミドｐＨＭ１５１９、ｐＢＬ１又
はｐＧＡ１に基づいている。別のプラスミドベクター、
例えばｐＣＧ４（米国特許第４４８９１６０号）又はｐ
ＮＧ２（Ｓｅｒｗｏｌｄ−Ｄａｖｉｓ他、ＰＥＭＳ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６６、１１
９〜１２４（１９９０））又はｐＡＧ１（米国特許第５
１５８８９１号）に基づくものも、同様に使用できる。
【００３８】更に、Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄ他（Ａｐｐｌ
ｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０、１２６〜１３２（１９９
４））によってｈｏｍ−ｔｈｒＢ−Ｏｐｅｒｏｎｓの重
複もしくは増幅について説明されているように、染色体
の中への組み込みによる遺伝子増幅の方法を使用するこ
とができるプラスミドベクターが適している。前記の方
法の場合、完全遺伝子が、プラスミドベクター中にクロ
ーニングされるが、これは、ホスト（代表的にはＥ．ｃ
ｏｌｉ）中に複製されるのであって、Ｃ．グルタミクム
中には複製できない。ベクターとしては、例えばｐＳＵ
Ｐ３０１（Ｓｉｍｏｎ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ １、７８４〜７９１（１９８３））、ｐＫ１８ｍｏ
ｂ又はｐＫ１９ｍｏｂ（Ｓｃｈａｅｆｅｒ他、Ｇｅｎｅ
１４５、６９〜７３（１９９４））、ｐＧＥＭ−Ｔ
（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉ
ｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｓ
ｈｕｍａｎ（１９９４）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９：３２
６７８〜８４；米国特許第５４８７９９３号）、ｐＣＲ
（Ｒ）Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｒｏｎ
ｉｎｇｅｎ、Ｎｉｅｄｅｒｌａｎｄｅ；Ｂｅｒｎａｒｄ
他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、２３４：５３４〜５４１（１９９３））又
はｐＥＭ１（Ｓｃｈｒｕｍｐｆ他、１９９１、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７３：４
５１０〜４５１６）が該当する。増幅すべき遺伝子を含
むプラスミドベクターは、引き続き、接合又は形質転換
によって、Ｃ．グルタミクムの所望の菌株に変えられ
る。接合の方法は、例えばＳｃｈａｅｆｅｒ他（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０，７５６〜７５９（１９９
４））により記載されている。形質転換の方法は、例え
ばＴｈｉｅｒｂａｃｈ他（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
２９，３５６〜３６２（１９８８））、Ｄｕｎｉｃａ
ｎ及びＳｈｉｖｎａｎ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
７、１０６７〜１０７０（１９８９））及びＴａｕｃ
ｈ他（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ １２３、３４３〜３４７（１９９４））
に記載されている。「交差」現象を用いる同種組換え後
に、生じた菌株は、当該遺伝子の少なくとも２つの複製
を有している。
ｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０、１２６〜１３２（１９９
４））によってｈｏｍ−ｔｈｒＢ−Ｏｐｅｒｏｎｓの重
複もしくは増幅について説明されているように、染色体
の中への組み込みによる遺伝子増幅の方法を使用するこ
とができるプラスミドベクターが適している。前記の方
法の場合、完全遺伝子が、プラスミドベクター中にクロ
ーニングされるが、これは、ホスト（代表的にはＥ．ｃ
ｏｌｉ）中に複製されるのであって、Ｃ．グルタミクム
中には複製できない。ベクターとしては、例えばｐＳＵ
Ｐ３０１（Ｓｉｍｏｎ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ １、７８４〜７９１（１９８３））、ｐＫ１８ｍｏ
ｂ又はｐＫ１９ｍｏｂ（Ｓｃｈａｅｆｅｒ他、Ｇｅｎｅ
１４５、６９〜７３（１９９４））、ｐＧＥＭ−Ｔ
（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉ
ｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｓ
ｈｕｍａｎ（１９９４）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９：３２
６７８〜８４；米国特許第５４８７９９３号）、ｐＣＲ
（Ｒ）Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇｒｏｎ
ｉｎｇｅｎ、Ｎｉｅｄｅｒｌａｎｄｅ；Ｂｅｒｎａｒｄ
他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ、２３４：５３４〜５４１（１９９３））又
はｐＥＭ１（Ｓｃｈｒｕｍｐｆ他、１９９１、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７３：４
５１０〜４５１６）が該当する。増幅すべき遺伝子を含
むプラスミドベクターは、引き続き、接合又は形質転換
によって、Ｃ．グルタミクムの所望の菌株に変えられ
る。接合の方法は、例えばＳｃｈａｅｆｅｒ他（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６０，７５６〜７５９（１９９
４））により記載されている。形質転換の方法は、例え
ばＴｈｉｅｒｂａｃｈ他（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
２９，３５６〜３６２（１９８８））、Ｄｕｎｉｃａ
ｎ及びＳｈｉｖｎａｎ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
７、１０６７〜１０７０（１９８９））及びＴａｕｃ
ｈ他（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌ
ｅｔｔｅｒｓ １２３、３４３〜３４７（１９９４））
に記載されている。「交差」現象を用いる同種組換え後
に、生じた菌株は、当該遺伝子の少なくとも２つの複製
を有している。
【００３９】従って、本発明のもう１つの対象は、プラ
スミドベクターを用いて形質転換した菌株を使用し、か
つ該プラスミドベクターが、リン酸転移酵素系の成分Ｈ
をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を有する、Ｌ−
アミノ酸、殊にＬ−リシンの発酵的製造法である。
スミドベクターを用いて形質転換した菌株を使用し、か
つ該プラスミドベクターが、リン酸転移酵素系の成分Ｈ
をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を有する、Ｌ−
アミノ酸、殊にＬ−リシンの発酵的製造法である。
【００４０】更に、Ｌ−アミノ酸、殊にＬ−リシンの製
造にとっては、ｐｔｓＨ−遺伝子とともに、所望のＬ−
アミノ酸の生合成経路の別の遺伝子を強化し、これによ
り、それぞれの生合成経路の１種又はそれ以上の酵素、
グリコース、補充反応又はアミノ酸エクスポートを過剰
発現することが有利であることもある。
造にとっては、ｐｔｓＨ−遺伝子とともに、所望のＬ−
アミノ酸の生合成経路の別の遺伝子を強化し、これによ
り、それぞれの生合成経路の１種又はそれ以上の酵素、
グリコース、補充反応又はアミノ酸エクスポートを過剰
発現することが有利であることもある。
【００４１】従って、例えばＬ−リシンの製造のために
は、ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするｄａ
ｐＡ−遺伝子（欧州特許第０１９７３３５号）、グリセ
ルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素をコードするｇａ
ｐ−遺伝子（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２）、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７４：６０
７６〜６０８６）、トリオースリン酸−イソメラーゼを
コードするｔｐｉ−遺伝子（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９
２）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ１７４：６０７６〜６０８６）、３−ホスホグリセリ
ン酸キナーゼをコードするｐｇｋ−遺伝子（Ｅｉｋｍａ
ｎｎｓ（１９９２）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ１７４：６０７６〜６０８６）、ホス
ホエノールピルビン酸−糖−リン酸転移酵素系の成分Ｍ
（ｐｔｓＭ）をコードするｐｔｓＭ−遺伝子（Ｌｅｅ他
（１９９４）、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｔｅｒｓ １〜２、１３７〜１４５）、ピルビン
酸−カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ−遺伝子（ド
イツ連邦共和国特許出願公開第１９８３１６０９号）、
及びリシン−エクスポートをコードするｌｙｓＥ−遺伝
子（ドイツ連邦共和国特許出願公開第１９５４８２２２
号）のグループから選択された１種又はそれ以上の遺伝
子を同時に過剰発現させることができる。
は、ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコードするｄａ
ｐＡ−遺伝子（欧州特許第０１９７３３５号）、グリセ
ルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素をコードするｇａ
ｐ−遺伝子（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９２）、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７４：６０
７６〜６０８６）、トリオースリン酸−イソメラーゼを
コードするｔｐｉ−遺伝子（Ｅｉｋｍａｎｎｓ（１９９
２）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ１７４：６０７６〜６０８６）、３−ホスホグリセリ
ン酸キナーゼをコードするｐｇｋ−遺伝子（Ｅｉｋｍａ
ｎｎｓ（１９９２）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ１７４：６０７６〜６０８６）、ホス
ホエノールピルビン酸−糖−リン酸転移酵素系の成分Ｍ
（ｐｔｓＭ）をコードするｐｔｓＭ−遺伝子（Ｌｅｅ他
（１９９４）、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
Ｌｅｔｔｅｒｓ １〜２、１３７〜１４５）、ピルビン
酸−カルボキシラーゼをコードするｐｙｃ−遺伝子（ド
