WO2023106351A1 - 芳香族化合物の製造方法 - Google Patents

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WO2023106351A1
WO2023106351A1 PCT/JP2022/045189 JP2022045189W WO2023106351A1 WO 2023106351 A1 WO2023106351 A1 WO 2023106351A1 JP 2022045189 W JP2022045189 W JP 2022045189W WO 2023106351 A1 WO2023106351 A1 WO 2023106351A1
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WO
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gene
amino acid
acid sequence
corynebacterium
seq
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PCT/JP2022/045189
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実郎 金田
史員 高橋
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花王株式会社
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    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing aromatic compounds using transformed cells having the ability to produce aromatic compounds, and the cells.
  • Non-Patent Document 1 aromatic amino acids
  • Non-Patent Document 2 4-hydroxybenzoic acid
  • Non-Patent Document 2 4-aminobenzoic acid
  • other aromatic compounds such as is available for production.
  • gallic acid has a strong reducing property, so it is used as a raw material for producing photographic developers and blue inks, and esters such as propyl gallate are used as antioxidants for oils and butters.
  • esters such as propyl gallate are used as antioxidants for oils and butters.
  • pyrogallol which is synthesized by decarboxylating gallic acid, is used as an electronic material, an organic synthesis reagent, a photographic developer, a mordant for woolen fabrics, etc. Therefore, efficient production of gallic acid is beneficial. .
  • the shikimate pathway is an important metabolic pathway for the biosynthesis of aromatic compounds by plants and microorganisms. That is, phosphoenolpyruvate produced in glycolysis combines with erythrose 4-phosphate supplied from the pentose phosphate pathway to form 3-deoxy-D-arabinopeptulosonic acid 7-phosphate (DAHP). , 3-dehydroquinic acid (DHQ) and 3-dehydroshikimic acid (DHS) to shikimic acid. Furthermore, shikimic acid undergoes transfer of the phosphate group from adenosine triphosphate to become 3-phosphoshikimic acid, and then to chorismic acid via 3-phosphoeno-lpyruvylshikimic acid.
  • DAHP 3-deoxy-D-arabinopeptulosonic acid 7-phosphate
  • DHQ 3-dehydroquinic acid
  • DHS 3-dehydroshikimic acid
  • shikimic acid undergoes transfer of the phosphate group from adenosine triphosphat
  • Patent Document 1 US Pat. No. 6,822,084
  • Non-Patent Document 1 Metab. Eng. 2018. 50:122-141.
  • Non-Patent Document 2 Metab. Eng. 2016. 38:322-330.
  • the present invention relates to the following.
  • a method for producing an aromatic compound or a salt thereof which comprises the step of culturing a transformed cell in which expression of a multiple transmembrane polypeptide shown in (A) or (B) below is enhanced.
  • A a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2
  • B a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 76% identity with the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2
  • 3-dehydroshikimic acid producing activity A transformed cell in which the expression of a multiple transmembrane polypeptide shown in (A) or (B) below is enhanced, wherein the host is a microbial cell with an improved transmembrane.
  • A a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • B a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 76% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • aroG and aroF are 2-dehydro-3-deoxyarabinoheptonate aldolase
  • aroB is 3-dehydroquinate synthase
  • aroD and qsuC are dehydroquinate dehydratase
  • qsuD is quinate/shikimate dehydrogenase.
  • aroE3 is shikimate dehydrogenase and hfm145 is 3,4-dihydroxybenzoate hydroxylase
  • qsuB is dehydroshikimate dehydratase
  • aroA is 5-enolate pyruvylshikimate-3-phosphate synthase
  • aroC is chorismate synthase
  • aroK is shikimate kinase. Analysis results by a cell transmembrane region prediction program.
  • the present invention relates to a method for producing an aromatic compound or a salt thereof using a transformed cell capable of producing an aromatic compound or a salt thereof, and to providing the transformed cell.
  • the present inventors have found that the productivity of aromatic compounds such as gallic acid is improved in transformed cells in which the expression of multiple transmembrane polypeptides belonging to the MFS family (major facilitator superfamily) is enhanced. It was found that an aromatic compound or a salt thereof can be efficiently produced by using.
  • the identity of amino acid sequences or nucleotide sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, genetic information processing software GENETYX Ver. 12 homology analysis (Search homology) program is used, unit size to compare (ktup) is set to 2, and analysis is performed.
  • GENETYX Ver. 12 homology analysis (Search homology) program is used, unit size to compare (ktup) is set to 2, and analysis is performed.
  • an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, added, or inserted means 1 or more and 10 or less, preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 It refers to an amino acid sequence in which 5 or less, more preferably 1 or more and 3 or less amino acids are deleted, substituted, added, or inserted.
  • a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted means 1 or more and 30 or less, preferably 1 or more and 24 or less, more preferably 1 or more and 15 It refers to a nucleotide sequence in which no more than 1, more preferably from 1 to 9 nucleotides have been deleted, substituted, added or inserted.
  • “addition" of amino acids or nucleotides includes addition of amino acids or nucleotides to one and both termini of a sequence.
  • control region in the present invention, "operably linked" between a control region and a gene means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region.
  • Procedures for "operably linking" genes and regulatory regions are well known to those of skill in the art.
  • the term "originally” used for cell functions, properties, and traits is used to indicate that the relevant functions, properties, and traits are present in the wild type of the cell.
  • the term “exogenous” is used to denote functions, properties, or traits that are introduced from outside rather than naturally present in the cell.
  • a "foreign" gene or polynucleotide is a gene or polynucleotide that has been exogenously introduced into the cell.
  • a foreign gene or polynucleotide may be derived from the same organism as the cell into which it is introduced, or from a heterologous organism (ie, a heterologous gene or polynucleotide).
  • the aromatic compound is an organic aromatic compound biosynthesized in the host cell, specifically an aromatic compound synthesized via the shikimic acid pathway, preferably 3-dehydroshikimic acid (DHS) and aromatic compounds derived from chorismate (Fig. 1). Specifically, protocatechuic acid, catechol, gallic acid, phenylalanine, L-DOPA, tyrosine, pretyrosine, tryptophan, 4-hydroxybenzoic acid, 4-aminobenzoic acid, 2,3-dihydroxybenzoic acid, 2,4- pyridinedicarboxylic acid, 2,5-pyridinedicarboxylic acid, 4-amino-3-hydroxybenzoic acid and the like.
  • DHS 3-dehydroshikimic acid
  • Fig. 1 aromatic compounds derived from chorismate
  • protocatechuic acid derived from DHS gallic acid derived from protocatechuic acid, 2,4-pyridinedicarboxylic acid (2,4-PDCA), 2,5-pyridinedicarboxylic acid (2,5-PDCA), Catechol, L-DOPA; 4-hydroxybenzoic acid, 4-aminobenzoic acid, 4-amino-3-hydroxybenzoic acid derived from chorismic acid, tyrosine, tryptophan, etc. are preferred, more preferably protocatechuic acid, protocatechuic acid They are derived aromatic compounds (preferably gallic acid, L-DOPA), 4-hydroxybenzoic acid, 4-amino-3-hydroxybenzoic acid, and more preferably gallic acid.
  • Examples of the salt of the aromatic compound include base addition salts and acid addition salts.
  • Examples of base addition salts include salts with alkali metals such as sodium and potassium, and salts with alkaline earth metals such as calcium and magnesium.
  • Examples of acid addition salts include hydrochlorides, sulfates, Mineral acid salts such as nitrates and phosphates are included.
  • a transformed cell is a cell in which expression of the multiple transmembrane polypeptide shown in (A) or (B) below is enhanced.
  • A a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • B a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 76% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; where
  • A SEQ ID NO: 2
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by refers to a membrane transport protein belonging to the MFS family derived from Corynebacterium glutamicum (referred to as "GALT0" in the present invention).
  • the identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is at least 76%, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% % or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more.
  • amino acid sequences having at least 76% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 include deletions, substitutions, additions, or Inserted amino acid sequences are included.
  • the polypeptides of (A) and (B) were confirmed to have multiple transmembrane helix structures by analysis using a cell transmembrane region prediction program, as shown in the reference examples described later.
  • Multiple transmembrane polypeptide As an example of the cell transmembrane region prediction program, TMHMM Server, v. 2.0 (Journal of Molecular Biology, 2001, 305: 567-580), DAS-TMfilter (Protein Eng., 2002, Volume 15, Issue 9: 745-752), PRED-TMR2 (Protein Eng., 1999, Volume e12, Issue8 : 631-634) and other analysis programs using prediction methods.
  • the productivity of aromatic compounds such as gallic acid and protocatechuic acid is increased in cells into which polynucleotides encoding the polypeptides (A) and (B) have been introduced so as to be able to express them. improves. Therefore, the multi-transmembrane polypeptide represented by (A) and (B) has a transporter activity (referred to as "aromatic compound transporter activity") involved in the transport of the aromatic compound or its salt. it is conceivable that.
  • Examples of the multiple transmembrane polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 76% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in (B) include the following polypeptides (B1) to (B3). be done.
  • (B1) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 90% or more, preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably Polypeptide consisting of an amino acid sequence having 99% or more identity
  • B2 The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or 90% or more, preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 95% or more, with the amino acid sequence A polypeptide consisting of an amino acid sequence having 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is a membrane transport protein derived from Corynebacterium crenatum, and is referred to as "GALT1" in the present invention.
  • the amino acid sequence identity between GALT1 and GALT0 is 98%.
  • a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is a membrane transport protein derived from Corynebacterium glutamicum, and is referred to as "GALT2" in the present invention.
  • the amino acid sequence identity between GALT2 and GALT0 is 90%.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is a membrane transport protein derived from Corynebacterium crudilactis, and is referred to as "GALT3" in the present invention.
  • the amino acid sequence identity between GALT3 and GALT0 is 85.4%.
  • a polypeptide derived from Corynebacterium callunae (DSM 20147) having an amino acid sequence identity of 75.5% with GALT0 ("GALT4"; Amino acid sequence: SEQ ID NO: 10, nucleotide sequence: SEQ ID NO: 9) are known.
  • Methods for introducing mutations such as deletion, substitution, addition, or insertion of amino acids into the amino acid sequence of the polypeptide include, for example, deletion, substitution, substitution, A method of introducing a mutation such as addition or insertion can be mentioned.
  • Techniques for introducing mutations into nucleotide sequences include, for example, chemical mutagens such as ethyl methanesulfonate, N-methyl-N-nitrosoguanidine and nitrous acid, or physical mutagens such as ultraviolet rays, X-rays, gamma rays and ion beams. mutagenesis, site-directed mutagenesis, the method described in Dieffenbach et al.
  • Techniques for site-directed mutagenesis include methods using Splicing overlap extension (SOE) PCR (Horton et al., Gene 77, 61-68, 1989), ODA method (Hashimoto-Gotoh et al., Gene, 152 , 271-276, 1995), Kunkel method (Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 488).
