ES2430274T3 - Microorganismo productor de precursor de L-metionina y método para producir L-metionina y ácido orgánico a partir de precursor de L-metionina - Google Patents

Microorganismo productor de precursor de L-metionina y método para producir L-metionina y ácido orgánico a partir de precursor de L-metionina Download PDF

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Abstract

Un método para producir L-metionina y ácidos orgánicos, que comprende las siguientes etapas: 1) preparar una cepa productora de precursor de L-metionina y producir precursor de L-metionina mediante fermentación de dicha cepa, donde la cepa productora de precursor de L-metionina se preparar mediante eliminación o debilitamiento de la actividad de cistationina gamma sintasa o de O-succinil homoserina sulfhidrilasa o de O-acetil homoserina sulfhidrilasa implicadas en la degradación de precursor de L-metionina y potenciando la actividad de homoserina O-succinil transferasa o de homoserina O-acetil transferasa implicada en la síntesis de precursor de L-metionina a partir de homoserina; y 2) producir L-metionina y ácidos orgánicos mediante reacción enzimática usando el precursor de L-metionina y metilmercaptano como sustratos, donde la reacción enzimática es inducida mediante enzimas o cepas microbianas que contienen la actividad de cistationina gamma sintasa o de O-succinil homoserina sulfhidrilasa o de O-acetil homoserina sulfhidrilasa, donde el precursor de L-metionina es O-acetil homoserina u O-succinil homoserina.

Description

Microorganismo productor de precursor de L-metionina y método para producir L-metionina y ácido orgánico a partir de precursor de L-metionina
Campo Técnico
La presente invención se refiere a un método para producir L-metionina y ácido orgánico. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método para producir L-metionina y ácido orgánico con un alto rendimiento mediante reacción de conversión enzimática a partir de precursor de L-metionina producido por fermentación de una cepa productora de precursor de L-metionina preparada según la presente invención. El método de la presente invención para producir L-metionina es más beneficioso medioambientalmente que el método convencional y permite una producción selectiva de L-metionina para usar L-metionina en diversos campos de la industria como aditivo alimentario para piensos y comidas, y como materia prima para suministros médicos y fármacos, etc.
Antecedentes de la Técnica
La metionina es uno de los aminoácidos esenciales del cuerpo humano que se ha usado ampliamente como aditivo alimentario para piensos y comidas, y además se ha usado como materia prima sintética para disoluciones médicas y suministros médicos. La metionina actúa como precursor de compuestos tales como la colina (lecitina) y la creatina y al mismo tiempo se usa como materia prima sintética para la cisteína y la taurina. La metionina también puede proporcionar azufre. La S-adenosilmetionina se deriva de la L-metionina y desempeña una función concreta para proporcionar grupos metilo en el organismo humano, y también está implicada en la síntesis de varios neurotransmisores en el cerebro. La metionina y/o la S-adenosil-L-metionina (SAM) inhiben la acumulación de grasa en el hígado y las arterias, y alivian la depresión, la inflamación, la enfermedad hepática y el dolor muscular, etc.
Las funciones in vivo de la metionina y/o la S-adenosil-L-metionina conocidas hasta el momento son las siguientes:
1) Inhibe la acumulación de grasa en el hígado y las arterias promoviendo el metabolismo de lípidos, y mejora la circulación sanguínea en el cerebro, el corazón y el riñón (J. Hepatol. Jeon BR et al., marzo de 2001; 34(3): 395401).
2) Promueve la digestión, la destoxificación y la excreción de sustancias tóxicas, y la excreción de metales pesados tales como el Pb.
3) Puede administrarse como un agente anti-depresivo en una dosis de 800 – 1.600 mg/día (Am. J. Clin. Nutr. Mischoulon D. et al., noviembre de 2002; 76(5): 1158S-61S).
4) Potencia las funciones hepáticas (FASEB J. Mato JM., enero de 2002; 16(1): 15-26) y es particularmente efectiva para la enfermedad hepática provocada por el alcohol (Cochrane Database Syst Rev., Rambaldi A., 2001; (4): CD0022359.
5) Tiene un efecto anti-inflamatorio sobre las enfermedades óseas y de las articulaciones, y promueve la recuperación de articulaciones (ACP J Club. Sander O., enero-febrero de 2003; 138(1): 21, J. Fam. Pract., Soeken KL et al., mayo de 2002; 51(5): 425-30).
6) Es un nutriente esencial para el cabello. Proporciona nutrición al cabello y con ello previene la pérdida de pelo (Audiol. Neurootol., Lockwood DS et al., septiembre-octubre de 2000; 5(5): 263-266).
La metionina puede sintetizarse química o biológicamente para ser aplicada a piensos, comida y medicinas.
En la síntesis química, la metionina se produce principalmente mediante hidrólisis de 5-(β-metilmercaptoetil)hidantoína. La metionina sintetizada químicamente presenta la desventaja de ser producida únicamente como una mezcla del tipo L y el tipo D.
En la síntesis biológica, la metionina se produce mediante un método que usa proteínas implicadas en la síntesis de metionina. La L-metionina se biosintetiza a partir de homoserina por acción de la enzima expresada por genes tales como metA, metB, metC, metE y metH. Particularmente, el metA es el que codifica homoserina O-succinil transferasa, que es la primera enzima necesaria para la biosíntesis de metionina, y convierte homoserina en Osuccinil-L-homoserina. La O-succinilhomoserina liasa o cistationina gamma sintasa codificada por el gen metB convierte la O-succinil-L-homoserina en cistationina. La cistationina beta liasa codificada por el gen metC convierte la cistationina en L-homocisteína. El metE codifica metionina sintasa independiente de cobalamina y el metH codifica metionina sintasa dependiente de cobalamina, y ambos convierten L-homocisteína en L-metionina. En este punto, la 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa codificada por metF y la serina hidroximetiltransferasa codificada por glyA trabajan juntas para sintetizar N(5)-metiltetrahidrofolato que proporciona el grupo metilo necesario para la síntesis de L-metionina.
La L-metionina es sintetizada por una serie de reacciones orgánicas catalizadas por las anteriores enzimas. La modificación genética de las proteínas anteriores o de otras proteínas que afecten a las proteínas anteriores podría dar como resultado la regulación de la síntesis de L-metionina. Por ejemplo, la Publicación de Patente Abierta Japonesa Nº 2000/139471 describe un método para la producción de L-metionina con la Escherichia sp. a la que se han eliminado los genes thrBC y metJ, el gen metBL ha sido sobre-expresado y el metK se ha reemplazado por un mutante. Asimismo, la Publicación de Patente de EE.UU. Nº US2003/00920026 A1 describe un método que usa un microorganismo de bloqueo de metD (inhibidor de la síntesis de L-metionina) que pertenece a Corynerbacterium sp. La Publicación de Patente de EE.UU. Nº US2002/0049305 describe un método para incrementar la producción de Lmetionina aumentando la expresión de 5,10-metilentetrahidrofolato reductasa (metF).
La Patente de EE.UU. Nº US2005/0054060 A1 describe el método de preparación de microorganismo productor de L-metionina que usa un mutante de cistationina sintasa (O-succinilhomoserina liasa). Esta cistationina sintasa mutante puede producir homocisteína o metionina directamente a partir de H2S o CH3SH en lugar de cisteína. En este método, el mutante de cistationina sintasa se introduce directamente en una célula y participa en el procedimiento de biosíntesis de metionina intracelular. En este método, la reacción de cistationina sintasa no es muy efectiva debido al uso de la ruta de biosíntesis de metionina intracelular. También, la elevada toxicidad del H2S o el CH3SH para las células reduce la eficacia de este método. En nuestro experimento, también descubrimos que la especificidad de sustrato de la cistationina sintasa para CH3SH es muy lenta comparada con la succinilhomoserina liasa derivada de Pseudomonas o Chromobacterium sp.
Según las publicaciones anteriores, la cistationina sintasa tiende a producir varios productos por reacción con varios sustratos. La cistationina sintasa media en la interacción entre la homocisteína y la O-succinil homoserina para producir homolantionina con una elevada eficacia (J. Bacteriol. (2006) vol. 188: p. 609-618). La cistationina sintasa de una célula puede interaccionar con varios precursores de metionina y puede producir varios subproductos con una elevada eficiencia. Por tanto, la sobreexpresión de Cistationina sintasa puede reducir la eficacia de la reacción debido a la mayor producción de subproductos.
La metionina producida mediante el método biológico convencional es de tipo L, lo que tiene ventajas, pero la cantidad de producción es demasiado baja. Esto es debido a que la ruta biosintética de metionina tiene sistemas de regulación retroalimentados muy estrictos. Una vez que la metionina se ha sintetizado a un nivel determinado, la metionina del producto final inhibe la transcripción del gen metA que codifica la proteína primaria para el inicio de la biosíntesis de metionina. La sobre-expresión del gen metA por sí misma no puede aumentar la producción de metionina debido a que el gen metA es suprimido por la metionina en la etapa de transcripción y a continuación es degradado por las proteasas intracelulares de la etapa de traducción (Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan y Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443). Por lo tanto, muchas de las patentes previas se han centrado en cómo liberar el gen metA de su sistema de regulación de retroalimentación (WO2005/108561, WO1403813).
Cuando se produce la metionina en un sistema biológico, la metionina producida se convierte en Sadenosilmetionina mediante S-adenosilmetionina sintasa en la ruta de degradación de la metionina. La Sadenosilmetionina sintasa no puede ser eliminada ya que la S-adenosilmetionina es una sustancia esencial en las células. Según las patentes previas, el gen que codifica S-adenosilmetionina sintasa se ha mutado para presentar una baja actividad a fin de incrementar la producción de metionina (WO2005/108561).
Giovanelli y Mudd (Biochem. Biophys. Res. Comm., 1968, 31, pág. 275-80) se refieren a la sulfuración de la Oacetilhomoserina y la O-acetilserina por acción de dos fracciones enzimáticas procedentes de la espinaca. Rowbury
(J. Gen. Microbiol., 1964, 37, 171-80) se refiere a la acumulación de O-succinilhomoserina por Escherichia coli y Salmonella typhimurium.
Descripción de la Invención
El método convencional de biosíntesis de metionina usa la ruta metabólica de cistationina sintasa para producir metionina, de tal modo que el proceso de reacción enzimática es ineficiente debido a la toxicidad de sulfuros y a la generación de subproductos. Adicionalmente, la regulación de la retroalimentación en la ruta de síntesis de metionina inhibe la producción en masa de la metionina.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método alternativo para la producción de L-metionina para superar los problemas del método convencional. El método alternativo está constituido por un proceso de dos etapas en el que el precursor de L-metionina se produce mediante fermentación y el precursor de L-metionina es convertido en L-metionina por enzimas.
Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir L-metionina de forma selectiva.
Otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un método para producir de forma simultánea un ácido orgánico como subproducto sin un proceso adicional.