イツ連邦共和国特許出願公開第１９８３１６０９号）、
及びリシン−エクスポートをコードするｌｙｓＥ−遺伝
子（ドイツ連邦共和国特許出願公開第１９５４８２２２
号）のグループから選択された１種又はそれ以上の遺伝
子を同時に過剰発現させることができる。
【００４２】更に、Ｌ−アミノ酸、殊にＬ−リシンの製
造のためには、ｐｔｓＨ−遺伝子とともに、ホスホノエ
ノールピルビン酸−カルボキシキナーゼをコードするｐ
ｃｋ−遺伝子（ドイツ連邦共和国特許第１９９５０４０
９．１号、ＤＳＭ１３０４７）及び／又はグルコース−
６−リン酸−イソメラーゼをコードするｐｇｉ−遺伝子
（米国０９／３９６、４７８、ＤＳＭ１２９６９） ピルビン酸オキシダーゼをコードするｐｏｘＢ−遺伝子
（ドイツ連邦共和国特許第１９８４６４９９．１号；Ｄ
ＳＭ１３１１４）のグループから選択された１種又はそ
れ以上の遺伝子を同時に減弱させることができる。
造のためには、ｐｔｓＨ−遺伝子とともに、ホスホノエ
ノールピルビン酸−カルボキシキナーゼをコードするｐ
ｃｋ−遺伝子（ドイツ連邦共和国特許第１９９５０４０
９．１号、ＤＳＭ１３０４７）及び／又はグルコース−
６−リン酸−イソメラーゼをコードするｐｇｉ−遺伝子
（米国０９／３９６、４７８、ＤＳＭ１２９６９） ピルビン酸オキシダーゼをコードするｐｏｘＢ−遺伝子
（ドイツ連邦共和国特許第１９８４６４９９．１号；Ｄ
ＳＭ１３１１４）のグループから選択された１種又はそ
れ以上の遺伝子を同時に減弱させることができる。
【００４３】更に、Ｌ−アミノ酸、殊にＬ−リシンの製
造のためには、ｐｔｓＨ−遺伝子の過剰発現とともに、
望ましくない副反応を遮断することができる（Ｏｖｅｒ
ｏｒｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ、Ｋｒｕｍｐｈａｎｚｌ、Ｓｉｋｙｔａ，
Ｖａｎｅｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｕ
Ｋ、ロンドン在、１９８２中のＮａｋａｙａｍａ：「Ｂ
ｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆＡｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｄ
ｕｃｉｎｇ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」）。
造のためには、ｐｔｓＨ−遺伝子の過剰発現とともに、
望ましくない副反応を遮断することができる（Ｏｖｅｒ
ｏｒｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ、Ｋｒｕｍｐｈａｎｚｌ、Ｓｉｋｙｔａ，
Ｖａｎｅｋ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｕ
Ｋ、ロンドン在、１９８２中のＮａｋａｙａｍａ：「Ｂ
ｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆＡｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｄ
ｕｃｉｎｇ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ」）。
【００４４】本発明により製造された微生物は、連続的
にか又は非連続的にバッチ法（回分培養）又は流加法
（Ｆｅｄ ｂａｔｃｈ−Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ）（流入
法）又は繰返し流加法（繰返し流入法）で、Ｌ−アミノ
酸、殊にＬ−リシンの生産の目的で培養することができ
る。公知の培養法についての概要は、Ｃｈｍｉｅｌの教
科書（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ １．Ｅｉ
ｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈ
ｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅ
ｒ Ｖｅｒｌａｇ、シュトゥットガルト、１９９１））
又はＳｔｏｒｈａｓの教科書（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅ
ｎ ｕｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕ
ｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９４））中に
記載されている。
にか又は非連続的にバッチ法（回分培養）又は流加法
（Ｆｅｄ ｂａｔｃｈ−Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ）（流入
法）又は繰返し流加法（繰返し流入法）で、Ｌ−アミノ
酸、殊にＬ−リシンの生産の目的で培養することができ
る。公知の培養法についての概要は、Ｃｈｍｉｅｌの教
科書（Ｂｉｏｐｒｏｚｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ １．Ｅｉ
ｎｆｕｅｈｒｕｎｇ ｉｎｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈ
ｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅ
ｒ Ｖｅｒｌａｇ、シュトゥットガルト、１９９１））
又はＳｔｏｒｈａｓの教科書（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅ
ｎ ｕｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕ
ｎｇｅｎ（Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｒａｕｎｓ
ｃｈｗｅｉｇ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９４））中に
記載されている。
【００４５】使用すべき培地は、適当な方法で、各菌株
の要求を満たしていなければならない。種々の微生物の
培地の説明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆ
ｏｒＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙのハンドブック「Ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａ
ｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ Ｄ．Ｃ．、米国、１９８１）に記載されている。炭
素源としては、糖類及び炭水化物、例えばグルコース、
サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトー
ス、メラッセ、デンプン及びセルロース、オイル及び脂
肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびヤシ
油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリ
ノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノー
ル及び有機酸、例えば酢酸を使用することができる。
の要求を満たしていなければならない。種々の微生物の
培地の説明は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆ
ｏｒＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙのハンドブック「Ｍａｎ
ｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａ
ｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏ
ｎ Ｄ．Ｃ．、米国、１９８１）に記載されている。炭
素源としては、糖類及び炭水化物、例えばグルコース、
サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトー
ス、メラッセ、デンプン及びセルロース、オイル及び脂
肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油およびヤシ
油、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリ
ノール酸、アルコール、例えばグリセリン及びエタノー
ル及び有機酸、例えば酢酸を使用することができる。
【００４６】これらの物質は、単独又は混合物として使
用することができる。窒素源としては、窒素含有有機化
合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エ
キス、トウモロコシ膨潤水、大豆ミール及び尿素又は無
機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸ア
ンモニウムを使用することができる。リン源としては、
リン酸、リン酸カリウム又はリン酸水素二カリウム又は
相応する、ナトリウム含有塩を使用することができる。
培地は、更に、成長に必要な金属の塩、例えば硫酸マグ
ネシウム又は硫酸鉄を含有していなければならない。最
終的に、必須発育物質、例えばアミノ酸及びビタミン
を、付加的に上記の物質に対して使用することができ
る。その上、培地に、適当な前駆体を添加することがで
きる。前記の使用物質は、培養基に、一回のバッチの形
で添加するか又は適当な方法で培養の間に与えることが
できる。
用することができる。窒素源としては、窒素含有有機化
合物、例えばペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エ
キス、トウモロコシ膨潤水、大豆ミール及び尿素又は無
機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸ア
ンモニウムを使用することができる。リン源としては、
リン酸、リン酸カリウム又はリン酸水素二カリウム又は
相応する、ナトリウム含有塩を使用することができる。
培地は、更に、成長に必要な金属の塩、例えば硫酸マグ
ネシウム又は硫酸鉄を含有していなければならない。最
終的に、必須発育物質、例えばアミノ酸及びビタミン
を、付加的に上記の物質に対して使用することができ
る。その上、培地に、適当な前駆体を添加することがで
きる。前記の使用物質は、培養基に、一回のバッチの形
で添加するか又は適当な方法で培養の間に与えることが
できる。
【００４７】培養基のｐＨ管理のために、塩基性化合
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニアもしくはアンモニア水又は酸性化合物、例えばリン
酸又は硫酸を適当な方法で使用する。発泡の管理のため
に、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使
用することができる。プラスミドの安定性の保持のため
に、培地に、適当な選択的に作用する物質、例えば抗生
物質を添加することができる。好気性の条件を保持する
ために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培
地に導入する。培養の温度は、通常、２０℃〜４５℃、
有利に２５℃〜４０℃である。培養は、Ｌ−リシンの最
