WO2023112933A1 - 新規プロモーター - Google Patents

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WO2023112933A1
WO2023112933A1 PCT/JP2022/045940 JP2022045940W WO2023112933A1 WO 2023112933 A1 WO2023112933 A1 WO 2023112933A1 JP 2022045940 W JP2022045940 W JP 2022045940W WO 2023112933 A1 WO2023112933 A1 WO 2023112933A1
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WO
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nucleotide sequence
promoter
dna
seq
gene
Prior art date
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PCT/JP2022/045940
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English (en)
French (fr)
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暉 永井
達也 長村
史員 高橋
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花王株式会社
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to novel promoters.
  • Patent Document 1 discloses a promoter of elongation factor tu as a highly active promoter that functions in Corynebacterium spp.
  • Patent Document 2 various promoter sequences derived from Escherichia and Corynebacterium were analyzed, and from these, SPL1, SPL7, and SPL13 promoters that function as highly active promoters in Corynebacterium were synthesized. It is disclosed that
  • Patent Document 1 JP-A-2008-212155
  • Patent Document 2 JP-A-2019-528075
  • the present invention provides a DNA having promoter activity, comprising a nucleotide sequence selected from the group consisting of (a) to (c) below: (a) a nucleotide sequence upstream of a gene encoding a polypeptide consisting of the following amino acid sequence; (b) a nucleotide sequence having at least 90% identity with a nucleotide sequence upstream of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence below; and (c) a nucleotide sequence upstream of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence below.
  • Nucleotide sequences with one or several nucleotides deleted, substituted, added or inserted into the sequence MX 1 X 2 X 3 FX 1 IX 4 QX 5 IFX 1 GX 6 X 1 X 1 LX 7 X 1 SX 8 X 1 X 1 GAQ X 9 VFX 10 X 1 X 11 X 1 X 1 X 12 SS (where X 1 is any amino acid residue, X 2 is S or A, X 3 is V or I, X 4 is F or I, X 5 is S or A , X 6 is V or I, X 7 is V or I, X 8 is V or I, X 9 is G or N, X 10 is D or T, X 11 is I or V and X 12 is A or F).
  • the present invention provides a promoter comprising a DNA selected from the group consisting of (g) to (i) below: (g) DNA consisting of a nucleotide sequence upstream of a gene encoding a polypeptide consisting of the following amino acid sequence; (h) DNA consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the upstream nucleotide sequence of a gene encoding a polypeptide consisting of the following amino acid sequence and having promoter activity; DNA comprising a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted into the upstream nucleotide sequence of the gene encoding the peptide, and having promoter activity; MX 1 X 2 X 3 FX 1 IX 4 QX 5 IFX 1 GX 6 X 1 X 1 LX 7 X 1 SX 8 X 1 X 1 GAQX 9 VFX 10 X 1 X 11 X 1 X 1 X 12
  • the present invention provides an expression vector comprising said DNA or promoter. In another aspect, the present invention provides a DNA expression cassette comprising said DNA or promoter. In another aspect, the present invention provides Corynebacterium comprising the expression vector or the DNA expression cassette. In another aspect, the present invention provides culturing the Corynebacterium; and recovering a target substance from the culture obtained by the culturing, A method for producing a target substance is provided.
  • ABA to AHBA conversion activity by HFM122 under the control of tu promoter, SPL13 promoter, or cg2875 promoter AHBA conversion rate by HFM122 under control of tu, SPL13, or cg2875 promoters. Expression level of reporter protein under control of tu promoter, SPL13 promoter, or cg2875 promoter (indicated by relative fluorescence intensity to tu promoter).
  • amino acid sequences or nucleotide sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, genetic information processing software GENETYX Ver. It is calculated by performing an analysis using 12 homology analysis programs with unit size to compare (ktup) set to 2.
  • At least 90% identity with respect to nucleotide sequences means 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, and even more preferably 98% or more. , more preferably 99% or more identity.
  • nucleotide sequence means preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10 It can mean 1, more preferably 1 to 5, even more preferably 1 to 3, still preferably 1 or 2.
  • addition of nucleotides includes addition of one or several nucleotides to one and both termini of a sequence.
  • amino acid residue refers to 20 amino acid residues that constitute proteins, alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamic acid (GIu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L ), Lysine (Lys or K), Methionine (Met or M), Phenylalanine (Phe or F), Proline (Pro or P), Serine (Ser or S), Threonine (Thr or T), Tryptophan (Trp or W) , tyrosine (Tyr or Y) and valine (Val or V).
  • upstream and downstream with respect to a gene refer to upstream and downstream in the transcription direction of the gene.
  • upstream sequence and “downstream sequence” of a gene refer to the sequences located on the 5' and 3' sides of the gene in the DNA sense strand, respectively.
  • a promoter linked upstream of a gene means that the promoter is present on the 5' side of the gene in the DNA sense strand.
  • upstream nucleotide sequence of a gene means a nucleotide sequence present on the 5' side of a gene in the DNA sense strand, that is, on the 5' side adjacent to the initiation codon of the gene.
  • operably linked between a gene and a control region such as a promoter means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region. It means that there is Procedures for "operably linking" genes and regulatory regions are well known to those of skill in the art.
  • promoter activity means an activity that promotes transcription of DNA (gene) into mRNA. Promoter activity can be confirmed by using a suitable reporter gene. For example, promoter activity can be confirmed by ligating a DNA encoding a detectable protein, ie, a reporter gene, downstream of the promoter and measuring the production amount of the gene product of the reporter gene.
  • reporter genes include ⁇ -galactosidase (LacZ) gene, ⁇ -glucuronidase (GUS) gene, luciferase gene, ⁇ -lactamase gene, gene encoding EtbC (2,3-dihydroxy-ethylbenzene 1,2-dioxygenase) genes of enzymes that act on chromogenic substrates such as GFP, genes of fluorescent proteins such as genes encoding GFP (Green Fluorescent Protein), and the like.
  • promoter activity can also be confirmed by measuring the expression level of mRNA transcribed from the reporter gene by quantitative RT-PCR or the like.
  • promoter activity can be confirmed by measuring reactions involving the protein encoded by the reporter gene.
  • HFM122 NCBI Reference Sequence: WP_010920262.1 known as 4-hydroxybenzoate-3-monooxygenase (EC1.14.13.2) and variants thereof (see JP 2021-73914)
  • HFM122 has 4-aminobenzoic acid hydroxylation activity and can convert 4-aminobenzoic acid (4-ABA) to 4-amino-3-hydroxybenzoic acid (4,3-AHBA).
  • 4-ABA 4-aminobenzoic acid
  • 4,3-AHBA 4-amino-3-hydroxybenzoic acid
  • the concentration of 4-ABA, 4,3-AHBA, or both is measured, or the conversion rate from 4-ABA to 4,3-AHBA is calculated based on the concentration. By doing so, the activity of the promoter can be measured.
  • target substance refers to a substance that can be produced by cells and whose production or production volume is desired to be increased.
  • Target substances include substances encoded by genes (target genes), substances produced by the action of substances encoded by genes (target genes), and substances encoded by genes (target genes) whose production volume is controlled by the action of substances encoded by genes (target genes). Included are increasing substances.
  • the present invention provides a novel promoter and a method for producing a target substance using the promoter.
  • the promoter of the present invention has high transcriptional activity and can significantly improve the transcription level of the gene to be regulated.
  • the promoter of the present invention can improve the efficiency of microbiological production of a target substance.
  • the present inventors found that among the genes derived from Corynebacterium glutamicum, the DNA consisting of the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1) of 613 bp upstream of the start codon of the gene indicated by Gene ID: cg2875 is known. It was found to have higher promoter activity than tu promoter and SPL13 promoter, which are highly active promoters (Figs. 1 to 3).
  • the cg2875 gene of Corynebacterium glutamicum consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 that encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and is predicted to be an ORF by the ORF prediction software Glimmer.
  • the protein encoded by the cg2875 gene is known to be a membrane protein and to be mycollized, but its function and expression level have not been known until now (Issa, H. et al., PLoS One, 2017, 12(2):e0171955).
  • the present inventors also found that, among the nucleotide sequences upstream of the cg2875 gene, DNA consisting of a nucleotide sequence of 208 bp upstream of the cg2875 gene (SEQ ID NO: 23) has a higher promoter activity than the tu promoter and the SPL13 promoter. was found (Fig. 4). If the DNA contains at least 86 bp of nucleotide sequence (SEQ ID NO: 21) at the 3' end, it has promoter activity equivalent to tu promoter or SPL13 promoter.
  • DNA consisting of the upstream nucleotide sequences (SEQ ID NOS: 26 to 41) of homologues of the cg2875 gene had higher promoter activity than the tu promoter and SPL13 promoter (Fig. 5).
  • homologue of the cg2875 gene refers to a gene presumed to encode a polypeptide having a function equivalent to that of the cg2875 protein.
  • the amino acid sequence encoded by the homologue, including the amino acid sequence encoded by the cg2875 gene, can be expressed as follows.
  • promoter of a homolog of the cg2875 gene examples include, for example, a promoter consisting of a nucleotide sequence having a query coverage of 98% or more in a BLAST search using the nucleotide sequence of the promoter of the cg2875 gene (SEQ ID NO: 23) as a query, and amino acids of the cg2875 protein.
  • the present invention relates to a novel DNA having promoter activity, a novel promoter, an expression vector containing the DNA or the promoter, a DNA expression cassette and a transformant, and a method for producing a target substance using the transformant.
  • the DNA having promoter activity of the present invention includes DNA having promoter activity consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of the following (a) to (c). (a) a nucleotide sequence upstream of a gene encoding a polypeptide consisting of the following amino acid sequence; (b) a nucleotide sequence having at least 90% identity with a nucleotide sequence upstream of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence below; and (c) a nucleotide sequence upstream of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence below.
  • a nucleotide sequence in which one or several nucleotides have been deleted, substituted, added or inserted into the sequence MX 1 X 2 X 3 FX 1 IX 4 QX 5 IFX 1 GX 6 X 1 X 1 LX 7 X 1 SX 8 X 1 X 1 GAQX 9 VFX 10 X 1 X 11 X 1 X 1 X 12 SS (where X 1 is any amino acid residue, X 2 is S or A, X 3 is V or I, X 4 is F or I, X 5 is S or A , X 6 is V or I, X 7 is V or I, X 8 is V or I, X 9 is G or N, X 10 is D or T, X 11 is I or V and X 12 is A or F).
  • the upstream nucleotide sequence length of the gene encoding the polypeptide consisting of the above amino acid sequence is not particularly limited as long as it has promoter activity, preferably 85 bp or more, more preferably 100 bp or more, still more preferably 200 bp or more, and preferably It is 800 bp or less, more preferably 650 bp or less, still more preferably 250 bp or less, and even more preferably 208 bp.
  • the range of nucleotide sequence length is preferably 85-800 bp, more preferably 85-650 bp, still more preferably 100-650 bp, still more preferably 100-250 bp, still more preferably 200-250 bp, still more preferably is 208 bp.
  • the DNA having promoter activity of the present invention consists of a nucleotide sequence selected from the group consisting of (d) to (f) below.
  • the DNA consisting of the nucleotide sequences of any one of SEQ ID NOs: 1, 21-23, and 26-41 has promoter activity as shown in Examples below.
  • Table 7 below shows the microbial strains from which the DNAs consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 26-41 are derived.
  • the DNA having promoter activity of the present invention consists of a nucleotide sequence selected from the group consisting of (d') to (f') below.
  • the nucleotide sequence selected from the group consisting of (d') to (f') is selected from the group consisting of (d'') to (f'') below. contains a nucleotide sequence that is (d") the nucleotide sequence of SEQ ID NO:21; (e") a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:21; and (f") deletion, substitution or addition of one or several nucleotides to the nucleotide sequence of SEQ ID NO:21. , or an inserted nucleotide sequence.
  • the DNA having promoter activity of the present invention has promoter activity at least in Corynebacterium.
  • the DNA having promoter activity of the present invention has improved promoter activity compared to the tu promoter. More preferably, the DNA having promoter activity of the present invention has improved promoter activity compared to the SPL13 promoter.
  • Promoters of the present invention include promoters composed of DNA selected from the group consisting of (g) to (i) below.
  • the upstream nucleotide sequence length of the gene encoding the polypeptide consisting of the above amino acid sequence is not particularly limited as long as it has promoter activity, preferably 85 bp or more, more preferably 100 bp or more, still more preferably 200 bp or more, and preferably It is 800 bp or less, more preferably 650 bp or less, still more preferably 250 bp or less, and even more preferably 208 bp.
  • the range of nucleotide sequence length is preferably 85-800 bp, more preferably 85-650 bp, still more preferably 100-650 bp, still more preferably 100-250 bp, still more preferably 200-250 bp, still more preferably is 208 bp.
  • the promoter of the present invention consists of DNA selected from the group consisting of (j) to (l) below.
  • (j) a DNA consisting of the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1, 21-23, and 26-41;
  • (k) a DNA consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity to the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1, 21-23, and 26-41 and having promoter activity;
  • (l) SEQ ID NO: 1 A DNA comprising a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted in any one of nucleotide sequences 21 to 23 and 26 to 41, and having promoter activity.
  • the DNA consisting of the nucleotide sequences of any one of SEQ ID NOs: 1, 21-23, and 26-41 has promoter activity as shown in Examples below.
  • Table 7 below shows the microbial strains from which the DNAs consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOS: 26-41 are derived.
  • the promoter of the present invention consists of DNA selected from the group consisting of (j') to (l') below.
  • (j') a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23;
  • (k') a DNA consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 and having promoter activity; and
  • (l') one or several to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 A DNA consisting of a nucleotide sequence in which nucleotides are deleted, substituted, added or inserted, and having promoter activity.
  • the promoter of the present invention contains a DNA selected from the group consisting of (j'') to (l'') below in the DNA selected from the group consisting of (j') to (l') above. .
  • (j") a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:21;
  • (k") a DNA consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and having promoter activity; and (l") one or several to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21
  • the promoter of the present invention has promoter activity at least in Corynebacterium.
  • the promoter of the present invention has improved promoter activity compared to the tu promoter. More preferably, the promoter of the present invention has improved promoter activity compared to the SPL13 promoter.
  • the DNA having the promoter activity of the present invention and the promoter of the present invention are collectively referred to as "the promoter of the present invention, etc.”.
  • the method for obtaining the promoter, etc. of the present invention is not particularly limited, and can be obtained by a conventional chemical synthesis method or genetic engineering method.
  • the promoter, etc. of the present invention can be artificially synthesized based on the nucleotide sequences of the promoter, etc. of the present invention (eg, SEQ ID NOS: 1, 21-23, and 26-41).
  • a commercially available DNA synthesis service provided by GenScript, etc. can be used.
  • Nucleotide sequences eg, SEQ ID NOs: 1, 21-23, and 26-41 can be cloned.
  • the promoter, etc. of the present invention can also be produced by introducing mutations into the DNA of the nucleotide sequences of the promoter, etc. of the present invention (eg, SEQ ID NOs: 1, 21-23, and 26-41).
  • Techniques for mutagenesis include, for example, ultraviolet irradiation and site-directed mutagenesis.
  • Techniques for site-directed mutagenesis include methods using Splicing overlap extension (SOE) PCR (Horton et al., Gene 77, 61-68, 1989), ODA method (Hashimoto-Gotoh et al., Gene, 152 , 271-276, 1995), Kunkel method (Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. Sci.
  • SOE Splicing overlap extension
  • the promoter, etc. of the present invention can be obtained by selecting one having desired promoter activity from the mutagenized DNA.
