JP5078101B2 - Ｌ−メチオニン前駆体産生菌株およびｌ−メチオニン前駆体からのｌ−メチオニンおよび有機酸の産生方法 - Google Patents
Ｌ−メチオニン前駆体産生菌株およびｌ−メチオニン前駆体からのｌ−メチオニンおよび有機酸の産生方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5078101B2 JP5078101B2 JP2009521706A JP2009521706A JP5078101B2 JP 5078101 B2 JP5078101 B2 JP 5078101B2 JP 2009521706 A JP2009521706 A JP 2009521706A JP 2009521706 A JP2009521706 A JP 2009521706A JP 5078101 B2 JP5078101 B2 JP 5078101B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- homoserine
- strain
- methionine
- producing
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 title claims description 205
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 title claims description 203
- 239000002243 precursor Substances 0.000 title claims description 90
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 68
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 title claims description 68
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 34
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 title claims description 11
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 135
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 99
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 89
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 89
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 85
- FCXZBWSIAGGPCB-YFKPBYRVSA-N O-acetyl-L-homoserine Chemical compound CC(=O)OCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O FCXZBWSIAGGPCB-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 75
- GNISQJGXJIDKDJ-YFKPBYRVSA-N O-succinyl-L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCOC(=O)CCC(O)=O GNISQJGXJIDKDJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 73
- 108010061618 O-succinylhomoserine (thiol)-lyase Proteins 0.000 claims description 57
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 52
- 101150060102 metA gene Proteins 0.000 claims description 41
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 38
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 33
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 30
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 30
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 28
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 24
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 24
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 23
- 101150114053 metZ gene Proteins 0.000 claims description 23
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 22
- 101150003180 metB gene Proteins 0.000 claims description 22
- 101710083973 Homocysteine synthase Proteins 0.000 claims description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 21
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 20
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 101150115974 metX gene Proteins 0.000 claims description 18
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 16
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 claims description 15
- 241000588881 Chromobacterium Species 0.000 claims description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 14
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 12
- 101150072448 thrB gene Proteins 0.000 claims description 12
- 101150059195 metY gene Proteins 0.000 claims description 11
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 10
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 10
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 10
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 10
- 101150040895 metJ gene Proteins 0.000 claims description 10
- 108010016979 Homoserine O-succinyltransferase Proteins 0.000 claims description 9
- 108010034653 homoserine O-acetyltransferase Proteins 0.000 claims description 9
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims description 9
- 101100290837 Bacillus subtilis (strain 168) metAA gene Proteins 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 7
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 7
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 claims description 5
- 241000588768 Providencia Species 0.000 claims description 5
- 241000607720 Serratia Species 0.000 claims description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 claims description 4
- 241000588879 Chromobacterium violaceum Species 0.000 claims description 4
- 241001619535 Hyphomonas neptunium Species 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- 241001148629 Leptospira meyeri Species 0.000 claims description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010071598 homoserine kinase Proteins 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 claims description 4
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 3
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 claims description 3
- 102100033451 Thyroid hormone receptor beta Human genes 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 241000589174 Bradyrhizobium japonicum Species 0.000 claims description 2
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 claims description 2
- 241000589346 Methylococcus capsulatus Species 0.000 claims description 2
- 229910052781 Neptunium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- LFNLGNPSGWYGGD-UHFFFAOYSA-N neptunium atom Chemical compound [Np] LFNLGNPSGWYGGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 claims 2
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 claims 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 claims 1
- 241000862981 Hyphomonas Species 0.000 claims 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 241000605121 Nitrosomonas europaea Species 0.000 claims 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 78
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 71
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 65
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 30
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 27
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 26
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 26
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 26
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 25
- YPWSLBHSMIKTPR-UHFFFAOYSA-N Cystathionine Natural products OC(=O)C(N)CCSSCC(N)C(O)=O YPWSLBHSMIKTPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N D-cystathionine Natural products OC(=O)C(N)CCSCC(N)C(O)=O ILRYLPWNYFXEMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- ILRYLPWNYFXEMH-WHFBIAKZSA-N L-cystathionine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CCSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O ILRYLPWNYFXEMH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 12
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 11
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 230000009123 feedback regulation Effects 0.000 description 7
- 101150043924 metXA gene Proteins 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- -1 propionyl homoserine Chemical compound 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 6
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 5
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 5
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 101150086633 metAA gene Proteins 0.000 description 5
- 101150091110 metAS gene Proteins 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 4
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 241000605122 Nitrosomonas Species 0.000 description 3
- 108700027408 O-acetylhomoserine (thiol)-lyase Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 3
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 3
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 3
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 3
- 101150095438 metK gene Proteins 0.000 description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 3
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobutanoic acid Natural products CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710188260 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase Proteins 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100076641 Bacillus subtilis (strain 168) metE gene Proteins 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N D-alpha-aminobutyric acid Chemical compound CC[C@@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 2
- FFFHZYDWPBMWHY-UHFFFAOYSA-N L-Homocysteine Natural products OC(=O)C(N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000008545 L-lysines Chemical class 0.000 description 2
- GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N L-thialysine Chemical compound NCCSC[C@H](N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 2
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000589327 Methylobacillus flagellatus Species 0.000 description 2
- 241000589345 Methylococcus Species 0.000 description 2
- FXDNYOANAXWZHG-VKHMYHEASA-N O-phospho-L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCOP(O)(O)=O FXDNYOANAXWZHG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 2
- 102100026115 S-adenosylmethionine synthase isoform type-1 Human genes 0.000 description 2
- 108050008511 S-adenosylmethionine synthases Proteins 0.000 description 2
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 2
- 101100116199 Streptomyces lavendulae dcsE gene Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150057540 aar gene Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 101150117293 metC gene Proteins 0.000 description 2
- 101150108178 metE gene Proteins 0.000 description 2
- 101150051471 metF gene Proteins 0.000 description 2
- 101150042623 metH gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 150000002741 methionine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 2
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 2
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxypentanal Chemical compound OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 2-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O SLAMLWHELXOEJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LGVJIYCMHMKTPB-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxynorvaline Chemical compound CCC(O)C(N)C(O)=O LGVJIYCMHMKTPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBKRXUMXMKBCLD-UHFFFAOYSA-N 5-(2-methylsulfanylethyl)imidazolidine-2,4-dione Chemical compound CSCCC1NC(=O)NC1=O SBKRXUMXMKBCLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002610 5-methyltetrahydropteroyltriglutamate-homocysteine S-methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 101100130094 Bacillus subtilis (strain 168) metK gene Proteins 0.000 description 1
