WO2024075674A1 - 微生物菌株、タンパク質、微生物菌株又はタンパク質を用いた没食子酸を製造する方法 - Google Patents
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Classifications
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- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
Definitions
- This technology relates to a microbial strain into which a gene related to a specific aromatic hydroxylase has been introduced, a protein which is a specific aromatic hydroxylase, and a method for producing gallic acid using the microorganism or the protein.
- Gallic acid is a phenolic compound found in many plants, including gallnut, gall nut, witch hazel, tea leaves, and oak bark. Gallic acid has three hydroxyl groups in its molecule, which gives it a high antioxidant effect and makes it useful as an antioxidant. Gallic acid derivatives are also used in adhesives, coatings, and electronic component-related products. Esters of gallic acid are also widely used as food additives. Demand for gallic acid is expected to exceed 8,000 tons per year, and is growing.
- gallic acid is produced industrially from plant materials such as Chinese gall nut and gall nuts. This results in an unstable supply of raw materials for each harvest, which is a factor in the rise in prices.
- gallic acid In order to produce gallic acid stably and cheaply in response to the increasing demand for gallic acid, there are hopes for a production method that uses microbial fermentation using sugars and other substrates.
- Production methods using microbial fermentation do not require organic solvents, heavy metals, strong acids, or strong alkalis, and can use sustainable plant biomass such as starch and cellulose, so they have a smaller environmental impact than production methods using chemical synthesis.
- stable production is possible by controlling the culture conditions, so it is expected that the target substance can be provided at a lower cost than production using plant cells.
- Patent Document 1 discloses a method for producing gallic acid from protocatechuic acid using a microorganism expressing p-hydroxybenzoic acid hydroxylase (PobA), an enzyme that produces protocatechuic acid from p-hydroxybenzoic acid derived from Pseudomonas putida KT2440 or Novosphingobium aromaticavorans DSM 12444; however, the ratio of gallic acid to protocatechuic acid does not increase sufficiently because the reaction producing protocatechuic acid from p-hydroxybenzoic acid proceeds more preferentially than the reaction producing gallic acid from protocatechuic acid.
- PobA p-hydroxybenzoic acid hydroxylase
- the main objective of this technology is to provide a protein with 5-position oxidation activity of protocatechuic acid that can efficiently produce gallic acid from protocatechuic acid, and a microbial strain that expresses said protein.
- the present technology provides the following: [1] A microbial strain into which a gene encoding a protocatechuate 5-oxidase derived from a microorganism of the Comamonadaceae family, or a protein having an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence of the protocatechuate 5-oxidase, has been introduced. [2] The microbial strain described in [1], wherein the Comamonadaceae microorganism is a microorganism selected from the genera Hylemoenella, Polaromonas, and Hydrogenophaga.
- [6] A method for producing gallic acid according to [4] or [5], wherein fermentation is carried out using a medium having a pH of 6.0 or less.
- [8] A method for producing gallic acid from protocatechuic acid using a protocatechuate 5-oxidase derived from a microorganism of the Comamonadaceae family, or a protein having an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence of the protocatechuate 5-oxidase.
- the protein according to [9] or [10] further comprising a substitution of tyrosine at positions 385 to 395 with phenylalanine, valine, or alanine.
- the microbial strain according to the present technology can efficiently produce gallic acid with an improved yield of gallic acid from protocatechuic acid. Fermentation using the microbial strain according to the present technology can improve the yield of gallic acid from protocatechuic acid and efficiently produce gallic acid. By using a protein having 5-position oxidation of protocatechuic acid according to the present technology, the yield of gallic acid from protocatechuic acid can be improved, and gallic acid can be produced efficiently. Note that the effects of the present technology are not limited to the effects described here, and may be any of the effects described in this specification.
- FIG. 1 shows the results of molecular phylogenetic analysis of PobA protein.
- FIG. 2 is a graph showing the gallic acid producing activity of the protocatechuic acid 5-oxidase according to the present technology.
- FIG. 1 is a diagram showing a pathway for producing gallic acid from sugar using a microorganism.
- the microbial strain of this technology is a microbial strain into which a gene encoding a protocatechuate 5-position oxidase derived from a microorganism of the Comamonadaceae family, or a protein having 70% or more identity to the amino acid sequence of the protocatechuate 5-position oxidase, has been introduced.
- the Comamonadaceae microorganism from which the protocatechuate 5-oxidase of this technology is derived is described with reference to Figure 2.
- protocatechuate 5-oxidase derived from the Comamonadaceae microorganism protocatechuate can be converted to gallic acid with high efficiency.
- the microorganism of the Comamonadaceae family is not particularly limited as long as it satisfies the above characteristics, but among the genera listed in the results of the phylogenetic analysis in Figure 1, the genera Hylemonella, Limnohabitans, Rhodoferax, Xylophilus, Ramlibacter, Polaromonas, and Hydrogenophaga are preferred, and the genera Hylemonella, Polaromonas, and Hydrogenophaga are particularly preferred.
- Amino acid sequence information of PobA (HgPobA) derived from Hylemonella gracilis (SEQ ID NO: 20) Amino acid sequence information of PobA derived from Limnohabitans sp. (SEQ ID NO: 23) Amino acid sequence information of PobA derived from Rhodoferax sedimins (SEQ ID NO: 24) Amino acid sequence information of PobA derived from Xylophilus ampelinus (SEQ ID NO: 25) Amino acid sequence information of PobA derived from Ramlibacter henchirensis (SEQ ID NO: 26) Amino acid sequence information of PobA derived from Comamonas phosphati (SEQ ID NO: 27) Amino acid sequence information of PobA (HyPobA) derived from Hydrogenophaga sp. (SEQ ID NO: 21) Amino acid sequence information of PoPobA (PoPobA) derived from Polaromon
- a gene encoding a protein having the same amino acid sequence as the protocatechuate 5-oxidase derived from a microorganism of the Comamonadaceae family expressed in the microbial strain of the present technology may be introduced, but a gene encoding a protein whose amino acid sequence has been altered to such an extent that the protocatechuate 5-oxidase can retain its activity of hydroxylating protocatechuate to produce gallic acid may also be introduced.
- a protein having an identity of preferably 70% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, even more preferably 99% or more, even more preferably 99.5% or more, even more preferably 99.7% or more to the amino acid sequence of the protocatechuate 5-oxidase can retain the activity of hydroxylating protocatechuate to produce gallic acid, and is therefore considered to have a high homology to the protocatechuate 5-oxidase of the present technology.
- the form of the gene to be introduced into the microbial strain is not particularly limited, but for example, the above-mentioned protocatechuate 5-oxidase or polynucleotide encoding the protein, or a vector containing the polynucleotide in its sequence, can be used.
- the polynucleotide encoding a protein such as protocatechuate 5-oxidase preferably includes a control region operably linked to an upstream region (a region on the 5' end of the polynucleotide chain) relative to the region encoding the protein such as protocatechuate 5-oxidase.
- the control region preferably includes a promoter, and may further include a cis-element or terminator that improves the transcription activity of the promoter.
- the polynucleotide may include a selection marker gene such as a drug resistance gene or an auxotrophic marker gene, allowing efficient screening of microbial strains into which genes have been introduced.
- the polynucleotide can be introduced into a vector by the restriction enzyme method.
- vector there is no particular limit to the type of vector that can be used in this technology, and it may be any vector, such as a plasmid, cosmid, phasmid, phage, transposon, or BAC vector.
- the vector may be a vector for introduction into a chromosome in the cells of the microbial strain into which the gene is to be introduced, or a vector that is maintained extrachromosomally, but it is preferable that the vector be amplified in the cells of the microbial strain.
- the vector that can be used in this technology but a bacterial vector is preferable, and a vector for the microbial strain into which the gene is to be introduced is more preferable.
- the microbial strain into which the gene is introduced is not particularly limited, but may be any of the following: Escherichia, Rhodococcus, Acinetobacter, Bradyrhizobium, Corynebacterium, Pseudomonas, Rhodopseudomonas, and the like.
- Microbial strains belonging to the genera Rhodopseudomonas, Sinorhizobium, Brevibacterium, Novosphingobium, or Ralstonia are preferred, with the genera Escherichia and Corynebacterium being particularly preferred.
- the method for introducing the gene into the microbial strain is not particularly limited, but may be any of the well-known transformation techniques that can be applied, such as general transformation methods using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)], electroporation [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)], transformation, transfection, conjugation, protoplast, particle gun, and Agrobacterium.
- Fermentation using the microbial strain of the present technology can suitably produce gallic acid from protocatechuic acid. Fermentation using the microbial strain of the present technology is not particularly limited, but can be suitably carried out, for example, by adding a culture solution in which the microbial strain of the present technology has been cultured as a preculture to the medium used for fermentation.
- the medium used for pre-culturing the microbial strain of the present technology may suitably be a medium generally used for the microbial strain into which the gene is to be introduced.
- a medium generally used for the microbial strain into which the gene is to be introduced For example, when the microbial strain into which the gene is to be introduced is of the genus Escherichia, it may be suitably cultured using LB medium, M9 medium, etc., with the culture temperature being 15°C to 45°C and the culture time being 1 to 7 days, etc.
- the microbial strain into which the gene is to be introduced is of the genus Corynebacterium, it may be suitably cultured using LB medium, CGXII medium (Journal of Bacteriology, 1993, 175:5595-5603), etc., with the culture temperature being 15°C to 45°C and the culture time being 1 to 7 days, etc.
- LB medium CGXII medium
- the culture temperature being 15°C to 45°C
- the culture time being 1 to 7 days, etc.
- the medium used for fermentation of the microbial strain of the present technology is not particularly limited as long as it contains, as a substrate, a compound that is a precursor of gallic acid in the production pathway of gallic acid shown in Figure 3.
- the compound that is a precursor of gallic acid contained in the medium may directly contain the compound shown in the production pathway of gallic acid shown in Figure 3, or may contain, for example, a compound such as terephthalic acid, phthalic acid, or isophthalic acid that can be a precursor of protocatechuic acid, which is a compound shown in the production pathway of gallic acid shown in Figure 3.
- the glucose-containing medium can be prepared by adding about 1 to 10%, preferably about 3 to 7%, of glucose to a medium generally used for the microbial strain into which the above-mentioned gene is introduced.
- fermentation can be suitably carried out in a CGXII medium or LB medium to which glucose has been added, at a culture temperature of 15°C to 45°C, for a culture time of 1 to 7 days, etc.
- a CGXII medium or LB medium to which glucose has been added
- a culture temperature of 15°C to 45°C for a culture time of 1 to 7 days
- fermentation can be suitably carried out in a LB medium or a fermentation production medium (Scientific reports, 2016, 6.1: 1-9.) to which glucose has been added, at a culture temperature of 28°C to 37°C, for a culture time of 1 to 7 days, etc.
- the typical pH of the fermentation liquid during cultivation is 6.5 to 7.5, and the amount of sulfuric acid used is estimated to be 13 to 16 g/L.
- the amount of sulfuric acid used can be estimated to be 5 to 8 g/L, allowing for a reduction in the amount of sulfuric acid used.
- the pH of the medium used for fermenting the microbial strain of the present technology is, for example, preferably 6.0 or less, and more preferably 5.0 or less.
- the temperature conditions for fermentation using the microbial strain of this technology can be set to a high temperature range of preferably 35°C to 45°C, and more preferably 37°C to 40°C.
- the protocatechuate 5-oxidase derived from a microorganism of the Comamonadaceae family used in this technology can be expressed in a system using a microbial strain into which a gene encoding the protocatechuate 5-oxidase is introduced, as described above, but it can also be expressed in an in vitro system by adding reagents such as amino acids to the gene encoding the protocatechuate 5-oxidase or its transcription product.
- gallic acid can be produced from protocatechuic acid using a protocatechuic acid 5-position oxidase derived from a microorganism of the Comamonadaceae family expressed in a system using the above-mentioned microbial strain or in an in vitro system, or a protein having an amino acid sequence that is 70% or more identical to that of the protocatechuic acid 5-position oxidase.
- protocatechuate 5-oxidase or a protein having 70% or more identity with the amino acid sequence of said protocatechuate 5-oxidase can be suitably recovered from the culture medium of a microbial strain, cell lysate, in vitro reaction solution, etc., by using general methods used in protein purification, such as cell disruption, centrifugation, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc., either alone or in appropriate combination.
- the protocatechuate 5-oxidase of this technology can be an enzyme with the same amino acid sequence as the protocatechuate 5-oxidase derived from a microorganism of the Comamonadaceae family, but it can also be an enzyme with a mutated amino acid sequence.
- the activity in producing gallic acid from protocatechuic acid may be improved.
- threonine at positions 294 to 304 preferably 294 or 302
- the activity in producing gallic acid from protocatechuic acid may be improved.
- tyrosine at positions 385 to 395, preferably 385 or 393, starting from the N-terminus of the polypeptide chain of the enzyme, with phenylalanine, valine, or alanine, the activity in producing gallic acid from protocatechuic acid may be improved.
- the mutation sites in the amino acid sequence of protocatechuate 5-oxidase can be those exemplified above, either alone or in appropriate combination, but are not limited to the above examples.
- An enzyme with a mutated amino acid sequence can be designed by substituting any amino acid residue in the polypeptide chain with another amino acid, deleting any amino acid residue in the polypeptide chain, or inserting a new amino acid residue at any position in the polypeptide chain.
- the enzyme with a mutated amino acid sequence can be produced, for example, by using a well-known site-directed mutagenesis method on the gene encoding the protocatechuate 5-oxidase of the present technology.
- Well-known site-directed mutagenesis methods can be carried out by any method, such as inverse PCR or annealing, using a mutation primer containing the nucleotide mutation to be introduced.
- the mutation primer may be designed to anneal to a region containing a nucleotide sequence that codes for the amino acid residue to be mutated in the target gene, and to contain a nucleotide sequence having a nucleotide sequence (codon) that codes for the mutated amino acid residue in place of the nucleotide sequence (codon) that codes for the amino acid residue to be mutated.
- gallic acid when gallic acid is produced from protocatechuic acid by fermentation using a microbial strain, the fermentation liquid is recovered; when gallic acid is produced from protocatechuic acid using protocatechuic acid 5-oxidase, gallic acid is recovered from the reaction liquid.
- the method for recovering gallic acid is not particularly limited, but for example, the aforementioned fermentation liquid or reaction liquid is adjusted to a pH of 4.0 or less with an acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid. Insoluble proteins generated by the pH adjustment are removed by a method such as centrifugation or filtration. The liquid after removal is appropriately stirred while being cooled to 4°C or less to obtain gallic acid crystals, which can be suitably recovered by a method such as centrifugation or filtration.
- gallic acid crystals can also be suitably recovered by mixing the aforementioned fermentation liquid or reaction liquid with an organic solvent such as benzene, toluene, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, or ethyl acetate, and then recovering and evaporating the organic solvent layer.
- an organic solvent such as benzene, toluene, dichloromethane, chloroform, diethyl ether, or ethyl acetate
- Example 1 Preparation of protocatechuate 5-oxidase and activity measurement
- a polynucleotide fragment was obtained by PCR using primers 1 and 2 having the nucleotide sequences shown below and KOD One® PCR Master Mix (Toyobo Co., Ltd.).
- Primer 1 (SEQ ID NO:2) (5'-atcaccacaggatccgaattcAAGCTATCCCACAAGAACTCAGG-3')
- Primer 2 (SEQ ID NO:3) (5'-ttaagcattatgcggccgcaagcttAGGCACCGAAGTCGAGGG-3')
- the polynucleotide fragment and pRSFDuet-1 were digested with the restriction enzymes EcoRI and HindIII, respectively, and then reacted and ligated with Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs) to obtain the pRSF-HgPobA plasmid.
- Primer 3 (SEQ ID NO:5) (5'-atcaccacagccaggatccgaattcGCGGACCCAGGTCGGCAT-3')
- Primer 4 (SEQ ID NO:6) (5'-ttaagcattatgcggccgcaagcTTATTCAATCGGAAGTCCAGTGAAATTCTCTGAAAACG-3')
- Primer 5 (SEQ ID NO:8) (5'-atcaccacaggatccgaattcGCGCACCCAGGTTGGTATC-3')
- Primer 6 (SEQ ID NO:9) (5'-ttaagcattatgcggccgcaagcTTAGTCGATGGGCAAGCC-3')
- pRSF-PaPobA plasmid (Comparative Example 1) A polynucleotide encoding PobA derived from Pseudomonas aeruginosa was artificially synthesized based on the gene sequence information (SEQ ID NO: 14) of PobA derived from Pseudomonas aeruginosa. A polynucleotide fragment was obtained by PCR using the polynucleotide as a template and a primer set having the nucleotide sequence shown below, KOD One® PCR Master Mix (Toyobo Co., Ltd.).
- Primer set for constructing pRSF-PaPobA plasmid 5'-TTCGTCGGTCTGCCGTATGAGG-3' (SEQ ID NO: 15) 5'-GTTTTCCGCAATTGTCGCCAG-3' (SEQ ID NO: 16)
- the polynucleotide fragment and pRSFDuet-1 were digested with the restriction enzymes EcoRI and HindIII, respectively, and then reacted and ligated with Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs) to obtain the pRSF-PaPobA plasmid.
- Primer set for constructing pRSF-CgPobA plasmid 5'-atcaccacagccaggatccgaattcAAATCACGTACCTGTGGC-3' (SEQ ID NO: 18) 5'-ttaagcattatgcggccgcaagcTTACACTTCAAACCGCGG-3' (SEQ ID NO: 19)
- the polynucleotide fragment and pRSFDuet-1 were digested with the restriction enzymes EcoRI and HindIII, respectively, and then reacted and ligated with Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs) to obtain the pRSF-CgPobA plasmid.
- Y393F introduction primer set 5'-CTGTGGCGGGAAAACTACGTGGGACTGC-3' (SEQ ID NO: 10) 5'-GCAGTCCCACGAAGTTTTCCGCCACAG-3' (SEQ ID NO: 11)
- the obtained polynucleotide fragments were treated with the restriction enzyme DpnI and then circularly ligated using T4 Polynucleotide Kinase (Takara Bio Inc.) and Ligation high Ver. 2 (Toyobo Co., Ltd.), and the resulting circular polynucleotide was designated as the pRSF-HgPobA-Y393F plasmid.
- a polynucleotide fragment was obtained by PCR using the T302A introduction primer set with the base sequence shown below and KOD One(R) PCR Master Mix (Toyobo).
- T302A introduction primer set 5'- CATCGTTCCTCCGGCTGGCGCAAAGGG-3' (SEQ ID NO: 12) 5'-CCCTTTGCGCCAGCCGGAGGAACGATG-3' (SEQ ID NO: 13)
- the obtained polynucleotide fragments were treated with the restriction enzyme DpnI and then ligated into a circular form using T4 Polynucleotide kinase (Takara Bio Inc.) and Ligation high Ver. 2 (Toyobo Co., Ltd.), and the resulting circular polynucleotide was named pRSF-HgPobA-T302A/Y393F plasmid (pRSF-HgPobA-TY plasmid).
- Each of the obtained E. coli strains was added to 5 mL of liquid LB medium in a test tube and cultured overnight at 37°C and 180 rpm to prepare a preculture solution.
- 100 mL of sterilized LB liquid medium was prepared by dispensing it into a 500 mL flask with wings, and kanamycin was added to a final concentration of 30 ⁇ g/L.
- the preculture solution was added to this to a final concentration of 1%, and the medium was cultured with shaking at 37°C and 120 rpm.
- the cell-free extract was applied to a HisTrap HP column (GE healthcare) equilibrated with equilibration buffer (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9), 20 mM imidazole), and the fraction eluted with elution solution (20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9), 500 mM imidazole) was collected.
- equilibration buffer 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9), 20 mM imidazole
- the eluted fraction was then loaded onto Amicon(R) Ultra Centrifugal Filters 0.5 mL 10k (Merck Millipore) and washed with buffer to remove imidazole from the protein solution.
- the protein concentration of each purified enzyme solution was measured using Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad, USA) and diluted with buffer to 1 mg/mL to prepare purified enzyme solutions of protocatechuate 5-position oxidase for HgPobA, HyPobA, PoPobA, HgPobA-TY, and PaPobA.
- reaction kinetic analysis was carried out using the purified enzyme solutions of HgPobA, HgPobA-TY, PoPobA, HyPobA and PaPobA described above.
- 100 ⁇ L of reaction solution containing 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9), 10 ⁇ M FAD, 200 ⁇ M NADPH, 1 mM pHBA or 2 mM PCA, and 1 ⁇ g of purified enzyme solution was used.
- the reaction was initiated by adding pHBA or PCA, and the absorbance at 340 nm was measured at 25° C. for 5 minutes using a spectrophotometer U3900 (HITACHI).
- HgPobA, PoPobA and HyPobA showed higher k cat values than PaPobA when PCA was used as a substrate, confirming that they are effective in efficiently producing gallic acid from PCA.
- the kcat value for PCA of HgPobA-TY in which two types of mutations were introduced into HgPobA, was 3.6-fold higher than that of PaPobA, and the Km value was also less than one-third that of PaPobA, demonstrating that the introduction of mutations can further improve the excellent properties of this enzyme as a PCA hydroxylase that hydroxylates PCA.
- the k cat values of PoPobA and HyPobA for pHBA are 1/10 to 1/20 times that of PaPobA, and the k cat values for PCA are 6 to 12 times that of PaPobA. Therefore, the reaction of producing gallic acid from PCA can proceed more preferentially than the reaction of producing PCA from pHBA, and an improvement in the yield of gallic acid in the reaction solution can be expected.
