MXPA01000261A - Nuevas secuencias nucleotidas codificantes al gen ptsh.. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere a un polinucleotido aislado, que contiene una secuencia polinucleotida, seleccionada del grupo formado por a) polinucleotido que cuando menos es un 70% identico a un polinucleotido que codifica a un pol-ipeptido, que contiene la secuencia aminoacida de la SEQ. ID. No. 2, b) polinucleotido que codifica a un polipeptido, que contiene una secuencia aminoacida que cuando menos es 70% identica a la secuencia aminoacida de la SEQ. ID. No. 2, c) polinucleotido que es complementario a los polinucleotidos de a) o b), y d) polinucleotido que contiene cuando menos 15 nucleotidos secuenciales de la secuencia polinucleotida de a), b) o c), y procedimiento para la preparacion por fermentacion de L-aminoacidos reforzando el gen ptsH que codifica al componente H del sistema de fosfotransferasa asi como el uso de los polinucleotidos anteriores como cebadores o sondas de hibridizacion.

Description

NUEVAS SECUENCIAS NUC EOTIDAS CODIFICANTES AL GEN ptsH DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El objeto de la invención son secuencias nucleótidas codificantes para el gen ptsH y un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en especial L-lisina utilizando bacterias corineformes, en las cuales se refuerza el gen de pfcsH. Estado de ia Técnica Los L-aminoácidos, en especial L-J_isina se utilizan en la medicina humana y en la industria farmacéutica, pero en especial en la alimentación animal. Se conoce que esos L-aminoácidos se producen por fermentación de cepas de bacterias corineformes en especial con Corynebacterium gl utamicum. Debido a la gran importancia de ese grupo de productos se trabaja continuamente a la mejora de esos procedimientos de preparación. Las mejoras del procedimiento pueden consistir en medidas técnicas de fermentación como por ejemplo agitación y alimentación de oxigeno, o la composición de los medios nutritivos como por ejemplo la concentración de azúcar durante la fermentación, o la post-elaboración a la forma de un producto, por medio por ejemplo de cromatografía de intercambio de iones o por medio de propiedades intrínsecas propias de los microorganismos . Para mejorar las propiedades de rendimiento de Ref: 126141 esos microorganismos se utilizan métodos como mutagénesis, selección y selección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes contra los antimetabolitos como por ejemplo el análogo de lisina S- (2-aminoetil) - cisteina o auxótropas para los aminoácidos regulatoria ente importantes y que producen L-aminoácidos como por ejemplo L-lísina. Desde hace algunos años se han utilizado métodos de técnica de recombinación de ADN para el mejoramiento de cepas que producen L-aminoácidos de Corynebacterium, en la cual genes de biosíntesis de L-aminoácidos individuales se amplifican y se estudia su efecto sobre la producción de }-os L-aminoácidos. Un artículo sobre esto se encuentra entre otros el de Kinoshita ( "Glutamicum Acid Bacteria" en Biology of Industrial Microorganisms, Demain y Solo on (Eds.), Benjamín Cummings, Londres, UK, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten y Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology , 73-103 (1995)) y Sahm et al., (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)). Tarea de la Invención Los inventores se propusieron la tarea de obtener nuevas medidas para mejorar la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en especial L-lisina. Descripción Detallada de la Invención Los L-aminoácidos en especial L-lisína tienen aplicación en la medicina humana, en industria farmacéutica y en especial en la alimentación animal. Por lo tanto existe un interés general en un procedimiento nuevo y mejorado para la producción L-aminoácidos y en especial L-lisina. Cuando a continuación se mencionen L-lisina o lisina, se implican no solo las bases sino también las sales como por ejemplo monoclorhidrato de lisina o sulfato de lisina. El objeto de la invención es un polinucleótido aislado de bacterias corineformes, que contiene la secuencia nucleótida, seleccionado del grupo formado por: a) Polinucleótido que cuando menos es 70% idéntico con un polinucleótido que codifica a un polipéptido, que contiene la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, b) Polinucleótido que codifica a un polipéptido, que contiene una secuencia aminoácida que cuando menos es 70% idéntica a la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, c) Polinucleótido que es complementario a los polinucleótidos de a) o b) , y d) Polinucleótido que contiene cuando menos 15 nucleótiajos secuenciales de la secuencia polinucleótida de a) , b) o c) . El objeto de la invención es igualmente el polinucleótido que es un ADN preferentemente recombinante, replicable en bacterias corineformes . El objeto de la invención es igualmente un polinucleótido que es ARN. El objeto de la invención es igualmente un polinucleótido que preferentemente es un AD? replicable que contiene : (i) la secuencia nucleótida, mostrada en SEQ-ID ?o. 1, o (ii) cuando menos una secuencia que corresponda a las secuencias (i) dentro del rango de degeneración del código genético, o (iii) cuando menos una secuencia que se hibridice con ias secuencias complementarias a las secuencias (i) o (ii) , y eventualmente (iv) mutaciones de sentido de función neutra en (i) . Otros objetos son un vector que contiene el polinucleótido mencionado y bacterias corineformes que sirven como células anfitrionas, que contienen al vector. Objeto de la invención lo son también polinucleótidos que en esencial consisten de una secuencia polinucleótida que pueden obtenerse por medio de selección por medio de hibridización de un banco genético correspondiente, que contiene completamente al gen con la secuencia polinucleótida correspondiente a la SEQ ID no,l, con una sonda que contiene la secuencia del polinucleótido mencionado de acuerdo con SEQ ID No . 1 o un fragmento de esta y aislado de la secuencia de AD? mencionada. Las secuencias polinucleótidas de acuerdo con la invención son adecuadas como sondas de hibridización para AR?, cAD? y AD?, para aislar cAD? con longitud completa, que codifiquen al componente H del sistema de fosfotransferasa (ptsH) y aislar aquellos cAD? o genes, que presenten una alta similitud con la secuencia del gen del componente H del sistema de fosfotransferasa. Las secuencias polinucleótidas de acuerdo con la invención además son adecuadas como cebadores para la preparación de AD? de genes que codifican al componente H del sistema de fosfotransferasa, por medio de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Esos oligonucleótidos que sirven como sondas o cebadores contienen cuando menos 30, preferentemente cuando menos 20, más especialmente cuando menos 15 nucleótidos secuenciales . Adecuados son igualmente los oligonucleótidos con una longitud de cuando menos 40 o 50 nucleótidos. "Aislado" significa que se retira de su ambiente natural . "Polinucleótido" se refiere en general a polirribonucleótidos y polidesoxirribunucleótidos, en donde se puede tratar de AR? o AD? no modificados o ARN o AD? modificados.

