KR101102720B1

KR101102720B1 - Ｎ-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물과 이를 이용한 ｎ-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민 생산 방법

Info

Publication number: KR101102720B1
Application number: KR1020090099986A
Authority: KR
Inventors: 홍국기; 정진수; 신수안; 박혜란; 조재현
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2008-10-20
Filing date: 2009-10-20
Publication date: 2012-01-05
Also published as: JP2012505667A; EP2348101B1; ES2584531T3; WO2010047516A2; US20110250647A1; US9005957B2; JP5677963B2; CN103429731A; WO2010047516A3; EP2348101A4; KR20100044129A; CN103429731B; EP2348101A2

Abstract

본 발명은 글루코사민 6 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 활성을 보유하는 N-아세틸 글루코사민을 생산하는 변이 코리네박테리움 속 미생물과 이를 이용한 N-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민을 생산하는 방법에 관한 것이다.

N-아세틸 글루코사민, 글루코사민, 코리네박테리움 속 미생물, N-아세틸 트랜스퍼라제

Description

Ｎ-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물과 이를 이용한 Ｎ-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민 생산 방법{A microorganism of Corynebacterium genus producing N-acetyl glucosamine and a method of producing N-acetyl glucosamine or glucosamine using the same}

본 발명은 N-아세틸 글루코사민을 생산하는 유전적으로 변형된 코리네박테리움 속 미생물 및 그를 이용하여 N-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민을 생산하는 방법에 관한 것이다.

글루코사민은 글루코오스의 아미노 유도체이고, N-아세틸 글루코사민은 글루코사민이 아세틸화된 유도체로 이들은 많은 천연 폴리사카라이드의 중요한 구성성분으로, 세포벽을 이루는 세포의 구조 물질을 형성한다.

N-아세틸 글루코사민은 조직 재생에 관여하는 단백질 합성에 중요한 성분이기 때문에 위염, 음식물 알러지, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease: IBD), 계실염 (diverticulitis) 및 골관절 조직의 대사장애로부터 야기되는 병리학적 질환뿐만 아니라 급성 및 만성형 류마티스 관절염 및 골관절염과 같은 광범위한 질병을 예방 및 치료하는데 있어서 잠재력을 갖고 있다. 글루코사민 역시 인간의 골관절염 질환의 예방 및 치료에 적용하는 기능성 식품으로 사용되고 있다.

글루코사민은 N-아세틸 글루코사민으로부터 유도된 복합 탄수화물인 키틴의 산 가수분해 방법, 및 키토산의 산 분해에 의해 제조된다. 원재료인 키틴은 N-아세틸 글루코사민과 글루코사민의 공중합체로 갑각류 및 곰팡이에서 발견되는 흔한 천연 물질이다. 키틴은 갑각류(바닷가재, 새우, 크릴, 게 및 참새우 외골격)로부터 주로 생산되어 왔으며, 최근에는, 시트르산 생산에 이용되는 곰팡이 바이오매스(biomass)와 같은 저렴한 원료로부터 수득할 수 있다.

통상적인 산업적 실시는 미네랄, 단백질 등을 동반한 다른 불순물을 제거하기 위하여 산과 염기의 조합으로 처리하여 키틴을 정제하고, 높은 온도에서 장시간 동안 저수율로 고농도의 염산을 통해서 한 단계로 키틴을 글루코사민으로 분해하고 탈 아세틸화하는 것이다. 글루코사민은 유리 염기로서 매우 불안정하고 분해되기 쉽기 때문에 염화염과 같은 안정한 염이 생산된다.

갑각류의 껍질 및 곰팡이 바이오매스에서의 글루코사민 함량이 적기 때문에 상당한 부피의 폐기물이 발생하며, 공정 그 자체는 상대적으로 낮은 수율을 나타내면서 에너지 및 화학적으로 집약적이기 때문에 상당히 고가이다, 또한, 갑각 동물에서 유래된 글루코사민의 경우 갑각 동물에 민감한 사람에게는 알러지 반응을 일으킬 가능성이 있다고 공지되어 있다. 또한, 원료 물질(예, 게 껍데기와 같은 키틴의 원료)의 이용가능성이 점진적으로 제한되고 있다. 그러므로 상업적인 판매와 이용을 위해 고수율로 글루코사민 및 N-아세틸 글루코사민을 제조할 수 있는 효율적 인 기술의 필요가 있다.