大値が形成されるまでの間継続する。
物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモ
ニアもしくはアンモニア水又は酸性化合物、例えばリン
酸又は硫酸を適当な方法で使用する。発泡の管理のため
に、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使
用することができる。プラスミドの安定性の保持のため
に、培地に、適当な選択的に作用する物質、例えば抗生
物質を添加することができる。好気性の条件を保持する
ために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培
地に導入する。培養の温度は、通常、２０℃〜４５℃、
有利に２５℃〜４０℃である。培養は、Ｌ−リシンの最
大値が形成されるまでの間継続する。
【００４８】この目的は、通常、１０時間〜１６０時間
に達する。
に達する。
【００４９】従って、本発明のもう１つの対象は、以下
の工程： ａ）リン酸転移酵素系の成分ＨをコードするｐｔｓＨ−
遺伝子を強化、殊に過剰発現する、Ｌ−アミノ酸を生産
するコリネフォルム細菌の発酵、 ｂ）培地中又は細菌の細胞中でのＬ−アミノ酸の集積培
養 ｃ）Ｌ−アミノ酸の単離 を実施するＬ−アミノ酸、殊にＬ−リシンの発酵的製造
法である。
の工程： ａ）リン酸転移酵素系の成分ＨをコードするｐｔｓＨ−
遺伝子を強化、殊に過剰発現する、Ｌ−アミノ酸を生産
するコリネフォルム細菌の発酵、 ｂ）培地中又は細菌の細胞中でのＬ−アミノ酸の集積培
養 ｃ）Ｌ−アミノ酸の単離 を実施するＬ−アミノ酸、殊にＬ−リシンの発酵的製造
法である。
【００５０】Ｌ−リシンの分析は、Ｓｐａｃｋｍａｎ他
（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０、
（１９５８）、１１９０）により記載されているよう
に、陰イオン交換クロマトグラフィーと、引き続くニン
ヒドリン誘導とによって行うことができる。
（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０、
（１９５８）、１１９０）により記載されているよう
に、陰イオン交換クロマトグラフィーと、引き続くニン
ヒドリン誘導とによって行うことができる。
【００５１】本発明による方法は、Ｌ−アミノ酸、殊に
Ｌ−リシンの発酵的製造に用いられる。
Ｌ−リシンの発酵的製造に用いられる。
【００５２】
【実施例】本発明を、以下に実施例に基づいて詳細に説
明する。
明する。
【００５３】例 １ コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からのゲノムコスミド−遺伝子バンクの製造 コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からの染色体ＤＮＡを、Ｔａｕｃｈ他（１９９５、Ｐ
ｌａｓｍｉｄ３３：１６８〜１７９）により記載された
ようにして単離し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和国、フラ
イブルク在、製品名Ｓａｕ３ＡＩ、コード番号２７−０
９１３−０２）を用いて部分的に分割した。ＤＮＡフラ
グメントを、エビ・アルカリ性ホスファターゼ（ｓｈｒ
ｉｍｐ ａｌｋａｌｉｓｃｈｅｒＰｈｏｓｐｈａｔａｓ
ｅ）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ、ドイツ連邦共和国、マンハイム在、製品
名ＳＡＰ、コード番号１７５８２５０）で脱リン酸化し
た。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＵＳ
Ａ、製品名ＳｕｐｅｒＣｏｓ１ コスミド・ベクターキ
ット、コード番号２５１３０１）によるコスミド・ベク
ターＳｕｐｅｒＣｏｓ１のＤＮＡ（Ｗａｈｌ他（１９８
７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ
ＳＡ ８４：２１６０〜２１６４）を、制限酵素Ｘｂａ
Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連
邦共和国、フライブルク在、製品名ＸｂａＩ、コード番
号２７−０９４８−０２）で分割し、同様にエビ・アル
カリ性フォスファターゼで脱リン酸化した。引き続き、
コスミド−ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩ（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和国、フラ
イブルク在、製品名ＢａｍＨＩ、コード番号２７−０８
６８−０４）で分割した。こうして処理したコスミド−
ＤＮＡを、処理したＡＴＣＣ１３０３２−ＤＮＡと混合
し、このバッチを、Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和国、フ
ライブルク在、製品名Ｔ４−ＤＮＡ−Ｌｉｇａｓｅ、コ
ード番号２７−０８７０−０４）で処理した。この結紮
混合物を、引き続き、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩ ＸＬパ
ッキング・エキス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ、ＵＳＡ、製品名Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩ ＸＬ
Ｐａｃｋｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ、コード番号２００２
１７）を用いてファージの中に挿入した。Ｅ．ｃｏｌｉ
菌株ＮＭ５５４（Ｒａｌｅｉｇｈ他、１９８８、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１６：１５６３
〜１５７５）の感染のために、細胞を、１０ｍＭのＭｇ
ＳＯ4に注ぎ込み、ファージ懸濁液のアリコートと混合
した。コスミドバンクの感染及び滴定を、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ他（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に記載されているよ
うにして実施したが、この場合、細胞を、アンピシリン
１００μｇ／ｍｌと一緒にＬＢ−Ａｇａｒ（Ｌｅｎｎｏ
ｘ、１９５５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１：９０）上に載置
した。３７℃で一晩の培養後に、組換えた個体クローン
を選択した。
２からのゲノムコスミド−遺伝子バンクの製造 コリネバクテリウム・グルタミクム ＡＴＣＣ１３０３
２からの染色体ＤＮＡを、Ｔａｕｃｈ他（１９９５、Ｐ
ｌａｓｍｉｄ３３：１６８〜１７９）により記載された
ようにして単離し、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和国、フラ
イブルク在、製品名Ｓａｕ３ＡＩ、コード番号２７−０
９１３−０２）を用いて部分的に分割した。ＤＮＡフラ
グメントを、エビ・アルカリ性ホスファターゼ（ｓｈｒ
ｉｍｐ ａｌｋａｌｉｓｃｈｅｒＰｈｏｓｐｈａｔａｓ
ｅ）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌｓ、ドイツ連邦共和国、マンハイム在、製品
名ＳＡＰ、コード番号１７５８２５０）で脱リン酸化し
た。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＵＳ
Ａ、製品名ＳｕｐｅｒＣｏｓ１ コスミド・ベクターキ
ット、コード番号２５１３０１）によるコスミド・ベク
ターＳｕｐｅｒＣｏｓ１のＤＮＡ（Ｗａｈｌ他（１９８
７）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ
ＳＡ ８４：２１６０〜２１６４）を、制限酵素Ｘｂａ
Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連
邦共和国、フライブルク在、製品名ＸｂａＩ、コード番
号２７−０９４８−０２）で分割し、同様にエビ・アル
カリ性フォスファターゼで脱リン酸化した。引き続き、
コスミド−ＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩ（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和国、フラ
イブルク在、製品名ＢａｍＨＩ、コード番号２７−０８
６８−０４）で分割した。こうして処理したコスミド−
ＤＮＡを、処理したＡＴＣＣ１３０３２−ＤＮＡと混合
し、このバッチを、Ｔ４−ＤＮＡ−リガーゼ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和国、フ
ライブルク在、製品名Ｔ４−ＤＮＡ−Ｌｉｇａｓｅ、コ
ード番号２７−０８７０−０４）で処理した。この結紮
混合物を、引き続き、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩ ＸＬパ
ッキング・エキス（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ、ＵＳＡ、製品名Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩ ＸＬ
Ｐａｃｋｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ、コード番号２００２
１７）を用いてファージの中に挿入した。Ｅ．ｃｏｌｉ
菌株ＮＭ５５４（Ｒａｌｅｉｇｈ他、１９８８、Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１６：１５６３
〜１５７５）の感染のために、細胞を、１０ｍＭのＭｇ
ＳＯ4に注ぎ込み、ファージ懸濁液のアリコートと混合
した。コスミドバンクの感染及び滴定を、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ他（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に記載されているよ
うにして実施したが、この場合、細胞を、アンピシリン
１００μｇ／ｍｌと一緒にＬＢ−Ａｇａｒ（Ｌｅｎｎｏ
ｘ、１９５５、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１：９０）上に載置
した。３７℃で一晩の培養後に、組換えた個体クローン
を選択した。
【００５４】例 ２ ｐｔｓＨ−遺伝子の単離及び配列化 個体コロニーのコスミド−ＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐ
Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（製品番号２７１
０６、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ連邦共和
国）を用いて、製造者指示により単離し、かつ制限酵素
Ｓａｕ３ＡＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品名Ｓａｕ
３ＡＩ、製品番号２７−０９１３−０２）で部分的に分
割した。ＤＮＡフラグメントを、エビ・アルカリ性フォ
スファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ドイツ連邦共和国、マンハイム
