CN101629160A

CN101629160A - 产l-甲硫氨酸前体的微生物及利用该微生物生产l-甲硫氨酸前体的方法

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Publication number: CN101629160A
Application number: CN200910131575A
Authority: CN
Inventors: 金喆河; 金素影; 申容旭; 严惠媛; 张真淑; 赵英郁; 李汉珍; 许仁庚; 徐昌一; 罗光镐
Original assignee: CJ Corp
Current assignee: CJ Corp; CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2009-04-07
Publication date: 2010-01-20
Anticipated expiration: 2029-04-07
Also published as: JP5339996B2; US20110207184A1; EP2108693B1; ES2537790T3; US8465952B2; CN101629160B; EP2108693A3; US9005952B2; PL2108693T3; BRPI0900742B1; EP2108693A2; US20090253186A1; JP2010000075A; BRPI0900742A2

Abstract

本发明涉及一种产L－甲硫氨酸前体——O－乙酰高丝氨酸的微生物，以及利用该微生物生产L－甲硫氨酸前体的方法。

Description

产L-甲硫氨酸前体的微生物及利用该微生物生产L-甲硫氨酸前体的方法

技术领域

本发明涉及一种产L-甲硫氨酸前体--O-乙酰高丝氨酸的微生物，以及利用该微生物生产L-甲硫氨酸前体的方法。

背景技术

甲硫氨酸是一种人体必需氨基酸，其已经被广泛地应用作饲料和食品添加剂，也被用作药剂和药物的合成原材料。甲硫氨酸作为胆碱(蛋黄素)和肌酸这些化合物的前体，同时也用作半胱氨酸和牛磺酸的合成原材料。甲硫氨酸还可以提供硫。S-腺苷-甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine)源自L-甲硫氨酸并在人体中起提供甲基的特定作用，同时还与脑部中各种神经递质的合成有关。甲硫氨酸和/或S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)可以抑制肝脏和动脉中的脂肪累积，还能减轻抑郁、炎症、肝脏疾病和肌肉疼痛等。

甲硫氨酸和/或S-腺苷-L-甲硫氨酸在体内的已知功能如下：

1)抑制肝脏和动脉中的脂肪累积，促进脂类代谢，并改善脑部、心脏和肾脏的血液循环(J Hepatol.Jeon BR等，2001 Mar；34(3)：395-401)。

2)促进毒素物质的消化、解毒和排泄，以及重金属的排泄，如铅。

3)以800-1600mg/天的剂量用作抗抑郁药物服用(Am J Clin Nutr.MischoulonD.等，2002 Nov；76(5)：1158S-61S)。

4)增强肝脏功能(FASEB J.Mato JM.，2002 Jan；16(1)：15-26)，并且尤其对由于酒精引起的肝脏疾病有效(Cochrane Database Syst Rev.，RambaldiA.，2001；(4)：CD002235)。

5)对骨与关节疾病有抗炎作用，并促进关节恢复(ACP J Club.Sander O.，2003Jan-Feb；138(1)：21，J Fam Pract.，Soeken KL等，2002 May；51(5)：425-30)。

6)是头发的必需营养物质。它可以为头发提供营养，从而防止脱发(AudiolNeurootol.，Lockwood DS等，2000 Sep-Oct；5(5)：263-266)。

甲硫氨酸可以通过化学或生物合成，从而用于饲料、食品和药品。

在化学合成中，甲硫氨酸主要通过5-(β-甲硫乙基)-乙内酰脲(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)水解来生产。化学合成的甲硫氨酸有个缺点，所生产的甲硫氨酸只能以L型和D型的混合形式被生产出来。

在生物合成中，甲硫氨酸通过利用参与甲硫氨酸合成的蛋白质生产。L-甲硫氨酸在如metA、metB、metC、metE、metH的这些基因所表达的酶的作用下，在大肠杆菌中由高丝氨酸生物合成。特别是metA是编码高丝氨酸琥珀酰转移酶(homoserineO-succinyltransferase)的基因，该基因是甲硫氨酸生物合成所必需的第一个酶，并且它将高丝氨酸转变为O-琥珀酰-L-高丝氨酸。O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶或metB基因编码的γ-胱硫醚合成酶将O-琥珀酰-L-高丝氨酸转变为胱硫醚。metC基因编码的β-胱硫醚裂解酶将胱硫醚转变为L-高半胱氨酸。metE基因编码钴胺素不依赖型甲硫氨酸合成酶，metH编码钴胺素依赖型甲硫氨酸合成酶，这两个酶可以将L-高半胱氨酸转变为L-甲硫氨酸。同时，metF基因编码的5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶和glyA基因编码的丝氨酸羟甲基转移酶共同合成N(5)-甲基四氢叶酸，以提供L-甲硫氨酸合成中必需的甲基。

L-甲硫氨酸通过上述酶一系列的有机反应合成。上述蛋白质和影响上述蛋白质的其它蛋白质的基因修饰可能导致L-甲硫氨酸合成的增加。例如，日本早期公开的公开号2000/139471的专利描述了用基因组中缺失thrBC和metJ基因，过表达metBL基因且metK基因被渗漏突变替代的埃希氏菌属(Escherichia sp.)生产L-甲硫氨酸的方法。此外，公开号为US2003/0092026 A1的美国专利也描述了利用敲除metD基因(L-甲硫氨酸合成抑制物)的属于棒状杆菌属(Corynerbacterium sp.)的微生物生产L-甲硫氨酸的方法。公开号为US2002/0049305的美国专利描述了通过提高5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(metF)的表达提高L-甲硫氨酸产量的方法。

用生物学方法生产的甲硫氨酸是L型的，其具有优点但是产量太低。这是因为甲硫氨酸生物合成途径具有非常严谨的反馈调节系统。一旦甲硫氨酸的合成达到一定水平，终产物甲硫氨酸将抑制编码起动甲硫氨酸生物合成主要蛋白质的metA基因的转录。由于metA基因在转录阶段被甲硫氨酸抑制，且在接下来的翻译阶段被胞内蛋白酶降解，因此metA基因本身的过表达不能提高甲硫氨酸的产量(Dvora Biran，Eyal Gur，LeoraGollan和Eliora Z.Ron：Control of methionine biosynthesis in Escherichia coliby proteolysis：Molecular Microbiology(2000)37(6)，1436-1443)。因此，许多先前的专利专注于如何将metA基因从反馈调节系统中分离出来(WO2005/108561，WO1403813)。