  • SOE Splicing overlap extension
  • site-directed mutagenesis such as Site-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km kit (Takara Bio Inc.), Transformer TM Site-Directed Mutagenesis kit (Clonetech), KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo) for Kits are also available.
  • transformed cells in which the expression of the polypeptide shown in (A) or (B) above is enhanced include cells in which the expression level of the polypeptide is increased, as well as activity of the polypeptide (aromatic Cells with enhanced compound transporter activity) are included.
  • the transformed cell is a cell into which a polynucleotide necessary for expression of the polypeptide has been introduced so that it can be expressed, and even if the polypeptide is foreign, the cell is originally It may be what you have. Examples thereof include cells into which the polynucleotide has been introduced so that it can be expressed, and cells into which the degree of expression of the polynucleotide has been enhanced.
  • the polynucleotide includes a polynucleotide encoding the multiple transmembrane polypeptide shown in (A) or (B) above, preferably the polynucleotide of (a) or (b) below (These polynucleotides are also referred to as "polynucleotides of the invention").
  • polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 refers to the gene (cg3038) encoding the multiple transmembrane polypeptide GALT0 described above.
  • the identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is at least 76%, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% % or more, more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more.
  • nucleotide sequences having at least 76% identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 include deletions, substitutions, additions, or An inserted nucleotide sequence is included. Methods for introducing mutations such as deletion, substitution, addition, or insertion of nucleotides into the nucleotide sequence are as described above.
  • the polynucleotide may be in single- or double-stranded form, and may be DNA or RNA.
  • the DNA may be cDNA, artificial DNA such as chemically synthesized DNA.
  • Examples of (b) polynucleotides consisting of a nucleotide sequence having at least 76% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 include the following polynucleotides (b1) to (b3).
  • (b1) the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 90% or more, preferably 92% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably Polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having 99% or more identity
  • Polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more identity the nucleotide
  • polynucleotide consisting of the nucleotide acid sequence shown by SEQ ID NO: 3 is the polynucleotide encoding GALT1
  • polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 5 is the polynucleotide encoding GALT2.
  • a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 is a polynucleotide encoding the GALT3.
  • the above polynucleotide may be incorporated into a vector.
  • the vector containing the polynucleotide of the invention is an expression vector.
  • the vector is an expression vector capable of introducing the polynucleotide of the present invention into a host microorganism and expressing the polynucleotide within the host microorganism.
  • the vector comprises a polynucleotide of the invention and a control region operably linked thereto.
  • the vector may be a vector capable of autonomous replication and replication outside the chromosome, such as a plasmid, or a vector that is integrated into the chromosome.
  • Examples of specific vectors include pUC-based vectors such as pBluescript II SK (-) (Stratagene), pUC18/19, pUC118/119 (Takara Bio), pET-based vectors (Takara Bio), pGEX-based vectors ( GE Healthcare), pCold-based vector (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), pUB110 (Mckenzie, T.
  • pUC-based vectors such as pBluescript II SK (-) (Stratagene), pUC18/19, pUC118/119 (Takara Bio), pET-based vectors (Takara Bio), pGEX-based vectors ( GE Healthcare), pCold-based vector (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), pUB110 (Mckenzie, T.
  • the polynucleotide may be constructed as a DNA fragment containing it.
  • the DNA fragments include, for example, PCR-amplified DNA fragments and restriction enzyme-cleaved DNA fragments.
  • the DNA fragment may be an expression cassette comprising the polynucleotide of the invention and a control region operably linked thereto.
  • control region contained in the above vector or DNA fragment is a sequence for expressing the polynucleotide of the present invention in a host cell into which the vector or DNA fragment has been introduced.
  • a starting point and the like can be mentioned.
  • the type of control region can be appropriately selected according to the type of host microorganism into which the vector or DNA fragment is introduced. If necessary, the vector or DNA fragment may further have a selectable marker such as an antibiotic resistance gene, an amino acid synthesis-related gene, and the like.
  • Transformed cells into which the vector or DNA fragment of interest has been introduced can be selected using a selection marker.
  • a selection marker is an antibiotic resistance gene
  • cells into which the desired vector or DNA fragment has been introduced can be selected by culturing in the antibiotic-supplemented medium.
  • the selectable marker is a gene associated with amino acid synthesis
  • after the gene is introduced into a host cell that is auxotrophic for the amino acid cells into which the target vector or DNA fragment has been introduced are selected based on the presence or absence of the amino acid auxotrophy as an index. can do.
  • introduction of the desired vector or DNA fragment can be confirmed by examining the DNA sequence of transformed cells by PCR or the like.
  • the strong regulatory region examples include T7 promoter, lac promoter, tac promoter, trp promoter, tu promoter, gap promoter, etc., which are known high expression promoters, but are not particularly limited thereto.
  • an inducible promoter derived from prokaryotes can be used, and the vanA (cg2616) promoter is induced by the addition of ferulic acid, vanillic acid or vanillin, and by the addition of resorcinol or 2,4-dihydroxybenzoic acid.
  • rhcH promoter that is induced
  • pcaI promoter that is induced by the addition of 4-hydroxybenzoic acid
  • nagI cg3351 gene promoter that is induced by the addition of 3-hydroxybenzoic acid
  • benA cg2637
  • benzoic acid benzoic acid gene promoter
  • Pben the promoter of the cg2118 gene or the promoter of the ptsS (cg2925) gene, which are induced by the addition of either fructose or sucrose, but are not particularly limited thereto.
  • a DNA fragment containing the polynucleotide sequence of the strong control region and the selectable marker is introduced into the host cell, followed by homologous recombination or Examples thereof include a method of selecting transformed cells by non-homologous recombination or the like.
  • the host cells may be cells suitable for producing aromatic compounds or salts thereof, and may be any of microbial cells, plant cells and animal cells, preferably microbial cells. From the viewpoint of production efficiency of aromatic compounds or salts thereof, especially protocatechuic acid, gallic acid, shikimic acid, 2,4-pyridinedicarboxylic acid, 2,5-pyridinedicarboxylic acid, catechol, L-DOPA, chorismic acid, 4-hydroxy In terms of production efficiency of aromatic compounds derived from 3-dehydroshikimic acid such as benzoic acid, 4-aminobenzoic acid, and 4-amino-3-hydroxybenzoic acid, or salts thereof, host cells are capable of producing 3-dehydroshikimic acid. It is more preferable to use microbial cells with improved production activity.
  • microbial cells examples include Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes, Pseudomonas bacteria, Streptococcus bacteria, Lactobacillus bacteria, fungi (Neurospora, Aspergillus, Trichoderma, etc.), yeasts (Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Yarrowia, Trichosporon, Rhodosporidium, Pichia, Candida, etc.) may be used. , Actinomycetes are more preferred.
  • coryneform bacteria As the actinomycete, a group of microorganisms defined as coryneform bacteria (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599 (1974)) is preferable, specifically, the genus Corynebacterium and the genus Brevibacterium. bacteria, Arthrobacter, Mycobacterium, Rhodococcus, Streptomyces, Micrococcus, and the like.
  • Brevibacterium ammoniagenes etc. are mentioned as a Brevibacterium genus microbe.
  • Arthrobacter globiformis includes Arthrobacter globiformis.
  • Mycobacterium genus includes Mycobacterium bovis and the like, and Micrococcus genus includes Micrococcus freudenreichii, Micrococcus leuteus, Micrococcus ureae, Micrococcus Coccus roseus (Micrococcus roseus) etc. are mentioned.
  • the coryneform bacteria the genus Corynebacterium is preferred, and Corynebacterium glutamicum is more preferred.
  • the above microbial cells may be wild strains, mutant strains thereof, or artificial genetically modified strains thereof.
  • Examples of microbial cells with improved 3-dehydroshikimic acid-producing activity include microbial cells in which genes necessary for producing 3-dehydroshikimic acid are enhanced.
  • the following (i), ( ii), (iii) and (iv) genetically engineered microbial cells preferably any one of (i), (ii), (iii) and (iv) Two or more, more preferably three or more, and more preferably all of (i), (ii), (iii), and (iv) are genetically engineered microbial cells.
  • gene enhancement includes introduction of a predetermined gene in an expressible state, introduction of a mutation into a predetermined gene or the control region of the gene, and the like.
  • Enhanced expression of the multiple transmembrane-spanning polypeptide represented by (A) or (B) in the produced transformant is due to, for example, that the transformant has a host cell (parent cell) It can be confirmed by the fact that the amount of transcription of the gene encoding the polypeptide is improved as compared with .
  • the amount of gene transcription can be measured by mRNA amount measurement by quantitative PCR, RNA-Seq analysis using a next-generation sequencer, DNA microarray analysis, or the like. Then, by culturing the produced transformed cells, evaluating the productivity of aromatic compounds or salts thereof, and selecting suitable transformed cells, obtaining useful aromatic compound or salt-producing cells. can be done.
  • the product can be measured according to the method described in Reference Examples below.
  • the method for producing an aromatic compound or a salt thereof of the present invention is carried out by culturing the above-described transformed cells, preferably in the presence of sugars, and recovering the desired aromatic compound or salt thereof.
  • Glucose is preferred as the sugar, but monosaccharides such as fructose, mannose, arabinose, xylose and galactose, as well as sugars capable of producing glucose by metabolism can also be used.
  • Such sugars include oligosaccharides or polysaccharides having glucose units, disaccharides such as cellobiose, sucrose, lactose, maltose, trehalose, cellobiose, xylobiose; polysaccharides such as dextrin or soluble starch; is mentioned.
  • Molasses can also be used, for example, as a raw material containing these raw material compounds.
  • Inedible agricultural waste such as straw (rice straw, barley straw, wheat straw, rye straw, oat straw, etc.), bagasse and corn stover, energy crops such as switchgrass, napier grass and miscanthus, and wood waste
  • a saccharified solution containing a plurality of sugars such as glucose, which is obtained by saccharifying waste paper or the like with a saccharifying enzyme or the like, can also be used.
  • the medium for culturing the transformed cells contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc., and can be either a natural medium or a synthetic medium as long as it is a medium capable of efficiently culturing the transformed cells of the present invention. may be used.
  • the carbon source the above sugars or molasses or saccharified solutions containing them are used.
  • sugar alcohols such as mannitol, sorbitol, xylitol and glycerin; , maleic acid, and gluconic acid; alcohols, such as ethanol and propanol; and hydrocarbons, such as normal paraffin.
  • a carbon source can be used individually by 1 type or in mixture of 2 or more types.
  • the concentration of the saccharide, which is the raw material compound, in the culture medium is preferably 1 to 20 w/v%, more preferably 2 to 10 w/v%, and even more preferably 2 to 5 w/v%.
  • Nitrogen sources include, for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean meal alkaline extract, alkylamines such as methylamine, nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, ammonia or its salts (ammonium chloride, Inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium sulfate, ammonium nitrate and ammonium acetate), urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, potassium nitrate and the like can be used.