在、製品名ＳＡＰ、製品番号１７５８２５０））で脱リ
ン酸化した。ゲル電気泳動による分離後に、コスミドフ
ラグメントの単離を、１５００〜２０００ｂｐの大きさ
の範囲内で、ＱｉａＥｘＩＩ ゲル・エキス・キット
（製品番号２００２１、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、
ドイツ連邦共和国）を用いて行った。Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ社（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｎｉｅｄｅｒｌａｎｄ
ｅ、製品名ＺｅｒｏＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ Ｋｉｔ、製品番号Ｋ２５００−０１）による配列
決定ベクターＺｅｒｏ−１を、制限酵素ＢａｍＨＩ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和
国、フライブルク在、製品名ＢａｍＨＩ、製品番号２７
−０８６８−０４）で分割した。配列決定バクターｐＺ
ｅｒｏ−１中のコスミドフラグメントの結紮を、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ他（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）により記載さ
れたのと同様にして実施したが、この場合、ＤＮＡ混合
物をＴ４−リガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在）と一緒に一
晩培養した。この結紮混合物を、引き続き、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Ｇｒａｎｔ、１９９０、Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．
Ａ．、８７：４６４５〜４６４９）中でエレクトロポレ
ーション処理し（Ｔａｕｃｈ他１９９４、ＦＥＭＳ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２３：３４３−
７）、かつＺｅｏｃｉｎ５０μｇ／ｍｌと一緒にＬＢ−
Ａｇａｒ（Ｌｅｎｎｏｘ、１９５５、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、１：１９０）の上に載置した。組換えクローンのプ
ラスミド調製を、Ｂｉｏｒｏｂｏｔ９６００（製品番
号、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ連邦共和国）
を用いて行った。Ｓａｎｇｅｒ他（１９７７、Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃ
ａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、
７４：５４６３〜５４６７）のジデオキシ連鎖中断法に
より、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他（１９９０、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：１０６
７）による変異を用いて配列決定した。ＰＥ Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓの「ＲＲ ｄＲｈｏｄａｍ
ｉｎ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ Ｋｉｔ」（製品番号４０３０４４、ドイツ連
邦共和国、ヴァイターシュタット在）を使用した。ゲル
電気泳動による分離及び配列決定反応の分析を、「Ｒｏ
ｔｉｐｈｏｒｅｓｅ ＮＦ Ａｃｒｙｌａｍｉｄ／Ｂｉ
ｓａｃｒｙｌａｍｉｄ」ゲル（２９：１）（製品番号Ａ
１２４．１、Ｒｏｔｈ、ドイツ連邦共和国、カールスル
ーエ在）中でＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ（ドイツ連邦共和国、ヴァイターシュタット在）の
「ＡＢＩＰｒｉｓｍ ３７７」を用いて行った。
Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（製品番号２７１
０６、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ連邦共和
国）を用いて、製造者指示により単離し、かつ制限酵素
Ｓａｕ３ＡＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在、製品名Ｓａｕ
３ＡＩ、製品番号２７−０９１３−０２）で部分的に分
割した。ＤＮＡフラグメントを、エビ・アルカリ性フォ
スファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ドイツ連邦共和国、マンハイム
在、製品名ＳＡＰ、製品番号１７５８２５０））で脱リ
ン酸化した。ゲル電気泳動による分離後に、コスミドフ
ラグメントの単離を、１５００〜２０００ｂｐの大きさ
の範囲内で、ＱｉａＥｘＩＩ ゲル・エキス・キット
（製品番号２００２１、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、
ドイツ連邦共和国）を用いて行った。Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ社（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｎｉｅｄｅｒｌａｎｄ
ｅ、製品名ＺｅｒｏＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ Ｋｉｔ、製品番号Ｋ２５００−０１）による配列
決定ベクターＺｅｒｏ−１を、制限酵素ＢａｍＨＩ（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ドイツ連邦共和
国、フライブルク在、製品名ＢａｍＨＩ、製品番号２７
−０８６８−０４）で分割した。配列決定バクターｐＺ
ｅｒｏ−１中のコスミドフラグメントの結紮を、Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ他（１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）により記載さ
れたのと同様にして実施したが、この場合、ＤＮＡ混合
物をＴ４−リガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ、ドイツ連邦共和国、フライブルク在）と一緒に一
晩培養した。この結紮混合物を、引き続き、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ菌株ＤＨ５αＭＣＲ（Ｇｒａｎｔ、１９９０、Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．
Ａ．、８７：４６４５〜４６４９）中でエレクトロポレ
ーション処理し（Ｔａｕｃｈ他１９９４、ＦＥＭＳ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２３：３４３−
７）、かつＺｅｏｃｉｎ５０μｇ／ｍｌと一緒にＬＢ−
Ａｇａｒ（Ｌｅｎｎｏｘ、１９５５、Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ、１：１９０）の上に載置した。組換えクローンのプ
ラスミド調製を、Ｂｉｏｒｏｂｏｔ９６００（製品番
号、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ連邦共和国）
を用いて行った。Ｓａｎｇｅｒ他（１９７７、Ｐｒｏｃ
ｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃ
ａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｕ．Ｓ．Ａ．、
７４：５４６３〜５４６７）のジデオキシ連鎖中断法に
より、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ他（１９９０、Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：１０６
７）による変異を用いて配列決定した。ＰＥ Ａｐｐｌ
ｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓの「ＲＲ ｄＲｈｏｄａｍ
ｉｎ ＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｉｎｇ Ｋｉｔ」（製品番号４０３０４４、ドイツ連
邦共和国、ヴァイターシュタット在）を使用した。ゲル
電気泳動による分離及び配列決定反応の分析を、「Ｒｏ
ｔｉｐｈｏｒｅｓｅ ＮＦ Ａｃｒｙｌａｍｉｄ／Ｂｉ
ｓａｃｒｙｌａｍｉｄ」ゲル（２９：１）（製品番号Ａ
１２４．１、Ｒｏｔｈ、ドイツ連邦共和国、カールスル
ーエ在）中でＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ（ドイツ連邦共和国、ヴァイターシュタット在）の
「ＡＢＩＰｒｉｓｍ ３７７」を用いて行った。
【００５５】得られた粗製配列データを、引き続き、Ｓ
ｔａｄｅｎ−Ｐｒｏｇｒａｍｐａｋｅｔｓ（１９８６、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１
４：２１７〜２３１）バージョン９７−０の使用下に処
理した。ｐＺｅｒｏ１誘導体の個体配列を、集合させて
合着させた。コンピューター制御されたコーディング領
域分析を、プログラムＸＮＩＰ（Ｓｔａｄｅｎ、１９８
６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、
１４：２１７〜２３１）で処理した。「Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）の非重複データバンクに対し
て、「ＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」
（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５：３３８９〜３４０
２）を用いて更に分析を実施した。
ｔａｄｅｎ−Ｐｒｏｇｒａｍｐａｋｅｔｓ（１９８６、
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１
４：２１７〜２３１）バージョン９７−０の使用下に処
理した。ｐＺｅｒｏ１誘導体の個体配列を、集合させて
合着させた。コンピューター制御されたコーディング領
域分析を、プログラムＸＮＩＰ（Ｓｔａｄｅｎ、１９８
６、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、
１４：２１７〜２３１）で処理した。「Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）の非重複データバンクに対し
て、「ＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ」
（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５：３３８９〜３４０
２）を用いて更に分析を実施した。
【００５６】得られたヌクレオチド配列を、配列番号１