  • a DNA having promoter activity can be selected by operably linking a gene of interest downstream of the mutagenized DNA and analyzing the expression level of the gene of interest.
  • nucleotide sequences are described, for example, in Dieffenbach et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 581-621, 1995).
  • the promoter, etc. of the present invention comprising a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence of the promoter, etc. of the present invention (eg, SEQ ID NOs: 1, 21-23, and 26-41). , or nucleotides in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted into the nucleotide sequences of the promoters of the present invention (eg, SEQ ID NOS: 1, 21-23, and 26-41)
  • the promoter, etc. of the present invention comprising the sequence can be obtained.
  • the promoter, etc. of the present invention has the function of regulating the expression of genes located downstream thereof.
  • a DNA fragment having an expression control region with excellent transcriptional activity can be obtained by using the promoter or the like of the present invention.
  • a DNA fragment containing the target gene and the promoter of the present invention operably linked upstream thereof can be constructed.
  • the DNA fragment may contain, in addition to the promoter and the like of the present invention and the gene of interest, a cis-element or terminator that enhances the transcriptional activity of the promoter and the like.
  • the DNA fragment may contain a selectable marker gene such as a drug resistance gene or an auxotrophic marker gene.
  • the DNA fragment containing the gene of interest and the promoter of the present invention is a DNA expression cassette for expressing the gene of interest.
  • the DNA fragment containing the promoter, etc. of the present invention described above can be constructed so as to have restriction enzyme recognition sequences at both ends.
  • the promoter and the like of the present invention can be introduced into a vector.
  • the promoter of the present invention can be introduced into the vector by cleaving the vector with a restriction enzyme and adding a DNA fragment containing the promoter of the present invention and having restriction enzyme cleavage sequences at the ends. (restriction enzyme method).
  • a DNA fragment containing the promoter, etc. of the present invention may be directly introduced into the host cell genome.
  • a DNA fragment containing the promoter, etc. of the present invention may be introduced upstream of the gene of interest in the genome of the host cell.
  • a DNA expression cassette containing the aforementioned target gene and the promoter of the present invention may be introduced into the host cell genome.
  • the promoter, etc. of the present invention by incorporating the promoter, etc. of the present invention into an expression vector capable of expressing a target gene, an expression vector capable of improving the expression of the target gene at the transcription level can be obtained.
  • the promoter, etc. of the present invention can be operably linked upstream of the DNA encoding the gene of interest.
  • the expression vector having the promoter and the like of the present invention may be a vector for introduction into the chromosome of host cells or a vector retained extrachromosomally. Those that are replicable in host cells are preferred.
  • expression vectors include vectors for Escherichia coli, vectors for Corynebacterium, etc.
  • plasmids, cosmids, phasmids, phages, transposons, BAC vectors, etc. can be used.
  • preferred vectors include pET21-a(+), pUC18/19, pUC118/119, pBR322, pMW218/219, pZ1 (Applied and Environmental Microbiology, 1989, 55:684-688), pEKEx1 (Gene, 1991, 102: 93-98), pHS2-1 (Gene, 1991, 107: 69-74), pCLiK5MCS (Japanese Patent Publication No.
  • the target gene to be placed downstream of the promoter of the present invention is not particularly limited.
  • the target gene is a gene that encodes a target substance or an enzyme involved in its synthesis.
  • the target gene may be a heterologous gene encoding a heterologous expression product, a gene derived from the same species introduced from the outside, a gene encoding an expression product inherent in the host cell, or any other gene. It may be a gene encoding a protein, peptide, nucleic acid, or the like.
  • substances encoded by target genes include enzymes, hormones, cytokines, other physiologically active peptides, transporters, and non-coding RNAs.
  • enzymes include Oxidoreductase, Transferase, Hydrolase, Lyase, Isomerase, Ligase or Synthetase, Glycolysis system enzymes, pentose phosphate cycle enzymes, TCA cycle enzymes, enzymes involved in the synthesis of aromatic compounds, and the like.
  • target genes include enzymes involved in the synthesis of aromatic compounds in host cells, such as gallic acid synthase (described in JP-A-2009-065839 and JP-A-2009-213392), AroF, AroG, genes encoding PabAB, PabC, and the like;
  • aromatic compounds include gallic acid, protocatechuic acid (PCA), aminohydroxybenzoic acid (AHBA), pyridinedicarboxylic acid (PDCA), catechol, 4-hydroxybenzoic acid, and the like.
  • An expression vector or DNA fragment containing the promoter and the like of the present invention is subjected to a general transformation method such as electroporation method, transformation method, transfection method, conjugation method, protoplast method, particle gun method, and Agrobacterium method.
  • the transformant of the present invention can be obtained by introducing it into a host cell using a method such as the above.
  • the host cell into which the above vector or DNA fragment is introduced is not particularly limited as long as the promoter of the present invention can function as a promoter in the cell, preferably bacteria, more preferably Corynebacterium. be done.
  • Corynebacterium include Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium halotolerans.
  • Corynebacterium alkanolyticum, Corynebacterium callunae and the like are preferred, and Corynebacterium glutamicum is more preferred.
  • Corynebacterium flavum Brevibacterium lactofermentum
  • Brevibacterium divaricatum Corynebacterium lilium Coryneform bacteria
  • Corynebacterium glutamicum (Liebl W et al, Int J Syst Bacteriol, 1991, 41: 255-260; Kazuo Komagata et al., Fermentation and Industry, 1987, 45 : 944-963).
  • the above transformant can be used for the production of the target substance.
  • a transformant containing an expression vector or a DNA fragment having a gene encoding a target substance or an enzyme involved in its synthesis and the promoter of the present invention operably linked upstream of the gene The gene is expressed under the control of the promoter or the like of the present invention to produce the target substance.
  • Examples of the target substance are as described above, and preferred examples include the substance encoded by the target gene described above and the product synthesized by the action of the substance, such as the aromatic compound described above. Enzymatically produced aromatic compounds are included. Examples of aromatic compounds include gallic acid, protocatechuic acid (PCA), aminohydroxybenzoic acid (AHBA), pyridinedicarboxylic acid (PDCA), catechol, 4-hydroxybenzoic acid, and the like.
  • the culture conditions for the transformant are not particularly limited as long as the cells of the transformant can grow and the target substance can be produced.
  • preferred media include LB medium and CGXII medium (Journal of Bacteriology, 1993, 175: 5595-5603). up to 45° C., and the culture time is 1 to 7 days.
  • preferred media include LB medium and M9 medium, and the culture conditions include a culture temperature of 15° C. to 45° C. and a culture time of 1 to 7 days.
  • the target substance can be obtained by recovering the target substance from the culture. If necessary, the recovered target substance may be further purified.
  • the method of recovering or purifying the target substance from the culture is not particularly limited, and may be carried out according to known recovery or purification methods. For example, the culture is collected, and if necessary, the cells are disrupted by ultrasonic waves, pressure, etc., and then the cell components are removed by decantation, filtration, centrifugation, etc. You have to collect the minutes.
  • the target substance can be purified by subjecting the collected fraction to dialysis, salting out, ion exchange method, distillation, solvent extraction, or a combination thereof, if necessary.
  • the culture of the transformant and the collection of the target substance may be performed by any of a batch method, a semi-batch method and a continuous method.
  • DNA having promoter activity consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of the following (a) to (c): (a) a nucleotide sequence upstream of a gene encoding a polypeptide consisting of the following amino acid sequence; (b) a nucleotide sequence having at least 90% identity with a nucleotide sequence upstream of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence below; and (c) a nucleotide sequence upstream of a gene encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence below.
  • a nucleotide sequence in which one or several nucleotides have been deleted, substituted, added or inserted into the sequence MX 1 X 2 X 3 FX 1 IX 4 QX 5 IFX 1 GX 6 X 1 X 1 LX 7 X 1 SX 8 X 1 X 1 GAQX 9 VFX 10 X 1 X 11 X 1 X 1 X 12 SS (where X 1 is any amino acid residue, X 2 is S or A, X 3 is V or I, X 4 is F or I, X 5 is S or A , X 6 is V or I, X 7 is V or I, X 8 is V or I, X 9 is G or N, X 10 is D or T, X 11 is I or V and X 12 is A or F).
  • the upstream nucleotide sequence length of the gene encoding the polypeptide consisting of the above amino acid sequence is preferably 85 bp or more, more preferably 100 bp or more, still more preferably 200 bp or more, preferably 800 bp or less, more preferably 650 bp.
  • the range of the nucleotide sequence length is preferably 85 to 800 bp, more preferably 85 to 650 bp, still more preferably 100 to 650 bp, still more preferably
  • the DNA of [1] which is preferably 100 to 250 bp, more preferably 200 to 250 bp, and still more preferably 208 bp.
  • [4] The DNA according to any one of [1] to [3], which consists of a nucleotide sequence selected from the group consisting of (d') to (f') below: (d') the nucleotide sequence of SEQ ID NO:23; (e′) a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:23; and (f′) deletion, substitution, addition of one or several nucleotides to the nucleotide sequence of SEQ ID NO:23 , or an inserted nucleotide sequence.
  • [5] The DNA of [4], which comprises a nucleotide sequence selected from the group consisting of (d") to (f") below: (d") the nucleotide sequence of SEQ ID NO:21; (e") a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO:21; and (f") deletion, substitution or addition of one or several nucleotides to the nucleotide sequence of SEQ ID NO:21. , or an inserted nucleotide sequence.
  • a promoter consisting of a DNA selected from the group consisting of (g) to (i) below: (g) DNA consisting of a nucleotide sequence upstream of a gene encoding a polypeptide consisting of the following amino acid sequence; (h) DNA consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the upstream nucleotide sequence of a gene encoding a polypeptide consisting of the following amino acid sequence and having promoter activity; DNA consisting of a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted into the upstream nucleotide sequence of the gene encoding the peptide, and having promoter activity; MX 1 X 2 X 3 FX 1 IX 4 QX 5 IFX 1 GX 6 X 1 X 1 LX 7 X 1 SX 8 X 1 X 1 GAQX 9 VFX 10 X 1 X 11 X 1 X 1 X 12 SS (
  • the length of the upstream nucleotide sequence of the gene encoding the polypeptide consisting of the above amino acid sequence is preferably 85 bp or more, more preferably 100 bp or more, still more preferably 200 bp or more, preferably 800 bp or less, more preferably 650 bp.
  • the range of the nucleotide sequence length is preferably 85 to 800 bp, more preferably 85 to 650 bp, still more preferably 100 to 650 bp, still more preferably
  • the promoter of [6] which is preferably 100 to 250 bp, more preferably 200 to 250 bp, and still more preferably 208 bp.
  • the promoter according to any one of [6] to [8], which consists of a DNA selected from the group consisting of (j') to (l') below: (j') a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23; (k') a DNA consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 and having promoter activity; and (l') one or several to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 A DNA consisting of a nucleotide sequence in which nucleotides are deleted, substituted, added or inserted, and having promoter activity.
  • the promoter of [9] which contains a DNA selected from the group consisting of (j'') to (l'') below: (j") a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:21; (k") a DNA consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and having promoter activity; and (l") one or several to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 A DNA consisting of a nucleotide sequence in which nucleotides are deleted, substituted, added or inserted, and having promoter activity. [11] Preferably, the DNA of any one of [1] to [5] or the promoter of any one of [6] to [10], which has promoter activity in Corynebacterium.
  • [12] An expression vector comprising the DNA of any one of [1] to [5] and [11] or the promoter of any one of [6] to [11].
  • the expression vector of [12] which preferably comprises a gene encoding an objective substance or an enzyme involved in its synthesis, and the DNA or promoter linked upstream of the gene.
  • the expression vector of [13], wherein the target substance is preferably an aromatic compound.
  • a DNA fragment comprising the DNA of any one of [1] to [5] and [11] or the promoter of any one of [6] to [11].
  • the DNA fragment of [15] which comprises a gene encoding a target substance or an enzyme involved in its synthesis, and the DNA or promoter linked upstream of the gene.
  • the DNA fragment of [16], wherein the target substance is preferably an aromatic compound.
  • a transformant comprising the expression vector of any one of [12] to [14] or the DNA fragment of any one of [15] to [17].
  • the transformant of [19] which is preferably Corynebacterium, more preferably Corynebacterium glutamicum.
  • the target substance is preferably an aromatic compound, more preferably at least selected from the group consisting of gallic acid, protocatechuic acid, aminohydroxybenzoic acid, pyridinedicarboxylic acid, catechol, and 4-hydroxybenzoic acid.
  • DNA having promoter activity consisting of a nucleotide sequence selected from the group consisting of the following (d) to (f): (d) the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1, 21-23, and 26-41; (e) a nucleotide sequence having at least 90% identity to the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1, 21-23, and 26-41; and (f) a nucleotide sequence of SEQ ID NOs: 1, 21-23, and 26-41 A nucleotide sequence in which one or several nucleotides have been deleted, substituted, added or inserted relative to any nucleotide sequence.
  • a promoter consisting of a DNA selected from the group consisting of the following (j) to (l): (j) a DNA consisting of the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1, 21-23, and 26-41; (k) a DNA consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity to the nucleotide sequence of any of SEQ ID NOs: 1, 21-23, and 26-41 and having promoter activity; and (l) SEQ ID NO: 1, A DNA comprising a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, substituted, added, or inserted in any one of nucleotide sequences 21 to 23 and 26 to 41, and having promoter activity.
  • the promoter of [26], comprising a DNA selected from the group consisting of (j') to (l') below: (j') a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23; (k') a DNA consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 and having promoter activity; and (l') one or several to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23 A DNA consisting of a nucleotide sequence in which nucleotides are deleted, substituted, added or inserted, and having promoter activity.
  • the promoter of [27] which comprises a DNA selected from the group consisting of (j'') to (l'') below: (j") a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO:21; (k") a DNA consisting of a nucleotide sequence having at least 90% identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 and having promoter activity; and (l") one or several to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21 A DNA consisting of a nucleotide sequence in which nucleotides are deleted, substituted, added or inserted, and having promoter activity. [29] Preferably, the DNA of any one of [23] to [25] or the promoter of any one of [26] to [28], which has promoter activity in Corynebacterium.
  • Example 1 Preparation of promoter activity evaluation plasmid 1
  • Preparation of pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_HFM122_V47L A vector fragment was amplified using pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122_V47L (see JP-A-2021-073914) as a template and primers (SEQ ID NOS: 4 and 5). .
  • valine at position 47 of HFM122 is replaced with leucine, and a gene encoding HFM122_V47L having higher activity than wild-type HFM122 is ligated.
  • primers SEQ ID NOS: 6 and 7 were used to generate a sequence obtained by adding a vector fragment linker sequence to the promoter sequence (Pcg2875) of Gene ID: cg2875 shown in SEQ ID NO: 1. amplified.
  • the vector fragment and Pcg2875 fragment were ligated with In-Fusion HD cloning kit (Clontech) to prepare pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_HFM122_V47L.
  • ECOS Competent E. Coli DH5 ⁇ strain (Nippon Gene) was transformed, and the obtained cell sap was spread on LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C.
  • colony PCR was performed using KOD One PCR Master Mix (TOYOBO) and primers (SEQ ID NOs: 8 and 9).
  • a transformant confirmed to have introduced a plasmid having the target gene was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C.
  • a plasmid was purified from the resulting culture medium using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio) to obtain pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_HFM122_V47L.
  • primers SEQ ID NOS: 13 and 14 were used to amplify a sequence obtained by adding a linker sequence of a vector fragment to the SPL13 promoter sequence.
  • the vector fragment and the SPL13 promoter fragment were ligated with In-Fusion HD cloning kit (Clontech) to prepare pECsf_gapS_pabABC_SPL13_HFM122_V47L.