  • alkylamines such as methylamine
  • nitrogen-containing organic compounds such as amino acids, ammonia or its salts (ammonium chloride, Inorganic or organic ammonium compounds such as ammonium sulfate, ammonium nitrate and ammonium acetate), urea, aqueous ammonia, sodium nitrate, potassium nitrate and the like can be used.
  • inorganic salts include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous nitrate, manganese sulfate, zinc sulfate, cobalt sulfate, and calcium carbonate.
  • vitamins, antifoaming agents, etc. can be added as needed.
  • vitamins include biotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, and nicotinic acid.
  • the transformants Prior to the reaction or culture containing sugars, it is preferable to grow the transformants by culturing them in the same medium under aerobic conditions at a temperature of about 25-38°C for about 12-48 hours.
  • the culture temperature or reaction temperature is preferably 15 to 45°C, more preferably 25 to 37°C.
  • the culture or reaction time is 24 hours to 168 hours, preferably 24 hours to 96 hours, more preferably 24 hours to 72 hours, and can be performed with stirring or shaking as necessary.
  • antibiotics such as ampicillin and kanamycin may be added to the medium during the culture, if necessary.
  • Cultivation may be of batch type, fed-batch type, or continuous type. Among them, a batch system is preferable. Cultivation or reaction may be carried out under aerobic conditions or reducing conditions, but is preferably carried out under aerobic conditions.
  • the reaction or culture When the reaction or culture is carried out under aerobic conditions, it is preferable to carry out under conditions that suppress excessive growth of the transformant from the viewpoint of the production efficiency of aromatic compounds or salts thereof.
  • the aromatic compound is susceptible to oxidation, the culture is preferably carried out under conditions of low dissolved oxygen concentration.
  • the dissolved oxygen concentration is preferably 0.1 to 3 ppm, more preferably 0.1 to 1 ppm.
  • the method of collecting and purifying the aromatic compound or its salt from the culture is not particularly limited. That is, it can be carried out by combining well-known ion exchange resin method, precipitation method, crystallization method, recrystallization method, concentration method and other methods. For example, after the cells are removed by centrifugation or the like, ionic substances are removed with a cation and anion exchange resin, and the mixture is concentrated to obtain an aromatic compound or a salt thereof. Aromatic compounds or salts thereof accumulated in the culture may be used as they are without isolation.
  • a method for producing an aromatic compound or a salt thereof comprising the step of culturing a transformed cell in which expression of a multiple transmembrane polypeptide shown in (A) or (B) below is enhanced.
  • (B1) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence (B2) The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6 or 90% or more with the amino acid sequence Polypeptide consisting of an amino acid sequence having identity (B3) A polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence having 90% or more identity with said amino acid sequence ⁇ 3>
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence having 90% or more identity with said amino acid sequence ⁇ 3> Above (A) or (B ) in an expressible state, the method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>.
  • ⁇ 4> The method according to ⁇ 3>, wherein the polynucleotide encoding the multiple transmembrane polypeptide shown in (A) or (B) is a polynucleotide shown in (a) or (b) below. .
  • polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (b) a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 76% identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1; ⁇ 5> (b)
  • the polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 76% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a polynucleotide shown in (b1) to (b3) below, ⁇ 4> The method described in .
  • (b1) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 3 or a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence (b2) The nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 5 or 90% or more with the nucleotide sequence Polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having identity (b3) Polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 or a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence ⁇ 6> Culturing in the presence of sugars The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>.
  • ⁇ 7> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 6>, wherein the host of the transformed cell is a microbial cell with improved 3-dehydroshikimic acid-producing activity.
  • the microbial cell with improved 3-dehydroshikimic acid-producing activity is a cell genetically engineered with one or more of the following (i), (ii), (iii) and (iv): The method according to ⁇ 7>.
  • the microbial cell with improved 3-dehydroshikimic acid-producing activity is a microbial cell genetically engineered with any two or more of (i), (ii), (iii), and (iv). , ⁇ 8>.
  • the microbial cell with improved 3-dehydroshikimic acid-producing activity is a microbial cell genetically engineered with any three or more of (i), (ii), (iii), and (iv). , ⁇ 8>.
  • the microbial cell with improved 3-dehydroshikimic acid-producing activity is the microbial cell genetically engineered in (i), (ii), (iii), and (iv), according to ⁇ 8>.
  • the method of. ⁇ 12> The method according to any one of ⁇ 7> to ⁇ 11>, wherein the microbial cell is a coryneform bacterium.
  • the coryneform bacterium belongs to the genus Corynebacterium.
  • Corynebacterium bacteria are Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerance, Corynebacterium alkanolyticum, Corynebacterium clenatum, Corynebacterium cruzilactis or Corynebacterium
  • ⁇ 16> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 15>, wherein the aromatic compound or its salt is derived from 3-dehydroshikimic acid or its salt.
  • the aromatic compound or its salt is gallic acid, protocatechuic acid, catechol, L-DOPA, 2,4-pyridinedicarboxylic acid, 2,5-pyridinedicarboxylic acid, 4-hydroxybenzoic acid, 4-aminobenzoic acid,
  • the method according to ⁇ 16> which is 4-amino-3-hydroxybenzoic acid or a salt thereof.
  • A A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2
  • B A polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 76% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 ⁇ 21> 3-dehydroshikimic acid production
  • the transformed cell according to ⁇ 20>, wherein the microbial cell with improved activity is a cell genetically engineered by any one or more of the following (i), (ii), (iii) and (iv): .
  • the microbial cell with improved 3-dehydroshikimic acid-producing activity is a microbial cell genetically engineered with any two or more of (i), (ii), (iii), and (iv). , the transformed cell according to ⁇ 21>.
  • the microbial cell with improved 3-dehydroshikimic acid-producing activity is a microbial cell genetically engineered with any three or more of (i), (ii), (iii), and (iv). , the transformed cell according to ⁇ 21>.
  • ⁇ 24> The description of ⁇ 21>, wherein the microbial cell with improved 3-dehydroshikimic acid-producing activity is a microbial cell genetically engineered in (i), (ii), (iii), and (iv). transformed cells.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 76% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 of (B) is a polypeptide shown in (B1) to (B3) below.
  • the transformed cell according to any one of ⁇ 20> to ⁇ 24>.
  • (B1) A polypeptide consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence (B2) The amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 6 or 90% or more with the amino acid sequence Polypeptide consisting of an amino acid sequence having identity (B3) A polypeptide consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence having 90% or more identity with said amino acid sequence ⁇ 26> Above (A) or (B ) in a state capable of expressing a polynucleotide encoding the multi-transmembrane polypeptide shown in ⁇ 20> to ⁇ 25>.
  • polynucleotide encoding the multiple transmembrane polypeptide shown in (A) or (B) above is a polynucleotide shown in (a) or (b) below, according to ⁇ 26> transformed cells.
  • polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 (b) a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 76% identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO:1; ⁇ 28> (b)
  • the polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having at least 76% identity with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a polynucleotide shown in (b1) to (b3) below, ⁇ 27> A transformed cell as described in .
  • (b1) A polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 3 or a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence (b2) The nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 5 or 90% or more with the nucleotide sequence Polynucleotide consisting of a nucleotide sequence having identity (b3) A polynucleotide consisting of a nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 or a nucleotide sequence having 90% or more identity with said nucleotide sequence ⁇ 29>
  • the microbial cell is a coryneform bacterium The transformed cell according to any one of ⁇ 20> to ⁇ 28>.
  • Corynebacterium bacteria are Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerance, Corynebacterium alkanolyticum, Corynebacterium clenatum, Corynebacterium cruzilactis or Corynebacterium
  • ⁇ 32> The transformed cell of ⁇ 31>, wherein the Corynebacterium bacterium is Corynebacterium glutamicum.
  • gallic acid (sometimes referred to as GAL)-producing bacteria 1) Construction of a plasmid for replacing the cg0620 gene region with a polypeptide gene having 3,4-dihydroxybenzoic acid hydroxylase activity
  • the base number shown is the base number of the genome sequence of the ATCC13032 strain, and the genome sequence information was obtained from the NCBI GB database as accession number NC_006958.
  • PrimeSTAR Max DNA Polymerase (TaKaRa) was used as an enzyme for PCR.
  • genomic DNA was used as a template and amplified with primers OT23 and OT24 to obtain a DNA fragment on the 3' side of the cg0620 gene region.
  • a DNA fragment (OT25) containing the promoter (hereinafter referred to as tu promoter) of the tuf gene (cg0587) of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain was produced by artificial gene synthesis.
  • DNA fragment of the promoter region was amplified with primers OT26 and OT27 to obtain a DNA fragment of the promoter region.
  • two types of DNA fragments SEQ ID NOS: 11 and 12
  • hfm145VF polypeptide gene having 3,4-dihydroxybenzoate hydroxylase activity
  • Each DNA fragment was used as a template and amplified with two kinds of DNA primers (OT30 and OT31 and OT32 and OT33) to obtain two kinds of DNA fragments.
  • pHKPsacB1 as a template, a vector fragment was amplified with primers OT34 and OT35.
  • the resulting PCR product was treated with DpnI (Takara Bio).
  • each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio) and ligated with the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) to create the plasmid pHKPsacB_cg0620- Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt was produced.
  • ECOS Competent E. Coli DH5 ⁇ strain (Nippon Gene) was transformed, and the cell solution was spread on an LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C.
  • a transformant having the plasmid was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C.
  • a plasmid was purified from this culture using NucleoSpin Plasmid EasyPure (TaKaRa) to obtain pHKPsacB_cg0620-Ptu-hfm145VF-hfm145VFopt.
  • KC148sr strain was obtained by introducing the strain into the spp. and selecting for kanamycin resistance.
  • the KC148sr strain was analyzed by the PCR method (Sapphire Amp (Takara Bio)) using primers OT20 and OT36, the expected results were obtained. It was confirmed to be a single-crossover homologous recombinant introduced into the gene region.
  • the KC148sr strain was cultured in 1 mL of LB liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride) for 24 hours, and a portion of the culture was spread on 20% sucrose-containing LB agar medium.
  • KC148 strain was obtained by culturing.
  • the KC148 strain is a double-crossover homologous recombinant in which the Ptu-hfm145VF-hfm145VFop gene has been introduced into the cg0620 gene region as expected. It was confirmed.
  • lactate dehydrogenase gene (hereinafter sometimes referred to as ldh gene) disrupted strain 1) Production of plasmid for disrupting ldh (cg3219) gene PrimeSTAR Max DNA Polymerase (TaKaRa) was used as an enzyme for PCR. .
  • pHKPsacB1 (described in Japanese Patent No. 6322576) as a template, the vector fragment was amplified with primers pHKPsacB-F2 and pHKPsacB-R2.