において示した。ヌクレオチド配列の分析により、２６
７個の塩基対のオープンリーディングフレームが明らか
になったが、これは、ｐｔｓＨ−遺伝子と呼称される。
該ｐｔｓＨ−遺伝子は、８９個のアミノ酸のタンパクを
コードしている。
において示した。ヌクレオチド配列の分析により、２６
７個の塩基対のオープンリーディングフレームが明らか
になったが、これは、ｐｔｓＨ−遺伝子と呼称される。
該ｐｔｓＨ−遺伝子は、８９個のアミノ酸のタンパクを
コードしている。
【００５７】例 ３ Ｃ．グルタミクム中のｐｔｓＨ−遺伝子を強化するため
の、シャトルベクターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐｔｓＨ
ｅｘｐの調製 ３．１ ベクターｐＣＲ（Ｒ）Ｂｌｕｎｔ ＩＩ中への
ｐｔｓＨ−遺伝子のクローニング 染色体ＤＮＡを、Ｅｉｋｍａｎｎｓ他（Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ １４０：１８１７〜１８２８（１９９
４））の方法により、ＡＴＣＣ １３０３２菌株から単
離した。Ｃ．グルタミクムについての例２から公知のｐ
ｔｓＨ−遺伝子の配列を基礎として、以下のオリゴヌク
レオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応のために選択した。
の、シャトルベクターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐｔｓＨ
ｅｘｐの調製 ３．１ ベクターｐＣＲ（Ｒ）Ｂｌｕｎｔ ＩＩ中への
ｐｔｓＨ−遺伝子のクローニング 染色体ＤＮＡを、Ｅｉｋｍａｎｎｓ他（Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌｏｇｙ １４０：１８１７〜１８２８（１９９
４））の方法により、ＡＴＣＣ １３０３２菌株から単
離した。Ｃ．グルタミクムについての例２から公知のｐ
ｔｓＨ−遺伝子の配列を基礎として、以下のオリゴヌク
レオチドを、ポリメラーゼ連鎖反応のために選択した。
【００５８】ｐｔｓＨｅｘｐ１： ５｀ ACC ACT GGT GCA ATC TCC AT 3′ ｐｔｓＨｅｘｐ２： ５｀ TTT ACT CAG CGT CAA GGT CC 3′ 前記プライマーを、ＡＲＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｇ
ｍｂＨ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ドイツ連邦共和国、ダ
ルムシュタット在）によって合成し、ＰＣＲ反応を、Ｉ
ｎｎｉｓ他（ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ Ｇｕｉ
ｄ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ、１９９０、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）の
標準ＰＣＲ法により、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓＧｍｂＨ（ドイツ連邦共和国、マンハイム在）から
のＰｗｏ−ポリメラーゼを用いて実施した。ポリメラー
ゼ連鎖反応により、プライマーは、潜在プロモーター領
域を有するｐｔｓＨ−遺伝子を有する６８６ｂｐのＤＮ
Ａフラグメントの増幅を可能にする。増幅されたＤＮＡ
フラグメントのＤＮＡ配列を、配列決定によって分析し
た。
ｍｂＨ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ドイツ連邦共和国、ダ
ルムシュタット在）によって合成し、ＰＣＲ反応を、Ｉ
ｎｎｉｓ他（ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ Ｇｕｉ
ｄ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎｓ、１９９０、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）の
標準ＰＣＲ法により、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓＧｍｂＨ（ドイツ連邦共和国、マンハイム在）から
のＰｗｏ−ポリメラーゼを用いて実施した。ポリメラー
ゼ連鎖反応により、プライマーは、潜在プロモーター領
域を有するｐｔｓＨ−遺伝子を有する６８６ｂｐのＤＮ
Ａフラグメントの増幅を可能にする。増幅されたＤＮＡ
フラグメントのＤＮＡ配列を、配列決定によって分析し
た。
【００５９】増幅されたＤＮＡフラグメントを、Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＺｅｒ
ｏ ＢｌｕｎｔＴＭ Ｋｉｔ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃ
Ａ、ＵＳＡ；カタログ番号Ｋ２７００−２０）を用い
て、ベクターｐＣＲ(R)Ｂｌｕｎｔ ＩＩの中に結紮さ
せた（Ｂｅｒｎａｒｄ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２３４；５３４〜５
４１（１９９３））。
ｉｔｒｏｇｅｎ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎからのＺｅｒ
ｏ ＢｌｕｎｔＴＭ Ｋｉｔ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃ
Ａ、ＵＳＡ；カタログ番号Ｋ２７００−２０）を用い
て、ベクターｐＣＲ(R)Ｂｌｕｎｔ ＩＩの中に結紮さ
せた（Ｂｅｒｎａｒｄ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２３４；５３４〜５
４１（１９９３））。
【００６０】次に、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株 ＴＯＰ１０を、
ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ（Ｈａｎａｈａｎ、ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ．第Ｉ巻、ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、ＵＳＡ、１９８５）を用
いてエレクトロポレーション処理した。プラスミドを有
する細胞を、カナマイシン２５ｍｇ／ｌで補足したＬＢ
ａｇａｒ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）上へ形
質転換混合物をプレーティングすることによって選択し
た。プラスミドＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡｐ
ｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて
形質転換株から単離し、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いる制
限によって分析し、この後、アガロースゲル電気泳動
（０．８％）を続けた。このプラスミドをｐＣＲＢ１−
ｐｔｓＨｅｘｐと命名し、図１中に示した。
ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ（Ｈａｎａｈａｎ、ＤＮＡ
Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏ
ａｃｈ．第Ｉ巻、ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、ＵＳＡ、１９８５）を用
いてエレクトロポレーション処理した。プラスミドを有
する細胞を、カナマイシン２５ｍｇ／ｌで補足したＬＢ
ａｇａｒ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）上へ形
質転換混合物をプレーティングすることによって選択し
た。プラスミドＤＮＡを、ＱｉａｇｅｎからのＱＩＡｐ
ｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて
形質転換株から単離し、制限酵素ＥｃｏＲＩを用いる制
限によって分析し、この後、アガロースゲル電気泳動
（０．８％）を続けた。このプラスミドをｐＣＲＢ１−
ｐｔｓＨｅｘｐと命名し、図１中に示した。
【００６１】３．２ Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．グルタミクム
シャトルベクター ｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２の調製 Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．グルタミクム シャトルベクター
を、従来技術により構成させた。該ベクターは、複製エ
フェクターｐｅｒ（米国特許第５１７５１０８号；Ｎｅ
ｓｖｅｒａ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ １７９、１５２５〜１５３２（１９９
７））を含むプラスミドｐＧＡ１の複製領域ｒｅｐ、ト
ランスポゾンＴｎ５のカナマイシン耐性付与性ａｐｈ
（３′）−ＩＩａ遺伝子（Ｂｅｃｋ他、Ｇｅｎｅ １
９、３２７〜３３６（１９８２））、プラスミド ｐＭ
Ｂ１の複製領域ｏｒｉＶ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎ ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＢｉｏｌｏｇｙ ４
３，７７〜９０（１９７９））、ｌａｃ−プロモーター
を含むｌａｃＺα−遺伝子フラグメント及び多クローニ
ング部位（ｍｃｓ）（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．
他、Ｇｅｎｅ ２６，１０１〜１０６（１９８３））及
びプラスミド ＲＰ４のｍｏｂ−領域（Ｓｉｍｏｎ他、
Ｂｉｏｌ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：７８４〜７９１
（１９８３））を有している。構成されたベクターを、
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αｍｃｒ（Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ
ＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ 第Ｉ巻、ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏ
ｒｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、ＵＳＡ）に形質転
換させた。プラスミドを有する細胞を、カナマイシン２
５ｍｇ／ｌで補足したＬＢ ａｇａｒ（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
Ｎ．Ｙ．）上へ形質転換混合物をプレーティングするこ
とによって選択した。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅ
ｎからのＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
