BRPI0900742B1

BRPI0900742B1 - micro-organismo e método para produção de o-acetil-homosserina.

Info

Publication number: BRPI0900742B1
Application number: BRPI0900742A
Authority: BR
Inventors: Ii Seo Chang; Ha Kim Chul; Jin Lee Han; Won Um Hye; Kyung Heo In; Sook Chang Jin; Ho Na Kwang; Young Kim So; Uk Shin Young; Wook Cho Young
Original assignee: Cj Cheiljedang Corp
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2009-04-06
Publication date: 2020-04-14
Also published as: JP2010000075A; JP5339996B2; CN101629160A; PL2108693T3; BRPI0900742A2; US20090253186A1; EP2108693B1; US20110207184A1; EP2108693A2; CN101629160B; US9005952B2; US8465952B2; ES2537790T3; EP2108693A3

Abstract

micro-organismo que produz precursor de l-metionina e método para produção do precursor de l-metionina usando o micro-organismo. a presente invenção refere-se a um micro-organismo produtor do precursor de l-metionina, 0-acetil-homosserina, e um método para produção do precursor de l-metionina usando o micro-organismo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MICROORGANISMO E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE O-ACETILHOMOSSERINA.

Antecedentes

Metionina é um dos aminoácidos essenciais do corpo humano que têm sido largamente usados como aditivos em ração e alimentos e, além disso, usada como uma matéria-prima sintética para soluções médicas e suprimentos médicos. Metionina age como um precursor de compostos tais como colina (lecitina) e creatina e ao mesmo tempo é usada como uma matéria-prima sintética para cisteína e taurina. Metionina também pode fornecer enxofre. S-adenosil-metionina é derivada da L-metionina e desempenha certo papel no fornecimento de grupo metila no corpo humano e também está envolvida na síntese de vários neurotransmissores no cérebro. Metionina e/ou S-adenosil-L-metionina (SAM) inibem o acúmulo de gordura no fígado e artérias e aliviam depressão, inflamação, doença hepática, e dor muscular, etc.

As funções da metionina e/ou S-adenosil-L-metionina in vivo conhecidas até agora são as seguintes.

1) Inibe o acúmulo de gordura no fígado e artérias promovendo metabolismo de lipídios e melhora a circulação sanguínea no cérebro, coração e rins (J Hepatol. Jeon BR et al., 2001 Mar; 34(3): 395-401).

2) Promove digestão, desintoxicação e excreção de substâncias tóxicas e excreção de metais pesados, tais como Pb.

3) Pode ser administrada como um agente antidepressivo na dosagem de 800 a 1.600 mg/dia (Am J Clin Nutr. Mischoulon D. et al., 2002 Nov; 76(5): 1158S-61S).

4) Potencializa funções hepáticas (FASEB J. Mato JM., 2002 Jan; 16 (1): 15-26) e particularmente é eficaz na doença hepática causada pelo álcool (Cochrane Database Syst Rev., Rambaldi A., 2001; (4): CD002235).

5) Tem efeito anti-inflamatório sobre ossos e artropatias e pro-

Petição 870180009355, de 02/02/2018, pág. 8/16 move a recuperação óssea (ACP J Club. Sander 0., 2003 Jan-Feb; 138(1): 21, J Fam Pract., Soeken KL etal., 2002 May; 51(5): 425-30).

6) É um nutriente essencial para o cabelo. Fornece nutrição ao cabelo e por meio disso previne a perda de cabelo (Audiol Neurootol., Lockwood DS et al., 2000 Sep-Oct; 5(5): 263-266).

Metionina pode ser quimicamente ou biologicamente sintetizada para ser aplicada em ração, alimentos e medicamentos.

Na síntese química, a metionina é majoritariamente produzida pela hidrólise de 5-(p-metilrnercaptoetil)-hidantoína. A metionina quimicamente sintetizada tem uma desvantagem de ser produzida somente como uma mistura das formas tipo L e tipo D.

Na síntese biológica, a metionina é produzida pelo método usando proteínas envolvidas na síntese de metionina. L-metionina é biossintetizada a partir da homosserina pela ação da enzima expressa por genes como metA, metB, metC, metE e metH, em E.coli. Particularmente, metA é o gene que codifica a homosserina O-succiniltransferase que é a primeira enzima necessária para a biossíntese de metionina, e converte homosserina em O-succinil-L-homosserina. O-succinil-homosserina liase ou cistationina gama sintase codificada pelo gene metB converte O-succinil-L-homosserina em cistationina. Cistationina beta liase codificada pelo gene metC converte cistationina em L-homocisteína. MetE codifica a metionina sintase independente de cobalamina e metH codifica metionina sintase dependente de cobalamina, ambas as quais convertem L-homocisteína em L-metionina. Neste momento, 5,10-metilenotetra-hidrofolato redutase codificado por metF e serina hidroximetiltransferase codificada por glyA colaboram para sintetizar N(5)-metiltetra-hidrofolato fornecendo o grupo metila necessário para a síntese de L-metionina.

L-metionina é sintetizada por uma série de reações orgânicas pelas enzimas supracitadas. A modificação genética nas proteínas supracitadas ou outras proteínas afetando a proteína supracitada podería resultar no aumento da síntese de L-metionina. Por exemplo, a publicação de patente japanesa aberta à inspeção pública N° 2000/139471 descreve um método para a produção de L-metionina com Escherichia sp. das quais os genes thrBC e metJ estão deletados no genoma, metBL é superexpresso e metK é substituído por um mutante hipomórfico. Também, a publicação de patente US N° US2003/0092026 A1 descreve um método usando micro-organismo com metD inativado(inibidor de síntese de L-metionina) pertencente a Corynerbacterium sp. A publicação de patente US N° US2002/0049305 descreve um método para aumentar a produção de L-metionina através do aumento da expressão da 5,10-metilenotetra-hidrofolato redutase (metF).

A metionina produzida pelo método biológico é do tipo L, que tem vantagens, mas a quantidade produzida é muito pequena. Isto porque a via biossintética da metionina tem sistemas de retrorregulação muito limitados. Uma vez que a metionina é sintetizada a um determinado nível, o produto final metionina inibe a transcrição do gene metA que codifica a proteína primária para início da biossíntese da metionina. A superexpressão do próprio gene metA não pode aumentar a produção de metionina porque o gene metA é suprimido pela metionina na etapa de transcrição e logo degradado pelas proteases intracelulares na etapa de tradução (Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan and Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443). Por isso, muitas das patentes prévias estiveram concentradas em como livrar o gene metA do seu sistema de retrorregulação (W02005/108561, WO1403813).