  • a DNA fragment on the 5' side of the cg3219 gene amplified with primers 3219-up-F and 3219-up-R using the genomic DNA of the ATCC 13032 strain ( NBRC 12168 strain) as a template, and the genomic DNA as the template with the primer 3219- A DNA fragment on the 3' side of the cg3219 gene amplified by down-F and 3219-down-R was obtained.
  • the resulting PCR product was treated with DpnI (Takara Bio).
  • each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio), and then ligated with In-Fusion HD cloning kit (Clontech) to obtain pHKBsacB- ⁇ ldh. was made.
  • ECOS Competent E. coli strain DH5 ⁇ (Nippon Gene) was transformed, and the cell solution was spread on an LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C.
  • colony PCR was performed using Sapphire Amp (TaKaRa) as an enzyme.
  • a transformant having a plasmid in which gene transfer was confirmed was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C.
  • a plasmid was purified from this culture using NucleoSpin Plasmid EasyPure (TaKaRa) to obtain pHKBsacB- ⁇ ldh.
  • KC148 ⁇ ldh-sr was cultured in 1 mL of LB liquid medium for 24 hours, and a portion of the culture was smear cultured on 20% sucrose-containing LB agar medium to obtain KC148 ⁇ ldh strain.
  • Colony PCR (Sapphire Amp) using primers 3219-coloP-F and 3219-coloP-R confirmed that the ldh gene (cg3219) was deleted by double-crossover homologous recombination. In addition, deletion of kanamycin resistance gene and sacB gene was confirmed.
  • colony PCR was performed using Sapphire Amp (TaKaRa) as an enzyme.
  • ocJK105 and ocJK106 as primers, introduction of the target DNA fragment was confirmed.
  • a transformant having a plasmid in which gene transfer was confirmed was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C.
  • a plasmid was purified from this culture using NucleoSpin Plasmid EasyPure (TaKaRa) to obtain pHKBsacB- ⁇ ldh::GALT0.
  • KC148 ⁇ ldh::GALT0-sr was cultured in 1 mL of LB liquid medium for 24 hours, and a portion of the culture was smear cultured on 20% sucrose-containing LB agar medium to obtain strain KC148 ⁇ ldh::GALT0. Knock-in of the GALT0 gene into the cg3219 locus was confirmed by colony PCR (Sapphire Amp) using primers ocJK107 and ocJK110. In addition, deletion of kanamycin resistance gene and sacB gene was confirmed.
  • a DNA fragment containing the ORF region of the GALT3 gene (SEQ ID NO: 7) amplified with primers ocJKT87 and ocJKT88 was obtained using, as a template, a DNA fragment represented by SEQ ID NO: GALT3_nuc that was artificially synthesized by Eurofins Genomics.
  • GALT3_nuc a DNA fragment represented by SEQ ID NO: GALT3_nuc that was artificially synthesized by Eurofins Genomics.
  • the ORF of the GALT3 gene is ligated downstream of the plasmid region upstream of the ldh gene.
  • ECOS Competent E. coli strain DH5 ⁇ (Nippon Gene) was transformed, and the cell solution was spread on an LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C.
  • colony PCR was performed using Sapphire Amp (TaKaRa) as an enzyme.
  • ocJK105 and ocJK106 as primers, introduction of the target DNA fragment was confirmed.
  • a transformant having a plasmid in which gene transfer was confirmed was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C.
  • a plasmid was purified from this culture using NucleoSpin Plasmid EasyPure (TaKaRa) to obtain pHKBsacB- ⁇ ldh::GALT3.
  • TaKaRa NucleoSpin Plasmid EasyPure
  • KC148 was transformed by electroporation (Bio-rad).
  • KC148 ⁇ ldh::GALT3-sr was obtained by selecting for kanamycin resistance.
  • PCR (Sapphire Amp) was performed using primers ocJK107 and ocJK98, and the expected results were obtained. It was confirmed that it was introduced into the cg3219 gene region by replacement.
  • KC148 ⁇ ldh::GALT3-sr was cultured in 1 mL of LB liquid medium for 24 hours, and a portion of the culture was smear cultured on 20% sucrose-containing LB agar medium to obtain KC148 ⁇ ldh::GALT3 strain.
  • Knock-in of the GALT3 gene into the cg3219 locus was confirmed by colony PCR (Sapphire Amp) using primers ocJK107 and ocJK110. In addition, deletion of kanamycin resistance gene and sacB gene was confirmed.
  • the KC148 ⁇ ldh strain, KC148 ⁇ ldh::GALT0 strain, and KC148 ⁇ ldh::GALT3 strain were streaked on an LB plate and cultured at 30° C. for 3 days.
  • the cells grown on the plate were inoculated into a round-bottom spitz (Eiken Chemical Co., Ltd.) filled with 4 mL of LB medium, and subjected to shaking culture (preculture) at 30° C. and 200 rpm for 24 hours.
  • Sodium benzoate was added to the CGXII medium shown in Table 2 to a final concentration of 1 mM, and Bio Jr. 8 (ABLE Co., Ltd.) was charged with 100 mL.
  • the concentration of gallic acid increased 2.7 times and the concentration of protocatechuic acid increased 3.1 times, confirming the productivity-enhancing effect of aromatic compounds.

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Abstract

芳香族化合物又はその塩を生産可能な形質転換細胞を用いて芳香族化合物又はその塩を製造する方法、及びこの形質転換細胞を提供する。　下記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドの発現が強化された形質転換細胞を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド　（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド

Description

芳香族化合物の製造方法
　本発明は、芳香族化合物生産能を有する形質転換細胞を用いた芳香族化合物の製造方法及び当該細胞に関する。
　近年、安価な原料であるグルコースから、微生物を用いて没食子酸を始め、有用な芳香族化合物を生産することが所望されている。中でも、コリネ型細菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）は各種アミノ酸や核酸生産に利用されてきた有用工業微生物であり、近年、コリネ型細菌を対象にした遺伝子組換え技術が確立されたこともあり、チロシンやトリプトファンのような芳香族アミノ酸（非特許文献１）や没食子酸、４－ヒドロキシ安息香酸（非特許文献１）、４－アミノ安息香酸（非特許文献２）等の芳香族化合物等、多様な有機化合物が生産可能となっている。中でも、没食子酸は、還元性が強いことから、写真の現像剤や青インクの製造原料等に使用され、また、没食子酸プロピル等のエステルは、油脂やバターの酸化防止剤として使用されている。さらに、没食子酸を脱炭酸して合成されるピロガロールは、電子材料、有機合成試薬、写真の現像液、毛織物の媒染剤等として使用されることから、没食子酸を効率よく生産させることは有益である。
　シキミ酸経路は、植物や微生物が芳香族化合物を生合成する重要な代謝経路である。すなわち、解糖系で作られるホスホエノールピルビン酸がペントースリン酸経路から供給されるエリスロース４－リン酸と結合して３－デオキシ－Ｄ－アラビノペプツロソン酸７－リン酸（ＤＡＨＰ）となり、３－デヒドロキナ酸（ＤＨＱ）、３－デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）を経てシキミ酸となる。さらに、シキミ酸はアデノシン３リン酸からリン酸基が転移して、３－ホスホシキミ酸となり、３－ホスホエノ－ルピルビルシキミ酸を経てコリスミ酸となる。シキミ酸経路では炭素６員環が形成された後、二重結合の形成が行われ、ＤＨＳから誘導されるプロトカテク酸からは、没食子酸、２，４－ピリジンジカルボン酸（２，４－ＰＤＣＡ）、２，５－ピリジンジカルボン酸（２，５－ＰＤＣＡ）、カテコール、Ｌ－ＤＯＰＡ等の芳香族化合物が生産される（図１）。
　一方、ＭＦＳファミリー（ｍａｊｏｒ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属する複数回膜貫通型ポリペプチドにストレス抵抗及び耐性に関与するタンパク質が含まれていることが報告されている（特許文献１）が、これらのタンパク質が芳香族化合物の生産性を向上させることは知られていない。
　　〔特許文献１〕米国特許第６，８２２，０８４号明細書
　　〔非特許文献１〕Metab. Eng. 2018. 50:122-141.
　　〔非特許文献２〕Metab. Eng. 2016. 38:322-330.