알러지 반응 가능성을 제거하기 위해 국제특허공개 WO 02/66667호는 미생물 바이오매스로부터 글루코사민을 제조하는 방법을 개시하고 있다. 그러나 상기 제조방법은 갑각 동물 알러지와 관련된 문제들은 해결하였으나 낮은 수율이라는 중대한 문제점을 갖고 있다. 상기 방법은 시트르산과 같은 다른 물질의 발효 중 생성된 바이오매스 폐기물에 의존하기 때문에 증가하는 시장의 요구를 만족시킬 수 있는 충분한 양의 글루코사민을 제조하기에 충분하지 않다.

한편, N-아세틸 글루코사민의 현재 생산 방법은 아세트산 무수물과 같은 유기 아세틸화 시약을 이용하여 글루코사민의 아세틸화에 의해 제조하는데, 그 생산량이 적어서 고가이다. 또한 낮은 생산 수율로 인하여 대량 생산이 용이하지 않다.

이를 극복하기 위한 한 방법으로 미국특허 7,332,304는 대장균 발효에 의해 N-아세틸 글루코사민을 제조할 수 있는 방법에 대하여 개시하고 있다. 이 방법은 기존의 복잡한 공정으로 인한 낮은 수율의 N-아세틸 글루코사민 생산을 획기적으로 바꾸어, 고수율의 N-아세틸 글루코사민 대장균 발효 생산 방법을 제시하고 있다. 또한, N-아세틸 글루코사민은 간단한 산처리에 의해 탈 아세틸화되어 글루코사민이 될 수 있다는 것은 공지의 사실 (Novikov V.Y. et al. Russ. J. Appl. Chem. 1997:1467-1470)이기 때문에 고수율의 글루코사민 생산도 가능함을 보여주었다.

그러나 이 방법은 생산 균주로 대장균을 사용하기 때문에 엔도톡신 등의 독성생산 가능성이 높아 건강식품 소재를 생산하는 방법으로서 적합하지 않다. 또한, N-아세틸 글루코사민 생산에 필수적인 효소인 글루코사민 6 포스페이트 아세틸트랜 스퍼라제 (glucosamine-6-phosphate acetyltransferase) (도 1 참조: GNA1)가 대장균 내에는 없기 때문에 이스트 등의 다른 미생물에서 도입해야 하는데, 이러한 중요 효소의 발현을 위해서는 반드시 유도 발현 시스템을 사용해야 한다는 제약이 있다 (Deng M.D. et al. Met Eng. 2005:201-214). 중요한 효소의 발현을 조절하지 못할 경우, 심각한 세포 증식 저해를 유발하기 때문이다. 유도 발현 시스템은 유도 물질을 써야 한다는 원가 상승의 단점과 유도 시점을 맞춰야 한다는 어려움이 있기 때문에 대량 발효를 이용한 산업적 수준의 생산에는 부적합한 것으로 여겨졌다. 상기 발명은 물질 생산의 안전성 및 산업화 적용의 가능성을 감안할 경우 대장균과 유도 발현 시스템을 이용하는 단점을 갖고 있다.

현재까지 원료물질 공급 불안정성 해소와 고수율 생산을 위한 대장균 발효 기술 개발은 있어 왔으나, 인간과 동물에 사용하기 안전한 N-아세틸 글루코사민 및 글루코사민 생산을 위한 적합한 생산 균주가 없었고, 또한 산업화가 용이하도록 주요 효소 발현 시스템을 유도 발현이 아닌 항시 발현을 이용한 생산균주에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

본 발명자들은 상기 언급된 문제점을 해결하고자 환경문제를 유발하지 않으면서 산업화 수준의 N-아세틸 글루코사민 및 글루코사민 발효 생산을 위해, 물질 생산 안정성과 산업화 적용 용이성을 실현할 수 있는 코리네박테리움 속 미생물을 개발하게 되었고, 이러한 미생물을 이용하여 N-아세틸 글루코사민 및 글루코사민을 생산하는 방법을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 N-아세틸 글루코사민을 생산하는 유전적으로 변형된 코리네박테리움 속 미생물, 바람직하게는 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 활성을 가지며, 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 (glucosamine-6-phosphate deaminase) 활성이 감소 또는 결실된 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 N-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 (glucosamine-6-phosphate acetyltransferase) 활성을 가지며, 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 (glucosamine-6-phosphate deaminase) 활성이 감소 또는 결실된 코리네박테리움 속 미생물로서, N-아세틸 글루코사민 및 글루코사민 생산능을 가지 는 코리네박테리움 속 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 (glucosamine-6-phosphate acetyltransferase)는 글루코사민 6 포스페이트를 아세틸화시켜 N-아세틸 글루코사민 6 포스페이트로 만드는 효소를 말한다. 상기 효소는 사카로마이세스(Saccharomyces) 속 미생물 등에 존재하지만, 본원의 코리네박테리움 속 미생물에는 존재하지 않는 효소이다.