De aquí en adelante, la presente invención se va a describir detalladamente. Las realizaciones de la presente invención son como se definen en las reivindicaciones. En particular, la presente invención se refiere a un método para producir L-metionina y un ácido orgánico, que comprende las siguientes etapas:
1) preparar una cepa productora de precursor de L-metionina y producir precursor de L-metionina mediante fermentación de la cepa, donde la cepa productora de precursor de L-metionina se prepara eliminando o debilitando la actividad de cistationina gamma sintasa o de O-succinilhomoserina sulfhidrilasa o de O-acetilhomoserina sulfhidrilasa implicadas en la degradación de precursor de L-metionina y potenciando la actividad de la homoserina O-succinil transferasa o la homoserina O-acetil transferasa implicadas en la síntesis de precursor de L-metionina a partir de homoserina; y
2) producir L-metionina y ácido orgánico mediante reacción enzimática usando el precursor de L-metionina y metilmercaptano como sustratos, donde la reacción enzimática es inducida por enzimas o cepas microbianas que contengan la actividad de cistationina gamma sintasa o de O-succinilhomoserina sulfhidrilasa o de Oacetilhomoserina sulfhidrilasa, donde el precursor de L-metionina es O-acetilhomoserina u O-succinilhomoserina. En determinadas realizaciones, la cepa productora de precursor de L-metionina de la etapa 1) se selecciona el grupo que consiste en Escherichia sp. o Corynebacterium sp. En determinadas realizaciones, la cepa productora de precursor de L-metionina de la etapa 1) se deriva de cepas productoras de L-treonina, L-isoleucina o L-lisina seleccionadas entre Escherichia sp. o Corynebacterium sp. En determinadas realizaciones, la cistationina gamma sintasa o la O-succinilhomoserina sulfhidrilasa o la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa de la etapa 1) están codificadas respectivamente por los genes metB o metZ o metY o por sus genes mutantes. En determinadas realizaciones, la cepa productora de precursor de L-metionina de la etapa 1) se caracteriza por usar la cepa cuya ruta de treonina, isoleucina o lisina está debilitada o eliminada, preferiblemente donde la cepa se caracteriza por eliminar o debilitar la homoserina quinasa codificada por el gen thrB. En determinadas realizaciones, la síntesis de precursor de Lmetionina es potenciada por la sobre-expresión del gen meta que codifica la homoserina O-succinil transferasa o por el gen metX que codifica la homoserina O-acetil transferasa. En determinadas realizaciones, el gen auténtico de homoserina O-succinil transferasa de un microorganismo es eliminado o debilitado, y a continuación se introduce un nuevo gen mutante o extraño de homoserina O-acetil transferasa a fin de potenciar la síntesis de Oacetilhomoserina, o donde el gen auténtico de homoserina O-acetil transferasa de un microorganismo es eliminado o debilitado, y a continuación se introduce un nuevo gen extraño o mutante de homoserina O-succinil transferasa a fin de potenciar la biosíntesis de O-succinilhomoserina. En determinadas realizaciones, la cepa productora de precursor de L-metionina se prepara mediante el proceso completo o mediante una parte de los métodos descritos anteriormente. En determinadas realizaciones, la cepa productora de precursor de L-metionina se deriva de la cepa productora de treonina Escherichia coli MF001 no dependiente de metionina (Nº de Acceso: KCCM-10568). En determinadas realizaciones, la cepa productora de precursor de L-metionina se selecciona del grupo que consiste en Escherichia coli CJM-BTJ (pMetA-CL) (Nº de Acceso: KCCM-10767) que es la cepa productora de Osuccinilhomoserina, Escherichia coli CJM-BTJ (ptJ-MetA-CL) (Nº de Acceso: KCCM-10872) que es la cepa productora de O-succinilhomoserina, y Escherichia coli CJM-BTJA (pCJ-MetX-CL) (Nº de Acceso: KCCM-10873) que es la cepa productora de O-acetilhomoserina. En determinadas realizaciones, la enzima convertidora de la etapa 2), que convierte precursor de L-metionina en metionina, se deriva de una cepa seleccionada del grupo que consiste en Escherichia sp., Corynebacterium sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Salmonellar sp., Brevibacterium sp., Hyphomonas sp., Chromobacterium sp. y Norcardia sp. o levaduras. En determinadas realizaciones, la enzima convertidora de la etapa 2) que convierte precursor de L-metionina en metionina se deriva de una cepa seleccionada del grupo que consiste en las siguientes cepas: Escherichia coli, Pseudomonas aurogenosa, Pseudomonas putida, Corynebacteria glutamicum, Leptospira meyeri, Saccharomyces cerevisiae, Chromobacterium Violaceum, Nocardia farcinica, Bradyrhizobium japonicum, Hyphomonas neptunium, Methylococcus capsulatus, Methylobacillus flagellatus, Nitrosomas europea, Klesiella pneumoniae, Bacillus subtilis, Shigella flexneri, Colwellia psychrerythraea y Salmonella entérica serovar Paratyphi A.
La presente invención también se refiere a una cepa para la producción de precursor de L-metionina de la etapa 1) del método descrito anteriormente, donde dicha cepa es tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 ó 10-13.
En la presente memoria se describe un método para la producción de L-metionina que comprende las etapas de 1) preparar una cepa productora de precursor de L-metionina y producir precursor de L-metionina mediante la fermentación de la cepa, y 2) producir L-metionina y un ácido orgánico mediante reacción enzimática del precursor de L-metionina.
En la presente memoria se describe, en el proceso de la etapa 1), una cepa productora de precursor de L-metionina que se generada y fermentada para la acumulación de precursor de L-metionina en el medio de cultivo. En este punto, la cepa para la producción de precursor de L-metionina se prepara mediante el método de la invención diseñado por los inventores, de modo que esta invención también incluye en su alcance la cepa y el método para generar la cepa.
El precursor de L-metionina descrito en la presente memoria está representado por uno de los grupos O-acil homoserina compuestos por la siguiente fórmula:
[Fórmula 1]
Donde
R es una sustancia que incluye C, H, O, N y otros compuestos con moléculas de 15 carbonos como máximo. Por ejemplo, en grupo O-acil homoserina descrito en la presente memoria incluye, aunque sin limitación, O-acetil homoserina, O-succinil homoserina, propionil homoserina, acetoacetil homoserina, coumaroil homoserina, malonil homoserina, hidroximetilglutaril homoserina y pimelilhomoserina.
El precursor de L-metionina es O-acetil homoserina u O-succinil homoserina.
La “cepa productora de precursor de L-metionina”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una cepa de microorganismos procarióticos o eucarióticos que es capaz de acumular precursor de L-metionina mediante la manipulación según la presente invención. Por ejemplo, la cepa se puede seleccionar del grupo que consiste en los microorganismos Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacteria sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Salmonellar sp., Brevibacteria sp., Hypomononas sp., Chromobacterium sp. y Norcadia sp. u hongos
o levaduras. Preferiblemente, los microorganismos de Pseudomonas sp., Norcardia sp. y Escherichia sp. se pueden usar para producir O-succinilhomoserina, y los microorganismos de Escherichia sp., Corynebacterium sp., Reptospira sp. y levaduras se pueden usar para producir O-acetilhomoserina. Más preferiblemente, se pueden usar los microorganismos de Escherichia sp., y con la mayor preferencia se puede usar Escherichia coli (denominada a partir de aquí “E. coli”). Adicionalmente, se pueden introducir genes extraños en el microorganismo de Escherichia sp. para producir selectivamente O-succinil homoserina y O-acetil homoserina.
La presente invención proporciona una cepa productora de precursor de L-metionina en la que los genes implicados en la degradación de O-succinil homoserina u O-acetil homoserina son eliminados o debilitados, y en la que se potencian los genes implicados en la síntesis de O-succinil homoserina u O-acetil homoserina. Adicionalmente, la cepa puede ser una en la que la ruta de biosíntesis de treonina esté bloqueada o debilitada para potenciar la producción de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina. Adicionalmente, la cepa puede ser una cepa en la que se introducen, sobre-expresan o potencia en actividad los genes que están libres del sistema de regulación de retroalimentación y que codifican las proteínas implicadas en la síntesis de O-succinil homoserina u O-acetil homoserina.
Más particularmente, la presente invención proporciona una cepa productora de precursor de L-metionina por ejemplo eliminando el gen metB implicado en la degradación del precursor de L-metionina, y potenciando la expresión del gen metA o metX implicado en la biosíntesis de precursor de L-metionina; o bloqueando el gen metA y en su lugar introduciendo el gen metX; o eliminando el gen metX y en su lugar introduciendo el gen metA. Adicionalmente, dicha cepa puede tener una eliminación en el gen thrB implicado en la ruta de biosíntesis de treonina y el gen metJ que reprime la transcripción del gen de síntesis de precursor de L-metionina. Además, la cepa puede implicar la introducción del gen metA o metX libre de sistema de regulación retroalimentada.
En la presente invención, se puede llevar a cabo una eliminación del gen cortando una región del gen o modificando la secuencia de proteína mediante la introducción de una secuencia de ADN específica en el cromosoma. El debilitamiento del gen se puede llevar a cabo reduciendo la actividad de la proteína introduciendo la mutación en la región ORF del gen diana o reduciendo la expresión de proteína a través de la modificación de una región promotora
o de secuencia de nucleótidos 5’-UTR del gen.
En la presente invención, se puede llevar a cabo el potenciamiento de la expresión de proteína mediante la modificación de la región promotora del gen o la secuencia de nucleótidos de la región 5’-UTR, y se puede llevar a cabo el potenciamiento de la actividad de la proteína mediante la introducción de la mutación en la región ORF del gen diana, y también se puede llevar a cabo el potenciamiento de la expresión de proteína mediante la introducción de la copia extra de gen diana en el cromosoma o mediante la introducción del vector que aloja el gen diana con el auto-promotor u otro promotor potenciado de la cepa.
En una realización preferida de la presente invención, el método para preparar una cepa productora de precursor de L-metionina es como se indica a continuación:
En la etapa (i), se elimina o se debilita un gen que codifica cistationina gamma sintasa, O-succinilhomoserina sulfhidrilasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa en una cepa a fin de acumular precursor L-metionina tal como Osuccinil homoserina u O-acetil homoserina.
El gen que codifica cistationina gamma sintasa se indica como metB, el gen que codifica O-succinilhomoserina sulhidrilasa se indica como metZ, y el gen que codifica O-acetilhomoserina sulfhidrilasa se indica como metY. Un ejemplo de gen que codifica la proteína que tiene la actividad mencionada anteriormente es el metB, que está presente en E. coli. La secuencia genómica del gen se puede obtener a partir de la secuencia genómica de E. coli (Nº de Acceso: AAC75876) publicada previamente (Blattner et al., Science 277: 1453-1462 (1997)). La anterior secuencia genómica también se puede obtener a partir del NCBI (National Center for Biotechnology Information) and DDBJ (DNA Data Bank Japan). Otros ejemplos de gens que presentan la anterior actividad son el metB y el metY derivados de Corynebacterium, y el metZ derivado de Pseudomonas.