  • ECOS Competent E. Coli DH5 ⁇ strain (Nippon Gene) was transformed, and the obtained cell sap was spread on LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C.
  • colony PCR was performed using KOD One PCR Master Mix (TOYOBO) and primers (SEQ ID NOs: 9 and 13).
  • a transformant confirmed to have introduced a plasmid having the target gene was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C.
  • a plasmid was purified from the resulting culture medium using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio) to obtain pECsf_gapS_pabABC_SPL13_HFM122_V47L.
  • Table 1 shows the primers used in 1) and 2) above.
  • Example 2 Preparation of Transformants Plasmids pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_HFM122_V47L and pECsf_gapS_pabABC_SPL13_HFM122_V47L obtained in Example 1, and pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122_V47L using the electroporation method (Bio- rad). The resulting transformed cell suspension was spread on a kanamycin-containing LB agar medium and allowed to stand at 30° C. for 2 days, and the resulting colonies were used as transformants.
  • Example 3 Comparison of promoter activity 1) Culture of transformant The transformant obtained in Example 2 was inoculated into a test tube containing 10 mL of the CGXII medium (containing 50 mg/L of kanamycin sulfate) shown in Table 2. and cultured with shaking at 30° C. and 200 rpm for 2 days.
  • CGXII medium containing 50 mg/L of kanamycin sulfate
  • the AHBA conversion rate was calculated from the AHBA concentration and the ABA concentration according to the following formula.
  • the strain expressed with the cg2875 promoter has a lower substrate ABA concentration and a higher product AHBA concentration. , the AHBA conversion was high. Therefore, it was shown that the activity of the cg2875 promoter is higher than that of the tu promoter and the SPL13 promoter.
  • Example 4 Preparation of promoter activity evaluation plasmid using reporter protein 1
  • pECsf_Pcg2875_mCherry Using pmCherry Vector purchased from Takara Bio Inc. as a template and primers (SEQ ID NOS: 156 and 157), the reporter protein mCherry sequence ( SEQ ID NO: 168) was amplified.
  • pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122_V47L see Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2021-073914
  • a vector fragment having a linker sequence of the mCherry fragment was amplified.
  • the linker sequence of the mCherry fragment and the linker sequence of the vector fragment were added to the promoter sequence (Pcg2875) of Gene ID: cg2875 shown in SEQ ID NO: 1.
  • the given sequence was amplified.
  • the vector fragment, mCherry fragment, and Pcg2875 fragment were ligated with In-Fusion HD cloning kit (Clontech) to prepare pECsf_Pcg2875_mCherry.
  • ECOS Competent E ECOS Competent E.
  • Coli DH5 ⁇ strain (Nippon Gene) was transformed, and the obtained cell sap was spread on LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C. Using the generated colonies as templates, colony PCR was performed using KOD One PCR Master Mix (TOYOBO) and primers (SEQ ID NOS: 162 and 163). A transformant confirmed to have introduced a plasmid having the target gene was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C. A plasmid was purified from the resulting culture medium using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio) to obtain pECsf_Pcg2875_mCherry.
  • Coli DH5 ⁇ strain (Nippon Gene) was transformed, and the obtained cell sap was spread on LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C. Using the generated colonies as templates, colony PCR was performed using KOD One PCR Master Mix (TOYOBO) and primers (SEQ ID NOS: 162 and 163). A transformant confirmed to have introduced a plasmid having the target gene was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C. A plasmid was purified from the resulting culture medium using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio) to obtain pECsf_tuD_mCherry.
  • the SPL13 promoter sequence disclosed in Patent Document 2 was chemically synthesized using the artificial gene synthesis service of Eurofins Genomics. Using the obtained DNA containing the SPL13 promoter as a template, primers (SEQ ID NOS: 166 and 167) were used to amplify a sequence obtained by adding the mCherry fragment linker sequence and the vector fragment linker sequence to the SPL13 promoter sequence. The vector fragment, mCherry fragment, and SPL13 promoter fragment were ligated with In-Fusion HD cloning kit (Clontech) to prepare pECsf_SPL13_mCherry. Using the resulting plasmid solution, ECOS Competent E.
  • Coli DH5 ⁇ strain (Nippon Gene) was transformed, and the obtained cell sap was spread on LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C. Using the generated colonies as templates, colony PCR was performed using KOD One PCR Master Mix (TOYOBO) and primers (SEQ ID NOS: 162 and 163). A transformant confirmed to have introduced a plasmid having the target gene was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C. A plasmid was purified from the resulting culture medium using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio) to obtain pECsf_SPL13_mCherry. Table 4 shows the primers used in 1) to 3) above.
  • Example 5 Preparation of Transformant Each plasmid obtained in Example 4 was used to transform Corynebacterium glutamicum DRHG145 strain (see Japanese Patent No. 6322576) by electroporation (Bio-rad). . The resulting transformed cell suspension was spread on a kanamycin-containing LB agar medium and allowed to stand at 30° C. for 2 days, and the resulting colonies were used as transformants.
  • Example 6 Comparison of promoter activity 1) Culture of transformant The transformant obtained in Example 5 was inoculated into a test tube containing 10 mL of the CGXII medium (containing 50 mg/L of kanamycin sulfate) shown in Table 2. and cultured with shaking at 30° C. and 200 rpm for 2 days.
  • CGXII medium containing 50 mg/L of kanamycin sulfate
  • Fig. 3 shows the relative fluorescence intensity for the tu promoter.
  • the fluorescence intensity was higher in the strain expressing mCherry with the cg2875 promoter than in the strain expressing mCherry with the tu promoter or SPL13 promoter. Therefore, it was shown that the activity of the cg2875 promoter is higher than that of the tu promoter and the SPL13 promoter.
  • Example 7 Reduction of Promoter Region 1
  • ECOS Competent E. Coli DH5 ⁇ strain (Nippon Gene) was transformed, and the obtained cell sap was spread on LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C.
  • colony PCR was performed using KOD One PCR Master Mix (TOYOBO) and primers (SEQ ID NOS: 24 and 25).
  • a transformant confirmed to have introduced a plasmid with a reduced promoter region of 80 bp was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured at 37° C. overnight.
  • a plasmid was purified from the resulting culture medium using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio) to obtain pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_S1_HFM122_V47L.
  • Example 8 Preparation of Transformants Plasmids pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_S1_HFM122_V47L, pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_S2_HFM122_V47L, pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875 obtained in Example 7 A transformant was obtained in the same manner as in Example 2 except that _S3_HFM122_V47L and pECsf_gapS_pabABC_Pcg2875_S4_HFM122_V47L were used.
  • Example 9 Comparison of Promoter Activity 1 Culture of Transformants Transformants were cultured in the same manner as in 1) of Example 3, except that the transformants obtained in Examples 2 and 8 were used.
  • the strain in which HFM122_V47L was expressed with the cg2875_S2 promoter which was the cg2875 promoter reduced to 86 bp, had an AHBA conversion rate equal to or greater than that of the strain in which HFM122_V47L was expressed with the tu or SPL13 promoter.
  • the strain in which HFM122_V47L was expressed with the cg2875_S1 promoter in which the cg2875 promoter was shortened to 80 bp, had a lower AHBA conversion rate than the strain in which HFM122_V47L was expressed with the tu or SPL13 promoter. Therefore, it was shown that the activity of the cg2875 promoter is equal to or higher than that of the tu promoter and the SPL13 promoter if the promoter region has a length of 86 bp.
  • Example 10 Search for Homologous Promoter 1
  • 42 nucleotide sequences promoter sequences
  • 42 nucleotide sequences of genes downstream of the alignment sequence with a query cover of 98% or more were extracted from each genome sequence.
  • BLAST search of cg2875 amino acid sequence The amino acid sequence of cg2875 (SEQ ID NO: 3) was subjected to a BLAST search. From the search results, Query cover extracted 100% aligned sequences and obtained amino acid sequences of 8 homologues. In addition, the upstream 208 bp nucleotide sequence (promoter sequence) of the gene encoding the eight homologous amino acid sequences was extracted from each genome sequence as a homologous promoter sequence.
  • the amino acid sequence of the protein encoded by the downstream gene of each homolog promoter can be represented by the following formula.
  • MX 1 X 2 X 3 FX 1 IX 4 QX 5 IFX 1 GX 6 X 1 X 1 LX 7 X 1 SX 8 X 1 X 1 GAQX 9 VFX 10 X 1 X 11 X 1 X 1 X 12 SS (where X 1 is any amino acid residue, X 2 is S or A, X 3 is V or I, X 4 is F or I, X 5 is S or A , X 6 is V or I, X 7 is V or I, X 8 is V or I, X 9 is G or N, X 10 is D or T, X 11 is I or V and X 12 is A or F).
  • the vector fragment and the cgUSDA promoter fragment were ligated using the In-Fusion HD cloning kit (Clontech).
  • ECOS Competent E. Coli DH5 ⁇ strain (Nippon Gene) was transformed, and the obtained cell sap was spread on LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C.
  • colony PCR was performed using KOD One PCR Master Mix (TOYOBO) and primers (SEQ ID NOs: 60 and 58).
  • a transformant confirmed to have introduced a plasmid having the target gene was inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C.
  • a plasmid was purified from the resulting culture medium using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio) to obtain pECsf_gapS_pabABC_PcgUSDA_HFM122_V47L.
  • cgR promoter (PcgR, SEQ ID NO:29), cgB414 promoter (PcgB414, SEQ ID NO:30), bfZL1 promoter (PbfZL1, SEQ ID NO:31), cgScgG1 promoter (PcgScgG1, SEQ ID NO:33), cgYI promoter (PcgYI, SEQ ID NO:34), csN24 promoter (PcsN24, SEQ ID NO:35), ccjz16 promoter (Pccjz16, SEQ ID NO:37), cdgimn1 promoter (Pcdgimn1, SEQ ID NO:38), cgCS176 promoter (PcgCS176, SEQ ID NO:39), cgBCo promoter (PcgBCo, SEQ ID NO:40) and For each promoter of the cgKbcgl promoter (PcgKbcgl, SEQ ID NO: 41),
  • Plasmids with each promoter pECsf_gapS_pabABC_PcgR_HFM122_V47L, pECsf_gapS_pabABC_PcgB414_HFM122_V47L, pECsf_gapS_pabABC_PbfZL1_HFM122_ V47L, pECsf_gapS_pabABC_PcgScgG1_HFM122_V47L, pECsf_gapS_pabABC_PcgYI_HFM122_V47L, pECsf_gapS_pabABC_PcsN24_HFM122_V47L, pECsf_gapS _pabABC_Pccjz16_HFM122_V47L, pECsf_gapS_pabABC_Pcdgimn
  • Coli DH5 ⁇ strain (Nippon Gene) was transformed, and the obtained cell sap was spread on LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C. The resulting colonies were inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C. Plasmids were purified from the resulting culture using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio) to obtain pECsf_gapS_pabABC_PcgTQ2223_HFM122_V47L and pECsf_gapS_pabABC_PcgATCC21831_HFM122_V47L. was.
  • the resulting colonies were inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C.
  • a plasmid was purified from the resulting culture medium using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio) to obtain pECsf_gapS_pabABC_Pcgmcc1_HFM122_V47L.
  • Coli DH5 ⁇ strain (Nippon Gene) was transformed, and the obtained cell sap was spread on LB agar medium containing kanamycin and allowed to stand overnight at 37°C. The resulting colonies were inoculated into 2 mL of LB liquid medium containing kanamycin and cultured overnight at 37°C. A plasmid was purified from the resulting culture medium using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio) to obtain pECsf_gapS_pabABC_PcgYImut_HFM122_V47L.
  • a plasmid was purified from the resulting culture medium using NucleoSpin Plasmid EasyPure to obtain pECsf_gapS_pabABC_PcgB253_HFM122_V47L.
  • Table 10 shows the primers used in 5) to 7) above.
  • Example 11 Preparation of Transformants Transformants were obtained in the same manner as in Example 2, except that a total of 16 plasmids obtained in 4) to 7) of Example 10 were used.
  • Example 12 Comparison of Promoter Activities 1) Culture of Transformants Transformants were cultured in the same manner as in 1) of Example 3, except that the transformants obtained in Examples 2 and 11 were used.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 100) containing the promoter (hereinafter referred to as tu promoter) of the tuf gene (cg0587) possessed by Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain was used with the genome of ATCC13032 strain as a template, and two types of DNA primers ( SEQ ID NOs: 101 and 102) to obtain DNA fragments.
  • tu promoter the promoter of the tuf gene (cg0587) possessed by Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain
  • pHKPsacB1 see International Publication No. 2014/007273
  • amplifying with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 103 and 104) amplifying with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 103 and 104), the resulting PCR product is treated with DpnI (Takara Bio).
  • each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio) and ligated with In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to obtain plasmid pHKPsacB_Ptu- aroG was generated.
  • the KC265sr strain was analyzed by the PCR method (Sapphire Amp (Takara Bio)) using the primers of SEQ ID NOs: 95 and 105, and the KC265sr strain was a single-crossover homologous recombinant in which the plasmid pHKPsacB_Ptu-aroG was introduced into the promoter region of cg2391. It was confirmed that The KC265sr strain was cultured in 1 mL of LB liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride) for 24 hours, and a portion of the culture was spread on 20% sucrose-containing LB agar medium.
  • LB liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride
  • KC265 strain was obtained by culturing.
  • PCR method Sakara Bio
  • primers of SEQ ID NOs: 105 and 106 primers of SEQ ID NOs: 105 and 106.
  • the KC265 strain is a double-crossover homologous recombinant in which a tu promoter has been introduced into the cg2391 (aroG) promoter region as expected. It was confirmed.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 100) containing the tu promoter was amplified with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 101 and 102) using the ATCC 13032 strain genome as a template to obtain a DNA fragment.
  • pHKPsacB1 as a template, amplification was performed with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 103 and 104), and the resulting PCR product was treated with DpnI (Takara Bio).
  • each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio) and ligated with In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to obtain plasmid pHKPsacB_Ptu- aroE3 was generated.
  • the KC282sr strain was analyzed by the PCR method (Sapphire Amp (Takara Bio)) using the primers of SEQ ID NOS: 108 and 113, and the KC282sr strain was a single-crossover homologous recombinant in which the plasmid pHKPsacB_Ptu-aroE3 was introduced into the promoter region of cg1835. It was confirmed that The KC282sr strain was cultured in 1 mL of LB liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride) for 24 hours, and a portion of the culture was spread on 20% sucrose-containing LB agar medium.
  • LB liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride
  • KC282 strain was obtained by culturing.
  • PCR method Sakara Bio
  • primers of SEQ ID NOs: 113 and 114 primers of SEQ ID NOs: 113 and 114.
  • the KC282 strain is a double-crossover homologous recombinant in which a tu promoter has been introduced into the cg1835 (aroE3) promoter region as expected. It was confirmed.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 100) containing the tu promoter was amplified with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 101 and 102) using the ATCC 13032 strain genome as a template to obtain a DNA fragment.
  • pHKPsacB1 as a template, amplification was performed with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 103 and 104), and the resulting PCR product was treated with DpnI (Takara Bio).
  • each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio) and ligated with In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to obtain plasmid pHKPsacB_Ptu- aroB was generated.
  • the KC300sr strain was analyzed by the PCR method (Sapphire Amp (Takara Bio)) using the primers of SEQ ID NOS: 116 and 121, and the KC300sr strain was a single-crossover homologous recombinant in which the plasmid pHKPsacB_Ptu-aroB was introduced into the promoter region of cg1827. It was confirmed that The KC300sr strain was cultured in 1 mL of LB liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride) for 24 hours, and a portion of the culture was spread on 20% sucrose-containing LB agar medium.