公开号为US2005/0054060A1的美国专利描述了一种通过修饰的胱硫醚合成酶(O-琥珀酰高丝氨酸裂解酶)合成高半胱氨酸或甲硫氨酸的方法，该胱硫醚合成酶可以直接以甲硫醇(CH₃SH)或硫化氢(H₂S)，而不是以半胱氨酸作为硫源。但是，本领域的技术人员非常熟悉胱硫醚合成酶在细胞中可以与多种甲硫氨酸前体结合，从而产生高水平的副产物。例如，据报道，胱硫醚合成酶通过O-琥珀酰高丝氨酸和高半胱氨酸的副反应积累高水平的高羊毛氨酸(J.Bacteriol(2006)vol 188：p609-618)。因此，胱硫醚合成酶的过表达增加了其副反应，降低了细胞内反应的效率。而且这种方法还有许多缺点。这个过程利用了具有副反应和反馈调节系统的细胞内代谢途径。此外，该过程所用的硫化氢和甲硫醇是对细胞具有严重毒性的。因此，甲硫氨酸的产量相对较小。

为解决这些问题，本发明人开发了两步法，包括：第一步，通过大肠杆菌发酵生产L-甲硫氨酸前体；第二步，通过酶反应将L-甲硫氨酸前体转变为L-甲硫氨酸(PCT/KR2007/003650)。此两步法能够解决上述问题，如硫化物的细胞毒性，甲硫氨酸和SAMe的反馈调节和胞内酶对中间产物降解(如γ-胱硫醚合成酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶)。而且，与产生D-甲硫氨酸和L-甲硫氨酸混合形式的甲硫氨酸的化学合成法相比，两步法在只选择性地产生L-甲硫氨酸上非常有效。

在两步法中，甲硫氨酸前体的产量对提高甲硫氨酸的产量是一个关键因素。为提高甲硫氨酸前体O-乙酰高丝氨酸的合成产量，强天冬氨酸激酶、高丝氨酸转移酶和O-乙酰高丝氨酸转移酶的良好组合是非常重要的。在前述的背景技术基础上，本发明人构建了产L-甲硫氨酸前体的菌株，该菌株的特征为：a)通过基因整合导入，强化了高丝氨酸O-乙酰转移酶活性(EC2.3.1.31)，整合的基因选自棒状杆菌属(corynebacteriumsp.)、钩端螺旋菌属(Leptospira sp.)、奇异球菌属(Deinococcus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)或分枝杆菌属(Mycobacterium sp.)；

或b)强化了天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶活性(EC2.7.2.4或1.1.1.3)；

或c)a)和b)的结合。

发明内容

本发明提供了一种产L-甲硫氨酸前体的微生物和一种利用该微生物生产L-甲硫氨酸前体的方法。

特别是，本发明提供了一个产L-甲硫氨酸前体的产生菌株，该菌株的特征为：a)通过基因整合导入并强化了高丝氨酸O-乙酰转移酶活性(EC2.3.1.31)，整合的基因选自棒状杆菌属(corynebacterium sp.)、钩端螺旋菌属(Leptospira sp.)、奇异球菌属(Deinococcus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)或分枝杆菌属(Mycobacteriumsp.)；

或c)a)和b)的结合，

以及一种用此菌株生产L-甲硫氨酸前体的方法。

附图说明

参考附图，可以更好的理解本发明优选实施例的应用，其中：

图1是甲硫氨酸前体产生菌株的基因操作的图解。

图2是甲硫氨酸生产的2步法化学结构的图解。

图3是metX基因表达pCJ-MetX-CL的示意图。

发明内容

就本发明的一个方面而言，本发明涉及L-甲硫氨酸前体的产生菌株，该菌株特征为：a)通过基因整合导入并强化了高丝氨酸O-乙酰转移酶活性(EC2.3.1.31)，整合的基因选自棒状杆菌属(corynebacterium sp.)、钩端螺旋菌(Leptospira sp.)、奇异球菌属(Deinococcus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)或分枝杆菌属(Mycobacteriumsp.)；

或c)a)和b)的结合，

以及一种用此菌株生产L-甲硫氨酸前体的方法。

术语“L-甲硫氨酸前体”被定义为甲硫氨酸特定代谢途径中一部分的代谢产物，或可以衍生这些代谢产物。特别是，此处所用的L-甲硫氨酸前体指的是O-乙酰高丝氨酸。

术语“L-甲硫氨酸前体产生菌株”指的是通过本发明的操作能累积L-甲硫氨酸前体的原核或真核微生物菌株。例如，该菌株可以选自由埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、普罗威登斯菌属(Providenciasp.)、棒状杆菌属(Corynebacteria sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、钩端螺旋菌属(Leptospira sp.)、沙门氏菌属(Salmonellar sp.)、短杆菌属(Brevibacteriasp.)、亚单胞菌属(Hypomononas sp.)、色素杆菌属(Chromobacterium sp.)和诺卡氏菌属(Norcardia sp.)微生物组成的组，或真菌，或酵母。优选可以利用埃希氏菌属、棒状杆菌属、钩端螺旋菌属和酵母属的微生物产生O-乙酰高丝氨酸。更优选的可以利用埃希氏菌属，且最优选地可以利用大肠杆菌(在下文中称为“E.coli”)。

在不同的实施例中，本发明提供了一种L-甲硫氨酸前体产生菌株，其中参与真正O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸降解的基因缺失或削弱，且通过引入或强化了参与O-乙酰高丝氨酸合成的基因。本发明也选择性提供了一个菌株，该菌株的苏氨酸生物合成途径被阻断或削弱，以增强O-乙酰高丝氨酸产量。本发明进一步提供了一个菌株，该菌株中导入、过表达或活性增强了不受反馈调节系统控制的高丝氨酸O-乙酰转移酶。本发明还提供了一个菌株，该菌株过表达或活性增强了天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶。本发明还提供了一个菌株，该菌株中导入、过表达或活性增强了不受反馈调节系统控制的高丝氨酸O-乙酰转移酶，和过表达或活性增强了天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶。

尤其是，本发明提供了一个L-甲硫氨酸前体产生菌株，该菌株敲除了参与L-甲硫氨酸前体降解的metB基因、参与苏氨酸生物合成途径的thrB基因和调节L-甲硫氨酸前体产物基因转录的metJ基因。本发明还通过敲除参与甲硫氨酸前体合成的真实metA或metX基因，导入外源metX基因，提供了一个L-甲硫氨酸前体的产生菌株。本发明还通过增强thrA基因编码的活性，提供了一个L-甲硫氨酸前体的产生菌株。

更优选地，本发明还通过敲除参与甲硫氨酸前体合成的真实metA或metX基因，导入不受反馈系统控制的外源metX基因，以及增强thrA基因编码的活性，提供了一个L-甲硫氨酸前体的产生菌株。

本发明中所使用的“失活”指的是基因的缺失或衰减(attenuation)。基因的缺失通过切除该基因的区域或在染色体中引入特定基因的序列来修饰蛋白质序列来实现。术语“衰减”或“削弱(weakening)”在此指的是减弱或消除微生物中一个或多个相应DNA编码的酶(蛋白质)的胞内活性，例如，通过修饰基因的启动子区域和5’-UTR的核苷酸序列，或者通过在靶基因的ORF区域引入突变来减弱蛋白的活性。通过衰减的方法，通常相应蛋白质的活性或浓度会降低到野生型蛋白质的活性或浓度的，或起始微生物中该蛋白质活性或浓度的0-75％、0-50％、0-25％、0-10％或0-5％。