A publicação de patente US N° US2005/0054060A1 descreve um método para sintetizar homocisteína ou metionina através da cistationina sintase modificada (O-succinil-homosserina liase) que usa metilmercaptana (CH3SH) ou sulfeto de hidrogênio (H₂S) diretamente como uma fonte de enxofre não cisteína. Entretanto, é bem entendido por aqueles na técnica que cistationina sintase pode ligar vários precursores de metionina nas células e por meio disso produzir o subproduto em um alto nível. Por exemplo, foi relatado que a cistationina sintase acumula altos níveis de homolantionina através da reação secundária de O-succinil-homosserina e homocisteína (J.Bacteriol (2006) vol 188:p609-618). Por isso, a superexpressão da cistati onina sintase pode reduzir a eficiência da reação intracelular devido ao aumento da sua reação secundária. Além disso, este método tem muitas desvantagens. Este processo usa vias metabólicas intracelulares que têm reações secundárias e sistemas de retrorregulação. Este processo também usa H2S ou CH₃SH que tem uma citotoxicidade celular severa. Portanto, o rendimento da produção de metionina é comparativamente pequeno.

Para resolver estes problemas, o presente inventor desenvolveu um processo compreendendo duas etapas; a primeira etapa para produção do precursor de L-metionina por fermentação em E.coli; e a segunda etapa de conversão do precursor de L-metionina em L-metionina através de reação enzimática (PCT/KR2007/003650). Este processo de duas etapas pode resolver os problemas supracitados, tais como citotoxicidade dos sulfetos, retrorregulação através da metionina e SAMe, decomposição do produto intermediário por enzimas intracelulares (por exemplo, cistationina gama sintase, O-succinil-homosserina sulfidrilase e O-acetil-homosserina sulfidrilase). Além disso, contra o método químico sintético de metionina que produz mistura de formas D-metionina e L-metionina, 0 processo de duas etapas é muito eficiente para produção somente de L-metionina seletivamente.

Neste processo de duas etapas, 0 rendimento da produção do precursor de metionina é um dos fatores-chave para o aumento do rendimento da produção de metionina. Para aumentar o rendimento sintético do precursor de metionina, O-acetil-homosserina, uma boa combinação de aspartoquinase potente, homosserina transferase e O-acetil-homosserina transferase é realmente importante. No antecedente supracitado, os presentes inventores construiram a cepa produtora do precursor de L-metionina a que é caracterizada pelo seguinte; a) a atividade da homosserina Oacetiltransferase (EC2.3.1.31) é introduzida e potencializada pela integração de genes selecionados de corynebacterium sp., Leptospira sp., Deinococcus sp., Pseudomonas sp., ou Mycobacterium sp.;

ou b) a atividade da aspartoquinase ou homosserina desidrogenase (EC2.7.2.4 ou 1.1.1.3) é potencializada, ou c) combinação de a) e b).

Sumário

A presente invenção fornece um micro-organismo produtor do precursor de L-metionina e um método para a produção do precursor de Lmetionina usando o micro-organismo.

Mais particularmente, a presente invenção fornece uma cepa produtora do precursor de L-metionina que é caracterizada pelo seguinte; a) a atividade da homosserina O-acetiltransferase (EC2.3.1.31) é introduzida e potencializada pela integração de genes selecionados a partir de corynebacterium sp., Leptospira sp., Deinococcus sp., Pseudomonas sp., ou Mycobacterium sp.;

ou b) a atividade da aspartoquinase ou homosserina desidrogenase (EC2.7.2.4 ou 1.1.1.3) é potencializada, ou c) combinação de a) e b), e um método para a produção do precursor de L-metionina usando a cepa.

Breve Descrição dos Desenhos

A aplicação das modalidades preferenciais da presente invenção é melhor entendida com referência aos desenhos anexados, em que:

Figura 1 é um diagrama que ilustra a manipulação genética da cepa produtora do precursor da metionina.

Figura 2 é um diagrama que ilustra estruturas químicas do processo de 2 etapas para a produção de metionina.

Figura 3 é um diagrama esquemático de pCJ-MetX-CL para a expressão do gene metX.

Descrição Detalhada

De acordo com um aspecto da mesma, a presente invenção é direcionada a uma cepa produtora do precursor de L-metionina caracterizada pelo seguinte; a) a atividade da homosserina O-acetiltransferase (EC2.3.1.31) é introduzida e potencializada pela integração de genes selecionados a partir de corynebacterium sp., Leptospira sp., Deinococcus sp., Pseudomonas sp., ou Mycobacterium sp.', ou b) a atividade da aspartoquinase ou homosserina desidroge6 nase (EC2.7.2.4 ou 1.1.1.3) é potencializada, ou c) combinação de a) e b).

e um método para a produção do precursor de L-metionina usando a cepa.

O termo precursor de L-metionina é definido como metabolitos que são partes da via metabólica específica da metionina ou podem ser derivados destes metabolitos. Particularmente, o precursor de L-metionina como usado neste pedido refere-se a uma O-acetil-homosserina.

O termo cepa produtora do precursor de L-metionina, como usado neste pedido refere-se a uma cepa de micro-organismos procarióticos ou eucarióticos que é capaz de acumular o precursor de L-metionina através da manipulação de acordo com a presente invenção. Por exemplo, a cepa pode ser selecionada a partir do grupo composto de micro-organismos ou fungos ou leveduras Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacteria sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Salmonellar sp., Brevibacteria sp., Hypomononas sp., Chromobacterium sp. e Norcardia sp. Preferencialmente, micro-organismos Escherichia sp., Corynebacterium sp., Leptospira sp. e leveduras podem ser usados para produção da O-acetilhomosserina. Mais preferencialmente, os micro-organismos Escherichia sp. podem ser usados, e ainda mais preferencialmente Escherichia coli (a seguir referida como E.coli) podem ser usados.

Em várias modalidades, a presente invenção fornece uma cepa produtora do precursor de L-metionina na qual um gene envolvido na decomposição de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina autênticas é deletado ou enfraquecido e em vez disso um gene envolvido na síntese de O-acetil-homosserina é introduzido ou potencializado. A presente invenção também fornece seletivamente uma cepa na qual a via de biossíntese da treonina está bloqueada ou atenuada para potencializar a produção da Oacetil-homosserina. A presente invenção fornece ainda uma cepa em que a homosserina O-acetiltransferase livre do sistema de retrorregulação é introduzida, superexpressa ou tem atividade potencializada. A presente invenção fornece ainda uma cepa na qual aspartoquinase ou homosserina desidroge nase estão superexpressas ou com atividade potencializada. A presente invenção também fornece uma cepa em que homosserina O-acetiltransferase livre do sistema de retrorregulação é introduzida, superexpressa ou tem atividade potencializada e aspartoquinase ou homosserina desidrogenase estão superexpressas ou com atividades potencializadas.

Mais particularmente, a presente invenção fornece uma cepa produtora do precursor de L-metionina através da deleção do gene metB envolvido na decomposição do precursor de L-metionina, do gene thrB envolvido na via de biossíntese da treonina e do gene metJ que regula a transcrição de genes para a produção do precursor de L-metionina. A presente invenção também fornece uma cepa produtora do precursor de L-metionina através da inativação do metA autêntico ou do gene metX envolvido na síntese do precursor de metionina e através da introdução de metX exógeno. A presente invenção também fornece uma cepa produtora do precursor de Lmetionina potencializando a atividade codificada pelo gene thrA.