Bajo "polipéptídos" se entiende péptidos o proteínas, que contienen dos o más aminoácidos unidos a través de enlaces de péptidos . Los polipéptidos de acuerdo con la invención incluyen polipéptidos de acuerdo con la SEQ. ID No. 2, en especial aquellos con la actividad biológica del componente H del sistema de fosfotransferasa y también aquellos que sean cuando menos en un 70% idénticos con el polipéptido de acuerdo con la SEQ. ID No. 2, preferentemente en un 80% y en especial posean cuando menos un 90 a 95% de identidad con el polipéptido de acuerdo con la SEQ ID No. 2, y que presenten la actividad mencionada. La invención se refiere además a un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en especial L-lisina utilizando bacterias corineform.es que en especial ya produzcan los L-aminoácidos deseados y en los cuales se refuerzan, en especial se sobre-expresan, las secuencias nucleótidas que codifican al gen ptsH. El concepto "refuerzo" describe a este respecto el aumento de la actividad intracelular de una o varias enzimas en un microorganismo, que son codificadas por el ADN correspondiente, para lo cual por ejemplo se aumenta el número de copias del gen o de los genes, se utiliza un fuerte promotor o un gen que codifica a la enzima correspondiente con alta actividad, y eventualmente se combinan esas medidas.

Los microorganismos que son objeto de la presenté invención pueden producir L-aminoácidos, especialmente L-lisina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones, celulosa o de glicerina y etanol. Puede tratarse de un representante de ias bacterias corineformes en especial del género Corynebacterium. En el género Corynebacterium debe mencionarse en especial el tipo Corynebacterium gl utamicum, que se conoce en la técnica por su capacidad de producir L-aminoácidos. Cepas adecuadas del género Corynebacterium en especial del tipo Corynebacterium gl utamicum, son por ejemplo las cepas tipo nativo conocidas Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806 Corynebacterium acetoacidophil um ATCC13870 Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Brevibacterium flavum ATCC14067 Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 y Brevibacterium divaricatum ATCC14020 y los mutantes o cepas preparados de ellas que produzcan L-lisina, como por ejemplo Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712, Corynebacterium gl utamicum FERM-P 6463, Corynebacterium gl utamicum FERM-P 6464 y Corynebacterium gl utamicum DSM5715. Los inventores pudieron aislar el nuevo gen de ptsH codificante al componente H del sistema de fosfotransferasa de C. glutamicum. Para aislar el gen ptsH o también otros genes de C. glutamicum primero se introduce un banco genético de ese microorganismo en E. coli. La introducción de los ¿bancos genéticos es en general conocido, y se describen en libros y manuales. Ejemplos de ellos son el texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Alemania, 1990) o el Manual de Sambrook et al.; Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) . Un banco genético muy conocido es la cepa W3110 de E. coli K-12, que fue depositada por Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) en vectores ?.

