SK362001A3

SK362001A3 - Nucleotide sequences which code for the ptsh gene

Info

Publication number: SK362001A3
Application number: SK36-2001A
Authority: SK
Inventors: Mike Farwick; Bettina Mockel; Walter Pfefferle
Original assignee: Degussa
Priority date: 2000-01-13
Filing date: 2001-01-09
Publication date: 2002-06-04
Also published as: MXPA01000261A; BR0100063A; HU0100131D0; EP1118666A2; EP1118666A3; DE10001101A1; ZA200100332B; AU7254800A; ID28932A; HUP0100131A2; JP2001224390A; KR100762112B1; CA2328583A1; KR20010086331A; CN1319667A; RU2268938C2

Description

Oblasť techniky

Predmetom vynálezu sú nukleotidové sekvencie kódujúce ptsH a spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselin, najmä L-lyzínu, použitím koryneformných baktérií, v ktorých sa zosilňuje gén ptsH.

Doterajší stav techniky

L-Aminokyseliny, najmä L-lyzín, sa používajú v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle, ale najmä vo výžive zvierat.

Je známe, že L-aminokyseliny sa vyrábajú fermentáciou kmeňov koryneformných baktérií, najmä Corynebacterium glutamicum. Kvôli velkému významu sa stále pracuje na zlepšení spôsobov výroby. Zlepšenia spôsobov sa môžu dokonca týkať fermentačno-technologických opatrení, ako napríklad miešania a zásobovania kyslíkom alebo zloženia živných médií, ako napríklad koncentrácie cukru počas fermentácie, alebo spracovania na produktovú formu, napríklad ionexovou chromatografiou, alebo vlastných úžitkových vlastností samotného mikroorganizmu.

Na zlepšenie úžitkových vlastností týchto mikroorganizmov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a voľby mutantov. Týmto spôsobom sa získajú kmene, ktoré sú rezistentné voči antimetabolitom, ako je napríklad analóg lyzínu S—(2— -aminoetyl)cysteín, alebo sú auxotrofné vzhľadom na regulačné významné metabolity a produkujú L-lyzín.

ŕ e b e e c c ♦ <* r e r c r • e e e or e o r t, e f e e r r e ( r r r r

·’ C r

C r- r , r

Už niekoľko rokov sa taktiež používajú metódy technológie rekombinantných DNA na kmeňové zlepšenie kmeňov Corynebacterium produkujúcich L-aminokyseliny tak, že jednotlivé gény pre biosyntézu L-aminokyselin sa amplifikujú a skúma sa účinok na produkciu L-aminokyselin. Prehľadný článok k tomu sa nachádza medzi iným v Kinoshita („Glutamic Acid Bacteria, in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamín Cummings, Londýn, Veľká Británia, 1985, 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991), Eggeling (Amino Acids 6:261-272 (1994)), Jetten a Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) a Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 2539 (1996)).

Vynálezcovia si stanovili za úlohu poskytnúť nové opatrenia na zlepšenú fermentačnú výrobu L-aminokyselín, najmä L-lyzínu.

L-Aminokyseliny, najmä L-lyzín, sa používajú v humánnej medicíne, vo farmaceutickom priemysle a najmä vo výžive zvierat. Existuje preto všeobecný záujem o poskytnutie nových, zlepšených spôsobov výroby L-aminokyselín, najmä L-lyzínu.

Keď sa v nasledovnom texte uvedie L-lyzín alebo lyzín, mieni sa tým nielen zásada, ale aj soli, ako napríklad monohydrochlorid lyzínu alebo sulfát lyzínu.

Podstata vynálezu c r r c o e ο

Predmetom vynálezu je izolovaný polynukleotid z koryneformných baktérií, obsahujúci polynukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahŕňajúcej

a) polynukleotid, ktorý je aspoň na 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID No. 2,

b) polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 70 % identická s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID No. 2,

c) polynukleotid, ktorý je komplementárny k polynukleotidom a) alebo b) a

d) polynukleotid obsahujúci aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov polynukleotidovej sekvencie a) , b) alebo c) .

Predmetom vynálezu je aj polynukleotid, ktorým je prednostne rekombinantná DNA, replikovateľná v koryneformných baktériách.

Predmetom vynálezu je aj polynukleotid, ktorým je RNA.

Predmetom vynálezu je aj polynukleotid, pričom sa prednostne jedná o replikovatelnú DNA, obsahujúcu:

(i) nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 1 alebo í

(ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii (i) v oblasti degenerácie genetického kódu alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá sa hybridizuje so sekŕ Γ c c

Cl f ·- r c r o ' Γ e e c r >· .. C r · r p r , _r venciou komplementárnou k sekvencií (i) alebo (ii) a poprípade (iv) funkčne neutrálne mutácie so zmyslom v (i).

Ďalšími predmetmi sú vektor obsahujúci jeden z uvedených pč^íúkleotidov a koryneformné baktérie slúžiace ako hostiteľské bunky, ktoré obsahujú tento vektor.

Predmetom.vynálezu sú aj polynukleotidy, ktoré sa skladajú v podstate z polynukleotidovej sekvencie, ktoré možno získať skríningom prostredníctvom hybridizácie príslušnej génovej banky, ktorá obsahuje úplný gén s polynukleotidovou sekvenciou zodpovedajúcou SEQ ID No. 1, pomocou sondy, ktorá obsahuje sekvenciu uvedeného polynukleotidu podlá SEQ ID No. 1 alebo jej fragment, a izoláciou uvedenej sekvencie DNA.