  • LB liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride
  • the KC300 strain was obtained by culturing.
  • PCR method Sakara Bio
  • the KC300 strain is a double-crossover homologous recombinant in which a tu promoter has been introduced into the cg1827 (aroB) promoter region as expected. It was confirmed.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 100) containing the tu promoter was amplified with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 101 and 102) using the ATCC 13032 strain genome as a template to obtain a DNA fragment.
  • pHKPsacB1 as a template, amplification was performed with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 103 and 104), and the resulting PCR product was treated with DpnI (Takara Bio).
  • each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio) and ligated with In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to obtain plasmid pHKPsacB_Ptu- aroA was generated.
  • the KC314sr strain was analyzed by the PCR method (Sapphire Amp (Takara Bio)) using the primers of SEQ ID NOS: 124 and 129, and the KC314sr strain was a single-crossover homologous recombinant in which the plasmid pHKPsacB_Ptu-aroA was introduced into the promoter region of cg0873. It was confirmed that The KC314sr strain was cultured in 1 mL of LB liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride) for 24 hours, and a portion of the culture was spread on 20% sucrose-containing LB agar medium.
  • LB liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride
  • the KC314 strain was obtained by culturing.
  • PCR method Sakara Bio
  • primers of SEQ ID NOs: 129 and 130 primers of SEQ ID NOs: 129 and 130.
  • the KC314 strain is a double-crossover homologous recombinant in which a tu promoter has been introduced into the cg0873 (aroA) promoter region as expected. It was confirmed.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 100) containing the tu promoter was amplified with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 101 and 102) using the ATCC 13032 strain genome as a template to obtain a DNA fragment.
  • a DNA fragment of the cg0503 gene (SEQ ID NO: 137) was amplified with two kinds of DNA primers (SEQ ID NOS: 138 and 139) using the ATCC 13032 strain genome as a template to obtain a DNA fragment.
  • pHKPsacB1 as a template, amplification was performed with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 103 and 104), and the resulting PCR product was treated with DpnI (Takara Bio).
  • each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio) and ligated with In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to obtain plasmid pHKPsacB_ ⁇ pobA: : Ptu-qsuC was produced.
  • the KC315sr strain was analyzed by the PCR method (Sapphire Amp (Takara Bio)) using the primers of SEQ ID NOS: 132 and 140, and the KC315sr strain was a plasmid pHKPsacB_ ⁇ pobA :: Ptu-qsuC was introduced into the promoter region of cg1226. Confirmed to be a recombinant.
  • the KC315sr strain was cultured in 1 mL of LB liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride) for 24 hours, and a portion of the culture was spread on 20% sucrose-containing LB agar medium.
  • the KC315 strain was obtained by culturing.
  • PCR method (Sapphire Amp (Takara Bio)) using primers of SEQ ID NOS: 140 and 141, the cg0503 (qsuC) gene bound to the tu promoter is introduced into the cg1226 (pobA) gene region of the KC315 strain as expected 2 It was confirmed to be a double crossover type homologous recombinant.
  • a downstream region (SEQ ID NO: 145) was amplified with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 146 and 147) to obtain a DNA fragment.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 148) containing the tu promoter was prepared by artificial gene synthesis and amplified with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 149 and 150) to obtain a DNA fragment.
  • a DNA fragment containing the E. coli aroG mutant gene (mutation of aspartic acid at position 146 to asparagine) was prepared by artificial gene synthesis, and using this as a template, two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 151 and 152) were used. Amplified to obtain a DNA fragment (SEQ ID NO: 153).
  • pHKPsacB1 Using pHKPsacB1 as a template, amplification was performed with two types of DNA primers (SEQ ID NOS: 103 and 104), and the resulting PCR product was treated with DpnI (Takara Bio). For the obtained five types of PCR products, each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio) and ligated with In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) to obtain plasmid pHKPsacB_cg0620_Ptu- aroG_D146N was produced.
  • KC341sr strain was obtained by introducing into the KC315 strain obtained from the above method and selecting for kanamycin resistance.
  • the KC341sr strain was analyzed by the PCR method (Sapphire Amp (Takara Bio)) using the primers of SEQ ID NOs: 143 and 154, and the KC341sr strain was a single-crossover homologous group in which the plasmid pHKPsacB_cg0620_Ptu-aroG_D146N was introduced into the cg0620 gene 3' downstream region. Confirmed to be a mutant.
  • the KC341sr strain was cultured in 1 mL of LB liquid medium (10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L sodium chloride) for 24 hours, and a portion of the culture was spread on 20% sucrose-containing LB agar medium.
  • the KC341 strain was obtained by culturing.
  • the PCR method Sapphire Amp (Takara Bio)
  • the KC341 strain introduced the E. coli-derived aroG mutant gene bound to the tu promoter into the 3′ downstream region of the cg0620 gene as expected. It was confirmed to be a double-crossover type homologous recombinant.
  • Corynebacterium glutamicum KC341 strain was obtained by the above procedure.
  • the primers used above are shown in Table 11.

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Abstract

高活性なプロモーターの提供。下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、プロモーター活性を有するＤＮＡ： （ａ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列； （ｂ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び （ｃ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列； ＭＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ１ＩＸ４ＱＸ５ＩＦＸ１ＧＸ６Ｘ１Ｘ１ＬＸ７Ｘ１ＳＸ８Ｘ１Ｘ１ＧＡＱＸ９ＶＦＸ１０Ｘ１Ｘ１１Ｘ１Ｘ１Ｘ１２ＳＳ （ここで、Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２がＳ又はＡであり、Ｘ３がＶ又はＩであり、Ｘ４がＦ又はＩであり、Ｘ５がＳ又はＡであり、Ｘ６がＶ又はＩであり、Ｘ７がＶ又はＩであり、Ｘ８がＶ又はＩであり、Ｘ９がＧ又はＮであり、Ｘ１０がＤ又はＴであり、Ｘ１１がＩ又はＶであり、Ｘ１２がＡ又はＦである）。

Description

新規プロモーター
　本発明は、新規プロモーターに関する。
　微生物による物質の工業生産において、目的物質の生産性向上は重要な課題の一つである。従来、微生物による物質生産性向上のための生物工学的研究が進められてきた。その１つは、高活性プロモーターに関する研究である。特許文献１には、コリネバクテリウム属菌で機能する高活性なプロモーターとして、伸長因子ｔｕのプロモーターが開示されている。
　特許文献２には、エッシェリキア属菌、コリネバクテリウム属菌由来の様々なプロモーター配列を分析し、それらから、コリネバクテリウム属菌で高活性なプロモーターとして機能するＳＰＬ１、ＳＰＬ７、ＳＰＬ１３のプロモーターを合成したことが開示されている。
　　（特許文献１）特開２００８－２１２１５５号公報
　　（特許文献２）特表２０１９－５２８０７５号公報
　一態様において、本発明は、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、プロモーター活性を有するＤＮＡ：
（ａ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列；
（ｂ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
（ｃ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列、ＭＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ１ＩＸ４ＱＸ５ＩＦＸ１ＧＸ６Ｘ１Ｘ１ＬＸ７Ｘ１ＳＸ８Ｘ１Ｘ１ＧＡＱＸ９ＶＦＸ１０Ｘ１Ｘ１１Ｘ１Ｘ１Ｘ１２ＳＳ
（ここで、Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２がＳ又はＡであり、Ｘ３がＶ又はＩであり、Ｘ４がＦ又はＩであり、Ｘ５がＳ又はＡであり、Ｘ６がＶ又はＩであり、Ｘ７がＶ又はＩであり、Ｘ８がＶ又はＩであり、Ｘ９がＧ又はＮであり、Ｘ１０がＤ又はＴであり、Ｘ１１がＩ又はＶであり、Ｘ１２がＡ又はＦである）を提供する。
　別の一態様において、本発明は、下記（ｇ）～（ｉ）からなる群より選択されるＤＮＡからなる、プロモーター：
（ｇ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｈ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｉ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ、
ＭＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ１ＩＸ４ＱＸ５ＩＦＸ１ＧＸ６Ｘ１Ｘ１ＬＸ７Ｘ１ＳＸ８Ｘ１Ｘ１ＧＡＱＸ９ＶＦＸ１０Ｘ１Ｘ１１Ｘ１Ｘ１Ｘ１２ＳＳ
（ここで、Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２がＳ又はＡであり、Ｘ３がＶ又はＩであり、Ｘ４がＦ又はＩであり、Ｘ５がＳ又はＡであり、Ｘ６がＶ又はＩであり、Ｘ７がＶ又はＩであり、Ｘ８がＶ又はＩであり、Ｘ９がＧ又はＮであり、Ｘ１０がＤ又はＴであり、Ｘ１１がＩ又はＶであり、Ｘ１２がＡ又はＦである）を提供する。
　別の一態様において、本発明は、前記ＤＮＡ又はプロモーターを含む発現ベクターを提供する。
　別の一態様において、本発明は、前記ＤＮＡ又はプロモーターを含むＤＮＡ発現カセットを提供する。
　別の一態様において、本発明は、前記発現ベクター又は前記ＤＮＡ発現カセットを含む、コリネバクテリウムを提供する。
　別の一態様において、本発明は、
　前記コリネバクテリウムを培養すること；及び
　該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法を提供する。
ｔｕプロモーター、ＳＰＬ１３プロモーター、又はｃｇ２８７５プロモーターの制御下にあるＨＦＭ１２２によるＡＢＡからＡＨＢＡへの変換活性。 ｔｕプロモーター、ＳＰＬ１３プロモーター、又はｃｇ２８７５プロモーターの制御下にあるＨＦＭ１２２によるＡＨＢＡ変換率。 ｔｕプロモーター、ＳＰＬ１３プロモーター、又はｃｇ２８７５プロモーターの制御下にあるレポータータンパクの発現量（ｔｕプロモーターに対する相対蛍光強度で示す）。 ｔｕプロモーター、ＳＰＬ１３プロモーター、ｃｇ２８７５プロモーター、又は縮小したｃｇ２８７５プロモーターの制御下にあるＨＦＭ１２２によるＡＨＢＡ変換率。 ｔｕプロモーター、ＳＰＬ１３プロモーター、又はｃｇ２８７５遺伝子のホモログのプロモーターの制御下にあるＨＦＭ１２２によるＡＨＢＡ変換率。
発明の詳細な説明
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本明細書において、ヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
　本明細書において、別途定義されない限り、ヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１個又は数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、さらにより好ましくは１～３個、なお好ましくは１個又は２個を意味し得る。本明細書において、ヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のヌクレオチドの付加が含まれる。
　本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
　本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、遺伝子の「上流配列」「下流配列」とは、それぞれＤＮＡセンス鎖において該遺伝子の５’側及び３’側に位置する配列をいう。例えば、「遺伝子の上流に連結されたプロモーター」とは、ＤＮＡセンス鎖において遺伝子の５’側にプロモーターが存在することを意味する。また、例えば、「遺伝子の上流のヌクレオチド配列」とは、ＤＮＡセンス鎖において遺伝子の５’側、すなわち該遺伝子の開始コドンに接して５’側に存在するヌクレオチド配列を意味する。
　本明細書において、遺伝子と、プロモーター等の制御領域との「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本明細書において、「プロモーター活性」とは、ＤＮＡ（遺伝子）のｍＲＮＡへの転写を促進する活性を意味する。プロモーター活性は、適当なレポーター遺伝子を用いることにより確認することができる。例えば、プロモーターの下流に検出可能なタンパク質をコードするＤＮＡ、すなわち、レポーター遺伝子を連結し、そのレポーター遺伝子の遺伝子産物の生産量を測定することにより、プロモーター活性を確認可能である。レポーター遺伝子の例としては、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）遺伝子、β－グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－ラクタマーゼ遺伝子、ＥｔｂＣ（２，３－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｅｎｅ　１，２－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子等の発色基質に対して作用する酵素の遺伝子や、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする遺伝子等の蛍光タンパク質の遺伝子、などが挙げられる。あるいは、プロモーター活性は、レポーター遺伝子から転写されたｍＲＮＡの発現量を定量ＲＴ－ＰＣＲ等で測定することによっても確認することができる。あるいは、プロモーター活性は、レポーター遺伝子がコードするタンパク質が関与する反応を測定することによっても確認することができる。例えば、４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１３．２）として知られているＨＦＭ１２２（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１０９２０２６２．１）及びその変異体（特開２０２１－７３９１４号公報に参照される）は、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有し、４－アミノ安息香酸（４－ＡＢＡ）を４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（４，３－ＡＨＢＡ）に変換できる。ＨＦＭ１２２をコードする遺伝子をレポーター遺伝子として用いる場合、４－ＡＢＡ、４，３－ＡＨＢＡ又は両方の濃度を測定することあるいは該濃度にもとづいて４－ＡＢＡから４，３－ＡＨＢＡへの変換率を算出することでプロモーターの活性を測定可能となる。
　本明細書において、「目的物質」とは、細胞が生産し得る物質であって、その生産又は生産量の増加が望まれる物質をいう。目的物質としては、遺伝子（目的遺伝子）にコードされる物質、遺伝子（目的遺伝子）にコードされる物質の働きで生産される物質、遺伝子（目的遺伝子）にコードされる物質の働きで生産量が増加する物質が包含される。
　本発明は、新規プロモーター、及び該プロモーターを用いた目的物質の製造方法を提供する。
　本発明者らは、コリネバクテリウム属菌由来のプロモーターについて検討したところ、高い転写活性を有する新規なプロモーターを見出した。
　本発明のプロモーターは、転写活性が高く、制御対象とする遺伝子の転写量を顕著に向上させることができる。本発明のプロモーターによれば、目的物質の微生物学的生産の効率を向上させることができる。
　本発明者らは、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来の遺伝子のうち、Ｇｅｎｅ　ＩＤ：ｃｇ２８７５で示される遺伝子の開始コドンの上流６１３ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号１）からなるＤＮＡが、公知の高活性プロモーターであるｔｕプロモーターやＳＰＬ１３プロモーターと比較して高いプロモーター活性を有することを見出した（図１～３）。コリネバクテリウム・グルタミカムが有するｃｇ２８７５遺伝子は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする配列番号２のヌクレオチド配列からなり、ＯＲＦ予測ソフトＧｌｉｍｍｅｒによってＯＲＦと予測された遺伝子である。ｃｇ２８７５遺伝子がコードするタンパク質は、膜タンパク質であること、ミコール化されることが知られているが、その機能や発現量に関してはこれまで知られていなかった（Ｉｓｓａ，Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．，ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２０１７，１２（２）：ｅ０１７１９５５）。