Bathe et al., (Molecular and General Genetics, 252;255-2?>5, 1996) describen un banco genético de C. glutamicum ATCC13032, que con la ayuda del vector de cosmido SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences US, 84:2160-2164) en la cepa NM554 de E. coli K-12 (Raleigh et l., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Bdrmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326)) describe otra vez un banco genético de C. glutamicum ATCC13032 utilizando el cosmido pHC79 (Hohn y Coliins, Gene 11, 291-2989 (1980)). Para la preparación de un banco genético de C. glutamicum en E. coli también pueden utilizarse los plásmidos como pBR322 (Bolívar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) o pUC9 (Viera et ai., 1982, Gene, 19:259-268). Como anfitriones son adecuados en especial aquellas cepas de E.coli, que están defectuosas en restricción y recombinación. Un ejemplo de esto es la cepa DH5aMCR, que fue descrita por Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences US, 87 (1990) 4645-4649) . Los fragmentos de ADN largos clonados con la ayuda de los cosmidos pueden ser subclonados y subsecuentemente secuenciados en vectores adecuados para la secuenciación, como lo describe por ejemplo Sanger et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America US, 74:5463-5467, 1377) . De esta manera se obtuvieron las nuevas secuencias de 7ADN de C. giutamicum que codifican al gen ptsH, que como SEQ ID NO. 1 son parte de la presente invención. Además a partir de la presente secuencia de AD? puede seleccionarse la secuencia aminoácida de la proteína correspondiente por medio de los métodos antes descritos. En la SEQ ID ?O. 2 se representa la secuencia aminoácida obtenida del producto genético de ptsH. Las secuencias de AD? codificantes, que se obtienen de la SEQ ID ?O. 1 por medio de la unidad de degeneración del código genético, también son parte de la invención. En la técnica se conocen además intercambios conservadores de aminoácidos como por ejemplo intercambio de glicina por alanina o de ácido asparagínico por ácido glutámico en proteínas como "mutaciones de sentido" (sense mutations) , que no conducen a modificaciones fundamentales de la actividad de la proteína, esto e.s que son de función neutra. Además se sabe que las modificaciones en la terminal N y/o C de una proteína, no pueden influir de manera esencial o hasta estabilizarla. Los datos sobre esto las encuentra el técnico entre otros en Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), por O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), por Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), por Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325 (1988) ) y en textos conocidos de genética y biología molecular. Las secuencias aminoácidas, que se dan correspondientemente en SEQ ID no. 2 también son parte constitutiva de la invención. De igual manera son parte de la invención las secuencias de ADN que hibridizan con la SEQ ID no. l o partes de SEQ ID No. 1. Finalmente también son partes constitutivas de la invención las secuencias de ADN que se prepararon por medio de reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando cebadores, que se obtienen de la SEQ ID. no. 1. Ese tipo de oligonucleótídos tienen típicamente una longitud de cuando menos 15 nucleótidos. Indicaciones respecto a la identificación de secuencias de ADN por medio de hibridización las encuentra el técnico entre otros en el Manual "The DIG System Users Guide for Filter Hibridization", de la firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemania, 1993), y por Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteríology (1991) 41:255-260). Indicaciones sobre la amplificación de secuencias de ADN con ia ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) se encuentran entre otros en el manual de Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) y por Newton y Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemania, 1994) . Los inventores encontraron que las bacterias corineformes después de la sobre-expresión del gen ptsH producen L-aminoácidos, especialmente L-lisina de forma mejorada. Para obtener la sobre-expresión puede aumentarse el número de copias del gen correspondiente o puede mutarse la región promotora y reguladora o el punto de ligado de as ribosomas, que se encuentran corriente arriba del gen estructural. De igual manera sirven los cartuchos de expresión que se construyen corriente arriba del gen estructural . Por medio de promotores inducibles es adicionalmente posible aumentar la expresión en el transcurso de la producción por fermentación de L-lisina. Por medio de medidas para alargar la vida del m-RNA se mejora igualmente la expresión. Además evitando la reducción de la proteína enzimática se refuerza la actividad enzimática. Los genes o las construcciones genéticas pueden encontrarse en los plásmidos con diferentes números de copias o estar integrados y amplificados en el cromosoma. Alternativamente puede obtenerse una sobre-expresión de los genes en cuestión por medio de la modificación de la composición del medio y la realización del cultivo. Datos sobre esto los encuentra el técnico entre otros en los escritos de Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya y Msrinaga (Bio/technology 6, 428-430 (1988)) de Eikmanns et ai. (Gene 102, 93-98 (1991)), en el escrito de patente europeo EP-B 0 472 869, en la patente de US 4,601,893, de Schwarzer y Pühler (Bio/technology 9, 84-87 (1991), de Reinscheid et al. (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la solicitud de patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134, 15-r24 (1993)), la publicación japonesa JP-A-10-229891, de Jensen y Ha mer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998) ) , de Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) y en los textos conocidos de Genética y Biología Molecular.

Ejempiificativamente se sobre-expresó el gen ptsH de acuerdo con la invención con la ayuda de plásmidos. Como plásmidos son adecuados aquellos que se replican en bacterias corineformes. Muchos vectores de plásmidos conocidos como por ejemplo pZl (Menkel et ai-, Applied and Enviromental Microbiology, (1989) 64: 549-554), pEKExl (Eikmanns et al., Gene 107:69-74 (1991)) o pHS2-l (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)) se basan en los plásmidos crípticos pHM1519, pBLl o pGAl . Otros vectores de plásmido como por ejemplo aquellos que se basan en pCG4 (US-A-4,489,160) o pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)), o pAGl (US-A 5,158,891), pueden utilizarse igualmente. Además son adecuados aquellos vectores de plásmido con cuya ayuda puede utilizarse el procedimiento de la amplificación genética por medio de integración en el cromosoma, descrito por ejemplo por Reinscheid et al.