Polynukleotidové sekvencie podlá vynálezu sú vhodné ako hybridizačné sondy pre RNA, cDNA a DNA, aby sa izolovali cDNA s celou dĺžkou, ktoré kódujú zložku H fosfotransferázového systému (ptsH), a aby sa izolovali také cDNA alebo gény, ktoré vykazujú velkú podobnosť sekvencie so sekvenciou génu pre zložku H fosfotransferázového systému.

Polynukleotidové sekvencie podlá vynálezu sú ďalej vhodné ako priméry na prípravu DNA génov, ktoré kódujú zložku H fosfotransferázového systému, polymerázovou reťazovou reakciou (PCR).

Také oligonukleotidy slúžiace ako sondy alebo priméry obsahujú aspoň 30, prednostne aspoň 20, celkom obzvlášť r ŕ r n

O r CC·

C O CC r c prednostne aspoň 15 za sebou nasledujúcich nukleotidov. Vhodné sú taktiež oligonukleotidy s dĺžkou aspoň 40 alebo 50 nukleotidov.

„Izolovaný znamená oddelený zo svojho prirodzeného prostredia.

„Polynukleotid sa vzťahuje všeobecne na polyribonukleotidy a polydeoxyribonukleotidy, pričom sa môže jednať o nemodifikované RNA alebo DNA alebo modifikované RNA alebo DNA.

Pod pojmom „polypeptidy sa rozumejú peptidy alebo proteíny, ktoré obsahujú dve alebo viac aminokyselín viazaných peptidovými väzbami.

Polypeptidy podlá vynálezu zahŕňajú polypeptid podlá SEQ ID No. 2, ďalej také, ktoré majú biologickú aktivitu zložky H fosfotransferázového systému a aj také, ktoré sú aspoň na 70 % identické s polypeptidom podlá SEQ ID No. 2, prednostne aspoň na. 80 % a obzvlášť také, ktoré vykazujú aspoň 90% až 95% identitu s polypeptidom podlá SEQ ID No. 2 a uvedenú aktivitu.

Vynález sa ďalej týka spôsobu fermentačnej výroby L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, použitím koryneformných baktérií, ktoré najmä už produkujú L-aminokyseliny a v ktorých sa zosilňujú, najmä nadmerne exprimujú nukleotidové sekvencie kódujúce gén ptsH.

Pojem „zosilnenie opisuje v tejto súvislosti zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo viacerých enzýmov v mikroorganizme, ktoré sú kódované príslušnou DNA, tým, že sa napríklad zvýši počet kópií génu, poprípade génov, použije ο ι>

r. c « r r t f e r o e * Γ.

c '· o c r c r ’ c r <r . c c r λ r sa silný promótor alebo sa použije gén, ktorý kóduje príslušný enzým s vysokou aktivitou a tieto opatrenia sa poprípade kombinujú.

Mikroorganizmy, ktoré sú predmetom predloženého vynálezu, môžu produkovať L-aminokyseliny, najmä L-lyzín, z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy alebo z glycerolu a etanolu. Môže sa jednať o zástupcov koryneformných baktérií, najmä rodu Corynebacterium. Pri rode Corynebacterium treba uviesť najmä druh Corynebacterium glutamicum, ktorý je v odbornom svete známy pre svoju schopnosť produkovať L-aminokyseliny.

Vhodnými kmeňmi rodu Corynebacterium, najmä druhu Corynebacterium glutamicum, sú napríklad známe kmene divého typu

Corynebacterium Ccrynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Brevibacterium Brevibacterium Brevibacterium glutamicum ATCC13032, acetoglutamicum ATCC15806, acetoacidophilum ATCC13870, thermoaminogenes FERM BP-1539 melassecola ATCC17965, flavum ATCC14067, lactofermentum ATCC13869 a divaricatum ATCC14020 a z nich vytvorené mutanty, poprípade kmene, produkujúce L-lyzín, ako napríklad

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709, Brevibacterium flavum FERM-P 1708,

Brevi bac téri um lactofermentum FERM-P 1712, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463, Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 a

Γ β r c e c c- <* r . λ r to r e f f>

c t' f* CC f r e r . Γ o i '. r r c

Corynebacterium glutamicum DSM5715.

Vynálezcom sa podarilo izolovať nový gén ptsH z C. glutamicum,· kódujúci zložku H fosfotransferázového systému.

Na izoláciu génu ptsH alebo aj iných génov z C. glutamicum sa najskôr založí génová banka tohto mikroorganizmu v

E. coli. Založenie génových bánk je opísané vo všeobecne známych učebniciach a príručkách. Ako príklad možno uviesť učebnicu od Winnackera: Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Nemecko, 1990) alebo príručku od Sambrooka et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1989) . Velmi známou génovou bankou je génová banka kmeňa W3110 E. coli K-12, ktorú založili Kohara et al. (Celí 50, 495 - 508 (1987)) v λ-vektoroch. Bathe et al.. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996) opisujú génovú banku C. glutamicum ATCC13032, ktorá bola založená pomocou kozmidového vektora SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164) v kmeni NM554 E. coli K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Bôrmann et al. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)) zasa opisujú génovú banku C. glutamicum ATCC13032 s použitím kozmidu pHC79 (Hohn a Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Na vytvorenie génovej banky C. glutamicum v E. coli sa môžu použiť aj plazmidy, ako napríklad pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979) alebo pUC9 (Viera¹ et al., 1982, Gene, 19:259-268). Ako hostitelia sú vhodné najmä také kmene E. coli, ktoré sú reštrikčné a rekombinačne defektne. Príkladom toho je kmeň DH5aMCR, ktorý opísal Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Dlhé fragmenty DNA klonované pomocou kozmidov sa potom zasa môžu r r subklonovať do bežných vektorov vhodných na sekvenovanie a potom sekvenovať, ako sa opisuje napríklad v Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74:5463-5467 (1977)).