- 208000020084 Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 241000589171 Bradyrhizobium sp. Species 0.000 description 1
- 241000941525 Chromobacterium sp. Species 0.000 description 1
- 241001135744 Colwellia Species 0.000 description 1
- 241001135745 Colwellia psychrerythraea Species 0.000 description 1
- 241000557614 Colwellia sp. Species 0.000 description 1
- 241000186249 Corynebacterium sp. Species 0.000 description 1
- 108010076010 Cystathionine beta-lyase Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N D-methionine Chemical compound CSCC[C@@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 241000488157 Escherichia sp. Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- GGLZPLKKBSSKCX-YFKPBYRVSA-N L-ethionine Chemical compound CCSCC[C@H](N)C(O)=O GGLZPLKKBSSKCX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- MBEPFGPQVBIIES-WDSKDSINSA-N L-homolanthionine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCSCC[C@H](N)C(O)=O MBEPFGPQVBIIES-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000589924 Leptospira sp. Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 102100025169 Max-binding protein MNT Human genes 0.000 description 1
- 101100023016 Methanothermobacter marburgensis (strain ATCC BAA-927 / DSM 2133 / JCM 14651 / NBRC 100331 / OCM 82 / Marburg) mat gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031551 Methionine synthase Human genes 0.000 description 1
- 101710163328 Methionine synthase Proteins 0.000 description 1
- 241000589325 Methylobacillus Species 0.000 description 1
- 241000557267 Methylobacillus sp. Species 0.000 description 1
- 241001533218 Methylococcus sp. Species 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 241000143395 Nitrosomonas sp. Species 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235088 Saccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- 241000607149 Salmonella sp. Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000607758 Shigella sp. Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000001430 anti-depressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000010364 biochemical engineering Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 101150091561 galP gene Proteins 0.000 description 1
- 101150093502 galR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 101150097303 glyA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150079604 glyA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 235000013882 gravy Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 description 1
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000002519 isoleucine derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- ZNOVTXRBGFNYRX-ABLWVSNPSA-N levomefolic acid Chemical compound C1NC=2NC(N)=NC(=O)C=2N(C)C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 ZNOVTXRBGFNYRX-ABLWVSNPSA-N 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006053 organic reaction Methods 0.000 description 1
- 101150088738 pckA gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 150000003568 thioethers Chemical class 0.000 description 1
- 101150000850 thrC gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150028338 tyrB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150044161 tyrR gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/12—Methionine; Cysteine; Cystine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
- C07C323/50—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
- C07C323/51—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
- C07C323/57—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups
- C07C323/58—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups with amino groups bound to the carbon skeleton
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明はＬ−メチオニンおよび有機酸の産生方法に関するものであって、より詳しくは本発明によって作製されたＬ−メチオニン前駆体産生菌株を使用して作製されたＬ−メチオニン前駆体から酵素転換反応を用いてＬ−メチオニンおよび有機酸を高収率で産生することによって、既存の方法に比べて環境にやさしい方法でＬ−メチオニンを産生し、Ｌ−メチオニンを選択的に産生することによって飼料および食品添加剤、医薬用および医薬品の原料などの多様な分野に広く使用するためのものである。
メチオニンは生体内の必須アミノ酸の一種類で飼料および食品添加剤として広く使用され、医薬用として輸液剤、医薬品の合成原料としても使用される。メチオニンはコリン（レシチン）とクレアチンのような化合物の前駆体で作用し、システインとタウリンの合成原料でも使われる。また、硫黄を提供する役割をする。Ｓ−アデノシル−メチオニンはＬ−メチオニンから由来して生体内でメチル基を提供する役割をして、脳の多様な神経伝達物質(neurotransmitter)合成に関連されている。メチオニンおよび／またはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン(SAM)は生体内で肝と動脈において脂肪蓄積を抑制し、鬱、炎症、肝疾患、筋肉痛を緩和するなどの多様な役割をする。
今まで知られたメチオニンおよび／またはＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの生体内の役割は次の通りである。
１）脂肪代謝を促進する肝と動脈において脂肪沈着を抑制し、脳、心臓、腎臓の血流を増進させる役割をする（J Hepatol. Jeon BR et al., 2001 Mar; 34(3):395-401（非特許文献１））。
２）消化を促進し、毒性物質の解毒と排泄を促進、鉛のような重金属の排泄を促進する。
３）メチオニンは毎日１日に８００〜１６００mgの投与で優れた抗鬱剤になると知られている（Am J Clin Nutr. Mischoulon D. et al., 2002 Nov; 76(5): 1158S-61S（非特許文献２））。
４）肝疾患において肝機能の向上作用をする(FASEB J Mato JM., 2002 Jan; 16(1): 15-26)。特にアルコールによる肝疾患に効果的である（Cochrane Database Syst Rev., Rambaldi A., 2001; (4): CD002235（非特許文献３））。
５）骨関節疾患に抗炎症効果が良く、関節回復を促進する（ACP J Club. Sander O., 2003 Jan-Feb; 138(1): 21、J Fam Pract., Soeken KL et al., 2002 May; 51(5): 425-30（非特許文献４））。
６）メチオニンは毛髪の必須栄養素である。毛髪に栄養を供給し脱毛を防止する（Audiol Neurootol., Lockwood DS et al., 2000 Sep-Oct; 5(5): 263-266（非特許文献５））。
メチオニンは前記のように動物飼料を含めた食品と医薬品で用いるために化学合成と生物学的合成を通じて産生することができる。
化学合成は主に５−（β−メチルメルカプトエチル）ヒダントインを加水分解させる反応を通じてＬ−メチオニンを産生する。しかし、このような化学合成を通じて産生されたメチオニンはＬ−型とＤ−型が混合された形態でのみ産生されるという短所がある。
生物学的合成はメチオニン生成に関与する蛋白質を用いる方法である。Ｌ−メチオニンはmetA、metB、metC、metE、metH遺伝子から発現される酵素蛋白質の作用によってホモセリンからメチオニンに生合成される。具体的に、metAはメチオニン生合成の一番目の酵素であるホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ(homoserine O-succinyltransterase)をコードする遺伝子でホモセリンをＯ−スクシニル−Ｌ−ホモセリンに転換する機能をする。metBがコードするＯ−スクシニルホモセリンリアーゼ(O-succinylhomoserine lyase)、またはシスタチオニンγ合成酵素酵素はＯ−スクシニル−Ｌ−ホモセリンをシスタチオニン(cystathionine)に転換する機能をする。metCがコードするシスタチオニンベタリアーゼ(cystathionine beta lyase)酵素はシスタチオニンをＬ−ホモシステインに転換する機能をする。metEがコードするコバラミン−非依存的メチオニンシンターゼとmetHがコードするコバラミン−依存的メチオニンシンターゼがＬ−ホモシステインをＬ−メチオニンに転換させる。この際、metFがコードする５，１０−メチレンテトラヒドロフォレートリダクターゼ(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase)とglyAがコードするセリンヒドロキシメチルトラスフェラーゼ(serin hydroxymethytransferase)は共に作用してＬ−メチオニン合成に必要なメチル基を提供するＮ(5)−メチルテトラヒドロフォレート(N(5)-methyltetrahydrofolate)を合成する機能をする。
Ｌ−メチオニンは前記酵素による一連の有機的な反応を通じて合成される。前記蛋白質または前記蛋白質に影響を与えるその他蛋白質の遺伝的な操作は、Ｌ−メチオニン合成の調節を生じさせる可能性がある。例えば、特開２０００−１３９４７１号（特許文献１）にはエシェリキア属に属するゲノム遺伝子上のthrBC、metJを除去し、metBLを過剰発現させ、metKを漏出変異体として作製し、Ｌ−メチオニンを産生する方法が記述されている。また、米国特許出願公開第２００３／００９２０２６号（特許文献２）にはコリネバクテリウム属に属し、Ｌ−メチオニン合成の阻害因子であるmetD遺伝子を除去した微生物を用いる方法が記述されている。米国特許出願公開第２００２／００４９３０５号（特許文献３）には５，１０−メチレンテトラヒドロフォレートリダクターゼ(metF)の発現を増加させてＬ−メチオニンの産生を増加させる方法が記載されている。
米国特許出願公開第２００５／００５４０６０号（特許文献４）では、Ｌ−メチオニンを産生する微生物を作製するためにシスタチオニンシンターゼに変異を加えてシステインを利用せず、直接H2SまたはCH3SHを用いてホモシステインまたはメチオニンを合成することが記載されている。この方法では変異されたシスタチオニンシンターゼを直接細胞に導入して細胞内のメチオニン合成過程に沿ってメチオニンを合成した。しかし、この方法では細胞内のメチオニン代謝経路を用いるから酵素の反応過程が非効率的である。また、H2SまたはCH3SHが細胞に毒性を有するという点から見て実効性に劣る。さらに、メチルメルカプタン(CH3SH)に対する基質特異性がシュードモナスまたはクロモバクテリウム属由来のスクシニルホモセリンリアーゼに比べて非常に低いことが我々の実験において確認された。
シスタチオニンシンターゼの場合、文献によると、互いに異なる基質と反応して互いに異なる物質を産生する傾向が大きい。シスタチオニンシンターゼはホモシステインとＯ−スクシニルホモセリンを結合して非常に高い効率でホモランチオニンという物質を産生するという報告がある（J.Bacteriol (2006) vol 188:p609-618（非特許文献６））。前記のようにシスタチオニンシンターゼが細胞内に存在する場合、互いに異なるメチオニン前駆体と結合することができ、この結合によって副産物を作る効率性も非常に高い。特に、シスタチオニンシンターゼを過剰発現する場合はより多くの副産物を生成する可能性があり、細胞内の反応の効率は非常に劣る。
なお、既存の生物学的合成で産生されるメチオニンはＬ型という長所があるが、その量が非常に微量である。これはメチオニンの合成経路がとてもよく調節されるフィードバック調節システムを有しているからである。メチオニンが一定水準以上に合成されると、最終産物であるメチオニンがメチオニン合成を開始する初期蛋白質metAの遺伝子転写をフィードバックで抑制する。metA遺伝子は転写段階においてメチオニンによって阻害を受け、翻訳段階において細胞内の蛋白質分解酵素によって分解されるメカニズムにより、メチオニンの量が調節されるため、metA遺伝子の高発現だけではメチオニンの量を一定水準以上に増加させることができない（Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan and Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443（非特許文献７））。従って、既存の多数の特許はmetA遺伝子のフィードバックを解除する研究に重点をおいていた（国際公開公報第2005/108561号（特許文献５）、国際公開公報第1403813号（特許文献６））。
また、生物学的システムでメチオニンを産生する場合、メチオニンの分解代謝の経路であるＳ−アデノシルメチオニンシンターゼによって生成されたメチオニンがＳ−アデノシルメチオニンに変換される。Ｓ−アデノシルメチオニンは細胞に必須的な物質であってＳ−アデノシルメチオニンシンターゼを欠損させることができないため、既存にはこの遺伝子を弱化させる方向でメチオニンの産生を増加しようとする特許が出願されたことがある（国際公開公報第2005/108561号（特許文献７））。
J Hepatol. Jeon BR et al., 2001 Mar; 34(3):395-401
Am J Clin Nutr. Mischoulon D. et al., 2002 Nov; 76(5): 1158S-61S
Cochrane Database Syst Rev., Rambaldi A., 2001; (4): CD002235
ACP J Club. Sander O., 2003 Jan-Feb; 138(1): 21、J Fam Pract., Soeken KL et al., 2002 May; 51(5): 425-30
Audiol Neurootol., Lockwood DS et al., 2000 Sep-Oct; 5(5): 263-266
J.Bacteriol (2006) vol 188:p609-618
Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan and Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443
前記の従来技術は細胞内のメチオニン代謝経路の中、シスタチオニンシンターゼ代謝経路を用いることから酵素の反応過程が非効率的であり、硫化物特有の基質毒性問題および副産物の生成の問題があり、またメチオニン合成経路のフィードバック調節によって十分な量のメチオニンを合成することができないという問題がある。
従って、本発明は既存の生物学的メチオニンの産生工程を代替して発酵によるＬ−メチオニン前駆体の産生および前記Ｌ−メチオニン前駆体の酵素転換工程の２つの工程を使用することによって、従来の前記問題を克服したＬ−メチオニンの産生方法を提供することを目的とする。
また、本発明はＬ−メチオニンを選択的に産生する方法を提供することを目的とする。
また、本発明は別途の産生工程無しで副産物として有機酸を同時に産生する方法を提供することを目的とする。
本発明について以下に詳細に説明する。
本発明は１）Ｌ−メチオニン前駆体を産生することができる菌株を作製し、この菌株を培養して発酵によりＬ−メチオニン前駆体を産生する工程、２）産生された前記Ｌ−メチオニン前駆体との酵素反応によりＬ−メチオニンおよび有機酸を産生する工程で構成されるＬ−メチオニンおよび有機酸を産生する方法を提供する。
本発明は１）Ｌ−メチオニン前駆体を産生することができる菌株を作製し、この菌株を培養して発酵によりＬ−メチオニン前駆体を産生する工程、２）産生された前記Ｌ−メチオニン前駆体との酵素反応によりＬ−メチオニンおよび有機酸を産生する工程で構成されるＬ−メチオニンおよび有機酸を産生する方法を提供する。
より詳しくは、前記第１工程はＬ−メチオニン前駆体産生菌株を作製し、この菌株を用いた発酵法でＬ−メチオニン前駆体を培養液に蓄積する工程である。この際、Ｌ−メチオニン前駆体産生菌株は本発明者の意図した方法によって作製される。従って、本発明はこのような菌株および菌株の作製方法も含まれる。
前記Ｌ−メチオニン前駆体は下記の化学式から構成されたＯ−アシルホモセリン(O-acyl homoserine)基のうちの一つで表され；
ここでＲは、Ｃ、Ｈ、Ｏ、Ｎおよびその他化合物を含む最大１５個の炭素分子である物質である。例えば、前記Ｏ−アシルホモセリン基はＯ−アセチルホモセリン(O-acetyl homoserine)、Ｏ−スクシニルホモセリン(O-succinyl homoserine)、プロピオニルホモセリン(propionyl homoserine)、アセトアセチルホモセリン(acetoacetyl homoserine)、クマロイルホモセリン(coumaroyl homoserine)、マロニルホモセリン(malonyl homoserine)、ヒドロキシメチルグルタリルホモセリン(hydroxymethylglutaryl homoserine)およびピメリルホモセリン(pimelyl homoserine)を含むが、これに限られるものではない。
本発明において、前記Ｌ−メチオニン前駆体は好ましくはＯ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリンである。