(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994) ) para la duplicación o amplificación del operon hom-thrB. Con este método se clona el gen completo en un vector de plásmido, que puede replicarse en un anfitrión (típicamente E.coli), pero no en C. glutamicum. Como vectores entran en consideración por ejemplo pSUP301 (Simón et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob o pK19mob (Scháfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, Wl, US), pCR2.1-T0P0 (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; patente US 5,487,993, Pcr®Blunt (Firma invitrogen, Groningen, Holanda; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) o pEMl (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516). El vector de plásmido que contiene al gen a amplificar, se conduce subsecuentemente por medio de conjugación o transformación en la cepa deseada de C. glutamicum, . Los métodos de conjugación se describen por ejemplo por Schafer et al. (applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994) ) . Los métodos para la transformación son descritos por ejemplo por Thierbach et .1. (applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989) ) y Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994) ) . Después de la recombinación homologa por medio de un producto de "cross over", contiene la cepa resultante dos copias del gen en cuestión. Otro objeto de la invención es así un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en especial L-lisina para lo cual se utiliza una cepa transformada con un vector de plásmido, y el vector de plásmido porta la secuencia nucleótida del gen que codifica al componete H del sistema de fosfotransferasa. Además puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos en especial L-lisina el sobre-expresar además del gen ptsH, una o varias enzimas de la vía de biosíntesis de los L-aminoácidos deseados, con lo cual se sobreexpresan una o varias enzimas de la vía biosintética, de la glicólisis, de la anapletórica, del ciclo del ácido cítrico o de la exportación de aminoácidos . Así puede ser ventajoso, por ejemplo para la preparación de L-lisina, el sobre-expresar simultáneamente uno o varios genes seleccionados del grupo de: • el gen dapA que codifica a la sintasa de dihidropicolinato (EP-B 0 197 335), o • el gen gap codificante a la dihidrogenasa de 3-fosfato de gliceraldehido (Eikmanns (1992) . Journal of Bacteriology 174:6076-6O86) , o • el gen tpi codificante a la isomerasa de fosfato de triosa (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174:6076-6086), o • el gen pgk codificante a la quinasa de 3-fosfoglicerato (Eikmanns (1992). Journal of Bacteriology 174:6076-6086), o • el gen ptsM codificante al componente M del sistema de piruvato de fosfoenol-azucar-fosfotransferasa (pstM) (Lee et al. (1994) FEMS, Microbiology Letters 1-2, 137-145), o • el gen pyc codificante a- la carboxilasa de piruvato (DE-A- 198 31 609) , y • el gen lysE codificante al exportador de lisina (DE-A-195 48 222) . Además puede ser ventajoso para la producción de L- aminoácidos, en especial L-lisina, el simultáneamente al refuerzo del gen ptsH, adicionalmente debilitar • el gen pck codificante a la carboxiquinasa de fosfoenolpiruvato (DE 199 50 409.1; DSM 13047) • el gen pgi codificante a isomerasa de glucosa-6-fosfato (US 09/396,478, DSM 12969) y/o • el gen poxB codificante a oxidasa de piruvato (DE 19846499.1; DSM 13114) . 7Además puede ser ventajoso para la producción de L-aminoácidos, en especial L-lisina, además de la sobre-expresión del gen ptsH, el desactivar reacciones indeseables (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms", en: Overproduction of Amino Acid Products, Kru phanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londres, UK, 1982) . Los microorganismos producidos de acuerdo con la invención pueden cultivarse continua o discontinuamente en procedimientos por lotes o en procedimiento de alimentación (fed batch) o procedimiento de alimentación repetitivo (repeated fed batch) con el fin de producir L-aminoácidos, en especial L-lisina. Un resumen de métodos de cultivo conocidos se encuentra en el texto de Chmiel (Bioprozestechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) ) o en el texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994) ) . El medio de cultivo utilizado debe de una forma adecuada ser suficiente para los requisitos de las cepas microorganismos en cuestión. La descripción de medios de cultivo de diferentes microorganismos se encuentra en el manual "Manual of Methods for General Bacteriology" de la Sociedad Americana de Bacteriología (Washington D.C., US, 1981) . Como fuente de carbono pueden utilizarse azucares y carbohidratos como por ejemplo glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melasa, almidones y celulosa, aceites y grasas como por ejemplo aceite de soya, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco, ácidos grasos como por ejemplo ácido palmitíco, ácido estearínico y ácido linoléico, alcoholes como por ejemplo glicerina y etanol y ácidos orgánicos como por ejemplo ácido acético. Estas substancias pueden utilizarse individualmente o en mezclas . Como fuente de nitrógeno, pueden utilizarse compuestos orgánicos que contengan nitrógeno como peptona, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de remojo de maíz, harina de soya y urea o compuesto inorgánicos como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse solas o como mezclas. Como fuentes de fósforo pueden utilizarse ácido fosfórico, dihidrofosfato de potasio o hidrofosfato dipotásico o las correspondientes sales que contienen sodio. El medio de cultivo debe además contener sales de metales como por ejemplo sulfato de magnesio o de hierro, que son necesarias para el crecimiento. Finalmente pueden utilizarse promotores del crecimiento como aminoácidos y vitaminas adicionalmente a las substancias mencionadas. Al medio de cultivo pueden agregarse precursores adecuados . Los aditivos mencionados pueden agregarse al cultivo en forma de una carga única o en una forma adecuada agregarse durante el cultivo . Para controlar el pH del cultivo se utilizan compuestos básicos como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amoníaco o compuestos ácidos como ácido fosfórico o ácido sulfúrico en forma adecuada. Para controlar la formación de espuma pueden utilizarse agentes anti-espumanfes como por ejemplo poliglicoléster de ácido graso o aceites de silicona. Para mantener la estabilidad de los plásmidos pueden agregarse al medio substancias de efecto selectivo, por ejemplo antibióticos. Para mantener las condiciones aeróbicas se introducen al cultivo oxígeno o mezclas gaseosas que contengan oxígeno como por ejemplo aire. La temperatura del cultivo se encuentra normalmente a 20°C a 45°C y preferentemente a 25°C a 40°C. El cultivo se continúa hasta que se ha formado una cantidad máxima de L-aminoácido. Este objetivo se alcanza normalmente en el transcurso de 10 a 160 horas . Otro objeto de la invención es por lo tanto un procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos en especial L-lisina, en el cual se realizan los siguientes pasos : a) Fermentación de las bacterias corineformes que producen L-aminoácidos, en las cuales cuando menos se refuerza, en especial se sobreexpresa el gen codificante al componente H del sistema de fosfotransferasa. b) Enriquecimiento de los L-aminoácidos en el medio o en las células de las bacterias, y c) Aislado de los L-aminoácidos. El análisis de L-lisina puede realizarse por medio de una cromatografía de intercambio de aniones con la subsecuente derivación de ninhidrina tal como lo describe Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190). El procedimiento de acuerdo con la invención sirve para la preparación por fermentación de L-aminoácidos, en especial de L-lísina.