Týmto spôsobom sa získala nová sekvencia DNA z C. glutamicum, kódujúca ptsH, ktorá je ako SEQ ID No. 1 súčasťou predloženého vynálezu. Ďalej sa z predloženej sekvencie DNA odvodila aminokyselinová sekvencia príslušného proteínu pomocou vyššie opísaných metód. V SEQ ID No. 2 je znázornená vyplývajúca aminokyselinová sekvencia génového produktu ptsH.

Kódujúce sekvencie DNA, ktoré vyplývajú z SEQ ID No. 1 v dôsledku degenerovatelnosti genetického kódu, sú taktiež súčasťou vynálezu. V odbornom svete sú ďalej konzervatívne výmeny aminokyselín, ako napríklad výmena glycínu za alanín alebo kyseliny asparágovej za kyselinu glutámovú, v proteínoch, známe ako „mutácie so zmyslom (sense mutations), ktoré nevedú k žiadnej zásadnej zmene aktivity proteínu, t. zn. sú funkčne neutrálne. Ďalej je známe, že zmeny na N-konci a/alebo C-konci proteínu nemôžu jeho funkciu podstatne obmedzovať alebo ju dokonca môžu stabilizovať. Údaje k tomu nájde odborník medzi iným v Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169:751-757 (1987)), v O'Regan et al. (Gene 77:237-251 (1989)), v Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3:240-247 (1994)), v Hochuli et al. (Bio/Technology 6:13211325 (1988)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie. Aminokyselinové sekvencie, ktoré vyplývajú príslušným spôsobom z SEQ ID NO. 2, a sekvencie DNA kódujúce tieto aminokyselinové sekvencie sú taktiež súčasťou tohto vynálezu.

r r , c « C C

Súčasťou vynálezu sú rovnako aj sekvencie DNA, ktoré sa hybridizujú s SEQ ID No. 1 alebo časťami SEQ ID No. 1. Napokon sú súčasťou vynálezu sekvencie DNA, ktoré sa pripravujú polymerázovou reťazovou reakciou (PCR) použitím primárov, ktoré vyplývajú z SEQ ID No. 1. Také oligonukleotidy majú typickým spôsobom dĺžku aspoň 15 nukleotidov.

Návody na identifikáciu sekvencii DNA pomocou hybridizácie nájde odborník medzi iným v príručke „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization od firmy Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Nemecko, 1993) a v Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260). Návody na amplifikáciu sekvencii DNA pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) nájde odborník medzi iným v príručke Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, Veľká Británia, 1984) a v Newton a Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Nemecko, 1994).

Vynálezcovia zistili, že koryneformné baktérie po nadmernej expresii génu ptsH produkujú zlepšeným spôsobom L-aminokyseliny, najmä L-lyzín.

Na dosiahnutie nadmernej expresie sa môže zvýšiť počet kópií príslušných génov alebo sa môže mutovať promótorová a regulačná oblasť alebo miesto pre naviazanie ribozómov, ktoré sa nachádza proti smeru štruktúrneho génu. Rovnakým . spôsobom pôsobia expresívne kazety, ktoré sa vkladajú proti smeru štruktúrneho génu. Pomocou indukovateľných promótorov možno prídavné zvýšiť expresiu v priebehu fermentačnej produkcie L-aminokyselín. Opatreniami na predĺženie trvanlivosti m-RNA sa expresia taktiež zlepšuje. Ďalej sa enzýmová aktivita taktiež zosilňuje zabránením odbúravania enzýmového proteínu. Gény alebo génové konštrukty môžu buď o r r r r r c ô c r _r ^r - ŕ r r I r r P r r. r c r r r existovať v plazmidoch s rozdielnym počtom kópii, alebo môžu byť integrované a amplifikované v chromozóme. Ďalej sa môže alternatívne dosiahnuť nadmerná expresia príslušných génov zmenou zloženia médií a zmenou uskutočnenia kultivácie.

Návody na to nájde odborník medzi iným v Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), v Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya a Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), v Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), v európskom patentovom spise EPS 0 472 869, v US patente 4, 601,893, vo Schwarzer a Píihler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), v Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), v LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), v patentovej prihláške WO 96/15246, v Malumbres et al. (Gene 134, 15 - 24 (1993)), v japonskom zverejnenom spise JP-A-10-229891, v Jensen a Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), v Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) a v známych učebniciach genetiky a molekulovej biológie .

Gén ptsH podlá vynálezu sa napríklad nadmerne exprimoval pomocou plazmidov.

Ako plazmidy sú vhodné také, ktoré sa replikujú v koryneformriých baktériách. Početné známe plazmidové vektory, ako napríklad pZl (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554), pEKExl (Eikmanns et al., Gene 102:93-98 (1991)) alebo pHS2-l (Sonnen et al., Gene 107:69-74 (1991)) sa zakladajú na kryptických plazmidoch pHM1519, pBLl alebo pGAl. Rovnako sa môžu použiť iné plazmidové vektory, ako napríklad tie, ktoré sú založené na pCG4 (US-A 4,489,160) alebo pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS e ľ n

P Γ r ! c,

O ©C Γ r <? p f c r r r. c C ..

Cl

Q

Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)) alebo pAGl (US-A 5, 158,891).