Ｋｉｔを用いて形質転換株から単離し、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いる制限によって分析
し、この後、アガロースゲル電気泳動（０．８％）を続
けた。このプラスミドをｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２と命名
し、図２中に示した。
シャトルベクター ｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２の調製 Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．グルタミクム シャトルベクター
を、従来技術により構成させた。該ベクターは、複製エ
フェクターｐｅｒ（米国特許第５１７５１０８号；Ｎｅ
ｓｖｅｒａ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ １７９、１５２５〜１５３２（１９９
７））を含むプラスミドｐＧＡ１の複製領域ｒｅｐ、ト
ランスポゾンＴｎ５のカナマイシン耐性付与性ａｐｈ
（３′）−ＩＩａ遺伝子（Ｂｅｃｋ他、Ｇｅｎｅ １
９、３２７〜３３６（１９８２））、プラスミド ｐＭ
Ｂ１の複製領域ｏｒｉＶ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎ ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＢｉｏｌｏｇｙ ４
３，７７〜９０（１９７９））、ｌａｃ−プロモーター
を含むｌａｃＺα−遺伝子フラグメント及び多クローニ
ング部位（ｍｃｓ）（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．
他、Ｇｅｎｅ ２６，１０１〜１０６（１９８３））及
びプラスミド ＲＰ４のｍｏｂ−領域（Ｓｉｍｏｎ他、
Ｂｉｏｌ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：７８４〜７９１
（１９８３））を有している。構成されたベクターを、
Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αｍｃｒ（Ｈａｎａｈａｎ、Ｄ
ＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐ
ｐｒｏａｃｈ 第Ｉ巻、ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏ
ｒｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ、ＵＳＡ）に形質転
換させた。プラスミドを有する細胞を、カナマイシン２
５ｍｇ／ｌで補足したＬＢ ａｇａｒ（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、
Ｎ．Ｙ．）上へ形質転換混合物をプレーティングするこ
とによって選択した。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅ
ｎからのＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ
Ｋｉｔを用いて形質転換株から単離し、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いる制限によって分析
し、この後、アガロースゲル電気泳動（０．８％）を続
けた。このプラスミドをｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２と命名
し、図２中に示した。
【００６２】以下の微生物を、ブダペスト条約により、
ドイツの微生物寄託当局（ＤＳＭＺ、ドイツ連邦共和
国、ブラウンシュバイク在）に寄託した： ・ Ｃ．グルタミクム菌株 ＤＭＳ５７１５／ｐＥＣ−
Ｋ１８ｍｏｂ２、ＤＳＭ１３２４５ ３．３ Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．グルタミクム シャトルベ
クターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２へのｐｔｓＨのクローニ
ング 例３．２に記載したＥ．ｃｏｌｉ−Ｃ．グルタミクム
シャトルベクターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２へｐｔｓＨ−
遺伝子を複製するために、ｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２から
プラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩ
及びＸｂａＩで完全に消化させ、かつアルカリフォスフ
ァターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓ
ｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、
ドイツ連邦共和国、マンハイム在）で処理した。
ドイツの微生物寄託当局（ＤＳＭＺ、ドイツ連邦共和
国、ブラウンシュバイク在）に寄託した： ・ Ｃ．グルタミクム菌株 ＤＭＳ５７１５／ｐＥＣ−
Ｋ１８ｍｏｂ２、ＤＳＭ１３２４５ ３．３ Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｃ．グルタミクム シャトルベ
クターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２へのｐｔｓＨのクローニ
ング 例３．２に記載したＥ．ｃｏｌｉ−Ｃ．グルタミクム
シャトルベクターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２へｐｔｓＨ−
遺伝子を複製するために、ｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２から
プラスミドＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩ
及びＸｂａＩで完全に消化させ、かつアルカリフォスフ
ァターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓ
ｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、
ドイツ連邦共和国、マンハイム在）で処理した。
【００６３】ベクターｐＣＲＢ１−ｐｔｓＨｅｘｐを、
エシェリキア・コリ Ｔｏｐ１０から単離し、制限エン
ドヌクレアーゼＫｐｎＩ及びＸｂａＩで完全に消化さ
せ、、ｐｔｓＨ遺伝子を有する７８８ｂｐフラグメント
を０．８％のアガロースゲル（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ連
邦共和国、Ｈｉｌｄｅｎ在からのＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇ
ｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）から精製した。
次に、ｐｔｓＨ−遺伝子を有するフラグメントを、ベク
ターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２で結紮させた（Ｔ４−リガ
ーゼ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｇｍｂ
Ｈ，ドイツ連邦共和国、マンハイム在）。この結紮混合
物を、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αｍｃｒ（Ｈａｎａｈａ
ｎ、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ．第Ｉ巻、ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ、Ｏ
ｘｆｏｒｄ、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ、ＵＳＡ）に形
質転換させた。プラスミドを有する細胞を、カナマイシ
ン２５ｍｇ／ｌで補足したＬＢ ａｇａｒ（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ、Ｎ．Ｙ．）上へ形質転換混合物をプレーティングす
ることによって選択した。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａ
ｇｅｎ（ドイツ連邦共和国、Ｈｉｌｄｅｎ在）からのＱ
ＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを
用いて形質転換株から単離し、制限酵素ＥｃｏＲＩを用
いる処理によって分析し、この後、アガロースゲル電気
泳動を続けた。このプラスミドをｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ
２ｐｔｓＨｅｘｐと命名し、図３中に示した。
エシェリキア・コリ Ｔｏｐ１０から単離し、制限エン
ドヌクレアーゼＫｐｎＩ及びＸｂａＩで完全に消化さ
せ、、ｐｔｓＨ遺伝子を有する７８８ｂｐフラグメント
を０．８％のアガロースゲル（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ連
邦共和国、Ｈｉｌｄｅｎ在からのＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇ
ｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）から精製した。
次に、ｐｔｓＨ−遺伝子を有するフラグメントを、ベク
ターｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２で結紮させた（Ｔ４−リガ
ーゼ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｇｍｂ
Ｈ，ドイツ連邦共和国、マンハイム在）。この結紮混合
物を、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＤＨ５αｍｃｒ（Ｈａｎａｈａ
ｎ、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ．第Ｉ巻、ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ、Ｏ
ｘｆｏｒｄ、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ、ＵＳＡ）に形
質転換させた。プラスミドを有する細胞を、カナマイシ
ン２５ｍｇ／ｌで補足したＬＢ ａｇａｒ（Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ、Ｎ．Ｙ．）上へ形質転換混合物をプレーティングす
ることによって選択した。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａ
ｇｅｎ（ドイツ連邦共和国、Ｈｉｌｄｅｎ在）からのＱ
ＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを
用いて形質転換株から単離し、制限酵素ＥｃｏＲＩを用
いる処理によって分析し、この後、アガロースゲル電気
泳動を続けた。このプラスミドをｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ
２ｐｔｓＨｅｘｐと命名し、図３中に示した。
【００６４】該菌株を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αｍｃｒ
／ｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐｔｓＨｅｘｐと命名し、ブ
ダペスト条約により、ドイツの微生物寄託当局（ＤＳＭ
Ｚ、ドイツ連邦共和国、ブラウンシュバイク在）に２０
００年１１月２８日にＤＳＭ１３８７８として、純粋な
培養物の形で寄託した 例 ４ プラスミドｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐｔｓＨｅｘｐを用
いる菌株ＤＳＭ５７１５の形質転換 菌株ＤＳＭ５７１５を、Ｌｉｅｂｌ他により記載された
電気泳動法（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ、５３：２９９〜３０３（１９８９））を用
いて、プラスミドｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐｔｓＨｅｘ
ｐで形質転換させた。形質転換株を、カナマイシン２５
ｍｇ／ｌで補足した、脳−心臓浸出物汁１８．５ｇ／
ｌ、ソルビトール０．５Ｍ、バクト−トリプトン（Ｂａ
ｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ）５ｇ／ｌ、バクト−イースト
エキス２．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ及びバクト寒天
１８ｇ／ｌからなるＬＢＨＩＳ寒天上で選択した。これ
を、３３℃で２日間恒温保持した。
／ｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐｔｓＨｅｘｐと命名し、ブ
ダペスト条約により、ドイツの微生物寄託当局（ＤＳＭ
Ｚ、ドイツ連邦共和国、ブラウンシュバイク在）に２０
００年１１月２８日にＤＳＭ１３８７８として、純粋な
培養物の形で寄託した 例 ４ プラスミドｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐｔｓＨｅｘｐを用
いる菌株ＤＳＭ５７１５の形質転換 菌株ＤＳＭ５７１５を、Ｌｉｅｂｌ他により記載された
電気泳動法（ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅ
ｔｔｅｒｓ、５３：２９９〜３０３（１９８９））を用
いて、プラスミドｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐｔｓＨｅｘ
ｐで形質転換させた。形質転換株を、カナマイシン２５
ｍｇ／ｌで補足した、脳−心臓浸出物汁１８．５ｇ／
ｌ、ソルビトール０．５Ｍ、バクト−トリプトン（Ｂａ
ｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ）５ｇ／ｌ、バクト−イースト
エキス２．５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ及びバクト寒天
１８ｇ／ｌからなるＬＢＨＩＳ寒天上で選択した。これ
を、３３℃で２日間恒温保持した。
【００６５】プラスミドＤＮＡを、形質転換株から常法
（Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈ他、１９９８、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４４、９１５〜９２７）によ
り単離し、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断
し、次に、プラスミドをアガロースゲル電気泳動によっ
て分析した。得られた菌株を、ＤＳＭ５７１５／ｐＥＣ
−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐｔｓＨｅｘｐと命名した。
（Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈ他、１９９８、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４４、９１５〜９２７）によ
り単離し、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで切断
し、次に、プラスミドをアガロースゲル電気泳動によっ
て分析した。得られた菌株を、ＤＳＭ５７１５／ｐＥＣ
−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐｔｓＨｅｘｐと命名した。
【００６６】例 ５ リシンの調製 例４において得られたＣ．グルタミクム菌株ＤＳＭ５７
１５／ｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐｔｓＨｅｘｐを、リシ
ンの生産に適する栄養媒体中で培養し、培養上清中での
リシン含量を測定した。
１５／ｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐｔｓＨｅｘｐを、リシ
ンの生産に適する栄養媒体中で培養し、培養上清中での
リシン含量を測定した。
【００６７】このために、該菌株を、まず、適当な抗体
を含有する寒天プレート（カナマイシン（２５ｍｇ／
ｌ）を含有する脳−心臓寒天）上で、３３℃で２４時間
恒温保持した。この寒天プレート培養物から出発して、
プレ−培養物を接種させた（エルレンマイヤーフラスコ
１００ｍｌ中の培地１０ｍｌ）。プレ−培養物に使用し
た培地は、固形培地Ｃｇ ＩＩＩであった。
を含有する寒天プレート（カナマイシン（２５ｍｇ／
ｌ）を含有する脳−心臓寒天）上で、３３℃で２４時間
恒温保持した。この寒天プレート培養物から出発して、
プレ−培養物を接種させた（エルレンマイヤーフラスコ
１００ｍｌ中の培地１０ｍｌ）。プレ−培養物に使用し
た培地は、固形培地Ｃｇ ＩＩＩであった。
【００６８】 Ｃｇ ＩＩＩ 培地 ＮａＣｌ ２．５ｇ／ｌ バクト−ペプトン １０ｇ／ｌ バクト−イーストエキス １０ｇ／ｌ グルコース（別個にオートクレーブ処理） ２％（ｗ／ｖ） ｐＨを、７．４に調節した。
【００６９】カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を、これに
添加した。このプレ−培養物を、振盪器上で２４０ｒｐ
ｍ、３３℃で１６時間恒温保持した。主培養物を、この
プレ−培養物から接種させたので、主培養物の初期吸光
度（６６０ｎｍ）は、０．０５であった。ＭＭ培地を、
主培養物に使用した。
添加した。このプレ−培養物を、振盪器上で２４０ｒｐ
ｍ、３３℃で１６時間恒温保持した。主培養物を、この
プレ−培養物から接種させたので、主培養物の初期吸光
度（６６０ｎｍ）は、０．０５であった。ＭＭ培地を、
主培養物に使用した。
【００７０】 ＭＭ 培地 ＣＳＬ（コーンスティープリカー） ５ｇ／ｌ ＭＯＰＳ（モルホリノプロパンスルホン酸） ２０ｇ／ｌ グルコル（別個にオートクレーブ処理） １００ｇ／ｌ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ２５ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １．０ｇ／ｌ ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ／ｌ ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ ５．０ｍｇ／ｌ ビオチン（滅菌濾過済み） ０．３ｍｇ／ｌ チアミン＊ＨＣｌ（滅菌濾過済み） ０．２ｍｇ／ｌ Ｌ−ロイシン（滅菌濾過済み） ０．１ｇ／ｌ ＣａＣＯ３ ２５ｇ／ｌ ＣＳＬ、ＭＯＰＳ及び塩溶液を、アンモニア溶液でｐＨ
７に調節し、かつオートクレーブ処理した。次に、無菌
液及びビタミン溶液を添加し、乾燥オートクレーブ処理
したＣａＣＯ３を添加した。
７に調節し、かつオートクレーブ処理した。次に、無菌
液及びビタミン溶液を添加し、乾燥オートクレーブ処理
したＣａＣＯ３を添加した。
【００７１】培養を、邪魔板を有する１００ｍｌのエル
レンマイヤーフラスコの中で容量１０ｍｌで実施した。
これに、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を添加した。培
養を３３℃及び空気湿度８０％で実施した。
レンマイヤーフラスコの中で容量１０ｍｌで実施した。
これに、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を添加した。培
養を３３℃及び空気湿度８０％で実施した。
【００７２】４８時間後及び７２時間後に、Ｂｉｏｍｅ
ｋ １０００（ＢｅｃｋｍａｎｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｉｃｈ在）を用いて６６０ｎｍの
測定波長で吸光度を測定した。形成されたリシン量を、
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｂｉｏｔｒｏｎｉｋ（ドイツ連邦
共和国、ハンブルク在）からのアミノ酸分析器を用い
て、イオン交換クロマトグラフィー及びニンヒドリン検
出を用いるポスト−カラム誘導によって測定した。
ｋ １０００（ＢｅｃｋｍａｎｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
ｓ ＧｍｂＨ、Ｍｕｎｉｃｈ在）を用いて６６０ｎｍの
測定波長で吸光度を測定した。形成されたリシン量を、
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｂｉｏｔｒｏｎｉｋ（ドイツ連邦
共和国、ハンブルク在）からのアミノ酸分析器を用い
て、イオン交換クロマトグラフィー及びニンヒドリン検
出を用いるポスト−カラム誘導によって測定した。
【００７３】試験の結果は、表１中に示してある。
【００７４】
【表１】
【００７５】
【配列表】
【００７６】
【外１】
【００７７】
【外２】
【図１】図１は、プラスミドｐＣＲＢ１−ｐｔｓＨｅｘ
ｐのマップを示す図である。
ｐのマップを示す図である。
【図２】図２は、プラスミドｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２を
示す図である。
示す図である。
【図３】図３は、プラスミドｐＥＣ−Ｋ１８ｍｏｂ２ｐ
ｔｓＨｅｘｐを示す図である。
ｔｓＨｅｘｐを示す図である。
Ｋａｎ カナマイシンの耐性遺伝子、 Ｚｅｏｃｉｎ
ゼオシンの耐性遺伝子、 ｐｔｓＨ Ｃ．グルタミクム
からのｐｔｓＨ−遺伝子、 ＣｏｌＥ１ プラスミドＣ
ｅｌＥ１の複製起点、 ｌａｃＺ−ａｌｐｈａ Ｅ．ｃ
ｏｌｉからのｌａｃＺ−遺伝子フラグメント、 ｌａｃ
Ｚ−ａｌｐｈａ｀ Ｅ．ｃｏｌｉからのｌａｃＺ−遺伝
子フラグメントのフラグメント、 ｐｅｒ ｐＧａ１か
らの複製番号を制御するための遺伝子、 ｏｒｉＶ ｐ
ＭＢ１からのＣｏｌＥ１−様起点、 ｒｅｐ Ｃ．グル
タミクムプラスミドｐＧＡ１からのプラスミドをコード
した複製領域、 ＲＰ４ｍｏｂ ＲＰ４可動化部位、
ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの制限部位、 Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの制限部位、Ｋｐｎ
Ｉ 制限酵素ＫｐｎＩの制限部位、 ＸｂａＩ 制限酵
素ＸｂａＩの制限部位