- Gallic acid production activity was analyzed using the purified enzyme solutions of HyPobA, PoPobA, HgPobA-TY, and PaPobA described above. 10 ⁇ M FAD, 0.5 mM NADPH, 2 mM PCA, and 10 ⁇ g of purified enzyme solution were added to 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9) to prepare 100 ⁇ L of reaction solution. After reacting for 30 minutes at 30° C., the concentration of the produced gallic acid was measured using HPLC (1200 Infinity Series: Hewlett Packerd).
- Figure 2 shows the results, with the activity of PaPobA to produce gallic acid from PCA being taken as 1, and the relative activity of each enzyme to produce gallic acid from PCA.
- HgPobA-TY can produce 8 times more gallic acid
- HyPobA and PoPobA can produce 20 times more gallic acid.
- Example 2 Production of Gallic Acid by Fermentation Using Microbial Strains
- (1) Preparation of Corynebacterium Strains Introduced with Genes Encoding Protocatechuate 5-Oxidase Genes encoding HyPobA, PoPobA, HgPobA-TY, and CgPobA were introduced into the CT07 strain, which was genetically modified according to the following procedure based on Corynebacterium glutamicum ATCC13032, a strain known to produce PCA from glucose.
- DNA containing the above gene promoter region in the gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 was synthesized and replaced with the promoter of elongation factor Tu.
- the base sequence of the region including cg0643 to cg0644 to cg0645 was used for ppsA (cg0644), the region including cg1127 to cg1128 to cg1129 for aroF fbr (cg1129), the region including cg2393 to cg2392 to cg2391 for aroG (cg2391), and the region including cg0500 to cg0501 for the qsuABCD operon (cg0501, cg0502, cg0503, cg0504).
- DNA was synthesized that had the promoter region of each of the above genes replaced with the promoter of the elongation factor Tu gene, and had SbfI recognition sequences attached to both ends of the DNA.
- Each of the resulting DNAs was digested with SbfI and inserted into the SbfI site of pHG0 shown below to construct a plasmid for homologous recombination.
- This plasmid was introduced into Corynebacterium glutamicum ATCC13032 to construct a strain in which the promoter of each gene was replaced with the elongation factor Tu promoter.
- aroF fbr was constructed by introducing a P155L mutation into the aroF gene during gene synthesis.
- the base sequence of the cg2629-cg2630-cg2631-cg2633 region containing the protocatechuic acid decomposition gene pcaHG (cg2631, cg2630) was obtained from the public database, and a base sequence was designed in which only the pcaHG (cg2631, cg2630) portion was deleted from this base sequence, and a gene was synthesized in which SbfI sequences were attached to both ends of this base sequence.
- the synthesized gene was digested with SbfI and inserted into the SbfI site of pHG0 constructed below to construct a plasmid for homologous recombination.
- This plasmid was introduced into the Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain into which the promoter of elongation factor Tu had been introduced, and the pcaHG gene on the chromosome of the Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain was homologously recombined with the pcaHG gene on the chromosome to delete the pcaHG gene on the chromosome of the Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain.
- the strain obtained by these steps was named CT07 strain.
- the cg0658 gene (sequence number 33) was extracted from the genome of Corynebacterium glutamicum ATCC13032, and the polynucleotide fragment of cg0658 was prepared by PCR using a set of the following primers with a SacI sequence attached and a primer with an XbaI sequence attached, and the polynucleotide fragment was then digested with the SacI and XbaI restriction enzymes. The polynucleotide fragment of cg0658 was then introduced into the SacI and XbaI sites of the vector pHG0, which had been digested with the SacI and XbaI restriction enzymes. This vector was named pHG0_0658.
- Polynucleotide fragments having a sequence in which the kanamycin resistance gene promoter (SEQ ID NO: 36) is linked to HypobA (SEQ ID NO: 4), PopobA (SEQ ID NO: 7), HgPobA_TY (SEQ ID NO: 37) or CgPobA (SEQ ID NO: 17) were obtained by artificial gene synthesis.
- kanamycin resistance gene promoter SEQ ID NO: 36
- PopobA SEQ ID NO: 7
- HgPobA_TY SEQ ID NO: 37
- CgPobA SEQ ID NO: 17
- a polynucleotide fragment consisting of HyPobA linked to a kanamycin resistance gene promoter was used as a template, and a polynucleotide fragment was obtained by PCR amplification using a kanamycin resistance gene promoter amplification Fw primer (sequence number 38) with an XbaI sequence introduced and a Rv primer (sequence number 39) with a HyPobASalI sequence introduced.
- XbaI sequence-introduced kanamycin resistance gene promoter amplification Fw primer 5'-GAGCTCATGCGCACCCAGGTTGGTATC -3' (SEQ ID NO: 38)
- a polynucleotide fragment consisting of PoPobA linked to a kanamycin resistance gene promoter was used as a template, and a polynucleotide fragment was obtained by PCR amplification using the XbaI sequence-introduced kanamycin resistance gene promoter amplification Fw primer (sequence number 38) and the PoPobASalI sequence-introduced Rv primer (sequence number 40).
- a polynucleotide fragment consisting of HgPobA-TY linked to a kanamycin resistance gene promoter was used as a template, and a polynucleotide fragment was obtained by PCR amplification using the XbaI sequence-introduced kanamycin resistance gene promoter amplification Fw primer (sequence number 38) and the HgPobA_SalI sequence-introduced Rv primer (sequence number 41).
- a polynucleotide fragment consisting of CgPobA linked to a kanamycin resistance gene promoter was used as a template, and a polynucleotide fragment was obtained by PCR amplification using the XbaI sequence-introduced kanamycin resistance gene promoter amplification Fw primer (sequence number 38) and the CgPobA_SalI sequence-introduced Rv primer (sequence number 42).
- the above four polynucleotide fragments obtained by PCR were digested with XbaI and SalI, and the digested DNA fragments related to protocatechuate 5-oxidase were recovered using a DNA recovery column (Gel/PCR Extraction Kit, manufactured by Nippon Genetics Co., Ltd.).
- the genome editing vector pHG0_0658 was digested with XbaI and SalI, and the digested pHG0_0658 was recovered using a DNA recovery column (Gel/PCR Extraction Kit manufactured by Nippon Genetics Co., Ltd.).
- the digested pHG0_0658 and the digested DNA fragment related to the protocatechuate 5-position oxidase described above were each ligated using Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs) to obtain a vector into which the four enzyme expression units shown below were introduced.
- preculture solutions were inoculated at 1% in CGXII medium (pH 7.0) containing 5% glucose, and cultured at 30°C for 72 hours with shaking.
- the culture solutions were appropriately diluted, and the concentrations of protocatechuic acid and gallic acid produced were measured using HPLC (1200 infinity series: Hewlett Packard).
- the CT07 strain produced 7.3 g/L of protocatechuic acid, but did not produce gallic acid (GA) because it did not express PobA.
- the CG07-CG strain expressing CgPobA produced 7.5 g/L of protocatechuic acid and 0.0001 g/L of gallic acid.
- the CG07-HG strain expressing HgPobA-TY produced 5.5 g/L of protocatechuic acid and 0.65 g/L of gallic acid.
- the CG07-HY strain carrying HyPobA produced 7.3 g/L of protocatechuic acid and 0.03 g/L of gallic acid.
- the CG07-PO strain carrying PoPobA produced 7.3 g/L of protocatechuic acid and 0.0004 g/L of gallic acid.
- the production rate of gallic acid is as shown in the table below, assuming that CG07-CG, which possesses the known enzyme CgPobA, is 1.
- CgPobA-TY By using HgPobA-TY, it is now possible to produce 6,500 times more gallic acid (GA) than before.
- the enzymes that maximize the fermentation production of gallic acid are CgPobA and PaPobA, and it has been reported that the amount of gallic acid produced when both are used is equivalent.
- the protocatechuate 5-oxidase derived from a microorganism of the Comamonadaceae family according to the present invention it is expected that the yield of gallic acid can be significantly improved compared to when CgPobA is used.
- the sequence of the protocatechuate 5-oxidase according to the present invention the yield of gallic acid in the fermentation liquid can be further improved.
- gallic acid can be produced using a medium that uses glucose as a substrate, it is expected that the production costs of gallic acid can be reduced.
- Example 2 by utilizing HgPobA-TY, 6,500 times more gallic acid was produced than by the technique using the CG07-CG strain obtained by introducing CgPobA. This indicates that the mutations that have been known to increase the production of gallic acid when introduced into PobA are also effective for HgPobA.
- the culture solutions were appropriately diluted, and the concentrations of protocatechuic acid and gallic acid produced were measured using HPLC (1200 Infinity Series: Hewlett Packerd), confirming that gallic acid was produced even under culture conditions of pH 4.0 for the CG07-HY strain, CG07-PO strain, and CG07-HG strain.
- HPLC Hewlett Packerd
- Example 3 Production of Gallic Acid by Scale-up
- the CG07-HG strain expressing HgPobA-TY was cultured overnight at 30° C. with shaking in an LB liquid medium containing ⁇ g/L of kanamycin to prepare a preculture solution.
- CGXII medium was prepared by adding 5% glucose to a jar fermenter (Marubishi Bio Engineering, product name MDL-8C), and the preculture solution was inoculated and cultured at 30°C for 56 hours at pH 6.8. As a result, 0.7 g/L of protocatechuic acid and 15.1 g/L of gallic acid were produced 56 hours into the culture. Judging from this production level, the developed fermentation production system can be used for practical production. Furthermore, it is expected that the production amount of gallic acid can be further improved by optimizing the culture conditions of the fermentation production system.
- the fungus bodies were removed by centrifugation or filtration.
- the culture filtrate was adjusted to a pH of 4.0 or less using sulfuric acid or the like.
- Insoluble proteins and other substances generated during this process were removed by centrifugation, and the resulting solution was cooled with appropriate stirring to obtain crystals of gallic acid. The crystals were collected by centrifugation.
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Abstract
本技術はプロトカテク酸から没食子酸を効率的に生成することができるプロトカテク酸５位酸化活性を有するタンパク質及び該タンパク質を発現する微生物菌株を提供することを目的とする。 コマモナス属の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質を用いることでプロトカテク酸から没食子酸の効率的な生成し得る。また、当該酵素をコードする遺伝子を導入した微生物菌株を用いた発酵により、プロトカテク酸から没食子酸を製造し得る。
Description
本技術は、特定の芳香族水酸化酵素に係る遺伝子を導入した微生物菌株、特定の芳香族水酸化酵素であるタンパク質、前記微生物又は前記タンパク質を用いた没食子酸を製造する方法に関する。
没食子酸 (Ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄ， ＧＡ) は、五倍子、没食子、ハマメリス、茶の葉、オークの樹皮など多くの植物に含まれているフェノール性化合物である。没食子酸は分子内にヒドロキシ基を3つもつため、高い抗酸化作用を示し、抗酸化剤として利用されている。また、没食子酸の誘導体は、接着剤、コーティング剤、電子部材関連の製品として利用される。また、没食子酸のエステル体は多くの食品用の添加物としても広く利用されている。没食子酸は年間８０００トン以上の需要が見込まれ、その需要が増加している。
現在、没食子酸は、五倍子や没食子を始めとする植物原料から工業的に生産されている。このため、収穫ごとの原料の供給量が安定せず、価格が上昇する要因となっている。増加する没食子酸の需要に対応して安定かつ安価に没食子酸を製造するため、糖等を基質とした微生物発酵による製造方法が期待されている。
微生物発酵による製造方法は、有機溶媒や重金属、強酸、強アルカリを利用せず、デンプンやセルロースなど持続可能な植物バイオマスを利用できる事から化学合成を用いた製造方法と比べて環境負荷が小さい。また、培養条件を制御することで安定的な生産が可能となるため、植物細胞による生産と比較して安価に対象物を提供することが期待できる。
しかし、図３に示す、微生物を用いた糖（グルコース）からの没食子酸の生成経路において、p-ヒドロキシ安息香酸 （ｐＨＢＡ）からプロトカテク酸（ＰＣＡ）を生成するp-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ＰｏｂＡ）は知られているものの、没食子酸の前駆体であるプロトカテク酸から選択的に没食子酸を生成できる酵素は知られていない。
例えば、下記特許文献１には、シュードモナス・プチダＫＴ２４４０由来、ノボスフィンゴビウム・アロマティカボランスＤＳＭ １２４４４由来のp-ヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する酵素であるp-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ＰｏｂＡ）を発現する微生物を用いたプロトカテク酸から没食子酸を生成する方法を開示するが、p-ヒドロキシ安息香酸からプロトカテク酸を生成する反応がプロトカテク酸から没食子酸を生成する反応に対して優位に進行するため、プロトカテク酸に対し、没食子酸の割合が十分に上がらない。
そこで、本技術はプロトカテク酸から没食子酸を効率的に生成することができるプロトカテク酸５位酸化活性を有するタンパク質及び該タンパク質を発現する微生物菌株を提供することを主目的とする。
本発明者らは鋭意研究した結果、コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質を用いることが、プロトカテク酸から没食子酸の効率的な生成に有用であることを見出した。
すなわち、本技術は以下を提供する。
［１］コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入した微生物菌株。
［２］前記コマモナス科の微生物が、Ｈｙｌｅｍｏｅｎｅｌｌａ属、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属から選ばれる微生物である、［１］に記載の微生物菌株。
［３］前記微生物菌株が、エシェリヒア属、ロドコッカス属、アシネトバクター属、ブラディリゾビウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、ロドシュードモナス属、シノリゾビウム属、ブレビバクテリウム属、ノボスフィンゴビウム属またはラルストニア属から選ばれる微生物菌株である、［１］又は［２］に記載の微生物菌株。
［４］［１］から［３］のいずれかに記載の微生物菌株を用いた発酵により、プロトカテク酸から没食子酸を製造する方法。
［５］グルコースを含有する培地において、［１］から［３］のいずれかに記載の微生物菌株を用いた発酵により没食子酸を製造する方法。
［６］ｐＨ６．０以下の培地を用いて発酵を行う、［４］又は［５］に記載の没食子酸を製造する方法。
［７］１５℃～４５℃の条件で発酵を行う、［４］から［６］のいずれかに記載の没食子酸を製造する方法。
［８］コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質を用いた、プロトカテク酸から没食子酸を製造する方法。
［９］コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質の１９９～２０９位のロイシンがバリンまたはグリシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