Ďalej sú vhodné také plazmidové vektory, pomocou ktorých sa môže použiť spôsob génovej amplifikácie integráciou do chromozómu, ako opísal napríklad Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), na duplikáciu, poprípade amplifikáciu operónu homthrB. Pri tejto metóde sa úplný gén klonuje do plazmidového vektora, ktorý sa môže replikovať v hostiteľovi (typicky E. coli) , avšak nie v C. glutamicum. Ako vektory prichádzajú do úvahy napríklad pSUP301 (Šimon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob alebo pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison,

WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US patent 5,487,993), pCR®Blunt (firma Invitrogen, Groningen, Holandsko; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) alebo pEMl (Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516). Plazmidový vektor obsahujúci gén, ktorý sa má amplifikovať, sa potom prenesie konjugáciou alebo transformáciou do žiadaného kmeň C. glutamicum. Metóda konjugácie je opísaná napríklad v Schäfer et al., (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Metódy transformácie sa opisujú napríklad v Thierbach et al., (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican a Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) a Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). Po homológnej rekombinácii pomocou „cross over udalosti obsahuje výsledný kmeň aspoň dve kópie uvedeného génu.

Ďalším predmetom vynálezu je preto spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, pri ktorom sa používa r r r r

r. r r e r r <- n < p * Γ C r c

C ' r. o <· r c c r· kmeň transformovaný plazmidovým vektorom, a plazmidový vektor, ktorý nesie nukleotidovú sekvenciu génu kódujúceho zložku H fosfotransferázového systému.

Prídavné môže byť pre produkciu L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, výhodné okrem génu ptsH zosilniť ďalšie gény pre biosyntetickú dráhu žiadanej L-aminokyseliny, aby sa nadmerne exprimoval jeden alebo viac enzýmov danej biosyntetickej dráhy, glykolýzy, anaplerotiky alebo prenosu L-aminokyseliny.

Takto sa napríklad môže na produkciu L-lyzínu súčasne nadmerne exprimovať jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej • gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu (EP-B 0 197 335), • gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174:

6076-6086), • gén tpi kódujúci triózafosfátizomerázu (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), • gén pgk kódujúci 3-fosfoglycerátkinázu (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), • gén ptsM kódujúci zložku M fosfoenolpyruvát-cukorfosfotransferázového systému (ptsM) (Lee et al. (1994), FEMS Microbiology Letters 1-2, 137-145), • gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu (DE-A-198 31 609) a lil C Λ.

r i r r c o r · r t.

• gén lysE kódujúci prenos lyzínu (DE-A-195 48 222) .

Ďalej môže byť pre produkciu L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, výhodné okrem génu ptsH súčasne zoslabiť • gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu (DE

199 50 409.1, DSM 13047) a/alebo • gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu (US 09/396,478, DSM 12969) • gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu (DE 19846499.1, DSM 13114) .

Ďalej môže byť pre produkciu L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, okrem nadmernej expresie génu ptsH výhodné vylúčiť nežiaduce vedľajšie reakcie (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, Londýn, Veľká Británia, 1982).

Mikroorganizmy vyrobené podľa vynálezu sa môžu na účely produkcie L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, kultivovať kontinuálne alebo diskontinuálne spôsobom batoh (vsádzková kultivácia) alebo spôsobom fed batoh (prítokový systém) alebo spôsobom repeated fed batch (opakovaný prítokový systém). Zhrnutie známych kultivačných metód je opísané v učebnici od Chmiela (Bioprozesstechnik 1. Einfúhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) alebo v učebnici od Storhasa (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).

r r r r e e r r r © c _r c e r f n c p r < <' r r c ‘ ~ t' - r • --r Γ f ? Použité kultivačné médium musí vhodným spôsobom vyhovovať nárokom daných kmeňov. Opisy kultivačných médií rozličných mikroorganizmov sa nachádzajú v príručke „Manual of Methods for General Bacteriology od American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981). Ako zdroje uhlíka sa môžu používať cukry a sacharidy, ako je napríklad glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza; oleje a tuky, ako napríklad sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosový olej; mastné kyseliny, ako je kyselina palmitová, kyselina steárová, kyselina linolová; alkoholy, ako je napríklad glycerol a etanol; a organické kyseliny, ako je napríklad kyselina octová. Tieto látky sa môžu používať ako jednotlivé zložky alebo ako zmes. Ako zdroje dusíka sa môžu používať organické zlúčeniny obsahujúce dusík, napríklad peptóny, kvasnicový extrakt, mäsový extrakt, sladový extrakt, kukuričný extrakt, sójová múka a močovina, alebo anorganické zlúčeniny, ako je napríklad síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny a dusičnan amónny. Zdroje dusíka sa môžu používať jednotlivo alebo ako zmes. Ako zdroje fosforu sa môžu používať kyselina fosforečná, dihydrogenfosforečnan draselný alebo hydrogenfosforečnan draselný alebo príslušné sodné soli. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železa, ktoré sú potrebné na rast. Napokon sa môžu dodatočne k vyššie uvedeným látkam používať esenciálne rastové látky, ako sú Laminokyseliny a vitamíny. Ku kultivačnému médiu sa môžu okrem toho pridávať vhodné prekurzory. Uvedené používané suroviny sa môžu ku kultúre pridávať vo forme jednorazovej vsádzky alebo sa môžu vhodným spôsobom pridávať počas kultivácie.

Na kontrolu pH kultúry sa vhodne používajú zásadité zlúčeniny, ako je hydroxid sodný, hydroxid draselný, amo15 • · c • * e 6 c ♦ c c r c · · e r r t n r c c e c c r r r r u r co .