例如，为了实现衰减，可以通过降低或消除基因的表达或酶蛋白质的催化性质。这两种方法可以选择地结合。

通过合适的培养，基因表达信号结构的修饰(突变)，以及反义RNA技术都可以实现基因表达的降低。例如，基因表达的信号结构可以是限制基因、激活基因、操纵子、启动子、弱化子、核糖体结合位点、起始密码子和终止子。专家们都可以找到这方面的信息，尤其是下面的文献中：Jensen和Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58：191 195(1998))，Carrier和Keasling(Biotechnology Progress 15：58 64(1999))，Franch和Gerdes(Current Opinion in Microbiology 3：159 164(2000))以及一些熟知的遗传学和分子生物学教科书如Knippers的《分子遗传学》第六版(″MolecularGenetics″，6th edition，1995)或Winnacker的《基因与克隆》(″Genes and Clones″，1990)。

从现有的技术中，可以获得引起酶蛋白质催化性质改变或降低的突变。例如可以参考下面这些人的工作，Qiu和Goodman(Journal of Biological Chemistry 272：86118617(1997))，Yano等(Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 95：5511 5515(1998))，以及Wente和Schachmann(Journal of Biological Chemistry 266：20833 20839(1991))。遗传学和分子生物学的教科书中有这方面的概述，例如Hagemann的普通遗传学(″General Genetics″，1986)。

可能的突变是转换、颠换、插入和缺失。“错义突变”或无义突变指的是酶活性的变化取决于氨基酸交换的效果。基因中至少一对碱基对的插入或缺失导致的“移码突变”，其将导致氨基酸的不正确组合或翻译的过早终止。突变的结果如果是在编码区域形成一个终止密码子，这还将导致翻译的提前终止。特别是几个密码子的缺失会导致酶活性的完全丧失。这些突变的说明都是现有技术，可以在公知的遗传学和分子生物学的教科书中找到，例如，Knippers的《分子遗传学》第六版(″Molecular Genetics″，6thedition，1995)，Winnacker的《基因与克隆》(″Genes and Clones″，1990)，或Hagemann的普通遗传学(″General Genetics″，1986)。

基因的合适突变，例如缺失突变，可以通过基因或等位基因的替代整合入合适的菌株。

本发明中，术语“强化(enhancement)”指的是相应DNA编码的酶的胞内活性的升高。酶的胞内活性的强化可以通过基因的过表达来实现。靶基因的过表达可以通过修饰基因的启动子区域或核苷酸序列的5’-UTR区域来实现。靶基因的过表达也可以通过在染色体中引入靶基因的额外拷贝来实现，通过将包含具有启动子的该靶基因的载体转化到宿主菌株，或在靶基因中引入增加表达的突变。酶的胞内活性的强化也可以通过在靶基因的ORF区域引入突变来实现。总的说来，基于野生型蛋白质或起始微生物中蛋白质的活性或浓度，通过强化的办法，相应蛋白质的活性或浓度可以提高至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最高到1000％或2000％。

在本发明的优选实施例中，制备L-甲硫氨酸前体的产生菌株的办法如下：

第一步，敲除或弱化菌株中的编码γ-胱硫醚合成酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰高丝氨酸硫解酶的基因，以累积L-甲硫氨酸前体如O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸。

编码γ-胱硫醚合成酶的基因为metB，编码O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶的基因为metZ，编码O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的基因为metY。编码具有上述活性的蛋白质的基因用大肠杆菌中的metB举例说明。该基因的基因组序列可以从已经报道(Blattner等，Science 277：1453-1462(1997))的大肠杆菌基因组序列(登记号为AAC75876)中获得。上述基因组序列也可以从NCBI(国家生物技术信息中心)和DDBJ(日本DNA数据库)获得。具有相同活性的其它基因通过来自棒状杆菌属的metB和metY和来自假单胞菌属的metZ举例说明。

如下列反应方程式所示，γ-胱硫醚合成酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶具有将O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸转变为胱硫醚或高半胱氨酸的活性。因此，一旦具有该活性的基因被敲除或弱化，O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸会在培养液中过量累积。

L-半胱氨酸+O-琥珀酰-L-高丝氨酸<＝>琥珀酸盐+胱硫醚

L-半胱氨酸+O-乙酰-L-高丝氨酸<＝>乙酸盐+胱硫醚

HS^-+O-琥珀酰-L-高丝氨酸<＝>琥珀酸盐+高半胱氨酸

HS^-+O-乙酰-L-高丝氨酸<＝>乙酸盐+高半胱氨酸

第二步，第一步中制备的菌株中编码高丝氨酸激酶的thrB基因被敲除或弱化。thrB基因参与从高丝氨酸合成O-磷酸高丝氨酸的反应，O-磷酸高丝氨酸在thrC基因作用下被转变为苏氨酸。thrB基因的敲除或弱化是为了将所有产生的高丝氨酸合成甲硫氨酸前体。

第三步，甲硫氨酸合成途径的转录调节子被敲除或弱化。参与甲硫氨酸合成的metA、metB、metC、metE和metF基因被反馈调节系统所抑制。metJ基因是大肠杆菌中的一个典型转录调节子基因。为了让合成甲硫氨酸前体的metA或metX因过表达，metJH基因需要去除。因此，去除大肠杆菌中的metJ基因，metA或metX基因的表达通常会提高，从而导致L-甲硫氨酸前体的大量产生。

上述步骤2和3可以根据前体产生菌株进行修饰或去除。但是，更优选进行该步骤来强化埃希氏菌属微生物的前体产生途径。

第四步，为了增加O-乙酰高丝氨酸、L-甲硫氨酸前体的合成，引入了metX基因编码的参与甲硫氨酸生物合成途径第一步反应的高丝氨酸O-乙酰转移酶。metX基因是一个常用的标识基因，编码的蛋白质具有高丝氨酸O-乙酰转移酶活性，而且新的外源高丝氨酸O-乙酰转移酶可以从不同的微生物菌种中得到。例如，编码高丝氨酸O-乙酰转移酶肽的基因可以选自棒状杆菌属、钩端螺旋菌属、奇异球菌属、假单胞菌属或分枝杆菌属。优选编码高丝氨酸O-乙酰转移酶肽的基因选自谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)、麦氏钩端螺旋菌(Leptospira meyeri)、耐辐射奇异球菌(Deinococcus radiodurans)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)。更优选的编码高丝氨酸O-乙酰转移酶肽的基因选自Unipro数据库中编号Q9RVZ8(Deinococcus radiodurans)、NP_249081(Pseudomonas aeruginosa)或YP_886028(Mycobacterium smegmatis)。已知来自麦氏钩端螺旋菌(leptospira meyeri)的metX基因具有反馈抑制(J Bacteriol.1998Jan；180(2)：250-5.Belfaiza J等)，以及先前在我们实验室确认的具有反馈抑制的几个高丝氨酸O-乙酰转移酶。

metX基因的引入和强化，可以通过引入基因或修饰基因的启动子区域和核苷酸序列的5’-UTR进行，也可以通过在靶基因的ORF区域引入突变实现。metX基因表达的强化会导致甲硫氨酸前体合成的提高。