　また本発明者らは、ｃｇ２８７５遺伝子の上流のヌクレオチド配列の内、ｃｇ２８７５遺伝子の上流２０８ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号２３）からなるＤＮＡが、ｔｕプロモーターやＳＰＬ１３プロモーターと比較して高いプロモーター活性を有することを見出した（図４）。該ＤＮＡは、３’末端の少なくとも８６ｂｐのヌクレオチド配列（配列番号２１）を含んでいれば、ｔｕプロモーターやＳＰＬ１３プロモーターと同等のプロモーター活性を有する。
　さらに本発明者らは、ｃｇ２８７５遺伝子のホモログの上流のヌクレオチド配列（配列番号２６～４１）からなるＤＮＡが、ｔｕプロモーターやＳＰＬ１３プロモーターと比較して高いプロモーター活性を有することを見出した（図５）。ここで、「ｃｇ２８７５遺伝子のホモログ」とは、ｃｇ２８７５タンパク質と同等の機能を有するポリペプチドをコードすると推測される遺伝子を指し、例えば、ｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２３）をｑｕｅｒｙとしたＢＬＡＳＴ検索においてＱｕｅｒｙ　ｃｏｖｅｒが９８％以上であるヌクレオチド配列の下流の遺伝子、ｃｇ２８７５タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）をｑｕｅｒｙとしたＢＬＡＳＴ検索においてＱｕｅｒｙ　ｃｏｖｅｒが１００％であるアミノ酸配列をコードする遺伝子等が挙げられる。該ホモログがコードするアミノ酸配列は、ｃｇ２８７５遺伝子がコードするアミノ酸配列も含めて、以下のように表すことができる。
ＭＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ１ＩＸ４ＱＸ５ＩＦＸ１ＧＸ６Ｘ１Ｘ１ＬＸ７Ｘ１ＳＸ８Ｘ１Ｘ１ＧＡＱＸ９ＶＦＸ１０Ｘ１Ｘ１１Ｘ１Ｘ１Ｘ１２ＳＳ（配列番号１６９）
（ここで、Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２がＳ又はＡであり、Ｘ３がＶ又はＩであり、Ｘ４がＦ又はＩであり、Ｘ５がＳ又はＡであり、Ｘ６がＶ又はＩであり、Ｘ７がＶ又はＩであり、Ｘ８がＶ又はＩであり、Ｘ９がＧ又はＮであり、Ｘ１０がＤ又はＴであり、Ｘ１１がＩ又はＶであり、Ｘ１２がＡ又はＦである）。
　「ｃｇ２８７５遺伝子のホモログのプロモーター」としては、例えば、ｃｇ２８７５遺伝子のプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２３）をｑｕｅｒｙとしたＢＬＡＳＴ検索においてＱｕｅｒｙ　ｃｏｖｅｒが９８％以上であるヌクレオチド配列からなるプロモーター、ｃｇ２８７５タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）をｑｕｅｒｙとしたＢＬＡＳＴ検索においてＱｕｅｒｙ　ｃｏｖｅｒが１００％であるアミノ酸配列をコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列からなるプロモーター等が挙げられる。
　本発明は、新規のプロモーター活性を有するＤＮＡ、新規プロモーター、該ＤＮＡ又は該プロモーターを含有する発現ベクター、ＤＮＡ発現カセット及び形質転換体、ならびに該形質転換体を用いた目的物質の製造方法に関する。
　本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡとしては、下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、プロモーター活性を有するＤＮＡが挙げられる。
（ａ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列；
（ｂ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
（ｃ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列；
ＭＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ１ＩＸ４ＱＸ５ＩＦＸ１ＧＸ６Ｘ１Ｘ１ＬＸ７Ｘ１ＳＸ８Ｘ１Ｘ１ＧＡＱＸ９ＶＦＸ１０Ｘ１Ｘ１１Ｘ１Ｘ１Ｘ１２ＳＳ
（ここで、Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２がＳ又はＡであり、Ｘ３がＶ又はＩであり、Ｘ４がＦ又はＩであり、Ｘ５がＳ又はＡであり、Ｘ６がＶ又はＩであり、Ｘ７がＶ又はＩであり、Ｘ８がＶ又はＩであり、Ｘ９がＧ又はＮであり、Ｘ１０がＤ又はＴであり、Ｘ１１がＩ又はＶであり、Ｘ１２がＡ又はＦである）。
　上記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列長は、プロモーター活性を有する限り特に限定されないが、好ましくは８５ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上、さらに好ましくは２００ｂｐ以上であり、好ましくは８００ｂｐ以下、より好ましくは６５０ｂｐ以下、さらに好ましくは２５０ｂｐ以下であり、また、さらにより好ましくは２０８ｂｐである。該ヌクレオチド配列長の範囲は、好ましくは８５～８００ｂｐ、より好ましくは８５～６５０ｂｐ、さらに好ましくは１００～６５０ｂｐ、さらにより好ましくは１００～２５０ｂｐであり、なお好ましくは２００～２５０ｂｐであり、なおより好ましくは２０８ｂｐである。
　好ましくは、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡは、下記（ｄ）～（ｆ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる。（ｄ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列；（ｅ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び（ｆ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列。
　ここで、配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡは、後記実施例に示すようにプロモーター活性を有する。配列番号２６～４１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが由来する微生物種を下記表７に示す。
　より好ましくは、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡは、下記（ｄ’）～（ｆ’）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる。
（ｄ’）配列番号２３のヌクレオチド配列；
（ｅ’）配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
（ｆ’）配列番号２３のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列。
　さらに好ましくは、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡは、上記（ｄ’）～（ｆ’）からなる群より選択されるヌクレオチド配列において、下記（ｄ”）～（ｆ”）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
（ｄ”）配列番号２１のヌクレオチド配列；
（ｅ”）配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
（ｆ”）配列番号２１のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列。
　本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡは、少なくともコリネバクテリウムにおいてプロモーター活性を有するものである。好ましくは、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡは、ｔｕプロモーターと比較して、プロモーター活性が向上している。より好ましくは、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡは、ＳＰＬ１３プロモーターと比較して、プロモーター活性が向上している。
　本発明のプロモーターとしては、下記（ｇ）～（ｉ）からなる群より選択されるＤＮＡからなるプロモーターが挙げられる。
（ｇ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｈ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｉ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
ＭＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ１ＩＸ４ＱＸ５ＩＦＸ１ＧＸ６Ｘ１Ｘ１ＬＸ７Ｘ１ＳＸ８Ｘ１Ｘ１ＧＡＱＸ９ＶＦＸ１０Ｘ１Ｘ１１Ｘ１Ｘ１Ｘ１２ＳＳ
（ここで、Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２がＳ又はＡであり、Ｘ３がＶ又はＩであり、Ｘ４がＦ又はＩであり、Ｘ５がＳ又はＡであり、Ｘ６がＶ又はＩであり、Ｘ７がＶ又はＩであり、Ｘ８がＶ又はＩであり、Ｘ９がＧ又はＮであり、Ｘ１０がＤ又はＴであり、Ｘ１１がＩ又はＶであり、Ｘ１２がＡ又はＦである）。
　上記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列長は、プロモーター活性を有する限り特に限定されないが、好ましくは８５ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上、さらに好ましくは２００ｂｐ以上であり、好ましくは８００ｂｐ以下、より好ましくは６５０ｂｐ以下、さらに好ましくは２５０ｂｐ以下であり、また、さらにより好ましくは２０８ｂｐである。該ヌクレオチド配列長の範囲は、好ましくは８５～８００ｂｐ、より好ましくは８５～６５０ｂｐ、さらに好ましくは１００～６５０ｂｐ、さらにより好ましくは１００～２５０ｂｐであり、なお好ましくは２００～２５０ｂｐであり、なおより好ましくは２０８ｂｐである。
　好ましくは、本発明のプロモーターは、下記（ｊ）～（ｌ）からなる群より選択されるＤＮＡからなる。
（ｊ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｋ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｌ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
　ここで、配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡは、後記実施例に示すようにプロモーター活性を有する。配列番号２６～４１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡが由来する微生物種を下記表７に示す。
　より好ましくは、本発明のプロモーターは、下記（ｊ’）～（ｌ’）からなる群より選択されるＤＮＡからなる。
（ｊ’）配列番号２３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｋ’）配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｌ’）配列番号２３のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
　さらに好ましくは、本発明のプロモーターは、上記（ｊ’）～（ｌ’）からなる群より選択されるＤＮＡにおいて、下記（ｊ”）～（ｌ”）からなる群より選択されるＤＮＡを含む。
（ｊ”）配列番号２１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｋ”）配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｌ”）配列番号２１のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
　本発明のプロモーターは、少なくともコリネバクテリウムにおいてプロモーター活性を有するものである。好ましくは、本発明のプロモーターは、ｔｕプロモーターと比較して、プロモーター活性が向上している。より好ましくは、本発明のプロモーターは、ＳＰＬ１３プロモーターと比較して、プロモーター活性が向上している。
　以下、本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ及び本発明のプロモーターを、まとめて「本発明のプロモーター等」と称する。
　本発明のプロモーター等の取得方法としては、特に制限されず、通常の化学合成法又は遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、本発明のプロモーター等のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１、２１～２３、及び２６～４１）に基づいて、本発明のプロモーター等を人工合成することができる。人工合成には、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社等から提供される市販のＤＮＡ合成サービスを利用することができる。あるいは、コリネバクテリウム・グルタミカム等の微生物から、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ　ＴＨＩＲＤ　ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｊｏｓｅｐｈ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ　Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２００１）記載の方法に従って、本発明のプロモーター等のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１、２１～２３、及び２６～４１）をクローニングすることができる。
　本発明のプロモーター等は、また、本発明のプロモーター等のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１、２１～２３、及び２６～４１）のＤＮＡに突然変異を導入することによって製造することができる。突然変異導入の手法としては、例えば、紫外線照射及び部位特異的変異導入法が挙げられる。部位特異的変異導入の手法としては、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ　７７，６１－６８，１９８９）を利用した方法、ＯＤＡ法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ－Ｇｏｔｏｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５２，２７１－２７６，１９９５）、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８５，８２，４８８）等が挙げられる。あるいは、Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｍｕｔａｎ－ＳｕｐｅｒＥｘｐｒｅｓｓ　Ｋｍキット（タカラバイオ）、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＴＭ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社）、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡社）等の市販の部位特異的変異導入用キットを利用することもできる。突然変異導入したＤＮＡから所望のプロモーター活性を有するものを選択することによって、本発明のプロモーター等を取得することができる。例えば、変異導入したＤＮＡの下流に目的遺伝子を作動可能に連結し、該目的遺伝子の発現量解析を行うことにより、プロモーター活性を有するＤＮＡを選択することができる。
　あるいは、ヌクレオチド配列に対するヌクレオチドの欠失、置換、付加、又は挿入の方法は、例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，５８１－６２１，１９９５）に記載されている。
　上述の手法を用いることによって、本発明のプロモーター等のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１、２１～２３、及び２６～４１）と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなる本発明のプロモーター等、又は、本発明のプロモーター等のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１、２１～２３、及び２６～４１）に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなる本発明のプロモーター等を取得することができる。
　本発明のプロモーター等は、その下流に配置された遺伝子の発現を制御する機能を有する。本発明のプロモーター等を利用することによって、転写活性に優れた発現制御領域を有するＤＮＡ断片を得ることができる。例えば、目的遺伝子と、その上流に作動可能に連結された本発明のプロモーター等とを含むＤＮＡ断片を構築することができる。該ＤＮＡ断片には、本発明のプロモーター等及び目的遺伝子の他に、該プロモーター等の転写活性を向上させるようなシスエレメント、又はターミネーターが含まれていてもよい。さらに、該ＤＮＡ断片は、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性マーカー遺伝子などの選択マーカー遺伝子を含んでいてもよい。好ましくは、該目的遺伝子と本発明のプロモーター等とを含むＤＮＡ断片は、該目的遺伝子を発現するためのＤＮＡ発現カセットである。
　上述した本発明のプロモーター等を含むＤＮＡ断片は、両末端に制限酵素認識配列を有するように構築することができる。該制限酵素認識配列を使用して、本発明のプロモーター等をベクターに導入することができる。例えば、ベクターを制限酵素で切断し、そこに、本発明のプロモーター等を含み端部に制限酵素切断配列を有するＤＮＡ断片を添加することによって、本発明のプロモーター等をベクターに導入することができる（制限酵素法）。
　本発明のプロモーター等を含むＤＮＡ断片は、宿主細胞のゲノムに直接導入してもよい。例えば、本発明のプロモーター等を含むＤＮＡ断片を、宿主細胞のゲノムにおける目的遺伝子の上流に導入してもよい。また例えば、上述した目的遺伝子と本発明のプロモーター等とを含むＤＮＡ発現カセットを、宿主細胞のゲノムに導入してもよい。
　あるいは、本発明のプロモーター等を、目的遺伝子の発現を可能とする発現ベクターに組み込むことで、当該目的遺伝子の発現を転写レベルで向上させることができる発現ベクターが得られる。該発現ベクターにおいては、本発明のプロモーター等は、目的遺伝子をコードするＤＮＡの上流に作動可能に連結され得る。本発明のプロモーター等を有する発現ベクターは、宿主細胞の染色体に導入するためのベクターであっても、染色体外に保持されるベクターであってもよい。宿主細胞内で複製可能なものが好ましい。
　発現ベクターの例としては、大腸菌用ベクター、コリネバクテリウム用ベクターなどが挙げられ、例えばプラスミド、コスミド、ファスミド、ファージ、トランスポゾン、ＢＡＣベクターなどを用いることができる。好ましいベクターの例としては、ｐＥＴ２１－ａ（＋）、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ２１８／２１９、ｐＺ１（Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８９，５５：６８４－６８８）、ｐＥＫＥｘ１（Ｇｅｎｅ，１９９１，１０２：９３－９８）、ｐＨＳ２－１（Ｇｅｎｅ，１９９１，１０７：６９－７４）、ｐＣＬｉＫ５ＭＣＳ（特表２００５－５２２２１８号公報）、ｐＣＧ２（特開昭５８－３５１９７号公報）、ｐＮＧ２（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９０，６６：１１９－１２４）、ｐＡＧ１（特開昭６１－５２２９０号公報）、ｐＨＫＰｓａｃＢ１（国際公開公報第２０１４／００７２７３号）などが挙げられる。
　上記発現ベクターやＤＮＡ断片において、本発明のプロモーター等の下流に配置される目的遺伝子は特に限定されない。例えば、目的遺伝子は、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子である。目的遺伝子は、異種発現産物をコードする異種遺伝子であっても、外部から導入された同種由来の遺伝子であっても、宿主細胞が本来有する発現産物をコードする遺伝子であっても、その他の任意のタンパク質、ペプチド、核酸などをコードする遺伝子であってもよい。目的遺伝子がコードする物質の例としては、酵素、ホルモン、サイトカイン、その他生理活性ペプチド、トランスポーター、ノンコーディングＲＮＡなどが挙げられる。酵素の例としては、酸化還元酵素（Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、転移酵素（Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、加水分解酵素（Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、脱離酵素（Ｌｙａｓｅ）、異性化酵素（Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、合成酵素（Ｌｉｇａｓｅ又はＳｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、解糖系の酵素、ペントースリン酸回路の酵素、ＴＣＡ回路の酵素、芳香族化合物の合成に関与する酵素、などが挙げられる。目的遺伝子の好ましい例としては、宿主細胞の芳香族化合物の合成に関与する酵素、例えば没食子酸合成酵素（特開２００９－０６５８３９号公報、特開２００９－２１３３９２号公報に記載）、ＡｒｏＦ、ＡｒｏＧ、ＰａｂＡＢ、ＰａｂＣなどをコードする遺伝子、などが挙げられる。芳香族化合物の例としては、没食子酸、プロトカテク酸（ＰＣＡ）、アミノヒドロキシ安息香酸（ＡＨＢＡ）、ピリジンジカルボン酸（ＰＤＣＡ）、カテコール、４－ヒドロキシ安息香酸などが挙げられる。
　本発明のプロモーター等を含む発現ベクター又はＤＮＡ断片を、一般的な形質転換法、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いて宿主細胞に導入することによって、本発明の形質転換体を得ることができる。
　上記ベクターやＤＮＡ断片を導入する宿主細胞としては、その細胞内で、本発明のプロモーター等がプロモーターとして機能し得るものであれば特に限定されないが、好ましくは細菌、より好ましくはコリネバクテリウムが挙げられる。コリネバクテリウムの例としては、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）などが好ましく、コリネバクテリウム・グルタミカムがより好ましい。なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム・リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌は、コリネバクテリウム・グルタミカムに菌名が統一されている（Ｌｉｅｂｌ　Ｗ　ｅｔ　ａｌ，Ｉｎｔ　Ｊ　Ｓｙｓｔ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９１，４１：２５５－２６０；駒形和男ら，発酵と工業，１９８７，４５：９４４－９６３）。
　上記形質転換体は、目的物質の製造に利用することができる。例えば、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に作動可能に連結された本発明のプロモーター等、を有する発現ベクター又はＤＮＡ断片を含む形質転換体を培養して、本発明のプロモーター等の制御下で該遺伝子を発現させ、目的物質を生産させる。
　目的物質の例は上述したとおりであるが、好ましい例としては、上述した目的遺伝子にコードされる物質、及び該物質の働きで合成される生成物、例えば上述した芳香族化合物の生産に関与する酵素により生成される、芳香族化合物が挙げられる。芳香族化合物の例としては、没食子酸、プロトカテク酸（ＰＣＡ）、アミノヒドロキシ安息香酸（ＡＨＢＡ）、ピリジンジカルボン酸（ＰＤＣＡ）、カテコール、４－ヒドロキシ安息香酸などが挙げられる。