O C r r c c r o c c c f r ' C c c.

niak, poprípade amoniaková voda, alebo kyslé zlúčeniny, ako je kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Na kontrolu tvorby peny sa môžu používať odpeňovadlá, ako napríklad polyglykolestery mastných kyselín. Na udržiavanie stability plazmidov sa môžu k médiu pridávať vhodné selektívne pôsobiace látky, napríklad antibiotiká. Aby sa udržiavali aeróbne podmienky, zavádza sa do kultúry kyslík alebo zmesi plynov obsahujúce kyslík, napríklad vzduch. Teplota kultúry je zvyčajne približne 20 °C až 45 °C a najmä približne 25 °C až 40 °C. Kultúra sa udržiava tak dlho, kým sa nevytvorí maximum L-lyzínu. Tento ciel sa zvyčajne dosiahne za 10 hodín až 160 hodín.

Ďalším predmetom vynálezu je preto spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín, najmä L-lyzínu, pri ktorom sa uskutočňujú nasledovné kroky:

a) fermentácia koryneformných baktérií produkujúcich

L-aminokyselinu, v ktorých sa zosilňuje, najmä nadmerne exprimuje aspoň gén ptsH kódujúci zložku H fosfotransferázového systému,

b) koncentrovanie L-aminokyseliny v médiu alebo v bunkách baktérií a

c) izolácia L-aminokyseliny.

Analýza L-lyzínu sa môže uskutočňovať anexovou chromatografiou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou tak, ako sa opisuje v Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958) 1190) .

Spôsob podlá vynálezu slúži na fermentačnú výrobu L-aminokyselín, najmä L-lyzínu.

Príklady uskutočnenia vynálezu : ( . c Γ <*·

Predložený vynález sa v nasledovnom texte bližšie vysvetľuje na základe príkladov uskutočnenia.

Príklad 1

Vytvorenie genómovej kozmidovej génovej banky z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032

Chromozómová DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 sa izolovala tak, ako sa opisuje v Tauch et al., (1995, Plasmid 33: 168-179), a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Sau3AI, Code no. 27-0913-02). Fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z garnátov (shrimp) (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, opis produktu SAP, Code no. 1758250). DNA kozmidového vektora SuperCosl (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164), získaná od firmy Stratagene (La Jolla, USA, opis produktu SuperCosl Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301), sa štiepila reštrikčným enzýmom Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Xbal, Code no. 27-0948-02) a taktiež defosforylovala alkalickou fosfatázou z garnátov (shrimp). Následne sa kozmidová DNA štiepila reštrikčným.enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu BamHI, Code no. 27-0868-04). Týmto spôsobom spracovaná kozmidová DNA sa zmiešala so spracovanou DNA ATCC13032 a zmes sa spracovala T4 DNA-ligázou (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu T4-DNA-ligáza, Code no. 27-0870-04). Ligačná zmes sa potom pomocou Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, opis produktu Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217) vbalila do fágov. Na infekciu kmeňa E. coli c o f

e c r tO

NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16:15631575) sa bunky zachytili v lOmM MgSO₄ a zmiešali s alikvotom suspenzie fágov. Infekcia a titrácia kozmidovej banky sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v Sambrook et al. (1989,

Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom sa bunky naniesli na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) so 100 pg/ml ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri 37 °C sa selektovali jednotlivé rekombinantné klony.

Príklad 2

Izolácia a sekvenovanie génu ptsH

Kozmidová DNA jednotlivej kolónie sa izolovala pomocou Qiaprep Spin Miniprep Kit (produkt č. 27106, Qiagen, Hilden, Nemecko) podľa návodov výrobcu a čiastočne rozštiepila reštrikčným enzýmom Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu Sau3AI, produkt č. 27-0913-02). Fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z garnátov (shrimp) (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Nemecko, opis produktu SAP, produkt č. 1758250). Po oddelení gélovou elektroforézou sa uskutočnila izolácia kozmidových plazmidov s rozsahom veľkostí 1 500 až 2 000 bp pomocou QiaExII gel Extraction Kit (produkt č. 20021,

Qiagen, Hilden, Nemecko). DNA sekvenčného vektora pZero-1, získaná od firmy Invitrogen (Groningen, Holandsko, opis produktu Zero Background Cloning Kit, produkt č. K2500-01), sa štiepila reštrikčným enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Nemecko, opis produktu BamHI, produkt č. 27-086804). Ligácia kozmidových fragmentov do sekvenčného vektora pZero-1 sa uskutočnila tak, ako sa opisuje v Sambrook et al. (Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), pričom zmes DNA s T4-ligázou (Pharmacia Biotech, e e e r>

Λ (_ t; ú e r (· e r f I* <. ' r é β t

O f r o r r· n /·. r t or >

r. c

C r GC

Freiburg, Nemecko) sa inkubovala cez noc. Táto ligačná zmes sa následne elektroporovala (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) do kmeňa E. coli DH5aMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649) a naniesla na agar LB (Lennox, 1955, Virology, 1:190) s 50 pg/ml zeocínu. Plazmidová preparácia rekombinantných klonov sa uskutočňovala pomocou Biorobot 9600 (product č. 900200, Qiagen, Hilden, Nemecko). Sekvenovanie sa uskutočňovalo dideoxymetódou ukončenia reťazca od Sanger et al. (1997, Proceedings of the National of Sciences

U.S.A.,74:5463-5467) s modifikáciami podlá Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067). Použil sa „RR dRhodamin Terminátor Cycle Sequencing Kit od PE Applied Biosystems (produkt č. 403044, Weiterstadt, Nemecko). Oddelenie gélovou elektroforézou a analýza sekvenačnej reakcie sa uskutočňovala v géle „Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid (29:1) (produkt č. A124.1, Roth, Karslruhe, Nemecko) so sekvenčným prístrojom „ABI prism 377 od PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Nemecko) .