第五步，增强天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶的活性，以增加高丝氨酸的合成，高丝氨酸是O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸的前体。thrA基因常见的定义是该基因编码的肽具有天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶活性。优选，Unipro数据库编号为AP_000666编码的天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶。更优选的是，选序列号为27的thrA基因所编码的氨基酸序列，该序列的345位点的氨基酸发生了突变。通过在thrA基因中引入突变或将靶基因整合到染色体中，以及进一步引入处理过的质粒来增强thrA基因的活性。

利用前述步骤1到5的部分或完整方法，就可以在菌株内累积L-甲硫氨酸的前体O-乙酰高丝氨酸。

可以从产L-赖氨酸、L-苏氨酸或L-异亮氨酸的菌株起始制备L-甲硫氨酸前体的产生菌株。优选用产L-苏氨酸的菌株制备产L-甲硫氨酸前体的菌株。采用该菌株，高丝氨酸合成容易进行，而且甲硫氨酸前体的产量会增加。因此，用产L-苏氨酸的菌株通过敲除或弱化苏氨酸生物合成途径中的一个基因，然后敲除或弱化metA或metY或metZ基因，就可以累积甲硫氨酸前体。更优选的是，先敲除或弱化thrB基因，再敲除或弱化metB或metY或metZ基因，来合成甲硫氨酸前体。同时，metX基因表达的强化会导致甲硫氨酸前体合成的增加。

本发明术语“L-苏氨酸产生菌株”指的是在体内能够生产L-苏氨酸的原核或真核微生物菌株。例如，该菌株可以包括属于埃希氏菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、普罗威登斯菌属、棒状杆菌属和短杆菌属的L-苏氨酸产生微生物菌种。其中，优选的是埃希氏菌属，更优选大肠杆菌。

本发明的一个优选实施例中，所用的菌株是产L-苏氨酸且不依赖L-甲硫氨酸的菌株CJM002，该菌株转化自产L-苏氨酸的大肠杆菌突变菌株TF4076(KFCC 10718，韩国专利号92-8365)。TF4076需要甲硫氨酸，抗甲硫氨酸类似物(如α-氨基-β-羟基戊酸，AHV)，赖氨酸类似物(如：S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸，AEC)和异亮氨酸类似物(如α-氨基丁酸)。由于TF4076是一个需要甲硫氨酸的菌株，该菌株不能在体内合成甲硫氨酸。通过去掉该菌株对甲硫氨酸的依赖，该菌株被用作本发明中的产甲硫氨酸前体的菌株，本发明人还通过用NTG人工突变使产L-苏氨酸的大肠杆菌CJM002去除了对甲硫氨酸的依赖。大肠杆菌CJM002被命名为大肠杆菌MF001，2004年4月9日保存在KCCM(韩国微生物保藏中心，Eulim Buld.，Hongje-1-Dong，Seodaemun-Ku，首尔，361-221，韩国)(登记号为KCCM-10568)。本发明中，大肠杆菌CJM002中的metB，thrB，metJ和metA基因均被敲除了，然后在metA基因的基因位点引入metX基因。所产生的由大肠杆菌CJM002构建的产L-甲硫氨酸前体菌株被命名为CJM-X。CJM-X菌株中的metX基因来自耐辐射奇异球菌。将带有thrA基因的表达载体转化到CJM-X菌株后，所得菌株被命名为CJM-X(pthrA(M)-CL)。

通过上述方法制得产O-乙酰高丝氨酸的大肠杆菌CJM-X(Escherichia coli CJM-X)(pthrA(M)-CL)于2008年1月23日保藏，登记号为KCCM10921P。

在本发明的另一个优选实施例中，采用的是PCT/KR2005/00344中公开的产L-苏氨酸菌株FTR2533。菌株FTR2533源自大肠杆菌TFR7624，大肠杆菌TFR7624源自大肠杆菌登记号KCCM 10236。而大肠杆菌登记号KCCM 10236源自大肠杆菌TF4076。大肠杆菌登记号KCCM 10236能表达高水平的催化从PEP形成草酰乙酸盐的ppc基因，且需要从天冬氨酸合成苏氨酸必须的酶，如thrA基因：天冬氨酸激酶1-高丝氨酸脱氢酶、thrB：高丝氨酸激酶、thrC：苏氨酸合成酶，从而能够增加L-苏氨酸的产量。大肠杆菌FTR7624(KCCM 10538)有一个失活的tyrR基因，该基因抑制L-苏氨酸生物合成所必需的基因tyrB的表达。大肠杆菌FTR2533(KCCM10541)是具有一个失活的galR基因的产L-苏氨酸菌株，是一个产L-苏氨酸的大肠杆菌突变菌株。

在本发明中，大肠杆菌FTR2533中的metB、thrB、metJ和metA基因均被敲除了，然后在metA基因的基因位点引入metX基因。所产生的由大肠杆菌FTR2533构建的产L-甲硫氨酸前体菌株被命名为CJM2-X。CJM2-X菌株中的metX基因来自耐辐射奇异球菌。将带有thrA基因的表达载体转化到CJM2-X菌株后，所得菌株被命名为CJM2-X(pthrA(M)-CL)。

大肠杆菌CJM2-X(Escherichia coli CJM2-×)(pthrA(M)-CL)于2008年2月12日保藏，登记号为KCCM 10925P。

另一方面，本发明涉及一种产L-甲硫氨酸前体的方法，该方法包括：a)上述微生物的发酵；b)在培养基中或微生物体中富集L-甲硫氨酸前体；和c)分离L-甲硫氨酸前体。

上述制备的产L-甲硫氨酸前体菌株的培养可以用本领域技术人员熟知的合适培养基和培养条件来进行。根据所选择的菌株，本领域技术人员可以简单调节所用的培养方法。例如，培养方法包括但不限于批次培养、连续培养和补料批次培养。不同的培养方法见参考文献James M.Lee的生物化学工程(Prentice-Hall International Editions，pp 138-176)。

培养基必需满足特定菌株的培养条件。不同的微生物培养基见参考文献美国细菌学会的普通细菌学方法手册(“Manual of Methods for General Bacteriology，WashingtonD.C.，USA，1981)。这些培养基含有不同的碳源、氮源和微量元素。碳源可以是碳水化合物如葡萄糖、蔗醣、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉、纤维素；也可以是脂肪如大豆油、葵花子油、篦麻油和椰子油；还可以是脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸；还可以是醇类如丙三醇和乙醇，以及有机酸如乙酸。也可以用这些化合物的一种或其混合物作为碳源。氮源可以是有机氮源如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麦芽提取物、玉米浆(CSL)和豆粉，以及无机氮源如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。也可以用这些化合物的一种或其混合物作为氮源。培养基中还可以添加包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾以及相应的钠盐作为磷源。培养基中也可以含有金属盐如硫酸镁或硫酸铁。此外，也可以加入氨基酸、维生素及其适当的前体。培养基或前体物可以通过批次或连续的方式加入培养基中。