ゼオシンの耐性遺伝子、 ｐｔｓＨ Ｃ．グルタミクム
からのｐｔｓＨ−遺伝子、 ＣｏｌＥ１ プラスミドＣ
ｅｌＥ１の複製起点、 ｌａｃＺ−ａｌｐｈａ Ｅ．ｃ
ｏｌｉからのｌａｃＺ−遺伝子フラグメント、 ｌａｃ
Ｚ−ａｌｐｈａ｀ Ｅ．ｃｏｌｉからのｌａｃＺ−遺伝
子フラグメントのフラグメント、 ｐｅｒ ｐＧａ１か
らの複製番号を制御するための遺伝子、 ｏｒｉＶ ｐ
ＭＢ１からのＣｏｌＥ１−様起点、 ｒｅｐ Ｃ．グル
タミクムプラスミドｐＧＡ１からのプラスミドをコード
した複製領域、 ＲＰ４ｍｏｂ ＲＰ４可動化部位、
ＥｃｏＲＩ 制限酵素ＥｃｏＲＩの制限部位、 Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ 制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの制限部位、Ｋｐｎ
Ｉ 制限酵素ＫｐｎＩの制限部位、 ＸｂａＩ 制限酵
素ＸｂａＩの制限部位
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:15） (72)発明者 ベッティーナ メッケル ドイツ連邦共和国 デュッセルドルフ ベ ンローデシュトラーセ 35 (72)発明者 ヴァルター プフェッフェルレ ドイツ連邦共和国 ハレ ヤーンシュトラ ーセ 33
Claims (17)
- 【請求項１】 ａ）配列番号２のアミノ酸配列を有する
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくと
も７０％までが同一であるポリヌクレオチド、 ｂ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも７０％まで
が同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、 ｃ）ａ）又はｂ）のポリヌクレオチドに対して相補的で
あるポリヌクレオチド、及び ｄ）ａ）、ｂ）又はｃ）のポリヌクレオチド配列の少な
くとも１５個の連続したヌクレオチドを有するポリヌク
レオチドのグループから選択されたポリヌクレオチド配
列を有するコリネフォルム細菌から単離されたポリヌク
レオチド。 - 【請求項２】 ポリヌクレオチドが、コリネフォルム細
菌中に複製可能な、有利に組換え型のＤＮＡである、請
求項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項３】 ポリヌクレオチドがＲＮＡである、請求
項１に記載のポリヌクレオチド。 - 【請求項４】 （ｉ）配列番号１で示されるヌクレオチ
ド配列、又は（ｉｉ）遺伝子コードの縮重の領域内の配
列（ｉ）に相応する少なくとも１種の配列、又は（ｉｉ
ｉ）配列（ｉ）又は（ｉｉ）に対して相補的な配列とハ
イブリッド形成する少なくとも１種の配列及び場合によ
り（ｉｖ）（ｉ）における機能的に中立なセンス突然変
異を含む、請求項２に記載の複製可能なＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列番号２中に示されたアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードする、請求項２に記載のポ
リヌクレオチド配列。 - 【請求項６】 請求項１によるポリヌクレオチド配列を
有するベクター。 - 【請求項７】 請求項６によるベクターを有するコリネ
フォルム細菌。 - 【請求項８】 Ｌ−アミノ酸の発酵的製造法において、
以下の工程： ａ）少なくとも、リン酸転移酵素系の成分Ｈをコードす
る遺伝子を強化、殊に過剰発現するＬ−アミノ酸を生産
するコリネフォルム細菌の発酵、 ｂ）培地又は細菌の細胞中でのＬ−アミノ酸の富化及び ｃ）Ｌ−アミノ酸の単離を実施することを特徴とする、
Ｌ−アミノ酸の発酵的製造法。 - 【請求項９】 付加的に、所望のＬ−アミノ酸の生合成
経路の他の遺伝子を強化させた細菌を使用する、請求項
８に記載の方法。 - 【請求項１０】 Ｌ−アミノ酸の形成を減少させる物質
代謝経路を少なくとも部分的に遮断する、請求項８に記
載の方法。 - 【請求項１１】 プラスミドベクターを用いて形質転換
した菌株を使用するが、該プラスミドベクターは、リン
酸転移酵素系の成分Ｈをコードする遺伝子のヌクレオチ
ド配列を有する、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１２】 Ｌ−リシンを製造するコリネフォルム
細菌を使用する、請求項８から１１までのいずれか１項
に記載の方法。 - 【請求項１３】 ジヒドロジピコリン酸シンターゼをコ
ードするｄａｐＡ−遺伝子、ピルビン酸−カルボキシラ
ーゼをコードするｐｙｃ−遺伝子、トリオースリン酸−
イソメラーゼをコードするｔｐｉ−遺伝子、グリセルア
ルデヒド−３−リン酸脱水素酵素をコードするｇａｐ−
遺伝子、ホスホエノールピルビン酸−糖−リン酸転移酵
素系の成分Ｍ（ｐｔｓＭ）をコードするｐｔｓＭ−遺伝
子、３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードするｐｇ
ｋ−遺伝子、及びリシン−エクスポートをコードするｌ
ｙｓＥ−遺伝子のグループから選択された１種又はそれ
以上の遺伝子を同時に強化、殊に過剰発現又は増幅させ
る、請求項９に記載の方法。 - 【請求項１４】 Ｌ−リシンの製造のために、ホスホノ
エノールピルビン酸−カルボキシキナーゼをコードする
ｐｃｋ−遺伝子、グルコース−６−リン酸−イソメラー
ゼをコードするｐｇｉ−遺伝子、ピルビン酸−オキシダ
ーゼをコードするｐｏｘＢ−遺伝子のグループから選択
された１種又はそれ以上の遺伝子を同時に減力させた細
菌を発酵させる、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１５】 コリネバクテリウム・グルタミクム属
の微生物を使用する、請求項８から１４までのいずれか
１項に記載の方法。 - 【請求項１６】 ポリメラーゼ連鎖反応による、ｐｔｓ
Ｈ遺伝子生成物をコードする遺伝子のＤＮＡの製造のた
めのプライマーとしての、請求項１に記載のポリヌクレ
オチド配列の使用。 - 【請求項１７】 ハイブリッド形成プローブとしての、
請求項１に記載のポリヌクレオチド配列の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10001101.2 | 2000-01-13 | ||
| DE10001101A DE10001101A1 (de) | 2000-01-13 | 2000-01-13 | Neue für das ptsH-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001224390A true JP2001224390A (ja) | 2001-08-21 |
Family
ID=7627360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001005671A Pending JP2001224390A (ja) | 2000-01-13 | 2001-01-12 | ｐｔｓＨ−遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1118666A3 (ja) |
| JP (1) | JP2001224390A (ja) |
| KR (1) | KR100762112B1 (ja) |
| CN (1) | CN1319667A (ja) |
| AU (1) | AU7254800A (ja) |
| BR (1) | BR0100063A (ja) |
| CA (1) | CA2328583A1 (ja) |
| DE (1) | DE10001101A1 (ja) |
| HU (1) | HUP0100131A2 (ja) |
| ID (1) | ID28932A (ja) |
| MX (1) | MXPA01000261A (ja) |
| RU (1) | RU2268938C2 (ja) |
| SK (1) | SK362001A3 (ja) |
| ZA (1) | ZA200100332B (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007117078A (ja) * | 2005-03-10 | 2007-05-17 | Ajinomoto Co Inc | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US8298791B2 (en) | 2005-03-10 | 2012-10-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1246922T1 (de) * | 1999-07-01 | 2003-03-20 | Basf Ag | Für proteine des phosphoenolpyruvat:zucker phosphotransferase systems kodierende gene aus corynebacterium glutamicum |
| US6884614B1 (en) | 1999-07-01 | 2005-04-26 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| AU2002316984A1 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-21 | Degussa Ag | Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family with enhanced fba expression |
| CN103890370B (zh) | 2011-10-26 | 2016-08-24 | 大陆汽车有限公司 | 用于喷射阀的阀组件和喷射阀 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0655149B2 (ja) * | 1985-03-12 | 1994-07-27 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ―リジンの製造法 |
| CA2220100C (en) * | 1995-05-05 | 2009-03-17 | Genencor International, Inc. | Application of glucose transport mutants for production of aromatic pathway compounds |
| CA2377378A1 (en) * | 1999-07-01 | 2001-01-11 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system proteins |
| JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
-
2000
- 2000-01-13 DE DE10001101A patent/DE10001101A1/de not_active Withdrawn
- 2000-12-28 AU AU72548/00A patent/AU7254800A/en not_active Abandoned
-
2001
- 2001-01-04 ID IDP20010001D patent/ID28932A/id unknown
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