Získané nespracované údaje o sekvenciách sa následne spracovali procesorom použitím programového balíka Staden (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) Version 97-0. Jednotlivé sekvencie derivátov pZerol sa zostavili do jedného súvislého celku. Počítačová analýza kódujúcich oblastí sa uskutočnila pomocou programu XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231). Ďalšie analýzy sa uskutočnili pomocou „BLAST search programs (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402) proti neredundantnej databanke od „National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) .

• t

r. r t e e r · r e r b * í·

C ft l f ’

Získaná nukleotidová sekvencia je znázornená v SEQ ID NO 1. Analýza nukleotidovej sekvencie poskytla otvorený čítací raster s 267 pármi báz, ktorý sa označil ako gén ptsH. Gén ptsH kóduje proteín s 89 aminokyselinami.

Príklad 3

Príprava kyvadlového vektora pEC-K18mob2ptsHexp na zosilnenie génu ptsH v C.glutamicum

3.1 Klonovanie génu ptsH do vektora pCR®Blunt II

Chromozómová DNA sa izolovala z kmeňa ATCC 13032 metódou podľa Eikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)) . Na základe sekvencie génu ptsH známej z príkladu 2 pre C. glutamicum sa selektovali nasledovné oligonukleotidy pre polymerázovú reťazovú reakciu:

PtsHexpl:

5' ACC ACT GGT GCA ATC TCC AT 3' ptsHexp2:

5' TTT ACT CAG CGT CAA GGT CC 3'

Znázornené priméry sa syntetizovali pomocou ARK Scientific GmbH Biosystems (Darmstadt, Nemecko) a PCR reakcia sa uskutočnila podľa štandardnej metódy PCR od Innisa et al. · (PCR protocols. A guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press) s polymerázou Pwo od Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Nemecko). Pomocou tejto polymerázovej reakcie umožnili priméry amplifikáciu 686 bp fragmentu DNA, ktorý nesie gén ptsH s potenciálnou promotórovou oblasťou. Sekvencia DNA amplifikovaného fragmentu DNA sa analyzovala sekvenovaním.

C r·

C r r r c r c r r β r r , (.· o

Amplifikovaný fragment DNA sa ligoval pomocou Zero Blunt™ Kit od Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA, USA; katalógové číslo K2700-20) do vektora pCR®Blunt II (Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)).

Kmeň E. coli TOPIO sa potom elektroporoval s ligačnou zmesou (Hanahan, in: DNA Cloning. A Practical Approach. zv. I., IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA, 1985). Bunky nesúce plazmid sa selektovali nanesením transformačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), ktorý bol doplnený 25 mg/1 kanamycínu. Plazmidová DNA sa izolovala z transformantu použitím QIAprep Spin Miniprep Kit od Qiagen a analyzovala reštrikciou reštrikčným enzýmom EcoRI nasledovanou elektroforézou na agarózovom géle (0,8%). Plazmid sa nazval pCRBlptsHexp a je znázornený na obrázku 1.

3.2 Príprava kyvadlového vektora pEC-K18mob2 z E. coli - C. glutamicum

Kyvadlový vektor z E. coli - C. glutamicum sa skonštruoval podlá doterajšieho stavu techniky. Vektor obsahuje replikačnú oblasť rep plazmidu pGAl zahŕňajúcu replikačný efektor per (US-A-5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), gén aph(3')-IIa transpozónu Tn5 udeľujúci rezistenciu na kanamycín (Beck et al., Gene 19, 327-336 (1982)), replikačnú oblasť oriV plazmidu pMBl (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quntitative Biology 43, 77-90 (1979)), génový fragment lacZa zahŕňajúci promótor lac a viacnásobné klonovacie miesto (mcs) (Norrander, J. M. et al., Gene 26, 101-106 (1983) a

oblasť mob plazmidu RP4 (Šimon et al._z Biol/Technology 1: 784-791 (1983)). Skonštruovaný vekor sa transformoval do kmeňa z E. coli DH5ctmcr (Hanahan, in: DNA Cloning. A Practical Approach. zv. I., IRL-Press, Oxford, Washington DC,

USA). Bunky nesúce plazmid sa selektovali nanesením transformačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), ktorý bol doplnený 25 mg/l kanamycínu. Plazmidová DNA sa izolovala z transformantu použitím QIAprep Spin Miniprep Kit od Qiagen a analyzovala reštrikciou reštrikčným enzýmom EcoRI a HindlII a potom elektroforézou na agarózovom géle (0,8%). Plazmid sa nazval pEC-K18mob2 a je znázornený na obrázku 2.

Nasledovný mikroorganizmus sa uložil v Nemeckej zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podľa Budapeštianskej zmluvy:

V- kmeň C. glutamicum DSM 5715/pEC-K18mob2 ako DSM 13245.

3.3 Klonovanie ptsH do kyvadlového vektora pEC-K18mob2 z E. coli - C. glutamicum

Na klonovanie génu ptsH do kyvadlového vektora pECK18mob2 z E. coli - C. glutamicum opísaného v príklade 3.2 sa plazmidová DNA z pEC-K18mob2 úplne rozštiepila reštrikčnými endonukleázami KpnI a Xbal a spracovala alkalickou fosfatázou (Alkaline phosphatase, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemecko).