따라서, 본 발명에 사용된 용어, "글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제(glucosamine-6-phosphate acetyltransferase) 활성을 갖는" 또는 "글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제(glucosamine-6-phosphate acetyltransferase) 활성을 갖는 코리네박테리움 속 미생물"은 코리네박테리움 속 미생물에는 존재하지 않는 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 코리네박테리움 속 미생물 내로 도입하여 코리네박테리움 속 미생물이 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 발현하고, 그를 이용하여 코리네박테리움 속 미생물이 N-글루코사민-6-포스페이트를 N-아세틸 글루코사민-6-포스페이트로 전환할 수 있는 것을 말한다.

상기 코리네박테리움 속 미생물 내로 도입하여 코리네박테리움 속 미생물이 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 활성을 보유하도록 하는 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하다. 본 발명의 구체적 실시에서는 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 서열을 벡터에 도입하고, 그 재조합 벡터로 코리네박테리움 속 미생물을 형질전환함으로써 제조하였다.

상기 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 유전자는 코리네박테리움 속 미생물에서 작동 가능한 핵산 서열을 가지는 유전자이면 족하다. 하나의 구체적 실시에서는 사카로마이세스 세레비제 (Saccharomyces cerevisiae)에서 유래한 것으로서, 바람직하게는 서열번호 11의 핵산 서열이다. 특히, 상기 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 서열은 그 활성을 유지하는 한, 일정 정도 변형이 가능하다. 본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상의 상동성이 유지되는 핵산 서열이 본 발명에서 목적하는 유전자의 활성을 보유하는 한, 본 발명의 상기 핵산 서열로부터 유래된 것과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명의 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 유전자는 바람직하게 상기 유전자의 발현을 유도하도록 프로모터가 작동가능하게 연결된다. 보다 바람직하게, 상기 프로모터는 본 발명의 목적에 적합하게 코리네박테리움 속 미생물이 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 항시 또는 유도 발현하기 위한 프로모터로서, 코리네박테리움 속 미생물에 도입된 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제가 항시 또는 유도 발현되도록 하는 프로모터이면 어느 것이나 가능하다. 하나의 구체적 실시에서, 상기 항시 발현 프로모터는 EFTU 프로모터이며, 상기의 유도 발현 프로모터는 laclq-Ptac 프로모터이다. 대장균의 경우 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제가 성장 초기에 발현될 경우 심각한 성장 저해 를 보여 유도 발현 시스템만을 쓸 수 있다는 제약이 있으나(Deng M.D. et al. Met Eng. 2005:201-214), 본 발명의 코리네박테리움 속 미생물은 상기 효소의 유도 및 항시 발현에 상관없이 성장에 아무런 저해가 없는 장점이 있다.

본 발명에 있어 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 (glucosamine-6-phosphate deaminase)는 아세틸 글루코사민 6-포스페이트를 글루코사민 6-포스페이트로 전환하는 효소를 말한다. 따라서 본 발명의 목적을 위하여 본 발명의 코리네박테리움 속 미생물은 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제를 암호화하는 핵산 서열이 부분적으로 또는 전체적으로 결실되거나 돌연변이되어 천연적으로 존재하는 핵산 서열에 비해 덜 발현되거나 전혀 발현되지 않은 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기와 같이 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제를 암호화하는 핵산 서열이 부분적으로 또는 전체적으로 결실되거나 돌연변이되어 천연적으로 존재하는 핵산 서열에 비해 덜 발현되거나 전혀 발현되지 않은 것을 본 발명에서는 "감소" 또는 "결실"이라 표현할 수 있다.

글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 유전자의 발현을 막거나 더 적은 발현을 얻기 위하여, 예컨대 구조 유전자(structure gene)의 상류 측에 위치한 프로모터 영역 및 조절 영역이 돌연변이될 수 있다. 구조 유전자의 상류 측에 부착된 발현 조절 카세트도 동일한 작용을 할 수 있다. 또한 조절될 수 있는 프로모터에 의해 발현을 감소시키거나, m-RNA의 안정성을 감소시킴으로써 유전자 번역을 조절하여 발현을 감소시킬 수 있다. 또한 특정 부위 재조합 DNA 기술에 의하여 유전자의 일부 또는 전부를 결실하거나 돌연변이된 단편의 교환에 의하여 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 활성을 감소 또는 결실시킬 수 있다. 그러나 이러한 방법 외에도 당해 분야에 공지된 다양한 방법을 이용하여 유전자의 발현을 막거나 더 적은 발현을 얻을 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명에서, "N-아세틸 글루코사민 생산능"이란 용어는 N-아세틸 글루코사민을 생산하는 능력으로서, 본 발명의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 경우 배지 중에 N-아세틸 글루코사민을 생산하고 축적하는 본 발명의 코리네박테리움 속 미생물의 능력을 말한다. 본 발명에서, "글루코사민 생산능"이란 용어는 미생물의 발효에 의하여 생산된 물질로부터 글루코사민을 생산하는 능력으로서, 본 발명의 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하여 배지 중에 축적된 N-아세틸 글루코사민을 공지된 다양한 방법에 의하여 탈아세틸화하여 글루코사민으로 전환시켜서 N-아세틸 글루코사민을 생산하고 축적하는 본 발명의 코리네박테리움 속 미생물의 능력을 말한다.