培养过程中，培养基的pH可以通过以适当的途径加入如氢氧化铵、氢氧化钾、氨、磷酸和硫酸的化合物来调节。培养过程中，气泡的产生可以通过消泡剂进行抑制，如脂肪酸聚乙酯。可以向培养基中通入氧气或含氧气体(如空气)来维持好气性条件。培养温度通常是20-45℃，优选25-40℃。培养期间可以持续进行直到L-甲硫氨酸前体达到所需的水平，培养时间最好为10-160小时。

具体实施方式

本发明实际且目前优选的实施例如下面的实施例所示，这些实施例是为了证明本发明，而不是为了构建本发明的界限。需要理解本领域的技术人员考虑在本发明公开的基础上可在本发明的精神和范围内进行改良和改进。

实施例1：构建产甲硫氨酸前体菌株

<1-1>metB基因的敲除

为了敲除大肠杆菌中编码胱硫醚合成酶的metB基因，采用了一步FRT-PCR敲除技术(PNAS(2000)vol 97：P6640-6645)。以pKD3载体为模版(PNAS(2000)vol 97：P6640-6645)，用序列1和2引物进行PCR，构建缺失盒。用以下程序进行PCR，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环。

PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，随后纯化1.2kbp条带获得DNA。回收的DNA片段使用pKD46载体电转至大肠杆菌(K12)W3110(PNAS(2000)vol 97：P6640-6645)。电转前，转化有pKD46载体的大肠杆菌W3110在含有100μg/L氨苄青霉素和5mM L-阿拉伯糖的LB培养基中30℃培养到OD₆₀₀达到0.6。然后用无菌蒸馏水洗涤菌体两次，再用10％的甘油洗涤一次。2500伏进行电转。复苏的菌株在含有25μg/L氯霉素的LB平板上划线，37℃培养过夜。然后，挑选具有氯霉素抗性的菌株。

用引物1和2以所选的菌株为模版在相同条件下进行PCR。通过1.0％琼脂糖凝胶上是否出现1.2kb大小的基因来确认metB基因的缺失。然后用pCP20载体转化该菌株(PNAS(2000)vol 97：P6640-6645)，在LB培养基中培养来去除氯霉素标记基因。metB基因敲除的菌株构建完成，在相同条件下进行PCR，1.0％琼脂糖凝胶上metB基因减小到150bp。构建的菌株命名为W3-B。

<1-2>thrB基因的敲除

发明人通过敲除编码高丝氨酸激酶的thrB基因，来尽量增加从高丝氨酸合成O-乙酰高丝氨酸。特别是，当产苏氨酸菌株被用作O-乙酰高丝氨酸的产物宿主时，thrB基因的敲除是必需的，因为在这个基因作用下，高丝氨酸向O-磷酰高丝氨酸的转变是非常强的。为了敲除上述构建的W3-B菌株中的thrB基因，用上述敲除metB基因相同的办法进行一步FRT-PCR。

用引物3和4，以pKD4载体为模版(PNAS(2000)vol 97：P6640-6645)，进行PCR来构建thrB基因缺失盒，程序如下：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环。PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，随后纯化1.6kbp条带的DNA。回收的DNA片段电转入转化有pKD46载体的大肠杆菌W3-B。复苏的菌株在含有50μg/L卡那霉素的LB平板上划线，37℃培养过夜。然后，挑选具有抗性的菌株。

用引物3和4以所选的菌株为模版在相同条件下进行PCR。通过1.0％琼脂糖凝胶是否出现1.6kb大小条带的菌株，来确认thrB基因的缺失。然后用pCP20载体转化该菌株，并在LB培养基中培养。thrB基因敲除的菌株构建完成，在相同条件下进行PCR，1.0％琼脂糖凝胶上thrB基因减小到150kb。构建的菌株命名为W3-BT。

<1-3>metJ基因的敲除

为了敲除参与甲硫氨酸前体合成的metA基因的调节子基因metB基因，采用了与敲除metB基因方法相同的一步FRT-PCR敲除技术。

用引物5和6，进行PCR来构建metJ基因缺失盒，程序如下：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环。

PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，随后纯化1.2kbp条带的DNA。回收的DNA片段电转入转化有pKD46载体的大肠杆菌W3-BT。复苏的菌株在含有氯霉素的LB平板上划线，37℃培养过夜，然后挑选具有抗性的菌株。

用引物7和8以所选的菌株为模版在上述相同条件下进行PCR。通过1.0％琼脂糖凝胶电泳是否出现1.6kb大小的基因来确认metJ基因的缺失。然后用pCP20载体转化该菌株，并在LB培养基中培养。最后构建完成的metJ基因敲除菌株，在相同条件下进行PCR，1.0％琼脂糖凝胶上metJ基因减小到600kb，同时确认菌株氯霉素标记被消除。构建的菌株命名为W3-BTJ。

<1-4>metA基因的敲除

为增加O-乙酰高丝氨酸的产量，编码高丝氨酸O-琥珀酰转移酶的基因metA基因从W3-BTJ菌株中敲除。基于metX基因的整合，导致O-琥珀酰高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸累积的发现，期望通过敲除metA基因促进O-乙酰高丝氨酸的累积(表3)。为了敲除metA基因，采用了一步法FRT-PCR缺失技术。

用引物9和10，进行PCR来构建metA基因缺失盒，程序如下：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，进行30个循环。

PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，随后纯化1.2kbp条带的DNA。回收的DNA片段电转入转化有pKD46载体的大肠杆菌W3-BTJ。复苏的菌株在含有氯霉素的LB平板上划线，37℃培养过夜。然后，挑选具有抗性的菌株。

用引物9和10以所选的菌株为模版在上述相同条件下进行PCR。通过1.0％琼脂糖凝胶是否出现1.1kb大小的基因来确认metA基因的缺失。然后用pCP20载体转化该菌株，并在LB培养基中培养。最后构建完成的metA基因敲除菌株，在相同条件下进行PCR，1.0％琼脂糖凝胶上metA基因减小到100kb，确认氯霉素标记被消除。构建的菌株命名为W3-BTJA。

<1-5>过表达metX基因

为提高O-乙酰高丝氨酸的产量，过表达了编码高丝氨酸O-乙酰转移酶的metX基因。

用引物28和29，以麦氏钩端螺旋菌染色体作为模版进行PCR，程序如下：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，进行25个循环。

PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，随后纯化1.1kbp条带的DNA。分离DNA片段后，用限制性内切酶EcoRV切割含有CJ1启动子的载体pCL1920，并与分离的DNA片段连接。大肠杆菌用载体转化，且在含有50μg/L壮观霉素的LB琼脂上挑选携带质粒的细胞。所构建的载体命名为pCJ1-MetXlme-CL。将该载体电转入W3-BTJ菌株，该构建的菌株命名为W3-BTJ/pCJ-MetXlme-CL。

另一个过表达metX基因的方法是，用引物30和31，以谷氨酸棒状杆菌染色体为模版进行PCR，程序如下：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，进行25个循环。

PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，随后纯化1.1kbp条带的DNA。随后，分离DNA片段后，用限制性内切酶EcoRV切割含有CJ1启动子的载体pCL1920，并与分离的DNA片段连接。用该载体转化大肠杆菌，并在含有50μg/L壮观霉素的LB琼脂上挑选携带质粒的细胞。所构建的载体命名为pCJ1-MetXlme-CL。将该载体电转入W3-BTJ菌株，该构建的菌株命名为W3-BTJ/pCJ-MetXcgl-CL。

另一个过表达metX基因的方法是，用引物11和12，以耐辐射奇异球菌染色体为模版进行PCR，程序如下：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，进行25个循环。

PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，随后纯化1.1kbp条带的DNA。分离DNA片段后，用限制性内切酶EcoRV切割含有CJ1启动子的载体pCL1920，并与分离的DNA片段连接。用该载体转化大肠杆菌，并在含有50μg/L壮观霉素的LB琼脂上挑选携带质粒的细胞。所构建的载体命名为pCJ1-MetXdr-CL。将该载体电转入W3-BTJ菌株，该构建的菌株命名为W3-BTJ/pCJ-MetXdr-CL。

另一个过表达metX基因的方法是，用引物13和14，以耻垢分枝杆菌染色体为模版进行PCR，程序如下：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，进行25个循环。

PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，随后纯化DNA片段。分离DNA片段后，用限制性内切酶EcoRV切割含有CJ1启动子的载体pCL1920，并与分离的DNA片段连接。用该载体转化大肠杆菌，并在含有50μg/L壮观霉素的LB琼脂上挑选携带质粒的细胞。所构建的载体命名为pCJ-MetXmsm-CL。所构建的载体电转入W3-BTJ菌株，该构建菌株命名为W3-BTJ/pCJ-MetXmsm-CL。

另一个过表达metX基因的方法是，用引物15和16，以铜绿假单胞菌PA01(pae)染色体为模版进行PCR，程序如下：94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟，进行25个循环。

PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，随后纯化DNA片段。分离DNA片段后，用限制性内切酶EcoRV切割含有CJ1启动子的载体pCL1920，并与分离的DNA片段连接。用该载体转化大肠杆菌，并在含有50μg/L壮观霉素的LB琼脂上挑选携带质粒的细胞。所构建的载体命名为pCJ-MetXpae-CL。

上述构建的载体分别电转入W3-BTJA菌株，用实施例2-1中的方法，采用摇瓶培养来检测该菌株的生产能力。

以引入来自谷氨酸棒状杆菌metX基因载体菌株(PCT/KR2007/003650)的O-乙酰高丝氨酸产量为100％，测定每个菌株的O-乙酰高丝氨酸的产量。

结果，转入pCJ-MetXdra-CL、pCJ-MetXmsm-CL和pCJ-MetXlme-CL载体的菌株，O-乙酰高丝氨酸的生产能力显著提高。

质粒	O-乙酰高丝氨酸产量(％)
质粒	O-乙酰高丝氨酸产量(％)	W3BTJA	pCJ-metXcgl-CL	100
pCJ-metXmsm-CL	114	W3BTJA	pCJ-metXcgl-CL	100
pCJ-metXmsm-CL	114		pCJ-metXlme-CL	105
pCJ-metXpae-CL	100		pCJ-metXlme-CL	105
pCJ-metXpae-CL	100		pCJ-metXdra-CL	164

由于来自耐辐射奇异球菌的metX基因(metX(dra))的稳定表达，在上面三个当中其具有最有效的生产，metX(dra)基因插入到大肠杆菌的染色体中。pSG载体系统用于构建插入metX(dra)的菌株(Appl.Environ.Microbiol.1993 V59.p.3485-3487，Villaverde.A等)。

首先，基因组DNA中metA基因的600bp上游区域，用引物17和18通过PCR进行扩增，基因组DNA中metA基因的600bp下游区域，用引物19和20通过PCR进行扩增。接着，用引物21和22，PCR扩增metX(dra)。每个PCR片段都通过凝胶洗脱分离，并且每个片段混合物用引物23和24进行PCR扩增。扩增的DNA用限制性酶BamHI/EcoRI进行切割，并克隆到载体pSG76C中。用上述构建的载体转化W3-BTJA，并筛选具有氯霉素抗性的菌株，检测metX(dra)基因的成功克隆。检测后的菌株再转入plscel载体以去除标记，并进行重筛选。结果，证实引入metX(dra)基因的菌株与含有pCL-metXdra质粒的菌株的O-乙酰高丝氨酸生产能力相似。

<1-6>过表达thrA基因

为了更有效的提高O-乙酰高丝氨酸的产量，进行了thrA基因的过表达。

为此，用引物25和26，以产L-苏氨酸菌株大肠杆菌CJM002(KCCM10568)染色体为模板进行PCR扩增thrA基因。扩增的DNA片段通过凝胶洗脱分离，并与用限制性内切酶EcoRV切割的含有CJ1启动子的载体pCL1920连接。连接后的载体命名为pCJ-thrA(M)-CL，并将其转化到实施例1-1)至1-5)所生产的菌株中。thrA基因编码的氨基酸序列见序列27，该序列中在345位氨基酸具有一个突变。

<1-7>产L-苏氨酸菌株的转换

在实施例1-1到1-5中描述的用产L-苏氨酸菌株且不依赖L-甲硫氨酸的大肠杆菌CJM002(KCCM10568)菌株构建的产O-乙酰高丝氨酸菌株命名为CJM-X。菌株CJM-X的染色体有一个来自耐辐射奇异球菌的metX基因。另一个产L-甲硫氨酸前体菌株用PCT/KR2005/00344公开的产L-苏氨酸菌株FTR2533(KCCM 10541)构建，如实施例1-1到1-5中所述的，且被命名为CJM-2X。菌株CJM-2X的染色体上有一个来自耐辐射奇异球菌的metX基因。每个菌株都转入一个thrA基因表达载体，如实施例1-6所述，并检测这些菌株中甲硫氨酸前体的产量。

实施例2：L-甲硫氨酸前体的生产发酵

<2-1>摇瓶培养实验

为研究实施例1中所构建菌株的甲硫氨酸前体生产能力，进行了锥形瓶培养实验。用metX基因表达载体转化的CJM2-BTJA和CJM-X、CJM2-X、CJM2-X/pthrA(M)-C在LB平板培养基上31℃培养过夜。PCT/KR2007/003650描述的产O-乙酰高丝氨酸前体菌株大肠杆菌CJM-BTJA(pCJ-MetX-CL)于2007年7月5日保藏，登记号为KCCM-10873。