本発明において、「Ｌ−メチオニン前駆体産生菌株」とはＬ−メチオニン前駆体を生物体内で産生することができる原核および真核の微生物菌株であって、本発明による操作によってＬ−メチオニン前駆体を蓄積することができる微生物菌株をいう。例えば、Ｌ−メチオニンを産生するエシェリキア属、エルウィニア属、セラチア属、プロビデンシア属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、レプトスピラ属、サルモネラ属、ブレビバクテリア属、ヒポモナス属、クロモバクテリウム属およびノルカジア属、または菌類または酵母類に属する微生物菌株が含まれる。好ましくは、Ｏ−スクシニルホモセリンを産生するためにシュードモナス属、ノルカジア属、エシェリキア属の微生物が使用され、Ｏ−アセチルホモセリンを産生するためにエシェリキア属、コリネバクテリウム属、レプトスピラ属、酵母類などが使用される。より好ましくは、エシェリキア属に属する微生物菌株、より好ましくは大腸菌(Escherichia coli; 以下E.coliと称する)が使用される。また、エシェリキア属菌株に外来の遺伝子を導入することによってＯ−スクシニルホモセリンおよびＯ−アセチルホモセリンを選択的に産生することができる。
本発明は前記の菌株からＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンの分解に関与する遺伝子を欠損または弱化させ、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンの合成に関与する遺伝子を導入または強化させる菌株をＬ−メチオニン前駆体産生菌株で提供する。なお、選択的にはＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンの産生強化のためにトレオニン生合成の経路を遮断または弱化した菌株を提供する。また、選択的にはＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンの合成に関与する蛋白質のフィードバック調節が解除された遺伝子を導入し、過剰発現または活性を強化させた菌株を提供する。
より詳しくは、本発明はＬ−メチオニン前駆体の分解に関与するmetB遺伝子、トレオニン生合成の経路に関与するthrB遺伝子およびＬ−メチオニン前駆体の産生遺伝子の転写を抑制するmetJ遺伝子を欠損させた菌株ならびにＬ−メチオニン前駆体の生合成に関与するmetAもしくはmetX遺伝子の発現を強化させ、またはフィードバック制御が解除されたmetAもしくはmetX遺伝子を導入し、またはmetA遺伝子を欠損させる代わりにmetX遺伝子を導入し、またはmetX遺伝子を欠損させる代わりにmetA遺伝子を導入したＬ−メチオニン前駆体産生菌株を提供する。
本発明において、前記遺伝子の欠損は遺伝体上で前記遺伝子の部位を切除したり特定遺伝子の配列を挿入して蛋白質の配列を変形させることによって行われ、遺伝子の弱化は前記遺伝子のプロモータ部位または５’−ＵＴＲ部位の塩基配列を変化させることによって蛋白質の発現を弱化させたりまたは当該遺伝子のＯＲＦ部位に変異を導入することによって蛋白質の活性を弱化させることができる。
本発明において、前記遺伝子の発現強化は前記遺伝子のプロモータ部位または５’−ＵＴＲ部位の塩基配列を変化させることによって蛋白質の発現を強化させることができ、当該遺伝子のＯＲＦ部位に変異を導入することによって蛋白質の活性を強化させることができ、当該遺伝子を染色体上に追加導入することによって発現を強化させることができ、当該遺伝子をベクター上に自己プロモータまたは強化された別個のプロモータと共に導入して菌株に形質転換することによって蛋白質の発現量を強化させることができる。
本発明の具体的実施様態において、前記Ｌ−メチオニン前駆体産生菌株を作製する方法は次のとおりである。
第１工程として、Ｌ−メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンを蓄積できるようにするため、菌株からシスタチオニンγ合成酵素またはＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼまたはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼなどの蛋白質をコードする遺伝子を欠損または弱化させる。
シスタチオニンγ合成酵素をコードする遺伝子をmetB、Ｏ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードする遺伝子をmetZ、Ｏ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードする遺伝子をmetYと表記する。上述のような活性を有する蛋白質をコードする遺伝子は例えば、大腸菌(E.coli)から公知のmetBがある。これは文献(Blattner et. Al., Science 277: 1453-1462 (1997))によって既に報告されている大腸菌のゲノム配列から得ることができる(Accession no. AAC75876)。また、前記遺伝子配列はＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター）およびＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータバンク）のようなデータベースからも得られる。この他にも同じ活性を有する遺伝子としてコリネバクテリウムのmetBおよびmetY、シュードモナス由来のmetZなどが報告されている。
シスタチオニンγ合成酵素、Ｏ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼまたはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼは下記の反応式に示されるようにＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをシスタチオニンまたはホモシステインに合成する活性を有している。従って、このような活性を有する遺伝子を欠損または弱化させる場合、Ｏ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンが培養液中に過剰に蓄積される。
Ｌ−システイン＋Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン ＜＝＞ コハク酸＋シスタチオニン
Ｌ−システイン＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン ＜＝＞ 酢酸＋シスタチオニン
ＨＳ−＋Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン ＜＝＞ コハク酸＋ホモシステイン
ＨＳ−＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン ＜＝＞ 酢酸＋ホモシステイン
Ｌ−システイン＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン ＜＝＞ 酢酸＋シスタチオニン
ＨＳ−＋Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン ＜＝＞ コハク酸＋ホモシステイン
ＨＳ−＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン ＜＝＞ 酢酸＋ホモシステイン
第２工程として、第１工程から作製された菌株でホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子を弱化または欠損させる。thrB遺伝子はホモセリンからＯ−ホスホホモセリン(O-phosphohomoserine)を合成した後、thrC遺伝子によってトレオニンに転換される。合成されたホモセリンが全量メチオニンの前駆体合成に用いられるようにthrB遺伝子を欠損または弱化させる。
第３工程として、metA遺伝子の転写を調節する転写調節因子であるmetJの遺伝子を欠損または弱化させる。メチオニン前駆体の合成に関与するmetA遺伝子はメチオニンによってフィードバック調節を受けるものであり、metJ遺伝子はmetA遺伝子の転写に関与するリプレッサーである。恒常的にmetA遺伝子を過剰発現することおよびメチオニン前駆体の合成を活性化するためには、metA遺伝子の転写リプレッサーの除去が有益である。従って、E.coliからmetJ遺伝子が除去されると、metA遺伝子の発現は増加し、Ｌ−メチオニン前駆体を大量合成することができる。
上記第２、第３工程は前駆体産生菌株によって改変可能であり、前駆体産生菌株を作製するために必須ではない。より好ましくは、エシェリキア属の微生物で前駆体の産生経路を強化するために実施することができる。
第４工程として、メチオニン前駆体の合成を増加させるために、メチオニン生合成の経路の初期段階を媒介する酵素のホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼまたはホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるmetA遺伝子またはmetX遺伝子の発現を強化させる。metA遺伝子はホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の通称であり、metX遺伝子はホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の通称である。前記metAまたはmetX遺伝子の発現を強化するために遺伝子の追加導入または５’−ＵＴＲまたはプロモータを変化させたり各遺伝子ＯＲＦに変異を導入する。この遺伝子の発現を強化すると、Ｌ−メチオニン前駆体の合成を大きく増加することができる。
菌株の生育にメチオニンが必要な場合、フィードバック制御が解除されたmetAまたはmetX遺伝子を導入することができる。この場合、培地中に添加されたメチオニンの濃度に関わらずＬ−メチオニン前駆体を合成することができ、培地中にメチオニンを添加することによってＬ−メチオニン前駆体を合成するでき、細胞の成長を促す。
また、Ｏ−スクシニルホモセリンを産生する菌株からＯ−アセチルホモセリンの産生を増加させるために、染色体内に存在するホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のmetA遺伝子を欠損させることができる。metA遺伝子を欠損させてＯ−スクシニルホモセリンの産生を止め、さらにmetX遺伝子を導入してＯ−アセチルホモセリンを産生する場合、metA遺伝子が存在時にmetX遺伝子を導入する場合に比べて高い収率のＯ−アセチルホモセリンを産生することができる。
なお、Ｏ−アセチルホモセリンを産生する菌株からＯ−スクシニルホモセリンの産生を増加させるために、染色体内に存在するホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のmetX遺伝子を欠損させることができる。metX遺伝子を欠損させてＯ−アセチルホモセリンの産生を止め、さらにmetA遺伝子を導入してＯ−スクシニルホモセリンを産生する場合、最も高い収率のＯ−スクシニルホモセリンを産生することができる。
上記１〜４工程のうち、一部または全体を導入した菌株を作製してＬ−メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンを蓄積することができる。
Ｌ−メチオニン前駆体産生菌株はＬ−リシン、Ｌ−トレオニンまたはＬ−イソロイシン産生菌株を用いて作製することもできる。好ましくは、Ｌ−トレオニン産生菌株を用いて作製することができる。この場合には既にホモセリンまでの合成が円滑になされる菌株であって、最も多い量のメチオニン前駆体を合成することができる。従って、Ｌ−トレオニン産生菌株を用いてトレオニンの合成経路に関与する遺伝子を欠損または弱化させ、metBまたはmetY、またはmetZ遺伝子を欠損または弱化させてメチオニン前駆体を蓄積することができる。より好ましくは、thrB遺伝子を欠損または弱化させた後、metBまたはmetYまたはmetZ遺伝子を欠損または弱化させてメチオニン前駆体を合成することができる。また、metAまたはmetX遺伝子の発現を強化して最も多量のメチオニン前駆体を合成することができる。
本発明において、「Ｌ−トレオニン産生菌株」とはＬ−トレオニンを生体内で産生することができる原核または真核の微生物菌株をいう。例えば、Ｌ−トレオニンを産生するエシェリキア属、エルウィニア属、セラチア属、プロビデンシア属、コリネバクテリウム属およびブレビバクテリウム属に属する微生物菌株が含まれる。好ましくは、エシェリキア属に属する微生物菌株、より好ましくは大腸菌が使用される。
また、Ｌ−トレオニン産生菌株は天然微生物菌株のみならず、変異微生物も含む。このような変異微生物は例えば、イソロイシン漏出形要求性、Ｌ−リシン類似体に対する耐性およびα−アミノ酪酸の耐性を有する微生物；内在的なホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ(ppc)遺伝子がゲノム含有された遺伝子の他に追加で１コピー以上の染色体ＤＮＡ中に挿入された変異微生物；Ｌ−メチオニン生合成の中間体であるオキサロ酢酸(oxaloacetate, OAA)をホスホエノールピルビン酸(PEP)に転換するに関与するpckA遺伝子が不活性化された微生物；Ｌ−メチオニンの生合成に関与するtyrB遺伝子の発現を抑制するtyrR遺伝子が不活性化された微生物；および糖伝達に関連されたgalP遺伝子の発現を抑制するgalR遺伝子が不活性化された微生物が含まれる。前記Ｌ−リシン類似体はＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システインおよびδ−メチル−Ｌ−リシンからなる群から選択される一つ以上の化合物であってよい。
本発明の好ましい実施態様ではＬ−トレオニンを産生するE.coli変異菌株ＴＦ４０７６(KFCC10718、韓国特許公告第92-8365号)を変異させたＬ−トレオニン産生およびＬ−メチオニン−非要求性ＣＪＭ００２を使用した。ＴＦ４０７６はメチオニン要求性、メチオニン類似体(例、α-アミノ-β-ヒドロキシ吉草酸、AHV)に対する耐性、リシン類似体(例、S-(2-アミノエチル)-L-システイン、AEC)に対する耐性、イソロイシン類似体(例、α-アミノ酪酸)に対する耐性、メチオニンの類似体(例、エチオニン)に対する耐性などの特性を有している。上記韓国特許の全体内容は請求項によって本明細書に含まれる。このようなＴＦ４０７６はメチオニン要求性菌株でインビボにおいてメチオニンを合成できない。本発明者らはこのようなメチオニン要求性を解除してメチオニン産生菌株として用いるためにＮＴＧを用いた人工的な突然変異法を使用してメチオニン要求性が解除されたトレオニン産生菌株のE.coli ＣＪＭ００２を作製した。E.coli ＣＪＭ００２は大腸菌 ＭＦ００１としてＫＣＣＭ(Korean Culture Center of Microorganism、大韓民国ソウル西大門区弘済１洞ユリムビル、361-221)に２００４年４月９日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５６８）。また、前記の方法を通じて作製したＯ−スクシニルホモセリン産生菌株の大腸菌 ＣＪＭ−ＢＴＪ(pMetA-CL)菌株は２００６年７月２１日に寄託し（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０７６７）、大腸菌 ＣＪＭ−ＢＴＪ(pCJ-MetA-CL)菌株は２００７年７月５日に寄託した（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０８７２）。また、上記方法によって作製したＯ−アセチルホモセリン産生菌株の大腸菌 ＣＪＭ−ＢＴＪＡ(pCJ-MetX-CL)菌株は２００７年７月５日に寄託した（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０８７３）。
上述のとおり作製されたＬ−メチオニン前駆体産生菌株の培養過程は当業者に知られた適当な培地と培養条件に応じてなされる。このような培養過程は当業者であれば選ばれる菌株によって容易に調整して使用することができる。前記培養方法の例にはバッチ式、連続式および流加式培養が含まれるが、これに限定されるものではない。このような多様な培養方法は、例えば文献("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176)に開示されている。
培養に使用される培地は特別な菌株の要求条件を適切に満たさなければならない。多様な微生物の培地は例えば文献("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981)に開示されている。前記培地は多様な炭素源、窒素源および微量元素成分を含む。使用できる炭素源の例にはブドウ糖、ショ糖、乳糖、果糖(fructose)、マルトース、でんぶん、セルロースのような炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油のような脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロールおよびエタノールのようなアルコール、アセト酸のような有機酸が含まれる。これらの化合物のうちの一つまたはその混合物は、炭素源として使用され得る。使用できる窒素源の例には、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液(CSL)および大豆粉のような有機窒素源および尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムおよび硝酸アンモニウムのような有機窒素源が含まれる。これらの化合物のうちの一つまたはその混合物は、窒素源として使用され得る。ここで、培地は付加的にリン源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムおよび対応するナトリウム−含有塩を含むことができる。また、硫酸マグネシウムや硫酸鉄のような金属塩も含むことができる。さらに、アミノ酸、ビタミンおよび適切な前駆体なども加えられ得る。これらの培地または前駆体はバッチ式または連続式で培養物に添加され得る。
また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸のような化合物を培養物に適切な方式で添加して培養物のｐＨを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を保持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体（例、空気）を注入する。培養物の温度は通常２０℃〜４５℃であり、好ましくは２５℃〜４０℃である。培養期間は望むＬ−メチオニン前駆体の生成量が得られるまで続けられ、好ましくは１０〜１６０時間である。
第２工程は、前記Ｌ−メチオニン前駆体産生菌株によって産生されたＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンとメチルメルカプタンに基質を用いてシスタチオニンシンターゼ、Ｏ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼもしくはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ活性を有する酵素または前記酵素を含む菌株を用いた酵素反応を通じてＬ−メチオニンおよび有機酸を産生する工程を含む。
より詳細には、本発明は上記方法で蓄積されたホモセリン、Ｏ−ホスホホモセリン、Ｏ−スクシニルホモセリン、またはＯ−アセチルホモセリンを基質として用いてシスタチオニンγ合成酵素、Ｏ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼまたはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼなどの酵素反応をによりＬ−メチオニンを産生する方法を提供する。好ましくは、本発明はＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンを基質で用いる。
本発明において、前記シスタチオニンγ合成酵素またはＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼまたはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼはエシェリキア属(Escherichia sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、レプトスピラ属(Leptospira sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium sp.)、サッカロミセス属(Saccharomyces sp.)、クロモバクテリウム属(Chromobacterium sp.)、ノルカジア属(Norcardia sp.)、ブラジリゾビウム属(Bradyrhizobium sp.)、ヒホモナス属、メチロコックス属(Methylococcus sp.)、メチロバシルス属(Methylobacillus sp.)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas sp.)、クレシエラ属(Klesiella sp.)、バシルス属(Bacillus sp.)、シゲラ属(Shigella sp.)、コルウェリア属(Colwellia sp.)、サルモネラ属(Salmonella sp.)、酵母(yeast)、菌類(fungi)に属する微生物菌株に由来するものであり得る。
第２工程において、Ｏ−スクシニルホモセリンをＬ−メチオニン前駆体で使用する場合、好ましくはシュードモナス属、ノルカジア属、クロモバクテリウム属に属する微生物菌株で、より好ましくは、シュードモナスアウロゲノサ(Pseudomonas aurogenosa)、ノルカジアファルシニカ(Norcardia Farcinica)、シュードモナスプチダ(Pseudomonas putida)、クロモバクテリウムビオラシウム(Chromobacterium Violaceum)に属する微生物菌株に由来するシスタチオニンγ合成酵素またはＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼまたはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼが使用される。