　本発明は、以下に係るものである。
　１）下記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドの発現が強化された形質転換細胞を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。
　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
　（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　２）３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞を宿主とする、下記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドの発現が強化された形質転換細胞。
　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
　（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
宿主としてコリネ型細菌を用いた場合の各種芳香族化合物の生産経路を示す模式図。図中、ａｒｏＧ及びａｒｏＦは２－デヒドロ－３－デオキシアラビノヘプトン酸アルドラーゼであり、ａｒｏＢは３－デヒドロキナ酸シンターゼであり、ａｒｏＤ及びｑｓｕＣはデヒドロキナ酸デヒドラターゼであり、ｑｓｕＤはキナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼであり、ａｒｏＥ３はシキミ酸デヒドロゲナーゼであり及びｈｆｍ１４５は３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼであり、ｑｓｕＢはデヒドロシキミ酸デヒドラターゼであり、ａｒｏＡは５－エノール酸ピルビルシキミ酸－３－リン酸シンターゼであり、ａｒｏＣはコリスミ酸シンターゼであり、そしてａｒｏＫはシキミ酸キナーゼである。 細胞膜貫通領域予測プログラムによる解析結果。
発明の詳細な説明
　本発明は、芳香族化合物又はその塩を生産可能な形質転換細胞を用いて芳香族化合物又はその塩を製造する方法、及び当該形質転換細胞を提供することに関する。
　本発明者らは、ＭＦＳファミリー（ｍａｊｏｒ　ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）に属する複数回膜貫通型ポリペプチドの発現が強化された形質転換細胞において、没食子酸を始めとする芳香族化合物の生産性が向上し、これを用いることにより芳香族化合物又はその塩を効率よく製造できることを見出した。
　本発明によれば、環境負荷の少ない発酵法によって、プロトカテク酸、没食子酸、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、カテコール、Ｌ－ＤＯＰＡ、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸のような芳香族化合物又はその塩を効率よく製造することが可能になる。
　本発明において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本発明において、「１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列」とは、１個以上１０個以下、好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列をいう。また、「１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列」とは、１個以上３０個以下、好ましくは１個以上２４個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらにより好ましくは１個以上９個以下のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列をいう。本発明において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端へのアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
　本発明において、制御領域と遺伝子との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本発明において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞の野生型に存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
　本発明において、芳香族化合物とは、宿主細胞内で生合成される有機芳香族化合物であり、具体的にはシキミ酸経路を介して合成される芳香族化合物、好ましくは、３－デヒドロシキミ酸（ＤＨＳ）やコリスミ酸から誘導される芳香族化合物を指す（図１）。
　具体的には、プロトカテク酸、カテコール、没食子酸、フェニルアラニン、Ｌ－ＤＯＰＡ、チロシン、プレチロシン、トリプトファン、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、２，３－ジヒドロキシ安息香酸、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、４－アミノ３－ヒドロキシ安息香酸等が挙げられる。
　このうち、ＤＨＳから誘導されるプロトカテク酸；プロトカテク酸から誘導される没食子酸、２，４－ピリジンジカルボン酸（２，４－ＰＤＣＡ）、２，５－ピリジンジカルボン酸（２，５－ＰＤＣＡ）、カテコール、Ｌ－ＤＯＰＡ；コリスミ酸から誘導される４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、４－アミノ３－ヒドロキシ安息香酸、チロシン、トリプトファン等が好ましく、より好ましくは、プロトカテク酸、プロトカテク酸から誘導される芳香族化合物（好ましくは、没食子酸、Ｌ－ＤＯＰＡ）、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ３－ヒドロキシ安息香酸であり、より好ましくは没食子酸である。
　当該芳香族化合物の塩としては、塩基付加塩、酸付加塩等を挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属との塩等が挙げられ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の鉱酸塩等が挙げられる。
　本発明において、形質転換細胞は、下記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドの発現が強化された細胞である。
　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
　（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　ここで、（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム　グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）由来の、ＭＦＳファミリーに属する膜輸送タンパク質（本発明においては、「ＧＡＬＴ０」と称する）を指す。
　（Ｂ）のポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列との同一性は、少なくとも７６％、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である。
　配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列の例としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列が挙げられる。
　（Ａ）及び（Ｂ）のポリペプチドは、後述する参考例に示すように、細胞膜貫通領域予測プログラムを用いた解析により複数個の膜貫通へリックス構造を有することが確認され、「複数回膜貫通型ポリペプチド（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」であると推定できる。ここで、細胞膜貫通領域予測プログラムの例としては、ＴＭＨＭＭ　Ｓｅｒｖｅｒ，ｖ．２．０（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，３０５：５６７－５８０）、ＤＡＳ－ＴＭｆｉｌｔｅｒ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．，２００２，Ｖｏｌｕｍｅ１５，Ｉｓｓｕｅ９：７４５－７５２）、ＰＲＥＤ－ＴＭＲ２（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ．，１９９９，Ｖｏｌｕｍｅ１２，Ｉｓｓｕｅ８：６３１－６３４）等の予測メソッドを用いた解析プログラムが挙げられる。
　後述する実施例に示すように（Ａ）及び（Ｂ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能なように導入された細胞において、没食子酸、プロトカテク酸のような芳香族化合物の生産性が向上する。よって、（Ａ）及び（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドは、当該芳香族化合物又はその塩の輸送に関わるトランスポーター活性（「芳香族化合物トランスポーター活性」と称する）を有するものと考えられる。
　（Ｂ）の配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなる複数回膜貫通型ポリペプチドとしては、例えば以下の（Ｂ１）～（Ｂ３）のポリペプチドが挙げられる。
　（Ｂ１）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　（Ｂ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　（Ｂ３）配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　ここで、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム　クレナタム（Corynebacterium crenatum）由来の膜輸送タンパク質であり、本発明においては「ＧＡＬＴ１」と称する。ＧＡＬＴ１とＧＡＬＴ０のアミノ酸配列の同一性は９８％である。
　配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム　グルタミカム由来の膜輸送タンパク質であり、本発明においては「ＧＡＬＴ２」と称する。ＧＡＬＴ２とＧＡＬＴ０のアミノ酸配列の同一性は９０％である。
　配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、コリネバクテリウム　クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）由来の膜輸送タンパク質であり、本発明においては「ＧＡＬＴ３」と称する。ＧＡＬＴ３とＧＡＬＴ０のアミノ酸配列の同一性は８５．４％である。
　なお、ＭＦＳファミリーに属する膜輸送タンパク質としては、この他に、ＧＡＬＴ０とのアミノ酸配列の同一性が７５．５％であるコリネバクテリウム　カルナエ（Corynebacterium callunae DSM 20147）由来のポリペプチド（「ＧＡＬＴ４」；アミノ酸配列：配列番号１０、ヌクレオチド配列：配列番号９）が知られている。
　上記ポリペプチドのアミノ酸配列に対してアミノ酸の欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法としては、例えば、該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対してヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法が挙げられる。ヌクレオチド配列への変異導入の手法としては、例えば、エチルメタンスルホネート、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸等の化学的変異原又は紫外線、Ｘ線、ガンマ線、イオンビーム等の物理的変異原による突然変異誘発、部位特異的変異導入法、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，５８１－６２１，１９９５）に記載の方法、等が挙げられる。部位特異的変異導入の手法としては、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　７７，６１－６８，１９８９）を利用した方法、ＯＤＡ法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５２，２７１－２７６，１９９５）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，４８８）等が挙げられる。あるいは、Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｍｕｔａｎ－ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍキット（タカラバイオ社）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販の部位特異的変異導入用キットを利用することもできる。
　本発明において、上記（Ａ）又は（Ｂ）で示されるポリペプチドの発現が強化された形質転換細胞には、当該ポリペプチドの発現量が増加した細胞の他、当該ポリペプチドの活性（芳香族化合物トランスポーター活性）が増強した細胞が包含される。当該形質転換細胞は具体的には、当該ポリペプチドの発現に必要なポリヌクレオチドが発現可能なように導入された細胞であって、そのポリペプチドは外来のものであっても、当該細胞が本来有しているものであっても良い。例えば、当該ポリヌクレオチドが発現可能なように導入された細胞、当該ポリヌクレオチドの発現の程度が増強された細胞が挙げられる。具体的には、当該ポリヌクレオチド及びこれと作動可能に連結された制御領域を含むベクターやＤＮＡ断片が導入された細胞や、当該ポリヌクレオチドの制御領域が後述する高発現プロモーターや誘導プロモーター等の強制御領域に置換された細胞等が挙げられる。
　ここで、ポリヌクレオチドとしては、前記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが挙げられ、好適には下記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチドが挙げられる（これらのポリヌクレオチドを、「本発明のポリヌクレオチド」とも称する）。
　（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
　ここで、（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、前述の複数回膜貫通型ポリペプチドＧＡＬＴ０をコードする遺伝子（ｃｇ３０３８）を指す。
　（ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、配列番号１で示されるヌクレオチド配列との同一性は、少なくとも７６％、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である。
　配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７６％の同一性を有するヌクレオチド配列の例としては、配列番号１で示されるヌクレオチド配列に対して１又は複数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列が挙げられる。ヌクレオチド配列にヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入等の変異を導入する方法は、上述したとおりである。上記ポリヌクレオチドは、１本鎖若しくは２本鎖の形態であり得、又はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。該ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ等の人工ＤＮＡであり得る。
　（ｂ）の配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとしては、例えば以下の（ｂ１）～（ｂ３）のポリヌクレオチドが挙げられる。
　（ｂ１）配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は当該ヌクレオチド配列と９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　（ｂ２）配列番号５で示されるヌクレオチド配列又は当該ヌクレオチド配列と９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　（ｂ３）配列番号７で示されるヌクレオチド配列又は当該ヌクレオチド配列と９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　ここで、配列番号３で示されるヌクレオチド酸配列からなるポリヌクレオチドは、前記ＧＡＬＴ１をコードするポリヌクレオチドであり、配列番号５で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、前記ＧＡＬＴ２をコードするポリヌクレオチドであり、配列番号７で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドは、前記ＧＡＬＴ３をコードするポリヌクレオチドである。
　上記ポリヌクレオチドは、ベクターに組み込まれていてもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドを含有するベクターは、発現ベクターである。また好ましくは、該ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを宿主微生物に導入することができ、かつ宿主微生物内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。好ましくは、該ベクターは、本発明のポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
　具体的なベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　II　ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９等のｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＥＴ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、ｐＵＢ１１０（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，１９８６，Ｐｌａｓｍｉｄ　１５（２）：９３－１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ）、ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン）、ｐＲＩ９０９／９１０等のｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック）、ＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ）、ｐＰＴＲ１／２（タカラバイオ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１－３３１，１９８５）、ｐＡＢ４－１（ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１－７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５－３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７－４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７－４５１，１９９０）等が挙げられる。