［１０］コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質の２９４～３０４位のトレオニンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
［１１］さらに、３８５～３９５位のチロシンがフェニルアラニン、バリンまたはアラニンに置換された、［９］又は［１０］に記載のタンパク質。
［１］コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入した微生物菌株。
［２］前記コマモナス科の微生物が、Ｈｙｌｅｍｏｅｎｅｌｌａ属、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属から選ばれる微生物である、［１］に記載の微生物菌株。
［３］前記微生物菌株が、エシェリヒア属、ロドコッカス属、アシネトバクター属、ブラディリゾビウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、ロドシュードモナス属、シノリゾビウム属、ブレビバクテリウム属、ノボスフィンゴビウム属またはラルストニア属から選ばれる微生物菌株である、［１］又は［２］に記載の微生物菌株。
［４］［１］から［３］のいずれかに記載の微生物菌株を用いた発酵により、プロトカテク酸から没食子酸を製造する方法。
［５］グルコースを含有する培地において、［１］から［３］のいずれかに記載の微生物菌株を用いた発酵により没食子酸を製造する方法。
［６］ｐＨ６．０以下の培地を用いて発酵を行う、［４］又は［５］に記載の没食子酸を製造する方法。
［７］１５℃～４５℃の条件で発酵を行う、［４］から［６］のいずれかに記載の没食子酸を製造する方法。
［８］コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質を用いた、プロトカテク酸から没食子酸を製造する方法。
［９］コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質の１９９～２０９位のロイシンがバリンまたはグリシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
［１０］コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質の２９４～３０４位のトレオニンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
［１１］さらに、３８５～３９５位のチロシンがフェニルアラニン、バリンまたはアラニンに置換された、［９］又は［１０］に記載のタンパク質。
本技術に従う微生物菌株は、プロトカテク酸からの没食子酸の収率が向上し、没食子酸を効率的に生成し得る。
本技術に従う微生物菌株を用いた発酵により、プロトカテク酸からの没食子酸の収率が向上し、没食子酸を効率的に生成し得る。
本技術に従うプロトカテク酸５位酸化を有するタンパク質を用いることで、プロトカテク酸からの没食子酸の収率が向上し、没食子酸を効率的に生成し得る。
なお、本技術の効果は、ここに記載された効果に限定されず、本明細書内に記載されたいずれかの効果であってもよい。
本技術に従う微生物菌株を用いた発酵により、プロトカテク酸からの没食子酸の収率が向上し、没食子酸を効率的に生成し得る。
本技術に従うプロトカテク酸５位酸化を有するタンパク質を用いることで、プロトカテク酸からの没食子酸の収率が向上し、没食子酸を効率的に生成し得る。
なお、本技術の効果は、ここに記載された効果に限定されず、本明細書内に記載されたいずれかの効果であってもよい。
以下に本技術の好ましい実施形態について説明する。ただし、本技術は以下の好ましい実施形態のみに限定されず、本技術の範囲内で自由に変更することができる。
本技術の微生物菌株は、コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入した微生物菌株である。
本技術のプロトカテク酸５位酸化酵素の由来となるコマモナス科の微生物を図２に基づき説明する。当該コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素を用いることでプロトカテク酸を没食子酸に高い効率で変換することができる。
当該コマモナス科の微生物は、上記特徴を満たすものであれば特に限定されるものではないが、図１で系統解析の結果で挙げられた属のうち、ハイルモネラ（Ｈｙｌｅｍｏｎｅｌｌａ）属、リムノハビタンス（Ｌｉｍｎｏｈａｂiｔａｎｓ）属、ロドフェラックス（Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ）属、キシロフィラス（Ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）属、ラムリバクター（Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ）属、ポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属、ハイドロゲノファガ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ）属が好ましく、ハイルモネラ（Ｈｙｌｅｍｏｎｅｌｌａ）属、ポラロモナス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ）属、ハイドロゲノファガ（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ）属が特に好ましい。
Ｈｙｌｅｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ由来ＰｏｂＡ (ＨｇＰｏｂＡ)のアミノ酸配列情報（配列番号２０）
Ｌｉｍｎｏｈａｂｉｔａｎｓ ｓｐ．由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号２３）
Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ ｓｅｄｉｍｉｎｓ由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号２４）
Ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ａｍｐｅｌｉｎｕｓ由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号２５）
Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ ｈｅｎｃｈｉｒｅｎｓｉｓ由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号２６）
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｉ由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号２７）
Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ ｓｐ．由来ＰｏｂＡ（ＨｙＰｏｂＡ）のアミノ酸配列情報（配列番号２１）
Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来ＰｏｂＡ （ＰｏＰｏｂＡ）のアミノ酸配列情報（配列番号２２）
Ｌｉｍｎｏｈａｂｉｔａｎｓ ｓｐ．由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号２３）
Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ ｓｅｄｉｍｉｎｓ由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号２４）
Ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ａｍｐｅｌｉｎｕｓ由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号２５）
Ｒａｍｌｉｂａｃｔｅｒ ｈｅｎｃｈｉｒｅｎｓｉｓ由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号２６）
Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｐｈｏｓｐｈａｔｉ由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号２７）
Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ ｓｐ．由来ＰｏｂＡ（ＨｙＰｏｂＡ）のアミノ酸配列情報（配列番号２１）
Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来ＰｏｂＡ （ＰｏＰｏｂＡ）のアミノ酸配列情報（配列番号２２）
本技術の微生物菌株で発現させるコマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入してもよいが、当該プロトカテク酸５位酸化酵素がプロトカテク酸を水酸化し没食子酸を生成する活性を保持できる範囲でアミノ酸配列を変更したタンパク質をコードする遺伝子を導入してもよい。当該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列に対し、好ましくは７０％以上の同一性を有し、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上、さらに好ましくは９９．７％以上の同一性を有するタンパク質は、プロトカテク酸を水酸化し没食子酸を生成する活性を保持し得るため、本技術に係るプロトカテク酸５位酸化酵素との相同性が高いと考えられる。
本技術において微生物菌株へ導入する遺伝子の形態は、特に限定されないが、例えば、前述のプロトカテク酸５位酸化酵素やタンパク質をコードするポリヌクレオチドや、当該ポリヌクレオチドを配列中に含むベクター等を用いることができる。
本技術におけるプロトカテク酸５位酸化酵素等のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、プロトカテク酸５位酸化酵素等のタンパク質をコードする領域に対する上流領域（ポリヌクレオチド鎖の５’末端側の領域）に作動可能に連結された制御領域を含むことが好ましい。当該制御領域は、好ましくはプロモーターを含み、さらに当該プロモーターの転写活性を向上させるシスエレメント、ターミネーターなどを含んでいてもよい。加えて、当該ポリヌクレオチドは薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子等の選択マーカー遺伝子を含ませることで遺伝子を導入された微生物菌株を効率的にスクリーニングすることができる。
さらに、本技術におけるプロトカテク酸５位酸化酵素等のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの両末端に制限酵素認識配列を設けることで、制限酵素法により、当該ポリヌクレオチドをベクターに導入することもできる。
本技術に使用し得るベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、コスミド、ファスミド、ファージ、トランスポゾン、ＢＡＣベクター等の任意のベクターであってもよい。また当該ベクターは、遺伝子を導入する微生物菌株の細胞内の染色体に導入するためのベクターであっても、染色体外に保持されるベクターであってもよいが、当該微生物菌株の細胞内で増幅可能なものが好ましい。本技術に使用し得るベクターは限定されるものではないが、細菌用ベクターが好ましく、遺伝子を導入する微生物菌株用のベクターがより好ましい。
本技術において、遺伝子を導入する微生物菌株としては、特に限定されないが、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ブラディリゾビウム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、シノリゾビウム（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノボスフィンゴビウム（Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）属またはラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属に属する微生物菌株が好ましく、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属が特に好ましい。
微生物菌株への前記遺伝子の導入方法は、特に限定されないが、一般的な形質転換方法、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ６９， ２１１０ （１９７２）〕、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６， ６１２７ （１９８８）〕、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法などの周知の形質転換技術を適用することができる。
本技術の微生物菌株を用いた発酵により、プロトカテク酸から没食子酸を好適に生成することができる。本技術の微生物菌株を用いた発酵は、特に限定されないが、例えば、本技術の微生物菌株を前培養として培養した培養液を発酵に用いる培地に加えることで好適に進行させることができる。
本技術の微生物菌株の前培養に用いる培地は、遺伝子を導入する微生物菌株に一般的に用いられる培地を好適に用いることができる。例えば、遺伝子を導入する微生物菌株がエシェリヒア属の場合、ＬＢ培地、Ｍ９培地等を用いて好適に培養することができ、培養温度は１５℃～４５℃、培養時間は１日～７日等の条件が挙げられる。遺伝子を導入する微生物菌株がコリネバクテリウム属の場合、ＬＢ培地、ＣＧＸII培地（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９３，１７５：５５９５－５６０３）等を用いて好適に培養することができ、培養温度は１５℃～４５℃、培養時間は１日～７日等の条件が挙げられる。
発酵に係る工程の前に前培養を行うことで、対数増殖期にある微生物菌株を用いて効率的にプロトカテク酸から没食子酸を好適に生成することができる。
発酵に係る工程の前に前培養を行うことで、対数増殖期にある微生物菌株を用いて効率的にプロトカテク酸から没食子酸を好適に生成することができる。
本技術の微生物菌株の発酵に用いる培地は、図３に示す没食子酸の生成経路において没食子酸の前駆体となる化合物を基質として含むものであれば特に限定されない。なお、培地中に含まれる没食子酸の前駆体となる化合物は、図３に示す没食子酸の生成経路に示された化合物を直接含んでもよく、例えば、図３に示す没食子酸の生成経路に示された化合物であるプロトカテク酸等の前駆体となり得るテレフタル酸、フタル酸、イソフタル酸等の化合物を含ませてもよい。
本技術の微生物菌株の発酵に用いる培地に含ませる基質としては、没食子酸の製造コストを低減する観点からは、グルコースを含有する培地を用いることが好ましい。グルコースを含有する培地としては、前述の遺伝子を導入する微生物菌株に一般的に用いられる培地にグルコースを１～１０％、好ましくは３～７％程度加えることにより調整することができる。
例えば、遺伝子を導入する微生物菌株がコリネバクテリウム属の場合、ＣＧＸII培地又はＬＢ培地にグルコースを加えた培地で、培養温度は１５℃～４５℃、培養時間は１日～７日等の条件で好適に発酵を進行させることができる。また、遺伝子を導入する微生物菌株がエシェリシア属の場合、グルコースを加えたＬＢ培地あるいは、発酵生産用培地（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ， ２０１６， ６．１： １－９.）で、培養温度は２８℃～３７℃、培養時間は１日～７日等の条件で好適に発酵を進行させることができる。
本技術の微生物菌株の発酵に用いる培地のｐＨを低くすることで、発酵液からの没食子酸を回収する工程において、没食子酸を結晶化させるために用いる硫酸、塩酸等の酸の使用量を減少させることができる。また、本技術の微生物菌株の発酵に用いる培地のｐＨを低くすることで、本技術の微生物菌株以外の菌株が混入することで、目的の発酵の進行が阻害されるリスクを低減することができる。
例えば、培養において典型的な発酵液のｐＨは６．５～７．５であり、この際使用する硫酸の量は１３～１６g/Lと想定されるが、 培養液のｐＨ５．０とした場合、使用する硫酸の量を５～８g/Lと想定でき、硫酸の使用量の削減できる。
本技術の微生物菌株の発酵に用いる培地のｐＨとしては、例えば、６．０以下が好ましく、５．０以下がさらに好ましい。
また、本技術に用いるコマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素は３７℃以上の温度域においても酵素活性を維持することが期待できるため、本技術の微生物菌株を用いた発酵における温度条件を好ましくは３５℃～４５℃、さらに好ましくは３７℃～４０℃の高温域とすることもできる。
本技術に用いるコマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素は、前述の通り、当該プロトカテク酸５位酸化酵素をコードする遺伝子を導入する微生物菌株を用いた系で発現させることもできるが、当該プロトカテク酸５位酸化酵素をコードする遺伝子又はその転写産物にアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系で発現させてもよい。
本技術においては、前記の微生物菌株を用いた系又はｉｎ ｖｉｔｒｏの系で発現させたコマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質を用いてプロトカテク酸から没食子酸を生成することもできる。
この場合、プロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質は、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、細胞の破砕、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、微生物菌株の培養液、細胞破砕液、ｉｎ ｖｉｔｒｏの系の反応液などから好適に回収することができる。
本技術のプロトカテク酸５位酸化酵素は、コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素と同一のアミノ酸配列の酵素を用いることもできるが、アミノ酸配列を変異させた酵素を用いることもできる。
例えば、当該酵素に係るポリペプチド鎖のＮ末端側を始点として１９９～２０９位、好ましくは１９９位～２００位に配置されたロイシンをバリンまたはグリシンに置換させることで、プロトカテク酸から没食子酸を生成する際の活性が向上する場合がある。
また、当該酵素に係るポリペプチド鎖のＮ末端側を始点として２９４～３０４位、好ましくは２９４位又は３０２位のトレオニンをアラニンに置換させることで、プロトカテク酸から没食子酸を生成する際の活性が向上する場合がある。
さらには、当該酵素に係るポリペプチド鎖のＮ末端側を始点として３８５～３９５位、好ましくは３８５位又は３９３位のチロシンをフェニルアラニン、バリンまたはアラニンに置換させることで、プロトカテク酸から没食子酸を生成する際の活性が向上する場合がある。
本技術において、プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列の変異箇所は、上記説明で例示したものを単独又は適宜組み合わせて導入することもできるが、上記の例示に限らず、ポリペプチド鎖中の任意のアミノ酸残基の他のアミノ酸への置換、ポリペプチド鎖中の任意のアミノ酸残基の欠損、又はポリペプチド鎖中の任意の位置に新たなアミノ酸残基を挿入することでアミノ酸配列を変異させた酵素を設計することができる。
アミノ酸配列を変異させた酵素は、例えば、本技術のプロトカテク酸５位酸化酵素をコードする遺伝子に周知の部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。周知の部位特異的変異導入法としては、例えば、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いてインバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。
前記変異用プライマーは、標的遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。
本技術において、微生物菌株を用いた発酵によりプロトカテク酸から没食子酸を生成する場合には、その発酵液、プロトカテク酸５位酸化酵素を用いてプロトカテク酸から没食子酸を生成する場合には、その反応液から没食子酸を回収する。
没食子酸の回収方法は、特に限定されないが、例えば、前述の発酵液又は反応液を硫酸、塩酸等の酸によってｐＨ４．０以下に調整する。ｐＨ調整によって発生した不溶性タンパク質を遠心又は濾過等の方法により除去する。除去後の液を適宜攪拌しながら、４℃以下に冷却させることで得た没食子酸の結晶を遠心又は濾過の方法により好適に回収することができる。 また、前述のｐＨ４．０以下に調整することに代えて、前述の発酵液又は反応液をベンゼン、トルエン、ジクロロメタン、クロロホルム、ジエチルエーテル、酢酸エチルなどの有機溶媒と混合した後、有機溶媒層を回収し蒸発させることによっても没食子酸の結晶を好適に回収することができる。
以下、実施例を用いて本技術を更に具体的に説明する。なお、本技術は、以下に示す実施例の内容に、何ら限定されるものではない。
実施例１ プロトカテク酸５位酸化酵素の調整及び活性測定
（１）プロトカテク酸５位酸化酵素発現用プラスミドの構築
＜１＞ｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡプラスミドの構築
Ｈｙｌｅｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ由来ＰｏｂＡ (ＨｇＰｏｂＡ)の遺伝子配列情報（配列番号１）を基に、Ｈｙｌｅｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ由来ＰｏｂＡをコードするポリヌクレオチドを人工的に合成した。当該ポリヌクレオチドを鋳型とし、下記に示す塩基配列を有するプライマー１及び２、ＫＯＤ Ｏｎｅ(R) ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （東洋紡株式会社） を用いてＰＣＲにより、ポリヌクレオチド断片を得た。
（１）プロトカテク酸５位酸化酵素発現用プラスミドの構築
＜１＞ｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡプラスミドの構築
Ｈｙｌｅｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ由来ＰｏｂＡ (ＨｇＰｏｂＡ)の遺伝子配列情報（配列番号１）を基に、Ｈｙｌｅｍｏｎｅｌｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ由来ＰｏｂＡをコードするポリヌクレオチドを人工的に合成した。当該ポリヌクレオチドを鋳型とし、下記に示す塩基配列を有するプライマー１及び２、ＫＯＤ Ｏｎｅ(R) ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （東洋紡株式会社） を用いてＰＣＲにより、ポリヌクレオチド断片を得た。
プライマー１（配列番号２）
（５‘－ａｔｃａｃｃａｃａｇｃｃａｇｇａｔｃｃｇａａｔｔｃＡＡＧＣＴＡＴＣＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＧ－３’）
プライマー２（配列番号３）
（５‘－ｔｔａａｇｃａｔｔａｔｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｃｔｔＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＧ－３’）
（５‘－ａｔｃａｃｃａｃａｇｃｃａｇｇａｔｃｃｇａａｔｔｃＡＡＧＣＴＡＴＣＣＣＡＣＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＧ－３’）
プライマー２（配列番号３）
（５‘－ｔｔａａｇｃａｔｔａｔｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｃｔｔＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＧ－３’）
前記ポリヌクレオチド断片とｐＲＳＦＤｕｅｔ－１とをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて消化した後、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて反応させ、連結させることで、ｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡプラスミドを得た。
＜２＞ｐＲＳＦ－ＨｙＰｏｂＡプラスミドの構築
同様の手順で、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ ｓｐ．由来ＰｏｂＡ（ＨｙＰｏｂＡ）の遺伝子配列情報（配列番号４）を基に、目的とするｐＲＳＦ－ＰｏＰｏｂＡプラスミドを得た。用いたプライマー３及び４の塩基配列を下記に示す。
同様の手順で、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ ｓｐ．由来ＰｏｂＡ（ＨｙＰｏｂＡ）の遺伝子配列情報（配列番号４）を基に、目的とするｐＲＳＦ－ＰｏＰｏｂＡプラスミドを得た。用いたプライマー３及び４の塩基配列を下記に示す。
プライマー３（配列番号５）
（５‘－ ａｔｃａｃｃａｃａｇｃｃａｇｇａｔｃｃｇａａｔｔｃＧＣＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＧＧＣＡＴ－３’）、
プライマー４（配列番号６）
（５‘－ｔｔａａｇｃａｔｔａｔｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｃＴＴＡＴＴＣＡＡＴＣＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＣＧ －３’）
（５‘－ ａｔｃａｃｃａｃａｇｃｃａｇｇａｔｃｃｇａａｔｔｃＧＣＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＧＧＣＡＴ－３’）、
プライマー４（配列番号６）
（５‘－ｔｔａａｇｃａｔｔａｔｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｃＴＴＡＴＴＣＡＡＴＣＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＡＣＧ －３’）
＜３＞ｐＲＳＦ－ＰｏＰｏｂＡプラスミドの構築
同様の手順で、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来ＰｏｂＡ （ＰｏＰｏｂＡ）の遺伝子配列情報（配列番号７）を基に、目的とするｐＲＳＦ－ＰｏＰｏｂＡプラスミドを得た。用いたプライマー５及び６の塩基配列を下記に示す。
同様の手順で、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来ＰｏｂＡ （ＰｏＰｏｂＡ）の遺伝子配列情報（配列番号７）を基に、目的とするｐＲＳＦ－ＰｏＰｏｂＡプラスミドを得た。用いたプライマー５及び６の塩基配列を下記に示す。
プライマー５（配列番号８）
（５‘－ａｔｃａｃｃａｃａｇｃｃａｇｇａｔｃｃｇａａｔｔｃＧＣＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＴＧＧＴＡＴＣ －３’）
プライマー６（配列番号９）
（５‘－ ｔｔａａｇｃａｔｔａｔｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｃＴＴＡＧＴＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＣＣ－３’）
（５‘－ａｔｃａｃｃａｃａｇｃｃａｇｇａｔｃｃｇａａｔｔｃＧＣＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＴＧＧＴＡＴＣ －３’）
プライマー６（配列番号９）
（５‘－ ｔｔａａｇｃａｔｔａｔｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｃＴＴＡＧＴＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＣＣ－３’）
＜４＞ｐＲＳＦ－ＰａＰｏｂＡプラスミドの構築（比較対象１）