본 발명에서, "N-아세틸 글루코사민 및/또는 글루코사민 생산능을 갖는 미생물"은 코리네박테리움(Corynebacterium)속에 속하는 미생물이다. 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미컴 (예. ATCC13032), 코리네박테리움 암모니아게네스 (예. ATCC 6872), 브레비박테리움 락토퍼멘텀 (Brevibacterium lactofermentum) (예. ATCC13869), 브레비박테리움 플라범 (Brevibacterium flavum) (예. ATCC14067), 코 리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes) (예. FERM-BP1539), 코리네박테리움 에피션스 (Corynebacterium efficiens) (예. C.efficiens str. YS-314) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미컴이며, 보다 더 바람직하게는 2008년 9월 29일자로 대한민국 서울 특별시 서대문구 홍제 1동 361-221 번지에 소재하는 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터에 수탁번호 KCCM10967P로 기탁된 코리네박테리움 글루타미컴 CJNAG1이다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 N-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하여 N-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민을 생산하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 (a) 본 발명의 N-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계 및 (b) 상기 배양 단계에서 생산된 N-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민을 수집하는 단계를 포함하는 N-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 배양단계는 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들면, "Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176에 개시되어 있다. 배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 만족시켜야 한다.

본 발명에서 사용되는 배지는 포도당을 탄소원으로 사용하고, 그 외의 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산 암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 및 질산 암모늄과 같은 무기질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산 철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포생성을 억제 할 수 있다. 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입없이 혹은 질소, 수소, 또는 이산화탄소 가스를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 30 ℃ 내지 37 ℃이며, 바람직하게는 35 ℃ 내지 37 ℃이다. 배양 기간은 원하는 유용 물질의 생성이 계속될 수 있는 기간이면 되고, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.

본 발명의 상기 수집단계는 상기 배양 단계에서 생산된 N-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민을 수집 및/또는 회수하는 것으로, 이의 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 N-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민을 수집 및/또는 회수할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 수집 및/또는 N-아세틸 글루코사민을 탈아세틸화하여 글루코사민으로 전환하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 그러한 전환 방법은 당해 분야에 널리 알려진 방법(예로, 노비코브 등(Novikov V.Y. et al. Russ. J. Appl. Chem. 1997:1467-1470) 에 공지된 방법 등) 을 이용할 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.

본 발명은 N-아세틸 글루코사민 생산능을 갖는 코리네박테리움 속 미생물을 제작하고 당해 미생물을 이용하여 N-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민을 생산함으로써, 알러지 반응의 위험이 없고 대량 공급이 가능한 N-아세틸 글루코사민 및 글루코사민을 제공하는데 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 건강 식품 및 치료용 소 재의 안전한 생산과 주요 효소의 항시 발현으로 산업적 적용이 용이하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: N-아세틸 글루코사민 6-포스페이트 디아미네이즈 (glucosamine-6-phosphate deaminase) 변이체의 제작 및 염색체 핵산 치환 재조합 벡터 pDZ -nagAST 제작

야생형 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum ATCC13102)의 N-아세틸 글루코사민-6-포스페이트의 이용을 막기 위해, N-아세틸 글루코사민-6-포스페이트를 기질로 이용하는 N-아세틸 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제를 암호화 하는 nagA1(NCgl2556, 서열 번호 1) 의 불활성화를 수행하였다.

불활성화의 방법은 유전자 제거 및 추가 서열 도입 등의 다양한 방법이 있을 수 있는데, 본 실시예에서는 nagA1 유전자의 ORF(open reading frame) 내에 정지코돈(stop codon)을 삽입하여 유전자의 해독(translation)을 불능시켰다.

구체적으로, 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum ATCC13102) 의 염색체 유전자를 분리하고, 이를 주형으로 서열번호 2와 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 통해 N-아세틸 글루코사민-6-포스페이 트 디아미나제를 코딩하는 유전자(nagA1: NCgl2556)를 얻었다.

nagA1 유전자를 증폭하기 위하여 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.