　また、上記ポリヌクレオチドは、これを含むＤＮＡ断片として構築されていてもよい。該ＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片及び制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む発現カセットであり得る。
　上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、該ベクター又はＤＮＡ断片が導入された宿主細胞内で本発明のポリヌクレオチドを発現させるための配列であり、例えばプロモーターやターミネーター等の発現調節領域、複製開始点等が挙げられる。該制御領域の種類は、ベクター又はＤＮＡ断片を導入する宿主微生物の種類に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、該ベクター又はＤＮＡ断片はさらに、抗生物質耐性遺伝子、アミノ酸合成関連遺伝子等の選択マーカーを有していてもよい。
　宿主細胞へのベクター又はＤＮＡ断片の導入には、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。
　目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞は、選択マーカーを利用して選択することができる。例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、該抗生物質添加培地で培養することで、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された細胞を選択することができる。また例えば、選択マーカーがアミノ酸合成関連遺伝子である場合、該アミノ酸要求性の宿主細胞に遺伝子導入した後、該アミノ酸要求性の有無を指標に、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された細胞を選択することができる。あるいは、ＰＣＲ等によって形質転細胞のＤＮＡ配列を調べることで目的のベクター又はＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
　また、強制御領域としては、公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、tｕプロモーター、ｇａｐプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。
　更に、強制御領域としては原核生物由来の誘導プロモーターを用いることができ、フェルラ酸、バニリン酸またはバニリンの添加により誘導がかかるｖａｎＡ（ｃｇ２６１６）プロモーター、レゾルシノールまたは２，４－ジヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｒｈｃＨプロモーター、４－ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｐｃａＩプロモーター、３－ヒドロキシ安息香酸の添加により誘導がかかるｎａｇＩ（ｃｇ３３５１）遺伝子のプロモーター、安息香酸の添加により誘導がかかるｂｅｎＡ（ｃｇ２６３７）遺伝子のプロモーター（以下、Ｐｂｅｎと略す）、もしくはフラクトースまたはスクロースのいずれかの添加により誘導がかかるｃｇ２１１８遺伝子のプロモーターまたはｐｔｓＳ（ｃｇ２９２５）遺伝子のプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。
　宿主細胞のゲノム上に存在する前記ポリヌクレオチドの制御領域を強制御領域に置換する方法としては、強制御領域と選択マーカーのポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を宿主細胞に導入し、相同組換え又は非相同組換え等により形質転換された細胞を選択する方法等が挙げられる。
　本発明において、宿主細胞は、芳香族化合物又はその塩の生産に適する細胞であればよく、微生物細胞、植物細胞及び動物細胞のいずれを用いてもよいが、好ましくは微生物細胞である。
　芳香族化合物又はその塩の生産効率の観点、特にプロトカテク酸、没食子酸、シキミ酸、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、カテコール、Ｌ－ＤＯＰＡ、コリスミ酸、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、４―アミノ３－ヒドロキシ安息香酸等の３－デヒドロシキミ酸から誘導される芳香族化合物又はその塩の生産効率の点から、宿主細胞は、３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞を用いるのが更に好ましい。
　微生物細胞としては、大腸菌、枯草菌、放線菌、シュードモナス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ラクトバチルス属細菌、真菌（ノイロスポラ属、アスペルギルス属、トリコデルマ属等）、酵母（サッカロマイセス属、クライベロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ヤロウィア属、トリコスポロン属、ロドスポリジウム属、ピキア属、キャンディダ属等）等、いずれを用いてもよいが、好ましくは原核微生物細胞であり、より好ましくはグラム陽性細菌であり、放線菌がさらに好ましい。
　放線菌としては、コリネ型細菌として定義されている一群の微生物（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974））が好ましく、具体的には、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、ロドコッカス属菌、ストレプトマイセス属菌、マイクロコッカス属菌、等が挙げられる。
　コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、コリネバクテリウム クレナタム（Corynebacterium crenatum）、コリネバクテリウム クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム カルナエ（Corynebacterium callunae）等が挙げられる。
　ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）等が挙げられる。
　アースロバクター属菌としては、アースロバクター グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）等が挙げられる。
　マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム ボビス等が挙げられ、マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス フロイデンライヒ（Micrococcus freudenreichii）、マイクロコッカス ルテウス（Micrococcus leuteus）、マイクロコッカス ウレアエ（Micrococcus ureae）、マイクロコッカス ロゼウス（Micrococcus roseus）等が挙げられる。
　コリネ型細菌のうち、好ましくはコリネバクテリウム属菌であり、より好ましくはコリネバクテリウム　グルタミカムである。
　上記微生物細胞は野生株であってもよいが、その変異株や人為的な遺伝子組換え体であってもよい。
　３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞としては、３－デヒドロシキミ酸を生産するために必要な遺伝子が強化された微生物細胞が挙げられ、具体的には、下記の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）のいずれか１つ以上の遺伝子操作を施した微生物細胞が挙げられ、好ましくは（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）のいずれか２つ以上、より好ましくは３つ以上、更に好ましくは（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の全ての遺伝子操作を施した微生物細胞が挙げられる。
　ここで、遺伝子の強化には、所定の遺伝子を発現可能な状態で導入すること、所定の遺伝子又は当該遺伝子の制御領域へ変異を導入すること等が包含される。
（ｉ）デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝子、キナ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びシキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
（ｉｉ）２－デヒドロ－３－デオキシアラビノヘプトン酸アルドラーゼ遺伝子、３－デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子、シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子からなるシキミ酸合成経路に関わる遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
（ｉｉｉ）グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、６－ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、リボース－５－リン酸イソメラーゼ遺伝子、リブロース－５－リン酸－３－エピメラーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子及びトランスアルドラーゼ遺伝子からなるペントースリン酸経路に関わる遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
（ｉｖ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の強化。
　作製された形質転換体において、（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドの発現が強化されていることは、例えば、該形質転換体において、その宿主細胞（親細胞）と比較して当該ポリペプチドをコードする遺伝子の転写量が向上していることにより確認することができる。なお、遺伝子の転写量は、定量ＰＣＲによるｍＲＮＡ量測定、次世代シーケンサーを用いたＲＮＡ－Ｓｅｑ解析、ＤＮＡマイクロアレイ解析等により測定することができる。
　そして、作製された形質転換細胞を培養し、芳香族化合物又はその塩の生産性を評価し、適切な形質転換細胞を選択することにより、有用な芳香族化合物又はその塩の生産細胞を得ることができる。生産物の測定方法は、後記参考例に記載の方法にしたがって行うことができる。
　本発明の芳香族化合物又はその塩の製造方法は、上述した形質転換細胞を培養、好ましくは糖類の存在下で培養し、目的の芳香族化合物又はその塩を回収することにより実施される。
　糖類としては、グルコースが好適であるが、フルクトース、マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトース等の単糖類の他、代謝によりグルコースを生成し得る糖類も使用できる。このような糖類にはグルコース単位を有するオリゴ糖又は多糖類が含まれ、セロビオース、スクロース(ショ糖)、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、キシロビオース等の二糖類；デキストリン又は可溶性澱粉等の多糖類等が挙げられる。
　また、例えばこれらの原料化合物を含む原料として、糖蜜も用いることができる。また、わら（稲わら、大麦わら、小麦わら、ライ麦わら、オート麦わら等）、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物や、木くず、古紙等を糖化酵素等で糖化した、グルコース等の複数の糖を含む糖化液を用いることもできる。
　形質転換細胞を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本発明の形質転換細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、上記の糖類又はそれを含む糖蜜や糖化液が用いられるが、上記の糖類の他に、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンのような糖アルコール；酢酸、クエン酸、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸のような有機酸；エタノール、プロパノールのようなアルコール；ノルマルパラフィンのような炭化水素等も用いることができる。炭素源は、１種を単独で、又は２種以上を混合して使用できる。
　培養液中の原料化合物である糖類の濃度は、１～２０ｗ／ｖ％が好ましく、２～１０ｗ／ｖ％がより好ましく、２～５ｗ／ｖ％がさらに好ましい。
　窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、メチルアミン等のアルキルアミン類、アミノ酸等の含窒素有機化合物、アンモニアもしくはその塩（塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウムのような無機又は有機アンモニウム化合物）、尿素、アンモニア水、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム等を使用することができる。
　無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。
　さらに、必要に応じて、ビタミン類や消泡剤等を添加することもできる。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンＢ１）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
　コリネ型細菌用培地としては、Ａ培地〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 7:182-196 (2004)〕、ＢＴ培地〔J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:91-103 (2004)〕、ＣＧＸＩＩ培地〔特許第６３２２５７６号〕等が挙げられ、これらの培地において、糖類濃度を上記範囲にして用いればよい。
　なお、糖類を含む反応又は培養に先立ち、同様の培地で、形質転換体を好気条件下で、温度約２５～３８℃で、約１２～４８時間培養して増殖させることが好ましい。
　培養温度又は反応温度は、１５～４５℃が好ましく、２５～３７℃がより好ましい。
　また、培養又は反応時間は、２４時間～１６８時間、好ましくは２４時間～９６時間、より好ましくは２４時間～７２時間、必要に応じ撹拌又は振とうしながら行うことができる。また、培養中は必要に応じてアンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
　培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
　培養又は反応は、好気的条件で行ってもよく、還元条件で行ってもよいが、好気的条件下で行うのが好ましい。
　好気的条件下で反応又は培養を行う場合、芳香族化合物又はその塩の生成効率の点から、形質転換体の過度の増殖を抑制する条件下で行うのが好ましい。
　芳香族化合物が酸化を受けやすい場合には、培養は溶存酸素濃度が低い条件で行うことが好ましい。例えば没食子酸の製造においては、具体的には溶存酸素濃度が０．１～３ｐｐｍが好ましく、０．１～１ｐｐｍがより好ましい。
　培養物からの芳香族化合物又はその塩の回収及び精製方法は特に制限されない。すなわち、周知のイオン交換樹脂法、沈澱法、晶析法、再結晶法、濃縮法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。例えば、菌体を遠心分離等で除去した後、カチオン及びアニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すれば芳香族化合物又はその塩を取得することができる。培養物中に蓄積された芳香族化合物又はその塩は、そのまま単離することなく用いてもよい。
　上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
　＜１＞下記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドの発現が強化された形質転換細胞を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。
　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
　（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　＜２＞前記（Ｂ）の配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが、以下の（Ｂ１）～（Ｂ３）で示されるポリペプチドである、＜１＞に記載の方法。
　（Ｂ１）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　（Ｂ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　（Ｂ３）配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　＜３＞前記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、＜１＞又は＜２＞に記載の方法。
　＜４＞（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、下記（ａ）又は（ｂ）で示されるポリヌクレオチドである、＜３＞に記載の方法。
　（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
　＜５＞（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）～（ｂ３）で示されるポリヌクレオチドである、＜４＞に記載の方法。
　（ｂ１）配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は当該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　（ｂ２）配列番号５で示されるヌクレオチド配列又は当該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　（ｂ３）配列番号７で示されるヌクレオチド配列又は当該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　＜６＞糖類の存在下で培養するものである＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の方法。
　＜７＞形質転換細胞の宿主が３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞である、＜１＞～＜６＞のいずれかに記載の方法。
　＜８＞３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞が、下記の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のいずれか１つ以上の遺伝子操作を施した細胞である、＜７＞に記載の方法。
（ｉ）デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝子、キナ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びシキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
（ｉｉ）２－デヒドロ－３－デオキシアラビノヘプトン酸アルドラーゼ遺伝子、３－デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子、シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子からなるシキミ酸合成経路に関わる遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