Vektor pCRBl-ptsHexp sa izoloval z Escherichia coli

ToplO a úplne rozštiepil reštrikčnými endonukleázami KpnI a

Xbal a z 0,8% agarózového gélu (QIAquick Gel Extraction Kit od Qiagen, Hilden, Nemecko) sa vyčistil 788 bp fragment s e · e r o r n í «· o f~ c r <· i ' e ·

0 r e t* r r r r r r c r f <· r r r r r c génom ptsH. Fragment s génom ptsH sa potom ligoval s vektorom pEC-K18mob2 (T4-ligáza, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim; Nemecko). Ligačná zmes sa transformovala do kmeňa z E. coli DH5otmcr (Hanahan, in: DNA Cloning. A Practical Approach. zv. I., IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA). Bunky nesúce plazmid sa selektovali nanesením transformačnej zmesi na agar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), ktorý bol doplnený 25 mg/l kanamycinu. Plazmidová DNA sa izolovala z transformantu použitím QIAprep Spin Miniprep Kit od Qiagen a analyzovala spracovaním reštrikčným enzýmom EcoRI a potom elektroforézou na agarózovom géle. Plazmid sa nazval pEC-K18mob2ptsHexp a je znázornený na obrázku 3.

Kmeň sa nazval E. coli DH5amcr/pEC-K18mob2ptsHexp a uložil sa vo forme čistej kultúry 28. novembra 2 000 v Nemeckej zbierke- mikroorganizmov a bunkových kultúr (DSMZ, Braunschweig, Nemecko) podľa Budapeštianskej zmluvy ako DSM 13878.

Príklad 4

Transformácia kmeňa DSM5715 s plazmidom pEC-K18mob2ptsHexp

Kmeň DSM5715 sa transformoval s plazmidom pEC-K18mob2ptsHexp použitím eletroporačnej metódy opísanej v Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303 (1989)). Transformanty sa selektovali na agare LBHIS zložen^om z 18,5 g/1 mozgovo-srdcového infúzneho bujónu, 0,5 M sorbitolu, 5 g/1 Bacto-tryptónu, 2,5 g/1 Bacto-yeast extract, 5 g/1 NaCl a 18 g/1 Bacto-agaru, ktorý bol doplnený • *

t) 0 e e c c e e r c

mg/1 kanamycínu. Inkubácia sa uskutočňovala 2 dni pri 33 ’C.

Plazmidová DNA sa izolovala z transformantu, obvyklou metódou (Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927), štiepila reštrikčnou endonukleázou EcoRI a plazmid sa potom analyzoval elektroforézou na agarózovom géle. Získaný kmeň sa nazval DSM5715/pEC-K18mob2ptsHexp.

Príklad 5

Príprava lyzínu

Kmeň C. glutamicum DSM5715/pEC-K18mob2ptsHexp získaný v príklade 4 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom na produkciu lyzínu a obsah lyzínu sa stanovoval v kultivačnom supernatante.

Na tento účel sa kmeň na začiatok inkuboval 24 hodín pri 33 °C na agarovej platni s vhodným antibiotikom (mozgovo-srdcový agar s kanamycínom (25 mg/1)). Vychádzajúc z tejto agarovej platne sa naočkovala predkultúra (10 ml média v 100 ml Erlenmeyerovej banke). Médiom použitým pre predkultúru bolo tuhé médium Cg III.

Médium Cg III 2,5 g/1 10 g/1 10 g/1 % (hmotnosť/objem)

NaCl

Bacto-peptón Bacto-yeast extract

Glukóza (oddelene autoklávovaná) Hodnota pH sa nastavila na 7,4.

K tomu sa pridal kanamycín (25 mg/1). Predkultúra sa inkubovala 16 hodín pri 33 °C pri 240 ot./min v e rt r e r « r· β Γ r e r c pretrepávačke. Hlavná kultúra sa naočkovala predkultúrou tak, aby začiatočná optická hustota (660 nm) hlavnej kultúry bola 0,05. Pre hlavnú kultúru sa použilo médium MM.

Médium MM:

CSL (Corn Steep Liquor)	5 g/1
MOPS (kyselina morfolinopropán-	20 g/1
sulfónová)
Glukóza (oddelene autoklávovaná)	100 g/i
(NH₄) ₂SO₄	25 g/1
kh₂po₄	0,1 g/1
MgSO„.7H₂O	1,0 g/1
CaCl₂.2H₂O	10 mg/1
FeSO₄.7H₂O	10 mg/1
MnSO₄.H₂O	5, 0 mg/1
Biotín (sterilizovaný filtráciou)	0,3 mg/1
Tiamín.HCl (sterilizovaný filtráciou)	0,2 mg/1
L-Leucín (sterilizovaný filtráciou)	θ·1 g/1
CaCO₃	25 g/1

CSL, MOPS a roztok solí sa roztokom amoniaku nastavili na pH 7 a autoklávovali. Potom sa pridal sterilný substrát a roztoky vitamínov, ako aj suchý autoklávovaný CaCCb.

Kultivácia sa uskutočňovala v 10 ml objemoch v 100 ml Erlenmeyerovej banke s priehradkami. Pridal sa kanamycín (25 mg/l). Kultivácia sa uskutočňovala pri 33 °C a 80% vlhkosti vzduchu.

. k 72 hodinách

Po 48 hodináchrsa určila optická hustota (OD) pri meracej vlnovej dĺžke 660 nm pomocou Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Mníchov). Vytvorené množstvo lyzínu sa stanovilo pomocou analyzátora aminokyselín od firmy Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Nemecko) ionexovou ch_^roma tograf iou a derivatizáciou na prídavnom stĺpci s ninhydrínovou detekciou.

Výsledok pokusu je uvedený v tabulke 1.