Mais preferencialmente, a presente invenção também fornece uma cepa produtora do precursor de L-metionina através da inativação do metA autêntico ou do gene metX envolvido na síntese do precursor de metionina e introduzindo o gene metX exógeno livre do sistema de retrorregulação potencializando a atividade codificada pelo gene thrA.

Na presente invenção, inativação como usado neste pedido refere-se a uma deleção ou enfraquecimento do gene. Uma deleção do gene é realizada através da remoção de uma região do gene ou modificação da sequência proteica através da introdução de uma sequência gênica específica no cromossomo. O termo atenuação ou enfraquecimento neste contexto descreve a redução ou a eliminação da atividade intracelular de uma ou várias enzimas (proteínas) em um micro-organismo que são codificadas pelo DNA correspondente, por exemplo, através da redução da atividade da proteína pela modificação de uma região promotora do gene e a sequência de nucleotídeos de 5'-UTR ou através da introdução de mutação na região ORF do gene alvo. Através de medidas de atenuação, a atividade ou concentração da proteína correspondente está reduzida em geral de 0 a 75%, 0 a

50%, 0 a 25%, 0 a 10% ou 0 a 5% da atividade ou concentração da proteína de tipo selvagem, ou atividade ou concentração da proteína no microorganismo inicial.

Para realizar uma atenuação, por exemplo, a expressão do gene ou as propriedades catalíticas das proteínas enzimas podem ser reduzidas ou eliminadas. As duas medidas podem ser opcionalmente combinadas.

A redução na expressão gênica pode ocorrer através de cultivo adequado, por modificação gênica (mutação) das estruturas de sinalização da expressão gênica ou também pela técnica de RNA antissenso. Estruturas de sinalização da expressão gênica são, por exemplo, genes repressores, genes ativadores, operadores, promotores, atenuadores, sítios de ligação a ribossomos, o códon de iniciação e terminadores. O perito pode encontrar informação neste aspecto, inter alia, por exemplo, em Jensen e Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 195 (1998)), em Carrier e Keasling (Biotechnology Progress 15: 58 64 (1999)), Franch e Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159 164 (2000)) e em livros-texto de genética e biologia molecular conhecidos, tais como, por exemplo, livro-texto de Knippers (Molecular Genetics, 6th edition, 1995) ou de Winnacker (Genes and Clones, 1990).

Mutações que levam a uma modificação ou redução nas propriedades catalíticas das proteínas enzima são conhecidas na técnica anterior. Exemplos que podem ser mencionados são os trabalhos de Qiu e Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611 8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95: 5511 5515 (1998)), e Wente and Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833 20839 (1991)). Descrições resumidas podem ser encontradas em livros-texto de genética e biologia molecular conhecidos, tais como, por exemplo, por Hagemann (General Genetics, 1986).

Mutações possíveis são transições, transversões, inserções e deleções. Dependendo do efeito da troca de aminoácido na atividade da enzima, as mutações de sentido trocado ou as mutações sem troca de sentido são referidas. Inserções ou deleções de pelo menos um par de bases em um gene levam a mutações da fase de leitura, que levam a incorporação de aminoácidos incorretos ou interrupção prematura da tradução. Se um códon de parada for formado na região de codificação como consequência da mutação, isto também leva a um término prematuro da tradução. Deleções de vários códons levam tipicamente a uma perda completa da atividade enzimática. Instruções sobre a geração de tais mutações é técnica anterior e podem ser encontradas em livros-texto de genética e biologia molecular conhecidos, tais como, por exemplo, o livro-texto de Knippers (Molecular Genetics, 6th edition, 1995), de Winnacker (Genes and Clones, 1990) ou de Hagemann (General Genetics, 1986).

Mutações adequadas nos genes, tais como, por exemplo, mutações delecionais, podem ser incorporadas em cepas adequadas através de substituição gênica ou alélica.

Na presente invenção, o termo potencialização descreve o aumento na atividade intracelular de uma enzima que é codificada pelo DNA correspondente. A potencialização da atividade intracelular de uma enzima pode ser alcançada através da superexpressão do gene. Superexpressão do gene alvo pode ser alcançada através da modificação da região promotora do gene ou da sequência de nucleotídeos da região 5' não traduzida. Superexpressão do gene alvo também pode ser alcançada através da introdução da cópia extra do gene objetivo no cromossomo pela transformação da cepa hospedeira com o vetor contendo o gene alvo com um promotor, ou através da introdução da mutação que pode aumentar a expressão no gene alvo. A potencialização da atividade intracelular de uma enzima também pode ser alcançada através da introdução da mutação na região ORF do gene alvo. Através de medidas de potencialização, a atividade ou concentração da proteína correspondente é, em geral, aumentada em pelo menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, até um máximo de 1000% ou 2000%, com base naquela da proteína de tipo selvagem ou na atividade ou concentração da proteína no micro-organismo inicial.

Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o método para preparação de uma cepa produtora do precursor de L-metionina é como se segue;

Na etapa 1, um gene que codifica proteínas tais como cistationina gama sintase, O-succinil-homosserina sulfidrilase ou O-acetil-homosserina sulfidrilase é deletado ou enfraquecido em uma cepa a fim de acumular o precursor de L-metionina, tal como O-succinil-homosserina ou O-acetilhomosserina.

O gene que codifica a cistationina gama sintase é indicado como metB, o gene que codifica a O-succinil-homosserina sulfidrilase é indicado como metZ, e o gene que codifica O-acetil-homosserina sulfidrilase é indicado como metY. Um gene que codifica a proteína que tem a atividade supracitada é exemplificado por metB em Escherichia coli. A sequência genômica do gene pode ser obtida da sequência genômica de E. coli (Número de acesso AAC75876) informado no relatório prévio (Blattner et. al., Science 277: 1453-1462 (1997)). A sequência gênomica supracitada também pode ser obtida no NCBI (National Center for Biotechnology Information) e DDBJ (DNA Data Bank Japan). Outros genes que têm a mesma atividade são exemplificados por metB e metY derivados de Corynebacterium, e metZ derivado de Pseudomonas.

Cistationina gama sintase ou O-succinil-homosserina sulfidrilase ou O-acetil-homosserina sulfidrilase têm atividade de conversão de Osuccinil-homosserina ou O-acetil-homosserina em cistationina ou homocisteína como mostrado nas fórmulas de reação seguintes. Por isso, se um gene que tem esta atividade é deletado ou enfraquecido, O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina é excessivamente acumulado na solução da cultura.