第２工程において、Ｏ−アセチルホモセリンをＬ−メチオニン前駆体として使用する場合、好ましくはレプトスピラ属、クロモバクテリウム属、ヒポモナス属に属する微生物菌株であって、より好ましくは、レプトスピラアウロゲノサ(Leptospira aurogenosa)、ヒポモナスネプチュニウム(Hyphomonas Neptunium)、クロモバクテリウムビオラシウム(Chromobacterium Violaceum)に属する微生物菌株に由来するシスタチオニンγ合成酵素またはＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼまたはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼが使用される。
前記の反応は下記示すとおりであり、その構造式は図２に示される。
ＣＨ３ＳＨ＋Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン ＜＝＞ コハク酸＋メチオニン
ＣＨ３ＳＨ＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン ＜＝＞ 酢酸＋メチオニン
ＣＨ３ＳＨ＋Ｏ−スクシニル−Ｌ−ホモセリン ＜＝＞ コハク酸＋メチオニン
ＣＨ３ＳＨ＋Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン ＜＝＞ 酢酸＋メチオニン
上記反応では図２に表記された化学式のようにメチルメルカプタンのCH3S-残基がＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンのコハク酸または酢酸の残基と置換されてメチオニンを生成するようになる。反応時にメチルメルカプタン(CH3SH)は様々な形態で添加が可能である。
前記活性を有する酵素をコードする遺伝子の配列はＮＣＢＩ（米国国立バイオテクノロジー情報センター）および日本のＤＮＡデータバンク(KEGG)のようなデータベースからも得られる。
生物学的転換反応のために得られた遺伝子配列から遺伝子をクローニングして発現ベクターに挿入した後、組換え菌株由来の酵素を活性型で発現させる。酵素発現菌株および発現された酵素の両方を前記反応に直接用いることができる。
上記遺伝子を発現させた酵素および酵素発現菌株はＬ−メチオニン前駆体を蓄積した発酵上澄液または発酵液と直接混合または部分的な混合反応を用いて反応を導く。本発明の好ましい実施態様において、発酵液に蓄積されたＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンはシュードモナス属、クロモバクテリウム属、レプトスピラ属、ヒポモナス属由来のシスタチオニンγ合成酵素またはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼまたはＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼによってメチオニンに転換することができる。
より好ましくは、発酵液に蓄積されたＯ−スクシニルホモセリンはシュードモナスアウロゲノサまたはシュードモナスプチダまたはクロモバクテリウムビオラシウム由来のシスタチオニンγ合成酵素およびＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼおよびＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼによってメチオニンに転換することができる。
または発酵液に蓄積されたＯ−アセチルホモセリンはレプトスピラメイエリ(Leptospira meyeri)、ヒポモナスネプチュニウム(Hyphomonas Neptunium)、クロモバクテリウムビオラシウム(Chromobacterium Violaceum)由来のシスタチオニンγ合成酵素およびＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼおよびＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼによってメチオニンに転換することができる。
各遺伝子を大腸菌発現ベクターであるｐＣＬ−ＣＪ１ベクター(韓国CJ社)で発現させ、超音波破砕を行い、細胞溶解液から酵素液を調製し、発現蛋白を得た。得られた酵素液をＯ−スクシニルホモセリンおよびＯ−アセチルホモセリンが蓄積された発酵液に添加し、これと共にメチルメルカプタン溶液を共に添加して反応を誘導した。反応はＤＴＮＢ(5,5-dithiobis(2-nitro-benzoic acid, 米国sigma社)を用いて確認し、反応産物はＨＰＬＣを用いて分析した。
本発明はＯ−スクシニルホモセリン、Ｏ−アセチルホモセリンとCH3SHとの反応を通じてＬ−メチオニンの他にもＯ−スクシニルホモセリンの場合はコハク酸を、Ｏ−アセチルホモセリンの場合は酢酸を別途の産生工程無しに副産物として得ることができる。
以下、本発明の現時点での現実的で好ましい実施態様を以下の実施例に示すとおり説明する。しかし、下記実施例は本発明を例示して説明するためのものであって、本発明の権利範囲が下記実施例によって限定されるものではない。
実施例１：メチオニン前駆体産生菌株の作製
＜１−１＞ metB遺伝子の欠損
大腸菌株においてシスタチオニンシンターゼをコードする遺伝子であるMetB遺伝子を欠損させるために、FRT-one-step PCR deletion方法を使用した(PNAS (2000) vol97:P6640-6645)。配列番号１、２番のプライマーを用いてpKD3ベクター(PNAS (2000) vol97:P6640-6645)を鋳型にしてPCR反応で欠損カセットを作製した。変性(denaturation)工程は９４℃で３０秒、アニーリング(annealing)工程は５５℃で３０秒、伸長(extension)工程は７２℃で１分間施し、これを３０サイクルでＰＣＲ行った。
大腸菌株においてシスタチオニンシンターゼをコードする遺伝子であるMetB遺伝子を欠損させるために、FRT-one-step PCR deletion方法を使用した(PNAS (2000) vol97:P6640-6645)。配列番号１、２番のプライマーを用いてpKD3ベクター(PNAS (2000) vol97:P6640-6645)を鋳型にしてPCR反応で欠損カセットを作製した。変性(denaturation)工程は９４℃で３０秒、アニーリング(annealing)工程は５５℃で３０秒、伸長(extension)工程は７２℃で１分間施し、これを３０サイクルでＰＣＲ行った。
その結果得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．２kbpサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片はｐＫＤ４６ベクター(PNAS (2000) vol97:P6640-6645)を予め形質転換させたE.coli(K12)Ｗ３１１０菌株にエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの前に、ｐＫＤ４６で形質転換を行ったＷ３１１０菌株は１００μg/Lアンピシリンと５mMの１−アラビノースが含まれたＬＢ培地を用いて３０℃でＯＤ６００が０．６になるまで培養した。その後に、培養した菌株を滅菌蒸留水で２回、１０％グリセロールで１回洗浄した。エレクトロポレーションは２５００Ｖで行った。回収した菌株は２５μg/Lクロラムフェニコールを含むＬＢプレート培地に塗布して３７℃で一夜培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
上記と同様の条件で同じプライマーを鋳型として選別した菌株に対してＰＣＲを行った。１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．２Kbに観察されるものを確認することによってmetB遺伝子の欠損を同定した。次に、確認された菌株はｐＣＰ２０ベクター(PNAS (2000) vol97:P6640-6645)で形質転換を行い、ＬＢ培地で培養した。最終的に、同じ条件でＰＣＲを行い、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１５０bpまで小さくなったmetB遺伝子の欠損菌株を作製し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。作製された菌株をＷ３−Ｂと命名した。
＜１−２＞ thrB遺伝子の欠損
ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子を欠損させることによって、ホモセリンからＯ−スクシニルホモセリンの合成量を増加させようとした。特にトレオニン産生菌株を用いる場合、ホモセリンを利用する活性が強力なため、この遺伝子の欠損は必ず必要である。上記のように作製されたＷ３−Ｂ菌株でthrB遺伝子を欠損させるために、上記metB遺伝子の欠損と同様にFRT-one-step PCR deletionを行った。
ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子を欠損させることによって、ホモセリンからＯ−スクシニルホモセリンの合成量を増加させようとした。特にトレオニン産生菌株を用いる場合、ホモセリンを利用する活性が強力なため、この遺伝子の欠損は必ず必要である。上記のように作製されたＷ３−Ｂ菌株でthrB遺伝子を欠損させるために、上記metB遺伝子の欠損と同様にFRT-one-step PCR deletionを行った。
thrB欠損カセットを作製するために、pKD4ベクター(PNAS (2000) vol97:P6640-6645)を鋳型にして、配列番号３および４のプライマーを用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で１分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲを行った。その結果得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．６kbpサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収したＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換させたＷ３−Ｂ菌株にエレクトロポレーションによって導入した。回収された菌株を５０μg/Lカナマイシンを含むＬＢプレート培地に塗布して３７℃で一夜培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
上記と同一の条件で、選別された菌株を鋳型にして配列番号３、４のプライマーを用いてＰＣＲを行った後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．６Kbに確認される菌株を選別することによってthrB遺伝子の欠損を確認した。次に、確認された菌株をｐＣＰ２０ベクターで形質転換してＬＢ培地で培養した。最終的に、同一条件下のＰＣＲを行い１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１５０bpに小さくなったthrB遺伝子の欠損菌株を作製し、カナマイシンマーカーが除去されたことを確認した。作製された菌株はＷ３−ＢＴ菌株と命名した。
＜１−３＞ metJ遺伝子の欠損
メチオニン前駆体の合成に関与するmetA遺伝子の調節遺伝子であるmetJを欠損させるために、metB遺伝子の欠損と同様にFRT-one-step PCR deletion法を行った。
メチオニン前駆体の合成に関与するmetA遺伝子の調節遺伝子であるmetJを欠損させるために、metB遺伝子の欠損と同様にFRT-one-step PCR deletion法を行った。
metJ遺伝子欠損カセットを作製するために配列番号５、６のプライマーを用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で１分間施し、これを３０サイクルでＰＣＲを行った。
その結果得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．２kbpサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換させたＷ３−ＢＴ菌株にエレクトロポレーションによって導入した。回収された菌株はクロラムフェニコールを含むＬＢプレート培地に塗布して３７℃で一夜培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
選別された菌株を鋳型にして配列番号７および８のプライマーを用いて同じ条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．６Kbに変化することを確認することによってmetJ遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株は再びｐＣＰ２０ベクターで形質転換してＬＢ培地で培養し、再び同一な条件のＰＣＲを通じて１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが６００bpに小さくなった最終metJ遺伝子欠損菌株を作製し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。作製された菌株をＷ３−ＢＴＪと命名した。
＜１−４−１＞ metA遺伝子の過剰発現
より多いメチオニン前駆体の合成のために、メチオニン前駆体のＯ−スクシニルホモセリン合成に関与するホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ酵素をコードするmetA遺伝子を過剰発現を行った。
より多いメチオニン前駆体の合成のために、メチオニン前駆体のＯ−スクシニルホモセリン合成に関与するホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ酵素をコードするmetA遺伝子を過剰発現を行った。
これのためにE.coli W3110の染色体を鋳型にして、配列番号９および１０番のプライマーを用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを２５サイクル行うＰＣＲ反応を施した。
その結果得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．２kbpサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片はpCL1920ベクターをSmaIで切断して得られたＤＮＡ断片と連結させた。連結されたベクターをE.coliに形質転換させて５０μg/Lスペクチノマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した後に選別した。このように作製されたベクターをpMetA-CLと命名した。pMetA-CLベクターの模式図は図３のとおりである。上記ベクターをW3-BTJ菌株に形質転換させて作製された菌株をW3-BTJ/pMetA-CLと命名し、Ｏ−スクシニルホモセリンの増加を観察した。
metA遺伝子の発現をさらに増加させるための他の方法として、前記のmetA遺伝子をpCL1920ベクターにCJ1プロモータ(韓国、CJ社)とEcoRV制限酵素を用いて連結させた。連結されたベクターをE.coli菌株に形質転換させ５０μg/Lスペクチノマイシンが含まれたＬＢ培地において培養した後に選別した。このように作製されたベクターをpCJ-MetA-CLと命名した。前記ベクターをW3-BTJ菌株に形質転換させて作製された菌株をW3-BTJ/pCJ-MetA-CLと命名し、Ｏ−スクシニルホモセリンの増加を観察した。
＜１−４−２＞ metX遺伝子の過剰発現
Ｏ−アセチルホモセリンの合成のために、メチオニン前駆体のＯ−アセチルホモセリン合成遺伝子であるホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードするmetX遺伝子の過剰発現を行った。
Ｏ−アセチルホモセリンの合成のために、メチオニン前駆体のＯ−アセチルホモセリン合成遺伝子であるホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードするmetX遺伝子の過剰発現を行った。
これのためにレプトスピラメイエリの染色体を鋳型にして配列番号１１および１２番のプライマーを用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを２５サイクル行うＰＣＲ反応を施した。
その結果得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．１kbpサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をpCL1920ベクターにCJ1プロモータとEcoRV制限酵素を用いて連結させた。連結されたベクターをE.coliに形質転換させて５０μg/Lスペクチノマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した後に選別した。このように作製されたベクターをpCJ1-MetXlme-CLと命名した。前記ベクターをW3-BTJ菌株に形質転換させて作製された菌株をW3-BTJ/pCJ-MetXlme-CLと命名し、Ｏ−アセチルホモセリンの増加を観察した。
metX遺伝子の過剰発現のための他の方法として、コリネバクテリウム染色体を鋳型にして配列番号６８、６９番のプライマーを用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを２５サイクル行うＰＣＲ反応を施した。
その結果得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、ＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をpCL1920ベクターにCJ1プロモータとEcoRV制限酵素を用いて連結させた。連結されたベクターをE.coliに形質転換させて５０μg/Lスペクチノマイシンが含まれたＬＢ培地で培養した後に選別した。このように作製されたベクターをpCJ-MetXcgl-CLと命名した。前記ベクターをW3-BTJ菌株に形質転換させて作製された菌株をW3-BTJ/pCJ-MetXcgl-CLと命名し、Ｏ−アセチルホモセリンの増加を観察した。
＜１−４−３＞ metA遺伝子の欠損
Ｏ−アセチルホモセリンの産生量を増加させるために、W3-BTJ菌株でホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるmetAを欠損させた。metA遺伝子のみを導入した場合、一定量のＯ−スクシニルホモセリンが蓄積されることが観察されたから、metA遺伝子を欠損させる場合最も多い量のＯ−アセチルホモセリンを蓄積することができると推定した（表４参照）。metA遺伝子を欠損させるためにFRT one step PCR deletion方法を使用した。
Ｏ−アセチルホモセリンの産生量を増加させるために、W3-BTJ菌株でホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であるmetAを欠損させた。metA遺伝子のみを導入した場合、一定量のＯ−スクシニルホモセリンが蓄積されることが観察されたから、metA遺伝子を欠損させる場合最も多い量のＯ−アセチルホモセリンを蓄積することができると推定した（表４参照）。metA遺伝子を欠損させるためにFRT one step PCR deletion方法を使用した。
metA遺伝子欠損カセットを作製するために配列番号７０および７１のプライマーを用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で１分間施し、これを３０サイクルでＰＣＲ行った。
その結果得られたＰＣＲ産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動した後、１．２kbpサイズのバンドからＤＮＡを精製した。回収されたＤＮＡ断片をｐＫＤ４６ベクターで予め形質転換させたE.coli W3-BTJ菌株にエレクトロポレーションによって導入した。回収された菌株をクロラムフェニコールを含むＬＢプレート培地に塗布して３７℃で一夜培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
選別された菌株を鋳型にして配列番号７０および７１のプライマーを用いて同じ条件でＰＣＲした後、１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１．１Kbに変化されることを確認することによってmetA遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はｐＣＰ２０ベクターで形質転換させてＬＢ培地で培養し、同一な条件のＰＣＲを通じて１．０％アガロースゲル上で遺伝子のサイズが１００bpに小さくなった最終metA遺伝子欠損菌株を作製し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。作製された菌株をＷ３−ＢＴＪＡと命名した。Ｗ３−ＢＴＪＡ菌株を前記pCJ-MetXlme-CLベクターで形質転換させて作製された菌株をW3-BTJA/pCJ-MetX-CLと命名した。前記菌株を同一な方法で培養した結果、Ｏ−スクシニルホモセリンの蓄積は観察されず、Ｏ−アセチルホモセリンの産生量がW3-BTJに比べて約２０％有意に増加することを確認した。
＜１−５＞ Ｌ−トレオニン産生菌株の転換
メチオニン要求性が解除されたＬ−トレオニン産生菌株の大腸菌ＣＪＭ００２(KCCM-10568号)を用いて前記１−１〜１−３と同一な方法でメチオニン前駆体産生菌株を作製した。作製された菌株はそれぞれCJM-BTJ、CJM-BTJ/pMetA-CLおよびCJM-BTJ/pCJ-MetA-CLと命名した。また、このCJM-BTJ菌株を用いて前記＜１−４−３＞の方法でmetA遺伝子を欠損させた菌株を作製し、作製された菌株をCJM-BTJAと命名した。
メチオニン要求性が解除されたＬ−トレオニン産生菌株の大腸菌ＣＪＭ００２(KCCM-10568号)を用いて前記１−１〜１−３と同一な方法でメチオニン前駆体産生菌株を作製した。作製された菌株はそれぞれCJM-BTJ、CJM-BTJ/pMetA-CLおよびCJM-BTJ/pCJ-MetA-CLと命名した。また、このCJM-BTJ菌株を用いて前記＜１−４−３＞の方法でmetA遺伝子を欠損させた菌株を作製し、作製された菌株をCJM-BTJAと命名した。
実施例２：Ｌ−メチオニン前駆体の産生のための発酵
＜２−１＞ フラスコ培養実験