La cistationina gamma sintasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa tiene la actividad de convertir O-succinil homoserina y O-acetil homoserina en cistationina u homocisteína, como se muestra en las siguientes fórmulas de reacción. Por lo tanto, la cepa en la que los genes que presentan estas actividades han sido eliminados o debilitados, demostró una acumulación de O-succinil homoserina u O-acetil homoserina en la disolución de cultivo.
L-cisteína + O-succinil-L-homoserina <=> succinato + cistationina
L-cisteína + O-acetil-L-homoserina <=> acetato + cistationina
HS- + O-succinil-L-homoserina <=> succinato + homocisteína
HS- + O-acetil-L-homoserina <=> acetato + homocisteína
En la etapa (ii) el gen thrB que codifica homoserina quinasa en la cepa preparada en la etapa (i) es eliminado o debilitado. El gen thrB está implicado en la síntesis de O-fosfohomoserina a partir de homoserina, que a su vez es convertida en treonina por el gen thrC. El gen thrB es eliminado o debilitado para usar toda la homoserina producida para la síntesis de precursor de metionina.
En la etapa (iii), el gen metJ, que es el regulador de la transcripción del gen metA, es eliminado o debilitado. El gen metA implicado en la síntesis de precursor de metionina está regulado por el sistema de regulación retroalimentado de la metionina y el gen metJ es un represor implicado en la transcripción del gen metA. Para sobre-expresar el gen metA constitutivamente y activar la síntesis de precursor de metionina, la eliminación del represor de transcripción de gen metA es beneficiosa. Por lo tanto, el gen metJ es eliminado en E. coli y la expresión de gen metA es aumentada, lo que puede conducir a la producción masiva de precursor de L-metionina.
Las etapas (ii) y (iii) anteriores pueden modificarse de acuerdo a una cepa productora de precursor y podrían no ser necesarias para la cepa productora de precursor. Sin embargo, preferiblemente pueden ejecutarse para potenciar la ruta de producción de precursor en el microorganismo Escherichia sp.
En la etapa (iv), se potencia la expresión de gen metA y metX que codifican la homoserina O-succinil transferasa o la homoserina O-acetil transferasa, que es la primera etapa mediada por enzima de la ruta de biosíntesis de la metionina, para promover la síntesis de precursor de metionina. El gen metA es el término general para el gen que codifica homoserina O-succinil transferasa, y el gen metX es el término general para el gen que codifica homoserina O-acetil transferasa. Para potenciar la expresión de gen metA o metX, se puede introducir una copia adicional de gen o se puede modificar la 5’-UTR o un promotor o se puede mutar cada gen. El potenciamiento de la expresión de dicho gen da como resultado un aumento significativo de la síntesis de precursor de L-metionina.
Si se considera que la metionina es necesaria para el crecimiento de una cepa, se puede introducir el gen metA o metX libre de regulación retroalimentada. En este caso, el precursor de L-metionina se puede sintetizar independientemente del contenido de metionina del medio y así la adición de metionina al medio facilita la síntesis de precursor de L-metionina y el crecimiento de las células.
Para aumentar la producción de O-acetilhomoserina a partir de cepa productora de O-succinilhomoserina, se puede eliminar el gen metA que codifica homoserina O-succinil transferasa que existe en el cromosoma. Cuando se inhibe la producción de O-succinilhomoserina por eliminación del gen metA y se produce O-acetilhomoserina por introducir adicionalmente gen metX, se puede producir O-acetilhomoserina con un rendimiento superior al obtenido en el caso de introducir el gen metX en presencia del gen metA.
También es posible aumentar la producción de O-succinilhomoserina en la cepa productora de O-acetilhomoserina eliminando el gen metX que codifica homoserina O-acetil transferasa que existe en el cromosoma de la cepa. Cuando se inhibe la producción de O-acetilhomoserina por eliminación del gen metX y se produce Osuccinilhomoserina introduciendo adicionalmente gen metA, se puede producir O-succinilhomoserina con un mayor rendimiento.
La O-succinilhomoserina o la O-acetilhomoserina, precursor de L-metionina, se pueden acumular en una cepa aprovechando una parte del proceso completo de las anteriores etapas (i) a (iv).
La cepa productora de precursor de L-metionina se puede preparar a partir de la cepa que produce L-lisina, Ltreonina o L-isoleucina. Preferiblemente, se puede preparar usando la cepa productora de L-treonina. Con esta cepa, la síntesis de homoserina ya es mayor y, como resultado, la producción de precursor de metionina puede aumentar. Así, se puede acumular precursor de metionina eliminando o debilitando un gen implicado en la ruta de biosíntesis de treonina y a continuación el gen metA o metY o metZ, usando cepa productora de L-treonina. Es más preferible eliminar o debilitar el gen thrB primero y a continuación el metB, metY o metZ para sintetizar el precursor de metionina. Mientras tanto, el potenciamiento de la expresión génica de metA o metX da como resultado el incremento de precursor de metionina.
La “cepa productora de L-treonina” se refiere a una cepa de microorganismo procariótico o eucariótico que es capaz de producir L-treonina in vivo. Por ejemplo, la cepa de la invención puede incluir cepas de microorganismos que producen L-treonina que pertenecen a Escherichia sp. o Corynebacterium sp. Otras cepas productoras de L-treonina incluyen Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp. y Brevibacterium sp. Los microorganismos Escherichia sp. son los preferidos, y más preferido es el Escherichia coli.
La cepa productora de L-treonina incluye no solo los microorganismos naturales sino también sus mutantes, representados por microorganismos que presenta un requerimiento de isoleucina y que son resistentes a análogos de L-lisina y ácido α-aminobutírico; y son mutados mediante la introducción adicional de al menos una copia extra de gen endógeno de fosfoenol piruvato carboxilasa (ppc); y son desactivados en el gen pckA implicado en el proceso de conversión de oxaloacetato (OAA) que es un intermedio de la síntesis de L-metionina en fosfoenol piruvato (PEP); y son desactivados en gen tyrR que inhibe la expresión de gen tyrB implicado en la biosíntesis de Lmetionina; y son desactivados en gen galR que inhibe la expresión de gen galP implicada en el transporte de glucosa. Los análogos de L-lisina en la presente memoria pueden ser uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en S-(2-aminoetil)-L-cisteína y δ-metil-L-lisina.
En una realización preferida de la presente invención, se usó CJM002, la cepa productora de L-treonina e independiente de L-metionina mutada a partir de TF4076 (KFCC 10718, Patente Coreana Nº 92-8365), la cepa mutante de E. coli productora de L-treonina. La TF4076 tiene un requerimiento para metionina, y es resistente a análogos de metionina (por ejemplo, ácido α-amino-β-hidroxi valérico, AHV), a análogos de lisina (por ejemplo, S-(2aminoetil)-L-cisteína, AEC), y a análogos de isoleucina (por ejemplo, ácido α-aminobutírico). La TF4076 no es capaz de sintetizar metionina in vivo debido a que es la cepa que presenta un requerimiento para metionina. Para usar esta cepa como cepa productora de metionina de la invención libre de un requerimiento para metionina, los inventores de la presente prepararon la cepa productora de L-treonina de E. coli CJM002 libre del requerimiento para metionina empleando una mutación artificial usando NTG. La CJM002 de E. coli fue denominada Escherichia coli MF001 y se depositó en el KCCM (Korean Culture Center of Microorganism, Edif. Eulim, Hongje-1-Dong, Seodaemun-Ku, Seúl, 361-221, Corea), el 9 de abril de 2004 (Nº de Acceso: KCCM-10568). También se depositó la CJM-BTJ (pMetA-CL) de Escherichia coli productora de O-succinilhomoserina, preparada por el método anterior, el 21 de julio de 2006 (Nº de Acceso: KCCM-10767) y la CJM-BTJ (pCJ-MetA-CL) de Escherichia coli se depositó el 5 de julio de 2007 (Nº de Acceso: KCCM-10872). La CJM-BTJA (pCJ-MetX-CL) de Escherichia coli productora de O-acetilhomoserina, preparada mediante el método anterior de la invención, también se depositó el 5 de julio de 2007 (Nº de Acceso: KCCM-10873).
El cultivo de la cepa productora de precursor de L-metionina preparado anteriormente se puede llevar a cabo mediante un medio apropiado usando las condiciones conocidas por los especialistas en la técnica. Los especialistas en la técnica entienden sobradamente que el método de cultivo se puede usar ajustando fácilmente según la cepa seleccionada. Por ejemplo, el método de cultivo que incluye, aunque sin limitación, el cultivo por cargas, continuo y por cargas alimentado. En la siguiente referencia se describe una variedad de métodos de cultivo: “Biochemical Engineering” por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pág. 138-176.
El método debe cumplir las condiciones de cultivo para una cepa específica. En la siguiente referencia se describe
una variedad de medios de cultivo de microorganismos: “Manual of Methods for General Bacteriology” de la
American Society for Bacteriology, Washington D.C., EE.UU., 1981. Dichos medios incluyen varias fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y elementos traza. Un ejemplo de fuente de carbono son carbohidratos tales como glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón, celulosa; lípidos tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos tales como ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcoholes tales como glicerol y etanol; y ácidos orgánicos tales como ácido acético. Se puede usar como fuente de carbono uno de los compuestos o una mezcla de los mismos. Los ejemplos de fuentes de nitrógeno incluyen fuentes de nitrógeno orgánico tales como peptona, extracto de levadura, jugo de carne, extracto de malta, licor de maíz
fermentado (CSL, del inglés “corn steep liquor”) y harina de judía, y fuentes de nitrógeno inorgánico tales como urea,
sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Se puede usar como fuente de nitrógeno uno de estos compuestos o una mezcla de los mismos. En la presente memoria, el medio puede incluir como adicionalmente como fuente de fosfatos dihidrógeno fosfato de potasio, hidrógeno fosfato de dipotasio y las correspondientes sales de sodio. El medio también puede incluir una sal metálica tal como sulfato de magnesio o sulfato de hierro. Adicionalmente, también se pueden añadir aminoácidos, vitaminas y los precursores apropiados. Los medios o los precursores se pueden añadir al cultivo por cargas o de forma continua.
El pH del cultivo se puede ajustar durante el cultivo añadiendo de un modo apropiado un compuesto del tipo hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoníaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico. Se puede inhibir la generación de burbujas durante el cultivo usando un agente antiespumante tal como éster de poliglicol de ácido graso. Para mantener las condiciones aerobias del cultivo, se puede inyectar oxígeno o un gas que contenga oxígeno (por ejemplo, aire) al cultivo. La temperatura del cultivo convenientemente es de 20-45ºC, preferiblemente de 25-40ºC. El periodo de cultivo puede continuar hasta que la producción de precursor de L-metionina alcanza un nivel deseado, y el tiempo de cultivo preferido es de 10-160 horas.
La etapa 2) del proceso incluye el proceso de producción de L-metionina y ácido orgánico mediante reacción enzimática usando una enzima que tiene la actividad de cistationina sintasa o de O-succinilhomoserina sulfhidrilasa
o de O-acetilhomoserina sulfhidrilasa, o la cepa que contiene estas actividades enzimáticas, usando Osuccinilhomoserina u O-acetilhomoserina producidas a partir de la anterior cepa productora de precursor de Lmetionina y metil mercaptano como sustrato.