서열번호 2 (nagA1 - 5)

5' - GGAATTCATGGCAGAAGTGGTGCATTATCAAG - 3'

서열번호 3 (nagA1 - 3)

5' - GCTCTAGAGATGATGTCCATGGTCGGACTCC - 3'

얻어진 N-아세틸 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제의 야생형 유전자를 이용하여 ORF내 정지코돈(stop codon)이 들어간 N-아세틸 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 변이체를 제조하기 위해 추가로 프라이머(서열 번호 4 및 5)를 제작하여 아미노산 서열 196번째 이소루신과 197번째 알라닌 사이에 정지코돈(stop codon)을 도입하였다.

구체적인 방법은 중합효소연쇄반응으로 얻어진 야생형의 nagA1을 주형으로 하여, 서열 번호 2와 4를 이용한 중합효소 연쇄 반응과 서열 번호 3과 5를 이용한 중합효소 연쇄 반응을 각각 수행하였다. 얻어진 두 종의 산물은 nagA1의 부분으로 원래 크기의 반정도의 크기이다. 이 두 산물을 동시에 주형으로 사용하고, 서열 번호 2와 3을 이용하여 추가 중합효소 연쇄 반응을 수행하였다. 이 과정을 통하여 N-아세틸 글루코사민 6-포스페이트 디아미나제가 불활성화된 변이체를 코딩하는 유 전자들을 얻었다. 상기 얻어진 불활성화된 nagA1 유전자의 단편을 제한효소 EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA)와 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)을 이용하여 대한민국 공개특허 제2008-0025355호 등에 개시된 공지의 분자생물학적 기술로 염색체 핵산 치환용 벡터 pDZ에 도입하여 pDZ-nagA1ST 벡터를 제작하였다(도 2).

서열번호 4 (nagA1ST - 5)

5' - GTGCCCGAAGGAAGCTTAAATGATGTGGTGCGC - 3'

서열번호 5 (nagA1ST - 3)

5' - GCGCACCACATCATTTAAGCTTCCTTCGGGCAC - 3'

실시예 2: 코리네박테리움 글루타미컴 CJNAGKO의 제작

제작된 pDZ-nagA1ST벡터를 야생형 코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum ATCC13102) 균주에 형질 전환하기 위해, 대한민국 공개특허 제2008-0025355호에 기술된 바와 같이 2차 교차(crossover) 과정을 거쳐 염색체 상에서 유전자 nagA1의 ORF 내에 정지코돈(stop codon)을 첨가 하였다. 최종적으로 아미노산 서열 196번째 이소루신과 197번째 알라닌 사이에 정지코돈(stop codon)이 도입된 CJNAGKO을 제작하였다.

실시예 3: 글루코사민 6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 (glucosamine-6-phosphate acetyltransferase)의 항시 발현 벡터 제작

N-아세틸 글루코사민의 생산을 위해 글루코사민-6-포스페이트를 기질로 사용하여 N-아세틸 글루코사민-6-포스페이트를 만드는 효소인 글루코사민 6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 발현하는 벡터를 제작하였다. 산업적 적용이 용이하도록 하기 위해 세포성장 기간 동안 효소를 항시 발현할 수 있도록 하는 프로모터(constitutitive promoter)를 이용하여 제작하였다. 발현에 사용된 효소는 기존에 잘 알려진, 효모의 일종인 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 유전자인 GNA1을 사용하였다.

효소의 항시 발현을 위해 코리네박테리움 글루타미컴에서 항시 발현 프로모터로 잘 알려진 EFTU 프로모터(Judith B. et al. Appl Environ Microbiol. 2005:8587-8596.)를 이용하였다. 코리네박테리움 글루타미컴에서 분리된 염색체를 주형으로 이용하고 서열번호 6과 7을 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응을 통해 EFTU 프로모터(서열번호 8)를 얻었다. 얻어진 EFTU 프로모터 산물을 제한효소 NdeI (New England Biolabs, Beverly, MA)과 HindIII (New England Biolabs, Beverly, MA)을 이용하여 공지의 분자생물학적 기술로 pECCG1117 벡터(Biotechnology letters vol 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)에 도입하였다. 이렇게 제작된 벡터를 pECCG117-PEFTU로 명명하였다. 또한 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 염색체를 분리하고 이것을 주형으로 하고, 서열 번호 9와 10을 프라이머로 사용하여 중합효소연 쇄반응을 통해 GNA1(서열번호 11)을 얻었다. 얻어진 GNA1은 SpeI (New England Biolabs, Beverly, MA)과 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 pECCG117-PEFTU 벡터에 도입하여 pECCG117-PEFTU-GNA1 벡터를 제작하였다(도 3).