Ejemplos: La presente invención se explicara más detalladamente con la ayuda de ios ejemplos de realización. Ejemplo 1 Preparación de un banco genético de cosmido genómico a partir de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 fue aislado como lo describe Tauch et al. (1995, Plasmid 33:168-179), y se disoció parcialmente con enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Friburgo Alemania, descripción del producto Sau3AI, código no. 27-0913-02). Los fragmentos de ADN se desfofosforilaron con la ayuda de fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, descripción del producto SAP, código no. 1758250) . El 7?DN del vector de cosmido SuperCol (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences US 84:2160-2164), en referencia a la firma Stratagene (La Jolla, US, descripción del producto SuperCosl Cosmid Vektor Kit, código no. 251301) se disoció con ia enzima de restricción Xbal (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, denominación del producto Xbal, código no. 27-0948-02) e igualmente se desfosforiló con fosfatasa alcalina. A continuación se disoció el ADN de cosmido con la enzima de restricción BamHI (Amersham Pharmacia, Friburgo, Alemania, denominación del producto BamHI, código no. 27-0868-04) . El ADN de cosm:j.do tratado de esa manera se mezcló con el ADN ATCC13032 tratado y el producto se trató con ligasa de ADN T4, (Amersham Pharmacia Biotech. Friburgo, Alemania, descripción del producto ligasa de ADN T4, producto no. 27-0870-04) . La mezcla de ligado se empacó en fagos con la ayuda de Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, US, denominación del producto Gigapack II XL Packing Extracts, código no. 200217) . Para la infección de la cepa de E. coli NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575) , las células se tomaron en 10 mM MgS04 y se mezclaron con una alícuota de suspensión de fagos. La infección y la titulación del banco de Cosmido fueron realizadas como lo describe Sambrook et al.; (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor) , en donde las células se trasplantan sobre agar LB (Lennox 1955, Virology, 1:190) con 100 µg/ml de ampicilina. Después de la incubación durante la noche a 37°C se seleccionaron ias colonias individuales recombinantes . Ejemplo 2 Aislado y Secuenciación del gen ptsH El ADN de cosmido de una colonia individual se aisló de acuerdo con las indicaciones del fabricante del Qiaprep Spin Miniprep Kit (producto no. 27106, Qiagen, Hilden, Alemania) y se disoció parcialmente con la enzima de restricción Sau3AI (Amersham Pharmacia, Friburgo Alemania, descripción del producto Sau3AI, código no. 27-0913-02) . Los fragmentos de ADN se desfofosforilaron con la ayuda de fosfatasa alcalina de camarón (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania, descripción del producto SAP, código no. 1758250) . Después de la separación electroforética de gel se realizó el aislado de los fragmentos de cosmido en el rango de 1500 a 2000 bp con el equipo QiaExII Gel Extraction Kit (producto no. 20021, Qiagen, Hilden, Alemania) . El ADN del vector de sesuenciación pZero-1 en relación al de la firma Invitrogen (Groningen, Holanda, denominación del produato Zero Background Cloning Kit, producto no. K2500-01) se disoció con la enzima de restricción BamHI (Amers am Pharmacia, Friburgo, Alemania, denominación del producto BamHI, código no. 27-0868-04). El ligado de los fragmentos de cosmido en el vector de secuenciación pZero-1 se realizó como se describe por Sambrook et al. {1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor) , en donde la mezcla de ADN se incuba durante la noche con ligasa T4 (Pharma Ía Biotech, Friburgo, Alemania) . Esa mezcla de ligado se electroporó a continuación en la cepa de E. coli DH5om[icr (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649) (Tauch et al. 1994, FEMS microbiology Letters, 123:343-7), y sobre agar LB (Lennox 1955, Virology, 1:190) con 50 µg/ml de zeocina. La preparación de plásmido de los clones recombinantes se realizó con el Birobot 9600 (producto no. 900200, Qiagen, Hilden, Alemania) . La J secuenciación se realizó de acuerdo con el método de ruptura de la cadena didesoxi de Sanger et al, (1977, Proceedings of the National of Sciences of the United States of America US, 74:5463-5467) y modificaciones de acuerdo con Zimmerman et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Se utilizó el "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" de PE Applied Biosystems (producto no. 403044, Weiterstadt, Alemania) . La separación electroforética y el análisis de la reacción de secuenciación se realizó en un gel de "acrilamida/ bisacrilamida para Rotiphoresis NF" (29:1) (producto no. A124.1, Roth, Karlsruhe, Alemania) con el aparato de secuenciación "ABI Prism 377" de PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Alemania) . Los datos de la secuencia en bruto -obtenidos fueron procesados subsecuentemente utilizando el paquete de programación Staden (1986, Nucleic Acids, Research, 14:217-231) versión 97-0. Las secuencias individuales de los derivadas de pZerol se ensamblaron en un Contig dependiente. El análisis de rango de codificación apoyado por computadora se realizó con el programa XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231). Otros análisis se realizaron con "BLAST search programs" (Altschiul et al., 1997, Nuclfic Acids research, 25: 3389-3402), frente al banco de datos no redundante del "National Center for Biotechnology Information" (NCBI, Bethesda, MD, US) .