Más particularmente, la presente invención proporciona el método para producir L-metionina mediante reacción enzimática de cistationina sintasa o de O-succinilhomoserina sulfhidrilasa o de O-acetilhomoserina sulfhidrilasa usando la homoserina, la O-fosfo homoserina, la O-succinil homoserina o la O-acetil homoserina acumuladas en el método anterior como sustrato. En la presente invención es preferible usar como sustrato O-succinil homoserina u O-acetil homoserina.
En la presente invención, la cistationina gamma sintasa o la O-succinilhomoserina sulfhidrilasa o la Oacetilhomoserina sulfhidrilasa pueden derivarse de Escherichia sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Corynebacterium sp., Chromobacterium sp., Nocardia sp., Hyphomonas sp., Salmonella sp. o levadura. También se describe que la cistationina gamma sintasa o la O-succinilhomoserina sulfhidrilasa o la O-acetilhomoserina sulfhidrilasa pueden derivarse de Saccharomyces sp., Bradyrhizobium sp., Methylococcus sp., Methylobacillus sp., Nitrosomas sp., Klesiella sp., Bacillus sp., Shigella sp., Colwellia sp. o de hongos.
En el proceso de etapa 2), cuando se usa O-succinil homoserina como precursor de L-metionina, se puede usar preferiblemente cistationina gamma sintasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa derivadas de Pseudomonas sp., Nocardia sp. o Chromobacterium sp., más preferiblemente derivadas de Pseudomonas aurogenosa, Nocardia farcinica, Pseudomonas putida o Chromobacterium violaceum.
En el proceso de etapa 2), cuando se usa O-acetil homoserina como precursor de L-metionina, se puede usar preferiblemente cistationina gamma sintasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa derivadas de Lectospira sp., Chromobacterium sp. o Hyphomonas sp., más preferiblemente derivadas de Leptospira meyeri, Pseudomonas aurogenosa, Hyphomonas neptunium o Chromobacterium violaceum.
Las anteriores reacciones enzimáticas se muestran en las siguientes fórmulas de reacción, y las fórmulas estructurales se muestran en la Figura 2.
CH3SH + O-succinil-L-homoserina <=> succinato + metionina
CH3SH + O-acetil-L-homoserina <=> acetato + metionina
En las anteriores reacciones, tal como se muestra en las fórmulas de la Figura 2, el residuo CH3S- del metilmercaptano es sustituido por un residuo succinato o acetato de la O-succinil homoserina o la O-acetil homoserina para producir metionina. El metil mercaptano (CH3SH) puede añadirse de diferentes formas durante la reacción.
La secuencia de los genes que codifican las enzimas que presentan la anterior actividad enzimática puede obtenerse a partir de la base de datos NCBI, EE.UU., y el DNA data bank (KEGG), Japón.
Para la reacción de conversión biológica, se clona un gen procedente de la secuencia génica obtenida, que a continuación es introducido en un vector de expresión. La enzima se expresa en forma activa a partir de una cepa recombinante. Tanto la cepa que expresa enzima como la enzima expresada pueden usarse directamente para la reacción.
Las enzimas expresadas a partir de los anteriores genes o las cepas microbianas que expresan dichas enzimas pueden mezclarse directamente, parcialmente o no, con el sobrenadante de fermentación o con el caldo de fermentación acumulado con precursor de L-metionina para iniciar la reacción. En una realización preferida de la invención, la O-succinil homoserina o la O-acetil homoserina acumuladas en la disolución de fermentación pueden ser convertidas en metionina mediante cistationina gamma sintasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u Osuccinilhomoserina sulfhidrilasa derivadas de Pseudomonas sp., Chromobacterium sp., Leptospira sp. o Hyphomonas sp.
Más preferiblemente, la O-succinilhomoserina acumulada en la disolución de fermentación es convertida en metionina mediante cistationina gamma sintasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa derivadas de Pseudomonas aurogenosa, Pseudomonas putida o Chromobacterium violaceum.
Más preferiblemente, la O-succinil homoserina acumulada en la disolución de fermentación es convertida en metionina mediante cistationina gamma sintasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa derivadas de Pseudomonas aurogenosa, Pseudomonas putida o Chromobacterium violaceum.
La O-acetilhomoserina acumulada en la disolución de fermentación es convertida en metionina mediante cistationina 5 gamma sintasa u O-acetilhomoserina sulfhidrilasa u O-succinilhomoserina sulfhidrilasa derivadas de Leptospira meyeri, Hyphomonas neptunium o Chromobacterium violaceum.
Se expresaron todos los genes en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea), el vector de expresión para E. coli, y la proteína expresada se obtuvo a partir de la disolución enzimática preparada mediante lisis celular usando ultrasonidos. Se añadió la disolución enzimática a la disolución de fermentación acumulada en O-succinil homoserina u O-acetil
10 homoserina, y también se añadió disolución de metilmercaptano para iniciar la reacción. La reacción fue confirmada usando DTNB (ácido 5,5-ditiobis(2-nitro-benzonico), Sigma, EE.UU.) y el producto de reacción fue analizado mediante HPLC.
En la presente invención, adicionalmente se pueden obtener subproductos tales como ácido succínico o ácido acético, sin un proceso de producción separado, mediante reacción de CH3SH con O-succinil homoserina y O-acetil 15 homoserina, respectivamente.
Breve Descripción de las Figuras
La aplicación de las realizaciones preferidas de la presente invención se entiende mejor haciendo referencia a las figuras anexas, en las que:
Figura 1: es un diagrama que ilustra la manipulación genética de la cepa productora de precursor de metionina.
20 Figura 2: es un diagrama que ilustra las estructuras químicas del proceso de 2 etapas para la producción de metionina.
Figura 3: es un diagrama esquemático de pMetA-CL para la expresión de gen metA.
Figura 4: es un diagrama esquemático de pCJ-MetB-CL para la expresión de gen metB.
Figura 5: es un gráfico que muestra las curvas de reacción que ilustran los consumos de O-succinil homoserina por 25 varias enzimas.
El origen de cada disolución enzimática es como se indica a continuación. La disolución enzimática nº 21 es un extracto celular que no contiene un gen específico.
Cepa
Número de cepa (ATCC) Nombre del gen (KEGG) Especificidad de sustrato
OSH
OAH
Escherichia coli K 12
55151 MetB + +
Pseudomonas aurogenosa
17933 MetZ +++ +
MetY
++++ ++++
Pseudomonas putida
17390 MetZ ++++ +
Corynebacteria glutamicum
13032 MetB + +
MetY
+ +
Leptospira meyeri
43278 MetY + ++
Saccharomyces cerevisiae
2704 Met25 + +
Chromobacterium violaceum
12472 MetZ ++++ +++
Nocardia farcinica
3318 MetZ ++++ +
Bradyrhizobium japonicum
10324 MetZ + +
Hyphomonas neptunium
49408 MetZ + ++++
Methylococcus capsulatus
19069D-5 MetZ + +
Methylobacillus flagellatus
51484D MetZ + +
Nitrosomonas europaea
19718D MetZ + +
Klesiella pneumoniae
25955 MetB + +
Bacillus subtilis
10783 MetB + +
Shigella flexneri 2457T
700930D-5 MetB + +
Figura 6: es un gráfico que muestra las curvas de reacción que ilustran los consumos de O-acetil homoserina para varias enzimas. Cada número es tal como se muestra en la Figura 5.
Figura 7: es un diagrama que ilustra la secuencia de aminoácidos de cada enzima usada para la reacción de conversión dispuesta mediante megalign de DNAstar.
Mejor modo para llevar a cabo la invención
Las realizaciones práctica y actualmente preferidas de presente invención son ilustrativas tal como se muestran en los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 1: Construcción de una cepa productora de precursor de metionina
<1-1> Eliminación de gen metB
Para eliminar el gen metB que codifica cistationina sintasa en la cepa de E. coli, se llevó a cabo una eliminación por PCR FRT de una etapa (PNAS (2000) vol. 97: P6640-6645). Los cebadores de la SEQ. ID NO: 1 y NO: 2 fueron usados para PCR usando el vector pKD3 (PNAS (2000) vol. 97: P6640-6645) como plantilla, dando como resultado la construcción de la casete de eliminación. La PCR se llevó a cabo como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 1 minuto.
El producto de PCR fue sometido a electroforesis sobre gel de agarosa al 1,0%, seguido de la purificación de ADN obtenido a partir de la banda de 1,2 kpb. El fragmento de ADN recuperado fue sometido a electroporación en E. coli (K12) W3110 transformado con vector pKD46 (PNAS (2000) vol. 97: P6640-6645). Antes de la electroporación, el W3110 transformado con pKD46 fue cultivado a 30ºC en medio LB que contenía 100 µg/L de ampicilina y 5 mM de 1-arabinosa hasta alcanzar una DO600 de 0,6. A continuación, la cepa cultivada se lavó dos veces con agua esterilizada destilada y una vez más con glicerol al 10%. La electroporación se llevó a cabo a 2500 V. La cepa recuperada se llevó a una placa de medio LB que contenía 25 µg/L de cloranfenicol, seguido de cultivo a 37ºC durante una noche. A continuación, se seleccionó una cepa que exhibía resistencia.
La PCR se llevó a cabo usando la cepa seleccionada como plantilla con los mismos cebadores indicados anteriormente y en las mismas condiciones. La eliminación del gen metB se identificó confirmando el gen de 1,2 kb de tamaño sobre el gel de agarosa al 1,0%. A continuación, la cepa fue transformada con vector pCP20 (PNAS (2000) vol. 97: P6640-6645) y se cultivó en medio LB. Se construyó una cepa final con metB bloqueado en la que el tamaño del gen metB se redujo hasta 150 pb sobre gel de agarosa al 1,0% mediante PCR en las mismas condiciones. Se confirmó que el marcador de cloranfenicol había sido eliminado. La cepa construida se denominó W3-B.
<1-2> Eliminación de gen thrB
Los inventores intentaron aumentar la síntesis de O-succinil homoserina a partir de homoserina por eliminación del gen thrB que codifica homoserina quinasa. Particularmente, cuando se usa una cepa productora de treonina, la eliminación de dicho gen fue bastante necesaria debido a que la actividad de uso de homoserina fue muy fuerte. Para la eliminación del gen thrB en la cepa W3-B construida antes, se llevó a cabo una eliminación con PCR de una etapa FRT del mismo modo descrito anteriormente para la eliminación de gen metB.
Para construir la casete de eliminación de thrB, se llevó a cabo una PCR usando un vector pKD4 (PNAS (2000) vol.