　形質転換体の培養条件は、該形質転換体の細胞の増殖及び目的物質の生産が可能な条件であれば特に限定されない。例えば、形質転換体がコリネバクテリウムの場合、好ましい培地としては、ＬＢ培地、ＣＧＸＩＩ培地（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９３，１７５：５５９５－５６０３）などが挙げられ、培養条件としては、培養温度は１５℃～４５℃、培養時間は１日～７日が挙げられる。形質転換体が大腸菌の場合、好ましい培地としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地などが挙げられ、培養条件としては、培養温度は１５℃～４５℃、培養時間は１日～７日が挙げられる。
　培養後、培養物から目的物質を回収することにより、目的物質を取得することができる。必要に応じて、回収した目的物質をさらに精製してもよい。培養物から目的物質を回収又は精製する方法は、特に限定されず、公知の回収又は精製方法に従って行えばよい。例えば、培養物を回収し、必要に応じて超音波や加圧等による菌体破砕処理を行い、次いで傾斜法、ろ過、遠心分離などにより細胞成分を除去した後、残った目的物質を含む画分を回収すればよい。必要に応じて回収した画分を透析、塩析、イオン交換法、蒸留、溶剤抽出等の方法、又はこれらの組み合わせにかけることで、目的物質を精製することができる。本発明による目的物質の製造方法において、形質転換体の培養及び目的物質の回収は、回分式、半回分式及び連続式のいずれの方法で行ってもよい。
　本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法等をさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、プロモーター活性を有するＤＮＡ：
（ａ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列；
（ｂ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
（ｃ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列；
ＭＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ１ＩＸ４ＱＸ５ＩＦＸ１ＧＸ６Ｘ１Ｘ１ＬＸ７Ｘ１ＳＸ８Ｘ１Ｘ１ＧＡＱＸ９ＶＦＸ１０Ｘ１Ｘ１１Ｘ１Ｘ１Ｘ１２ＳＳ
（ここで、Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２がＳ又はＡであり、Ｘ３がＶ又はＩであり、Ｘ４がＦ又はＩであり、Ｘ５がＳ又はＡであり、Ｘ６がＶ又はＩであり、Ｘ７がＶ又はＩであり、Ｘ８がＶ又はＩであり、Ｘ９がＧ又はＮであり、Ｘ１０がＤ又はＴであり、Ｘ１１がＩ又はＶであり、Ｘ１２がＡ又はＦである）。
〔２〕上記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列長が、好ましくは８５ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上、さらに好ましくは２００ｂｐ以上であり、好ましくは８００ｂｐ以下、より好ましくは６５０ｂｐ以下、さらに好ましくは２５０ｂｐ以下であり、また、さらにより好ましくは２０８ｂｐであり、該ヌクレオチド配列長の範囲が、好ましくは８５～８００ｂｐ、より好ましくは８５～６５０ｂｐ、さらに好ましくは１００～６５０ｂｐ、さらにより好ましくは１００～２５０ｂｐであり、なお好ましくは２００～２５０ｂｐであり、なおより好ましくは２０８ｂｐである、〔１〕記載のＤＮＡ。
〔３〕下記（ｄ）～（ｆ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、〔１〕又は〔２〕記載のＤＮＡ：
（ｄ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
（ｆ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列。
〔４〕下記（ｄ’）～（ｆ’）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載のＤＮＡ：
（ｄ’）配列番号２３のヌクレオチド配列；
（ｅ’）配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
（ｆ’）配列番号２３のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列。
〔５〕下記（ｄ”）～（ｆ”）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、〔４〕記載のＤＮＡ：
（ｄ”）配列番号２１のヌクレオチド配列；
（ｅ”）配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
（ｆ”）配列番号２１のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列。
〔６〕下記（ｇ）～（ｉ）からなる群より選択されるＤＮＡからなる、プロモーター：
（ｇ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｈ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｉ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
ＭＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ１ＩＸ４ＱＸ５ＩＦＸ１ＧＸ６Ｘ１Ｘ１ＬＸ７Ｘ１ＳＸ８Ｘ１Ｘ１ＧＡＱＸ９ＶＦＸ１０Ｘ１Ｘ１１Ｘ１Ｘ１Ｘ１２ＳＳ
（ここで、Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２がＳ又はＡであり、Ｘ３がＶ又はＩであり、Ｘ４がＦ又はＩであり、Ｘ５がＳ又はＡであり、Ｘ６がＶ又はＩであり、Ｘ７がＶ又はＩであり、Ｘ８がＶ又はＩであり、Ｘ９がＧ又はＮであり、Ｘ１０がＤ又はＴであり、Ｘ１１がＩ又はＶであり、Ｘ１２がＡ又はＦである）。
〔７〕上記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列長が、好ましくは８５ｂｐ以上、より好ましくは１００ｂｐ以上、さらに好ましくは２００ｂｐ以上であり、好ましくは８００ｂｐ以下、より好ましくは６５０ｂｐ以下、さらに好ましくは２５０ｂｐ以下であり、また、さらにより好ましくは２０８ｂｐであり、該ヌクレオチド配列長の範囲が、好ましくは８５～８００ｂｐ、より好ましくは８５～６５０ｂｐ、さらに好ましくは１００～６５０ｂｐ、さらにより好ましくは１００～２５０ｂｐであり、なお好ましくは２００～２５０ｂｐであり、なおより好ましくは２０８ｂｐである、〔６〕記載のプロモーター。
〔８〕下記（ｊ）～（ｌ）からなる群より選択されるＤＮＡからなる、〔６〕又は〔７〕記載のプロモーター：
（ｊ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｋ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｌ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
〔９〕下記（ｊ’）～（ｌ’）からなる群より選択されるＤＮＡからなる、〔６〕～〔８〕のいずれか１項記載のプロモーター：
（ｊ’）配列番号２３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｋ’）配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｌ’）配列番号２３のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
〔１０〕下記（ｊ”）～（ｌ”）からなる群より選択されるＤＮＡを含む、〔９〕記載のプロモーター：
（ｊ”）配列番号２１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｋ”）配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｌ”）配列番号２１のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
〔１１〕好ましくは、コリネバクテリウムにおいてプロモーター活性を有する、〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載のＤＮＡ又は〔６〕～〔１０〕のいずれか１項記載のプロモーター。
〔１２〕〔１〕～〔５〕及び〔１１〕のいずれか１項記載のＤＮＡ又は〔６〕～〔１１〕のいずれか１項記載のプロモーターを含む発現ベクター。
〔１３〕好ましくは、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された前記ＤＮＡ又はプロモーターとを含む、〔１２〕記載の発現ベクター。
〔１４〕前記目的物質が、好ましくは芳香族化合物である、〔１３〕記載の発現ベクター。
〔１５〕〔１〕～〔５〕及び〔１１〕のいずれか１項記載のＤＮＡ又は〔６〕～〔１１〕のいずれか１項記載のプロモーターを含むＤＮＡ断片。
〔１６〕好ましくは、目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された前記ＤＮＡ又はプロモーターとを含む、〔１５〕記載のＤＮＡ断片。
〔１７〕前記目的物質が、好ましくは芳香族化合物である、〔１６〕記載のＤＮＡ断片。
〔１８〕好ましくはＤＮＡ発現カセットである、〔１５〕～〔１７〕のいずれか１項記載のＤＮＡ断片。
〔１９〕〔１２〕～〔１４〕のいずれか１項記載の発現ベクター、又は〔１５〕～〔１７〕のいずれか１項記載のＤＮＡ断片を含む、形質転換体。
〔２０〕好ましくはコリネバクテリウムであり、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムである、〔１９〕記載の形質転換体。
〔２１〕〔１９〕又は〔２０〕記載の形質転換体を培養すること；及び
　該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
を含む、目的物質の製造方法。
〔２２〕前記目的物質が、好ましくは芳香族化合物であり、より好ましくは没食子酸、プロトカテク酸、アミノヒドロキシ安息香酸、ピリジンジカルボン酸、カテコール、及び４－ヒドロキシ安息香酸からなる群より選択される少なくとも１種である、〔２１〕記載の方法。
〔２３〕下記（ｄ）～（ｆ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、プロモーター活性を有するＤＮＡ：
（ｄ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
（ｆ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列。
〔２４〕下記（ｄ’）～（ｆ’）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、〔２３〕記載のＤＮＡ：
（ｄ’）配列番号２３のヌクレオチド配列；
（ｅ’）配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
（ｆ’）配列番号２３のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列。
〔２５〕下記（ｄ”）～（ｆ”）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、〔２４〕記載のＤＮＡ：
（ｄ”）配列番号２１のヌクレオチド配列；
（ｅ”）配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
（ｆ”）配列番号２１のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列。
〔２６〕下記（ｊ）～（ｌ）からなる群より選択されるＤＮＡからなる、プロモーター：
（ｊ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｋ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｌ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
〔２７〕下記（ｊ’）～（ｌ’）からなる群より選択されるＤＮＡからなる、〔２６〕に記載のプロモーター：
（ｊ’）配列番号２３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｋ’）配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｌ’）配列番号２３のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
〔２８〕下記（ｊ”）～（ｌ”）からなる群より選択されるＤＮＡを含む、〔２７〕記載のプロモーター：
（ｊ”）配列番号２１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
（ｋ”）配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
（ｌ”）配列番号２１のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
〔２９〕好ましくは、コリネバクテリウムにおいてプロモーター活性を有する、〔２３〕～〔２５〕のいずれか１項記載のＤＮＡ又は〔２６〕～〔２８〕のいずれか１項記載のプロモーター。
　以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
実施例１　プロモーター活性評価用プラスミドの作製
１）ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌの作製
　ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ（特開２０２１－０７３９１４号公報参照）を鋳型にプライマー（配列番号４及び５）を用いてベクター断片を増幅した。尚、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌでは、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株が有するｔｕプロモーターの制御下に、ＨＦＭ１２２の４７位のバリンがロイシンに置換され、野生型のＨＦＭ１２２より活性が高いＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌをコードする遺伝子が連結されている。また、ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマー（配列番号６及び７）を用いて、配列番号１で示したＧｅｎｅ　ＩＤ：ｃｇ２８７５のプロモーター配列（Ｐｃｇ２８７５）にベクター断片のリンカー配列を付与した配列を増幅した。ベクター断片とＰｃｇ２８７５断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを作製した。得られたプラスミド溶液を用いて、ＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩静置した。発生したコロニーを鋳型に、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）及びプライマー（配列番号８及び９）を用いてコロニーＰＣＲを行った。目的遺伝子を持つプラスミドの導入が確認された形質転換体を、カナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行い、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを得た。
２）ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＳＰＬ１３＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌの作製
　ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを鋳型にプライマー（配列番号１０及び１１）を用いてベクター断片を増幅した。一方、特許文献２に開示されるＳＰＬ１３プロモーター配列（配列番号１２）をユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して化学合成した。得られたＳＰＬ１３プロモーターを含むＤＮＡを鋳型に、プライマー（配列番号１３及び１４）を用いてＳＰＬ１３プロモーター配列にベクター断片のリンカー配列を付与した配列を増幅した。ベクター断片とＳＰＬ１３プロモーター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＳＰＬ１３＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを作製した。得られたプラスミド溶液を用いて、ＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩静置した。発生したコロニーを鋳型に、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）及びプライマー（配列番号９及び１３）を用いてコロニーＰＣＲを行った。目的遺伝子を持つプラスミドの導入が確認された形質転換体を、カナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行い、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＳＰＬ１３＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを得た。
　上記１）及び２）で用いたプライマーを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２　形質転換体の作製
　実施例１で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ及びｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＳＰＬ１３＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌと、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを用いて、後述する参考例１で得られたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣ３４１株にエレクトロポレーション法（Ｂｉｏ－ｒａｄ）により形質転換した。得られた形質転換細胞液をカナマイシン含有ＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で２日間静置し、得られたコロニーを形質転換体とした。
実施例３　プロモーター活性の比較
１）形質転換体の培養
　実施例２で得られた形質転換体を表２に示すＣＧＸＩＩ培地（カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含む）１０ｍＬを入れた試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍにて２日間振盪培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
２）プロモーター活性の測定
　４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（４，３－ＡＨＢＡ、以下、単にＡＨＢＡと称す）と４－アミノ安息香酸（４－ＡＢＡ、以下、単にＡＢＡと称す）の定量をＨＰＬＣにより行った。ＨＰＬＣ分析に供する培養液を３７ｍＭ硫酸にて適宜希釈した後、アクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不要物の除去を行った。ＨＰＬＣの測定条件を表３に示す。尚、試験はＮ＝３で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　ＡＨＢＡ濃度とＡＢＡ濃度からＡＨＢＡ変換率を以下の式に従い算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000004
　図１及び２に示すように、ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌをｔｕプロモーター又はＳＰＬ１３プロモーターで発現させた株より、ｃｇ２８７５プロモーターで発現させた株の方が、基質であるＡＢＡの濃度が低く、生産物のＡＨＢＡ濃度が高く、ＡＨＢＡ変換率が高かった。よって、ｃｇ２８７５プロモーターの活性がｔｕプロモーター及びＳＰＬ１３プロモーターより高いことが示された。
実施例４　レポータータンパクを用いたプロモーター活性評価用プラスミドの作製
１）ｐＥＣｓｆ＿Ｐｃｇ２８７５＿ｍＣｈｅｒｒｙの作製
　タカラバイオ株式会社から購入したｐｍＣｈｅｒｒｙ　Ｖｅｃｔｏｒを鋳型に、プライマー（配列番号１５６及び１５７）を用いて、レポータータンパクｍＣｈｅｒｒｙ配列（配列番号１６８）を増幅した。ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ（特開２０２１－０７３９１４号公報参照）を鋳型にプライマー（配列番号１５８及び１５９）を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙ断片のリンカー配列を付与したベクター断片を増幅した。ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムＤＮＡを鋳型に、プライマー（配列番号１６０及び１６１）を用いて、配列番号１で示したＧｅｎｅ　ＩＤ：ｃｇ２８７５のプロモーター配列（Ｐｃｇ２８７５）にｍＣｈｅｒｒｙ断片のリンカー配列とベクター断片のリンカー配列を付与した配列を増幅した。ベクター断片とｍＣｈｅｒｒｙ断片、Ｐｃｇ２８７５断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＥＣｓｆ＿Ｐｃｇ２８７５＿ｍＣｈｅｒｒｙを作製した。得られたプラスミド溶液を用いて、ＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩静置した。発生したコロニーを鋳型に、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）及びプライマー（配列番号１６２及び１６３）を用いてコロニーＰＣＲを行った。目的遺伝子を持つプラスミドの導入が確認された形質転換体を、カナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行い、ｐＥＣｓｆ＿Ｐｃｇ２８７５＿ｍＣｈｅｒｒｙを得た。
２）ｐＥＣｓｆ＿ｔｕＤ＿ｍＣｈｅｒｒｙの作製
　タカラバイオ株式会社から購入したｐｍＣｈｅｒｒｙ　Ｖｅｃｔｏｒを鋳型に、プライマー（配列番号１５６及び１５７）を用いて、レポータータンパクｍＣｈｅｒｒｙ配列を増幅した。ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ（特開２０２１－０７３９１４号公報参照）を鋳型にプライマー（配列番号１５８及び１５９）を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙ断片のリンカー配列を付与したベクター断片を増幅した。ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ（特開２０２１－０７３９１４号公報参照）を鋳型に、プライマー（配列番号１６４及び１６５）を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株が有するｔｕプロモーターの配列にｍＣｈｅｒｒｙ断片のリンカー配列とベクター断片のリンカー配列を付与した配列を増幅した。ベクター断片とｍＣｈｅｒｒｙ断片、ｔｕＤ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＥＣｓｆ＿ｔｕＤ＿ｍＣｈｅｒｒｙを作製した。得られたプラスミド溶液を用いて、ＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩静置した。発生したコロニーを鋳型に、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）及びプライマー（配列番号１６２及び１６３）を用いてコロニーＰＣＲを行った。目的遺伝子を持つプラスミドの導入が確認された形質転換体を、カナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行い、ｐＥＣｓｆ＿ｔｕＤ＿ｍＣｈｅｒｒｙを得た。