EFTU 프로모터 및 GNA1 유전자를 증폭하기 위하여 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.

서열번호 6 (EFTU - 5)

5' - GACTAGTATGTTCGGTTACGTCGGTGACCTTC - 3'

서열번호 7 (EFTU - 3)

5' - CCCAAGCTTCTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCCTGC - 3'

서열번호 9 (GNA1 - 5)

5' - GGAATTCCATATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAAGG - 3'

서열번호 10 (GNA1 - 3)

5' - GCTCTAGACTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCC - 3'

실시예 4: 글루코사민 6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 (glucosamine-6-phosphate acetyltransferase)의 유도 발현 벡터 제작

코리네박테리움 글루타미컴의 유도 발현 시스템을 제작하여 실시예 3의 코리 네박테리움 글루타미컴의 항시 발현 시스템과 비교를 시도하였다.

구체적으로, 분리된 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 염색체를 주형으로 하고, 서열 번호 9와 10을 프라이머로 사용하여 중합효소연쇄반응을 통해 GNA1을 얻고, PstI (New England Biolabs, Beverly, MA)과 XbaI (New England Biolabs, Beverly, MA)를 이용하여 코리네박테리움 글루타미컴에서 유도 발현 시스템으로 잘 알려진 pVWEx2 벡터(Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. 76:545-552)에 도입하여 pVWEx2-GNA1 벡터를 제작하였다(도 4). 상기 유도 발현은 lacIq-Ptac 프로모터를 이용하였다. 사용된 프라이머들의 서열은 각각 다음과 같다.

서열번호 12 (Vw2-GNA1 - 5)

5' - AACTGCAGATGAGCTTACCCGATGGATTTTATATAAGG - 3'

서열번호 13 (Vw2-GNA1 - 3)

5' - GCTCTAGACTATTTTCTAATTTGCATTTCCACGCCTGC - 3'

실시예 5: GNA1이 도입된 코리네박테리움 글루타미컴 CJNAGKO을 이용한 N-아세틸 글루코사민의 생산

코리네박테리움 글루타미컴을 이용한 N-아세틸 글루코사민을 생산하기 위해 염색체 내 N-아세틸 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 (nagA1) ORF에 정지코돈(stop codon)이 들어간 변이체 CJNAGKO에 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스 퍼라제(GNA1)을 도입하였다. 즉, 실시예 3 및 4에서 제작된 p117-PEFTU-GNA1와 pVWEx2-GNA1를 각각 CJNAGKO에 형질전환하여 N-아세틸 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 의 활성이 없으며 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제(GNA1) 활성이 있는 균주를 제작하였다. 이들 제작된 균주 각각을 CJNAG1(KCCM10967P), CJNAG2로 명명하였다(표 1).

제작된 균주들의 N-아세틸 글루코사민 생산 여부를 테스트하기 위해, N-아세틸 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제만 불활성화된 균주(대조군 2)와 글루코사민 6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제만 증폭된 균주(대조군 3)를 각각 제작하여 대조군으로 사용하였다. 그리고 야생형의 코리네박테리움 글루타미컴을 추가 대조군(대조군 1)으로 사용하여 최종 N-아세틸 글루코사민의 생성여부를 파악 하였다(표 1).

사용된 배지 조성 및 배양 방법은 테스트 튜브에 seed 배지(500ml 증류수에 trypton 5g, yeast extract 2.5g, NaCl 5g, Brain heart infusion 18.5 g, 500ml의 증류수에 sorbitol 91g, 각각 고온 고압 살균 후 섞음.) 5ml를 넣은 후, 테스트 균주들을 접종한 후, 30℃에서 12시간 배양하였다. 삼각 플라스크 250ml에 본 배양 배지 (증류수 1L 기준, 포도당 90g 별도 살균, (NH4)2SO4 40g, Soy Protein 2.5g, Corn Steep Solids 5g, 요소 3g, KH2PO4 1g, MgSO4 7H2O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 1000㎍, 칼슘-판토텐산 2000㎍, 니코틴아마이드 3000㎍, CaCO3 30g 별도 살균) 20ml을 분주한 후, seed 배양액 200ul를 접종하여 30℃에서 42시간 발효하였다. 특히, pVWEx2-GNA1로 형질 전환된 균주인 ‘대조군 3’과 ‘CJNAG2’는 세포의 optical density(OD)가 600nm 파장에서 1.0일 때 IPTG를 100uM 넣어 주었다. 각각의 균주에 대해 3개씩의 flask test를 수행하여 평균 세포 농도와 N-아세틸 글루코사민을 측정하였다. 발효 결과 항시 발현과 유도 발현에 상관없이 약 1.0 g/L 이상의 N-아세틸 글루코사민이 생성되었다(표 1). 기존의 대장균을 이용한 NAG 생산의 경우 성장과 생산을 나누는 유도발현 시스템만이 적용 가능했었으나, 코리네박테리움의 경우 항시 발현 시스템도 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 제조된 N-아세틸 글루코사민은 산처리 방법에 의해 탈 아세틸화 시켜 글루코사민을 생산할 수 있으며, 이를 위해 노비코브 등(Novikov V.Y. et al. Russ. J. Appl. Chem. 1997:1467-1470) 에 기재된 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 이를 통해 N-아세틸 글루코사민을 생산하면 글루코사민을 용이하게 추가 생산할 수 있다.