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来ＰｏｂＡ (ＰａＰｏｂＡ)の遺伝子配列情報（配列番号１４）を基に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来ＰｏｂＡをコードするポリヌクレオチドを人工的に合成した。当該ポリヌクレオチドを鋳型とし、下記に示す塩基配列を有するプライマーセット、ＫＯＤ Ｏｎｅ(R) ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （東洋紡株式会社） を用いてＰＣＲにより、ポリヌクレオチド断片を得た。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来ＰｏｂＡ (ＰａＰｏｂＡ)の遺伝子配列情報（配列番号１４）を基に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来ＰｏｂＡをコードするポリヌクレオチドを人工的に合成した。当該ポリヌクレオチドを鋳型とし、下記に示す塩基配列を有するプライマーセット、ＫＯＤ Ｏｎｅ(R) ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （東洋紡株式会社） を用いてＰＣＲにより、ポリヌクレオチド断片を得た。
ｐＲＳＦ－ＰａＰｏｂＡプラスミド構築用プライマーセット
５‘－ＴＴＣＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＴＡＴＧＡＧＧ－３’（配列番号１５）
５‘－ＧＴＴＴＴＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＣＧＣＣＡＧ－３’（配列番号１６）
５‘－ＴＴＣＧＴＣＧＧＴＣＴＧＣＣＧＴＡＴＧＡＧＧ－３’（配列番号１５）
５‘－ＧＴＴＴＴＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＣＧＣＣＡＧ－３’（配列番号１６）
前記ポリヌクレオチド断片とｐＲＳＦＤｕｅｔ－１とをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて消化した後、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて反応させ、連結させることで、ｐＲＳＦ－ＰａＰｏｂＡプラスミドを得た。
＜５＞ｐＲＳＦ－ＣｇＰｏｂＡプラスミドの構築（比較対象２）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来ＰｏｂＡ (ＣｇＰｏｂＡ)の遺伝子配列情報（配列番号１７）を基に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来ＰｏｂＡをコードするポリヌクレオチドを人工的に合成した。当該ポリヌクレオチドを鋳型とし、下記に示す塩基配列を有するプライマーセット、ＫＯＤ Ｏｎｅ(R) ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （東洋紡株式会社） を用いてＰＣＲにより、ポリヌクレオチド断片を得た。
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来ＰｏｂＡ (ＣｇＰｏｂＡ)の遺伝子配列情報（配列番号１７）を基に、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来ＰｏｂＡをコードするポリヌクレオチドを人工的に合成した。当該ポリヌクレオチドを鋳型とし、下記に示す塩基配列を有するプライマーセット、ＫＯＤ Ｏｎｅ(R) ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （東洋紡株式会社） を用いてＰＣＲにより、ポリヌクレオチド断片を得た。
ｐＲＳＦ－ＣｇＰｏｂＡプラスミド構築用プライマーセット
５‘－ａｔｃａｃｃａｃａｇｃｃａｇｇａｔｃｃｇａａｔｔｃＡＡＡＴＣＡＣＧＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣ－３’（配列番号１８）
５‘－ｔｔａａｇｃａｔｔａｔｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｃＴＴＡＣＡＣＴＴＣＡＡＡＣＣＧＣＧＧ－３’（配列番号１９）
５‘－ａｔｃａｃｃａｃａｇｃｃａｇｇａｔｃｃｇａａｔｔｃＡＡＡＴＣＡＣＧＴＡＣＣＴＧＴＧＧＣ－３’（配列番号１８）
５‘－ｔｔａａｇｃａｔｔａｔｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｃＴＴＡＣＡＣＴＴＣＡＡＡＣＣＧＣＧＧ－３’（配列番号１９）
前記ポリヌクレオチド断片とｐＲＳＦＤｕｅｔ－１とをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIIIを用いて消化した後、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて反応させ、連結させることで、ｐＲＳＦ－ＣｇＰｏｂＡプラスミドを得た。
（２）プロトカテク酸５位酸化酵素の変異タンパク質の発現用プラスミドの構築
＜１＞ｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡ‐Ｔ３０２Ａ／Ｙ３９３Ｆプラスミドの構築
前述のｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡプラスミドを鋳型として、下記に示す塩基配列を有するＹ３９３Ｆ導入プライマーセットとＫＯＤ Ｏｎｅ(R) ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （東洋紡株式会社） を用いてＰＣＲにより、ポリヌクレオチド断片を得た。
＜１＞ｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡ‐Ｔ３０２Ａ／Ｙ３９３Ｆプラスミドの構築
前述のｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡプラスミドを鋳型として、下記に示す塩基配列を有するＹ３９３Ｆ導入プライマーセットとＫＯＤ Ｏｎｅ(R) ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （東洋紡株式会社） を用いてＰＣＲにより、ポリヌクレオチド断片を得た。
Ｙ３９３Ｆ導入プライマーセット
５‘－ ＣＴＧＴＧＧＣＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＴＧＧＧＡＣＴＧＣ －３’（配列番号１０）
５‘－ ＧＣＡＧＴＣＣＣＡＣＧＡＡＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＡＣＡＧ －３’ （配列番号１１）
５‘－ ＣＴＧＴＧＧＣＧＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＴＧＧＧＡＣＴＧＣ －３’（配列番号１０）
５‘－ ＧＣＡＧＴＣＣＣＡＣＧＡＡＧＴＴＴＴＣＣＧＣＣＡＣＡＧ －３’ （配列番号１１）
得られたポリヌクレオチド断片を、制限酵素ＤｐｎIで処理した後、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ (タカラバイオ株式会社)およびＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ． ２ （東洋紡株式会社） を用いて環状に連結し、得られた環状ポリヌクレオチドをｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡ‐Ｙ３９３Ｆプラスミドとした。
その後、得られたプラスミドのｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡ‐Ｙ３９３Ｆを鋳型として、下記に示す塩基配列を有するＴ３０２Ａ導入プライマーセットとＫＯＤ Ｏｎｅ(R) ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （ｔｏｙｏｂｏ） を用いてＰＣＲにより、ポリヌクレオチド断片を得た。
Ｔ３０２Ａ導入プライマーセット
５‘－ ＣＡＴＣＧＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＴＧＧＣＧＣＡＡＡＧＧＧ －３’（配列番号１２）
５‘－ ＣＣＣＴＴＴＧＣＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＧＧＡＡＣＧＡＴＧ －３’（配列番号１３）
５‘－ ＣＡＴＣＧＴＴＣＣＴＣＣＧＧＣＴＧＧＣＧＣＡＡＡＧＧＧ －３’（配列番号１２）
５‘－ ＣＣＣＴＴＴＧＣＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＧＧＡＡＣＧＡＴＧ －３’（配列番号１３）
得られたポリヌクレオチド断片を、制限酵素ＤｐｎIで処理した後、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ (タカラバイオ株式会社)およびＬｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ Ｖｅｒ． ２ （東洋紡株式会社） を用いて環状に連結し、得られた環状ポリヌクレオチドをｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡ‐Ｔ３０２Ａ／Ｙ３９３Ｆプラスミド（ｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡ‐ＴＹプラスミド）とした。
（３）プロトカテク酸５位酸化酵素の生産
前述のｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡプラスミド、ｐＲＳＦ－ＨｙＰｏｂＡプラスミド、ｐＲＳＦ－ＰｏＰｏｂＡプラスミド、ｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡ‐ＴＹプラスミド、ｐＲＳＦ－ＰａＰｏｂＡプラスミドを、それぞれ大腸菌ＢＬ２１ Sｔａｒ（ＤＥ３）株（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）に導入し、カナマイシン含有寒天培地での培養により、目的とするプラスミドを導入した大腸菌株を選抜した。
前述のｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡプラスミド、ｐＲＳＦ－ＨｙＰｏｂＡプラスミド、ｐＲＳＦ－ＰｏＰｏｂＡプラスミド、ｐＲＳＦ－ＨｇＰｏｂＡ‐ＴＹプラスミド、ｐＲＳＦ－ＰａＰｏｂＡプラスミドを、それぞれ大腸菌ＢＬ２１ Sｔａｒ（ＤＥ３）株（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）に導入し、カナマイシン含有寒天培地での培養により、目的とするプラスミドを導入した大腸菌株を選抜した。
得られた大腸菌株をそれぞれ５ｍＬの液体ＬＢ培地を試験管に添加し、３７℃、１８０ｒｐｍ で終夜培養し前培養液とした。
全容５００ｍＬの羽付きフラスコに分注して滅菌したＬＢ液体培地１００ｍＬを用意し、終濃度３０μｇ／Ｌとなるようにカナマイシンを添加した。これに終濃度１％となるように前記前培養液を加え、３７℃、１２０ ｒｐｍで振盪培養した。
菌体濁度（ＯＤ６００）が０．６になった時点で、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように添加し、２０℃、１２０ｒｐｍで振盪しながら１２－１８時間培養しプロトカテク酸５位酸化酵素の生産を誘導した。
（４）プロトカテク酸５位酸化酵素の精製
タンパク質誘導後、前記大腸菌株を集菌し、緩衝液 （２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．９）） に懸濁して、超音波破砕した後、当該破砕液を遠心分離 (８０００ｒｐｍ、１０分、４℃)して上清 (無細胞抽出液) を回収した。
タンパク質誘導後、前記大腸菌株を集菌し、緩衝液 （２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．９）） に懸濁して、超音波破砕した後、当該破砕液を遠心分離 (８０００ｒｐｍ、１０分、４℃)して上清 (無細胞抽出液) を回収した。
当該無細胞抽出液を、平衡化緩衝液 (２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．９）、２０ｍＭイミダゾール) で平衡化させたＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ｃｏｌｕｍｎ （ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供した後、溶出液 (２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．９）、５００ｍＭイミダゾール)で溶出した画分を回収した。
その後、溶出画分をＡｍｉｃｏｎ(R) Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓ ０．５ｍＬ １０ｋ（Ｍｅｒck Ｍｉｌｉｐｏｒｅ) に供し、緩衝液を用いて洗浄することで、タンパク質溶液からイミダゾールを排除した。
精製酵素液をＢｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ （Ｂｉｏ－Ｒａｄ， ＵＳＡ） を用いてタンパク質濃度をそれぞれ測定し、１ｍｇ／ｍＬになるように緩衝液で希釈し、ＨｇＰｏｂＡ、ＨｙＰｏｂＡ、ＰｏＰｏｂＡ、ＨｇＰｏｂＡ‐ＴＹ及びＰａＰｏｂＡそれぞれのプロトカテク酸５位酸化酵素の精製酵素液を調製した。
（５）プロトカテク酸５位酸化酵素と既存のＰｏｂＡとのアミノ酸配列の同一性の確認
前述のＨｇＰｏｂＡ（配列番号２０）、ＨｙＰｏｂＡ（配列番号２１）及びＰｏＰｏｂＡ（配列番号２２）にかかるプロトカテク酸５位酸化酵素を用いて、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のp-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ＰｏｂＡ）のアミノ酸配列との同一性を確認した。
前述のＨｇＰｏｂＡ（配列番号２０）、ＨｙＰｏｂＡ（配列番号２１）及びＰｏＰｏｂＡ（配列番号２２）にかかるプロトカテク酸５位酸化酵素を用いて、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のp-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼ（ＰｏｂＡ）のアミノ酸配列との同一性を確認した。
結果を下記の表１に示す。本技術にかかる前記微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のp-ヒドロキシ安息香酸ヒドロキシラーゼとのアミノ酸配列との同一性は６０％以下であることが確認できる。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来ＰｏｂＡ (ＰａＰｏｂＡ)のアミノ酸配列情報（配列番号２８）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ由来ＰｏｂＡ (ＣｇＰｏｂＡ)のアミノ酸配列情報（配列番号２９）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号３０）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号３１）
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ由来ＰｏｂＡのアミノ酸配列情報（配列番号３２）
（６）プロトカテク酸５位酸化酵素の酵素活性の測定
＜１＞反応速度論的解析
前述のＨｇＰｏｂＡ、ＨｇＰｏｂＡ‐ＴＹ、ＰｏＰｏｂＡ、ＨｙＰｏｂＡ及びＰａＰｏｂＡの精製酵素液を用いて反応速度論的解析を行った。
酵素活性測定には、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．９）に、１０μＭ ＦＡＤ、２００μＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ｐＨＢＡあるいは２ｍＭ ＰＣＡ、１μｇ精製酵素液を含む１００ μＬの反応液を用いた。
当該反応はｐＨＢＡあるいはＰＣＡを添加することにより開始され、分光光度計Ｕ３９００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて、２５℃で３４０ｎｍの吸光度を５分間測定した。
＜１＞反応速度論的解析
前述のＨｇＰｏｂＡ、ＨｇＰｏｂＡ‐ＴＹ、ＰｏＰｏｂＡ、ＨｙＰｏｂＡ及びＰａＰｏｂＡの精製酵素液を用いて反応速度論的解析を行った。
酵素活性測定には、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．９）に、１０μＭ ＦＡＤ、２００μＭ ＮＡＤＰＨ、１ｍＭ ｐＨＢＡあるいは２ｍＭ ＰＣＡ、１μｇ精製酵素液を含む１００ μＬの反応液を用いた。
当該反応はｐＨＢＡあるいはＰＣＡを添加することにより開始され、分光光度計Ｕ３９００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて、２５℃で３４０ｎｍの吸光度を５分間測定した。
その結果を表２に示す。ＨｇＰｏｂＡ、ＰｏＰｏｂＡおよびＨｙＰｏｂＡはＰＣＡを基質とした際にＰａＰｏｂＡより高いｋｃａｔ値を示し、ＰＣＡから没食子酸の効率的な生成に有効であることが確認できる。
また、ＨｇＰｏｂＡに２種類の変異を導入したＨｇＰｏｂＡ‐ＴＹのＰＣＡに対するｋｃａｔ値はＰａＰｏｂＡのそれより３．６倍大きく、さらにＫｍ値も３分の１倍以下となり、変異の導入により、ＰＣＡを水酸化するＰＣＡ水酸化酵素として優れた性質をさらに改善し得ることが明らかとなった。
ＰｏＰｏｂＡおよびＨｙＰｏｂＡのｐＨＢＡに対するｋｃａｔ値は、ＰａＰｏｂＡのそれより10分の1～20分の１倍であり、ＰＣＡに対するｋｃａｔ値は、ＰａＰｏｂＡのそれより６～１２倍大きいことから、ｐＨＢＡからＰＣＡの生成反応よりも、ＰＣＡから没食子酸の生成反応を優位に進めることができ、反応液中の没食子酸の収率の向上が期待できる。
＜２＞没食子酸生成活性の解析
前述のＨｙＰｏｂＡ、ＰｏＰｏｂＡ、ＨｇＰｏｂＡ‐ＴＹ、ＰａＰｏｂＡの精製酵素液を用いて没食子酸生成活性を解析した。
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．９）に、１０μＭ ＦＡＤ、０．５ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２ｍＭ ＰＣＡ、１０μｇ精製酵素液を添加し１００μＬの反応液を調製した。それを３０℃で３０分反応させた後、ＨＰＬＣ （１２００ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ： Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋｅｒｄ）を用いて生成された没食子酸の濃度を測定した。
前述のＨｙＰｏｂＡ、ＰｏＰｏｂＡ、ＨｇＰｏｂＡ‐ＴＹ、ＰａＰｏｂＡの精製酵素液を用いて没食子酸生成活性を解析した。
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．９）に、１０μＭ ＦＡＤ、０．５ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２ｍＭ ＰＣＡ、１０μｇ精製酵素液を添加し１００μＬの反応液を調製した。それを３０℃で３０分反応させた後、ＨＰＬＣ （１２００ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ： Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋｅｒｄ）を用いて生成された没食子酸の濃度を測定した。
図２はその結果として、ＰａＰｏｂＡのＰＣＡから没食子酸の生成活性を１としたときの各酵素のＰＣＡからの没食子酸の生成活性を相対値として示したものである。
ＰＣＡ水酸化活性が高いことが知られる公知の酵素であるＰａＰｏｂＡを用いた場合と比較すると、ＨｇＰｏｂＡ-ＴＹは８倍、ＨｙＰｏｂＡやＰｏＰｏｂＡは２０倍多い没食子酸を生産できることが明らかとなった。
実施例２ 微生物菌株を用いた発酵による没食子酸の生成
（１）プロトカテク酸５位酸化酵素をコードする遺伝子を導入したコリネバクテリウム菌株の調整
ＨｙＰｏｂＡ、ＰｏＰｏｂＡ、ＨｇＰｏｂＡ‐ＴＹ及びＣｇＰｏｂＡをコードする遺伝子を、以下の手順で、グルコースからＰＣＡを生産する菌株として知られるコリネバクテリウム グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２を基に、下記の手順で遺伝子改変を行ったＣＴ０７株に導入した。
（１）プロトカテク酸５位酸化酵素をコードする遺伝子を導入したコリネバクテリウム菌株の調整
ＨｙＰｏｂＡ、ＰｏＰｏｂＡ、ＨｇＰｏｂＡ‐ＴＹ及びＣｇＰｏｂＡをコードする遺伝子を、以下の手順で、グルコースからＰＣＡを生産する菌株として知られるコリネバクテリウム グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２を基に、下記の手順で遺伝子改変を行ったＣＴ０７株に導入した。
＜１＞ＣＴ０７株の構築
コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のｔｋｔ（ｃｇ１７７４）， ｐｐｓＡ（ｃｇ０６４４）， ａｒｏＦｆｂｒ（ｃｇ１１２９）， ａｒｏＧ（ｃｇ２３９１）およびｑｓｕＡＢＣＤオペロン（ｃｇ０５０１、ｃｇ０５０２、ｃｇ０５０３，ｃｇ０５０４）のプロモーターを、下記に記載の方法により、遺伝子発現能力が構成的であり強力なｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Tｕ（ｃｇ０５８７）の遺伝子のプロモーターと交換した。
コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のｔｋｔ（ｃｇ１７７４）， ｐｐｓＡ（ｃｇ０６４４）， ａｒｏＦｆｂｒ（ｃｇ１１２９）， ａｒｏＧ（ｃｇ２３９１）およびｑｓｕＡＢＣＤオペロン（ｃｇ０５０１、ｃｇ０５０２、ｃｇ０５０３，ｃｇ０５０４）のプロモーターを、下記に記載の方法により、遺伝子発現能力が構成的であり強力なｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Tｕ（ｃｇ０５８７）の遺伝子のプロモーターと交換した。
コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の遺伝子中の上記の遺伝子プロモーター領域を含むＤＮＡを合成し、ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｔｕのプロモーターと交換した。
ｔｋｔ（ｃｇ１７７４）についてはＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、ＫＥＧＧ（ Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ）等の公共データベース上に登録されたｃｇ１７７３～ｃｇ１７７４の領域の塩基配列を用いた。同様に、ｐｐｓＡ（ｃｇ０６４４）についてはｃｇ０６４３～ｃｇ０６４４～ｃｇ０６４５を含む領域、ａｒｏＦｆｂｒ（ｃｇ１１２９）についてはｃｇ１１２７～ｃｇ１１２８～ｃｇ１１２９を含む領域、ａｒｏＧ（ｃｇ２３９１）についてはｃｇ２３９３～ｃｇ２３９２～ｃｇ２３９１を含む領域、ｑｓｕＡＢＣＤオペロン（ｃｇ０５０１、ｃｇ０５０２、ｃｇ０５０３，ｃｇ０５０４）についてはｃｇ０５００～ｃｇ０５０１を含む領域の塩基配列を用いた。
上記の各遺伝子のプロモーター領域をｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｔｕの遺伝子のプロモーターと交換した配列からなり、ＤＮＡの両末端にＳｂｆＩの認識配列を付与させたＤＮＡを合成した。得られたそれぞれのＤＮＡをＳｂｆＩで消化し、下記に示したｐＨＧ０のＳｂｆＩ部位に挿入し、相同組換え用のプラスミドを構築した。このプラスミドをコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に導入し、それぞれの遺伝子のプロモーターがｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｔｕのプロモーターと置き換えられた株を構築した。
さらに、ａｒｏＦ遺伝子については遺伝子合成する際にＰ１５５Ｌの変異を導入しａｒｏＦｆｂｒを構築した。また、プロトカテク酸分解遺伝子ｐｃａＨＧ（ｃｇ２６３１，ｃｇ２６３０）を含むｃｇ２６２９～ｃｇ２６３０～ｃｇ２６３１～ｃｇ２６３３領域の塩基配列を前記公共データベースから取得し、この塩基配列からｐｃａＨＧ（ｃｇ２６３１，ｃｇ２６３０）部分のみを欠失させた塩基配列を設計し、この塩基配列の両末端にＳｂｆＩ配列を付着させた遺伝子を合成した。合成した遺伝子をＳｂｆＩで消化し、下記に構築するｐＨＧ０のＳｂｆＩサイトに挿入し、相同組換え用のプラスミドを構築した。このプラスミドを前述のｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ Ｔｕのプロモーターを導入したコリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株に導入し、染色体上のｐｃａＨＧの遺伝子と相同組換えさせることによって、コリネバクテリウムグルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株の染色体上のｐｃａＨＧ遺伝子を欠損させた。これらによって得られた菌株をＣＴ０７株とした。
＜２＞ゲノム編集ベクターの構築
市販ベクターであるｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ株式会社）のＦｓｐＩサイトにユーロフィンジェノミクス社にて人工合成したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来レバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を導入し、ショ糖培地上では微生物に致死的な化合物を生産するベクターｐＨＧ０を構築した。
市販ベクターであるｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ株式会社）のＦｓｐＩサイトにユーロフィンジェノミクス社にて人工合成したＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来レバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を導入し、ショ糖培地上では微生物に致死的な化合物を生産するベクターｐＨＧ０を構築した。
相同組み換えによって目標遺伝子をＣＴ０７株に導入するため、ｃｇ０６５８遺伝子（配列番号３３）をコリネバクテリウム グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムからSａｃＩ配列を付着させた下記プライマーとＸｂａＩ配列を付着させたプライマーとのセットを用いたＰＣＲによって調整されたｃｇ０６５８のポリヌクレオチド断片をＳａｃＩ及びＸｂａＩで制限酵素処理した。その後、ｃｇ０６５８のポリヌクレオチド断片を、ＳａｃＩ及びＸｂａＩで制限酵素処理したベクターｐＨＧ０のＳａｃＩ及びＸｂａＩサイトに導入した。このベクターをｐＨＧ０＿０６５８と命名した。
ＳａｃＩ配列導入ｃｇ０６５８プライマー
５‘－ＧＡＧＣＴＣＡＴＧＣＧＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣ－３’（配列番号３４）
ＸｂａＩ配列導入ｃｇ０６５８プライマー
５‘－ＧＡＧＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＴＡＧＧＧＡＣＣＧＴＡＴＧＣＧ－３’（配列番号３５）
５‘－ＧＡＧＣＴＣＡＴＧＣＧＴＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＴＴＣ－３’（配列番号３４）
ＸｂａＩ配列導入ｃｇ０６５８プライマー
５‘－ＧＡＧＣＴＣＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＴＡＧＧＧＡＣＣＧＴＡＴＧＣＧ－３’（配列番号３５）
＜３＞酵素発現ユニットの構築
ＨｙＰｏｂＡ、ＰｏＰｏｂＡ、ＨｇＰｏｂＡ－ＴＹ及びＣｇＰｏｂＡの遺伝子をコリネバクテリウム グルタミカム内で発現させるため、既知のプロモーターであるｐＨＳＧ２９８由来のカナマイシン耐性遺伝子プロモーター（配列番号３６）を利用した。
ＨｙＰｏｂＡ、ＰｏＰｏｂＡ、ＨｇＰｏｂＡ－ＴＹ及びＣｇＰｏｂＡの遺伝子をコリネバクテリウム グルタミカム内で発現させるため、既知のプロモーターであるｐＨＳＧ２９８由来のカナマイシン耐性遺伝子プロモーター（配列番号３６）を利用した。
当該カナマイシン耐性遺伝子プロモーター（配列番号３６）とＨｙｐｏｂＡ（配列番号４）， ＰｏｐｏｂＡ（配列番号７）， ＨｇＰｏｂＡ＿ＴＹ（配列番号３７）又はＣｇＰｏｂＡ（配列番号１７）を連結させた配列を有するポリヌクレオチド断片をそれぞれ人工遺伝子合成により取得した。得られた４つのポリヌクレオチド断片をそれぞれ鋳型として、５‘末端にＸｂａＩ配列、３’末端にＳａｌＩ配列を付着させたプライマーセットを用いてＰＣＲにより４つのポリヌクレオチド断片を作成した。このときの鋳型とプライマーの組み合わせを下記に示す。