挑取单菌落接种于3mL含有壮观霉素的LB培养基，随后31℃培养5小时。培养液200倍稀释到含有25mL产甲硫氨酸前体培养基的250mL的锥形瓶中，随后31℃，200rpm，培养64小时。进行HPLC检测，比较甲硫氨酸前体生产能力(表2和表3)。结果，以不依赖甲硫氨酸的产L-苏氨酸菌株制备的产甲硫氨酸前体菌株的甲硫氨酸产量显著提高。

表1：甲硫氨酸前体产量实验的摇瓶培养基成份

成份	浓度(/L)
成份	浓度(/L)	葡萄糖	40g
硫酸铵	17g	葡萄糖	40g
硫酸铵	17g	KH₂PO₄	1.0g
MgSO₄·7H₂O	0.5g	KH₂PO₄	1.0g
MgSO₄·7H₂O	0.5g	FeSO₄·7H₂O	5mg
MnSO₄·8H₂O	5mg	FeSO₄·7H₂O	5mg
MnSO₄·8H₂O	5mg	ZnSO₄	5mg
碳酸钙	30g	ZnSO₄	5mg

酵母提取物	2g
酵母提取物	2g	甲硫氨酸	0.15g
苏氨酸	0.15g	甲硫氨酸	0.15g

表2：摇瓶培养的甲硫氨酸前体(O-乙酰高丝氨酸)产量

<2-2>大规模发酵

选择具有O-乙酰高丝氨酸生产能力的一些菌株，在5L发酵罐中培养以大量生产O-乙酰高丝氨酸。每个菌株都接种于含有壮观霉素的LB培养基，随后31℃培养过夜。接着挑取单菌落接种于10mL的含有壮观霉素的LB培养基，31℃培养5小时。培养液100倍稀释到含有200mL甲硫氨酸前体种子培养基的1000mL锥形瓶中，随后31℃，200rpm，培养3-10小时。培养液接种于5L发酵罐，进一步通过批次补料发酵继续培养20-100小时。通过HPLC检测发酵液中的甲硫氨酸前体浓度，结果见表4：

表3：甲硫氨酸前体产量检测的发酵培养基成份

成份	种子培养基	主培养基	补料培养基
成份	种子培养基	主培养基	补料培养基	葡萄糖(g/L)	10.1	40	600
MgSO₄7H₂O(g/L)	0.5	4.2		葡萄糖(g/L)	10.1	40	600
MgSO₄7H₂O(g/L)	0.5	4.2		酵母提取物(g/L)	10	3.2
KH₂PO₄	3	3	8	酵母提取物(g/L)	10	3.2
KH₂PO₄	3	3	8	硫酸铵(g/L)		6.3
NH₄Cl(g/L)	1			硫酸铵(g/L)		6.3
NH₄Cl(g/L)	1			NaCl(g/L)	0.5
Na₂HPO₄12H₂O(g/L)	5.07			NaCl(g/L)	0.5
Na₂HPO₄12H₂O(g/L)	5.07			DL-甲硫氨酸(g/L)		0.5	0.5
L-异亮氨酸(g/L)	0.05	0.5	0.5	DL-甲硫氨酸(g/L)		0.5	0.5
L-异亮氨酸(g/L)	0.05	0.5	0.5	L-苏氨酸(g/L)		0.5	0.5

表4：发酵罐中的甲硫氨酸前体产量

	O-乙酰高丝氨酸(g/L)
	O-乙酰高丝氨酸(g/L)	CJM-BTJA/pCJ-metXcgl-CL	＞55
CJM-BTJA/pCJ-metXdra-CL	＞75	CJM-BTJA/pCJ-metXcgl-CL	＞55
CJM-BTJA/pCJ-metXdra-CL	＞75	CJM-X/pthrA(M)-CL	＞80
CJM2-X/pthrA(M)-CL	＞90	CJM-X/pthrA(M)-CL	＞80

工业应用性

如前所述，用本发明的产甲硫氨酸前体菌株，甲硫氨酸的生产会比传统的甲硫氨酸化学合成法对环境友好。而且本发明菌株所产O-乙酰高丝氨酸转变的L-甲硫氨酸可以被广泛用于动物饲料和动物饲料添加剂产品，也可以用于人类食品和食品添加剂。