본 발명의 다양한 실시예가 상세히 기술되어 있지만 당 업계에서 본 실시예의 변형 및 응용이 가능함은 명백하다. 그러므로 그러한 변형 및 응용은 이하의 청구항에 기재된 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 명백히 이해되어야 한다.

도 1은 N-아세틸 글루코사민 생합성 경로 및 N-아세틸 글루코사민 생산균주의 유전자 변형을 도식화한 것이다. 본 발명에서는 nagA를 불활성화시키고, 외래 유전자인 GNA1을 증폭하였다.

도 2는 pDZ-nagA1ST 벡터 구조를 나타낸 그림이다. pDZ에 정지코돈이 들어간 nagA1을 클로닝하였다.

도 3은 pECCG117-PEFTU-GNA1 벡터 구조를 나타낸 그림이다. pECCG117 벡터에 항시 발현 프로모터인 PEFTU를 1차 클로닝 하였고, GNA1을 추가로 클로닝 하여 제작되었다.

도 4는 pVWEx2-GNA1 벡터 구조를 나타낸 그림이다. pVWEx2 벡터에 GNA1을 클로닝하여 제작되었다.

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A MICROORGANISM OF CORYNEBACTERIUM GENUS PRODUCING N-ACETYL GLUCOSAMINE AND A METHOD OF PRODUCING N-ACETYL GLUCOSAMINE OR GLUCOSAMINE USING THE SAME <130> PA090435KR <150> KR2008-0102633 <151> 2008-10-20 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1167 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(1167) <223> nagA1(NCgl2556) <400> 1 atggcagaag tggtgcatta tcaagaaaat gcaggtcaag cagttaaaaa aattgaagga 60 agaattgtta ccccccacgg ggtgattgat ggctttctcc aactcgaaaa cggcatcatc 120 acggaactct ctggagaacc agcacctaaa aacgcaggat tccaccccga actccccacg 180 attgttccca gttttattga tcttcataat cacggtggaa acggtggcgc gtttcctacg 240 ggaacgcagg accaggcgag gaatgccgcg cagtatcacc gcgaacatgg cacgaccgtg 300 atgttggcaa gcatggtttc ggcgccggct gacgcactgg cagcgcaggt ggaaaacctt 360 attcccttgt gtgaagaggg cctgctgtgc ggcattcacc tcgagggtcc tttcatcaac 420 gcatgccgtt gtggtgctca aaacccggat tttatttttc ccggcaaccc aacagatctt 480 gcccaggtga tccatgcggg aaaaggttgg atcaaatcga tcacagtagc gccggaaact 540 gacaatctta ctgagcttct cgatctctgc gcagcgcacc acatcattgc ttccttcggg 600 cacactgatg cagattttga taccactacc agcgcaattg ccttggctaa agagaaaaat 660 gtgacggtca cggctacgca tttgttcaat gcgatgcctc cgctgcatca tagggatccc 720 ggcagcgtgg gcgctttgct tgctgcggca cgtgccgggg acgcatatgt tgagttgatc 780 gccgacggcg tgcatttggc cgatggaacg gtcgatctag ctcgttccaa caacgccttt 840 ttcatcacgg acgccatgga agccgccgga atgccagacg gtgagtacat tttgggcgtt 900 ttgaacgtca ccgtcaccga tggcgtcgcc cgtctgcgcg atggcggcgc catcgccggg 960 ggtaccagca cactagcgag tcagttcgtg caccacgtgc gcaggggtat gacgcttatc 1020 gacgcgaccc tccacacctc aaccgtcgcc gccaaaattc tcggacttag cgatcacgaa 1080 atcgttaaat ccaaccctgt aaattttgtg gtctttgact caaacggcca gttacaacag 1140 gtccatttag accatcaagt aatttaa 1167 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplication of nagA1 <400> 2 ggaattcatg gcagaagtgg tgcattatca ag 32 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of nagA1 <400> 3 gctctagaga tgatgtccat ggtcggactc c 31 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplication of mutated nagA1 <400> 4 gtgcccgaag gaagcttaaa tgatgtggtg cgc 33 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of mutated nagA1 <400> 5 gcgcaccaca tcatttaagc ttccttcggg cac 33 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of EFTU promoter <400> 6 gactagtatg ttcggttacg tcggtgacct tc 32 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of EFTU promoter <400> 7 cccaagcttc tattttctaa tttgcatttc cacgcctgc 39 <210> 8 <211> 497 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> promoter <222> (1)..