Tabulka 1

Kmeň	Optická hustota (660 nm)	Lyzín-HCl g/i
DSM5715/pEC-K18mob2 (48 hodín)	^11/4	14,14
DSM5715/pEC-Kl8mob2ptsHexp (48 hodín)	10,7	15,98
DSM5715/pEC-K18mob2mob2 (72 hodín)	10,1	15,24
DSM5715/pEC-K18mob2ptsHexp (72 hodín)	10, 0	17,13

e c « e • e σ c c· o r r c r

Prehľad obrázkov na výkresoch

Priložené sú nasledovné obrázky:

Obrázok 1: Mapa plazmidu pCRBl-ptsHexp

Obrázok 2: Mapa plazmidu pEC-K18mob2

Obrázok 3: Mapa plazmidu pEC-K18mob2ptsHexp

Použité skratky a názvy majú nasledovný význam:

Kan:

Zeocin: ptsH:

ColEl: lacZ-alpha: lacZ-alpha' per: oriV: rep:

EcoRI: HindlII: KpnI:

Xbal:

gén pre rezistenciu na kanamycín gén pre rezistenciu na zeocin gén ptsH z C. glutamicum počiatok replikácie plazmidu CelEl génový fragment lacZ z E. coli : fragment génového fragmenttu lacZ z E. coli gén na kontrolu počtu kópií z pGAl počiatok z pMBl zhodný s ColEl plazmidom kódovaná replikačná oblasť z plazmidu pGAl C. glutamicum štiepne miesto pre reštrikčný enzým EcoRI štiepne miesto pre reštrikčný enzým HindlII štiepne miesto pre reštrikčný enzým KpnI štiepne miesto pre reštrikčný enzým Xbal

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaný polynukleotid z koryneformných baktérií, obsahujúci polynukleotidovú sekvenciu, vybranú zo skupiny zahŕňajúcej

a) polynukleotid, ktorý je aspoň na 70 % identický s polynukleotidom, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID No. 2,

b) polynukleotid, ktorý kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je aspoň na 70 % identická s aminokyselinovou sekvenciou SEQ ID No. 2,

c) polynukleotid, ktorý je komplementárny k polynukleotidom

a) alebo b), a

d) polynukleotid obsahujúci aspoň 15 za sebou nasledujúcichnukleoti dov polynukleotidovej sekvencie a) , b) alebo c).
2. Polynukleotid podľa nároku 1, pričom polynukleotidom je prednostne rekombinantná DNA, replíkovateľná v koryneformných baktériách.
3. Polynukleotid podľa nároku 1, pričom polynukleotidom je RNA.
4. Replikovatelná DNA podľa nároku 2 obsahujúca:

(i) nukleotidovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 1, alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii (i) v oblasti degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá sa hybridizuje so sek30 e · λ r

P · r

V * f Γ» β C

C r C c rv ft e p λ e r p e r r r r r r r c c r p venciou komplementárnou k sekvencii (i) alebo (ii), a poprípade (iv) funkčne neutrálne mutácie so zmyslom v (i).
5. Polynukleotidová sekvencia podlá nároku 2, ktorá kóduje polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu znázornenú v SEQ ID No. 2.
6. Vektor obsahujúci polynukleotidovú sekvenciu podlá nároku 1.
7. Koryneformná baktéria obsahujúca vektor podľa nároku

6.
9. Spôsob fermentačnej výroby L-aminokyselín, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňujú nasledovné kroky:

a) fermentácia koryneformných baktérií produkujúcich

L-aminokyselinu, v ktorých sa zosilňuje, najmä nadmerne exprimuje aspoň gén ptsH kódujúci zložku H fosfotransferázového systému,

b) koncentrovanie L-aminokyseliny v médiu alebo v bunkách baktérií a

c) izolácia L-aminokyseliny.
10. Spôsob podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa prídavné zosilňujú ďalšie gény pre biosyntetickú dráhu žiadanej L-aminokyseliny.

.CC—----—C

Γ -ľ·
11. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa používajú baktérie, v ktorých sa aspoň čiastočne eliminujú metabolické dráhy, ktoré znižujú tvorbu L-aminokyseliny.
12. Spôsob podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa používa kmeň transformovaný plazmidovým vektorom a tento plazmidový vektor nesie nukleotidovú sekvenciu génu kódujúceho zložku H fosfotransferázového systému.
13. Spôsob podľa jedného alebo viacerých z nárokov 9 až 12, vyznačujúci sa tým, že sa používajú koryneformné baktérie, ktoré produkujú L-lyzín.
14. Spôsob podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že sa súčasne zosilňuje, najmä nadmerne exprimuje alebo amplifikuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej gén dapA kódujúci dihydrodipikolinátsyntázu, gén pyc kódujúci pyruvátkarboxylázu, gén tpi kódujúci triózafosfátizomerázu, gén gap kódujúci glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázu, gén ptsM kódujúci zložku M fosfoenolpyruvát-cukorfosfotransferázového systému (ptsM), gén pgk kódujúci 3-fosfoglycerátkinázu a gén lysE kódujúci prenos lyzínu.

CO r r f' ’β r ‘ c O C

C C c e r r o r
15. Spôsob podía nároku 11, vyznačujúci sa tým, že na výrobu L-lyzínu sa fermentujú baktérie, v ktorých sa súčasne zoslabuje jeden alebo viac génov zvolených zo skupiny zahŕňajúcej gén pck kódujúci fosfoenolpyruvátkarboxykinázu, gén pgi kódujúci glukóza-6-fosfátizomerázu, gén poxB kódujúci pyruvátoxidázu.
16. Spôsob podía jedného alebo viacerých z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že sa používajú mikroorganizmy rodu Corynebacterium glutamicum.
17. Použitie polynukleotidových sekvencii podía nároku 1 ako primérov na prípravu DNA génov, ktoré kódujú génový produkt ptsH, polymerázovou reťazovou reakciou.
18. Použitie polynukleotidových sekvencii podía nároku 1 ako hybridizačných sond.