97: P6640-6645) como plantilla con cebadores de SEQ ID NO: 3 y NO: 4 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 1 minuto. El producto de PCR se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación del ADN obtenido a partir de la banda de 1,6 kpb. El fragmento de ADN recuperado se sometió a electroporación en la cepa W3-B transformada con vector pKD46. La cepa recuperada se llevó a placa de medio LB que contenía 50 µg/L de canamicina, seguido de cultivo a 37ºC durante una noche. A continuación, se seleccionó una cepa que exhibía resistencia.
La PCR se llevó a cabo usando la cepa seleccionada como plantilla con cebadores de SEQ ID NO: 3 y NO: 4 en las mismas condiciones indicadas anteriormente. La eliminación del gen ThrB fue identificada seleccionando la cepa cuyo tamaño es 1,6 kb en gel de agarosa al 1,0%. A continuación la cepa fue transformada con vector pCP20 y cultivada en medio LB. Se construyó una cepa final con thrB bloqueado en la que el tamaño del gen thrB se redujo hasta 150 kb sobre gel de agarosa al 1,0% mediante PCR en las mismas condiciones. Se confirmó que el marcador de canamicina había sido eliminado. La cepa construida se denominó W3-BT.
<1-3> Eliminación de gen metJ
Para la eliminación del gen metJ que es el gen regulador del gen metA implicado en la síntesis de precursor de metionina, se llevó a cabo una eliminación de PCR de una etapa FRT del mismo modo usado para la eliminación del gen metB.
Para construir la casete de eliminación de metJ, se llevó a cabo una PCR con los cebadores de SEQ ID NO: 5 y NO: 6 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 1 minuto.
El producto de PCR se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación del ADN obtenido a partir de la banda de 1,2 kpb. El fragmento de ADN recuperado se sometió a electroporación en la cepa W3-BT transformada con vector pKD46. La cepa recuperada se llevó a placa de medio LB que contenía cloranfenicol, seguido de cultivo a 37ºC durante una noche. A continuación, se seleccionó una cepa que exhibía resistencia.
La PCR se llevó a cabo usando la cepa seleccionada como plantilla con cebadores de SEQ ID NO: 7 y NO: 8 en las mismas condiciones indicadas anteriormente. La eliminación del gen metJ fue identificada seleccionando la cepa cuyo tamaño es 1,6 kb en gel de agarosa al 1,0%. A continuación la cepa fue transformada con vector pCP20 y cultivada en medio LB. Se construyó una cepa final con metJ bloqueado en la que el tamaño del gen metJ se redujo hasta 600 kb sobre gel de agarosa al 1,0% mediante PCR en las mismas condiciones. Se confirmó que el marcador de cloranfenicol había sido eliminado. La cepa construida se denominó W3-BTJ.
<1-4-1> Sobreexpresión de gen metA
Para aumentar la síntesis de precursor de metionina, se sobre-expresó el gen metA que codifica homoserina Osuccinil transferasa implicada en la síntesis de O-succinil homoserina, el precursor de metionina.
Se llevó a cabo la PCR usando el cromosoma de E. coli w3110 como plantilla con los cebadores de las SEQ ID NO: 9 y NO: 10 como se indica a continuación; 25 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El producto de PCR se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación del ADN obtenido a partir de la banda de 1,2 kpb. El fragmento de ADN recuperado fue ligado a otro fragmento de ADN obtenido del vector pCL1920 por digestión con Smal. Se transformó la E. coli con el vector ligado, que a continuación fue cultivado en medio LB que contenía 50 µg/L de espectinomicina, seguido de selección. El vector así construido se denominó pMetA-CL. En la Figura 3 se muestra el diagrama esquemático del pMetA-CL. La cepa W3-BTJ fue transformada con dicho vector. La cepa construida se denominó W3-BTJ/pMetA-CL y se observó un aumento del nivel de O-succinil homoserina en ella.
Como método adicional para aumentar la expresión de gen metA, el gen metA fue ligado al vector pCL1920 usando promotor CJ1 (CJ, Corea) y EcoRV. Se transformó la E. coli con el vector ligado, que a continuación fue cultivado en medio LB que contenía 50 µg/L de espectinomicina, seguido de selección. El vector así construido fue denominado pCJ-MetA-CL. La cepa W3-BTJ fue transformada con dicho vector. La cepa construida se denominó W3-BTJ/pCJ-MetA-CL y se observó un aumento del nivel de O-succinil homoserina en ella.
<1-4-2> Sobreexpresión de gen metX
Para sintetizar O-acetil homoserina, el gen metX que codifica homoserina O-acetil transferasa implicado en la síntesis de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, fue sobreexpresado.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Leptospira meyeri como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 11 y NO: 12 como se indica a continuación; 25 ciclos desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El producto de PCR se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación del ADN obtenido a partir de la banda de 1,1 kpb. El fragmento de ADN recuperado fue ligado a vector pCL1920 usando promotor CJ1 y EcoRV. Se transformó E. coli con el vector ligado, que a continuación fue cultivado en medio LB que contenía 50 µg/L de espectinomicina, seguido de selección. El vector así construido se denominó pCJ1-MetXlme-CL. La cepa W3-BTJ fue transformada con dicho vector. La cepa construida se denominó W3-BTJ/pCJ-MetXlme-CL y se observó un aumento en el nivel de O-acetil homoserina en ella.
Otro método para sobreexpresar el gen metX se realizó llevando a cabo una PCR que usa el cromosoma de Corynebacterium como plantilla con los cebadores de SEQ ID NO: 68 y NO: 69 como se indica a continuación; 25 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El producto de PCR se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación de ADN. El fragmento de ADN recuperado se ligó a vector pCL1920 usando promotor CJ1 y EcoRV. Se transformó E. coli con el vector ligado, que a continuación fue cultivado en medio LB que contenía 50 µg/L de espectinomicina, seguido de selección. El vector así construido se denominó pCJ-MetXcgl-CL. La cepa W3-BTj se transformó con dicho vector. La cepa construida se denominó W3-BTJ/pCJ-MetXcgl-CL y se observó un aumento del nivel de O-acetil homoserina.
<1-4-3> Eliminación de gen metA
Para aumentar la producción de O-acetil homoserina, se eliminó el gen metA que codifica homoserina O-succinil transferasa en la cepa W3-BTJ. En base al descubrimiento de que solo la introducción de gen metX dio como resultado la acumulación de O-succinil homoserina, se esperaba que la eliminación del gen metA diera como resultado la promoción de la acumulación de O-acetil homoserina (Tabla 3). Para eliminar el gen metA, se llevó a cabo una PCR de una etapa FRT.
Para construir la casete de eliminación de metA, se llevó a cabo una PCR con los cebadores de SEQ ID NO: 70 y NO: 71 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 1 minuto.
El producto de PCR se sometió a electroforesis sobre gel de agarosa al 1,0%, seguido de purificación de ADN aislado a partir de la banda de 1,2 kpb. El fragmento de ADN recuperado fue sometido a electroporación en la cepa de E. coli W3-BTJ transformada con el vector pKD46. La cepa recuperada fue llevada a placa de metido LB que contenía cloranfenicol, seguido de cultivo a 37ºC durante una noche. A continuación, se seleccionó una cepa que exhibía resistencia.
Se llevó a cabo una PCR usando la cepa seleccionada como plantilla con los cebadores de SEQ ID NO: 70 y NO: 71 en las mismas condiciones utilizadas antes. La eliminación del gen metA se identificó confirmando un gen de 1,1 kb de tamaño sobre gel de agarosa al 1,0%. A continuación la cepa fue transformada con vector pCP20 y cultivada en medio LB. Se construyó una cepa final con metA bloqueado en la que el tamaño del gen metA se redujo hasta 100 kb sobre gel de agarosa al 1,0% mediante PCR en las mismas condiciones. Se confirmó que el marcador de cloranfenicol había sido eliminado. La cepa construida se denominó W3-BTJA. La cepa W3-BTJA fue transformada con el vector pCJ-MeTXlme-CL y la cepa resultante se denominó W3-BTJA/pCJ-MetX-CL. La cepa fue cultivada del mismo modo que se ha descrito anteriormente y como resultado no se observó acumulación de O-succinil homoserina, sino que la producción de O-acetil homoserina aumentó significativamente, aproximadamente en un 20%, en comparación con la W3-BTj.
<1-5> Conversión de cepa productora de L-treonina
Se construyeron cepas productoras de precursor de metionina del mismo modo que se describe en los Ejemplos <11> a <1-3> usando E. coli DJM002 (KCCM-10568), la cepa productora de L-treonina libre del requerimiento para metionina. Las cepas construidas fueron denominadas CJM-BTJ, CJM-BTJ/pMetA-CL y CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL, respectivamente. También se construyó la cepa con gen metA bloqueado de la misma manera descrita en <1-4-3> usando la cepa CJM-BTJ y la cepa resultante se denominó CJM-BTJA.
Ejemplo 2: Fermentación para la producción de precursor de L-metionina
<2-1> Experimento de cultivo en matraz
Para investigar la capacidad de producción de precursor de metionina de la cepa construida en el Ejemplo 1, se llevó a cabo un cultivo en matraz Erlenmeyer. Se cultivaron W3-BTJ, CJM-BTJ y W3-BTJ transformados con vector de expresión de metA y metX en medio de placa LB que contenía espectinomicina a 31ºC durante una noche. Se inoculó una única colonia en 3 mL de medio LB que contenía espectinomicina, seguido del cultivo a 31ºC durante 5 horas. La disolución del cultivo se diluyó 1:200 en un matraz Erlenmeyer de 250 mL que contenía 25 mL de medio de producción de precursor de metionina, seguido de cultivo a 31ºC, 200 rpm durante 64 horas. Se llevó a cabo un análisis de HPLC para comparar con la capacidad de producción de precursor de metionina (Tabla 2 y Tabla 3). Como resultado, la capacidad de producción de metionina aumentó significativamente en la cepa productora de precursor de metionina preparada a partir de la cepa productora de L-treonina libre del requerimiento para metionina.