カナマイシン耐性遺伝子プロモーターと連結させたＨｙＰｏｂＡからなるポリヌクレオチド断片を鋳型として、ＸｂａＩ配列導入カナマイシン耐性遺伝子プロモーター増幅Ｆｗプライマー（配列番号３８）とＨｙＰｏｂＡＳａｌＩ配列導入Ｒｖプライマー（配列番号３９）を用いたＰＣＲによる増幅でポリヌクレオチド断片を得た。
ＸｂａＩ配列導入カナマイシン耐性遺伝子プロモーター増幅Ｆｗプライマー
５‘－ＧＡＧＣＴＣＡＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＴＧＧＴＡＴＣ －３’（配列番号３８）
ＨｙＰｏｂＡＳａｌＩ配列導入Ｒｖプライマー
５‘－ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＣＣＣＧ－３’（配列番号３９）
５‘－ＧＡＧＣＴＣＡＴＧＣＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＴＧＧＴＡＴＣ －３’（配列番号３８）
ＨｙＰｏｂＡＳａｌＩ配列導入Ｒｖプライマー
５‘－ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＴＣＧＡＴＧＧＧＣＡＡＧＣＣＣＧ－３’（配列番号３９）
カナマイシン耐性遺伝子プロモーターと連結させたＰｏＰｏｂＡからなるポリヌクレオチド断片を鋳型として、ＸｂａＩ配列導入カナマイシン耐性遺伝子プロモーター増幅Ｆｗプライマー（配列番号３８）とＰｏＰｏｂＡＳａｌＩ配列導入Ｒｖプライマー（配列番号４０）を用いたＰＣＲによる増幅でポリヌクレオチド断片を得た。
ＰｏＰｏｂＡＳａｌＩ配列導入Ｒｖプライマー
５‘－ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＣＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧ－３’（配列番号４０）
５‘－ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＣＡＡＴＣＧＧＡＡＧＴＣＣＡＧ－３’（配列番号４０）
カナマイシン耐性遺伝子プロモーターと連結させたＨｇＰｏｂＡ－ＴＹからなるポリヌクレオチド断片を鋳型として、ＸｂａＩ配列導入カナマイシン耐性遺伝子プロモーター増幅Ｆｗプライマー（配列番号３８）とＨｇＰｏｂＡ＿ＳａｌＩ配列導入Ｒｖプライマー（配列番号４１）を用いたＰＣＲによる増幅でポリヌクレオチド断片を得た。
ＨｇＰｏｂＡ＿ＳａｌＩ配列導入Ｒｖプライマー
５‘－ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＧ－３’（配列番号４１）
５‘－ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＧＴＣＧＡＧＧＧ－３’（配列番号４１）
カナマイシン耐性遺伝子プロモーターと連結させたＣｇＰｏｂＡからなるポリヌクレオチド断片を鋳型として、ＸｂａＩ配列導入カナマイシン耐性遺伝子プロモーター増幅Ｆｗプライマー（配列番号３８）とＣｇＰｏｂＡ＿ＳａｌＩ配列導入Ｒｖプライマー（配列番号４２）を用いたＰＣＲによる増幅でポリヌクレオチド断片を得た。
ＣｇＰｏｂＡ＿ＳａｌＩ配列導入Ｒｖプライマー
５‘－ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＡＣＴＴＣＡＡＡＣＣＧＣＧＧＧ－３’（配列番号４２）
５‘－ＧＴＣＧＡＣＴＴＡＣＡＣＴＴＣＡＡＡＣＣＧＣＧＧＧ－３’（配列番号４２）
ＰＣＲで得られた上記の４つのポリヌクレオチド断片をＸｂａＩおよびＳａｌＩを用いて消化し、ＤＮＡ回収カラム（日本ジェネティクス社製Ｇｅｌ／ＰＣＲ エクストラクションキット）にてプロトカテク酸５位酸化酵素に係る消化ＤＮＡ断片として回収した。
同様にゲノム編集ベクターｐＨＧ０＿０６５８をＸｂａＩおよびＳａｌＩにて消化し、ＤＮＡ回収カラム（日本ジェネティクス社製Ｇｅｌ／ＰＣＲ エクストラクションキット）にて消化後のｐＨＧ０＿０６５８を回収した。消化後のｐＨＧ０＿０６５８と前述のプロトカテク酸５位酸化酵素に係る消化ＤＮＡ断片とをそれぞれＧｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて連結させ、下記に示す４つの酵素発現ユニットを導入したベクターを得た。
ｐＨＧ０＿０６５８＿Ｐｋｍ＿ＨｙＰｏｂＡ
ｐＨＧ０＿０６５８＿Ｐｋｍ＿ＰｏＰｏｂＡ
ｐＨＧ０＿０６５８＿Ｐｋｍ＿ＨｇＰｏｂＡ-ＴＹ
ｐＨＧ０＿０６５８＿Ｐｋｍ＿ＣｇＰｏｂＡ
ｐＨＧ０＿０６５８＿Ｐｋｍ＿ＨｙＰｏｂＡ
ｐＨＧ０＿０６５８＿Ｐｋｍ＿ＰｏＰｏｂＡ
ｐＨＧ０＿０６５８＿Ｐｋｍ＿ＨｇＰｏｂＡ-ＴＹ
ｐＨＧ０＿０６５８＿Ｐｋｍ＿ＣｇＰｏｂＡ
＜４＞酵素発現ユニットのゲノム導入
上記で作成した４つのプラスミドをそれぞれコリネバクテリウム グルタミカムＣＴ０７株にエレクトロポレーション法を用いて導入し、ｃｇ０６５８遺伝子を相同組み換え領域とした相同組み換えによって目標遺伝子を導入し、カナマイシン２０μｇ／Ｌを含むＬＢ培地での培養によりゲノムにプラスミドが導入された微生物菌株を取得した。これらの菌株は、それぞれのＰｏｂＡ遺伝子を染色体あたり１コピーだけ有するコリネバクテリウムグルタミカムＣＴ０７株の遺伝子導入微生物菌株である。これらをそれぞれＣＧ０７－ＨＹ株, ＣＧ０７－ＰＯ株, ＣＧ０７－ＨＧ株およびＣＧ０７－ＣＧ株と命名した。
上記で作成した４つのプラスミドをそれぞれコリネバクテリウム グルタミカムＣＴ０７株にエレクトロポレーション法を用いて導入し、ｃｇ０６５８遺伝子を相同組み換え領域とした相同組み換えによって目標遺伝子を導入し、カナマイシン２０μｇ／Ｌを含むＬＢ培地での培養によりゲノムにプラスミドが導入された微生物菌株を取得した。これらの菌株は、それぞれのＰｏｂＡ遺伝子を染色体あたり１コピーだけ有するコリネバクテリウムグルタミカムＣＴ０７株の遺伝子導入微生物菌株である。これらをそれぞれＣＧ０７－ＨＹ株, ＣＧ０７－ＰＯ株, ＣＧ０７－ＨＧ株およびＣＧ０７－ＣＧ株と命名した。
＜５＞培養試験
ＣＧ０７－ＨＹ株, ＣＧ０７－ＰＯ株, ＣＧ０７－ＨＧ株及びＣＧ０７－ＣＧ株をカナマイシン２０μｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地にて３０℃で終夜、振盪培養を行い前培養液とした。また、プラスミドを導入していないＣＴ０７株を抗生物質を含まないＬＢ液体培地にて３０℃で終夜、振盪培養を行い前培養液とした。
ＣＧ０７－ＨＹ株, ＣＧ０７－ＰＯ株, ＣＧ０７－ＨＧ株及びＣＧ０７－ＣＧ株をカナマイシン２０μｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地にて３０℃で終夜、振盪培養を行い前培養液とした。また、プラスミドを導入していないＣＴ０７株を抗生物質を含まないＬＢ液体培地にて３０℃で終夜、振盪培養を行い前培養液とした。
これらの前培養液を、５％グルコースを加えたＣＧＸＩＩ培地（ｐＨ７．０）に１％となるように接種し、３０℃、７２時間振盪培養した。培養液は適宜希釈し、ＨＰＬＣ （１２００ ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｓｅｒｉｅｓ： Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋｅｒｄ）を用いて生成されたプロトカテク酸および没食子酸の濃度を測定した。
ＣＧ０７－ＨＹ株, ＣＧ０７－ＰＯ株, ＣＧ０７－ＨＧ株、ＣＧ０７－ＣＧ株及びＣＴ０７株の培養液中のプロトカテク酸および没食子酸の濃度の測定結果を下記の表３に示す。
ＣＴ０７株はプロトカテク酸７．３ｇ／Ｌを生産したがＰｏｂＡを発現しないため、没食子酸（ＧＡ）は生産されなかった。一方でＣｇＰｏｂＡを発現するＣＧ０７－ＣＧ株はプロトカテク酸７．５ｇ／Ｌおよび没食子酸０．０００１ｇ／Ｌを生産した。また、ＨｇＰｏｂＡ－ＴＹを発現するＣＧ０７－ＨＧはプロトカテク酸５．５ｇ／Ｌおよび没食子酸０．６５ｇ／Ｌを生産した。ＨｙＰｏｂＡを保有するＣＧ０７－ＨＹ株はプロトカテク酸７．３ｇ／Ｌおよび没食子酸０．０３ｇ／Ｌを生産した。ＰｏＰｏｂＡを保有するＣＧ０７－ＰＯ株はプロトカテク酸７．３ｇ／Ｌおよび没食子酸０．０００４ｇ／Ｌを生産した。
既知酵素ＣｇＰｏｂＡを保有するＣＧ０７－ＣＧを１とした場合の没食子酸の生産倍率は下表の通りである。ＨｇＰｏｂＡ－ＴＹを利用することで、従来の６５００倍の没食子酸（ＧＡ）生産することが可能になった。
これまでに開発された天然型酵素の中で、没食子酸の発酵生産が最大となる酵素はＣｇＰｏｂＡまたはＰａＰｏｂＡであり、両者を用いたときの没食子酸の生産量は同等であることが報告されている。本発明に係るコマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素を用いることによって、ＣｇＰｏｂＡを用いたときよりも大幅に没食子酸の収率を向上させることが期待できる。また、本発明に係るプロトカテク酸５位酸化酵素の配列を改変することで、発酵液中の没食子酸の収率をさらに向上させ得る。
さらに、グルコースを基質とする培地を用いて、没食子酸を製造できることから、没食子酸の製造コスト低減が期待できる。
実施例２において、ＨｇＰｏｂＡ－ＴＹを活用することによって、ＣｇＰｏｂＡを導入して得られたＣＧ０７－ＣＧ株をそれよりも用いた技術の６５００倍多くの没食子酸を生成できた。これは、これまで知られているＰｏｂＡに導入することで没食子酸の生産能を高めることが知られている変異は、ＨｇＰｏｂＡに対しても有効であることを示す。
［低ｐＨ培養試験］
ＣＧ０７－ＨＹ株、 ＣＧ０７－ＰＯ株、及びＣＧ０７－ＨＧ株を、カナマイシン２０μｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地にて３０℃で終夜、振盪培養を行い、前培養液を調製した。これらの前培養液を、５％グルコースを加えたＣＧＸＩＩ培地（ｐＨ４．０）に１％となるように接種し、３０℃、７２時間振盪培養した。培養液は適宜希釈し、ＨＰＬＣ （１２００ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ： Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋｅｒｄ）を用いて生成されたプロトカテク酸および没食子酸の濃度を測定することにより、ＣＧ０７－ＨＹ株、 ＣＧ０７－ＰＯ株、及びＣＧ０７－ＨＧ株について、ｐＨ４．０の培養条件においても、没食子酸が生成することを確認した。当該培養条件とすることで、硫酸、塩酸等の酸の使用量を減少させるとともに、本技術の微生物菌株以外の菌株が混入するリスクも低減し得る。
ＣＧ０７－ＨＹ株、 ＣＧ０７－ＰＯ株、及びＣＧ０７－ＨＧ株を、カナマイシン２０μｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地にて３０℃で終夜、振盪培養を行い、前培養液を調製した。これらの前培養液を、５％グルコースを加えたＣＧＸＩＩ培地（ｐＨ４．０）に１％となるように接種し、３０℃、７２時間振盪培養した。培養液は適宜希釈し、ＨＰＬＣ （１２００ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ： Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋｅｒｄ）を用いて生成されたプロトカテク酸および没食子酸の濃度を測定することにより、ＣＧ０７－ＨＹ株、 ＣＧ０７－ＰＯ株、及びＣＧ０７－ＨＧ株について、ｐＨ４．０の培養条件においても、没食子酸が生成することを確認した。当該培養条件とすることで、硫酸、塩酸等の酸の使用量を減少させるとともに、本技術の微生物菌株以外の菌株が混入するリスクも低減し得る。
［高温培養試験］
ＣＧ０７－ＨＹ株、 ＣＧ０７－ＰＯ株、及びＣＧ０７－ＨＧ株を、カナマイシン２０μｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地にて３０℃で終夜、振盪培養を行い、前培養液を調製した。これらの前培養液を、５％グルコースを加えたＣＧＸＩＩ培地（ｐＨ７．０）に１％となるように接種し、４０℃、７２時間振盪培養した。培養液は適宜希釈し、ＨＰＬＣ （１２００ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ： Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋｅｒｄ）を用いて生成されたプロトカテク酸および没食子酸の濃度を測定することにより、ＣＧ０７－ＨＹ株、 ＣＧ０７－ＰＯ株、及びＣＧ０７－ＨＧ株について、４０℃の培養条件においても、没食子酸が生成することを確認した。当該培養条件とすることで、培養効率を高め、没食子酸の生産効率向上が期待できる。
ＣＧ０７－ＨＹ株、 ＣＧ０７－ＰＯ株、及びＣＧ０７－ＨＧ株を、カナマイシン２０μｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地にて３０℃で終夜、振盪培養を行い、前培養液を調製した。これらの前培養液を、５％グルコースを加えたＣＧＸＩＩ培地（ｐＨ７．０）に１％となるように接種し、４０℃、７２時間振盪培養した。培養液は適宜希釈し、ＨＰＬＣ （１２００ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ： Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋｅｒｄ）を用いて生成されたプロトカテク酸および没食子酸の濃度を測定することにより、ＣＧ０７－ＨＹ株、 ＣＧ０７－ＰＯ株、及びＣＧ０７－ＨＧ株について、４０℃の培養条件においても、没食子酸が生成することを確認した。当該培養条件とすることで、培養効率を高め、没食子酸の生産効率向上が期待できる。
実施例３ スケールアップによる没食子酸の生成
ＨｇＰｏｂＡ－ＴＹを発現するＣＧ０７－ＨＧ株をカナマイシンμｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地にて３０℃で終夜、振盪培養を行い前培養液とした。
ＨｇＰｏｂＡ－ＴＹを発現するＣＧ０７－ＨＧ株をカナマイシンμｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地にて３０℃で終夜、振盪培養を行い前培養液とした。
ジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製 製品名ＭＤＬ－８Ｃ）に５％グルコースを加えたＣＧＸＩＩ培地を調整し、前記前培養液を接種し３０℃、５６時間、ｐＨ６．８の条件で培養した。その結果、培養５６時間目においてプロトカテク酸０．７ｇ／Ｌおよび没食子酸１５．１ｇ／Ｌを生産した。この生産レベルから判断し、開発された発酵生産系は、実生産に利用可能なものである。さらには、当該発酵生産系の培養条件を最適化することで没食子酸の生産量をさらに向上させることが期待できる。
上記培養液を加熱殺菌後、遠心または濾過などにより菌体を除去した。この培養濾液を硫酸などによりｐＨ４．０以下に調製した。この過程で発生する不溶性タンパク等を遠心により除去し、得られた液を適宜撹拌しながら冷却することで、没食子酸の結晶を得た。当該結晶を遠心により回収した。
［配列表］
<110> University of Tsukuba
<120> Microbial strain, protein, method for producing gallic acid using microbial strain or protein
<130> ＦＰＣＴ１３８８
<160> ４２
<110> University of Tsukuba
<120> Microbial strain, protein, method for producing gallic acid using microbial strain or protein
<130> ＦＰＣＴ１３８８
<160> ４２
<210> SEQ ID NO:1
<211> Length 1209
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence １
ATGTCTTATCCCACAAGAACTCAGGTCGCTATCATCGGTGCCGGACCTAGTGGCCTCATGCTGGGCGCTCTGCTGCACAAAGCGGGGATTGACACCGTAGTCCTCGAACGGCAGTCTGGCGATTATGTGCTTGGACGCATTAGAGCCGGCGTTTTGGAACAAGTGACGATGGACCTTATGGACGAGATAGGAGTAGGGGCCAGAATGCACCAGGAAGGTCTGGTGCATGGAGGCTTCGATATGCTCTTTCAGGGGCAACGCCATAGGATTGACATGAATCGGCTGACTGGAGGTCAGAATGTGATGGTTTATGGGCAGACAGAGGTGACAAGAGACTTGATGGATGCAAGGCAGCAAGCGGGACTGACCACCATCTACGAAGCCGCTAATGTGGCCATACACGACTTTGGCAGCGGGAAACCTCGAGTGACTTATGAGAAAGACGGCAAAACCCACGAACTGCAGTGCGACTTCATTGCAGGCTGCGACGGCTTTCACGGCGTCTGTCGGGATACCGTGAAGAAGTCCGCCAGTGCCAGTGCAATCCGCGAGTACGAAAAGGTGTACAACTTCGGGTGGCTGGGTTTGCTGTCCGATACCCCTCCGGTCCACCACGAACTCATCTACGTAAACAGCGAGAGAGGCTTCGCCCTGTGTTCCCAGAGGTCTGCGACGAGGAGCCGGTATTACCTCCAGGTGCCACTGACAGATAAGGTCGAACAGTGGTCAGATCAGGCCTTTTGGGATGAGCTCAAACTGCGCCTTGACCCACAAGCCAGAGAGCATCTGGTTACCGGACCCAGCATAGAGAAGAGCATCGCACCCCTCAGGTCCTTCGTGACAGAGCCACTGCGGTTTGGGCGACTGTTCCTTGCTGGCGATGCTGGGCACATCGTTCCTCCGACTGGCGCAAAGGGATTGAACCTGGCCGCCACCGACGTCAAGTATCTCAGCGCTGCACTGACCGAGTTCTACCAGGGAAAGTCCGAGGCTGGGATCAACCACTACTCAGAACGCTGCCTGAAGAGGATTTGGCGAGCTGAGAGGTTCTCATGGTGGTTTACGTCCCTGATGCATCGGTTCCCCGAAAATGGCGAGATTGGGCAGAAATTGCAAGAGGCCGAACTGGACTACATCGTCCATTCCGAGACTGGTGCCAGGTCTGTGGCGGAAAACTACGTGGGACTGCCCCTCGACTTCGGTGCCTAA
<211> Length 1209
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence １
ATGTCTTATCCCACAAGAACTCAGGTCGCTATCATCGGTGCCGGACCTAGTGGCCTCATGCTGGGCGCTCTGCTGCACAAAGCGGGGATTGACACCGTAGTCCTCGAACGGCAGTCTGGCGATTATGTGCTTGGACGCATTAGAGCCGGCGTTTTGGAACAAGTGACGATGGACCTTATGGACGAGATAGGAGTAGGGGCCAGAATGCACCAGGAAGGTCTGGTGCATGGAGGCTTCGATATGCTCTTTCAGGGGCAACGCCATAGGATTGACATGAATCGGCTGACTGGAGGTCAGAATGTGATGGTTTATGGGCAGACAGAGGTGACAAGAGACTTGATGGATGCAAGGCAGCAAGCGGGACTGACCACCATCTACGAAGCCGCTAATGTGGCCATACACGACTTTGGCAGCGGGAAACCTCGAGTGACTTATGAGAAAGACGGCAAAACCCACGAACTGCAGTGCGACTTCATTGCAGGCTGCGACGGCTTTCACGGCGTCTGTCGGGATACCGTGAAGAAGTCCGCCAGTGCCAGTGCAATCCGCGAGTACGAAAAGGTGTACAACTTCGGGTGGCTGGGTTTGCTGTCCGATACCCCTCCGGTCCACCACGAACTCATCTACGTAAACAGCGAGAGAGGCTTCGCCCTGTGTTCCCAGAGGTCTGCGACGAGGAGCCGGTATTACCTCCAGGTGCCACTGACAGATAAGGTCGAACAGTGGTCAGATCAGGCCTTTTGGGATGAGCTCAAACTGCGCCTTGACCCACAAGCCAGAGAGCATCTGGTTACCGGACCCAGCATAGAGAAGAGCATCGCACCCCTCAGGTCCTTCGTGACAGAGCCACTGCGGTTTGGGCGACTGTTCCTTGCTGGCGATGCTGGGCACATCGTTCCTCCGACTGGCGCAAAGGGATTGAACCTGGCCGCCACCGACGTCAAGTATCTCAGCGCTGCACTGACCGAGTTCTACCAGGGAAAGTCCGAGGCTGGGATCAACCACTACTCAGAACGCTGCCTGAAGAGGATTTGGCGAGCTGAGAGGTTCTCATGGTGGTTTACGTCCCTGATGCATCGGTTCCCCGAAAATGGCGAGATTGGGCAGAAATTGCAAGAGGCCGAACTGGACTACATCGTCCATTCCGAGACTGGTGCCAGGTCTGTGGCGGAAAACTACGTGGGACTGCCCCTCGACTTCGGTGCCTAA
<210> SEQ ID NO:２
<211> Length 48
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence ２
ATCACCACAGCCAGGATCCGAATTCAAGCTATCCCACAAGAACTCAGG
<211> Length 48
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence ２
ATCACCACAGCCAGGATCCGAATTCAAGCTATCCCACAAGAACTCAGG
<210> SEQ ID NO:３
<211> Length 43
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence ３
TTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTAGGCACCGAAGTCGAGGG
<211> Length 43
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence ３
TTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTAGGCACCGAAGTCGAGGG
<210> SEQ ID NO:４
<211> Length １１７６
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hydrogenophaga sp.
<400> Sequence ４
ATGCGCACCCAGGTTGGTATCATCGGCGCCGGCCCGGCCGGATTGATGCTCGCGCACATGCTTCACCTTGAGGGCATTGAATCTGTAATTATCGAACGTAGCAAGCGCGAGCATGTACAAAATCGTTTGCGCGCCGGCGTTCTGGAACAGGGCACGGTAGAAATGATGCGTGAACTCGGCTTGGGAGAACGCATCGGACAGCTGGGATTGGAGCAACATCGTATCGACTTTCGTTTTGGAGGAGAATCCCATCCCATTGATTTCCACGAAGCTACCGGCGGACGGTCGGCTTGGGTATATCCCCAACACGAAGTGGTCAAAGATCTGATGGCTGCACGTACCGCTGCCGGTGCCCAGATGCTCTTCGAAACGCCTGTTACTGCTATTGAAGGAATTGACGGCACCCGCCCAGTAGTTCGTTTTGAAAAGGACGGAGTCGCGGGAGAACTGCACTGTGATTTCGTTGTTGGTTGTGACGGTTTTCGTGGTATTTCACGTCGTGCTATCCCAGCCCGTGAAGGACAAGTGCACGATCGGATCTATCCGTTTGGTTGGCTGGGTATCCTCGCCGAGGCTCCACCCGCGACTAATGAAGTAACCTGGGGCTGTCACGAGGACGGCTTTGCTATGATGTCCATTCGGACGCCTAGCGTAACCCGTTTGTATCTGCAGTGCGAACCTGATGAAAACCCGGACCATTGGTCCGACGACCGTATTTGGTCGGCACTGCATAAGCGGTTGGACGTGCCTGGATTGCCACCAATCAACGAAGGTCGCATTACCCAGAAAGGCGTAACGGCCATGCGTTCTTTTTTGTTTGAGCCCATGCAACACGGTCGTCTGTTTCTGGCCGGTGACGCCGCTCACATCGTCCCTCCGACCGGCGCCAAGGGACTGAACTCTGCGATGGCAGACGTAAAAGTCCTCGCCCGCGCGTTGGAGCAACACTACCAACGTGGATCCCAGGACCTTTTGGCTCGTTATTCAAAGACTTGTCTGAAGCGCATGTGGTTGGTTCAACGGTTCTCGGCCGGACTCTGCACGATGGTACATAGCTTCGCAGGCGATTCTTCTTTCGTTCGTCGCCTTCAGCGCGCTGACTTGGATTACATGACCGGCACGACCGCGGGCCGCTTGCAGTTCTCAGAGAATTTCACGGGCTTGCCCATCGACTAA
<211> Length １１７６
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hydrogenophaga sp.
<400> Sequence ４
ATGCGCACCCAGGTTGGTATCATCGGCGCCGGCCCGGCCGGATTGATGCTCGCGCACATGCTTCACCTTGAGGGCATTGAATCTGTAATTATCGAACGTAGCAAGCGCGAGCATGTACAAAATCGTTTGCGCGCCGGCGTTCTGGAACAGGGCACGGTAGAAATGATGCGTGAACTCGGCTTGGGAGAACGCATCGGACAGCTGGGATTGGAGCAACATCGTATCGACTTTCGTTTTGGAGGAGAATCCCATCCCATTGATTTCCACGAAGCTACCGGCGGACGGTCGGCTTGGGTATATCCCCAACACGAAGTGGTCAAAGATCTGATGGCTGCACGTACCGCTGCCGGTGCCCAGATGCTCTTCGAAACGCCTGTTACTGCTATTGAAGGAATTGACGGCACCCGCCCAGTAGTTCGTTTTGAAAAGGACGGAGTCGCGGGAGAACTGCACTGTGATTTCGTTGTTGGTTGTGACGGTTTTCGTGGTATTTCACGTCGTGCTATCCCAGCCCGTGAAGGACAAGTGCACGATCGGATCTATCCGTTTGGTTGGCTGGGTATCCTCGCCGAGGCTCCACCCGCGACTAATGAAGTAACCTGGGGCTGTCACGAGGACGGCTTTGCTATGATGTCCATTCGGACGCCTAGCGTAACCCGTTTGTATCTGCAGTGCGAACCTGATGAAAACCCGGACCATTGGTCCGACGACCGTATTTGGTCGGCACTGCATAAGCGGTTGGACGTGCCTGGATTGCCACCAATCAACGAAGGTCGCATTACCCAGAAAGGCGTAACGGCCATGCGTTCTTTTTTGTTTGAGCCCATGCAACACGGTCGTCTGTTTCTGGCCGGTGACGCCGCTCACATCGTCCCTCCGACCGGCGCCAAGGGACTGAACTCTGCGATGGCAGACGTAAAAGTCCTCGCCCGCGCGTTGGAGCAACACTACCAACGTGGATCCCAGGACCTTTTGGCTCGTTATTCAAAGACTTGTCTGAAGCGCATGTGGTTGGTTCAACGGTTCTCGGCCGGACTCTGCACGATGGTACATAGCTTCGCAGGCGATTCTTCTTTCGTTCGTCGCCTTCAGCGCGCTGACTTGGATTACATGACCGGCACGACCGCGGGCCGCTTGCAGTTCTCAGAGAATTTCACGGGCTTGCCCATCGACTAA
<210> SEQ ID NO:５
<211> Length ４３
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hydrogenophaga sp.
<400> Sequence ５
ATCACCACAGCCAGGATCCGAATTCGCGGACCCAGGTCGGCAT
<211> Length ４３
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hydrogenophaga sp.