（ｉｉｉ）グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、６－ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、リボース－５－リン酸イソメラーゼ遺伝子、リブロース－５－リン酸－３－エピメラーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子及びトランスアルドラーゼ遺伝子からなるペントースリン酸経路に関わる遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
（ｉｖ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の強化。
　＜９＞３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞が、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）のいずれか２つ以上の遺伝子操作を施した微生物細胞である、＜８＞に記載の方法。
　＜１０＞３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞が、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）のいずれか３つ以上の遺伝子操作を施した微生物細胞である、＜８＞に記載の方法。
　＜１１＞３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞が、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の遺伝子操作を施した微生物細胞である、＜８＞に記載の方法。
　＜１２＞微生物細胞がコリネ型細菌である、＜７＞～＜１１＞のいずれかに記載の方法。
　＜１３＞コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、＜１２＞に記載の方法。
　＜１４＞コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム エフィシェンス、コリネバクテリウム アンモニアゲネス、コリネバクテリウムハロトレランス、コリネバクテリウム アルカノリティカム、コリネバクテリウム クレナタム、コリネバクテリウム クルジラクチス又はコリネバクテリウム カルナエである、＜１３＞に記載の方法。
　＜１５＞コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、＜１３＞に記載の方法。
　＜１６＞芳香族化合物又はその塩が３－デヒドロシキミ酸から誘導される芳香族化合物又はその塩である＜１＞～＜１５＞のいずれかに記載の方法。
　＜１７＞芳香族化合物又はその塩が没食子酸、プロトカテク酸、カテコール、Ｌ－ＤＯＰＡ、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、４―アミノ３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、＜１６＞に記載の方法。
　＜１８＞芳香族化合物又はその塩が没食子酸、プロトカテク酸、Ｌ－ＤＯＰＡ、４－ヒドロキシ安息香酸、４―アミノ３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、＜１５＞に記載の方法。
　＜１９＞芳香族化合物又はその塩が没食子酸、プロトカテク酸、又はそれらの塩である、＜１８＞に記載の方法。
　＜２０＞３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞を宿主とする、下記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドの発現が強化された形質転換細胞。
　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
　（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　＜２１＞３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞が、下記の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のいずれか１つ以上の遺伝子操作を施した細胞である、＜２０＞に記載の形質転換細胞。
（ｉ）デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝子、キナ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びシキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
（ｉｉ）２－デヒドロ－３－デオキシアラビノヘプトン酸アルドラーゼ遺伝子、３－デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子、シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子からなるシキミ酸合成経路に関わる遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
（ｉｉｉ）グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、６－ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、リボース－５－リン酸イソメラーゼ遺伝子、リブロース－５－リン酸－３－エピメラーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子及びトランスアルドラーゼ遺伝子からなるペントースリン酸経路に関わる遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
（ｉｖ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の強化。
　＜２２＞３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞が、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）のいずれか２つ以上の遺伝子操作を施した微生物細胞である、＜２１＞に記載の形質転換細胞。
　＜２３＞３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞が、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）のいずれか３つ以上の遺伝子操作を施した微生物細胞である、＜２１＞に記載の形質転換細胞。
　＜２４＞３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞が、前記（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、及び（ｉｖ）の遺伝子操作を施した微生物細胞である、＜２１＞に記載の形質転換細胞。
　＜２５＞前記（Ｂ）の配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが、以下の（Ｂ１）～（Ｂ３）で示されるポリペプチドである、＜２０＞～＜２４＞のいずれかに記載の形質転換細胞。
　（Ｂ１）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　（Ｂ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　（Ｂ３）配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
　＜２６＞前記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、＜２０＞～＜２５＞のいずれかに記載の形質転換細胞。
　＜２７＞前記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、下記（ａ）又は（ｂ）で示されるポリヌクレオチドである、＜２６＞に記載の形質転換細胞。
　（ａ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、
　（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
　＜２８＞（ｂ）配列番号１で示されるヌクレオチド配列と少なくとも７６％の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが、下記（ｂ１）～（ｂ３）で示されるポリヌクレオチドである、＜２７＞に記載の形質転換細胞。
　（ｂ１）配列番号３で示されるヌクレオチド配列又は当該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　（ｂ２）配列番号５で示されるヌクレオチド配列又は当該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　（ｂ３）配列番号７で示されるヌクレオチド配列又は当該ヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド
　＜２９＞微生物細胞がコリネ型細菌である、＜２０＞～＜２８＞のいずれかに記載の形質転換細胞。
　＜３０＞コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、＜２９＞に記載の形質転換細胞。
　＜３１＞コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウム エフィシェンス、コリネバクテリウム アンモニアゲネス、コリネバクテリウムハロトレランス、コリネバクテリウム アルカノリティカム、コリネバクテリウム クレナタム、コリネバクテリウム クルジラクチス又はコリネバクテリウム カルナエである、＜３０＞に記載の形質転換細胞。
　＜３２＞コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、＜３１＞に記載の形質転換細胞。
　以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
（１）没食子酸（ＧＡＬという場合もある）生産菌の作製
　１）ｃｇ０６２０遺伝子領域を３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド遺伝子と置換するためのプラスミドの構築
　下記の実施例で示す塩基番号は、ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノム配列の塩基番号であり、該ゲノム配列情報については、ＮＣＢＩのＧＢデータベースから、アクセッション番号ＮＣ＿００６９５８として取得した。
　ＰＣＲ用酵素はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いた。
　ＡＴＣＣ１３０３２株（＝ＮＢＲＣ　１２１６８株）のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーＯＴ２０及びＯＴ２１にて増幅し、ｃｇ０６２０遺伝子領域の５’側のＤＮＡ断片を得た。またゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーＯＴ２３及びＯＴ２４にて増幅し、ｃｇ０６２０遺伝子領域の３’側のＤＮＡ断片を得た。また、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株が有するｔｕｆ遺伝子（ｃｇ０５８７）のプロモーター（以下、ｔｕプロモーターと称する）を含むＤＮＡ断片（ＯＴ２５）を人工遺伝子合成にて作製した。これを鋳型にプライマーＯＴ２６及びＯＴ２７にて増幅して、プロモーター領域のＤＮＡ断片を得た。また、３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド遺伝子（以下、ｈｆｍ１４５ＶＦと略記する）を含むＤＮＡ断片を人工遺伝子合成にて２種類（配列番号１１と１２）作製した。それぞれのＤＮＡ断片を鋳型にし、それぞれ２種類のＤＮＡプライマー（ＯＴ３０とＯＴ３１及びＯＴ３２とＯＴ３３）にて増幅し、２種類のＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型に、プライマーＯＴ３４及びＯＴ３５にて、ベクター断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた６種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔを作製した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．　Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、細胞液をカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一晩静置した。プラスミドを持つ形質転換体をカナマイシンンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（ＴａＫａＲａ社）と用いてプラスミドの精製を行い、ｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔを得た。
　２）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチド遺伝子導入株の作製
　エレクトロポレーション（Ｂｉｏ－ｒａｄ）による形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔをＣＹ４４株（ＣＹ４４株は、特許６３２２５７６号公報の参考例１４記載のｔｋｔ株であり、トランスケトラーゼ（ｔｋｔという場合もある）遺伝子の転写をｔｕプロモーターによって制御することによって発現が強化されている。また、デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子（ｑｓｕＢという場合もある）遺伝子とｖａｎＲ（ｃｇ２６１５）遺伝子の転写を安息香酸の添加により誘導することができる。さらにシキミ酸デヒドロゲナーゼ（ａｒｏＥ３という場合もある）遺伝子がＶａｎＲリプレッサーにより制御される。）に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ１４８ｓｒ株を取得した。プライマーＯＴ２０及びＯＴ３６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ１４８ｓｒ株を解析したところ、予想通りの結果が得られたことから、ＫＣ１４８ｓｒ株はプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０－Ｐｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐｔがｃｇ０６２０遺伝子領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
　ＫＣ１４８ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ１４８株を得た。プライマーＯＴ３６とＯＴ３７のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ１４８株が予想通りＰｔｕ－ｈｆｍ１４５ＶＦ－ｈｆｍ１４５ＶＦｏｐ遺伝子がｃｇ０６２０遺伝子領域に導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
（２）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（以下、ｌｄｈ遺伝子という場合もある）破壊株の作製
　１）ｌｄｈ（ｃｇ３２１９）遺伝子を破壊するためのプラスミドの作製
　ＰＣＲ用酵素はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いた。ｐＨＫＰｓａｃＢ１（特許６３２２５７６号公報に記載）を鋳型に、プライマーｐＨＫＰｓａｃＢ－Ｆ２及びｐＨＫＰｓａｃＢ－Ｒ２でベクター断片を増幅した。ＡＴＣＣ１３０３２株（＝ＮＢＲＣ　１２１６８株）のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマー３２１９－ｕｐ－Ｆ及び３２１９－ｕｐ－Ｒにて増幅したｃｇ３２１９遺伝子の５’側のＤＮＡ断片、及びゲノムＤＮＡを鋳型にプライマー３２１９－ｄｏｗｎ－Ｆ及び３２１９－ｄｏｗｎ－Ｒにて増幅したｃｇ３２１９遺伝子の３’側のＤＮＡ断片を得た。得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた３種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈを作製した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．　Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、細胞液をカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一晩静置した。得られたコロニーを鋳型にして、Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（ＴａＫａＲａ社）を酵素として用い、コロニーＰＣＲを行った。プライマーは３２１９－ｕｐ－Ｆ及び３２１９－ｄｏｗｎ－Ｒを用いて、目的ＤＮＡ断片の導入を確認した。遺伝子の導入が確認されたプラスミドを持つ形質転換体をカナマイシンンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（ＴａＫａＲａ社）と用いてプラスミドの精製を行い、ｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈを得た。
　２）ｌｄｈ遺伝子（ｃｇ３２１９）の破壊株の取得
　上記で得られたプラスミドｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈを用いて、ＫＣ１４８にエレクトロポレーション法（Ｂｉｏ－ｒａｄ）により形質転換した。カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ１４８Δｌｄｈ―ｓｒを取得した。得られたコロニーを鋳型にして、プライマーｓａｃＢ－１及び３２１９－ｕｐ１５００を用いてＰＣＲ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ）を行ったところ予想通りの結果が得られたことから、プラスミドｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈが１回交差型相同組換えによりｃｇ３２１９遺伝子領域に導入されたことを確認した。ＫＣ１４８Δｌｄｈ―ｓｒを１ｍＬのＬＢ液体培地中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ１４８Δｌｄｈ株を得た。プライマー３２１９－ｃｏｌｏＰ－Ｆ及び３２１９－ｃｏｌｏＰ－Ｒを用いたコロニーＰＣＲ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ）により、ｌｄｈ遺伝子（ｃｇ３２１９）が２回交差型相同組換えにより欠失していることを確認した。合わせて、カナマイシン耐性遺伝子とｓａｃＢ遺伝子も欠失していることを確認した。
（３）ＧＡＬＴ０遺伝子のｃｇ３２１９ローカスへのノックイン株の作製
　１）ＧＡＬＴ０遺伝子をｃｇ３２１９ローカスへノックインするためのプラスミドの作製