[Tabla 1]
Composición del medio de matraz para la producción de precursor de metionina
Composición
Concentración (por litro)
Glucosa
40 g
Sulfato de amonio
17 g
KH2HPO4
1,0 g
MgSO4 · 7H2O
0,5 g
FeSO4 · 7H2O
5 mg
MnSO4 · 8H2O
5 mg
ZnSO4
5 mg
Composición
Concentración (por litro)
Carbonato de calcio
30 g
Extracto de levadura
2 g
Metionina
0,15 g
Treonina
0,15 g
[Tabla 2] Producción de precursor de metionina (O-succinil homoserina) mediante cultivo en matraz
DO
Consumo de glucosa (g/L) O-succinil homoserina (g/L)
W3-BTJ
10 40 0,3
W3-BTJ/pMetA-CL
12 40 1,2
W3-BTJ/pCJ-MetA-CL
12 40 1,8
CJM-BTJ
5,0 33 0,6
CJM-BTJ/pMetA-CL
6,0 36 5,2
CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL
6,0 40 10,1
[Tabla 3] Producción de precursor de metionina (O-acetil homoserina) mediante cultivo en matraz
DO
Consumo de glucosa (g/L) O-acetil homoserina (g/L)
W3-BTJ
10 40 0
W3-BTJ/pCJ-MetXlme-CL
12 40 1,5
W3-BTJ/pCJ-MetXcgl-CL
12 40 1,4
W3-BTJA/pCJ-metXlme-CL
11 40 1,8
CJM-BTJ
5,0 33 0
CJM-BTJ/pCJ-metXlme-CL
5,5 40 4,8
CJM-BTJ/pCJ-MetXcgl-CL
6,0 36 4,6
CJM-BTJA/pCJ-metX-CL
5,8 40 6,5
<2-2> Fermentación a gran escala
Se seleccionó una cepa que exhibe la mayor capacidad de producción de precursor de metionina del Ejemplo 1 para
10 producir en masa precursor de metionina, que a continuación se cultivó en un fermentador de 5 L. Se inoculó CJMBTJ/pCJ-metA-CL o CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL en medio LB que contiene espectinomicina, seguido de cultivo a 31ºC durante una noche. A continuación, se inoculó una única colonia en 10 mL de medio LB que contenía espectinomicina, que se cultivó a 31ºC durante 5 horas. La disolución de cultivo se diluyó 1:100 en un matraz Erlenmeyer de 1000 mL que contenía 200 mL de medio de siembra de precursor de metionina, seguido de cultivo a
15 31ºC, 200 rpm durante 3 – 10 horas. La disolución de cultivo fue inoculada en un fermentador de 5 L, seguido de un cultivo adicional durante 50 – 100 horas mediante fermentación semicontinua. La concentración de precursor de metionina en la disolución fermentada se midió mediante HPLC y los resultados se muestran en la Tabla 5.
[Tabla 4]
Composición de medio de fermentador para la producción de precursor de metionina.
Composición
Medio de siembra Medio principal Medio alimentado
Glucosa (g/L)
10,1 40 600
MgSO4·7H2O (g/L)
0,5 4,2
Extracto de levadura (g/L)
10 3,2
KH2PO4
3 3 8
Sulfato de amonio (g/L)
6,3
NH4Cl (g/L)
1
NaCl (g/L)
0,5
Na2HPO4·12H2O (g/L)
5,07
DL-Metionina (g/L)
0,5 0,5
L-Isoleucina (g/L)
0,05 0,5 0,5
L-Treonina (g/L)
0,5 0,5
[Tabla 5] Producción de precursor de metionina en un fermentador
O-succinil homoserina (g/L)
O-acetil homoserina (g/L)
CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL
>80 0
CJM-BTJA/pCJ-MetXlme-CL
0 >55
Ejemplo 3: Producción de enzima convertidora de metionina
<3-1> Cistationina gamma sintasa derivada de E. coli
Se clonó el gen metB que codifica cistationina gamma sintasa derivada de E. coli, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina u O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de E. coli como plantilla con los cebadores de SEQ ID NO: 13 y NO: 14 como se indica a continuación; 25 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NcoI/HindIII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ-Corea) digerido con las mismas enzimas. El vector resultante fue denominado pCJ-MetB-CL y en la Figura 4 se muestra el diagrama esquemático. Se transformó E. coli W3110 con el vector clonado y a continuación se cultivó en medio de placa LB que contenía 50 µg/L de espectinomicina, seguido de selección de colonia. La colonia seleccionada fue inoculada en 3 mL de medio LB que contenía 50 µg/L de espectinomicina, seguido de cultivo a 37ºC durante una noche. Las células de cultivo fueron recuperadas, lavadas con tampón de fosfato potásico 0,1 M (pH 7,5), suspendidas en 200 µL de tampón de fosfato potásico, y lisadas con ultrasonidos 5 veces a intervalos de 30 segundos. El lisato celular se centrifugó a 12.000 rpm durante 10 minutos y se obtuvo el sobrenadante para cuantificar el nivel total de proteína usando una disolución de cuantificación de proteínas de Bio-Rad (Bio-Rad, EE.UU.). La expresión de proteínas se identificó mediante SDS-PAGE. El sobrenadante obtenido del extracto celular se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-2> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Pseudomonas sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Pseudomonas sp., que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina. Como microorganismos Pseudomonas sp., se usaron la Pseudomonas aeruginosa y la Pseudomonas putida.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de cada cepa como plantilla con los cebadores de SEQ ID NO: 15 y NO: 16 para la Pseudomonas aeruginosa y los cebadores de SEQ ID NO: 17 y NO: 18 para la Pseudomonas putida como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/PacI y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <1-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-3> O-acetil homoserina sulfhidrilasa derivada de Pseudomonas sp.
Se clonó el gen metY que codifica O-acetil homoserina sulfhidrilasa derivada de Pseudomonas sp., que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Pseudomonas aeruginosa como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 19 y NO: 20 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/PacI y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-4> Cistationina sintasa derivada de Corynebacterium glutamicum
Se clonó el gen metB que codifica cistationina sintasa derivada de Corynebacterium glutamicum, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Corynebacterium glutamicum como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 21 y NO: 22 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NcoI/HindIII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-5> O-acetil homoserina sulfhidrilasa derivada de Corynebacterium glutamicum
Se clonó el gen metZ que codifica O-acetil homoserina sulfhidrilasa derivada de Corynebacterium glutamicum, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Corynebacterium glutamicum como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 23 y NO: 24 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-6> O-acetil homoserina sulfhidrilasa derivada de Leptospira sp.
Se clonó el gen metY que codifica O-acetil homoserina sulfhidrilasa derivada de Leptospira meyeri, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Leptospira meyeri como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 25 y NO: 26 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-7> O-acetil homoserina sulfhidrilasa derivada de Saccharomyces sp.
Se clonó el gen met25 que codifica O-acetil homoserina sulfhidrilasa derivada de Saccharomyces cerevisiae, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Saccharomyces cerevisiae como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 27 y NO: 28 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/PacI y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-8> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Chromobacterium sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Chromobacterium violaceum, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Chromobacterium violaceum como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 29 y NO: 30 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-9> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Nocardia sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Nocardia farcinica, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Nocardia farcinica como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 31 y NO: 32 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-10> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Bradyrhizobium sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Bradyrhizobium japonicum, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Bradyrhizobium japonicum como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 33 y NO: 34 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-11> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Hyphomonas sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Hyphomonas neptunium, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Hyphomonas neptunium como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 35 y NO: 36 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con BamHII/HindIII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-12> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Methylococcus sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Methylococcus capsulatus, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Methylococcus capstulatus como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 37 y NO: 38 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-13> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Methylobacillus sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Methylobacillus flagellatus, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Methylobacillus flagelatus como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 39 y NO: 40 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-14> O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Nitrosomonas sp.
Se clonó el gen metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Nitrosomonas europaea, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Nitrosomonas europaea como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 41 y NO: 42 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-15> Cistationina sintasa derivada de Klesiella sp.
Se clonó el gen metB que codifica cistationina sintasa derivada de Klesiella pneumoniae, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Klesiella pneumoniae como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 43 y NO: 44 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-16> Cistationina sintasa derivada de Bacillus sp.
Se clonó el gen metB que codifica cistationina sintasa derivada de Bacillus subtilis, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Bacillus subtilis como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 45 y NO: 46 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-17> Cistationina sintasa derivada de Shigella sp.
Se clonó el gen metB que codifica cistationina sintasa derivada de Shigella flexneri 2457T, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Shigella flexneri 2457T como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 47 y NO: 48 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-18> Cistationina sintasa derivada de Colwellia sp.
Se clonó el gen metB que codifica cistationina sintasa derivada de Colwellia psychrerythraea, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Colwellia phychrerythraea como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 49 y NO: 50 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-19> Cistationina sintasa derivada de Salmonella sp.
Se clonó el gen metB que codifica cistationina sintasa derivada de Salmonella entérica serovar paratyphi A, que se usaría para la conversión de O-succinil homoserina o de O-acetil homoserina, el precursor de metionina, en metionina.
Se llevó a cabo una PCR usando el cromosoma de Salmonella entérica serovar paratyphi A como plantilla y los cebadores de SEQ ID NO: 51 y NO: 52 como se indica a continuación; 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, maduración a 55ºC durante 30 segundos, extensión a 72ºC durante 2 minutos.
El fragmento de ADN obtenido fue digerido con NdeI/AvrII y clonado en vector pCL-CJ1 (CJ, Corea) digerido con las mismas enzimas. Se obtuvo el sobrenadante del extracto celular usando el vector clonado del mismo modo que se ha descrito en el Ejemplo <3-1> y se usó para la reacción de conversión enzimática.
<3-20> Comparación de las actividades de las enzimas convertidoras usando OSHS como sustrato.
Se comparó la actividad de cada una de las disoluciones enzimáticas obtenidas en los Ejemplos <3-1> a <3-19> para seleccionar la enzima convertidora de metionina óptima.
En primer lugar, se disolvió O-succinil homoserina (Sigma, EE.UU.) en tampón de fosfato potásico 0,1 M (pH 7,5) a una concentración de 3 mM. Se añadió piridoxal 5’-fosfato (Sigma, EE.UU.) usado como co-enzima a la disolución de reacción a una concentración final de 10 µM. Se añadió metil mercaptano (Metil mercaptano, Tokyo Kasei Organic Chemicals, Japón), usado como sustrato adicional, a la disolución de reacción a una concentración final de 2 mM. Se colocó 1 mL de disolución de reacción a 37ºC, a la cual se añadieron 10 µL de cada disolución de enzima (concentración de proteína: 5 mg/mL). Se recolectaron 100 µL de la disolución de reacción cada 5 – 10 minutos y se añadieron a 900 µL de disolución de DTNB (Sigma, EE.UU.) de 4 mg/mL. Se midió la DO415 para confirmar el avance de la reacción.
Se hizo reaccionar el DTNB con el grupo SH del metilmercaptano que quedaba en la disolución de reacción y se sintetizó así una sustancia amarilla. Por tanto, el avance o no de la reacción se comprobó observando la desaparición del color amarillo de la disolución de reacción resultante de la reacción de conversión de metilmercaptano en metionina.
Tal como se muestra en la Figura 5, se demuestra que la O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Chromobacterium sp., la O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Norcardia sp., la O-succinil homoserina sulfhidrilasa y la O-acetil homoserina sulfhidrilasa derivadas de Pseudomonas sp. presentan elevadas actividades enzimáticas. Otras enzimas también mostraron algún grado de actividad, pero sus velocidades de reacción fueron relativamente bajas. La reactividad de cada enzima con el sustrato se recoge en la Tabla 6. Tras completar la reacción de una hora, se llevó a cabo un análisis de HPLC para confirmar las producciones finales de metionina y ácido succínico. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
<3-21> Comparación de las actividades de las enzimas convertidoras usando OAHS como sustrato
El experimento se llevó a cabo con O-acetil homoserina de la misma manera descrita en el Ejemplo <3-20>. La Oacetil homoserina se purificó a partir del sobrenadante de la disolución fermentada. Para la reacción se usaron las mismas disoluciones de reacción y disoluciones enzimáticas usadas para el experimento con O-succinil homoserina. Tal como se muestra en la Figura 6, se demostró que la O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Hypomononas sp., la O-acetil homoserina sulfhidrilasa derivada de Pseudomonas sp., la O-succinil homoserina sulfhidrilasa de Chromobacterium sp. y la O-succinil homoserina derivada de Leptospira sp., presentan elevadas actividades enzimáticas. Otras enzimas también mostraron algún grado de actividad, pero sus velocidades de reacción fueron relativamente bajas. En la Tabla 6 se presentan las reactividades de cada enzima con cada sustrato. Tras completar una hora de reacción, se aplicó análisis de HPLC para confirmar las producciones finales de metionina y ácido succínico. Los resultados se muestran en la Tabla 8.