L-cisteína + O-succinil-L-homosserina <=> succinato + cistationina

L-cisteína + O-acetil-L-homosserina <=> acetato + cistationina HS' + O-succinil-L-homosserina <=> succinato + homocisteína HS' + O-acetil-L-homosserina <=> acetato + homocisteína

Na etapa 2, o gene thrB de codificação da homosserina quinase na cepa preparada na etapa 1 é deletado ou enfraquecido. O gene thrB está envolvido na síntese de O-fosfo-homosserina a partir de homosserina, que então é convertida em treonina pelo gene thrC. O gene thrB é deletado ou enfraquecido a fim de usar toda homosserina produzida para a síntese do precursor de metionina.

Na etapa 3, um regulador de transcrição da via sintética da metionina é deletado ou enfraquecido. Os genes metA, metB, metC, metE, e metF envolvidos na síntese de metionina são reprimidos pelo sistema de retrorregulação. O gene metJ é um gene regulador de transcrição típico em E.coli. Para permitir que o gene metA ou metX seja superexpresso para síntese do precursor de metionina, metJ precisa ser deletado. Então, o gene metJ é eliminado em E. coli, a expressão gênica de metA ou metX é aumentada continuamente, levando à produção em massa do precursor de Lmetionina.

As etapas 2 e 3 supracitadas podem ser modificadas ou eliminadas de acordo com a cepa produtora do precursor. Entretanto, pode ser mais preferencialmente realizado para potencializar a via de produção do precursor no micro-organismo da Escherichia sp.

Na etapa 4, o gene metX que codifica homosserina O-acetiltransferase que medeia o primeiro processo da via de biossíntese da metionina é introduzido a fim de aumentar a síntese de O-acetil-homosserina, precursor de L-metionina. MetX é uma designação comum do gene que codifica a proteína que tem a atividade da homosserina O-acetiltransferase, e uma nova homosserina O-acetiltransferase exógena pode ser obtida de várias espécies de micro-organismo. Por exemplo, o peptídeo homosserina Oacetiltransferase é codificado pelos genes selecionados a partir da corynebacterium sp., Leptospira sp., Deinococcus sp., Pseudomonas sp., ou Mycobacterium sp. Preferencialmente, o peptídeo homosserina O-acetiltransferase é codificado pelos genes selecionados a partir da corynebacterium glutamicum, Leptospira meyeri, Deinococcus radiodurans, Pseudomonas aeruginosa, ou Mycobacterium smegmatis. Mais preferencialmente, o peptídeo homosserina O-acetiltransferase é codificado pelos genes selecionados a partir do banco de dados Unipro N° Q9RVZ8 {Deinococcus radiodurans),

NP_249081 (Pseudomonas aeruginosa), ou YP_886028 (Mycobacterium smegmatis). O gene metX de leptospira meyeri foi conhecido como resistente à retrorregulação (J Bacteriol. 1998 Jan; 180(2):250-5. Belfaiza J et al.) e várias homosserina O-acetiltransferases foram confirmadas antes como resistentes à retrorregulação no laboratório.

A introdução e a potencialização do gene metX podem ser realizadas pela introdução do gene ou pela modificação de uma região promotora do gene e a sequência de nucleotídeos 5'-UTR ou por introdução de mutação na região ORF do gene alvo. A potencialização da expressão gênica do metX resulta no aumento da síntese do precursor de metionina.

Na etapa 5, aspartoquinase ou homosserina desidrogenase têm atividade potencializada a fim de aumentar a síntese da homosserina que é o precursor de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina. ThrA é uma designação comum do gene que codifica o peptídeo que tem atividade de aspartoquinase e homosserina desidrogenase. Preferencialmente, uma aspartoquinase e homosserina desidrogenase codificada pelo gene do banco de dados Unipro No: AP 000666. Mais preferencialmente, a sequência de aminoácidos codificada pelo gene thrA é representada na SEQ. ID. NO: 27 que tem mutação no aminoácido na posição 345. Potencialização da atividade thrA é realizada através da introdução a mutação no gene thrA ou pela introdução adicional do gene alvo no cromossomo ou pela introdução adicional do plasmídeo processado.

O-acetil-homosserina que é a precursora de L-metionina, pode ser acumulada em uma cepa tirando partido de uma parte ou do processo inteiro supracitado da etapa 1 à etapa 5.

A cepa produtora do precursor de L-metionina pode ser preparada a partir da cepa produtora L-lisina, L-treonina ou L-isoleucina. Preferencialmente, pode ser preparada pelo uso da cepa produtora de L-treonina. Com esta cepa, a síntese de homosserina é mais fácil e a produção do precursor de metionina é consequentemente aumentada. Então, o precursor de metionina pode ser acumulado através da deleção ou enfraquecimento de um gene envolvido na via de biossíntese da treonina e em seguida os genes metA ou metY ou MetZ, usando a cepa produtora de L-treonina. É mais preferencial deletar ou enfraquecer o gene thrB primeiro e então metB, metY ou metZ para sintetizar o precursor de metionina. No mesmo período, a potencialização da expressão gênica do metX resulta no aumento da síntese do precursor de metionina.

O termo, cepa produtora de L-treonina da invenção refere-se a uma cepa de micro-organismo procariótico ou eucariótico que é capaz de produzir L-treonina in vivo. Por exemplo, a cepa pode estar incluída na cepa de micro-organismo produtora de L-treonina que pertence a Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacterium sp. e Brevibacterium sp. Entre estes, micro-organismo Escherichia sp. é preferencial e Escherichia coli é mais preferencial.

Em uma modalidade preferencial da presente invenção, CJM002, a cepa produtora de L-treonina e a cepa independente da Lmetionina transformada a partir de TF4076 (KFCC 10718, Korean Patent N° 92-8365), a cepa de E. coli mutante produtora de L-treonina, foi usada. TF4076 que necessita de metionina, e é resistente a análogos metionina (por exemplo, ácido α-amino-hidróxi-valérico, AHV), análogos de lisina (por exemplo, S-(2-aminoetil)-L-cisteína, AEC), e análogos de isoleucina (por exemplo, ácido α-aminobutílico). TF4076 não é capaz de sintetizar metionina in vivo porque é a cepa que necessita de metionina. Para uso desta cepa como a cepa produtora do precursor de metionina da invenção livre da necessidade de metionina, os presentes inventores prepararam a cepa produtora de L-treonina E. coli CJM002 livre da necessidade de metionina através da mutação artificial usando NTG. E. coli CJM002 foi denominado como Escherichia coli MF001 e depositado no KCCM ((Korean Culture Center of Microorganism, Eulim Buld., Hongje-1-Dong, Seodaemun-Ku, Seoul, 361-221, Korea) em 9 de abril de 2004 (Número de acesso KCCM-10568). Na presente invenção, o genes metB, thrB, metJ e metA da E.coli CJM002 foram deletados, então o gene metX foi introduzido no locus do metA. O precursor da cepa produtora do precursor de L-metionina resultante construída usando E.coli CJM002 foi denominada CJM-X. O gene metX da cepa CJM-X foi de rivado de D.radiodurans. A cepa CJM-X foi transformada com o vetor de expressão thrA, e foi denominada CJM-X(pthrA (M)-CL).