３）ｐＥＣｓｆ＿ＳＰＬ１３＿ｍＣｈｅｒｒｙの作製
　タカラバイオ株式会社から購入したｐｍＣｈｅｒｒｙ Ｖｅｃｔｏｒを鋳型に、プライマー（配列番号１５６及び１５７）を用いて、レポータータンパクｍＣｈｅｒｒｙ配列を増幅した。ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ（特開２０２１－０７３９１４号公報参照）を鋳型にプライマー（配列番号１５８及び１５９）を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙ断片のリンカー配列を付与したベクター断片を増幅した。特許文献２に開示されるＳＰＬ１３プロモーター配列をユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して化学合成した。得られたＳＰＬ１３プロモーターを含むＤＮＡを鋳型に、プライマー（配列番号１６６及び１６７）を用いてＳＰＬ１３プロモーター配列にｍＣｈｅｒｒｙ断片のリンカー配列とベクター断片のリンカー配列を付与した配列を増幅した。ベクター断片とｍＣｈｅｒｒｙ断片、ＳＰＬ１３プロモーター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結し、ｐＥＣｓｆ＿ＳＰＬ１３＿ｍＣｈｅｒｒｙを作製した。得られたプラスミド溶液を用いて、ＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩静置した。発生したコロニーを鋳型に、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）及びプライマー（配列番号１６２及び１６３）を用いてコロニーＰＣＲを行った。目的遺伝子を持つプラスミドの導入が確認された形質転換体を、カナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行い、ｐＥＣｓｆ＿ＳＰＬ１３＿ｍＣｈｅｒｒｙを得た。
　上記１）～３）で用いたプライマーを表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例５　形質転換体の作製
　実施例４で得られた各プラスミドを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＲＨＧ１４５株（特許第６３２２５７６号公報参照）をエレクトロポレーション法（Ｂｉｏ－ｒａｄ）により形質転換した。得られた形質転換細胞液をカナマイシン含有ＬＢ寒天培地に塗布した後、３０℃で２日間静置し、得られたコロニーを形質転換体とした。
実施例６　プロモーター活性の比較
１）形質転換体の培養
　実施例５で得られた形質転換体を表２に示すＣＧＸＩＩ培地（カナマイシン硫酸塩５０ｍｇ／Ｌを含む）１０ｍＬを入れた試験管に植菌し、３０℃、２００ｒｐｍにて２日間振盪培養した。
２）プロモーター活性の測定
　レポータータンパクｍＣｈｅｒｒの蛍光強度をプレートリーダーＩｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ　Ｐｌｅｘ（ＴＥＣＡＮ社製）を用いて、励起波長５８７ｎｍ、蛍光波長６１０ｎｍで測定した。尚、試験はＮ＝３で行った。
　ｔｕプロモーターに対する相対蛍光強度を図３に示した。ｍＣｈｅｒｒｙをｔｕプロモーター又はＳＰＬ１３プロモーターで発現させた株より、ｃｇ２８７５プロモーターで発現させた株の方が蛍光強度は高かった。よって、ｃｇ２８７５プロモーターの活性がｔｕプロモーター及びＳＰＬ１３プロモーターより高いことが示された。
実施例７　プロモーター領域の縮小
１）プロモーター領域を８０ｂｐに縮小したプラスミドの作製
　ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを鋳型にプライマー（配列番号１５及び１６）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを実施し、ｃｇ２８７５プロモーター（Ｐｃｇ２８７５）を８０ｂｐ（配列番号２０）に縮小したプラスミドを作製した。得られたプラスミド溶液を用いて、ＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩静置した。発生したコロニーを鋳型に、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）及びプライマー（配列番号２４及び２５）を用いてコロニーＰＣＲを行った。プロモーター領域を８０ｂｐに縮小したプラスミドの導入が確認された形質転換体を、カナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行い、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿Ｓ１＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを得た。
２）プロモーター領域を８６ｂｐに縮小したプラスミドの作製
　Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲのプライマーとして配列番号１５及び１７のプライマーを用いた以外は上記１）と同様にして、ｃｇ２８７５プロモーターを８６ｂｐ（配列番号２１）に縮小したプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿Ｓ２＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを得た。
３）プロモーター領域を９６ｂｐに縮小したプラスミドの作製
　Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲのプライマーとして配列番号１５及び１８のプライマーを用いた以外は上記１）と同様にして、ｃｇ２８７５プロモーターを９６ｂｐ（配列番号２２）に縮小したプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿Ｓ３＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを得た。
４）プロモーター領域を２０８ｂｐに縮小したプラスミドの作製
　Ｉｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲのプライマーとして配列番号１５及び１９のプライマーを用いた以外は上記１）と同様にして、ｃｇ２８７５プロモーターを２０８ｂｐ（配列番号２３）に縮小したプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿Ｓ４＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを得た。
　上記１）～４）で用いたプライマーを表５に、上記１）～４）で調製したプロモーター領域を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例８　形質転換体の作製
　実施例７で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿Ｓ１＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿Ｓ２＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿Ｓ３＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ及びｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿Ｓ４＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを用いた以外は実施例２と同様にして、形質転換体を得た。
実施例９　プロモーター活性の比較
１）形質転換体の培養
　実施例２及び８で得られた形質転換体を用いた以外は実施例３の１）と同様にして、形質転換体を培養した。
２）プロモーター活性の測定
　得られた各培養液について、実施例３の２）と同様にして、プロモーター活性を測定した。尚、試験はＮ＝３で行った。
　図４に示すように、ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを、ｃｇ２８７５プロモーターを２０８ｂｐに縮小したｃｇ２８７５＿Ｓ４プロモーターで発現させた株は、ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌをｔｕ又はＳＰＬ１３プロモーターで発現させた株より、ＡＨＢＡ変換率が高かった。よって、ｃｇ２８７５プロモーターの活性は、プロモーター領域が２０８ｂｐの長さがあれば、ｔｕプロモーター及びＳＰＬ１３プロモーターより高いことが示された。また、ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを、ｃｇ２８７５プロモーターを８６ｂｐに縮小したｃｇ２８７５＿Ｓ２プロモーターで発現させた株は、ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌをｔｕ又はＳＰＬ１３プロモーターで発現させた株とＡＨＢＡ変換率が同等以上だった。一方で、ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを、ｃｇ２８７５プロモーターを８０ｂｐに縮小したｃｇ２８７５＿Ｓ１プロモーターで発現させた株は、ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌをｔｕ又はＳＰＬ１３プロモーターで発現させた株より、ＡＨＢＡ変換率が低かった。よって、ｃｇ２８７５プロモーターの活性は、プロモーター領域が８６ｂｐの長さがあれば、ｔｕプロモーター及びＳＰＬ１３プロモーターと同等以上であることが示された。
実施例１０　ホモログプロモーターの探索
１）ｃｇ２８７５プロモーターのヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴ検索
　２０８ｂｐのｃｇ２８７５＿Ｓ４プロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２３）をＢＬＡＳＴ検索（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）に供した。検索結果から、Ｑｕｅｒｙ　ｃｏｖｅｒが９８％以上のアライメント配列を抽出したところ、４２個のヌクレオチド配列（プロモーター配列）を獲得した。また、検索結果からＱｕｅｒｙ　ｃｏｖｅｒが９８％以上のアライメント配列下流の遺伝子のヌクレオチド配列４２個を各ゲノム配列から抽出した。
２）ｃｇ２８７５のアミノ酸配列のＢＬＡＳＴ検索
　ｃｇ２８７５のアミノ酸配列（配列番号３）をＢＬＡＳＴ検索に供した。検索結果から、Ｑｕｅｒｙ　ｃｏｖｅｒが１００％のアライメント配列を抽出し８個のホモログのアミノ酸配列を獲得した。また、８個のホモログのアミノ酸配列をコードする遺伝子の上流の２０８ｂｐのヌクレオチド配列（プロモーター配列）を、ホモログプロモーター配列として各ゲノム配列から抽出した。
３）ホモログのプロモーター配列の抽出
　２０８ｂｐのｃｇ２８７５＿Ｓ４プロモーターのヌクレオチド配列、上記１）の４２個のプロモーターのヌクレオチド配列、及び上記２）の８個のプロモーターのヌクレオチド配列の計５１個のヌクレオチド配列から重複する配列を除き、１６個のホモログプロモーターのヌクレオチド配列（配列番号２３及び２６～４１）を獲得した。各ホモログプロモーターの由来を表７に、該各ホモログプロモーターの下流の遺伝子がコードするアミノ酸配列（配列番号３及び４２～５７）を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　各ホモログプロモーターの下流の遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、以下の式で表すことができる。
ＭＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ１ＩＸ４ＱＸ５ＩＦＸ１ＧＸ６Ｘ１Ｘ１ＬＸ７Ｘ１ＳＸ８Ｘ１Ｘ１ＧＡＱＸ９ＶＦＸ１０Ｘ１Ｘ１１Ｘ１Ｘ１Ｘ１２ＳＳ
（ここで、Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２がＳ又はＡであり、Ｘ３がＶ又はＩであり、Ｘ４がＦ又はＩであり、Ｘ５がＳ又はＡであり、Ｘ６がＶ又はＩであり、Ｘ７がＶ又はＩであり、Ｘ８がＶ又はＩであり、Ｘ９がＧ又はＮであり、Ｘ１０がＤ又はＴであり、Ｘ１１がＩ又はＶであり、Ｘ１２がＡ又はＦである）。
４）ホモログプロモーター活性評価用プラスミドの作製１
　ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを鋳型にプライマー（配列番号４及び５）を用いてベクター断片を増幅した。一方、ｃｇＵＳＤＡプロモーター配列（ＰｃｇＵＳＤＡ、配列番号２８）をユーロフィンジェノミクス社の人工遺伝子合成サービスを利用して化学合成した。得られたｃｇＵＳＤＡプロモーターを含むＤＮＡを鋳型に、プライマー（配列番号５８及び５９）を用いてｃｇＵＳＤＡプロモーター配列にベクター断片のリンカー配列を付与した配列を増幅した。ベクター断片とｃｇＵＳＤＡプロモーター断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）にて連結した。得られたプラスミド溶液を用いて、ＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩静置した。発生したコロニーを鋳型に、ＫＯＤ　Ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）及びプライマー（配列番号６０及び５８）を用いてコロニーＰＣＲを行った。目的遺伝子を持つプラスミドの導入が確認された形質転換体を、カナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行い、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＵＳＤＡ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを得た。
　ｃｇＲプロモーター（ＰｃｇＲ、配列番号２９）、ｃｇＢ４１４プロモーター（ＰｃｇＢ４１４、配列番号３０）、ｂｆＺＬ１プロモーター（ＰｂｆＺＬ１、配列番号３１）、ｃｇＳｃｇＧ１プロモーター（ＰｃｇＳｃｇＧ１、配列番号３３）、ｃｇＹＩプロモーター（ＰｃｇＹＩ、配列番号３４）、ｃｓＮ２４プロモーター（ＰｃｓＮ２４、配列番号３５）、ｃｃｊｚ１６プロモーター（Ｐｃｃｊｚ１６、配列番号３７）、ｃｄｇｉｍｎ１プロモーター（Ｐｃｄｇｉｍｎ１、配列番号３８）、ｃｇＣＳ１７６プロモーター（ＰｃｇＣＳ１７６、配列番号３９）、ｃｇＢＣｏプロモーター（ＰｃｇＢＣｏ、配列番号４０）及びｃｇＫｂｃｇｌプロモーター（ＰｃｇＫｂｃｇｌ、配列番号４１）の各プロモーターについても、プロモーター配列にベクター断片のリンカー配列を付与した配列を増幅するためのプライマー及びコロニーＰＣＲのためのプライマーとして下記表９に示すプライマーを用いた以外はｃｇＵＳＤＡプロモーターの場合と同様にして、各プロモーターを有するプラスミド、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＲ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＢ４１４＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｂｆＺＬ１＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＳｃｇＧ１＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＹＩ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｓＮ２４＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｃｊｚ１６＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｄｇｉｍｎ１＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＣＳ１７６＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＢＣｏ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ及びｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＫｂｃｇｌ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
５）ホモログプロモーター活性評価用プラスミドの作製２
　ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇ２８７５＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを鋳型にプライマー（配列番号８３及び８４、又は８５及び８６）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを実施し、ｃｇＴＱ２２２３プロモーター配列（ＰｃｇＴＱ２２２３、配列番号２６）又はｃｇＡＴＣＣ２１８３１プロモーター配列（ＰｃｇＡＴＣＣ２１８３１、配列番号２７）とＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌが連結したプラスミドを作製した。得られたプラスミド溶液を用いて、ＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩静置した。発生したコロニーをカナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行い、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＴＱ２２２３＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌ及びｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＡＴＣＣ２１８３１＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを得た。
６）ホモログプロモーター活性評価用プラスミドの作製３
　ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｂｆＺＬ１＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを鋳型にプライマー（配列番号８７及び８８）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを実施し、ｃｇｍｃｃ１プロモーター配列（Ｐｃｇｍｃｃ１、配列番号３２）とＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌが連結したプラスミドを作製した。得られたプラスミド溶液を用いて、ＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩静置した。発生したコロニーをカナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行い、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿Ｐｃｇｍｃｃ１＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを得た。
７）ホモログプロモーター活性評価用プラスミドの作製４
　ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＹＩ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを鋳型にプライマー（配列番号８９及び９０）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを実施し、ｃｇＹＩプロモーター配列（ＰｃｇＹＩ、配列番号３４）の１３８番目のＡがＧに、１３９番目のＴがＣに置換したｃｇＹＩｍｕｔプロモーター配列（ＰｃｇＹＩｍｕｔ、配列番号９１）とＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌが連結したプラスミドを作製した。得られたプラスミド溶液を用いて、ＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株（ニッポンジーン社）に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩静置した。発生したコロニーをカナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行い、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＹＩｍｕｔ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを得た。次いで、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＹＩｍｕｔ＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを鋳型にプライマー（配列番号９２及び９３）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ　ＰＣＲを実施し、ｃｇＢ２５３プロモーター配列（ＰｃｇＢ２５３、配列番号３６）とＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌが連結したプラスミドを作製した。得られたプラスミド溶液を用いて、ＥＣＯＳ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．Ｃｏｌｉ　ＤＨ５α株に形質転換し、得られた細胞液を、カナマイシンを含有するＬＢ寒天培地に塗布して３７℃で一晩静置した。発生したコロニーをカナマイシンを含むＬＢ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＥａｓｙＰｕｒｅを用いてプラスミドの精製を行い、ｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＰｃｇＢ２５３＿ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌを得た。
　上記５）～７）で用いたプライマーを表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
実施例１１　形質転換体の作製
　実施例１０の４）～７）で得られた計１６個のプラスミドを用いた以外は実施例２と同様にして、形質転換体を得た。
実施例１２　プロモーター活性の比較
１）形質転換体の培養
　実施例２及び１１で得られた形質転換体を用いた以外は実施例３の１）と同様にして、形質転換体を培養した。
２）プロモーター活性の測定
　得られた各培養液について、実施例３の２）と同様にして、プロモーター活性を測定した。尚、試験はＮ＝３で行った。
　図５に示すように、ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌをホモログプロモーターで発現させた株はいずれも、ＨＦＭ１２２＿Ｖ４７Ｌをｔｕ又はＳＰＬ１３プロモーターで発現させた株より、ＡＨＢＡ変換率が高かった。よって、ホモログプロモーターの活性は、いずれもｔｕプロモーター及びＳＰＬ１３プロモーターより高いことが示された。
参考例１　形質転換体（ＫＣ３４１株）の作製
１）ｃｇ２３９１（ａｒｏＧ）プロモーター領域にｔｕプロモーターが導入された形質転換体の作製
ｉ）ｃｇ２３９１プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入するためのプラスミドの構築