<400> Sequence ５
ATCACCACAGCCAGGATCCGAATTCGCGGACCCAGGTCGGCAT
<210> SEQ ID NO:６
<211> Length ６１
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hydrogenophaga sp.
<400> Sequence ６
TTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTATTCAATCGGAAGTCCAGTGAAATTCTCTGAAAACG
<211> Length ６１
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hydrogenophaga sp.
<400> Sequence ６
TTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTATTCAATCGGAAGTCCAGTGAAATTCTCTGAAAACG
<210> SEQ ID NO:７
<211> Length １１７６
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Polaromonas sp.
<400> Sequence ７
ATGCGGACCCAGGTCGGCATCGTGGGTGCGGGTCCTGCCGGATTGATGTTGTCACACATGCTCCACCTTGAAGGTATCGAATCAGTGATCATCGAACGCGCATCACGCGAGCATGTACAAAGCCGCCTTCGGGCCGGTGTACTTGAGCATGGCACCGTTGACATGCTGCGCGAGTTGGGCTTGGGTGAGCGCATTGGCAAGATTGGCTTGGAGCAGCATGCTATTGATTTTCGGTTTGGAGGCGAGTCCCATCGCTTGGACTTTCACCAAGCGACGAATGGACGGTCGGCATGGGTGTACCCTCAGCATGAGTTGGTGACTGATTTGATGAATGCACGTATGCAAGCTGGTGCTGAGATTCTCTTCGAAACTCCCGTAACTCGGATTGACGGACTGCATACCAGCAAACCAACTGTTCACTTCGAGCAAGGAGGCGAGCCGCGTGAGCTCGTCTGTGACTTCGTGGTAGGTTGTGACGGCTTTCGTGGTGTATGTCGTGATGCTATTCCTGATACCGTACTTAAAACTTACGATCGTGTGTACCCCTTCGGCTGGCTGGGTATTTTGGCTGAAGCACCGGCCCCGACTCGCGAAATCACTTGGGGCTGCCACGAAGAAGGATTTGCCATGCTCTCTATCCGTTCGCCGAGCGTGACCCGTTTGTATCTCCAGTGCGAACCTGATGATGATCCTGATCATTGGAGCGACGACCATATCTGGGCAGAGCTGCACAAGCGGCTTGATGTTCCCGGCATGCCCCCCGTTAATGAGGGAAAGATTATGCAAAAAGGTGTGACCGCCATGCGCTCGTTTTTGGCAGAGCCTATGCAATATGGCAAGCTTTTCCTTGCAGGAGACGCCGCCCACATTGTGCCCCCAACCGGAGCTAAAGGTCTCAATTCCGCTATGGCGGATGTCAAAGTGCTTGGTCGTGGCTTGGCTGAAAAGTACCGGCGTGGTGCTGATCACCTTTTGGAACGTTATTCCCAAATCTGTCTCAAGCGCATGTGGTTGGTACAACGTTTTTCCGCGGGCTTGTGCACGATGGTGCACCAATTCCCCGGTGATAACGCTTTTGTGCGGCGCTTGCAACGGGCTGACCTTGATTACATGACCGGAACGGCGGCGGGACGTCTCGCGTTTTCAGAGAATTTCACTGGACTTCCGATTGAATAA
<211> Length １１７６
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Polaromonas sp.
<400> Sequence ７
ATGCGGACCCAGGTCGGCATCGTGGGTGCGGGTCCTGCCGGATTGATGTTGTCACACATGCTCCACCTTGAAGGTATCGAATCAGTGATCATCGAACGCGCATCACGCGAGCATGTACAAAGCCGCCTTCGGGCCGGTGTACTTGAGCATGGCACCGTTGACATGCTGCGCGAGTTGGGCTTGGGTGAGCGCATTGGCAAGATTGGCTTGGAGCAGCATGCTATTGATTTTCGGTTTGGAGGCGAGTCCCATCGCTTGGACTTTCACCAAGCGACGAATGGACGGTCGGCATGGGTGTACCCTCAGCATGAGTTGGTGACTGATTTGATGAATGCACGTATGCAAGCTGGTGCTGAGATTCTCTTCGAAACTCCCGTAACTCGGATTGACGGACTGCATACCAGCAAACCAACTGTTCACTTCGAGCAAGGAGGCGAGCCGCGTGAGCTCGTCTGTGACTTCGTGGTAGGTTGTGACGGCTTTCGTGGTGTATGTCGTGATGCTATTCCTGATACCGTACTTAAAACTTACGATCGTGTGTACCCCTTCGGCTGGCTGGGTATTTTGGCTGAAGCACCGGCCCCGACTCGCGAAATCACTTGGGGCTGCCACGAAGAAGGATTTGCCATGCTCTCTATCCGTTCGCCGAGCGTGACCCGTTTGTATCTCCAGTGCGAACCTGATGATGATCCTGATCATTGGAGCGACGACCATATCTGGGCAGAGCTGCACAAGCGGCTTGATGTTCCCGGCATGCCCCCCGTTAATGAGGGAAAGATTATGCAAAAAGGTGTGACCGCCATGCGCTCGTTTTTGGCAGAGCCTATGCAATATGGCAAGCTTTTCCTTGCAGGAGACGCCGCCCACATTGTGCCCCCAACCGGAGCTAAAGGTCTCAATTCCGCTATGGCGGATGTCAAAGTGCTTGGTCGTGGCTTGGCTGAAAAGTACCGGCGTGGTGCTGATCACCTTTTGGAACGTTATTCCCAAATCTGTCTCAAGCGCATGTGGTTGGTACAACGTTTTTCCGCGGGCTTGTGCACGATGGTGCACCAATTCCCCGGTGATAACGCTTTTGTGCGGCGCTTGCAACGGGCTGACCTTGATTACATGACCGGAACGGCGGCGGGACGTCTCGCGTTTTCAGAGAATTTCACTGGACTTCCGATTGAATAA
<210> SEQ ID NO:８
<211> Length ４４
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Polaromonas sp.
<400> Sequence ８
ATCACCACAGCCAGGATCCGAATTCGCGCACCCAGGTTGGTATC
<211> Length ４４
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Polaromonas sp.
<400> Sequence ８
ATCACCACAGCCAGGATCCGAATTCGCGCACCCAGGTTGGTATC
<210> SEQ ID NO:９
<211> Length ４１
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Polaromonas sp.
<400> Sequence ９
TTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTAGTCGATGGGCAAGCC
<211> Length ４１
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Polaromonas sp.
<400> Sequence ９
TTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTAGTCGATGGGCAAGCC
<210> SEQ ID NO:１０
<211> Length ２７
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence １０
CTGTGGCGGAAAACTACGTGGGACTGC
<211> Length ２７
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence １０
CTGTGGCGGAAAACTACGTGGGACTGC
<210> SEQ ID NO:１１
<211> ２７
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence １１
GCAGTCCCACGAAGTTTTCCGCCACAG
<211> ２７
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence １１
GCAGTCCCACGAAGTTTTCCGCCACAG
<210> SEQ ID NO:１２
<211> Length ２７
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence １２
CATCGTTCCTCCGGCTGGCGCAAAGGG
<211> Length ２７
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence １２
CATCGTTCCTCCGGCTGGCGCAAAGGG
<210> SEQ ID NO:１３
<211> Length ２７
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence １３
CCCTTTGCGCCAGCCGGAGGAACGATG
<211> Length ２７
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence １３
CCCTTTGCGCCAGCCGGAGGAACGATG
<210> SEQ ID NO:１４
<211> Length １１８５
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Pseudomonas aeruginosa
<400> Sequence １４
ATGAAAACACAGGTAGCCATCATTGGTGCGGGTCCAAGTGGGTTGTTGCTCGGCCAGTTACTCCACAAAGCAGGCATCGATAACGTGATTCTGGAGCGTCAAACGCCGGATTACGTACTGGGACGCATTCGCGCGGGAGTGCTGGAACAAGGTATGGTTGATCTGCTGCGTGAAGCGGGAGTAGATCGCCGGATGGCGCGCGACGGCTTAGTGCATGAAGGTGTCGAGATCGCTTTCGCTGGGCAACGCCGTCGGATCGACCTGAAACGCCTGTCTGGCGGTAAAACGGTGACCGTGTATGGCCAGACAGAAGTGACGCGTGACCTGATGGAGGCACGTGAAGCCTGTGGCGCTACGACCGTTTATCAGGCCGCGGAAGTCCGCTTACACGATTTGCAGGGTGAACGTCCGTATGTCACCTTCGAACGGGATGGGGAACGCCTGCGCTTGGACTGCGACTATATTGCTGGTTGCGATGGCTTTCATGGCATTTCACGTCAGAGCATTCCGGCAGAACGCTTAAAAGTGTTCGAACGTGTCTACCCTTTTGGTTGGTTAGGCCTGCTTGCCGATACTCCACCCGTTTCGCACGAACTGATCTACGCAAATCATCCGCGTGGCTTTGCCTTGTGCTCCCAACGTTCCGCGACGCGCTCTCGTTATTACGTGCAAGTTCCACTCAGTGAGAAAGTTGAGGATTGGAGCGATGAACGCTTCTGGACCGAACTCAAGGCACGCTTACCCAGTGAGGTAGCCGAAAAGCTGGTGACTGGCCCGTCACTTGAAAAGAGCATTGCACCGTTGCGCTCGTTTGTTGTCGAACCTATGCAGCATGGCCGCCTGTTTCTGGCGGGAGATGCCGCGCACATTGTTCCGCCTACTGGCGCGAAAGGGCTGAATCTGGCAGCTTCAGACGTTTCTACCCTCTATCGCCTGCTGCTTAAAGCCTATCGTGAGGGTCGTGGGGAACTGCTGGAACGCTATTCGGCGATCTGTCTGCGCCGTATCTGGAAAGCGGAACGCTTTAGCTGGTGGATGACCAGCGTGCTGCATCGGTTTCCGGATACCGACGCCTTCAGCCAGCGCATCCAGCAGACCGAACTGGAGTACTACCTTGGCTCCGAAGCTGGTCTGGCGACAATTGCGGAAAACTACGTCGGTCTGCCGTATGAGGAGATTGAGTAA
<211> Length １１８５
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Pseudomonas aeruginosa
<400> Sequence １４
ATGAAAACACAGGTAGCCATCATTGGTGCGGGTCCAAGTGGGTTGTTGCTCGGCCAGTTACTCCACAAAGCAGGCATCGATAACGTGATTCTGGAGCGTCAAACGCCGGATTACGTACTGGGACGCATTCGCGCGGGAGTGCTGGAACAAGGTATGGTTGATCTGCTGCGTGAAGCGGGAGTAGATCGCCGGATGGCGCGCGACGGCTTAGTGCATGAAGGTGTCGAGATCGCTTTCGCTGGGCAACGCCGTCGGATCGACCTGAAACGCCTGTCTGGCGGTAAAACGGTGACCGTGTATGGCCAGACAGAAGTGACGCGTGACCTGATGGAGGCACGTGAAGCCTGTGGCGCTACGACCGTTTATCAGGCCGCGGAAGTCCGCTTACACGATTTGCAGGGTGAACGTCCGTATGTCACCTTCGAACGGGATGGGGAACGCCTGCGCTTGGACTGCGACTATATTGCTGGTTGCGATGGCTTTCATGGCATTTCACGTCAGAGCATTCCGGCAGAACGCTTAAAAGTGTTCGAACGTGTCTACCCTTTTGGTTGGTTAGGCCTGCTTGCCGATACTCCACCCGTTTCGCACGAACTGATCTACGCAAATCATCCGCGTGGCTTTGCCTTGTGCTCCCAACGTTCCGCGACGCGCTCTCGTTATTACGTGCAAGTTCCACTCAGTGAGAAAGTTGAGGATTGGAGCGATGAACGCTTCTGGACCGAACTCAAGGCACGCTTACCCAGTGAGGTAGCCGAAAAGCTGGTGACTGGCCCGTCACTTGAAAAGAGCATTGCACCGTTGCGCTCGTTTGTTGTCGAACCTATGCAGCATGGCCGCCTGTTTCTGGCGGGAGATGCCGCGCACATTGTTCCGCCTACTGGCGCGAAAGGGCTGAATCTGGCAGCTTCAGACGTTTCTACCCTCTATCGCCTGCTGCTTAAAGCCTATCGTGAGGGTCGTGGGGAACTGCTGGAACGCTATTCGGCGATCTGTCTGCGCCGTATCTGGAAAGCGGAACGCTTTAGCTGGTGGATGACCAGCGTGCTGCATCGGTTTCCGGATACCGACGCCTTCAGCCAGCGCATCCAGCAGACCGAACTGGAGTACTACCTTGGCTCCGAAGCTGGTCTGGCGACAATTGCGGAAAACTACGTCGGTCTGCCGTATGAGGAGATTGAGTAA
<210> SEQ ID NO:１５
<211>Length ２２
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Pseudomonas aeruginosa
<400> Sequence １５
TTCGTCGGTCTGCCGTATGAGG
<211>Length ２２
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Pseudomonas aeruginosa
<400> Sequence １５
TTCGTCGGTCTGCCGTATGAGG
<210> SEQ ID NO:１６
<211> Length ２１
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Pseudomonas aeruginosa
<400> Sequence １６
GTTTTCCGCAATTGTCGCCAG
<211> Length ２１
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Pseudomonas aeruginosa
<400> Sequence １６
GTTTTCCGCAATTGTCGCCAG
<210> SEQ ID NO:１７
<211> Length １１８８
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence １７
ATGAATCACGTACCTGTGGCAATCATTGGAGCTGGCCCCGCGGGTCTGACGCTGGCCCACCTGCTGCATCTTCAAGGCGTCGAGAGCATTGTGTTCGAGTCTCGGACGCGCAAGGATGTAGAAGAGACTGTTCGTGCTGGAATCTTGGAACAAGGCACGCTCAATTTGATGCGTGAAACCGGTGTCGGAGCACGTATGGAAGCCGAGGCTGACCATGACGAGGCAATCGACATCTCTATCAACAATGAGCGCACGCGCATCCCGCTTACCGAGTTGACGGGCCACAAAGTAGCTATTTACCCACAGCATGAATATCTGAAGGATTTCATCGCAAAGCGCATCGAGGACGGTGGAGAACTCTTGTTTACCACGACTGTAGACAGCGTTGAAAACTACGAAGGAGACCTGGCTAAGGTTACGTATACCGAAGCAGACGGATCAAGCACTACTATTACCGCTGACTACGTTATCGCCGCGGACGGCTCGAACTCGCCTTATCGCAAGCTCATTACCGAAGATGGCGGTGTACGTGCGCGCCATGAATATCCATACGCTTGGTTCGGTATCCTCGTAGAGGCCCCCAAAACCCAAAAGGAGCTGATTTATGCGACGCACCCGGAAGGCTTCGCCCTGATCAGCACGCGTACTGACGAAATCCAGCGGTATTATCTGCAATGCAATCCAGATGATACCCCCGACATGTGGCCGGACGATCGCATTTGGGAGCAGTTGCACCTTCGTGCCGATAGCCCTGGAATTACTGTGTCCGAGGGACGGATTTTCGACAAAGCGGTTCTGCGTTTCTGTTCCGCGGTCACGGAGCCTATGCAGAAAGGCCGCCTGTTTTTGGCGGGAGATGCGGCTCATACCGTACCGCCTACGGGTGCAAAAGGCCTCAATCTGGCGGTAGCTGATGTATCCGTCCTGGCACCCGCGTTGGTTCGTGCATTGAAGAAGAAGGATACCGGTCTTCTGGATTCCTACACCAGCCTGGCAGTTCCACGCATCTGGAAAGCTCAACACTTTTCTTATTGGATGTCGTCAATGCTCCACGCCGTGCCCGGAGAGGATCACTTCGCAACGCAACGCCGTTTCGCCGAACTTCGTTCTGTCCTGGAGTCTCAGAGCGGACAACGTTACCTCGCTGAGCAATACGTTGGCCGGGATCTCCCGCGGTTTGAAGTGTAA
<211> Length １１８８
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence １７
ATGAATCACGTACCTGTGGCAATCATTGGAGCTGGCCCCGCGGGTCTGACGCTGGCCCACCTGCTGCATCTTCAAGGCGTCGAGAGCATTGTGTTCGAGTCTCGGACGCGCAAGGATGTAGAAGAGACTGTTCGTGCTGGAATCTTGGAACAAGGCACGCTCAATTTGATGCGTGAAACCGGTGTCGGAGCACGTATGGAAGCCGAGGCTGACCATGACGAGGCAATCGACATCTCTATCAACAATGAGCGCACGCGCATCCCGCTTACCGAGTTGACGGGCCACAAAGTAGCTATTTACCCACAGCATGAATATCTGAAGGATTTCATCGCAAAGCGCATCGAGGACGGTGGAGAACTCTTGTTTACCACGACTGTAGACAGCGTTGAAAACTACGAAGGAGACCTGGCTAAGGTTACGTATACCGAAGCAGACGGATCAAGCACTACTATTACCGCTGACTACGTTATCGCCGCGGACGGCTCGAACTCGCCTTATCGCAAGCTCATTACCGAAGATGGCGGTGTACGTGCGCGCCATGAATATCCATACGCTTGGTTCGGTATCCTCGTAGAGGCCCCCAAAACCCAAAAGGAGCTGATTTATGCGACGCACCCGGAAGGCTTCGCCCTGATCAGCACGCGTACTGACGAAATCCAGCGGTATTATCTGCAATGCAATCCAGATGATACCCCCGACATGTGGCCGGACGATCGCATTTGGGAGCAGTTGCACCTTCGTGCCGATAGCCCTGGAATTACTGTGTCCGAGGGACGGATTTTCGACAAAGCGGTTCTGCGTTTCTGTTCCGCGGTCACGGAGCCTATGCAGAAAGGCCGCCTGTTTTTGGCGGGAGATGCGGCTCATACCGTACCGCCTACGGGTGCAAAAGGCCTCAATCTGGCGGTAGCTGATGTATCCGTCCTGGCACCCGCGTTGGTTCGTGCATTGAAGAAGAAGGATACCGGTCTTCTGGATTCCTACACCAGCCTGGCAGTTCCACGCATCTGGAAAGCTCAACACTTTTCTTATTGGATGTCGTCAATGCTCCACGCCGTGCCCGGAGAGGATCACTTCGCAACGCAACGCCGTTTCGCCGAACTTCGTTCTGTCCTGGAGTCTCAGAGCGGACAACGTTACCTCGCTGAGCAATACGTTGGCCGGGATCTCCCGCGGTTTGAAGTGTAA
<210> SEQ ID NO:１８
<211> Length ４３
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence １８
ATCACCACAGCCAGGATCCGAATTCAAATCACGTACCTGTGGC
<211> Length ４３
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence １８
ATCACCACAGCCAGGATCCGAATTCAAATCACGTACCTGTGGC
<210> SEQ ID NO:１９
<211> Length ４１
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence １９
TTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTACACTTCAAACCGCGG
<211> Length ４１
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence １９
TTAAGCATTATGCGGCCGCAAGCTTACACTTCAAACCGCGG
<210> SEQ ID NO:２０
<211> Length ４０２
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence ２０
MSYPTRTQVAIIGAGPSGLMLGALLHKAGIDTVVLERQSGDYVLGRIRAGVLEQVTMDLMDEIGVGARMHQEGLVHGGFDMLFQGQRHRIDMNRLTGGQNVMVYGQTEVTRDLMDARQQAGLTTIYEAANVAIHDFGSGKPRVTYEKDGKTHELQCDFIAGCDGFHGVCRDTVKKSASASAIREYEKVYNFGWLGLLSDTPPVHHELIYVNSERGFALCSQRSATRSRYYLQVPLTDKVEQWSDQAFWDELKLRLDPQAREHLVTGPSIEKSIAPLRSFVTEPLRFGRLFLAGDAGHIVPPAGAKGLNLAATDVKYLSAALTEFYQGKSEAGINHYSERCLKRIWRAERFSWWFTSLMHRFPENGEIGQKLQEAELDYIVHSETGARSVAENFVGLPLDFGA
<211> Length ４０２
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence ２０
MSYPTRTQVAIIGAGPSGLMLGALLHKAGIDTVVLERQSGDYVLGRIRAGVLEQVTMDLMDEIGVGARMHQEGLVHGGFDMLFQGQRHRIDMNRLTGGQNVMVYGQTEVTRDLMDARQQAGLTTIYEAANVAIHDFGSGKPRVTYEKDGKTHELQCDFIAGCDGFHGVCRDTVKKSASASAIREYEKVYNFGWLGLLSDTPPVHHELIYVNSERGFALCSQRSATRSRYYLQVPLTDKVEQWSDQAFWDELKLRLDPQAREHLVTGPSIEKSIAPLRSFVTEPLRFGRLFLAGDAGHIVPPAGAKGLNLAATDVKYLSAALTEFYQGKSEAGINHYSERCLKRIWRAERFSWWFTSLMHRFPENGEIGQKLQEAELDYIVHSETGARSVAENFVGLPLDFGA
<210> SEQ ID NO:２１
<211> Length ３９１
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Hydrogenophaga sp.
<400> Sequence ２１
MRTQVGIIGAGPAGLMLAHMLHLEGIESVIIERSKREHVQNRLRAGVLEQGTVEMMRELGLGERIGQLGLEQHRIDFRFGGESHPIDFHEATGGRSAWVYPQHEVVKDLMAARTAAGAQMLFETPVTAIEGIDGTRPVVRFEKDGVAGELHCDFVVGCDGFRGISRRAIPAREGQVHDRIYPFGWLGILAEAPPATNEVTWGCHEDGFAMMSIRTPSVTRLYLQCEPDENPDHWSDDRIWSALHKRLDVPGLPPINEGRITQKGVTAMRSFLFEPMQHGRLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNSAMADVKVLARALEQHYQRGSQDLLARYSKTCLKRMWLVQRFSAGLCTMVHSFAGDSSFVRRLQRADLDYMTGTTAGRLQFSENFTGLPID
<211> Length ３９１
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Hydrogenophaga sp.