Escherichia coli CJM-X (pthrA (M)-CL), cepa produtora da O-acetil-homosserina, preparada pelo método supracitado foi depositada em 23 de janeiro de 2008, com Número de acesso KCCM 10921P.

Em outra modalidade preferencial da presente invenção, FTR2533 que é a cepa produtora de L-treonina descrita em PCT/KR2005/00344 foi usada. FTR2533 foi derivada a partir de Escherichia coli TFR7624 que foi derivada a partir da Escherichia coli Número de acesso KCCM 10236. E a Escherichia coli Número de acesso KCCM 10236 que foi derivada a partir de Escherichia coli TF4076. Escherichia coli Número de acesso KCCM 10236 é capaz de expressar níveis mais altos dos genes ppc que catalisam a formação de oxaloacetato a partir de PEP e as enzimas necessárias para a biossíntese da treonina a partir de aspartato, por exemplo, thrA: aspartoquinase 1-homosserina desidrogenase, thrB: homosserina quinase, thrC: treonina sintase, por meio disso permitindo um aumento na produção de L-treonina. E Escherichia coli FTR7624 (KCCM10538) tem um gene tyrR inativado que reverte a expressão do gene tyrB necessária para a biossíntese da L-treonina. E Escherichia coli FTR2533 (KCCM10541) é a cepa produtora de L-treonina que tem um gene gaIR inativado, a cepa E. coli produtora de L-treonina mutante.

Na presente invenção, os genes metB, thrB, metJ e metA da E.coli FTR2533 foram deletados, então o gene metX foi introduzido no locus de metA. O resultado da cepa produtora do precursor de L-treonina construída utilizando E.coli FTR2533 foi denominado CJM2-X. O gene metX da cepa CJM2-X foi derivado de D.radiodurans. A cepa CJM2-X foi transformada com o vetor de expressão thrA, efoi denominada CJM2-X (pthrA(M)-CL).

A Escherichia coli CJM2-X (pthrA(M)-CL) foi depositada em 12 de fevereiro de 2008, com Número de acesso KCCM 10925P.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para produção do precursor de L-metionina, o método compreendendo: a) fermentação dos micro-organismos supracitados; b) enriquecimento do pre cursor de L-metionina no meio ou nos micro-organismos; e c) isolamento do precursor de L-metionina.

A cultura da cepa produtora do precursor de L-metionina preparada acima pode ser realizada através de um meio próprio e condições conhecidas por aqueles versados na técnica. É bem entendido por aqueles versados na técnica que o método de cultura pode ser usado facilmente através de ajustes, de acordo com a cepa selecionada. Por exemplo, o método de cultura inclui, mas não está limitado a, batelada, cultura contínua e batelada alimentada. Vários métodos de cultura são descritos na seguinte referência: Biochemical Engineering por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.

O meio tem que reune as condições de cultura para uma cepa específica. Uma variedade de meios de cultura para micro-organismo é descrita na seguinte referência: Manual of Methods for General Bacteriology pela American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981. Aqueles meios incluem várias fontes de carbono, fontes de nitrogênio e elementos-traço. A fonte de carbono é exemplificada através de carboidrato, tal como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido, celulose; gordura, tal como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácido graxo, tal como ácido palmítico, ácido esteárico, e ácido linoleico; álcool, tal como glicerol e etanol; e ácido orgânico, tal como ácido acético. Um destes compostos ou mistura dos mesmos podem ser usados como uma fonte de carbono. A fonte de nitrogênio é exemplificada por essa fonte de nitrogênio orgânico como peptona, extrato de levedura, molho de carne, extrato de malte, água de maceração de milho (CSL) e farinha de feijão e fonte de nitrogênio inorgânico como ureia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. Um destes compostos ou mistura dos mesmos podem ser usados como uma fonte de nitrogênio. O meio neste pedido pode adicionalmente incluir o di-hidrogeno fosfato potássico, hidrogeno fosfato dipotássico e sais que contêm somente correspondentes como uma fonte de fosfato. O meio também pode incluir um sal metálico, tal como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro. Além disso, aminoáci16 dos, vitaminas e precursores apropriados podem ser acrescentados também.

* Os meios ou precursores podem ser adicionados por batelada ou continuamente à cultura.

O pH da cultura pode ser ajustado durante o cultivo através da adição de modo apropriado de um composto tal como hidróxido de amônio, hidróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico. A geração de bolhas de ar pode ser inibida durante o cultivo através do uso de um agente antiespumante, tal como poliglicol éster de ácido graxo. Para manter a condição aeróbica da cultura, oxigênio ou gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) pode ser injetado na cultura. A temperatura da cultura é convencionalmente de 20 a 45°C, preferencialmente de 25 a 40°C. O período do cultivo pode ser continuado até a produção do precursor de L-metionina alcançar um nível procurado, e o tempo preferencial de cultivo é de 10 a 160 horas. Exemplificação

Modalidades práticas e atualmente preferenciais da presente invenção são ilustrativas como mostrado nos seguintes Exemplos que são apresentados para ilustrar, mas não devem ser interpretados como limite da presente invenção. Será avaliado que os versados na técnica, na consideração desta descrição, podem fazer modificações e melhorias dentro do espíri20 to e escopo da presente invenção.

Exemplo 1: Construção de uma cepa produtora do precursor da metionina <1-1 > Deleção de gene metB

Para deletar o gene metB que codifica a cistationina sintase em cepa de E. coli, PCR para FRT de deleção em uma etapa foi realizado 25 (PNAS (2000) νοΙ97: P6640-6645). Iniciadores de SEQ. ID. NO: 1 e NO: 2 foram usados para PCR usando o vetor pKD3 (PNAS (2000) vol97: P66406645) como um molde, resultando na construção do cassete de deleção. PCR foi realizada como se segue; 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 1 mi30 nuto.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0%, seguido pela purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,2 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi eletroporado em E. coli (K12) W3110 transformada com o vetor pKD46 (PNAS (2000) νοΙ97: P6640-6645). Antes da eletroporação, W3110 transformada com pKD46 foi cultivada a 30°C em meio LB que contém 100 pg/L de ampicilina e 5 mM de L-arabinose até que D0₆oo alcançasse 0,6. Então, a cepa cultivada foi lavada duas vezes com água destilada esterilizada e mais uma vez com glicerol 10%. Eletroporação foi realizada a 2500 V. A cepa recuperada foi inoculada na placa de meio LB contendo 25 pg/L de cloranfenicol, seguido pelo cultivo a 37°C durante a noite. Então, a cepa exibindo resistência ao cloranfenicol foi selecionada.