La secuencia nucleótida obtenida se representa en SEQ ID no. 1. Los análisis de ia secuencia nucleótida dio un marcador de lectura abierto con 267 pares de bases, que fue denominado como el gen ptsH. El gen ptsH codifica a una proteína de 89 aminoácidos. Ejemplo 3 Preparación del vector péndulo pEC-K18mob2ptsHexp para reforzar el gen ptsH en C. glutamicum 3.1 Clonación del gen ptsH en el vector Pcr®Blunt De la cepa ATCC 13032 se aisló de acuerdo con el método de Eikmanns et al. (Microbiology 140; 1817-1828 (1994)) ADN cromosómico. Debido a la secuencia conocida por el ejemplo 2 para C. glutamicum del gen ptsH se seleccionaron los siguientes oligonucleótidos para la reacción de cadenas de polimerasa: ptsHexpl : 5' ACC ACT GGT GCA ATC TCC AT 3' ptsHexP2: 5' TTT ACT CAG CGT CAA GGT CC 3' Los cebadores epresentados fueron sintetizados por la firma ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Alemania) y la reacción PCR se realizó de acuerdo con el protocolo estándar de Innis et al. (PCR protocols. A guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) con polimerasa Pwo de la firma Roche Diagostics GmbH (Mannheim, Alemania) . Con la ayuda de la reacción de cadenas dé polimerasa permitieron los cebadores la amplificación de un fragmento de ADN de 686 kb de longitud, que portaba el gen ptsH con la región promotora potencial. La secuencia ADN el fragmento de ADN amplificado se verificó por medio de secuenciació . El fragmento de ADN amplificado se ligó con el equipo Zero Blunt™Kit de Invitrogen Corporation (Cárlsbad, CA, Estados Unidos; catálogo no. K2700-00) en el vector pcr®Blunt n (Bernard et al., Jpournal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993) ) . La cepa de E. coli TOP10 entonces se electroporó con la mezcla de ligado (Hanahan, en: DNA Cloning. A Practical Approach, vol. I., IRL-Press,. Oxford, Washington DC, Estados Unidos, 1985) . Las células que portaban el plasmido se seleccionaron al inocular la mezcla de transformación en agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. edición, Cold Spring Hrbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N:Y:, 1989) que ha sido suplementado con 25 mg/l de kanamicina. El ADN de plásmido se aisló de un transformante usando el equipo QIAprepSpin Miniporep Kitde Qiagen y se analizó por medio de restricción con la enzima de restricción EcoRI seguido por electroforesis de gel de agarosa (0.8%) . El plasmido fue nombrado pCRBl- pstHexp y se muestra en la figura 1. 3.2 Preparación del vector péndulo E.coli-C. glutamicum pEC- K18mob2 De acuerdo con el estado de la técnica se construyó el vector péndulo E.coli.-C. glutamicum. El vector contiene la región de replicación rep del plásmido pGAl incluyendo el efector de replicación per (US-A-5, 175, 108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), el gen de resistencia a la kanamicina aph(3')-Ha de la transposon Tn5 (Beck et al., Gene 19, 327-336 (1982)), la región de replicación oriV del plásmido pMBl (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)), el fragmento genético iacZa incluyendo el promotor lac y un punto de corte de clonación múltiple (mes) (Norrander, J.M., et al., Gene 26,101-106 (1983)) y la región mob del plásmido RP4 (Simón et al., Bio/Technology 1:784-791 (19983)). El vector construido se transformó en la cepa de E. coii DH5oc (Hanahan, en: DNA Cloning. A Practical Approach, vol. I, IRL-Press-Oxford, Washington DC, US) . La selección de las células que portan el plásmido se realizó por medio de trasplantado del producto de transformación sobre agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laborátory Manual. 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y.) que fue suplementada con 25 mg/l de kanamicina. El ADN de plásmido se aisló de un transformante con la ayuda del QIAprep Spin Miniprep Kit de la firma Qiagen y se verificó por medio de la restricción con la enzima de restricción EcoRI y HindIII con subsecuente electroforesis en gel de agarosa (0.8%). El plásmido fue llamado pEC-K18mob2 y se representa en la figura 2. El siguiente microorganismo fue depositado en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest: • Cepa de Corynebacterium glutamicum DSM5715/pEC- Kl8mob2 como DSM 13245 3.3 Clonación de ptsH en el vector péndulo de E.coli-C. glutamicum pEC-K18mob2 Con el fin de clonar el gen ptsH en el vector péndulo de E.coli-C.gluiamicum pEC-Kl8mob2 descrito en el ejemplo 3.2, el ADN de plásmido de pEC-kl8mon2 se digirió completamente con las endonucleasas de restricción Kpnl y Xbal y se trató con fosfatasa alcalina (fosfatasa