実施例１から作製された菌株のメチオニン前駆体の産生量を実験するために三角フラスコ培養を施した。抗生剤スペクチノマイシンが含有されたＬＢプレート培地にW3-BTJとCJM-BTJおよびmetA、metX発現ベクターで形質転換させたW3-BTJ菌株を播種して３１℃で一夜培養した後、単一コロニーをスペクチノマイシンが含まれた３mlのＬＢ培地に播種した後、３１℃で５時間培養し、再び２５mlメチオニン前駆体の産生培地を含む２５０ml三角フラスコに２００倍希釈して３１℃２００rpmで６４時間培養してＨＰＬＣ分析を通じてメチオニン前駆体の産生量を比較した（表３および表４）。その結果、メチオニン要求性が解除されたトレオニン産生菌株を使用して作製されたメチオニン前駆体産生菌株の場合、メチオニン前駆体の産生量が著しく増加したことがわかった。
実施例１から作製された菌株のメチオニン前駆体の産生量を実験するために三角フラスコ培養を施した。抗生剤スペクチノマイシンが含有されたＬＢプレート培地にW3-BTJとCJM-BTJおよびmetA、metX発現ベクターで形質転換させたW3-BTJ菌株を播種して３１℃で一夜培養した後、単一コロニーをスペクチノマイシンが含まれた３mlのＬＢ培地に播種した後、３１℃で５時間培養し、再び２５mlメチオニン前駆体の産生培地を含む２５０ml三角フラスコに２００倍希釈して３１℃２００rpmで６４時間培養してＨＰＬＣ分析を通じてメチオニン前駆体の産生量を比較した（表３および表４）。その結果、メチオニン要求性が解除されたトレオニン産生菌株を使用して作製されたメチオニン前駆体産生菌株の場合、メチオニン前駆体の産生量が著しく増加したことがわかった。
＜２−２＞ 大型発酵槽実験
実施例１で最も優れたメチオニン前駆体の産生能を見せた菌株を用いてメチオニン前駆体を大量生産するために、５Ｌ発酵槽培養を施した。抗生剤スペクチノマイシンが含有されたＬＢプレート培地にCJM-BTJ/pCJ-metA-CL菌株またはCJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL菌株を播種して３１℃で一夜培養した。その後、単一コロニーをスペクチノマイシンが含まれた１０mlＬＢ培地に播種した後、３１℃で５時間培養し、再び２００mlメチオニン前駆体のシード培地を含む１０００ml三角フラスコに１００倍希釈して３１℃、２００rpmで３〜１０時間培養した後、５Ｌ発酵槽に播種して流加式培養(Fed batch)発酵法で５０〜１００時間培養した。このように培養した発酵液においてメチオニン前駆体の濃度をＨＰＬＣで分析した結果は表６の通りである。
実施例１で最も優れたメチオニン前駆体の産生能を見せた菌株を用いてメチオニン前駆体を大量生産するために、５Ｌ発酵槽培養を施した。抗生剤スペクチノマイシンが含有されたＬＢプレート培地にCJM-BTJ/pCJ-metA-CL菌株またはCJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL菌株を播種して３１℃で一夜培養した。その後、単一コロニーをスペクチノマイシンが含まれた１０mlＬＢ培地に播種した後、３１℃で５時間培養し、再び２００mlメチオニン前駆体のシード培地を含む１０００ml三角フラスコに１００倍希釈して３１℃、２００rpmで３〜１０時間培養した後、５Ｌ発酵槽に播種して流加式培養(Fed batch)発酵法で５０〜１００時間培養した。このように培養した発酵液においてメチオニン前駆体の濃度をＨＰＬＣで分析した結果は表６の通りである。
実施例３：メチオニン転換酵素の産生
＜３−１＞ E.coli由来のシスタチオニンγ合成酵素
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるE.coli由来のシスタチオニンγ合成酵素をコードしているmetB遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるE.coli由来のシスタチオニンγ合成酵素をコードしているmetB遺伝子をクローニングした。
E.coliの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号１３および１４を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを２５サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNcol/HindIIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。最終作製されたベクターをpCL-MetB-CLと命名した。模式図は図４のとおりである。クローニングされたベクターをE.coli W3110細胞に形質転換させ、５０μg/Lのスペクチノマイシンが含まれたＬＢプレート培地で培養した後、コロニーを選別した。選別されたコロニーを５０μg/Lのスペクチノマイシンが含まれたＬＢ培地３mlに播種して一夜の間３７℃で培養した。培養された細胞は再び回収して０．１Mリン酸カリウム緩衝液(Potassium phosphate, pH7．5)で洗浄して再び２００μｌのリン酸カリウム緩衝液に懸濁し、３０秒おきに５回超音波処理をして細胞を破砕した。破砕された細胞抽出液を１２０００rpmで１０分間遠心分離した後、上澄液を取ってBio-Rad蛋白質定量液(米国BIO-Rad社)を用いて蛋白質の総量を定量した。また、SDS-PAGE法を用いて蛋白質の発現を確認した。回収された細胞抽出液の上澄液を酵素転換反応に使用した。
＜３−２＞ シュードモナス属由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるシュードモナス属(Pseudomonas Sp.)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。シュードモナスはシュードモナスアルギノサおよびシュードモナスプチダの２種を使用した。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるシュードモナス属(Pseudomonas Sp.)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。シュードモナスはシュードモナスアルギノサおよびシュードモナスプチダの２種を使用した。
それぞれの菌株の染色体を鋳型にしてシュードモナスアルギノサの場合はプライマー配列番号１５および１６を、シュードモナスプチダの場合は配列番号１７および１８を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/PacIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−３＞ シュードモナス属由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるシュードモナス属由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetY遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるシュードモナス属由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetY遺伝子をクローニングした。
シュードモナスアルギノサ菌株の染色体を鋳型にし、配列番号１９および２０を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/PacIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−４＞ コリネバクテリウムグルタミクム由来のシスタチオニンシンターゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるコリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum)由来のシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるコリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum)由来のシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子をクローニングした。
コリネバクテリウムグルタミクムの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号２１および２２を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNcoI/Hind3で切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−５＞ コリネバクテリウムグルタミクム由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるコリネバクテリウムグルタミクム由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるコリネバクテリウムグルタミクム由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
コリネバクテリウムグルタミクムの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号２３および２４を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/Avr2で切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−６＞ レプトスピラ属由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるレプトスピラメイエリ(Leptospira meyeri)由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetY遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるレプトスピラメイエリ(Leptospira meyeri)由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetY遺伝子をクローニングした。
レプトスピラメイエリの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号２５および２６を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/AvrIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−７＞ サッカロミセス属由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用される出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmet25遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用される出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmet25遺伝子をクローニングした。
出芽酵母の染色体を鋳型にしてプライマー配列番号２７および２８を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/PacIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−８＞ クロモバクテリウム属由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるクロモバクテリウムビオラシウム(Chromobacterium Violaceum)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるクロモバクテリウムビオラシウム(Chromobacterium Violaceum)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
クロモバクテリウムビオラシウムの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号２９および３０を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/AvrIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)のにクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−９＞ ノルカジア属由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるノルカジアファルシニカ(Norcardia Farcinica)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるノルカジアファルシニカ(Norcardia Farcinica)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
ノルカジアファルシニカの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号３１および３２を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/AvrIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−１０＞ ブラジリゾビウム属由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるブラジリゾビウムジャポニクム(Bradyrhizobium Japonicum)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるブラジリゾビウムジャポニクム(Bradyrhizobium Japonicum)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
ブラジリゾビウムジャポニクムの染色体を鋳型にしてプライマー配列３３および３４を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/AvrIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−１１＞ ヒポモナス属由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるヒポモナスネプチュニウム(Hyphomonas Neptunium)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるヒポモナスネプチュニウム(Hyphomonas Neptunium)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
ヒポモナスネプチュニウムの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号３５および３６を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をBamHII/HindIIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−１２＞ メチロコックス属由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるメチロコックスカプスラツス(Methylococcus Capsulatus)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるメチロコックスカプスラツス(Methylococcus Capsulatus)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
メチロコックスカプスラツスの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号３７および３８を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/AvrIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−１３＞ メチロバシルス属由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるメチロバシルスフラゲラツス(Methylobacillus Flagellatus)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるメチロバシルスフラゲラツス(Methylobacillus Flagellatus)由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
メチロバシルスフラゲラツスの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号３９および４０を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/AvrIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−１４＞ ニトロソモナス属由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるニトロソモナスヨーロパエア由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるニトロソモナスヨーロパエア由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼをコードするmetZ遺伝子をクローニングした。
ニトロソモナスヨーロパエアの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号４１および４２を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/AvrIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−１５＞ クレシエラ属由来のシスタチオニンシンターゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるクレシエラニュモニアエ(Klesiella Pneumoniae)由来のシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるクレシエラニュモニアエ(Klesiella Pneumoniae)由来のシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子をクローニングした。
クレシエラニュモニアエの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号４３および４４を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/AvrIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−１６＞ バシルス属由来のシスタチオニンシンターゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用される枯草菌(Bacillus Subtilis)由来のシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用される枯草菌(Bacillus Subtilis)由来のシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子をクローニングした。
枯草菌の染色体を鋳型にしてプライマー配列番号４５および４６を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/AvrIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−１７＞ シゲラ属由来のシスタチオニンシンターゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるシゲラフレキシネリ2457T(Shigella Flexneri 2457T)由来のシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるシゲラフレキシネリ2457T(Shigella Flexneri 2457T)由来のシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子をクローニングした。
シゲラフレキシネリ2457Tの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号４７および４８を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/AvrIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−１８＞ コルウェリア属由来のシスタチオニンシンターゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるコルウェリアサイクレリトラエア(Colwellia Psychrerythraea)由来のシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるコルウェリアサイクレリトラエア(Colwellia Psychrerythraea)由来のシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子をクローニングした。
コルウェリアサイクレリトラエアの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号４９および５０を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/AvrIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−１９＞ サルモネラ由来のシスタチオニンシンターゼ
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるサルモネラエンタリカ血清型パラチフス(Salmonella enterica serovar Paratyphi A)由来のシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子をクローニングした。