PCR foi realizada usando a cepa selecionada como um molde com os iniciadores N°s 1 e 2 sob a mesma condição. A deleção do gene metB foi identificada através da confirmação do tamanho do gene de 1,2 kb em gel de agarose 1,0%. A cepa então foi transformada com o vetor pCP20 (PNAS (2000) vol97: P6640-6645) e cultivada em meio LB para eliminar o gene marcador de cloranfenicol. A cepa final com metB inativado foi construída na qual o tamanho do gene metB foi reduzido a 150 bp em gel de agarose 1,0% através de PCR sob as mesmas condições. A cepa construída foi denominada W3-B.

<1-2> Deleção de gene thrB

Os inventores tentaram aumentar a síntese de O-acetilhomosserina a partir da homosserina pela deleção do gene thrB que codifica homosserina quinase. Particularmente, quando a cepa produtora de treonina é usada como um hospedeiro de produção de O-acetil-homosserina, a deleção do gene thrB é necessária porque a conversão de homosserina a Ofosfo-homosserina por este gene é muito forte. Para deletar o gene thrB na cepa W3-B construída acima, PCR para FRT de deleção em uma etapa foi realizada da mesma maneira que a descrita acima para a deleção do gene metB.

Para construir o cassete de deleção thrB, PCR foi realizada usando vetor pKD4 (PNAS (2000) νοΙ97: P6640-6645) como um molde com iniciadores de SEQ. ID. NO: 3 e NO: 4 como se segue; 30 ciclos de desnatu ração a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto. O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0%, seguido pela purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,6 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi eletroporado na cepa W3-B transformada com o vetor pKD46. A cepa recuperada foi inoculada na placa de meio LB contendo 50 pg/L de canamicina, seguido pelo cultivo a 37°C durante a noite. Então, uma cepa exibindo resistência foi selecionada.

PCR foi realizada usando a cepa selecionada como um molde com iniciadores de SEQ. ID. NO: 3 e NO: 4 sob as mesmas condições conforme o supracitado. A deleção do gene ThrB foi identificada através da seleção da cepa cujo tamanho é 1,6 kb em gel de agarose 1,0%. A cepa foi então transformada com o vetor pCP20 e cultivada em meio LB. A cepa final com o gene inativado thrB foi construída na qual o tamanho do gene thrB foi reduzido a 150 kb em gel de agarose 1,0% por PCR sob as mesmas condições. Foi confirmado que o marcador de canamicina foi eliminado. A cepa construída foi denominada W3-BT.

<1-3> Deleção de gene metJ

Para deletar o gene metJ que é o gene regulador do gene metA envolvido na síntese do precursor de metionina, PCR para FRT de deleção em uma etapa foi realizada da mesma maneira como usada para a deleção do gene metB.

Para construir um cassete de deleção metJ, PCR forem realizados com iniciadores de SEQ. ID. NO: 5 e NO: 6 como se segue; 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0%, seguido pela purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,2 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi eletroporado na cepa W3-BT transformada com o vetor pKD46. A cepa recuperada foi inoculada na placa de meio LB contendo cloranfenicol, seguido pelo cultivo a 37°C durante a noite. Então, uma cepa exibindo resistência foi selecionada.

PCR foi realizada pelo uso da cepa selecionada como um molde com iniciadores de SEQ. ID. NO: 7 e NO: 8 sob as mesmas condições conforme o supracitado. A deleção de metJ foi identificada através da confirmação do tamanho do gene de 1,6kb em gel de agarose 1,0%. A cepa foi então transformada com o vetor pCP20 e cultivada em meio LB. A cepa final com metJ inativado foi construída na qual o tamanho do gene metJ foi reduzido a 600 kb em gel de agarose 1,0% por PCR sob as mesmas condições e foi confirmada que a cepa com marcador de Cloranfenicol foi eliminada. A cepa construída foi denominada W3-BTJ.

<1-4> Deleção de gene de metA

Para aumentar a produção de O-acetil-homosserina, o gene metA que codifica homosserina O-succiniltransferase foi deletado na cepa W3BTJ. Com base no achado que a integração do gene metX resultou no acúmulo tanto de O-succinil-homosserina quanto de O-acetil-homosserina, e foi esperado que a deleção do gene metA resultasse na promoção do acúmulo da O-acetil-homosserina (Tabela 3). Para deletar o gene metA, PCR para FRT de deleção em uma etapa foi realizada.

Para construir o cassete de deleção de metA, PCR foi realizada com iniciadores de SEQ. ID. NO: 9 e NO: 10 como se segue; 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 1 minuto.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0%, seguido pela purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,2 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi eletroporado na cepa E. coli W3BTJ transformada com o vetor pKD46. A cepa recuperada foi inoculada na placa de meio LB contendo cloranfenicol, seguida pelo cultivo a 37°C durante a noite. Então, uma cepa exibindo resistência foi selecionada.

PCR foi realizada usando a cepa selecionada como um molde com iniciadores de SEQ. ID. NO: 9 e NO: 10 sob as mesmas condições que o supracitado. A deleção do gene metA foi identificada através da confirmação do tamanho do gene com 1,1 kb em gel de agarose 1,0%. A cepa então foi transformada com o vetor pCP20 e cultivada em meio LB. A cepa final metA foi construída no qual o tamanho do gene metA foi reduzido a 100 kb em gel de agarose 1,0% por PCR sob as mesmas condições. Foi confirmado que o marcador cloranfenicol foi eliminado. A cepa construída foi denominada W3-BTJA.

<1-5> superexpressão de gene metX

Para aumentar a produção de O-acetil-homosserina, a superexpressão do gene metX que codifica homosserina O-acetiltransferase foi realizada.

PCR foi realizada através do uso do cromossomo de Leptospira meyeri como molde com iniciadores de SEQ. ID. NO: 28 e NO: 29 como se segue; 25 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 2 minutos.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0%, seguido pela purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,1 kbp. Após isolamento do fragmento de DNA, o vetor pCL1920 contendo o promotor CJ1 foi clivado com a enzima de restrição EcoRV e ligado ao fragmento de DNA isolado. E.coli foi transformada com o vetor e células carregando plasmídeo foram selecionadas em ágar LB contendo 50 pg/L de espectinomicina. O vetor construído foi denominado pCJ1-MetXlme-CL. O vetor foi eletroporado na cepa W3-BTJ e a cepa construída foi denominada W3-BTJ/pCJ-MetXlme-CL.

Como outro método de superexpressão do gene metX, PCR foi realizada através do uso do cromossomo de Corynebacteríum glutamicum como molde com iniciadores de SEQ. ID. NO: 30 e NO: 31 como se segue; 25 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 2 minutos.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0%, seguido pela purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,1 kbp. Após isolamento do fragmento de DNA, o vetor pCL1920 contendo o promotor CJ1 foi clivado com a enzima de restrição EcoRV e ligado ao fragmento de DNA isolado. E.coli foi transformada com o vetor e células carregando plasmídeo foram selecionadas em ágar LB contendo 50 pg/L de espectinomicina. O vetor construído foi denominado pCJ1-MetXlme-CL. O ve tor foi eletroporado na cepa W3-BTJ e a cepa construída foi denominada W3-BTJ/pCJ-MetXcgl-CL.