alcalina Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) . El vector pCRBl-ptsHexp se aisló de Escherichia coli TolO y se digirió completamente con endonucleasas de restricción Kpnl y Xbal, y el fragmento de 788 bp con el gen ptsH se purificó a partir 0.8% gel de agarosa (QIAquick Gel Extraction Kit de Qiagen, Hilden, Alemania) . El fragmento con el gen pstH se ligó entonces con el vector pEC-K18mob2 (ligasa T4, Roche Disgnostics GmbH, Mannheim, Alemania) . La mezcla de ligado se transformó en la cepa E.coli DHSamcr (Hanahan, en: DNA Cloning. A Practical Approach, vol. I, IRL- Press, Oxford, Washington DC, Estados Unidos) . Las células que portan plásmido se seleccionaron al inocular la mezcla de transformación en agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y.) que fue suplementada con 25 mg/l de kanamicina. El ADN de plásmido se aisló de un transformante con la ayuda del QIAprep Spin Miniprep Kit de la firma Qiagen (Hilden, Alemania) y se veri£r> per pßdio de trafcarráartto con la enzima de restricción EcoRI con subsecuente electroforesis en gel de agarosa. El plásmido fue llamado pEC-K18mob2ptsHexp y se representa en la figura 3. La cepa fue nombrada E. coli DH5amcr/pEC- K18mob2ptsHexp y fue depositada en la forma de un cultivo puro el 28 de noviembre del 2000 en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares, (DSMZ; Braunschweig, Alemania) como DSM 13879, de acuerdo con el Tratado de Budapest . 'Ejemplo 4 Transformación de la cepa DSM5715 con el plasmido pEC-Kl8mob2ptsHexp La cepa de DSM5715 se transformó con el plásmido pEC-K18mob2ptsHexp utilizando el método de electroporación de Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)). La selección de los transformantes se realizó sobre agar LBHIS consistente de 18.5 g/1 caldo de infusión de cerebro-corazón, Sorbitol 0.5M, 5 g/1 Bacto-tripton, 2.5 g/1 extracto de bacto-levadura, 5 g/1 NaCl y 18 g/1 Bacto-Agar, que había sido suplementado con 25 mg/l de kanamicina. La incubación se realizó durante 2 días a 33°C. El ADN de plásmido se aisló de un transformante de acuerdo con los métodos habituales (Peters-Wendish et al., Microbiology, 144:915-927 (1998)), se cortó con la endonucleasa de restricción EcoRI y el plásmido se verificó por medio de subsecuente electroforesis de gel de agarosa . La cepa obtenida fue llamada DSM5715/pEC-K18mob2ptsHexp. Ejemplo 5 Preparación de lisina La cepa de C. glutamicum DSM5715/pEC-K18mob2ptsHexp obtenida en el ejemplo 4, se cultivó en un medio nutritivo adecuado para la producción de lisina y se determinó el contenido de lisina en la nata del cultivo. Para esto, primero se incubó la cepa sobre una placa de agar con el antibiótico correspondiente (agar de cerebro-corazón con kanamicina (25 mg/l) ) durante 24 horas, a 33°C. A partir de ese cultivo en placas de agar se inoculó un pre-cultivo (10 ml de medio en un matraz Erlenmeyer de 100 ml) . Como medio para el pre-cultivo se utilizó el medio completo Cg III.

Medio Cg III NaCl 2.5 g/1 Bacto-peptona 10 g/1 Extracto Bacto-Levadura 10 g/1 Glucosa (en autoclave separado) 2% (p/v) El valor pH se ajustó a un pH de 7.4. A este se le agregó kanamicina (25 mg/m) . El precultivo se incubó durante 16 horas a 33°C a 240 rpm en el agitador. De este precultivo se inoculó un cultivo principal, de tal forma que el OD inicial (660 nm) del cultivo principal fue de 0.05. Para el cultivo principal se utilizó el medio MM. Medio MM CSL (Licor de remojo de maíz) 5 g/1 MOPS 20 g/1 Glucosa (en autoclave separado) lOOg/l (NH4)2S0 25g/l KH2PO4 0.1g/l MgS04*7H20 1.0g/l CaCl2*7H20 10 mg/l FeS0 * 7H20 10mg/l MnS04*H20 5. Omg/1 Biotina (filtrada estéril) 0.3 mg/l Tiamina*HCl (filtrada estéril) 0.2 mg/l L-leucina (filtrada estéril) 0.1 g/1 CaC05 25 g/1 CSL, MOPS y la solución salina se ajustan a un pH de 7 con amoníaco ' acuoso y se someten a autoclave. Finalmente se agregan las soluciones estériles de substrato y vitamina, así como el CaC03 sometido a autoclaveseco. El cultivo se realiza en 10 ml de volumen en un matraz Erlenmeyer de 100 ml con chicanas . Se agregó kanamicina (25 mg/i) . El cultivo se realizó a 33° C y 80% de humedad del aire. Después de 48 - y 72 horas se determinó la OD a una longitud de onda de medición de 660 nm con el Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich) . La cantidad de lisina formada se determinó con un analizador de aminoácidos de la firma Eppendorf-BioTronik (Hamburgo, Alemania) por medio de cromatografía de intercambio de iones y la derivatización de columna posterior con detección de ninhidrina. En la tabla 1 se presentan los resultados de la prueba .