　ｃｇ２３９１遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号９４）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号９５及び９６）にて増幅し、またｃｇ２３９１遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（配列番号９７）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号９８及び９９）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株が有するｔｕｆ遺伝子（ｃｇ０５８７）のプロモーター（以下、ｔｕプロモーターと称する）を含むＤＮＡ断片（配列番号１００）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１０１及び１０２）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１（国際公開公報第２０１４／００７２７３号参照）を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１０３及び１０４）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＧを作製した。
ｉｉ）ｃｇ２３９１プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入した株の作製
　エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＧをコリネバクテリウム・グルタミカムＨＴ２３株（国際公開公報第２０１４／００７２７３号参照）に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ２６５ｓｒ株を取得した。配列番号９５及び１０５のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ２６５ｓｒ株を解析し、ＫＣ２６５ｓｒ株がプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＧがｃｇ２３９１のプロモーター領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
　ＫＣ２６５ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ２６５株を得た。配列番号１０５及び１０６のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ２６５株が予想通りｃｇ２３９１（ａｒｏＧ）プロモーター領域にｔｕプロモーターが導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
２）ｃｇ１８３５（ａｒｏＥ３）プロモーター領域にｔｕプロモーターが導入された形質転換体の作製
ｉ）ｃｇ１８３５プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入するためのプラスミドの構築
　ｃｇ１８３５遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号１０７）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１０８及び１０９）にて増幅し、またｃｇ１８３５遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（配列番号１１０）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１１１及び１１２）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号１００）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１０１及び１０２）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１０３及び１０４）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＥ３を作製した。
ｉｉ）ｃｇ１８３５プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入した株の作製
　エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＥ３を１）で得られたＫＣ２６５株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ２８２ｓｒ株を取得した。配列番号１０８及び１１３のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ２８２ｓｒ株を解析し、ＫＣ２８２ｓｒ株がプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＥ３がｃｇ１８３５のプロモーター領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
　ＫＣ２８２ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ２８２株を得た。配列番号１１３及び１１４のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ２８２株が予想通りｃｇ１８３５（ａｒｏＥ３）プロモーター領域にｔｕプロモーターが導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
３）ｃｇ１８２７（ａｒｏＢ）プロモーター領域にｔｕプロモーターが導入された形質転換体の作製
ｉ）ｃｇ１８２７プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入するためのプラスミドの構築
　ｃｇ１８２７遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号１１５）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１１６及び１１７）にて増幅し、またｃｇ１８２７遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（配列番号１１８）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１１９及び１２０）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号１００）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１０１及び１０２）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１０３及び１０４）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＢを作製した。
ｉｉ）ｃｇ１８２７プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入した株の作製
　エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＢを２）で得られたＫＣ２８２株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ３００ｓｒ株を取得した。配列番号１１６及び１２１のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ３００ｓｒ株を解析し、ＫＣ３００ｓｒ株がプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＢがｃｇ１８２７のプロモーター領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
　ＫＣ３００ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ３００株を得た。配列番号１２１及び１２２のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ３００株が予想通りｃｇ１８２７（ａｒｏＢ）プロモーター領域にｔｕプロモーターが導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
４）ｃｇ０８７３（ａｒｏＡ）プロモーター領域にｔｕプロモーターが導入された形質転換体の作製
ｉ）ｃｇ０８７３プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入するためのプラスミドの構築
　ｃｇ０８７３遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号１２３）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１２４及び１２５）にて増幅し、またｃｇ０８７３遺伝子ＯＲＦ中の５’側領域（配列番号１２６）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１２７及び１２８）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号１００）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１０１及び１０２）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１０３及び１０４）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた４種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＡを作製した。
ｉｉ）ｃｇ０８７３プロモーター領域にｔｕプロモーターを導入した株の作製
　エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＡを３）で得られたＫＣ３００株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ３１４ｓｒ株を取得した。配列番号１２４及び１２９のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ３１４ｓｒ株を解析し、ＫＣ３１４ｓｒ株がプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿Ｐｔｕ－ａｒｏＡがｃｇ０８７３のプロモーター領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
　ＫＣ３１４ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ３１４株を得た。配列番号１２９及び１３０のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ３１４株が予想通りｃｇ０８７３（ａｒｏＡ）プロモーター領域にｔｕプロモーターが導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
５）ｃｇ１２２６（ｐｏｂＡ）プロモーター領域にｔｕプロモーターと結合させたｃｇ０５０３（ｑｓｕＣ）遺伝子が導入された形質転換体の作製
ｉ）ｃｇ１２２６遺伝子領域にｔｕプロモーターと結合させたｃｇ０５０３遺伝子を導入するためのプラスミドの構築
　ｃｇ１２２６遺伝子領域の５’側上流領域（配列番号１３１）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１３２及び１３３）にて増幅し、またｃｇ１２２６遺伝子領域の３’側領域（配列番号１３４）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１３５及び１３６）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号１００）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１０１及び１０２）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｃｇ０５０３遺伝子のＤＮＡ断片（配列番号１３７）をＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１３８及び１３９）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１０３及び１０４）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた５種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｐｏｂＡ：：Ｐｔｕ－ｑｓｕＣを作製した。
ｉｉ）ｃｇ１２２６遺伝子領域にｔｕプロモーターと結合させたｃｇ０５０３遺伝子を導入した株の作製
　エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｐｏｂＡ：：Ｐｔｕ－ｑｓｕＣを４）で得られたＫＣ３１４株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ３１５ｓｒ株を取得した。配列番号１３２及び１４０のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ３１５ｓｒ株を解析し、ＫＣ３１５ｓｒ株がプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ΔｐｏｂＡ：：Ｐｔｕ－ｑｓｕＣがｃｇ１２２６のプロモーター領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
　ＫＣ３１５ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ３１５株を得た。配列番号１４０及び１４１のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ３１５株が予想通りｃｇ１２２６(ｐｏｂＡ)遺伝子領域にｔｕプロモーターと結合させたｃｇ０５０３（ｑｓｕＣ）遺伝子が導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
６）ｃｇ０６２０遺伝子の３’下流領域にｔｕプロモーターと結合させた大腸菌由来ａｒｏＧ変異体遺伝子が導入された形質転換体の作製
ｉ）ｃｇ０６２０遺伝子の３’下流領域にｔｕプロモーターと結合させた大腸菌由来ａｒｏＧ変異体遺伝子を導入するためのプラスミドの構築
　ｃｇ０６２０遺伝子ＯＲＦ領域及び５’側上流領域（配列番号１４２）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１４３及び１４４）にて増幅し、またｃｇ０６２０遺伝子の３’側下流領域（配列番号１４５）を２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１４６及び１４７）にて増幅し、ＤＮＡ断片を得た。また、ｔｕプロモーターを含むＤＮＡ断片（配列番号１４８）を人工遺伝子合成にて作製し、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１４９及び１５０）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た。大腸菌のａｒｏＧ変異体（１４６位のアスパラギン酸をアスパラギンとする変異）遺伝子を含むＤＮＡ断片を人工遺伝子合成にて作製し、これをテンプレートとして、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１５１及び１５２）にて増幅して、ＤＮＡ断片を得た（配列番号１５３）。また、ｐＨＫＰｓａｃＢ１を鋳型にし、２種類のＤＮＡプライマー（配列番号１０３及び１０４）にて増幅し、得られたＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った。得られた５種類のＰＣＲ産物に対し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）により連結することでプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０＿Ｐｔｕ－ａｒｏＧ＿Ｄ１４６Ｎを作製した。
ｉｉ）ｃｇ０６２０遺伝子の３’下流領域にｔｕプロモーターと結合させた大腸菌由来ａｒｏＧ変異体遺伝子を導入した株の作製
　エレクトロポレーションによる形質転換法を用いて、上述のプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０＿Ｐｔｕ－ａｒｏＧ＿Ｄ１４６Ｎを５）で得られたＫＣ３１５株に導入し、カナマイシン耐性で選択することにより、ＫＣ３４１ｓｒ株を取得した。配列番号１４３及び１５４のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））によりＫＣ３４１ｓｒ株を解析し、ＫＣ３４１ｓｒ株がプラスミドｐＨＫＰｓａｃＢ＿ｃｇ０６２０＿Ｐｔｕ－ａｒｏＧ＿Ｄ１４６Ｎがｃｇ０６２０遺伝子３’下流領域に導入された１回交差型相同組換え体であることを確認した。
　ＫＣ３４１ｓｒ株を１ｍＬのＬＢ液体培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）の中で２４時間培養し、培養液の一部を２０％スクロース含有ＬＢ寒天培地上で塗抹培養することにより、ＫＣ３４１株を得た。配列番号１５４及び１５５のプライマーを用いるＰＣＲ法（Ｓａｐｐｈｉｒｅ　Ａｍｐ（タカラバイオ））により、ＫＣ３４１株が予想通りｃｇ０６２０遺伝子の３’下流領域にｔｕプロモーターと結合させた大腸菌由来ａｒｏＧ変異体遺伝子が導入されている２回交差型相同組換え体であることを確認した。
　以上の手順により、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣ３４１株を得た。
　上記で用いたプライマーを表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012

Claims (15)

  1. 　下記（ａ）～（ｃ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、プロモーター活性を有するＤＮＡ：
    （ａ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列；
    （ｂ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    （ｃ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列；
    ＭＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ１ＩＸ４ＱＸ５ＩＦＸ１ＧＸ６Ｘ１Ｘ１ＬＸ７Ｘ１ＳＸ８Ｘ１Ｘ１ＧＡＱＸ９ＶＦＸ１０Ｘ１Ｘ１１Ｘ１Ｘ１Ｘ１２ＳＳ
    （ここで、Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２がＳ又はＡであり、Ｘ３がＶ又はＩであり、Ｘ４がＦ又はＩであり、Ｘ５がＳ又はＡであり、Ｘ６がＶ又はＩであり、Ｘ７がＶ又はＩであり、Ｘ８がＶ又はＩであり、Ｘ９がＧ又はＮであり、Ｘ１０がＤ又はＴであり、Ｘ１１がＩ又はＶであり、Ｘ１２がＡ又はＦである）。
  2. 　下記（ｄ）～（ｆ）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、請求項１記載のＤＮＡ：
    （ｄ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列；
    （ｅ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    （ｆ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列。
  3. 　下記（ｄ’）～（ｆ’）からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、請求項１又は２記載のＤＮＡ：
    （ｄ’）配列番号２３のヌクレオチド配列；
    （ｅ’）配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    （ｆ’）配列番号２３のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列。
  4. 　下記（ｄ”）～（ｆ”）からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３記載のＤＮＡ：
    （ｄ”）配列番号２１のヌクレオチド配列；
    （ｅ”）配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列；及び
    （ｆ”）配列番号２１のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列。
  5. 　下記（ｇ）～（ｉ）からなる群より選択されるＤＮＡからなる、プロモーター：
    （ｇ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
    （ｈ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
    （ｉ）下記アミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子の上流のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；
    ＭＸ１Ｘ２Ｘ３ＦＸ１ＩＸ４ＱＸ５ＩＦＸ１ＧＸ６Ｘ１Ｘ１ＬＸ７Ｘ１ＳＸ８Ｘ１Ｘ１ＧＡＱＸ９ＶＦＸ１０Ｘ１Ｘ１１Ｘ１Ｘ１Ｘ１２ＳＳ
    （ここで、Ｘ１が任意のアミノ酸残基であり、Ｘ２がＳ又はＡであり、Ｘ３がＶ又はＩであり、Ｘ４がＦ又はＩであり、Ｘ５がＳ又はＡであり、Ｘ６がＶ又はＩであり、Ｘ７がＶ又はＩであり、Ｘ８がＶ又はＩであり、Ｘ９がＧ又はＮであり、Ｘ１０がＤ又はＴであり、Ｘ１１がＩ又はＶであり、Ｘ１２がＡ又はＦである）。
  6. 　下記（ｊ）～（ｌ）からなる群より選択されるＤＮＡからなる、請求項５記載のプロモーター：
    （ｊ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
    （ｋ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
    （ｌ）配列番号１、２１～２３、及び２６～４１のいずれかのヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
  7. 　下記（ｊ’）～（ｌ’）からなる群より選択されるＤＮＡからなる、請求項５又は６記載のプロモーター：
    （ｊ’）配列番号２３のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
    （ｋ’）配列番号２３のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
    （ｌ’）配列番号２３のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
  8. 　下記（ｊ”）～（ｌ”）からなる群より選択されるＤＮＡを含む、請求項７記載のプロモーター：
    （ｊ”）配列番号２１のヌクレオチド配列からなるＤＮＡ；
    （ｋ”）配列番号２１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ；及び
    （ｌ”）配列番号２１のヌクレオチド配列に対して１個又は数個のヌクレオチドが欠失、置換、付加、又は挿入されたヌクレオチド配列からなり、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。
  9. 　請求項１～４のいずれか１項記載のＤＮＡ又は請求項５～８のいずれか１項記載のプロモーターを含む発現ベクター。
  10. 　目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された前記ＤＮＡ又はプロモーターとを含む、請求項９記載の発現ベクター。
  11. 　請求項１～４のいずれか１項記載のＤＮＡ又は請求項５～８のいずれか１項記載のプロモーターを含むＤＮＡ発現カセット。
  12. 　目的物質又はその合成に関わる酵素をコードする遺伝子と、該遺伝子の上流に連結された前記ＤＮＡ又はプロモーターとを含む、請求項１１記載のＤＮＡ発現カセット。
  13. 　請求項９もしくは１０記載の発現ベクター又は請求項１１もしくは１２記載のＤＮＡ発現カセットを含む、コリネバクテリウム。
  14. 　コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項１３記載のコリネバクテリウム。
  15. 　請求項１３又は１４記載のコリネバクテリウムを培養すること；及び
    　該培養で得られた培養物から目的物質を回収すること、
    を含む、目的物質の製造方法。
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