Como outro método da superexpressão do gene metX, PCR foi realizada através do uso do cromossomo de Deinococcus radiodurans como padrão com iniciadores de SEQ. ID. NO: 11 e NO: 12 como se segue; 25 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 2 minutos.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0%, seguido pela purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,1 kbp. Após isolamento do fragmento de DNA, o vetor pCL1920 contendo o promotor CJ1 foi clivado com a enzima de restrição EcoRV e ligado ao fragmento de DNA isolado. E.coli foi transformada com o vetor e células carregando plasmídeo foram selecionadas em ágar LB contendo 50 pg/L de espectinomicina. O vetor construído foi denominado pCJ1-MetXdr-CL. O vetor foi eletroporado na cepa W3-BTJ e a cepa construída foi denominada W3BTJ/pCJ-MetXdr-CL.

Como outro método da superexpressão do gene metX, PCR foi realizada através do uso do cromossomo de Mycobacterium smegmatis como padrão com iniciadores de SEQ. ID. NO: 13 e NO: 14 como se segue; 25 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 2 minutos.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0%, seguido pela purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,1 kbp. Após isolamento do fragmento de DNA, o vetor pCL1920 contendo o promotor CJ1 foi clivado com a enzima de restrição EcoRV e ligado ao fragmento de DNA isolado. E.coli foi transformada com o vetor e células carregando plasmídeo foram selecionadas em ágar LB contendo 50 pg/L de espectinomicina. O vetor construído foi denominado pCJ-MetXmsm-CL. O vetor foi eletroporado na cepa W3-BTJ e a cepa construída foi denominada W3-BTJ/pCJ-MetXmsm-CL.

Como outro método da superexpressão do gene metX, PCR foi realizada através do uso do cromossomo de Pseudomonas aeruginosa co mo padrão com iniciadores de SEQ. ID. NO: 15 e NO: 16 como se segue; 25 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, extensão a 72°C por 2 minutos.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0%, seguido pela purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,1 kbp. Após isolamento do fragmento de DNA, o vetor pCL1920 contendo o promotor CJ1 foi clivado com a enzima de restrição EcoRV e ligado ao fragmento de DNA isolado. E.coli foi transformada com o vetor e células carregando plasm ideo foram selecionadas em ágar LB contendo 50 pg/L de espectinomicina. O vetor construído foi denominado pCJ-MetXpae-CL. O vetor foi eletroporado na cepa W3-BTJ e a cepa construída foi denominada W3BT J/pCJ-MetXpae-CL.

Os vetores supracitados construídos foram eletroporados na cepa W3-BTJA respectivamente e a capacidade de produção da cepa foi verificada usando frasco de cultura como descrito no Exemplo 2-1.

A produção de O-acetil-homosserina de cada cepa é medida, com base em 100% da produção O-acetil-homosserina da cepa introduzida com o vetor metX derivado de corynebacterium glutamicum (PCT/KR2007/003650).

Como resultado, a capacidade de produção de O-acetilhomosserina foi significativamente aumentada em cada cepa transformada com vetor pCJ-MetXdra-CL, pCJ-MetXmsm-CL e pCJ-MetXIme-CL.

	Plasmídeo	Produção de O-acetil-homosserina (%)
W3BTJA	pCJ-metXcgl-CL	100
	pCJ-metXmsm-CL	114
	pCJ-metXIme-CL	105
	pCJ-metXpae-CL	100
	pCJ-metXdra-CL	164

Para a expressão estável do gene metX a partir de D. radiodurans (metX(dra)) mostrando a produção mais eficiente entre os três supraci tados, o gene metX(dra) foi inserido no cromossomo da E.coli. Sistema de vetor pSG foi usado para construir cepa com o inserto metX(dra) (Appl. Environ. Microbiol. 1993 V59. P.3485-3487, Villaverde. A et. al).

Em primeiro lugar, 600bp da região a montante do metA do DNA genômico foi amplificado por PCR com iniciadores de SEQ. ID. NO: 17 e NO: 18, e 600bp da região a jusante do metA do DNA genômico foi amplificado por PCR com iniciadores de SEQ. ID. NO: 19 e NO: 20. Então, metX(dra) foi amplificado por PCR com iniciadores de SEQ. ID. NO: 21 e NO: 22. Cada fragmento de PCR foi isolado através da eluição do gel e a mistura de fragmentos foi amplificada por PCR com iniciadores de SEQ. ID. NO: 23 e NO: 24. O DNA amplificado foi clivado com a enzima de restrição BamHI/EcoRI e clonado no vetor pSG76C. A cepa W3-BTJAfoi transformada com o vetor construído supracitado e as cepas resistentes ao cloranfenicol foram selecionadas e a clonagem bem-sucedida de gene metXdra foi detectada. As cepas detectadas foram transformadas com o vetor piscei para remoção do marcador, e resselecionadas. Como resultado da confirmação da capacidade de produção de O-acetil-homosserina, a produção da cepa com metX(dra) introduzido no gene foi similar àquela cepa abrangendo o plasmídeo pCL-metXdra.

<1-6> superexpressão de gene thrA

Para aumentar a produção de O-acetil-homosserina mais eficientemente, a superexpressão do gene thrA foi realizada.

Para isto, o gene thrA foi amplificado por PCR através do uso do cromossomo de E.coli CJM002 (KCCM10568), a cepa produtora de Ltreonina, como um molde com iniciadores de SEQ. ID. NO: 25 e NO: 26. O fragmento de DNA amplificado foi isolado por eluição do gel e ligado com o promotor CJ1 no vetor pCL1920 usando a enzima de restrição EcoRV. O vetor ligado foi denominado pCJ-thrA(M)-CL e transformado nas cepas produzidas pelo método do Exemplo 1-1)-1-5. A sequência de aminoácidos codificada pelo gene thrA é representada em SEQ. ID. NO: 27 que tem uma mutação no aminoácido na posição 345.

<1-7> Conversão da cepa produtora de L-treonina

A cepa produtora de O-acetil-homosserina foi construída usando E.coli CJM002 (KCCM10568) que é a cepa produtora de L-treonina e independente de L-metionina, como descrita no Exemplo 1-1 a 1-5, e denominado como CJM-X. O cromossomo da cepa CJM-X tem o gene metX derivado de D.radiodurans. E outra cepa produtora do precursor de L-metionina foi construída usando FTR2533 (KCCM10541) que é a cepa produtora de Ltreonina descrita em PCT/KR2005/00344, como descrito nos Exemplos 1-1 a

1-5, e denominado como CJM-2X. O cromossomo da cepa CJM-2X tem o gene metX derivado de D.radiodurans. Cada cepa foi transformada com o vetor de expressão thrA como descrito no Exemplo 1-6 e a produção do precursor de metionina foi medida nesta cepa.