Tabla 1 Se anexan las siguientes figuras: Figura 1: mapa del plásmido pCRBl-ptsHexp Figura 2: mapa del plásmido pEC-K18mob2 Figura 3: mapa del plásmido pEC-K18mob2ptsHexp Las abreviaturas y denominaciones usadas tienen los siguientes significados: Kan: gen de resistencia a la kanamicina Zeocina: gen de resistencia a la zeocina ptsH: gen ptsH de C. glutamicum ColEl : origen de replicación del plasmido ColEl lacZ-alpha: fragmento del gen lacZ de E. coli lacZ-alpha' : fragmento del gen lacZ de E. colí per: gen para el control del número de copias de pGAl oriV: origen similar a ColEi de pMBl rep: región de replicación codificada con plásmido de plásmido pGAl de C. glutamicum RP4mob: punto de mobilización RP4 EcoRI : punto de restricción de la enzima de restricción EcoRI HindIII: punto de restricción de la enzima de restricción HindIII Kpnl: punto de restricción de la enzima de restricción Kpnl Xbal : punto de restricción de la enzima de restricción Xbal Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de- la invención.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad io contenido en las siguientes reivindicaciones: 1.- Polinucleótido aislado de bacterias corineformes, caracterizado porque contiene una secuencia polinucleótida, seleccionada del grupo formado por: a) polinucleótido que cuando menos es 70% idéntico a un polinucleótido que codifica a un polipéptido, que contiene la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, b) polinucleótido que codifica a un polipéptido, que contiene una secuencia aminoácida que cuando menos es 70% idéntica a la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, c) polinucleótido que es complementario a los polinucleótidos de a) o b) , y d) polinucleótido que contiene cuando menos 15 nucleotidos de la secuencia polinucleótida de a) , b) o c) .
2. 2.- Polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el _polinucleótido es ADN, preferentemente recombinante, replicable en bacterias corineformes .
3. 3.- Poiinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es ARN.
4. 4.- ADN replicable de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque contiene: (i) la secuencia nucleótida, mostrada en SEQ-ID no. 1, o (ii) cuando menos una secuencia que corresponda a la secuencia (i) dentro del rango de degeneración del código genético, o (iii) cuando menos una secuencia que se hibridice con las secuencias complementarias a las secuencias (i) o (ii) , y eventualmente (iv) mutaciones de sentido de función neutra en (i) .
5. 5.- Secuencia polinucleótida de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizada porque codifica a un polipéptido, que contiene la secuencia aminoácida representada en SEQ ID no. 2.
6. 6.- Vector caracterizado porque contiene una secuencia polinucleótida de acuerdo con la reivindicación 1.
7. 7.- Bacteria corineforme, caracterizada porque contiene un vector de acuerdo con la reivindicación 6.
8. 8.- Procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos, caracterizado porque se realizan los siguientes pasos: a) Fermentación de las bacterias corineformes que producen los L-aminoácidos, en las cuales cuando menos se refuerza, en especial se sobre-expresa, el gen que codifica al componente H del sistema de fosfotransferasa, b) enriquecimiento de los L-aminoácidos en le medio o en las células de las bacterias y c) aislado de los L-aminoácidos.
9. 9.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales adicionalmente se refuerzan otros genes de la via biosintética de los L-aminoácidos deseados .
10. 10.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque se utilizan bacterias en las cuales están desactivadas cuando menos parcialmente las vías metabólicas, que reducen la formación de L-aminoácidos.
11. 11.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque se utiliza una cepa transformada con un vector de plásmido, y el vector de plásmido porta una secuencia nucleótida del gen que codifica al componente H del sistema de fosfotransferasa.
12. 12.- Procedí mi ento de acuerdo con una o varias de jas reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque se utilizan bacterias corineformes, que producen L-iisina.
13. 13.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque simultáneamente se refuezan, en especial se sobre-expresan o amplifican uno o más genes seleccionados del grupo formado por el gen dapA que codifica a la sintasa de dihidropicolinato el gen pyc codificante a la carboxilasa de piruvato el gen tpi codificante a la isomerasa de fosfato de triosa el gen gap codificante a la dihidrogenasa de 3-fosfato de .gliceraldehido el gen ptsM codificante al componente M del sistema de piruvato de fosfoenol-azucar-fosfotransferasa (pstM) el gen pgk codificante a la quinasa de 3-fosfoglicerato el gen lysE codificante al exportador de usina.
14. 14.- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque para la preparación de L-lisina, se fermentan bacterias en las cuales simultáneamente se debilitan uno o varios genes, seleccionados del grupo formado por el gen pck codificante a la carboxiquinasa de fosfoenolpiruvato el gen pgi codificante á isomerasa de glucosa-6-fosfato el gen poxB codificante a oxidasa de piruvato.
15. 15.- Procedimiento de acuerdo con una o varias de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se utilizan microorganismos del género Corynebacterium glutamicum.
16. 16.- Uso de secuencias polinucleótidas de acuerdo con la reivindicación 1 como cebador para la preparación de iDN de genes, que codifican al producto genético ptsH, por medio de la reacción de cadenas de polimerasa.
17. 17.- Uso de secuencias polinucleótidas de acuerdo con la reivindicación 1 como sondas de hibridización. RESUHEN DE IA INVENCIÓN La invención se refiere a un polinucleótido aislado, que contiene una secuencia poilnucleótida, seleccionada del grupo formado por a) polinucleótido que cuando menos es un 70% idéntico a un polinucleótido que codifica a un polipéptido, que contiene la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, b) polinucleótido que codifica a un polipéptido, que contiene una secuencia aminoácida que cuando menos es 70% idéntica a la secuencia aminoácida de la SEQ. ID. No. 2, c) polinucleótido que es complementaria a los polinucleótidos de a) o b) , y d) polinucleótido que contiene cuando menos 15 nucleótidos secuenciales de la secuencia polinucleótida de a) , b) o c), y procedimiento para la preparación por fermentación de L-aminoácidos reforzando el gen ptsH que codifica al componente H del sistema de fosfotransferasa así como el uso de los polinucleótidos anteriores como cebadores o sondas de hibridización .