[Tabla 6]
Reacción de conversión de O-succinil homoserina y O-acetil homoserina mediante enzimas derivadas de cada cepa
Cepa
Nº de cepa (ATCC) Gen (KEGG) Especificidad de sustrato
OSH
OAH
Escherichia coli K12
55151 MetB + +
Pseudomonas aurogenosa
17933 MetZ +++ +
Cepa
Nº de cepa (ATCC) Gen (KEGG) Especificidad de sustrato
OSH
OAH
MetY
++++ ++++
Pseudomonas putida
17390 MetZ ++++ +
Corynebacterium glutamicum
13032 MetB + +
MetY
+ +
Leptospira meyeri
43278 MetY + ++
Saccharomyces cerevisiae
2704 Met25 + +
Chormobacterium violaceum
12472 MetZ ++++ +++
Nocardia farcinica
3318 MetZ ++++ +
Bradyrhizobium japonicum
10324 MetZ + +
Hyphomonas neptunium
49408 MetZ + ++++
Methylococcus capsulatus
19069D-5 MetZ + +
Methylobacillus flagellatus
51484D MetZ + +
Nitrosomas europaea
19718D MetZ + +
Klesiella pneumoniae
25955 MetB + +
Bacillus subtilis
10783 MetB + +
Shigella flexneri 2475T
700930D-5 MetB + +
Cowwellia psychrerythraea
BAA-618D MetB + +
Salmonella entérica serovar paratyphi A
9150D MetB + +
[Tabla 7] Capacidad de producción de metionina y ácido succínico a partir de O-succinil homoserina para cada enzima.
Enzima, gen
Cantidad de metionina (g/L) Cantidad de ácido succínico (g/L)
Corynebacterium glutamicum, metB
0,05 0,03
Escherichia coli, metB
0,14 0,1
Nocardia farcinica, metZ
0,21 0,17
Pseudomonas putida, metZ
0,22 0,17
Pseudomonas aurogenosa, metZ
0,22 0,17
Chromobacterium violaceum
0,22 0,17
Pseudomonas aurogenosa, metY
0,21 0,17
[Tabla 8] Producción de metionina y ácido acético a partir de O-acetil homoserina para cada enzima.
Enzima, gen
Cantidad de metionina (g/L) Cantidad de ácido acético (g/L)
Pseudomonas aurogenosa, metY
0,22 0,081
Chromobacterium violaceum, metZ
0,18 0,068
Hyphomonas neptunium, metZ
0,22 0,082
Corynebacterium glutamicum, metY
0,05 0,015
Leptospira meyeri, metY
0,15 0,05
<3-22> Identificación de la inhibición de retroalimentación para enzima convertidora
La inhibición de retroalimentación fue identificada en presencia o en ausencia de metionina del mismo modo descrito en los Ejemplos <3-20> y <3-21>. Las disoluciones de reacción fueron preparadas de la misma manera indicada anteriormente y se llevó a cabo la misma reacción añadiendo o no 5 g/L de metionina en cada reacción de disolución. Se asignó un 100% a la velocidad de reacción de la disolución de reacción sin metionina, y la actividad remanente en presencia de metionina se calculó como un % en base a ésta. Los resultados se muestran en la Tabla
9.
Como resultado, la actividad de la O-acetil homoserina sulfhidrilasa derivada de Pseudomonas sp., la O-succinil homoserina sulfhidrilasa derivada de Norcardia sp. y la O-acetil homoserina sulfhidrilasa derivada de Leptospira sp. fueron inhibidas por la metionina, lo que sugiere que dichas actividades enzimáticas fueron inhibidas por el sistema de retroalimentación en presencia de metionina. Se usaron enzimas sin sistema de retroalimentación en reacciones adicionales. Se asumió que la enzima era inhibida por el sistema de retroalimentación en la realización anterior para uso en la misma reacción cuando se usó una cepa mutante libre de sistema de retroalimentación.
[Tabla 9]
Inhibición de la actividad enzimática por metionina
Enzima, gen
Actividad remanente (%)
OSHS
OAHS
Chromobacterium violaceum, metZ
97 100
Pseudomonas aurogenosa, metY
54 53
Nocardia farcinica, metZ
68
Pseudomonas putida, metZ
98
Pseudomonas aurogenosa, metZ
98
Leptospira meyeri, metY
45
Hyphomonas neptunium, metZ
100
<3-23> Comparación de homología entre las enzimas convertidoras
Se comparó la homología entre enzimas convertidoras usadas la reacción de conversión para investigar las interacciones de la reactividad frente a O-succinil homoserina y O-acetil homoserina y la inhibición de retroalimentación.
A partir de la comparación de la homología entre las enzimas convertidoras usadas en la presente memoria, se confirmó que la homología entre los metZs que codifican O-succinil homoserina sulfhidrilasa y la homología entre los metYs que codifican O-acetil homoserina sulfhidrilasa fueron superiores a la homología entre los metZs y los metYs. En relación con la anterior realización, existen muchos casos de metZ que codifica O-succinil homoserina sulfhidrilasa que no exhibe la inhibición de retroalimentación. Sin embargo, se identificó que el metY que codifica Oacetil homoserina sulfhidrilasa era inhibido por el sistema de retroalimentación relativamente elevada, debido a que todas las enzimas usadas en los ejemplos fueron inhibidas por retroalimentación. Respecto a la selectividad a la Osuccinil homoserina y la O-acetil homoserina, el grupo de gen metZ presentó una elevada selectividad a la O-succinil homoserina, mientras que el grupo de gen metY presentó una elevada selectividad a O-acetil homoserina. Entre medias, el metY derivado de Pseudomonas putida y el metZ derivado de Chromobacterium violaceum presentaron una reactividad específicamente elevada para ambos sustratos.
Las secuencias de aminoácidos de todas las enzimas usadas en la presente memoria fueron alineadas mediante el programa Clustal W (DNAstar). Como resultado, todas ellas presentaron los dominios representados por las siguientes secuencias. Por lo tanto, las enzimas que presentan los siguientes dominios pueden producir metionina de la misma manera.
Dominio 1: Y-(S, I, T, V)-R-X-X-(N,S)
Dominio 2: (V,A,I)-(V,L,I)-D-N-X-(F,V,M,I)-X-(T,S)-(P,A)-X-(L,I)-(Q,C,V)-X-(P,G)-(L,F)-X-(L,M,H)-G-(A,V)-(D,H)
Dominio 3: (S,A,G,P)-(P,A,V)-F-(N,D)-(A,S)-(W,F,Y)-X-X-X-(K,W,R,S)-G-(L,M,V,I,M)-(E,K,D,R)-T-(L,M)-
Dominio 5: (H,Y)-(P,A)-(A,S)-(T,S)-(T,M,Q)-(T,S)-H
Dominio 6: (V,I,L)-R-(V,I,L,F)-(S,A)-(V,I,T)-G-(L,I)-E-
Ejemplo 4: Reacción de conversión de metionina mediante enzima convertidora
<4-1> Producción en masa de enzima convertidora
Para producir en masa la cepa productora de enzima convertidora de metionina construida en el Ejemplo 2 (2-2 a 28), la cepa se cultivó en un fermentador de 1 L. Se transformó una cepa (W3110) con vector de expresión metZ derivado de Pseudomonas sp. o vector de expresión de metZ derivado de Hyphomonas sp. Las cepas transformadas fueron inoculadas sobre medio de placa LB que contenía espectinomicina, seguido de cultivo a 30 – 40ºC durante una noche. La única colonia obtenida fue inoculada en 40 mL de medio LB que contenía espectinomicina, seguido de cultivo a 30 – 40ºC durante 5 horas. La cepa cultivada que expresa metZ derivada de Pseudomonas sp. y la cepa cultivada que expresa metZ derivada de Hyphomonas sp. fueron cultivadas en un fermentador de 1 L a 30 – 40ºC, 600 – 900 rpm durante 15 – 30 horas. En la Tabla 10 se muestra la composición del medio de cultivo.
La disolución de enzima convertidora de metionina se preparó homogeneizando células de las disolución fermentada usando ultrasonidos.
[Tabla 10]
Composición del medio para la producción de enzima convertidora
Composición de medio 2XYT
Extracto de levadura (g/L)
10
Triptófano (g/L)
16
Glucosa (g/L)
40
Espectinomicina (g/L)
50
<4-2> Reacción de conversión de metionina
La reacción de conversión de metionina se llevó a cabo usando disolución de enzima convertidora de O-succinil homoserina derivada de Pseudomonas sp. y disolución de enzima convertidora de O-acetil homoserina derivada de Hyphomonas sp. preparadas en el Ejemplo 4 (4-1), respectivamente en la disolución de fermentación de O-succinil homoserina y O-acetil homoserina preparadas en el Ejemplo 2 (2-2).
Se añadieron 0,1 L de disolución de cultivo enzimático de células lisadas a 2,0 L de disolución de fermentación de precursor de metionina que no eliminó la célula, al cual se añadieron 0,3 L de Na-metilmercaptano al 15% para iniciar la reacción. Dos horas después, la disolución de fermentación se recuperó y las células fueron eliminadas. Se llevó a cabo un análisis de HPLC para confirmar la producción de metionina. Los resultados se muestran en la Tabla
11.
[Tabla 11]
L-metionina (g/L)
Ácido succínico (g/L) Ácido acético (g/L)
Disolución de fermentación de O-succinil homoserina (>80 g/L)
>42 >33 0
Disolución de fermentación de O-acetil homoserina (>55 g/L)
>40 0 >15
Como resultado, mientras que en el método convencional la L-metionina se produce a una baja concentración, de hasta 10 g/L, con el método de la presente invención se puede producir L-metionina a gran escala a concentraciones de hasta 30 g/L.