Exemplo 2: Fermentação para a produção do precursor de L-metionina <2-1 > Experimento em frasco de cultura

Para investigar a capacidade de produção do precursor de metionina da cepa construída no Exemplo 1, o cultivo foi realizado em frasco Erlenmeyer. CJM2-BTJA transformado com o vetor de expressão metX e CJMX, CJM2-X, CJM2-X/pthrA (M)-CL foram cultivados em placa com meio LB a 31 °C durante a noite. Escherichia coli CJM-BTJA (pCJ-MetX-CL) descrita em PCT/KR2007/003650, cepa produtora do precursor de O-acetil-homosserina, foi depositada em 5 de julho de 2007, com o Número de acesso KCCM10873.

Uma colônia única foi inoculada em 3 ml de meio LB que contém espectinomicina, seguida pelo cultivo a 31 °C durante 5 horas. A solução de cultivo foi diluída 200 vezes em um frasco Erlenmeyer de 250 ml que contendo 25 ml de meio para produção do precursor de metionina, seguido pelo cultivo a 31 °C, 200 rpm durante 64 horas. HPLC foi realizada para comparação com a capacidade de produção do precursor de metionina (Tabela 2 e Tabela 3). Como resultado, a capacidade de produção de metionina foi significativamente aumentada na cepa produtora do precursor de metionina preparada a partir da cepa produtora de L-treonina livre da necessidade de metionina.

Tabela 1

Composição do meio do frasco para produção do precursor de metionina

Composição	Concentração (por litro)
Glicose	40 g
Sulfato de amônio	I7g
KH₂PO₄	i,0g
MgSO₄7H₂O	0,5 g
FeSO₄7H₂O	5 mg
MnSO₄8H₂O	5 mg
ZnSO₄	5 mg
Carbonato de cálcio	30 g
Extrato de levedura	2g
Metionina	0,15g
Treonina	0,15g

Tabela 2

Produção do precursor de metionina (O-acetil-homosserina) por frasco de cultura

	O-acetil-homosserina (g/L)
CJM-BTJA/pCJ-metXdr-CL	15
CJM-X	14
CJM2-X	18,3
CJM2-X/pthrA(M)-CL	20,7

<2-2> Fermentação em larga escala

Algumas cepas exibindo capacidade de produção de O-acetilhomosserina foram selecionadas e cultivadas em um fermentador de 5 L para produção em massa de O-acetil-homosserina. Cada cepa foi inoculada 10 no meio LB contendo espectinomicina, seguida pelo cultivo a 31 °C durante a noite. Então, uma colônia única foi inoculada em 10 ml de meio LB contendo espectinomicina, que foi cultivada a 31 °C durante 5 horas. A solução de cultivo foi diluída 100 vezes em um frasco Erlenmeyer 1000 ml contendo 200 ml do meio de semeadura do precursor de metionina, seguido pela cultura a 15 31 °C, 200 rpm de 3 a 10 horas. A solução de cultivo foi inoculada em um fermentador de 5 L, seguida pelo cultivo adicional de 20 a 100 horas pela fermentação através de batelada alimentada. A concentração do precursor de metionina na solução fermentada foi medida por HPLC e os resultados são mostrados em Tabela 4.

Tabela 3

Composição do meio fermentador para produção do precursor de metionina

Composição	Meio de semeadura	Meio Principal	Meio de nutrição
Glicose(gZL)	10,1	40	600
MgSO₄7H₂O (g/L)	0,5	4,2
Extrato de levedura (g/L)	10	3,2
KH₂PO₄	3	3	8
Sulfato de amônio (g/L)		6,3
NH₄CI(g/L)	1
NaCI(g/L)	0,5
Na₂HPO₄12H₂O (g/L)	5,07
DL-Metionina (g/L)		0,5	0,5
L-lsoleucina (g/L)	0,05	0,5	0,5
L-Treonina (g/L)		0,5	0,5

Tabela 4

Produção do precursor de metionina em um fermentador

	O-acetil-homosserina (g/L)
C J M-BT J A/pC J-metXcgl-CL	>55
CJM-BTJA/pCJ-metXdra-CL	>75
CJM-X/pthrA(M)-CL	>80
CJM2-X/pthrA(M)-CL	>90

Aplicabilidade Industrial

Como descrito até agora, usando-se a cepa produtora do pre10 cursor de metionina na presente invenção, metionina pode ser produzida de uma forma mais ambientalmente correta que o método químico convencional síntese de metionina. E a L-metionina convertida a partir da O-acetilhomosserina produzida a partir da cepa de acordo com a presente invenção pode ser largamente usada na produção de ração animal ou aditivos para 15 ração animal, além de alimento ou aditivos alimentares para seres humanos.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Micro-organismo para produção de O-acetil-homosserina, caracterizado pelo fato de que compreende todas as seguintes características (a) a (e):

a) a atividade da homosserina O-acetiltransferase (EC2.3.1.31) é introduzida e potencializada pela integração do gene metX de Deinococcus sp.;

b) a atividade da aspartoquinase ou homosserina desidrogenase (EC2.7.2.4 ou 1.1.1.3) é potencializada pela superexpressão do gene thrA, em que a aspartoquinase ou homosserina desidrogenase tem SEQ ID NO: 27;

c) a cistationina gama sintase, O-succinil-homosserina sulfidrilase, ou O-acetil-homosserina sulfidrilase é enfraquecida ou inativada;

d) a homosserina quinase é enfraquecida ou inativada; e

e) o regulador de transcrição das vias de síntese de metionina codificado pelo gene metJ é enfraquecido ou inativado, em que o micro-organismo é uma Escherichia sp..

2. Micro-organismo de acordo com a reivindicação1, caracterizado pelo fato de que Deinococcus sp. é Deinococcus radiodurans.

3. Micro-organismo de acordo com a reivindicação1, caracterizado pelo fato de que o peptídeo homosserina O-acetiltransferase tem SEQ ID NO: 32.

4. Micro-organismo de acordo com a reivindicação1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é Escherichia coli.

5. Micro-organismo de acordo com a reivindicação1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo antes da modificação é Escherichia coli MF001, depositado sob número de acesso KCCM 10568.

6. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo antes da modificação é Escherichia coli FTR2533, depositado sob número de acesso KCCM 10541.

7. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é Escherichia coli CJM-X

Petição 870190130825, de 09/12/2019, pág. 4/9 (pthrA (M)-CL), depositado sob número de acesso KCCM 10921P.

8. Micro-organismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é Escherichia coli CJM2-X (pthrA (M)-CL), depositado sob número de acesso KCCM 10925P.

5 9. Método de produção de O-acetil-homosserina, caracterizado por:

a) fermentação com os micro-organismos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 8;

b) enriquecimento de O-acetil-homosserina no meio ou em 10 micro-organismos; e

c) isolamento de O-acetil-homosserina.