メチオニン前駆体であるＯ−スクシニルホモセリンまたはＯ−アセチルホモセリンをメチオニンに転換させる酵素として使用されるサルモネラエンタリカ血清型パラチフス(Salmonella enterica serovar Paratyphi A)由来のシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子をクローニングした。
サルモネラエンタリカ血清型パラチフスの染色体を鋳型にしてプライマー配列番号５１および５２を用いて変性工程は９４℃で３０秒、アニーリング工程は５５℃で３０秒、伸長工程は７２℃で２分間施し、これを３０サイクル行うＰＣＲ反応を通じて獲得した。
獲得したＤＮＡ断片をNdeI/AvrIIで切断して、同一に切断したpCL-CJ1ベクター(韓国、CJ社)にクローニングした。クローニングされたベクターを前記＜３−１＞と同じ方法を使用して細胞抽出液の上澄液を回収し、酵素転換反応に使用した。
＜３−２０＞ OSHSを基質にした転換酵素の活性比較
前記の＜３−１＞から＜３−１９＞の方法で獲得したそれぞれの酵素液を活性比較して最適のメチオニン転換酵素を選別した。
前記の＜３−１＞から＜３−１９＞の方法で獲得したそれぞれの酵素液を活性比較して最適のメチオニン転換酵素を選別した。
このために、Ｏ−スクシニルホモセリン(Sigma社)を３mMの濃度で０．１Mリン酸カリウム緩衝液(pH7．5)に溶解した。また、この反応液に助酵素で使用されるピリドキサールホスフェート(Pyridoxal 5'-phosphate、米国Sigma社)を最終濃度１０μMになるように添加した。反応液にもう一つの基質として使用されるメチルメルカプタン(Methyl mercaptan、日本東京化成工業株式会社)を最終濃度２mMで添加した。この反応液１mlを３７℃に位置した後、各酵素抽出液を蛋白質濃度５mg/mlに合わせて１０μｌ添加した。反応の進行如何は毎５〜１０分おきに１００μｌの反応液を回収して４mg/mlのＤＴＮＢ(米国Sigma社)溶液９００μｌに添加した後、ＯＤ４１５における吸光度を測定することによって確認した。
DTNBは反応液中に残存するメチルメルカプタンのSH基と反応して黄色いの物質を合成する。従って、反応液状のメチルメルカプタンが反応によってメチオニンに転換されることで反応液の黄色が消えるものであって、反応の進行が確認できる。
実験結果、図５のようにクロモバクテリウム由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ、ノルカジア由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ、シュードモナス属由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼおよびＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼが非常に高い活性を見せた。他の酵素も全てある程度の活性は見せているが、反応進行速度が相対的に遅いことが確認された。各酵素の基質に対する反応性を要約した表は表７のとおりである。また、１時間の反応が終了された後に選別された反応液からＨＰＬＣ分析を通じて最終生成されたメチオニンおよびコハク酸の生成を確認した結果は表８に示した。
＜３−２１＞ ＯＡＨＳを基質にした転換酵素の活性比較。
前記＜３−２０＞と同一の反応をＯ−アセチルホモセリンを用いて反応させた。Ｏ−アセチルホモセリンは発酵上澄液から精製した。Ｏ−スクシニルホモセリンと同一な反応液および同一な酵素液を用いて反応させた結果、図６のようにヒポモナス由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ、シュードモナス属由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ、クロモバクテリウム属由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼおよびレプトスピラ属由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼが高い活性を見せた。他の酵素も全てある程度の活性は見せているが、反応進行速度が相対的に遅いことが確認された。各酵素の基質に対する反応性を要約して表７に示した。また、１時間の反応が終了された後に選別された反応液からＨＰＬＣ分析を通じて最終生成されたメチオニンおよび酢酸の量を確認した結果は表９に示した。
前記＜３−２０＞と同一の反応をＯ−アセチルホモセリンを用いて反応させた。Ｏ−アセチルホモセリンは発酵上澄液から精製した。Ｏ−スクシニルホモセリンと同一な反応液および同一な酵素液を用いて反応させた結果、図６のようにヒポモナス由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ、シュードモナス属由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ、クロモバクテリウム属由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼおよびレプトスピラ属由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼが高い活性を見せた。他の酵素も全てある程度の活性は見せているが、反応進行速度が相対的に遅いことが確認された。各酵素の基質に対する反応性を要約して表７に示した。また、１時間の反応が終了された後に選別された反応液からＨＰＬＣ分析を通じて最終生成されたメチオニンおよび酢酸の量を確認した結果は表９に示した。
＜３−２２＞ 転換酵素のフィードバック阻害確認
前記３−２０および２１と同一の方法を使用してメチオニンの存在有無によるフィードバックの阻害反応を確認した。前記と同一な反応液を作製し、各反応液にそれぞれ５g/Lのメチオニンを添加または非添加して同一な反応進行を行った。メチオニンを添加しない場合の反応進行速度を１００％にしたとき、メチオニンの存在時の残存活性を％で表記して表１０に示した。
前記３−２０および２１と同一の方法を使用してメチオニンの存在有無によるフィードバックの阻害反応を確認した。前記と同一な反応液を作製し、各反応液にそれぞれ５g/Lのメチオニンを添加または非添加して同一な反応進行を行った。メチオニンを添加しない場合の反応進行速度を１００％にしたとき、メチオニンの存在時の残存活性を％で表記して表１０に示した。
その結果、シュードモナス由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ、ノルカジア由来のＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼおよびレプトスピラ由来のＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼがメチオニンによる活性阻害を見せたことを確認した。従って、これらの酵素はメチオニンによるフィードバック阻害を有しているものと推定され、後ほど反応にはフィードバック阻害がない酵素を使用した。前記の実施例においてフィードバック阻害を受ける酵素もフィードバック阻害が解除される変異株を使用する場合、同一な反応に使用できると推定された。
＜３−２３＞ 転換酵素の相同性比較
転換反応に使用された各酵素間の相同性を比較してＯ−スクシニルホモセリンおよびＯ−アセチルホモセリンに対する反応性およびフィードバック調節阻害との相関関係を確認した。
転換反応に使用された各酵素間の相同性を比較してＯ−スクシニルホモセリンおよびＯ−アセチルホモセリンに対する反応性およびフィードバック調節阻害との相関関係を確認した。
使用された酵素の相同性を比較した結果、Ｏ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼで命名されるmetZ間の相同性およびＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼで命名されるmetY間の相同性が相互間の相同性に比べて相対的に高いことがわかった。前記の実施例と連関してみてＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼで命名されたmetZの場合にはフィードバック調節阻害を見せていない場合が最も多いのに比べて、Ｏ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼで命名されたmetYの場合には実施例に使用された酵素の全てがフィードバック調節阻害を見せて相対的に高いフィードバック調節阻害を有していることと確認された。Ｏ−スクシニルホモセリンおよびＯ−アセチルホモセリンに対する選択性について、metZ遺伝子群はＯ−スクシニルホモセリンに対する選択性が高く、metY遺伝子群はＯ−アセチルホモセリンに対する選択性は高かったが、シュードモナスプチダ由来のmetYおよびクロモバクテリウムビオラシウム由来のmetZは２つの両基質に対して特異的に高い反応性を見せた。
実施例に使用された全ての酵素をアミノ酸配列に基づいて配列整列プログラムのクラスタルWプログラム(ClustalW program; DNAstar)で整列(align)した結果、次のような配列で明記されるドメインを共通的に有していることが確認された。
ドメイン１：Y-(S, I, T, V)-R-X-X-(N,S)
ドメイン２：
(V,A,I)-(V,L,I)-D-N-X-(F,V,M,I)-X-(T,S)-(P,A)-X-(L,I)-(Q,C,V)-X-(P,G)-(L,F)
-X-(L,M,H)-G-(A,V)-(D,H)
ドメイン３：
(S,A,G,P)-(P,A,V)-F-(N,D)-(A,S)-(W,F,Y)-X-X-X-(K,Q,R,S)-G-(L,M,V,I,M)-(
E,K,D,R)-T-(L,M)
ドメイン５：(H,Y)-(P,A)-(A,S)-(T,S)-(T,M,Q)-(T,S)-H-
ドメイン６：(V,I,L)-R-(V,I,L,F)-(S,A)-(V,I,T)-G-(L,I)-E-
ドメイン２：
(V,A,I)-(V,L,I)-D-N-X-(F,V,M,I)-X-(T,S)-(P,A)-X-(L,I)-(Q,C,V)-X-(P,G)-(L,F)
-X-(L,M,H)-G-(A,V)-(D,H)
ドメイン３：
(S,A,G,P)-(P,A,V)-F-(N,D)-(A,S)-(W,F,Y)-X-X-X-(K,Q,R,S)-G-(L,M,V,I,M)-(
E,K,D,R)-T-(L,M)
ドメイン５：(H,Y)-(P,A)-(A,S)-(T,S)-(T,M,Q)-(T,S)-H-
ドメイン６：(V,I,L)-R-(V,I,L,F)-(S,A)-(V,I,T)-G-(L,I)-E-
実施例４：メチオニン転換酵素によるメチオニン転換反応
＜４−１＞ 転換酵素の大量産生
実施例２（２−２および２−８）から作製されたメチオニン転換酵素の産生菌株を大量産生するために１Ｌ発酵槽培養を施した。抗生剤スペクチノマイシンが含有されたＬＢプレート培地にW3110をシュードモナス由来metZ発現ベクターで形質転換またはヒポモナス由来metZ発現ベクターで形質転換させた菌株をそれぞれ播種して３０〜４０℃で一夜培養した後、単一コロニーをスペクチノマイシンが含まれた４０mlＬＢ培地に播種した後、３０〜４０℃で５時間培養した。このように培養されたシュードモナス由来metZ発現菌株およびヒポモナス由来metZ発現菌株を１L発酵槽で６００〜９００rpm、３０〜４０℃、１５〜３０時間培養した。培養に使用された培地組成は表１１に示した。
実施例２（２−２および２−８）から作製されたメチオニン転換酵素の産生菌株を大量産生するために１Ｌ発酵槽培養を施した。抗生剤スペクチノマイシンが含有されたＬＢプレート培地にW3110をシュードモナス由来metZ発現ベクターで形質転換またはヒポモナス由来metZ発現ベクターで形質転換させた菌株をそれぞれ播種して３０〜４０℃で一夜培養した後、単一コロニーをスペクチノマイシンが含まれた４０mlＬＢ培地に播種した後、３０〜４０℃で５時間培養した。このように培養されたシュードモナス由来metZ発現菌株およびヒポモナス由来metZ発現菌株を１L発酵槽で６００〜９００rpm、３０〜４０℃、１５〜３０時間培養した。培養に使用された培地組成は表１１に示した。
培養が終わったメチオニン転換酵素発酵液を超音波電動を用いて細胞を破砕してメチオニン転換酵素液を作製した。
＜４−２＞ メチオニン転換反応
前記の実施例２（２−２）から産生されたＯ−スクシニルホモセリン発酵液とＯ−アセチルホモセリン発酵液とにそれぞれ実施例４（４−１）から作製されたシュードモナス由来Ｏ−スクシニルホモセリン転換酵素液およびヒホモナス由来のＯ−アセチルホモセリン転換酵素液を使用してメチオニン転換反応を行った。
前記の実施例２（２−２）から産生されたＯ−スクシニルホモセリン発酵液とＯ−アセチルホモセリン発酵液とにそれぞれ実施例４（４−１）から作製されたシュードモナス由来Ｏ−スクシニルホモセリン転換酵素液およびヒホモナス由来のＯ−アセチルホモセリン転換酵素液を使用してメチオニン転換反応を行った。
細胞を除去しないメチオニン前駆体発酵液２．０Lに破砕した酵素培養液０．１Lを添加した後、１５％Na-メチルメルカプタン０．３Lを添加して反応を開始し、２時間経過後に発酵液を回収して細胞を除去した後、HPLCを通じてメチオニン生成を確認した。その結果を表１２に示した。
前記の結果からわかるように、既存の発明では１０g/L以下の低い濃度のＬ−メチオニンを産生することに比べて前記の発明では３０g/L以上のＬ−メチオニンを生成してＬ−メチオニンを大量に産生可能であることが確認できた。
Ｌ−メチオニンを選択的に産生することによって飼料および食品添加剤、医薬用および医薬品の原料などの多様な分野で広く使用することができる。上述のとおり本発明の具体例をついて詳細に説明したが、本発明の範疇および技術思想範囲内で当業者にとって多様な変形および修正が可能であることは明らかであり、このような変形および修正が添付された本発明の特許請求範囲に属することも当然である。
Claims (37)
- Ｌ−メチオニンおよび有機酸を産生する方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする産生方法；
１））Ｏ−アシルホモセリンの分解に関与するシスタチオニンγ合成酵素(cystathionine gamma synthase)またはＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ(O-succinylhomoserine sulfhydrylase)またはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ(O-Acetylhomoserine sulfhydrylase)の活性を欠損または弱化させることによりＯ−アシルホモセリンを産生することができる細菌菌株を作製し、このＯ−アシルホモセリンを産生することができる細菌菌株を発酵槽培養してＯ−アシルホモセリンを培養液に蓄積する工程、および
２） 蓄積されたＯ−アシルホモセリンを、Ｌ−メチオニンおよび有機酸に転換するために少なくとも培養液の一部と転換酵素を混合し、ここでメチルメルカプタンまたはそれの塩を添加する工程、ここで前記転換酵素は二次細菌菌株から由来し、シスタチオニンγ合成酵素(cystathionine gamma synthase)、Ｏ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ(O-succinylhomoserine sulfhydrylase)またはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ(O-Acetylhomoserine sulfhydrylase) から選択され、Ｏ−アシルホモセリンはＬ−メチオニン前駆体である。 - 前記Ｏ−アシルホモセリンはＯ−アセチルホモセリンまたはＯ−スクシニルホモセリンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 第１工程のＯ−アシルホモセリンを産生することができる菌株はエシェリキア(Escherichia)属、エルウィニア(Erwinia)属、セラチア(Serratia)属、プロビデンシア(Providencia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、レプトスピラ(Leptospira)属、サルモネラル(Salmonellar)属、ブレビバクテリウム(Brevbacterium)属、ヒポモナス(Hyphomonas)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属、ノルカジア(Norcardia)属、または黴類(fungi)または酵母類(yeast)からなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 第１工程のＯ−アシルホモセリンを産生することができる菌株はＬ−トレオニン、Ｌ−イソロイシン、またはＬ−リシン産生菌株に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 第１工程のＯ−アシルホモセリンを産生することができる菌株はＬ−トレオニン産生菌株に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記Ｌ−トレオニン産生菌株はエシェリキア属、コリネバクテリウム属から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
- 第１工程のＯ−アシルホモセリンを産生することができる菌株はエシェリキアコリ(Escherichia coli)を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記シスタチオニンγ合成酵素またはＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼまたはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼはそれぞれmetB、またはmetZ、またはmetY、またはこれらの変異体遺伝子によってコードされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 第１工程のＯ−アシルホモセリンを産生することができる菌株はトレオニン、またはイソロイシン、またはリシン生合成経路が弱化または欠損された菌株を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- トレオニン生合成経路に関与するホモセリンキナーゼ酵素が欠損または弱化されたことを特徴とする請求項９に記載の方法。
- 前記ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子がthrBであることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
- 第１工程のＯ−アシルホモセリンを産生することができる菌株はホモセリンからＯ−アシルホモセリンの合成経路を強化させた菌株を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記Ｏ−アシルホモセリンを産生することができる菌株はホモセリンからＯ−アシルホモセリンの合成経路に関与するホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ、またはホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの発現または活性をさらに強化して調製されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
- 前記合成Ｏ−アシルホモセリンを産生することができる菌株はＯ−スクシニルトランスフェラーゼをコードするmetA遺伝子、またはホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコードするmetX遺伝子の過多発現によって強化して調製されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
- 前記Ｏ−アシルホモセリンを産生することができる菌株はフィードバックが解除されたホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼ、またはホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの導入によって強化して調製されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
- 前記Ｏ−アシルホモセリンを産生することができる菌株はＬ−メチオニン前駆体産生遺伝子の転写に関与する調節遺伝子を欠損または弱化させることによって強化して調製されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
- 前記調節遺伝子がmetJであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
- 前記Ｏ−アシルホモセリンとしてＯ−アセチルホモセリンの合成を強化させるために、微生物菌株固有のホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼを欠損または弱化させた後、新規外来または固有のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼを導入または強化することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
- 前記Ｏ−アシルホモセリンとしてＯ−スクシニルホモセリンの合成経路を強化させるために、微生物菌株固有のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼを欠損または弱化させた後、新規外来または固有のホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼを導入または強化することを特徴とする請求項１２に記載の方法。