<400> Sequence ２１
MRTQVGIIGAGPAGLMLAHMLHLEGIESVIIERSKREHVQNRLRAGVLEQGTVEMMRELGLGERIGQLGLEQHRIDFRFGGESHPIDFHEATGGRSAWVYPQHEVVKDLMAARTAAGAQMLFETPVTAIEGIDGTRPVVRFEKDGVAGELHCDFVVGCDGFRGISRRAIPAREGQVHDRIYPFGWLGILAEAPPATNEVTWGCHEDGFAMMSIRTPSVTRLYLQCEPDENPDHWSDDRIWSALHKRLDVPGLPPINEGRITQKGVTAMRSFLFEPMQHGRLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNSAMADVKVLARALEQHYQRGSQDLLARYSKTCLKRMWLVQRFSAGLCTMVHSFAGDSSFVRRLQRADLDYMTGTTAGRLQFSENFTGLPID
<210> SEQ ID NO:２２
<211> Length ３９１
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Polaromonas sp.
<400> Sequence ２２
MRTQVGIVGAGPAGLMLSHMLHLEGIESVIIERASREHVQSRLRAGVLEHGTVDMLRELGLGERIGKIGLEQHAIDFRFGGESHRLDFHQATNGRSAWVYPQHELVTDLMNARMQAGAEILFETPVTRIDGLHTSKPTVHFEQGGEPRELVCDFVVGCDGFRGVCRDAIPDTVLKTYDRVYPFGWLGILAEAPAPTREITWGCHEEGFAMLSIRSPSVTRLYLQCEPDDDPDHWSDDHIWAELHKRLDVPGMPPVNEGKIMQKGVTAMRSFLAEPMQYGKLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNSAMADVKVLGRGLAEKYRRGADHLLERYSQICLKRMWLVQRFSAGLCTMVHQFPGDNAFVRRLQRADLDYMTGTAAGRLAFSENFTGLPIE
<211> Length ３９１
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Polaromonas sp.
<400> Sequence ２２
MRTQVGIVGAGPAGLMLSHMLHLEGIESVIIERASREHVQSRLRAGVLEHGTVDMLRELGLGERIGKIGLEQHAIDFRFGGESHRLDFHQATNGRSAWVYPQHELVTDLMNARMQAGAEILFETPVTRIDGLHTSKPTVHFEQGGEPRELVCDFVVGCDGFRGVCRDAIPDTVLKTYDRVYPFGWLGILAEAPAPTREITWGCHEEGFAMLSIRSPSVTRLYLQCEPDDDPDHWSDDHIWAELHKRLDVPGMPPVNEGKIMQKGVTAMRSFLAEPMQYGKLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNSAMADVKVLGRGLAEKYRRGADHLLERYSQICLKRMWLVQRFSAGLCTMVHQFPGDNAFVRRLQRADLDYMTGTAAGRLAFSENFTGLPIE
<210> SEQ ID NO:２３
<211> Length ３９７
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Limnohabitans sp.
<400> Sequence ２３
MSTTRTQVAIVGAGPSGLLLGQLLFKAGIDAIIVERQSPDYVLSRIRAGVLEQVTMDLLDEAGVGQRMHKEGLVHTGFDLLFKGARHRIDMDHLTGGKKVIVYGQTEVTRDLMDTRQAEGLPTVYEAGNVQVHDFDSQKPRVTYEKNGQLHTIECDFIAGCDGFHGVCRASAPKNAIKEYEKVYPFGWLGVLSDTPPVHHELIYANSTRGFALCSQRSATRSRYYLQVPTTDKVEQWSDDAFWAELRNRLDPEAREHLVTGPSIEKSIAPLRSFVTEPMRFGRMFLAGDAAHIVPPTGAKGLNLAATDVKYLSTAFIEFYADQTEAGIDAYSERCLRRVWRAERFSWWFTSLMHHFPENGDIGQKFQDAELDYLIHSEAGSRTMAENYVGLPLNFGE
<211> Length ３９７
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Limnohabitans sp.
<400> Sequence ２３
MSTTRTQVAIVGAGPSGLLLGQLLFKAGIDAIIVERQSPDYVLSRIRAGVLEQVTMDLLDEAGVGQRMHKEGLVHTGFDLLFKGARHRIDMDHLTGGKKVIVYGQTEVTRDLMDTRQAEGLPTVYEAGNVQVHDFDSQKPRVTYEKNGQLHTIECDFIAGCDGFHGVCRASAPKNAIKEYEKVYPFGWLGVLSDTPPVHHELIYANSTRGFALCSQRSATRSRYYLQVPTTDKVEQWSDDAFWAELRNRLDPEAREHLVTGPSIEKSIAPLRSFVTEPMRFGRMFLAGDAAHIVPPTGAKGLNLAATDVKYLSTAFIEFYADQTEAGIDAYSERCLRRVWRAERFSWWFTSLMHHFPENGDIGQKFQDAELDYLIHSEAGSRTMAENYVGLPLNFGE
<210> SEQ ID NO:２４
<211> Length ３９１
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Rhodoferax sedimins
<400> Sequence ２４
MRTQVGIVGAGPAGLMLSHMLHLEGIESVIIERASREHVQSRLRAGVLEHGTVDMLKELGLGERISTLGLEQHAIDFRFGGESHRLDFHQATNGRRTWVYPQHEVVTDLMKARMQAGAQILFETSVTRIEGLQTRKPTIHFEQGGEPRELQCDFIVGCDGFRGVCRDAIPDSVLKIYDRVYPFGWLGILAEAPAPTNEITWGCHEDGFAMLSIRSPSVTRLYLQCEPNEDADRWSDGRIWAELHKRLDVPGMPPVNEGKITQKGVTAMRSFLAEPMQYGRLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNSSMADVKVLGRGLVEQYKRGVADILDRYSQICLKRMWLVQRFSAGLCTMVHQIPGDNAFVRRLQRADLDYMTGTVAGRLAFSENFTGLPIE
<211> Length ３９１
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Rhodoferax sedimins
<400> Sequence ２４
MRTQVGIVGAGPAGLMLSHMLHLEGIESVIIERASREHVQSRLRAGVLEHGTVDMLKELGLGERISTLGLEQHAIDFRFGGESHRLDFHQATNGRRTWVYPQHEVVTDLMKARMQAGAQILFETSVTRIEGLQTRKPTIHFEQGGEPRELQCDFIVGCDGFRGVCRDAIPDSVLKIYDRVYPFGWLGILAEAPAPTNEITWGCHEDGFAMLSIRSPSVTRLYLQCEPNEDADRWSDGRIWAELHKRLDVPGMPPVNEGKITQKGVTAMRSFLAEPMQYGRLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNSSMADVKVLGRGLVEQYKRGVADILDRYSQICLKRMWLVQRFSAGLCTMVHQIPGDNAFVRRLQRADLDYMTGTVAGRLAFSENFTGLPIE
<210> SEQ ID NO:２５
<211> Length ３９１
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Xylophilus ampelinus
<400> Sequence ２５
MRTQVGIVGAGPAGLMLAHLLRREGIDAVVIERAAREHVRTRLRAGVLEQGTVEMLREAGVGGRIDAVGMEMHAIDFRFGGRSHRLDFHEASGGRRAWVYPQHEVVTDLMSACDAGDVPILYEAPVERIEGLEDDRARIVFGQDGAAGEITCDFVAGCDGFRGVSRGSMPAGIARGYDRIYPFGWLGILADAPPASPDVTWGCSDRGFAMMSMRSPTVTRLYLQCEPDEDPDAWSDDRIWSELHRRLDVEGMPSLREGPIRDKGVTAMRSFLSEPMQHGRLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNSAMADIKVLAAALVDHYRHGRSDRLATYSERCLRRMWLVQRFSAALCTMVHQFPGQNEFVRRLQRADLDYMTGTHAGRLQFAENFTGLPIE
<211> Length ３９１
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Xylophilus ampelinus
<400> Sequence ２５
MRTQVGIVGAGPAGLMLAHLLRREGIDAVVIERAAREHVRTRLRAGVLEQGTVEMLREAGVGGRIDAVGMEMHAIDFRFGGRSHRLDFHEASGGRRAWVYPQHEVVTDLMSACDAGDVPILYEAPVERIEGLEDDRARIVFGQDGAAGEITCDFVAGCDGFRGVSRGSMPAGIARGYDRIYPFGWLGILADAPPASPDVTWGCSDRGFAMMSMRSPTVTRLYLQCEPDEDPDAWSDDRIWSELHRRLDVEGMPSLREGPIRDKGVTAMRSFLSEPMQHGRLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNSAMADIKVLAAALVDHYRHGRSDRLATYSERCLRRMWLVQRFSAALCTMVHQFPGQNEFVRRLQRADLDYMTGTHAGRLQFAENFTGLPIE
<210> SEQ ID NO:２６
<211> Length ３９０
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Ramlibacter henchirensis
<400> Sequence ２６
MRTQVGIVGAGPAGLMLAQILHLQGIDSVLIERASQEHVRSRLRAGVLEQGTVEMMREFGVGERVMKVGLRQRAIDFRFNGESHPIDFESVCGRNTWVYPQHEVVSDLMAARERSGLPVVYDAPVSRIEGLDGGRPVIHYERDGEPLRLECDYVAGCDGFRGISRSWIPADRLKVYDRIYPFGWLGILADAKPAIQDITWGCHEDGFAMMSIRSPTVTRLYLQCEPDENPDDWPDDRIWAELHKRLDVPGLPRLEEGRITQKGVTAMRSFLAEPMQYGRLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNSALADVKVLARALTEQYRNENGQWLERYSDICLKRMWLVQRFSSGLCTMTHQFRGDEPFVRRLQRADLEYMTMHAPGRLEFSENFTGLPVE
<211> Length ３９０
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Ramlibacter henchirensis
<400> Sequence ２６
MRTQVGIVGAGPAGLMLAQILHLQGIDSVLIERASQEHVRSRLRAGVLEQGTVEMMREFGVGERVMKVGLRQRAIDFRFNGESHPIDFESVCGRNTWVYPQHEVVSDLMAARERSGLPVVYDAPVSRIEGLDGGRPVIHYERDGEPLRLECDYVAGCDGFRGISRSWIPADRLKVYDRIYPFGWLGILADAKPAIQDITWGCHEDGFAMMSIRSPTVTRLYLQCEPDENPDDWPDDRIWAELHKRLDVPGLPRLEEGRITQKGVTAMRSFLAEPMQYGRLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNSALADVKVLARALTEQYRNENGQWLERYSDICLKRMWLVQRFSSGLCTMTHQFRGDEPFVRRLQRADLEYMTMHAPGRLEFSENFTGLPVE
<210> SEQ ID NO:２７
<211> Length ３７４
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Comamonas phosphati
<400> Sequence ２７
MSHMLHLAGIESVVLERAGREHVRTRLRAGVLEQGVVEMLRELGLGERLDQLALKQSALDFRFDGASRRIDFEAEIGRNVWVYPQHEVVTDLMNARQKAGAAIFYEAPVQRIDGLEGERPVLHFEHQGESCRLECDYVAGCDGFRGVSRSAIPADKLKVFDRIYPFGWLGILAEAPAATNEIVWGCHDGGFAMQSIRSPSVTRLYLQCAPDENPDHWSDDRIWSELHKRLDVEGMPPVNEGRVTQKGVTAMRSFLAEPMQWGRLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNSALADIKVLARALVAHYREGADAHLARYSDTCLRRMWLVQRFSAGLCTMTHQFPGQNPFVQRLQRTDLDYMTGTRAGRLQFSENFTGLPVE
<211> Length ３７４
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Comamonas phosphati
<400> Sequence ２７
MSHMLHLAGIESVVLERAGREHVRTRLRAGVLEQGVVEMLRELGLGERLDQLALKQSALDFRFDGASRRIDFEAEIGRNVWVYPQHEVVTDLMNARQKAGAAIFYEAPVQRIDGLEGERPVLHFEHQGESCRLECDYVAGCDGFRGVSRSAIPADKLKVFDRIYPFGWLGILAEAPAATNEIVWGCHDGGFAMQSIRSPSVTRLYLQCAPDENPDHWSDDRIWSELHKRLDVEGMPPVNEGRVTQKGVTAMRSFLAEPMQWGRLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNSALADIKVLARALVAHYREGADAHLARYSDTCLRRMWLVQRFSAGLCTMTHQFPGQNPFVQRLQRTDLDYMTGTRAGRLQFSENFTGLPVE
<210> SEQ ID NO:２８
<211> Length ３９４
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Pseudomonas aeruginosa
<400> Sequence ２８
MKTQVAIIGAGPSGLLLGQLLHKAGIDNVILERQTPDYVLGRIRAGVLEQGMVDLLREAGVDRRMARDGLVHEGVEIAFAGQRRRIDLKRLSGGKTVTVYGQTEVTRDLMEAREACGATTVYQAAEVRLHDLQGERPYVTFERDGERLRLDCDYIAGCDGFHGISRQSIPAERLKVFERVYPFGWLGLLADTPPVSHELIYANHPRGFALCSQRSATRSRYYVQVPLSEKVEDWSDERFWTELKARLPSEVAEKLVTGPSLEKSIAPLRSFVVEPMQHGRLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNLAASDVSTLYRLLLKAYREGRGELLERYSAICLRRIWKAERFSWWMTSVLHRFPDTDAFSQRIQQTELEYYLGSEAGLATIAENYVGLPYEEIE
<211> Length ３９４
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Pseudomonas aeruginosa
<400> Sequence ２８
MKTQVAIIGAGPSGLLLGQLLHKAGIDNVILERQTPDYVLGRIRAGVLEQGMVDLLREAGVDRRMARDGLVHEGVEIAFAGQRRRIDLKRLSGGKTVTVYGQTEVTRDLMEAREACGATTVYQAAEVRLHDLQGERPYVTFERDGERLRLDCDYIAGCDGFHGISRQSIPAERLKVFERVYPFGWLGLLADTPPVSHELIYANHPRGFALCSQRSATRSRYYVQVPLSEKVEDWSDERFWTELKARLPSEVAEKLVTGPSLEKSIAPLRSFVVEPMQHGRLFLAGDAAHIVPPTGAKGLNLAASDVSTLYRLLLKAYREGRGELLERYSAICLRRIWKAERFSWWMTSVLHRFPDTDAFSQRIQQTELEYYLGSEAGLATIAENYVGLPYEEIE
<210> SEQ ID NO:２９
<211> Length ３９５
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence ２９
MNHVPVAIIGAGPAGLTLAHLLHLQGVESIVFESRTRKDVEETVRAGILEQGTLNLMRETGVGARMEAEADHDEAIDISINNERTRIPLTELTGHKVAIYPQHEYLKDFIAKRIEDGGELLFTTTVDSVENYEGDLAKVTYTEADGSSTTITADYVIAADGSNSPYRKLITEDGGVRARHEYPYAWFGILVEAPKTQKELIYATHPEGFALISTRTDEIQRYYLQCNPDDTPDMWPDDRIWEQLHLRADSPGITVSEGRIFDKAVLRFRSAVTEPMQKGRLFLAGDAAHTVPPTGAKGLNLAVADVSVLAPALVRALKKKDTGLLDSYTSLAVPRIWKAQHFSYWMSSMLHAVPGEDHFATQRRFAELRSVLESQSGQRYLAEQYVGRDLPRFEV
<211> Length ３９５
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence ２９
MNHVPVAIIGAGPAGLTLAHLLHLQGVESIVFESRTRKDVEETVRAGILEQGTLNLMRETGVGARMEAEADHDEAIDISINNERTRIPLTELTGHKVAIYPQHEYLKDFIAKRIEDGGELLFTTTVDSVENYEGDLAKVTYTEADGSSTTITADYVIAADGSNSPYRKLITEDGGVRARHEYPYAWFGILVEAPKTQKELIYATHPEGFALISTRTDEIQRYYLQCNPDDTPDMWPDDRIWEQLHLRADSPGITVSEGRIFDKAVLRFRSAVTEPMQKGRLFLAGDAAHTVPPTGAKGLNLAVADVSVLAPALVRALKKKDTGLLDSYTSLAVPRIWKAQHFSYWMSSMLHAVPGEDHFATQRRFAELRSVLESQSGQRYLAEQYVGRDLPRFEV
<210> SEQ ID NO:３０
<211> Length ４０８
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Corynebacterium ammoniagenes
<400> Sequence ３０
MGTPTNSDSSHTPVAIIGAGPAGLMLSHLLHLEGVESVVIEKQSREEVESTVRAGILEQGTIDLLRKTGVGERLDREAEIDEGISISIAGESHRIDFAKYTGKQVAVYPQHEVLIDLIAKRLSDDGELWFDTEVVSIADHESDNPKVHYRTADGTEGVLSADFVVGADGSKSLARKLITDDGGLRMKHEYPFAWFGIMVNAPQTAPEVIYATHPEGFALISTRSENVQRYYLQCNPDDTPDMWSDDRIWEQLHLRADSDTVTVSEGEITDKAVLRFRSAVTDPMQRGRLFIAGDAAHTVPPTGAKGLNLAMADVCALAPSLVRAVKKSDTSLLDTYSERALPRVWKTQHFSYWMSSMLHSVPAENEMSTLFQTNRRLAELSTVVTSDAGRQLLAQQFVGWDFPSIEAL
<211> Length ４０８
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Corynebacterium ammoniagenes
<400> Sequence ３０
MGTPTNSDSSHTPVAIIGAGPAGLMLSHLLHLEGVESVVIEKQSREEVESTVRAGILEQGTIDLLRKTGVGERLDREAEIDEGISISIAGESHRIDFAKYTGKQVAVYPQHEVLIDLIAKRLSDDGELWFDTEVVSIADHESDNPKVHYRTADGTEGVLSADFVVGADGSKSLARKLITDDGGLRMKHEYPFAWFGIMVNAPQTAPEVIYATHPEGFALISTRSENVQRYYLQCNPDDTPDMWSDDRIWEQLHLRADSDTVTVSEGEITDKAVLRFRSAVTDPMQRGRLFIAGDAAHTVPPTGAKGLNLAMADVCALAPSLVRAVKKSDTSLLDTYSERALPRVWKTQHFSYWMSSMLHSVPAENEMSTLFQTNRRLAELSTVVTSDAGRQLLAQQFVGWDFPSIEAL
<210> SEQ ID NO:３１
<211> Length ４０４
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Corynebacterium callunae
<400> Sequence ３１
MNHIPVAIIGAGPAGLTLAHLLHLQGIESIVFEKRTRKEVEETVRAGILEQGTLNLMRETGVGARMEAEADHDEAIDISINGERIRIPLTEITGHKVAIYPQHEYLKDFIAKRLEDGGELLFSTTVDAVEGTGGTGGTEGFDNDKVKVVYTEADGSSTTISADYVIAADGSSSPYRKIITEGSGVRARHEYPYAWFGILVEAAKTQKEVIYATHPEGFALISTRTDTVQRYYLQCDPNDTPDMWSDDRIWEQLHLRADSPGITVSEGKIFDKAVLRFRSAVTEPMQKGRLFLAGDAAHTVPPTGAKGLNLAVADVSVLAPGLVRALKKKDSALLDDYTKLALPRVWKAQHFSYWMSSMLHAVPDEDYFATQRRFAELHSVLGSEAGQRYLAEQFVGRDLPRFEV
<211> Length ４０４
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Corynebacterium callunae
<400> Sequence ３１
MNHIPVAIIGAGPAGLTLAHLLHLQGIESIVFEKRTRKEVEETVRAGILEQGTLNLMRETGVGARMEAEADHDEAIDISINGERIRIPLTEITGHKVAIYPQHEYLKDFIAKRLEDGGELLFSTTVDAVEGTGGTGGTEGFDNDKVKVVYTEADGSSTTISADYVIAADGSSSPYRKIITEGSGVRARHEYPYAWFGILVEAAKTQKEVIYATHPEGFALISTRTDTVQRYYLQCDPNDTPDMWSDDRIWEQLHLRADSPGITVSEGKIFDKAVLRFRSAVTEPMQKGRLFLAGDAAHTVPPTGAKGLNLAVADVSVLAPGLVRALKKKDSALLDDYTKLALPRVWKAQHFSYWMSSMLHAVPDEDYFATQRRFAELHSVLGSEAGQRYLAEQFVGRDLPRFEV
<210> SEQ ID NO:３２
<211> Length ３９９
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Corynebacterium efficiens
<400> Sequence ３２
MNHVPVAIIGAGPAGLTLAHLLHLQGIESVVFESRSRQDVEETVRAGILEQGTLNLMRETGVGERMEREADHDEAIDIAINNENIRIPLTELTGHKVAIYPQHEYLKDFIAKRIEDGGELLFETTVDSVENFEGDAQENKATITYTGVDGTTRQLTADYVVAADGSNSPYRKIITDDGGIRARHEYPYAWFGILVEAPKTQKEVIYATHPEGFALISTRTDTVQRYYLQCDPNDTPEMWSDDRIWEQLHLRADSPGITVSEGKIFDKAVLRFRSAVTEPMQKGRLFIAGDAAHTVPPTGAKGLNLAVADVSVLAPGLTRAIKRNDTGLLDDYTRLTVPRIWKAQHFSYWMSSMLHAVPGEDHFATQRRFAELRSVLESEAGQRYLAEQFVGRDLPRFDY
<211> Length ３９９
<212> Type ＰＲＴ
<213> Organism Corynebacterium efficiens
<400> Sequence ３２
MNHVPVAIIGAGPAGLTLAHLLHLQGIESVVFESRSRQDVEETVRAGILEQGTLNLMRETGVGERMEREADHDEAIDIAINNENIRIPLTELTGHKVAIYPQHEYLKDFIAKRIEDGGELLFETTVDSVENFEGDAQENKATITYTGVDGTTRQLTADYVVAADGSNSPYRKIITDDGGIRARHEYPYAWFGILVEAPKTQKEVIYATHPEGFALISTRTDTVQRYYLQCDPNDTPEMWSDDRIWEQLHLRADSPGITVSEGKIFDKAVLRFRSAVTEPMQKGRLFIAGDAAHTVPPTGAKGLNLAVADVSVLAPGLTRAIKRNDTGLLDDYTRLTVPRIWKAQHFSYWMSSMLHAVPGEDHFATQRRFAELRSVLESEAGQRYLAEQFVGRDLPRFDY