【序列表】

<110>CJ株式会社

<120>

<160>

<170>

<210>1

<211>71

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<223>扩增氯霉素的引物

<400>1

TTACTCTGGT GCCTGACATT TCACCGACA AAGCCCAGGG AACTTCATCA Cgtgtaggct ggagctgctt c

<210>2

<211>71

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<223>扩增氯霉素的引物

<400>2

TTACCCCTTG TTTGCAGCCC GGAAGCCATT TTCCAGGTCG GCAATTAAA Tcatatgaat atcctcctta g

<210>3

<211>72

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<223>扩增卡那霉素的引物

<400>3

AAAGAATATG CCGATCGGTT CGGGCTTAGG CTCCAGTGC CTGTTCGGTG Ggtgtaggct

ggagctgct tc

<210>4

<211>74

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<223>扩增卡那霉素的引物

<400>4

AGACAACCGA CATCGCTTTC AACATTGGCG ACCGGAGCC GGGAAGGCA AAcatatga

atatcctcc ttag

<210>5

<211>71

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<223>扩增氯霉素的引物

<400>5

atggctgaat ggagcggcga atatatcagc ccatacgctg agcacggcaa ggtgtaggct ggagctgctt

c

<210>6

<211>65

<212>DNA

<213>合成序列

<220>

<223>扩增氯霉素的引物

<400>6

gtattcccac gtctccgggt taatccccat ctcacgcatg atctccatat gaatatcctc cttag

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<223>扩增metJ基因的引物

<400>7

gggctttgtc ggtgaaatg

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<223>扩增metJ基因的引物

<400>8

actttgcgat gagcgagag

<210>9

<211>70

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<223>敲除metA基因的引物

<400>9

CAATTTCTTGCGTGAAGAAAACGTCTTTGTGATGACAACTTCTCGTGCGTgtgtaggctggagctgcttc

<210>10

<211>70

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<223>敲除metA基因的引物

<400>10

AATCCAGCGTTGGATTCATGTGCCGTAGATCGTATGGCGTGATCTGGTAGcatatgaatatcctccttag

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>耐辐射奇异球菌

<220>

<223>扩增metX基因的引物

<400>11

gggaattcCA Tatgaccgcc gtgctcgcg

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>耐辐射奇异球菌

<220>

<223>扩增metX基因的引物

<400>12

CCCAAGCTTt caactcctga gaaacgc

<210>13

<211>24

<212>DNA

<213>耻垢分枝杆菌

<220>

<223>扩增metX基因的引物

<400>13

CATATGacga tcatcgaaga acga

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>耻垢分枝杆菌

<220>

<223>扩增metX基因的引物

<400>14

AAGCTTtcac cgttgtgcaa gctc

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>铜绿假单胞菌

<220>

<223>扩增metX基因的引物

<400>15

CATATGacga tcatcgaaga acga

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>铜绿假单胞菌

<220>

<223>扩增metX基因的引物

<400>16

AAGCTTtcac cgttgtgcaa gctc

<210>17

<211>24

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<223>扩增metA基因的引物

<400>17

ccggaattcC TACGCCCCCA CATA

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<223>扩增metA基因的引物

<400>18

cggcggtcat AACCTGATTA CCTCA

<210>19

<211>25

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<223>扩增metA基因的引物

<400>19

caggagt tgaTCTTCTGTGATAGTC

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<223>扩增metA基因的引物

<400>20

ccggaattcACATTGGCGTTGAGC

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>耐辐射奇异球菌

<220>

<223>扩增metX基因的引物

<400>21

TAATCAGGTTatgaccgccgtgctc

<210>22

<211>24

<212>DNA

<213>耐辐射奇异球菌

<220>

<223>扩增metX基因的引物

<400>22

TCACAGAAGAtcaactcctgagaaa

<210>23

<211>27

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<223>扩增metA基因的引物

<400>23

ccggaattcC GCCAGATTCA GCAACGG

<210>24

<211>27

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<223>扩增metA基因的引物

<400>24

ccggaattcC CGCGAATTTT CCAATCA

<210>25

<211>32

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<223>扩增thrA基因的引物

<400>25

CTGGCAAAGC TTtcaaagga aaactccttc gt

<210>26

<211>32

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<223>扩增thrA基因的引物

<400>26

AGTCGTGATA TCatgcgagt gttgaagttc gg

<210>27

<211>820

<212>蛋白质

<213>大肠杆菌

<220>

<223>融合天冬氨酸激酶的高丝氨酸脱氢酶

<400>27

MRVLKFGGTSVANAERFLRVADILESNARQGQVATVLSAPAKITNHLVAMIEKTISGQDA

LPNISDAERIFAELLTGLAAAQPGFPLAQLKTFVDQEFAQIKHVLHGISLLGQCPDSINA

ALICRGEKMSIAIMAGVLEARGHNVTVIDPVEKLLAVGHYLESTVDIAESTRRIAASRIP

ADHMVLMAGFTAGNEKGELVVLGRNGSDYSAAVLAACLRADCCEIWTDVDGVYTCDPRQV

PDARLLKSMSYQEAMELSYFGAKVLHPRTITPIAQFQIPCLIKNTGNPQAPGTLIGASRD

EDELPVKGISNLNNMAMFSVSGPGMKGMVGMAARVFAAMSRARIFVVLITQSSSEYSISF

CVPQSDCVRAERAMQEEFYLELKEGLLEPLAVTERLAIISVVGDGMRTLRGISAKFFAAL

ARANINIVAIAQGSSERSISVVVNNDDATTGVRVTHQMLFNTDQVIEVFVIGVGGVGGAL

LEQLKRQQSWLKNKHIDLRVCGVANSKALLTNVHGLNLENWQEELAQAKEPFNLGRLIRL

VKEYHLLNPVIVDCTSSQAVADQYADFLREGFHVVTPNKKANTSSMDYYHQLRYAAEKSR

RKFLYDTNVGAGLPVIENLQNLLNAGDELMKFSGILSGSLSYIFGKLDEGMSFSEATTLA

REMGYTEPDPRDDLSGMDVARKLLILARETGRELELADIEIEPVLPAEFNAEGDVAAFMA

NLSQLDDLFAARVAKARDEGKVLRYVGNIDEDGVCRVKIAEVDGNDPLFKVKNGENALAF

YSHYYQPLPLVLRGYGAGNDVTAAGVFADLLRTLSWKLGV

<210>28

<211>23

<212>DNA

<213>麦氏钩端螺旋菌

<220>

<223>扩增metX基因的引物

<400>28

CATATGccta cctccgaaca gaa

<210>29

<211>26

<212>DNA

<213>麦氏钩端螺旋菌

<220>

<223>扩增metX基因的引物

<400>29

AAGCTTtcaa aggaaaactc cttcgt

<210>30

<211>20

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<220>

<223>扩增metX基因的引物

<400>30

CAT atgcccaccc tcgcgcc

<210>31

<211>25

<212>DNA

<213>谷氨酸棒状杆菌

<220>

<223>扩增metX基因的引物

<400>31

AAGCTT ttagatgtagaactcgatg

Claims

1.一种能够生产O-乙酰高丝氨酸的源自埃希氏菌属的微生物，其特征在于：

a)通过整合选自棒状杆菌属、钩端螺旋菌属、奇异球菌属、假单胞菌属或分枝杆菌属的基因，高丝氨酸O-乙酰转移酶活性(EC2.3.1.31)被引入并强化；

或b)天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶活性(EC2.7.2.4或1.1.1.3)被强化；

或c)a)和b)的结合。

2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，编码所述高丝氨酸O-乙酰转移酶的肽的基因选自谷氨酸棒状杆菌、麦氏钩端螺旋菌、耐辐射奇异球菌、铜绿假单胞菌或耻垢分枝杆菌。

3.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，编码所述高丝氨酸O-乙酰转移酶的肽的基因选自Unipro数据库编号为Q9RVZ8、NP_249081或YP_886028的基因。

4.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶的肽在345位氨基酸有一个突变。

5.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述天冬氨酸激酶或高丝氨酸脱氢酶的肽序列为SEQ ID NO 27。

6.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物源自产L-苏氨酸、L-异亮氨酸或L-赖氨酸的菌株。

7.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物为大肠杆菌。

8.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，γ-胱硫醚合成酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶或O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶被弱化或失活了。

9.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，高丝氨酸激酶被弱化或失活了。

10.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，甲硫氨酸合成途径的转录调节子被弱化或失活了。

11.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物源自不依赖甲硫氨酸的产苏氨酸菌株的大肠杆菌MF001，登记号为KCCM 10568。

12.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物源自产苏氨酸菌株的大肠杆菌FTR2533，登记号为KCCM 10541。

13.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物为产O-乙酰高丝氨酸的大肠杆菌CJM-X(pthrA(M)-CL)，登记号为KCCM 10921P。

14.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于，所述微生物为产O-乙酰高丝氨酸的大肠杆菌CJM2-X(pthrA(M)-CL)，登记号为KCCM 10925P。

15.一种产O-乙酰高丝氨酸的方法，包括：a)发酵根据权利要求1到14中任一权利要求所述的微生物；b)在培养基中或微生物体内富集O-乙酰高丝氨酸；和c)分离O-乙酰高丝氨酸。