　ＰＣＲ用酵素はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いた。ｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈを鋳型に、プライマーｏｃＪＫ８３及びｏｃＪＫ８４でベクター断片を増幅した。ＡＴＣＣ１３０３２株（＝ＮＢＲＣ　１２１６８株）のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマーｏｃＪＫＴ８５及びｏｃＪＫＴ８６にて増幅したＧＡＬＴ０遺伝子（配列番号１）のＯＲＦ領域を含むＤＮＡ断片を得た。得られた２種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ０を作製した。本プラスミドはｌｄｈ遺伝子上流のプラスミド領域下流にＧＡＬＴ０遺伝子のＯＲＦが連結されている。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．　Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、細胞液をカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一晩静置した。得られたコロニーを鋳型にして、Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（ＴａＫａＲａ社）を酵素として用い、コロニーＰＣＲを行った。プライマーはｏｃＪＫ１０５及びｏｃＪＫ１０６を用いて、目的ＤＮＡ断片の導入を確認した。遺伝子の導入が確認されたプラスミドを持つ形質転換体をカナマイシンンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（ＴａＫａＲａ社）と用いてプラスミドの精製を行い、ｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ０を得た。
２）ＧＡＬＴ０遺伝子のｃｇ３２１９ローカスへのノックイン株の取得
　上記で得られたプラスミドｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ０を用いて、ＫＣ１４８にエレクトロポレーション法（Ｂｉｏ－ｒａｄ）により形質転換した。カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ１４８Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ０―ｓｒを取得した。得られたコロニーを鋳型にして、プライマーｏｃＪＫ１０７及びｏｃＪＫ８７を用いてＰＣＲ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ）を行ったところ予想通りの結果が得られたことから、プラスミドｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ０が１回交差型相同組換えによりｃｇ３２１９遺伝子領域に導入されたことを確認した。ＫＣ１４８Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ０―ｓｒを１ｍＬのＬＢ液体培地中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ１４８Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ０株を得た。プライマーｏｃＪＫ１０７及びｏｃＪＫ１１０を用いたコロニーＰＣＲ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ）により、ＧＡＬＴ０遺伝子のｃｇ３２１９ローカスへのノックインを確認した。合わせて、カナマイシン耐性遺伝子とｓａｃＢ遺伝子も欠失していることを確認した。
（４）ＧＡＬＴ３遺伝子のｃｇ３２１９ローカスへのノックイン株の作製
　１）ＧＡＬＴ３遺伝子をｃｇ３２１９ローカスへノックインするためのプラスミドの作製
　ＰＣＲ用酵素はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ社）を用いた。ｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈを鋳型に、プライマーｏｃＪＫ８３及びｏｃＪＫ８４でベクター断片を増幅した。ユーロフィンジェノミクス株式会社にて人工遺伝子合成した配列番号ＧＡＬＴ３＿ｎｕｃで示すＤＮＡ断片を鋳型に、プライマーｏｃＪＫＴ８７及びｏｃＪＫＴ８８にて増幅したＧＡＬＴ３遺伝子（配列番号７）のＯＲＦ領域を含むＤＮＡ断片を得た。得られた２種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製後、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ３を作製した。本プラスミドはｌｄｈ遺伝子上流のプラスミド領域下流にＧＡＬＴ３遺伝子のＯＲＦが連結されている。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．　Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、細胞液をカナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して、３７℃で一晩静置した。得られたコロニーを鋳型にして、Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（ＴａＫａＲａ社）を酵素として用い、コロニーＰＣＲを行った。プライマーはｏｃＪＫ１０５及びｏｃＪＫ１０６を用いて、目的ＤＮＡ断片の導入を確認した。遺伝子の導入が確認されたプラスミドを持つ形質転換体をカナマイシンンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（ＴａＫａＲａ社）と用いてプラスミドの精製を行い、ｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ３を得た。
２）ＧＡＬＴ３遺伝子のｃｇ３２１９ローカスへのノックイン株の取得
　上記で得られたプラスミドｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ３を用いて、ＫＣ１４８にエレクトロポレーション法（Ｂｉｏ－ｒａｄ）により形質転換した。カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ１４８Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ３―ｓｒを取得した。得られたコロニーを鋳型にして、プライマーｏｃＪＫ１０７及びｏｃＪＫ９８を用いてＰＣＲ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ）を行ったところ予想通りの結果が得られたことから、プラスミドｐＨＫＢｓａｃＢ－Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ３が１回交差型相同組換えによりｃｇ３２１９遺伝子領域に導入されたことを確認した。ＫＣ１４８Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ３―ｓｒを１ｍＬのＬＢ液体培地中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ１４８Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ３株を得た。プライマーｏｃＪＫ１０７及びｏｃＪＫ１１０を用いたコロニーＰＣＲ（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ）により、ＧＡＬＴ３遺伝子のｃｇ３２１９ローカスへのノックインを確認した。合わせて、カナマイシン耐性遺伝子とｓａｃＢ遺伝子も欠失していることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（５）芳香族化合物生産性の評価
　ＫＣ１４８Δｌｄｈ株、ＫＣ１４８Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ０株、及びＫＣ１４８Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ３株をＬＢプレートに画線し、３０℃で３日間培養した。プレート上に生育した菌体を、ＬＢ培地を４ｍＬ仕込んだ丸底スピッツ（栄研化学）に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで２４時間振盪培養（前培養）を行った。表２に示すＣＧＸＩＩ培地に終濃度１ｍＭとなるよう安息香酸ナトリウムを添加し、Ｂｉｏ　Ｊｒ．８（エイブル株式会社）の培養槽に１００ｍＬ仕込んだ。前記前培養液を１ｍＬ植菌し、３２℃、７００ｒｐｍ、１００ｍＬ／ｍｉｎの通気量の条件で１８時間振盪培養を行い、芳香族化合物の生産性を評価した。培養液を希硫酸で適宜希釈し、遠心にて菌体を除去した後、上清を回収した。上清中の没食子酸（ＧＡＬ）及びプロトカテク酸（ＰＣＡという場合もある）濃度を定量した。結果を表３に示した。ＫＣ１４８Δｌｄｈ株と比較してＫＣ１４８Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ０株では没食子酸濃度が３．１倍にプロトカテク酸濃度が４．８倍となり、芳香族化合物の生産性向上効果を確認した。同様に、ＫＣ１４８Δｌｄｈ：：ＧＡＬＴ３株では、没食子酸濃度が２．７倍にプロトカテク酸濃度が３．１倍となり、芳香族化合物の生産性向上効果を確認した。
　なお、ＧＡＬＴ０遺伝子に代えてＧＡＬＴ１又はＧＡＬＴ２遺伝子を導入するＧＡＬＴ１株及びＧＡＬＴ２株もまた、変異前の株と比較して優れたプロトカテク酸及び没食子酸の生産性向上効果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
参考例１　没食子酸及びプロトカテク酸の定量
　回収した上清はアクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行ない、反応液をＨＰＬＣに供した。
　ＨＰＬＣの装置はＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。Ｌ－カラム　ＯＤＳ（４．６ｍｍ　Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ　リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。検出にはＵＶ検出器（検出波長２１０）を用いた。
参考例２　細胞膜貫通領域予測プログラムを用いた膜貫通へリックス構造の解析
　目的のポリペプチド配列（ここではＧＡＬＴ０）をhttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/に送信する。その結果、トランスメンブレンヘリックス（膜貫通領域）部分を予測し、その前後が細胞膜内（ｉｎｓｉｄｅ）及び細胞膜外（ｏｕｔｓｉｄｅ）として解析結果が得られる（図２）。これにより、ＧＡＬＴ０は膜貫通領域を１２個もつ１２回膜貫通型のポリペプチドと予測結果が得られる。同様にＧＡＬＴ１以降も膜貫通領域を予測できる。

Claims (22)

  1. 　下記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドの発現が強化された形質転換細胞を培養する工程を含む、芳香族化合物又はその塩の製造方法。
    　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
    　（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
  2. 　前記（Ｂ）の配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが、以下の（Ｂ１）～（Ｂ３）で示されるポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
    　（Ｂ１）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
    　（Ｂ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
    　（Ｂ３）配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
  3. 　前記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　糖類の存在下で培養するものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　形質転換細胞の宿主が３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞が、下記の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のいずれか１つ以上の遺伝子操作を施した細胞である、請求項４に記載の方法。
    （ｉ）デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝子、キナ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びシキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
    （ｉｉ）２－デヒドロ－３－デオキシアラビノヘプトン酸アルドラーゼ遺伝子、３－デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子、シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子からなるシキミ酸合成経路に関わる遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
    （ｉｉｉ）グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、６－ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、リボース－５－リン酸イソメラーゼ遺伝子、リブロース－５－リン酸－３－エピメラーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子及びトランスアルドラーゼ遺伝子からなるペントースリン酸経路に関わる遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
    （ｉｖ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の強化。
  7. 　微生物細胞がコリネ型細菌である、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 　コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、請求項７に記載の方法。
  9. 　コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウムエフィシェンス、コリネバクテリウム アンモニアゲネス、コリネバクテリウム ハロトレランス、コリネバクテリウム アルカノリティカム、コリネバクテリウム クレナタム、コリネバクテリウム クルジラクチス又はコリネバクテリウム カルナエである、請求項８に記載の方法。
  10. 　コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、請求項８に記載の方法。
  11. 　芳香族化合物又はその塩が３－デヒドロシキミ酸から誘導される芳香族化合物又はその塩である請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　芳香族化合物又はその塩が没食子酸、プロトカテク酸、カテコール、Ｌ－ＤＯＰＡ、２，４－ピリジンジカルボン酸、２，５－ピリジンジカルボン酸、４－ヒドロキシ安息香酸、４－アミノ安息香酸、４－アミノ３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　芳香族化合物又はその塩が没食子酸、プロトカテク酸、Ｌ－ＤＯＰＡ、４－ヒドロキシ安息香酸、４―アミノ３－ヒドロキシ安息香酸、又はそれらの塩である、請求項１２に記載の方法。
  14. 　芳香族化合物又はその塩が没食子酸、プロトカテク酸、又はそれらの塩である、請求項１３に記載の方法。
  15. 　３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞を宿主とする、下記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドの発現が強化された形質転換細胞。
    　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
    　（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
  16. 　３－デヒドロシキミ酸生産活性が向上した微生物細胞が、下記の（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）のいずれか１つ以上の遺伝子操作を施した細胞である、請求項１５に記載の形質転換細胞。
    （ｉ）デヒドロシキミ酸デヒドラターゼ遺伝子、デヒドロキナ酸デヒドラターゼ遺伝子、キナ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子及びシキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
    （ｉｉ）２－デヒドロ－３－デオキシアラビノヘプトン酸アルドラーゼ遺伝子、３－デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子、シキミ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子からなるシキミ酸合成経路に関わる遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
    （ｉｉｉ）グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、６－ホスホグルコノラクトナーゼ遺伝子、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、リボース－５－リン酸イソメラーゼ遺伝子、リブロース－５－リン酸－３－エピメラーゼ遺伝子、トランスケトラーゼ遺伝子及びトランスアルドラーゼ遺伝子からなるペントースリン酸経路に関わる遺伝子群から選ばれる１以上の遺伝子の強化。
    （ｉｖ）３，４－ジヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子の強化。
  17. 　前記（Ｂ）の配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも７６％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが、以下の（Ｂ１）～（Ｂ３）で示されるポリペプチドである、請求項１５又は１６に記載の形質転換細胞。
    　（Ｂ１）配列番号４で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
    　（Ｂ２）配列番号６で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
    　（Ｂ３）配列番号８で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド
  18. 　前記（Ａ）又は（Ｂ）で示される複数回膜貫通型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む、請求項１５～１７のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
  19. 　微生物細胞がコリネ型細菌である、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の形質転換細胞。
  20. 　コリネ型細菌がコリネバクテリウム属細菌である、請求項１９に記載の形質転換細胞。
  21. 　コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカム、コリネバクテリウムエフィシェンス、コリネバクテリウム アンモニアゲネス、コリネバクテリウム ハロトレランス、コリネバクテリウム アルカノリティカム、コリネバクテリウム クレナタム、コリネバクテリウム クルジラクチス又はコリネバクテリウム カルナエである、請求項２０に記載の形質転換細胞。
  22. 　コリネバクテリウム属細菌がコリネバクテリウム グルタミカムである、請求項２１に記載の形質転換細胞。
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