<210> SEQ ID NO:３３
<211> Length ２２４１
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence ３３
ATGCGTTTTGATCTCCATTCTGTAGTTATTTCCACATTGGTTTTCGCTGCGGTTGCTTTGGTATGGCGCTTGTTTTTTGTCGGTGGTTGGCTTGTACGTCGGCGTAAAGCACGTATCCGCAGGCAGACGCTCGCGGATGAAGAGCGGGCAGAAAATGCTGAGGTATCTGCAGGGGAGCCTGCCGAATCGAGCACAAACGAAGCAGCCGAATCTGAATCTGAAACCTCGGAGCGTCGCGGAATCTGGCGCGTGATCTTTGATTACATGCGCGACGGTGGCATCTTGGATCACCGTTGGCTGCTGCCTGCCGCAGGTGCTATCACTGGTGCGTGGCTGATCATTGATCGTGCCGTTGATCTGCTCTTGAGCACCGAGCATGGTTTGGGCGATATCGTCCAAGGCTGGGATGTCCATTGGCATGCTTCGACTGTCCGTTTTATAGATGAGACCGGCATTGCGTCATCCACGATGATGGGGCAGCTGCGCAATATTGAAACGCAGCAAGATCTGTTCTACCCAAGCGCATGGCATGCTGGTGCATGGGTGCTGTCGGATGTCGGAAATCTGACGATTGTTGAAGCCACCAACCTCACTGGCATTGTGCTGTCCGGATTGTTGCTGCCGTTAGCTGTTGCACTGATTGCATGGCGGATGATCAACAATCGTGGACTGACCGCGCAGATTGGTGCGGGCTTTGCTGGACTGATCACCATTGCCTCTCCGGTACTGTTCTGGGTTGGTAACTACGTGGGTGCGTGGCCTTATGTTGCTGCGATCGGTGCTTCAGGTGTGGTGCTTGCGCTGTTTATGTCCACTCCGTCTGTGCCGGTAAGAATCTTTGCCGCAGCATTGGCGTTCATGGGTATGTTCCAGCTGCATCCAGCCCCATCCACCATCGTGATCATGGTGTTGCTGCTGTGGTGGCTGCTCAAACTCGTGGTGGTTCCAAGCCAGAAAGTGAAGGGCTGGAAGGCGGGCATCGGTATCCGTTTGAAGGATGTCGGCATCCTGGCCATCACGGGCATCATCGGTGTGCTCTTCATGCTGCCTCAGGTGATTTCAGGTTCCGAACAAACCGAAGATGTGCTGTCATATTCTGCTGAGGAACAAGTCACCCGCAGCGAGTCCTGGTTGGTGTCTATTTTCATGGAGACCCGCCATGTTGATTTCTTCGGAAATATTGACATCGTCCCAGTGCTGGTATTCGCAGCAATCGGTGGCGTGGTTGCTTTGGTGTGGCGCGGAAACTTGTGGGCGCCGGTGTTTTACTTCGCCAGCGTTGCGTTGACCGCTAACTCGCTGAAGCCTTTTGAAGAGCCGTGGGGTGATTGGCTCAACATCGTGGGCGGTCTGCATTACTCCACAGGACACCGTTTGATCATGCCTGTCGCCATGTTCACTTTTGCTGCCGCAGGTATCGGCGCTGCCGCAGTGATCCGTTTGATCTGCTTGGGACCAATAAAGAAGTTCACCACTGTTTCCGGTGTTGTTTCTGTGGTGATGGCTCTTGTTGTGGCTGTGCCATTGCAGACTTGGGCGAAGGATTTTGTAGAGGAAGGATCCGAAACCACAATCCTTGCGCCACACAATGATGAACGTATGGTGAGCAACAACGACTTGGCTGCCTGGGACTGGTTAATCCAACAGCCAGGTGGAGCTGACATGAACATCATGGGTGACCCCGCAGATGGTAACGGCTGGATGTATGCCTACAACGGCTTGCACTCCGTGGCCCGCCACTATGCATGGCCAGCAGCAGGCGAAGGCTCTGCCACCGCGATGCTGTTCTGGTGGCCTCAACTTCTAGGTGTGGGCACCGATGAAAACCCAGATCAAGTCAACGATGTGGATCAGGCTGCTCGTGATCTCAACGTCGGCTACTTCATGATCAGTCCGTGGACGTTCTGGGATTTCCAGATCCCCAACTTCCGCCAGATCGATCTGCTGTGGCAAACCCCAGGCGTGACACCGGTGTACAAGAAGGGCGACTCGGTGATCTTCGCAGTCAACGATATGTTCACTGACGCCGAACTGGATCAGATGCGTGCACCTGGTAATTCTCCAGAACCACTGCCAGAGCTTCCTACCTTGGGCGAGCTTGGGTTGGCTGAAACTGAAGACGAGGTAGATCAGACTTATTACCATCGTCCAACGGTTCCTGCTGGTGTGAACTCAGAGATGCCTTCAGCCGAAACTCTGTATGCACCGGATCCAACGAAGCCGCATACGGTCCCTAACTAA
<211> Length ２２４１
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence ３３
ATGCGTTTTGATCTCCATTCTGTAGTTATTTCCACATTGGTTTTCGCTGCGGTTGCTTTGGTATGGCGCTTGTTTTTTGTCGGTGGTTGGCTTGTACGTCGGCGTAAAGCACGTATCCGCAGGCAGACGCTCGCGGATGAAGAGCGGGCAGAAAATGCTGAGGTATCTGCAGGGGAGCCTGCCGAATCGAGCACAAACGAAGCAGCCGAATCTGAATCTGAAACCTCGGAGCGTCGCGGAATCTGGCGCGTGATCTTTGATTACATGCGCGACGGTGGCATCTTGGATCACCGTTGGCTGCTGCCTGCCGCAGGTGCTATCACTGGTGCGTGGCTGATCATTGATCGTGCCGTTGATCTGCTCTTGAGCACCGAGCATGGTTTGGGCGATATCGTCCAAGGCTGGGATGTCCATTGGCATGCTTCGACTGTCCGTTTTATAGATGAGACCGGCATTGCGTCATCCACGATGATGGGGCAGCTGCGCAATATTGAAACGCAGCAAGATCTGTTCTACCCAAGCGCATGGCATGCTGGTGCATGGGTGCTGTCGGATGTCGGAAATCTGACGATTGTTGAAGCCACCAACCTCACTGGCATTGTGCTGTCCGGATTGTTGCTGCCGTTAGCTGTTGCACTGATTGCATGGCGGATGATCAACAATCGTGGACTGACCGCGCAGATTGGTGCGGGCTTTGCTGGACTGATCACCATTGCCTCTCCGGTACTGTTCTGGGTTGGTAACTACGTGGGTGCGTGGCCTTATGTTGCTGCGATCGGTGCTTCAGGTGTGGTGCTTGCGCTGTTTATGTCCACTCCGTCTGTGCCGGTAAGAATCTTTGCCGCAGCATTGGCGTTCATGGGTATGTTCCAGCTGCATCCAGCCCCATCCACCATCGTGATCATGGTGTTGCTGCTGTGGTGGCTGCTCAAACTCGTGGTGGTTCCAAGCCAGAAAGTGAAGGGCTGGAAGGCGGGCATCGGTATCCGTTTGAAGGATGTCGGCATCCTGGCCATCACGGGCATCATCGGTGTGCTCTTCATGCTGCCTCAGGTGATTTCAGGTTCCGAACAAACCGAAGATGTGCTGTCATATTCTGCTGAGGAACAAGTCACCCGCAGCGAGTCCTGGTTGGTGTCTATTTTCATGGAGACCCGCCATGTTGATTTCTTCGGAAATATTGACATCGTCCCAGTGCTGGTATTCGCAGCAATCGGTGGCGTGGTTGCTTTGGTGTGGCGCGGAAACTTGTGGGCGCCGGTGTTTTACTTCGCCAGCGTTGCGTTGACCGCTAACTCGCTGAAGCCTTTTGAAGAGCCGTGGGGTGATTGGCTCAACATCGTGGGCGGTCTGCATTACTCCACAGGACACCGTTTGATCATGCCTGTCGCCATGTTCACTTTTGCTGCCGCAGGTATCGGCGCTGCCGCAGTGATCCGTTTGATCTGCTTGGGACCAATAAAGAAGTTCACCACTGTTTCCGGTGTTGTTTCTGTGGTGATGGCTCTTGTTGTGGCTGTGCCATTGCAGACTTGGGCGAAGGATTTTGTAGAGGAAGGATCCGAAACCACAATCCTTGCGCCACACAATGATGAACGTATGGTGAGCAACAACGACTTGGCTGCCTGGGACTGGTTAATCCAACAGCCAGGTGGAGCTGACATGAACATCATGGGTGACCCCGCAGATGGTAACGGCTGGATGTATGCCTACAACGGCTTGCACTCCGTGGCCCGCCACTATGCATGGCCAGCAGCAGGCGAAGGCTCTGCCACCGCGATGCTGTTCTGGTGGCCTCAACTTCTAGGTGTGGGCACCGATGAAAACCCAGATCAAGTCAACGATGTGGATCAGGCTGCTCGTGATCTCAACGTCGGCTACTTCATGATCAGTCCGTGGACGTTCTGGGATTTCCAGATCCCCAACTTCCGCCAGATCGATCTGCTGTGGCAAACCCCAGGCGTGACACCGGTGTACAAGAAGGGCGACTCGGTGATCTTCGCAGTCAACGATATGTTCACTGACGCCGAACTGGATCAGATGCGTGCACCTGGTAATTCTCCAGAACCACTGCCAGAGCTTCCTACCTTGGGCGAGCTTGGGTTGGCTGAAACTGAAGACGAGGTAGATCAGACTTATTACCATCGTCCAACGGTTCCTGCTGGTGTGAACTCAGAGATGCCTTCAGCCGAAACTCTGTATGCACCGGATCCAACGAAGCCGCATACGGTCCCTAACTAA
<210> SEQ ID NO:３４
<211> Length ２６
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence ３４
GAGCTCATGCGTTTTGATCTCCATTC
<211> Length ２６
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence ３４
GAGCTCATGCGTTTTGATCTCCATTC
<210> SEQ ID NO:３５
<211> Length ３３
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence ３５
GAGCTCCTCTAGATTAGTTAGGGACCGTATGCG
<211> Length ３３
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence ３５
GAGCTCCTCTAGATTAGTTAGGGACCGTATGCG
<210> SEQ ID NO:３６
<211> Length １２５
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Escherichia coli
<400> Sequence ３６
TTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTT
<211> Length １２５
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Escherichia coli
<400> Sequence ３６
TTCGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTT
<210> SEQ ID NO:３７ （ＨｇＰｏｂＡ＿ＴＹの配列）
<211> Length １２０９
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence ３７
ATGTCTTACCCTACGCGGACCCAGGTAGCTATCATCGGCGCAGGTCCGTCAGGCCTGATGTTGGGCGCTCTTCTCCACAAGGCTGGTATTGATACGGTTGTTCTCGAACGTCAGTCCGGCGATTATGTTTTGGGACGTATCCGCGCCGGAGTACTCGAACAAGTGACTATGGATCTGATGGATGAGATTGGAGTCGGCGCCCGTATGCACCAGGAGGGCTTGGTTCACGGTGGTTTTGACATGCTGTTTCAAGGCCAACGGCATCGTATTGATATGAATCGGTTGACTGGCGGACAAAATGTAATGGTCTACGGTCAGACCGAAGTCACGCGGGATCTTATGGATGCTCGCCAACAAGCCGGTTTGACCACGATCTACGAGGCTGCAAACGTGGCGATTCATGATTTCGGAAGCGGCAAACCTCGGGTCACGTACGAGAAGGACGGTAAGACCCACGAGTTGCAGTGTGACTTTATTGCAGGTTGTGACGGCTTTCACGGCGTATGCCGGGACACGGTTAAAAAGAGCGCTTCTGCGTCTGCGATCCGGGAGTATGAAAAAGTGTACAACTTTGGCTGGCTGGGTCTCTTGTCTGATACGCCGCCGGTTCATCATGAGcTgATCTATGTAAATTCTGAGCGTGGTTTCGCACTGTGCAGCCAGCGCTCTGCGACCCGTTCTCGTTACTATCTTCAGGTGCCCCTTACCGATAAAGTAGAACAATGGAGCGACCAAGCTTTCTGGGACGAACTGAAACTGCGGCTTGATCCTCAAGCCCGTGAACATTTGGTTACCGGTCCATCAATTGAAAAGTCTATCGCACCGCTCCGGTCATTCGTTACCGAACCCCTGCGGTTTGGCCGTCTCTTCCTGGCCGGCGATGCGGGACACATTGTCCCACCTgCcGGAGCCAAGGGACTTAATCTGGCAGCCACTGATGTGAAGTACTTGAGCGCGGCCCTCACGGAATTTTATCAGGGAAAATCCGAGGCTGGCATCAACCACTACTCTGAACGCTGTCTGAAGCGTATCTGGCGTGCAGAACGGTTTTCCTGGTGGTTTACTTCACTCATGCATCGTTTCCCGGAGAACGGAGAGATCGGCCAGAAGCTTCAGGAAGCAGAGCTCGATTACATTGTCCACTCGGAAACCGGAGCGCGTTCGGTTGCCGAAAACTTTGTTGGACTCCCTCTGGATTTCGGTGCAtaa
<211> Length １２０９
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence ３７
ATGTCTTACCCTACGCGGACCCAGGTAGCTATCATCGGCGCAGGTCCGTCAGGCCTGATGTTGGGCGCTCTTCTCCACAAGGCTGGTATTGATACGGTTGTTCTCGAACGTCAGTCCGGCGATTATGTTTTGGGACGTATCCGCGCCGGAGTACTCGAACAAGTGACTATGGATCTGATGGATGAGATTGGAGTCGGCGCCCGTATGCACCAGGAGGGCTTGGTTCACGGTGGTTTTGACATGCTGTTTCAAGGCCAACGGCATCGTATTGATATGAATCGGTTGACTGGCGGACAAAATGTAATGGTCTACGGTCAGACCGAAGTCACGCGGGATCTTATGGATGCTCGCCAACAAGCCGGTTTGACCACGATCTACGAGGCTGCAAACGTGGCGATTCATGATTTCGGAAGCGGCAAACCTCGGGTCACGTACGAGAAGGACGGTAAGACCCACGAGTTGCAGTGTGACTTTATTGCAGGTTGTGACGGCTTTCACGGCGTATGCCGGGACACGGTTAAAAAGAGCGCTTCTGCGTCTGCGATCCGGGAGTATGAAAAAGTGTACAACTTTGGCTGGCTGGGTCTCTTGTCTGATACGCCGCCGGTTCATCATGAGcTgATCTATGTAAATTCTGAGCGTGGTTTCGCACTGTGCAGCCAGCGCTCTGCGACCCGTTCTCGTTACTATCTTCAGGTGCCCCTTACCGATAAAGTAGAACAATGGAGCGACCAAGCTTTCTGGGACGAACTGAAACTGCGGCTTGATCCTCAAGCCCGTGAACATTTGGTTACCGGTCCATCAATTGAAAAGTCTATCGCACCGCTCCGGTCATTCGTTACCGAACCCCTGCGGTTTGGCCGTCTCTTCCTGGCCGGCGATGCGGGACACATTGTCCCACCTgCcGGAGCCAAGGGACTTAATCTGGCAGCCACTGATGTGAAGTACTTGAGCGCGGCCCTCACGGAATTTTATCAGGGAAAATCCGAGGCTGGCATCAACCACTACTCTGAACGCTGTCTGAAGCGTATCTGGCGTGCAGAACGGTTTTCCTGGTGGTTTACTTCACTCATGCATCGTTTCCCGGAGAACGGAGAGATCGGCCAGAAGCTTCAGGAAGCAGAGCTCGATTACATTGTCCACTCGGAAACCGGAGCGCGTTCGGTTGCCGAAAACTTTGTTGGACTCCCTCTGGATTTCGGTGCAtaa
<210> SEQ ID NO:３８
<211> Length ２７
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Escherichia coli
<400> Sequence ３８
GAGCTCATGCGCACCCAGGTTGGTATC
<211> Length ２７
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Escherichia coli
<400> Sequence ３８
GAGCTCATGCGCACCCAGGTTGGTATC
<210> SEQ ID NO:３９
<211> Length ２６
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hydrogenophaga sp.
<400> Sequence ３９
GTCGACTTAGTCGATGGGCAAGCCCG
<211> Length ２６
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hydrogenophaga sp.
<400> Sequence ３９
GTCGACTTAGTCGATGGGCAAGCCCG
<210> SEQ ID NO:４０
<211> Length ２６
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Polaromonas sp.
<400> Sequence ４０
GTCGACTTATTCAATCGGAAGTCCAG
<211> Length ２６
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Polaromonas sp.
<400> Sequence ４０
GTCGACTTATTCAATCGGAAGTCCAG
<210> SEQ ID NO:４１
<211> Length ２６
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence ４１
GTCGACTTAGGCACCGAAGTCGAGGG
<211> Length ２６
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Hylemonella gracilis
<400> Sequence ４１
GTCGACTTAGGCACCGAAGTCGAGGG
<210> SEQ ID NO:４２
<211> Length ２５
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence ４２
GTCGACTTACACTTCAAACCGCGGG
<211> Length ２５
<212> Type ＤＮＡ
<213> Organism Corynebacterium glutamicum
<400> Sequence ４２
GTCGACTTACACTTCAAACCGCGGG
Claims (11)
- コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子を導入した微生物菌株。
- 前記コマモナス科の微生物が、Ｈｙｌｅｍｏｅｎｅｌｌａ属、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ属、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａ属から選ばれる微生物である、請求項１に記載の微生物菌株。
- 前記微生物菌株が、エシェリヒア属、ロドコッカス属、アシネトバクター属、ブラディリゾビウム属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、ロドシュードモナス属、シノリゾビウム属、ブレビバクテリウム属、ノボスフィンゴビウム属またはラルストニア属から選ばれる微生物菌株である、請求項１に記載の微生物菌株。
- 請求項１に記載の微生物菌株を用いた発酵により、プロトカテク酸から没食子酸を製造する方法。
- グルコースを含有する培地において、請求項１に記載の微生物菌株を用いた発酵により没食子酸を製造する方法。
- ｐＨ６．０以下の培地を用いて発酵を行う、請求項４又は５に記載の没食子酸を製造する方法。
- １５℃～４５℃の温度条件で発酵を行う、請求項４又は５に記載の没食子酸を製造する方法。
- コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質を用いた、プロトカテク酸から没食子酸を製造する方法。
- コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質の１９９～２０９位のロイシンがバリンまたはグリシンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
- コマモナス科の微生物由来のプロトカテク酸５位酸化酵素、又は該プロトカテク酸５位酸化酵素のアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するタンパク質の２９４～３０４位のトレオニンがアラニンに置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
- さらに、３８５～３９５位のチロシンがフェニルアラニン、バリンまたはアラニンに置換された、請求項９又は１０に記載のタンパク質。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022-159637 | 2022-10-03 | ||
| JP2022159637 | 2022-10-03 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2024075674A1 true WO2024075674A1 (ja) | 2024-04-11 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2023/035854 WO2024075674A1 (ja) | 2022-10-03 | 2023-10-02 | 微生物菌株、タンパク質、微生物菌株又はタンパク質を用いた没食子酸を製造する方法 |
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|---|---|
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Citations (3)
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| JP2009213392A (ja) * | 2008-03-10 | 2009-09-24 | Genaris Inc | 改良型没食子酸合成酵素および没食子酸の製造法 |
| JP2021185830A (ja) * | 2020-05-29 | 2021-12-13 | 花王株式会社 | 没食子酸合成酵素 |
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| DATABASE UniProtKB 7 April 2021 (2021-04-07), ANONYMOUS: "SubName: Full=4-hydroxybenzoate 3-monooxygenase {ECO:0000313|EMBL:QBK05525.1}; EC=1.14.13.2 {ECO:0000313|EMBL:QBK05525.1}", XP093154745, Database accession no. A0A4P6UN65 * |
| DATABASE UniProtKB 7 April 2021 (2021-04-07), ANONYMOUS: "SubName: Full=4-hydroxybenzoate 3-monooxygenase {ECO:0000313|EMBL:QHE86262.1}", XP093154749, Database accession no. A0A6P1IUY4 * |
| KATSUKI, NOZOMI ET AL.: "Identification and characterization of novel proteins belonging to p-hydroxybenzoate hydroxylase family", PROCEEDINGS OF THE ANNUAL MEETING OF JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY 2022, 3B09-09, 5 March 2022 (2022-03-05) * |
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