Aplicabilidad industrial
El método de la invención permite la producción selectiva de L-metionina, que es superior a la síntesis química convencional que produce D-metionina y L-metionina juntas, y la producción de ácidos orgánicos tales como ácido succínico o ácido acético como subproductos sin ningún proceso independiente adicional.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> CJ CHEILJEDANG CORPORATION
5 <120> Microorganismo productor de precursor de L-metionina y método para producir L-metionina y ácido orgánico a partir de precursor de L-metionina
<130> 69.60.98072
<140> EP 07793305.9
<141>
<150> PCT/KR2007/003650 15 <151>
<150> KR 10-2006-0071581
<151>
<150> KR 10-2007-0076045
<151>
<160> 71
25 <170> Kopatentln 1.71
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador para la amplificación de cloranfenicol
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador para la amplificación de cloranfenicol
<210> 3 45 <211> 70
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador para la amplificación de kanamicina <212> DNA
<210>
4
<211>
70
22
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador para la amplificación de kanamicina
<400> 4
agacaaccga catcgctttc aacattggcg accggagccg ggaaggcaaa catatgaata 60 tcctccttag 70
<210> 5
<211> 71
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador para la amplificación de cloranfenicol
<211> 65
<212> DNA
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador para la amplificación de cloranfenicol
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<210>8
<211>19
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<210>9
<211>28
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<210>
10
<211>
28
<212>
DNA
<213>
Escherichia coli
5
<400>
10
agctctagac tgctgaggta cgtttcgg
28
<210>
11
10
<211> 23
<212>
DNA
<213>
Leptospira meyeri
<210>
12
<211>
26
<212>
DNA
<213>
Leptospira meyeri
<210>
13
<211>
33
<212>
DNA
<213>
Escherichia coli
<210>
14
<211>
30
<212>
DNA
<213>
Escherichia coli
<210> 15 15 <211> 30
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa
20 <210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> Pseudomonas aeruginosa
<210>
17
<211>
30
<212>
DNA
<213>
Pseudomonas putida
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> Pseudomonas putida
<210> 19
<211> 29
<212>
DNA 10 <213> Pseudomonas aeruginosa
<210> 20
<211> 28
<212>
DNA 15 <213> Pseudomonas aeruginosa
<210> 21
<211> 29 20 <212> DNA
<213> Gorynebacterium glutamicum
<210> 22 25 <211> 27
<212> DNA
<213> corynebacterium glutamicum
30 <210> 23
<211> 30
<212> DNA
<213>
Corynebacterium glutamicum
<213>
Corynebacterium glutamicum
<213>
Leptospi ra meyeri
<210>
25
<211>
28
<212>
DNA
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> Leptospira meyeri
<210> 27
<211>
28 10 <212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<210> 28
<211>
28 15 <212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<210> 29
<211>
21 20 <212> DNA
<213> chromobacterium violaceum
<210> 30
<211>
24 25 <212> DNA
<213> Chromobacterium violaceum
<210> 31
<211>
24 30 <212> DNA
<213> Nocardia farcinica <210> 34
<211>
24
<212>
DNA
<213>
Nocardia farcinica
<210>
33
<211>
24
<212>
DNA
40
<213> Bradyrhizobium japom'cum
<211> 24
<212> DNA
<213> Bradyrhizobium japonicum
<211>
25
<212>
DNA
<213>
Hyphomonas Neptunium
<210>
36
<211>
24
<212>
DNA
<213>
Hyphomonas Neptunium
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213>
Methylococcus capsulatus
<213>
Methylococcus capsulatus
<210>
39
<211>
25
<212>
DNA
<213>
Methylobacillus Flagellatus
<210>
40
<211>
25
<212>
DNA
<213>
Methylobacillus Flagellatus
<210>
41
<210>
42
<211>
22
<212>
DNA
<213>
Nitrosomonas europaea
<211> 25
<212> DNA
<213> Nitrosomonas europaea
<210>
43
<211>
23
<212>
DNA
<213>
Klesiella pneumoniae
<210>
44
<211>
25
<212>
DNA
<213>
Klesiella pneumoniae
<210>
45
<211>
23
<212>
DNA
<213>
Bacillus subtilis
<210>
46
<211>
27
<212>
DNA
<213>
Bacillus subtilis
<212> DNA
<213> Shigella flexneri 2457T
<210>
48
<211>
27
<212>
DNA
<213>
Shigella flexneri 2457T
<210>
49
<211>
33
<212>
DNA
5
<213> Colwellia Psychrerythraea
<210> 50
<211> 30
<212> DNA 10 <213> Colwellia Psychrerythraea
<210> 51 15 <211> 23
<212> DNA
<213> salmonella enterica serovar Paratyphi A
<210>
52
<211>
27
<212>
DNA
25
<213> Salmonella enterica serovar Paratyphi A
<210> 53
<211> 403 30 <212> PRT
<213> Pseudomonas aeruginosa
<210>
54
<211>
403
<212>
PRT
5
<213> Pseudomonas putida
<210> 55
<211> 425
<212> PRT
<213> Pseudomonas putida
<210> 56
<211> 394
<212> PRT
<213> chromobacterium violaceum
<210> 57
<211> 404
<212> PRT
<213> Nocardia farcinica
<210>
58
<210>
59
<211>
417
<212>
PRT
<213>
Bradyrhizobium Japonicum
<211> 399
<212> PRT
<213> Hyphomonas Neptunium
<210> 60
<211> 383
<212> PRT
<213> Methylococcus Capsulatus
<210> 61
<211> 392
<212> PRT
<213> Methylobacillus Flagellatus
5
<210> <211> <212> <213> 62 391 PRT Nitrosomonas Europaea
<400>
62
40
<210> 63
<211> 386
<212> PRT
<213> Klesiella Pneumoniae
<210> 64
<211> 373
<212> PRT
<213> Bacillus Subtilis
<210> 65
<211> 386
<212> PRT
<213> Shigella flexneri 2457T
<210> 66
<211> 388
<212> PRT
<213> Colwellia Psychrerythraea
<210> 67
<211> 386
<212> PRT
<213> Salmonella enterica serovar Paratyphi A
<210>
68
<211>
20
<212>
DNA
<213>
corynebacterium glutamicum
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<211>
70
<212>
DNA
<213>
Escherichia coli
<210>
71
<211>
70
<212>
DNA
<213>
Escherichia coli

Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Un método para producir L-metionina y ácidos orgánicos, que comprende las siguientes etapas:
    1) preparar una cepa productora de precursor de L-metionina y producir precursor de L-metionina mediante fermentación de dicha cepa, donde la cepa productora de precursor de L-metionina se preparar mediante eliminación o debilitamiento de la actividad de cistationina gamma sintasa o de O-succinil homoserina sulfhidrilasa o de O-acetil homoserina sulfhidrilasa implicadas en la degradación de precursor de L-metionina y potenciando la actividad de homoserina O-succinil transferasa o de homoserina O-acetil transferasa implicada en la síntesis de precursor de L-metionina a partir de homoserina; y
    2) producir L-metionina y ácidos orgánicos mediante reacción enzimática usando el precursor de L-metionina y metilmercaptano como sustratos, donde la reacción enzimática es inducida mediante enzimas o cepas microbianas que contienen la actividad de cistationina gamma sintasa o de O-succinil homoserina sulfhidrilasa o de O-acetil homoserina sulfhidrilasa, donde el precursor de L-metionina es O-acetil homoserina u O-succinil homoserina.
  2. 2.- El método según la reivindicación 1, donde la cepa productora de precursor de L-metionina de la etapa 1) se selecciona del grupo que consiste en Escherichia sp. o Corynebacterium sp.
  3. 3.-El método según la reivindicación 1 ó 2, donde la cepa productora de precursor de L-metionina de la etapa 1) se deriva de cepa productora de L-treonina, L-isoleucina o L-lisina seleccionada de Escherichia sp. o Corynebacterium sp.
  4. 4.-El método según la reivindicación 1, donde la cistationina gamma sintasa o la O-succinil homoserina sulfhidrilasa o la O-acetil homoserina sulfhidrilasa de la etapa 1) están codificadas respectivamente por metB o metZ o metY, o sus genes mutantes.
  5. 5.-El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la cepa productora de precursor de Lmetionina de la etapa 1) se caracteriza por usar la cepa cuya ruta de biosíntesis de treonina, isoleucina o lisina es debilitada o eliminada.
  6. 6.-El método según la reivindicación 5, donde la cepa se caracteriza por la eliminación o el debilitamiento de homoserina quinasa codificada por el gen thrB.
  7. 7.-El método según la reivindicación 1, donde la síntesis de precursor de L-metionina es potenciada por la sobreexpresión de gen metA que codifica homoserina O-succinil transferasa o gen metX que codifica homoserina O-acetil transferasa.
  8. 8.-El método según la reivindicación 1, donde el gen auténtico de homoserina O-succinil transferasa de un microorganismos es eliminado o debilitado, y a continuación se introduce un nuevo gen de homoserina O-acetil transferasa con el objetivo de potenciar la síntesis de O-acetil homoserina, o donde el gen auténtico de homoserina acetil transferasa de un microorganismo es eliminado o debilitado, y a continuación se introduce un nuevo gen de homoserina O-succinil transferasa con el objetivo de potenciar la biosíntesis de O-succinil homoserina.
  9. 9.-El método según la reivindicación 1, donde la cepa productora de precursor de L-metionina se prepara mediante el proceso completo, o una parte, del método de la reivindicación 2 a la reivindicación 8.
  10. 10.-El método según la reivindicación 1, donde la cepa productora de precursor de L-metionina se deriva de la cepa productora de treonina MF001 de Escherichia coli libre de dependencia de metionina (Nº de acceso: KCCM-10568).
  11. 11.-El método según la reivindicación 1, donde la cepa productora de precursor de L-metionina se selecciona del grupo que consiste en CJM-BTJ(pMetA-CL) de Escherichia coli (Nº de acceso: KCCM-10767) que es la cepa productora de O-succinil homoserina, CJM-BTJ(ptJ-MetA-CL) de Escherichia coli (Nº de acceso: KCCM-10872) que es la cepa productora de O-succinil homoserina, y CJM-BTJA(pCJ-MetX-CL) de Escherichia coli (Nº de acceso: KCCM-10873) que es la cepa productora de O-acetil transferasa.
  12. 12.-El método según la reivindicación 1, donde la enzima convertidora de la etapa 2) que convierte el precursor de Lmetionina en metionina se deriva de una cepa seleccionada del grupo que consiste en Escherichia sp., Corynebacterium sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Salmonellar sp., Brevibacterium sp., Hyphomonas sp., Chromobacterium sp. y Norcardia sp. o levaduras.
  13. 13.-El método según la reivindicación 1, donde la enzima convertidora de la etapa 2) que convierte precursor de Lmetionina en metionina se deriva de una cepa seleccionada del grupo que consiste en las siguientes cepas:
    Escherichia coli, Pseudomonas aurogenosa, Pseudomonas putida, Corynebacteria glutamicum, Leptospira meyeri, Saccharomyces cerevisiae, Chromobacterium violaceum, Nocardia farcinica, Bradyrhizobium japonicum, Hyphomonas neptunium, Methylococcus capsulatus, Methylobacillus flagellatus, Nitrosomas europaea, Klesiella pneumoniae, Bacillus subtilis, Shigella flexneri, Colwellia psychrerythraea y Salmonella entérica serovar paratyphi A.
  14. 14.-Una cepa para la producción de precursor de L-metionina de la etapa 1) de la reivindicación 1, donde dicha cepa es tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, ó 10 a 13.
    Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8
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