- 前記Ｏ−アシルホモセリンを産生することができる菌株が請求項３乃至１９に記載の全部または一部の方法を用いて作製されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記Ｏ−アシルホモセリンを産生することができる菌株がメチオニン要求性が解除されたトレオニン産生菌株である大腸菌MF001(受託番号：KCCM-10568)に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記Ｏ−アシルホモセリンを産生することができる菌株がＯ−スクシニルホモセリン産生菌株である大腸菌CJM-BTJ(pMetA-CL)(受託番号：KCCM-10767P)であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記Ｏ−アシルホモセリンを産生することができる菌株がＯ−スクシニルホモセリン産生菌株である大腸菌CJM-BTJ(pCJ-MetA-CL)(受託番号：KCCM10872P)であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記Ｏ−アシルホモセリンを産生することができる菌株がＯ−アセチルホモセリン産生菌株である大腸菌CJM-BTJA(pCJ-MetX-CL)(受託番号：KCCM10873P)であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 第２工程のＯ−アシルホモセリンをメチオニンに転換する転換酵素は、エシェリキア属、エルウィニア属、セラチア属、プロビデンシア属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、レプトスピラ属、サルモネラル属、およびブレビバクテリウム属、ヒポモナス属、クロモバクテリウム属、ノルカジア属、または黴類または酵母類からなる群より選択される菌株に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 第２工程のＯ−アシルホモセリンをメチオニンに転換する転換酵素は、シュードモナス属、クロモバクテリウム属、レプトスピラ属、ヒポモナス属からなる群より選択される菌株に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 第２工程のＯ−アシルホモセリンをメチオニンに転換する転換酵素は、下記の菌株からなる群から選択される菌株に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 第２工程のＯ−アシルホモセリンをメチオニンに転換する転換酵素は、シュードモナス属、クロモバクテリウムビオラシウム、レプトスピラメイエリ、ヒポモナスネプチュニウムからなる群から選択される菌株に由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 第２工程のＯ−アシルホモセリンをメチオニンに転換する転換酵素は、Ｏ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼまたはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼの活性を有する組み換え酵素またはこの酵素活性を保有している組み換え細菌菌株であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記有機酸がコハク酸または酢酸であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記組み換え酵素または組み換え細菌菌株は、それぞれシスタチオニンγ合成酵素(cystathionine gamma synthase)またはＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ(O-succinylhomoserine sulfhydrylase)またはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ(O-Acetylhomoserine sulfhydrylase)をコードする組み換え遺伝子の少なくとも一つを含む組み換え細菌菌株から由来することを特徴とする請求項２９に記載の方法。
- 前記組み換え遺伝子は、エシェリキア属、エルウィニア属、セラチア属、プロビデンシア属、コリネバクテリウム属、シュードモナス属、レプトスピラ属、サルモネラル属、およびブレビバクテリウム属、ヒポモナス属、クロモバクテリウム属、ノルカジア属、または黴類または酵母類から由来するシスタチオニンγ合成酵素(cystathionine gamma synthase)またはＯ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ(O-succinylhomoserine sulfhydrylase)またはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ(O-Acetylhomoserine sulfhydrylase)をコードすることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
- 前記組み換え遺伝子は、エシェリキアコリK12(Escherichia Coli K12)、シュードモナスアウロゲノサ(Pseudomoans aurogenosa)、シュードモナスプチダ(Pseudomoans putida)、コリネバクテリウムグルタミクム(Corynebacterium glutamicum)、レプトスピラメイエリ(Leptospira meyeri)、サッカロミセスセレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)、クロモバクテリウムビオラシウム(Chromobacterium Violaceum)、ノルカジアファルシニカ(Norcardia Farcinica)、ブラジリゾビウムジャポニクム(Bradyrhizobium Japonicum)、ヒホモナスネプチュニウム(Hyphomonas Neptunium)、メチロコックスカプスラツス(Methylococcus Capsulatus)、 メチロバシリスフラゲラツス(Methylobacillys Flagellatus)、ニトロソモナスヨーロパエア(Nitrosomonas Europaea)、クレシエラニュモニアエ(Klesiella Pneumoniae)、バシルス属サブチリス(Bacillus Subtilis)、シゲラ属フレキシネリ2457T(Shigella flexneri 2457T)から由来されるシスタチオニンγ合成酵素(cystathionine gamma synthase)、Ｏ−スクシニルホモセリンサルフヒドリラーゼ(O-succinylhomoserine sulfhydrylase)またはＯ−アセチルホモセリンサルフヒドリラーゼ(O-Acetylhomoserine sulfhydrylase)をコードすることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
- 前記転換酵素の混合前に、培養液からＯ−アシルホモセリンを生産することができる細菌菌株を分離することを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記転換酵素は、破砕された細胞抽出液の上澄液として提供されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記培養液で、Ｏ−アシルホモセリンの濃度は醗酵の後５０ｇ/ｌ以上に到達することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 前記培養液で、Ｏ−アシルホモセリンの濃度は醗酵の後３０ｇ/ｌ以上に到達することを特徴とする請求項１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2006-0071581 | 2006-07-28 | ||
| KR20060071581 | 2006-07-28 | ||
| KR10-2007-0076045 | 2007-07-27 | ||
| KR1020070076045A KR100905381B1 (ko) | 2006-07-28 | 2007-07-27 | Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법 |
| PCT/KR2007/003650 WO2008013432A1 (en) | 2006-07-28 | 2007-07-30 | Microorganism producing l-methionine precursor and method of producing l-methionine and organic acid from the l-methionine precursor |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012148175A Division JP5371073B2 (ja) | 2006-07-28 | 2012-07-02 | Ｌ−メチオニン前駆体産生菌株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009544309A JP2009544309A (ja) | 2009-12-17 |
| JP5078101B2 true JP5078101B2 (ja) | 2012-11-21 |
Family
ID=39222930
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009521706A Active JP5078101B2 (ja) | 2006-07-28 | 2007-07-30 | Ｌ−メチオニン前駆体産生菌株およびｌ−メチオニン前駆体からのｌ−メチオニンおよび有機酸の産生方法 |
| JP2012148175A Active JP5371073B2 (ja) | 2006-07-28 | 2012-07-02 | Ｌ−メチオニン前駆体産生菌株 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2012148175A Active JP5371073B2 (ja) | 2006-07-28 | 2012-07-02 | Ｌ−メチオニン前駆体産生菌株 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US8426171B2 (ja) |
| EP (2) | EP2046968B1 (ja) |
| JP (2) | JP5078101B2 (ja) |
| KR (2) | KR100905381B1 (ja) |
| CN (3) | CN101356281B (ja) |
| BR (1) | BRPI0712399B1 (ja) |
| DK (1) | DK2657345T3 (ja) |
| ES (2) | ES2595453T3 (ja) |
| PL (2) | PL2046968T3 (ja) |
| WO (1) | WO2008013432A1 (ja) |
Families Citing this family (56)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100905381B1 (ko) | 2006-07-28 | 2009-06-30 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법 |
| US7851180B2 (en) * | 2008-04-04 | 2010-12-14 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism |
| US9005952B2 (en) * | 2008-04-04 | 2015-04-14 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism |
| KR101048593B1 (ko) | 2009-02-27 | 2011-07-12 | 씨제이제일제당 (주) | 메칠머캅탄과 디메칠설파이드의 혼합물을 사용하여 메치오닌 생산능을 증가시키는 방법 |
| KR101164711B1 (ko) | 2009-02-27 | 2012-07-11 | 씨제이제일제당 (주) | 미네랄 첨가와 산처리를 이용하여 메치오닌의 용해도를 증가시키는 방법 |
| US8609396B2 (en) | 2009-08-28 | 2013-12-17 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-acetyl-homoserine using the microorganism |
| US8283152B2 (en) * | 2009-08-28 | 2012-10-09 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-acetyl-homoserine using the microorganism |
| WO2011080301A2 (en) * | 2009-12-30 | 2011-07-07 | Metabolic Explorer | Strains and method for the production of methionine |
| KR101381048B1 (ko) * | 2010-10-20 | 2014-04-14 | 씨제이제일제당 (주) | Ｏ-포스포세린 생산 균주 및 이로부터 생산된 ｏ-포스포세린으로부터 ｌ-시스테인 또는 이의 유도체의 생산방법 |
| KR101250651B1 (ko) * | 2010-12-21 | 2013-04-03 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 ｏ-아세틸호모세린 설피드릴라제 또는 변이체 및 이를 이용한 메치오닌 전환 방법 |
| JP6368488B2 (ja) | 2010-12-29 | 2018-08-01 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーション | Ｌ−メチオニン及び関連産物の生産方法 |
| CN107475319A (zh) * | 2011-09-02 | 2017-12-15 | 阿克马法国公司 | L‑甲硫氨酸的制备方法 |
| US9834491B2 (en) * | 2013-03-20 | 2017-12-05 | Cj Cheiljedang Corporation | Method for producing bio-based homoserine lactone and bio-based organic acid from O-acyl homoserine produced by microorganisms |
| KR101565213B1 (ko) | 2013-10-23 | 2015-11-03 | 씨제이제일제당 (주) | Ｏ-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 ｏ-숙시닐호모세린의 생산방법 |
| KR101555749B1 (ko) | 2013-10-23 | 2015-09-25 | 씨제이제일제당 (주) | O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-숙시닐호모세린의 생산방법 |
| KR101555750B1 (ko) * | 2013-10-23 | 2015-09-25 | 씨제이제일제당 (주) | O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-숙시닐호모세린의 생산방법 |
| EP3090070B1 (en) * | 2014-01-02 | 2020-04-29 | Trelys, Inc. | Compositions and methods for biological production of amino acids in hydrogenotrophic microorganisms |
| EP3150710B1 (en) * | 2014-03-20 | 2022-05-11 | Cj Cheiljedang Corporation | Method for preparing homoserine lactone and organic acid from microorganism-derived o-acyl homoserine |
| KR101580785B1 (ko) * | 2014-04-10 | 2015-12-29 | 씨제이제일제당 주식회사 | O-숙시닐호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-숙시닐호모세린의 생산방법 |
| KR101547651B1 (ko) * | 2014-06-03 | 2015-08-26 | 씨제이제일제당 주식회사 | O-숙시닐호모세린 또는 숙신산의 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 숙신산 또는 o-숙시닐호모세린의 생산 방법 |
| KR101825777B1 (ko) * | 2014-06-05 | 2018-02-07 | 씨제이제일제당 (주) | O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법 |
| KR101641770B1 (ko) | 2014-06-23 | 2016-07-22 | 씨제이제일제당 (주) | O-아세틸 호모세린을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 o-아세틸 호모세린을 생산하는 방법 |
| KR20160111285A (ko) | 2015-03-16 | 2016-09-26 | 씨제이제일제당 (주) | 사료 첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물 |
| BR112017023761A2 (pt) | 2015-05-06 | 2018-07-31 | Trelys Inc | composições e métodos para a produção biológica de metionina |
| EP3305808B1 (en) * | 2015-06-04 | 2022-01-12 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing o-acetyl-homoserine, and method for producing o-acetyl-homoserine by using same |
| WO2017009047A1 (en) * | 2015-07-13 | 2017-01-19 | Evonik Degussa Gmbh | Method for producing l-methionine |
| PL3331998T3 (pl) | 2015-08-07 | 2020-12-28 | Evonik Operations Gmbh | Wytwarzanie przez fermentację l-metioniny zależne od tiokarboksylanu białka |
| FR3041659B1 (fr) | 2015-09-30 | 2017-10-20 | Arkema France | Procede de production de l-methionine |
| FR3041658B1 (fr) | 2015-09-30 | 2017-10-20 | Arkema France | Procede de production de l-methionine |
| KR101836719B1 (ko) * | 2015-10-13 | 2018-04-20 | 씨제이제일제당 (주) | O-아세틸호모세린 설피드릴라제 변이체 및 이를 이용한 l-메치오닌 제조 방법 |
| WO2017065567A1 (en) * | 2015-10-14 | 2017-04-20 | Cj Cheiljedang Corporation | Bio-based n-acetyl-l-methionine and use thereof |
| KR101821050B1 (ko) | 2015-10-14 | 2018-03-09 | 씨제이제일제당 (주) | 바이오-기반 n-아세틸-l-메티오닌 및 이의 용도 |
| MX2018006434A (es) | 2015-11-27 | 2018-09-28 | Evonik Degussa Gmbh | Metodo para producir l-metionina. |
| KR101851452B1 (ko) | 2016-07-18 | 2018-04-24 | 씨제이제일제당 (주) | O-아세틸-호모세린을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 o-아세틸-호모세린을 생산하는 방법 |
| CN106065411B (zh) * | 2016-08-10 | 2021-12-07 | 洛阳华荣生物技术有限公司 | 发酵法生产肌酸 |
| EP3330380A1 (en) | 2016-12-05 | 2018-06-06 | Evonik Degussa GmbH | Process for producing l-methionine from methional |
| FR3061493B1 (fr) * | 2016-12-29 | 2020-07-03 | Arkema France | Procede de synthese de polysulfures fonctionnalises |
| FR3061494B1 (fr) | 2016-12-29 | 2020-07-03 | Arkema France | Procede de synthese de dithiocarbamates cycliques fonctionnalises |
| SG11201913889WA (en) * | 2017-06-30 | 2020-01-30 | Cj Cheiljedang Corp | Novel o-succinyl homoserine transferase variant and method of producing o-succinyl homoserine using the same |
| CN111032862B (zh) * | 2017-06-30 | 2023-09-19 | Cj第一制糖株式会社 | 新型o-琥珀酰高丝氨酸转移酶突变体及使用其生产o-琥珀酰高丝氨酸的方法 |
| CN107541531B (zh) * | 2017-09-26 | 2020-07-17 | 扬州工业职业技术学院 | 一种利用微生物代谢处理石油化工污水生产蛋氨酸的方法 |