(497) <223> EFTU promoter <400> 8 atgttcggtt acgtcggtga ccttcgctct aagacccagg gtcgtgcaaa ctactccatg 60 gtcttcgatt cctacgctga ggtcccagcc aacgttgccg cagatgttat tgctgagcgc 120 aacggcaccg cttcctaaag atcgtttaga tccgaaggaa aacgtcgaaa agcaatttgc 180 ttttcgacgc cccaccccgc gcgttttagc gtgtcagtag gcgcgtaggg taagtggggt 240 agcggcttgt tagatatctt gaaatcggct ttcaacagca ttgatttcga tgtatttagc 300 tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt ttgaaaatca acgccgttgc 360 ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag atctgtgtgc tcagtcttcc 420 aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca attcgtggct gcgaaagtcg tagccaccac 480 gaagtccagg aggacat 497 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of GNA1 <400> 9 ggaattccat atgagcttac ccgatggatt ttatataagg 40 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of GNA1 <400> 10 gctctagact attttctaat ttgcatttcc acgcc 35 <210> 11 <211> 480 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> gene <222> (1)..(480) <223> GNA1 <400> 11 atgagcttac ccgatggatt ttatataagg cgaatggaag agggggattt ggaacaggtc 60 actgagacgc taaaggtttt gaccaccgtg ggcactatta cccccgaatc cttcagcaaa 120 ctcataaaat actggaatga agccacagta tggaatgata acgaagataa aaaaataatg 180 caatataacc ccatggtgat tgtggacaag cgcaccgaga cggttgccgc tacggggaat 240 atcatcatcg aaagaaagat cattcatgaa ctggggctat gtggccacat cgaggacatt 300 gcagtaaact ccaagtatca gggccaaggt ttgggcaagc tcttgattga tcaattggta 360 actatcggct ttgactacgg ttgttataag attattttag attgcgatga gaaaaatgtc 420 aaattctatg aaaaatgtgg gtttagcaac gcaggcgtgg aaatgcaaat tagaaaatag 480 480 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplification of Vw2-GNA1 <400> 12 aactgcagat gagcttaccc gatggatttt atataagg 38 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplification of Vw2-GNA1 <400> 13 gctctagact attttctaat ttgcatttcc acgcctgc 38

Claims

글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 (glucosamine-6-phosphate acetyltransferase)가 도입되고, 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 (glucosamine-6-phosphate deaminase) 활성이 감소 또는 결실된 코리네박테리움 속 미생물로서, N-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 (glucosamine-6-phosphate acetyltransferase)는 서열번호 11의 핵산서열로 암호화된 것을 특징으로 하는 N-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제가 유도 발현 또는 항시 발현되는 것을 특징으로 하는 N-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
제3항에 있어서, 상기 항시 발현은 EFTU 프로모터를 이용한 것을 특징으로 하는 N-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
제3항에 있어서, 상기 유도 발현은 lacIq-Ptac 프로모터를 이용한 것을 특징 으로 하는 N-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미컴인 것을 특징으로 하는 N-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움속 미생물.
제1항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미컴 CJNAG1(KCCM10967P)인 것을 특징으로 하는 N-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움속 미생물.
(a) 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제가 도입되고, N-아세틸 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제 활성이 감소 또는 결실된 N-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 준비하는 단계; (b) 상기 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 단계; 및 (c) 상기 배양 단계에서 생산된 N-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민을 수집하는 단계를 포함하는 N-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민을 생산하는 방법.
제8항에 있어서, (c) 단계에서 수집된 N-아세틸 글루코사민을 탈아세틸화하여 글루코사민을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 N-아세틸 글루코사민 또는 글루코사민을 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 N-아세틸 글루코사민-6-포스페이트 디아미나제에 정지코돈을 삽입한 것을 특징으로 하는 N-아세틸 글루코사민 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물.