| KR101866884B1 (ko) | 2018-01-29 | 2018-06-14 | 씨제이제일제당(주) | 사료 첨가제용 조성물 및 이를 포함하는 동물 사료 조성물 |
| KR102377500B1 (ko) * | 2019-10-28 | 2022-03-23 | 씨제이제일제당 주식회사 | 외래 metZ 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 도입된 L-메티오닌 생산 미생물 및 이를 이용한 L-메티오닌 생산방법 |
| KR102182497B1 (ko) | 2019-12-20 | 2020-11-24 | 씨제이제일제당 주식회사 | 내막 단백질의 변이체 및 이를 이용한 목적 산물 생산 방법 |
| JP2023532005A (ja) | 2020-06-26 | 2023-07-26 | シージェイ チェイルジェダン コーポレーション | 発酵液からアミノ酸顆粒を製造する方法 |
| FR3112549A1 (fr) | 2020-07-20 | 2022-01-21 | Arkema France | Procede ameliore de synthese de mercaptans fonctionnalises |
| FR3117115B1 (fr) | 2020-12-04 | 2023-05-05 | Arkema France | Procede de synthese de mercaptans fonctionnalises sous pression d’h2s |
| KR102525074B1 (ko) | 2021-03-10 | 2023-04-24 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규한 시트레이트 신타아제 변이체 및 이를 이용한 o-아세틸-l-호모세린 또는 l-메티오닌 생산 방법 |
| AU2022250692B2 (en) | 2021-04-01 | 2024-01-04 | Evonik Operations Gmbh | Enzymatic method for producing l-glufosinate and its phosphoesters |
| CN113088503B (zh) * | 2021-04-27 | 2023-01-10 | 浙江工业大学 | 一种o-琥珀酰巯基转移酶突变体及其在l-甲硫氨酸合成中的应用 |
| KR102377745B1 (ko) | 2021-05-12 | 2022-03-23 | 씨제이제일제당 주식회사 | 신규 프로모터 및 이의 용도 |
| WO2022244932A1 (ko) | 2021-05-20 | 2022-11-24 | 씨제이제일제당 (주) | 신규 프로모터 및 이의 용도 |
| TW202333581A (zh) | 2021-12-24 | 2023-09-01 | 南韓商Ｃｊ第一製糖股份有限公司 | 由發酵液製備含胺基酸製品之方法 |
| KR20230139597A (ko) * | 2022-03-28 | 2023-10-05 | 씨제이제일제당 (주) | O-아세틸 호모세린 생산 미생물 및 이를 이용한 o-아세틸 호모세린 또는 l-메치오닌 생산 방법 |
| WO2024061456A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Evonik Operations Gmbh | Enzymatic method for producing l-glufosinate and its phosphoesters |
| WO2024061455A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Evonik Operations Gmbh | Enzymatic method for producing l-glufosinate and its phosphoesters |
Family Cites Families (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR920008365Y1 (ko) | 1990-01-31 | 1992-11-20 | 주식회사 기아기공 | Nc 연삭기 오버트래블(over travel) 해제회로 |
| KR920009598B1 (ko) | 1990-10-11 | 1992-10-21 | 주식회사삼성전자 | 풀림방지용 체결기구 |
| KR920008365B1 (ko) | 1990-12-31 | 1992-09-26 | 제일제당 주식회사 | L-스레오닌 제조방법 |
| JPH07503855A (ja) * | 1992-02-20 | 1995-04-27 | ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド | 硫黄の還元源を用いたメチオニンの生合成 |
| JP4110641B2 (ja) * | 1998-11-17 | 2008-07-02 | 味の素株式会社 | 発酵法によるｌ−メチオニンの製造法 |
| BRPI0016995B1 (pt) | 2000-01-21 | 2016-03-08 | Ajinomoto Kk | bactéria escherichia coli geneticamente modificada, e, método para produzir l-lisina |
| US20020049305A1 (en) | 2000-08-02 | 2002-04-25 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the metF gene |
| DE10107002A1 (de) | 2001-02-15 | 2002-08-29 | Consortium Elektrochem Ind | Verfahren zur fermentativen Herstellung von O-Acetyl-L-Serin |
| US6579705B2 (en) | 2001-04-04 | 2003-06-17 | Consortium Fur Elektrochemische Industrie Gmbh | Process for preparing non-proteinogenic L-amino acids |
| DE10126164A1 (de) | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Degussa | Für das metD-gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| US7160711B2 (en) | 2001-08-06 | 2007-01-09 | Degussa Ag | Coryneform bacteria which produce chemical compounds I |
| DE10239073A1 (de) * | 2002-08-26 | 2004-03-11 | Basf Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung schwefelhaltiger Feinchemikalien |
| DE10247437A1 (de) | 2002-10-11 | 2004-04-29 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Feedback-resistente Homoserin-Transsuccinylasen |
| DE10249642A1 (de) | 2002-10-24 | 2004-05-13 | Consortium für elektrochemische Industrie GmbH | Feedback-resistente Homoserin-Transsuccinylasen mit modifiziertem C-Terminus |
| FR2851256A1 (fr) * | 2003-02-18 | 2004-08-20 | Metabolic Explorer Sa | Procede de criblage et d'evolution dirigee de souches produisant de la methionine par nouvelle voie metabolique |
| JP2006517796A (ja) * | 2003-02-18 | 2006-08-03 | メタボリック エクスプローラー | 代謝経路の生成または改変を可能とする進化した微生物の生産方法 |
| US20040199941A1 (en) | 2003-03-24 | 2004-10-07 | Rice University | Increased bacterial CoA and acetyl-CoA pools |
| DE10316109A1 (de) | 2003-04-09 | 2004-10-21 | Degussa Ag | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| AU2004293807A1 (en) | 2003-11-24 | 2005-06-09 | Pgxhealth, Llc | NTRK1 genetic markers associated with progression of Alzheimer's Disease |
| KR100576342B1 (ko) | 2004-02-05 | 2006-05-03 | 씨제이 주식회사 | ｇａｌＲ 유전자가 불활성화된 Ｌ-쓰레오닌 생성 미생물,그를 제조하는 방법 및 상기 미생물을 이용한Ｌ-쓰레오닌의 제조방법 |
| ES2267026T3 (es) | 2004-04-29 | 2007-03-01 | Borealis Technology Oy | Proceso de produccion de polietileno. |
| WO2005111202A1 (en) * | 2004-05-12 | 2005-11-24 | Metabolic Explorer | Recombinant enzyme with altered feedback sensitivity |
| KR100651220B1 (ko) * | 2004-06-29 | 2006-11-29 | 씨제이 주식회사 | Ｌ-메씨오닌 생산 균주 및 상기 균주를 이용한ｌ-메씨오닌의 생산방법 |
| WO2006082252A2 (en) | 2005-02-07 | 2006-08-10 | Metabolic Explorer | Method for the enzymatic production of alpha-ketobutyrate |
| CA2611513A1 (en) | 2005-06-17 | 2006-12-28 | Microbia, Inc. | Improved amino acid and metabolite biosynthesis |
| JP2009501550A (ja) | 2005-07-18 | 2009-01-22 | ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア | メチオニン生産組換え微生物 |
| US8389250B2 (en) | 2006-01-04 | 2013-03-05 | Metabolic Explorer | Methods for producing methionine by culturing a microorganism modified to enhance production of cysteine |
| JP2009060791A (ja) | 2006-03-30 | 2009-03-26 | Ajinomoto Co Inc | Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法 |
| KR100905381B1 (ko) | 2006-07-28 | 2009-06-30 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법 |
| CN101573438B (zh) | 2006-09-15 | 2013-01-02 | Cj第一制糖株式会社 | 具有增加的l-赖氨酸生产力的棒状杆菌和使用其生产l-赖氨酸的方法 |
| US8143035B2 (en) | 2006-09-22 | 2012-03-27 | Rice University | Pantothenate kinase overexpression and pantothenic acid supplementation in actinomycetes |
| EP2808382B1 (en) | 2007-04-11 | 2016-03-16 | CJ CheilJedang Corporation | Compositions and methods of producing methionine |
| US7851180B2 (en) * | 2008-04-04 | 2010-12-14 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism |
| US9005952B2 (en) | 2008-04-04 | 2015-04-14 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism |
| US8283152B2 (en) | 2009-08-28 | 2012-10-09 | Cj Cheiljedang Corporation | Microorganism producing O-acetyl-homoserine and the method of producing O-acetyl-homoserine using the microorganism |
-
2007
- 2007-07-27 KR KR1020070076045A patent/KR100905381B1/ko active IP Right Grant
- 2007-07-30 US US12/066,111 patent/US8426171B2/en active Active
- 2007-07-30 CN CN200780001169.7A patent/CN101356281B/zh active Active
- 2007-07-30 DK DK13178074.4T patent/DK2657345T3/en active
- 2007-07-30 EP EP07793305.9A patent/EP2046968B1/en active Active
- 2007-07-30 EP EP13178074.4A patent/EP2657345B1/en active Active
- 2007-07-30 ES ES13178074.4T patent/ES2595453T3/es active Active
- 2007-07-30 CN CN201210149909.4A patent/CN102943096B/zh active Active
- 2007-07-30 ES ES07793305T patent/ES2430274T3/es active Active
- 2007-07-30 CN CN201310068944.8A patent/CN103397057B/zh active Active
- 2007-07-30 PL PL07793305T patent/PL2046968T3/pl unknown
- 2007-07-30 BR BRPI0712399A patent/BRPI0712399B1/pt active IP Right Grant
- 2007-07-30 PL PL13178074T patent/PL2657345T3/pl unknown
- 2007-07-30 JP JP2009521706A patent/JP5078101B2/ja active Active
- 2007-07-30 WO PCT/KR2007/003650 patent/WO2008013432A1/en active Application Filing
-
2008
- 2008-11-05 KR KR1020080109357A patent/KR100951766B1/ko active IP Right Grant
-
2012
- 2012-07-02 JP JP2012148175A patent/JP5371073B2/ja active Active
-
2013
- 2013-01-29 US US13/752,907 patent/US9029105B2/en active Active
-
2015
- 2015-04-07 US US14/680,355 patent/US20150211034A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2009544309A (ja) | 2009-12-17 |
| ES2430274T3 (es) | 2013-11-19 |
| KR100905381B1 (ko) | 2009-06-30 |
| BRPI0712399A2 (pt) | 2012-10-16 |
| ES2595453T3 (es) | 2016-12-30 |
| CN102943096B (zh) | 2014-08-27 |
| CN101356281B (zh) | 2015-08-19 |
| CN102943096A (zh) | 2013-02-27 |
| EP2046968B1 (en) | 2013-09-11 |
| CN101356281A (zh) | 2009-01-28 |
| KR100951766B1 (ko) | 2010-04-08 |
| EP2657345A1 (en) | 2013-10-30 |
| JP5371073B2 (ja) | 2013-12-18 |
| EP2657345B1 (en) | 2016-09-07 |
| PL2657345T3 (pl) | 2017-01-31 |
| JP2012213401A (ja) | 2012-11-08 |
| US8426171B2 (en) | 2013-04-23 |
| BRPI0712399B1 (pt) | 2017-06-06 |
| EP2046968A1 (en) | 2009-04-15 |
| EP2046968A4 (en) | 2011-04-27 |
| US20100184164A1 (en) | 2010-07-22 |
| US20150211034A1 (en) | 2015-07-30 |
| KR20080011132A (ko) | 2008-01-31 |
| PL2046968T3 (pl) | 2013-12-31 |
| US20130231503A1 (en) | 2013-09-05 |
| DK2657345T3 (en) | 2016-10-24 |
| CN103397057A (zh) | 2013-11-20 |
| CN103397057B (zh) | 2016-03-23 |
| KR20080102123A (ko) | 2008-11-24 |
| US9029105B2 (en) | 2015-05-12 |
| WO2008013432A1 (en) | 2008-01-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5078101B2 (ja) | Ｌ−メチオニン前駆体産生菌株およびｌ−メチオニン前駆体からのｌ−メチオニンおよび有機酸の産生方法 | |
| JP5339996B2 (ja) | Ｌ−メチオニン前駆体生産菌株およびこれを用いたｌ−メチオニン前駆体の生産方法 | |
| JP5525746B2 (ja) | Ｌ−メチオニン前駆体生産菌株およびこれを用いたｌ−メチオニン前駆体の生産方法 | |
| JP2008504048A (ja) | Ｌ−メチオニン生産菌株及び前記菌株を用いたｌ−メチオニンの生産方法 | |
| US20110053252A1 (en) | Microorganism producing o-acetyl-homoserine and the method of producing o-acetyl-homoserine using the microorganism | |
| KR101136248B1 (ko) | Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 이를 이용한 ｌ-메치오닌 전구체의 생산 방법 | |
| EP2751276A1 (en) | Preparation process of l-methionine | |
| KR101136289B1 (ko) | Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 이를 이용한 ｌ-메치오닌 전구체의 생산 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110809 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111109 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111124 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120229 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120702 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120718 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20120725 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120823 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120824 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150907 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5078101 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |