JP5525746B2 - L−メチオニン前駆体生産菌株およびこれを用いたl−メチオニン前駆体の生産方法 - Google Patents
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Description
今まで知られているメチオニンおよび/またはS−アデノシル−メチオニンの生体内(in vivo)機能は、次のとおりである。
1)脂肪代謝を促進する肝と動脈における脂肪蓄積を抑制し、脳、心臓および腎臓の血液循環を向上させる(非特許文献1)。
2)消化作用、毒性物質の解毒または排出、および鉛(Pb)などの重金属の排出を増進させる。
3)1日当たり800〜1600mgの投与量で抗うつ剤として投与できる(非特許文献2)。
4)肝機能を増進させ(非特許文献3)、特に、アルコールによって引き起こされる肝疾患に効果的である(非特許文献4)。
5)骨関節疾患に対する抗炎症効果を示し、関節回復を促進する(非特許文献5)。
6)毛髪の必須栄養素である。毛髪に栄養を供給することにより、脱毛を防ぐ(非特許文献6)。
化学的な合成は、主に、5−(β−メチルメルカプトエチル)−ヒダントイン(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)の加水分解反応によってメチオニンを生産する。ところが、このように化学的に合成されたメチオニンは、L型とD型の混合形態で生産されるという欠点を持っている。
生物学的な合成は、メチオニンの合成に関与するタンパク質を使用する方法である。L−メチオニンは、大腸菌(E.coli)においてmetA、metB、metC、metEおよびmetHなどの遺伝子から発現する酵素の作用によってホモセリンから生合成される。特に、metAは、メチオニン生合成の一番目の酵素であるホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ(succinyltransferase)をコードする遺伝子であって、ホモセリンをO−スクシニル−L−ホモセリン(O-succinylhomoserine)に転換する機能を行う。metB遺伝子によってコードされるO−スクシニルホモセリンリアーゼ(O-succinylhomoserine lyase)またはシスタチオニンガンマシンターゼ(cystathionine gamma synthase)は、O−スクシニル−L−ホモセリンをシスタチオニンに転換する。metCによってコードされるシスタチオニンベータリアーゼは、シスタチオニンをL−ホモシステインに転換する機能を行う。metEによってコードされるコバラミン非依存性メチオニンシンターゼ(cobalamine-independent methionine synthase)と、metHによってコードされるコバラミン依存性メチオニンシンターゼ(cobalamine-dependent methionine synthase)は、L−ホモシステインをL−メチオニンに転換する。ここに加えて、metFによってコードされる5,10−メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase)と、glyAによってコードされるセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼとは一緒に作用し、L−メチオニンの合成に必須的なメチル基を提供するN(5)−メチルテトラヒドロ葉酸(N(5)-methyltetrahydrofolate)を合成する機能を行う。
また、生物学的方法によって生産されるメチオニンは、L型であるという利点があるが、その量は極めて微量である。これはメチオニン生合成経路が非常によく調節されるフィードバック体系を持っているためである。メチオニンが一定の水準以上に合成されると、最終産物としてのメチオニンがメチオニン生合成を開始する初期タンパク質をコードするmetA遺伝子の転写をフィードバックで抑制する。metA遺伝子は、転写段階ではメチオニンによって阻害され、翻訳段階では細胞内プロテアーゼによって分解されるメカニズムでメチオニンの量を調節するので、metA遺伝子の高発現のみではメチオニンの量を一定の水準以上に増加させることができない(非特許文献7)。したがって、以前の多くの特許らは、フィードバック調節体系からmetA遺伝子のフィードバックを解除する研究に集中している(特許文献4および特許文献5)。
このような問題を解決するために、本発明者らは、2段階、(1)大腸菌(E.coli)の発酵によってL−メチオニン前駆体を生産する段階と、(2)酵素反応によってL−メチオニン前駆体をL−メチオニンに転換する段階とを含む過程を開発したことがある(特許文献7)。前記2段階の過程による場合、硫化物特有の基質毒性問題、メチオニンとSAMeによる菌株のフィードバック調節問題、細胞内酵素(例えば、シスタチオニンガンマシンターゼ、O−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼ、およびO−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼ)による中間産物の分解活性問題を全て解決することができる。しかも、D−メチオニンとL−メチオニンとの混合形態を生産する化学的な合成方法に比べ、前記2段階の過程はL−メチオニンのみを選択的に生産するのに非常に効果的である。
前記2段階の過程で、メチオニン前駆体の生産量はメチオニン生産量増加の核心要素の一つである。メチオニン前駆体であるO−アセチルホモセリンの合成量を増加させるために、強力なアスパルトキナーゼ、ホモセリントランスフェラーゼおよびO−アセチルホモセリントランスフェラーゼの組み合わせが非常に重要である。
本発明の目的は、1)ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ活性(EC2.3.1.46)が導入および増進され、前記ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼはメチオニンに対するフィードバック抵抗性を有し;2)アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性(EC2.7.2.4または1.1.1.3)が増進された、O−スクシニルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株を提供することにある。
本発明の他の目的は、前記菌株を用いてL−メチオニン前駆体を生産する方法を提供することにある。
本願で使用される用語「L−メチオニン前駆体」とは、メチオニン特化代謝経路の一部分である代謝物質、またはこの代謝物質から派生した物質をいう。特に、本願におけるL−メチオニン前駆体とはO−スクシニルホモセリンを意味する。
本願で使用される用語「L−メチオニン前駆体生産菌株」とは、L−メチオニン前駆体を生物体内で生産することが可能な原核または眞核微生物菌株であって、本発明に係る操作によってL−メチオニン前駆体を蓄積することが可能な菌株をいう。例えば、菌株はエシェリキア属(Escherichia sp.)、エルウィニア属(Erwinia sp.)、セラシア属(Serratia sp.)、プロビデンシア属(Providencia sp.)、コリネバクテリウム属(Corynebacteria sp.)、シュードモナス属(Pseudomonas sp.)、レプトスピラ属 (Leptospira)、サルモネラ属(Salmonellar sp.)、ブレビバクテリウム属(Brevibacteria sp.)、ヒポモナス属(Hypomonas sp.)、クロモバクテリウム属(Chromobacteria sp.)、およびノカルジア属(Nocardia)、またはカビ類(fungi)または酵母類(yeast)に属する微生物菌株を含むことができる。好ましくは、エシェリキア属、コリネバクテリウム属およびレプトスピラ属の微生物菌株と酵母である。さらに好ましくはエシェリキア属の微生物菌株であり、最も好ましくは大腸菌(E.coli)である。
さらに詳しくは、本発明は、L−メチオニン前駆体の分解に関与するmetB遺伝子、トレオニン生合成経路に関与するthrB遺伝子、およびL−メチオニン前駆体生産遺伝子の転写を調節するmetJ遺伝子を欠損させたL−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。また、本発明は、メチオニン前駆体の合成に関与する本来のmetAまたはmetX遺伝子をノックアウトし、フィードバックが解除された外部のmetA遺伝子を導入したL−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。また、本発明は、thrA遺伝子によってコードされる活性を増強させたL−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。
さらに好ましくは、本発明は、本来のmetAまたはmetX遺伝子をノックアウトし、フィードバック抵抗性metA遺伝子を導入し、thrA遺伝子を増進させたL−メチオニン前駆体生産菌株を提供する。
本願で使用される用語「非活性」 の減衰または欠失をいう。遺伝子の欠失は、遺伝子を切断しあるいは染色体上に特定の遺伝子配列を挿入してタンパク質の配列を変形させることにより行われる。ここで、「減衰(attenuation)」または「弱化(weakening)」という用語は、微生物菌株において相応するDNAによってコードされる少なくとも一つの酵素に対する細胞内活性を除去または減少させることを意味する。例えば、遺伝子のプロモーター部位および5’−UTR部位の塩基配列を変形させることによりタンパク質の発現を弱化させるか、あるいは当該遺伝子のORF部位に突然変異を導入することによりタンパク質の活性を弱化させることができる。減衰の測定によれば、相応するタンパク質の濃度または活性は一般に野生型(wild-type)または初期微生物菌株の濃度または活性に比べて0〜75%、0〜50%、0〜25%、0〜10%または0〜5%に減少する。
減衰を成すために、例えば、遺伝子の発現または酵素タンパク質の触媒活性を減少または除去することができ、前記2つの方法を選択的に組み合わせることができる。
適切な培養によって、あるいは遺伝子発現の信号構造の変形によって、あるいはアンチセンス−RNA技術によって遺伝子発現を減少させることができる。例えば、遺伝子発現の信号構造は、例えばリプレッサー(repressor)遺伝子、アクチベータ(activator) 遺伝子、オペレーター(operator)、プロモーター、アテニュエーター(attenuator)、リボソーム結合部位、開始コドン(codon)およびターミネーター(terminator)である。これに関連し、JensenおよびHammer(Biotechnology and Bioengineering 58: 191 195 (1998)) 、CarrierおよびKeasling(Biotechnology Progress 15: 58 64 (1999)) 、FranchおよびGerdes(Current Opinion in Microbiology 3: 159 164 (2000)) 、並びに遺伝学科分子生物学の公知の教科書であるKnippers("Molecular Genetics", 6th edition, 1995)またはWinnacker("Genes and Clones", 1990)などを参考することができる。
できる限り、突然変異は転移(transitions)、転換(transversions)、挿入(insertions)および欠失(deletions)による突然変異である。酵素活性に関わるアミノ酸配列の変化有無に応じてミスセンス(missense)突然変異またはノンセンス(nonsense)突然変異に区分することができる。遺伝子の少なくとも一つの塩基対において、この突然変異は間違ったアミノ酸を導入し、翻訳が速やかな中断を誘導する。もし停止コドンが突然変異の結果としてコーディング地域に形成されると、これも翻訳の未成熟終了(termination)を誘導する。典型的に多数のコドンが欠失されると、酵素活性が完全に損失してしまう。このような突然変異の発生に関する具体的な内容は、Knippers("Molecular Genetics", 6th edition, 1995)、Winnacker ("Genes and Clones", , 1990)またはHagemann("General Genetics", 1986)などの著名な遺伝学および分子生物学教科書を参考することができる。
本発明の具体的な実施様態において、L−メチオニン前駆体生産菌株を準備する方法は次のとおりである。
第1段階として、O−スクシニルホモセリンまたはO−アセチルホモセリンなどのL−メチオニン前駆体を蓄積するために、シスタチオニンガンマシンターゼ、O−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼまたはO−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼなどのタンパク質をコードする遺伝子を菌株において欠損または弱化させる。
シスタチオニンガンマシンターゼまたはO−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼまたはO−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼは、次の反応式に示すように、O−スクシニルホモセリンまたはO−アセチルホモセリンをシスタチオニンまたはホモシステインに転換する能力を持っている。よって、この活性を持つ遺伝子を弱化させる場合、O−スクシニルホモセリンまたはO−アセチルホモセリンが培養液に過量蓄積される。
L−システイン+O−スクシニル−L−ホモセリン⇔スクシネート+シスタチオニン
L−システイン+O−アセチル−L−ホモセリン⇔アセテート+シスタチオニン
HS−+O−スクシニル−L−ホモセリン⇔スクシネート+ホモシステイン
HS−+O−アセチル−L−ホモセリン⇔アセテート+ホモシステイン
第3段階として、メチオニン合成経路の転写調節因子を欠損または弱化させる。メチオニン合成を随伴するmetA、metB、metC、metEおよびmetF遺伝子は、フィードバック調節体系によって抑制される。metJ遺伝子はE.coliにおける典型的な転写調節因子である。メチオニン前駆体を合成するためにmetAまたはmetX遺伝子を過発現させなければならず、このためにmetJの除去が必要である。よって、E.coliからmetJを除去すると、metAまたはmetX遺伝子の発現が常に促進された状態となり、L−メチオニン前駆体を大量生産することができる。
前記第2段階と前記第3段階は、前駆体生産菌株によって異なり、前駆体生産菌株を製作するために必須的ではない。より好ましくは、エシェリキア属の微生物における前駆体生産経路を強化するために行うことができる。
フィードバック抵抗性metA遺伝子の突然変異によってフィードバック抵抗性ホモセリンO−スクシニルの活性が発生する。PCT/US2007/009146は、フィードバック抵抗性metA遺伝子の製造方法を開示している。前記国際特許に含まれた一般な情報は本発明の範囲に含まれる。本発明において、フィードバック抵抗性metA10遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は配列番号18に、metA11遺伝子は配列番号20に、metA32遺伝子は配列番号14に、metA37遺伝子は配列番号16に、metA41遺伝子は配列番号21にそれぞれ示されている(PCT/US2007/009146)。また、本発明では、前記ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーは配列番号30のアミノ酸配列(GenBank Accession No:AP 004514によるアミノ酸配列)のうち24、29、79、114、140、163、222、275、290、291、295、297、304または305番の位置の少なくとも一つに突然変異を持っている。
metA遺伝子の導入および増進は、遺伝子の導入によって、または5’−UTRのヌクレオチド配列と遺伝子のプロモーター地域の変形によって、または目的遺伝子のORF地域への突然変異導入によってなされ得る。フィードバック調節体系から解除された突然変異metA遺伝子の導入によって、培地内メチオニンの濃度を問わずにL−メチオニン前駆体の生成が増加する。
また、O−スクシニルホモセリンの生産は、染色体から本来のmetA遺伝子を除去し、そこに突然変異metA遺伝子を導入することにより、さらに増加できる。metJ遺伝子の欠損によってプロモーターの活性が増進されたmetAプロモーターの下で、フィードバック抵抗性metA遺伝子はさらに多くのO−スクシニルホモセリンを生産することができる。
好ましくは、アスパルトキナーゼおよびホモセリンデヒドロゲナーゼは、Uniproデータベース登録番号AP_000666の遺伝子によってコードされる。さらに好ましくは、thrA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号29に示されたが、アミノ酸位置345に突然変異を持っている。ThrA活性の増進は、thrA遺伝子への突然変異導入によって染色体上に目標の遺伝子をさらに導入し、過程処理されたプラスミドをさらに導入することによりなされ得る。
L−メチオニン前駆体であるO−スクシニルホモセリンは、前記第1段階〜第5段階の全体過程または一部分を用いることにより菌株に蓄積できる。
L−メチオニン前駆体生産菌株は、L−リシン(lysine)、L−トレオニン、L−イソロイシン(isoleusine)を生産する菌株を用いて製造することができる。好ましくは、L−トレオニンを生産する菌株を使用することにより製造する。この場合には、既にホモセリンまでの合成が円滑に行われた菌株であって、さらに多くのメチオニン前駆体を合成することができる。したがって、トレオニン生産菌株を用いて、トレオニン生合成経路に関与する遺伝子、およびmetA、metY、metZを欠損または弱化させることにより、メチオニン前駆体を蓄積することができる。
本発明の好適な具体例において、L−トレオニンを生産するE.coli突然変異菌株であるTF4076(KFCC10718、韓国特許公告第92−8365号)から形質転換されたL−トレオニン生産および独立菌株としてのCJM002を使用した。TF4076は、メチオニン要求性、メチオニン類似体(例えば、α−アミノ−β−ヒドロキシバレリアン酸、AHV)、リシン類似体(例えば、S−(2−アミノエチル)−L−システイン、AEC)に対する耐性、イソロイシン類似体(例えば、α−アミノ酪酸)に対する耐性などの特徴を持つ。TF4076はメチオニン要求性菌株であって、細胞内でメチオニンは合成できない。本発明者らはこのようなメチオニン要求性を解除してメチオニン生産菌株として用いるために、NTGを使用した人工的な突然変異法を用いて、メチオニン要求性が解除されたトレオニン生産菌株E.coli CJM002を製造した。前記E.coli CJM002は、Escherichia coli MF001と命名し、2004年4月9日にKCCM(Korean Culture Center of Microorganism、韓国ソウル市西大門区弘済1洞ユリムビル361−221)に寄託番号KCCM−10568で寄託した。
本発明において、E.coli CJM002菌株のmetB、thrB、metJおよびmetA遺伝子を欠損させた後、フィードバック抵抗性metAを導入した。このように製造された最終的なL−メチオニン前駆体生産菌株はCJM−A11と命名した。CJM−X菌株をthrA発現ベクターで形質転換させ、これをCJM−A11(pthrA(M)−CL)と命名した。このように製造したO−スクシニルホモセリン生産菌株Escherichia coli CJM−A11は2008年1月23日に寄託番号KCCM10922Pで寄託した。
本発明の具体的な実施例において、E.coli FTR2533菌株のmetB、thrB、metJおよびmetA遺伝子を欠損させた後、フィードバック抵抗性metA遺伝子を導入した。このように製造された最終的なL−メチオニン前駆体はCJM2−Allと命名した。CJM2−All菌株をthrA発現ベクターで形質転換させ、これをCJM2−All(pthrA(M)−CL)と命名した。前記方法によって製造したEscherichia coli CJM2−All(pthrA(M)−CL)は、2008年2月12日に寄託番号KCCM10924Pで寄託した。
別の様態において、本発明は、L−メチオニン前駆体を生産する方法に関するものである。具体的には、本発明は、a)前記微生物菌株を発酵させる段階と、b)培地または菌株内でO−スクシニルホモセリンを培養する段階、およびc)O−スクシニルホモセリンを分離する段階を含んでなる、O−スクシニルホモセリンの生産方法に関する。
前記で製造されたL−メチオニン前駆体生産菌株の培養は、当業界における公知の適切な培地と培養条件によって行われ得る。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。前記培養方法は、例えば回分式、連続式および流加式培養を含むが、これに限定されない。このような様々な培養方法は、例えば、文献「"Biochemical Engineering"by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.」に開示されている。
また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸および硫酸などの化合物を適切な方式で添加することにより、培養物のpHを調整することができる。また、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することにより培養する間に気泡の生成を抑えることができる。また、培養液の好気性条件を保つために、培養液内に酸素または酸素含有ガス(例えば、空気)が注入できる。培養物の温度は一般に20〜45℃、好ましくは25〜40℃である。培養の期間はL−メチオニン前駆体の生産が所望の水準に到達するまで続くことができ、好ましい培養時間は10〜160時間である。
実施例1:メチオニン前駆体生産菌株の製造
<1−1>metB遺伝子の欠損
E.coli菌株においてシスタチオニンシンターゼをコードするmetB遺伝子を欠損させるために、FRT−one−step PCR deletion方法を行った(PNAS(2000)vol97:P6640〜6645)。配列番号1および配列番号2のプライマーを用いてpKD3ベクター(PNAS(2000)vol97:P6640〜6645)を鋳型としてPCR反応によって欠損カセットを構成した。PCRは、94℃で30秒の変性過程(denaturation)、55℃で30秒のアニーリング過程(annealing)および72℃で1分の伸長過程を1サイクルとして、これを30サイクル繰り返すことにより行った。
ホモセリンキナーゼをコードする遺伝子としてのthrB遺伝子を欠損させることにより、ホモセリンからO−スクシニルホモセリンの合成量を増加させようとした。特にトレオニン生産菌株を用いる場合、ホモセリンの利用活性が非常に大きいため、この遺伝子の欠損が必ず必要である。前記製作されたW3−B菌株からthrB遺伝子を欠損させるために、metB遺伝子欠損時と同一のFRT one step PCR deletion方法を使用した。
thrB欠損カセットを製作するために、pKD4ベクター(PNAS(2000)vol197:P6640〜6645)を鋳型として、配列番号3、4のプライマーを用いて、94℃で30秒の変性段階、55℃で30秒のアニーリング段階および72℃で1分の延長段階を1サイクルとして、これを30サイクル繰り返すPCR反応を行った。
その結果として得られたPCR産物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、1.6kbpサイズのバンドからDNAを精製した。回収されたDNA断片をpKD46ベクターで予め形質転換させたW3−B菌株にエレクトロポレーションした。回収された菌株を、50μg/Lのカナマイシンを含んだLB平板培地に塗抹し、37℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
メチオニン前駆体の合成に関与するmetA遺伝子の調節遺伝子であるmetJ遺伝子を欠損させるために、metB遺伝子欠損時と同一のFRT one step PCR deletion方法を使用した。metJ遺伝子欠損カセットを製作するために、配列番号5、6のプライマーを用いて、94℃で30秒の変性(denaturation)段階、55℃で30秒のアニーリング(annealing)段階および72℃で1分の延長(extension)段階を1サイクルとして、これを30サイクル繰り返し行った。
その結果として得られたPCR産物を1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、1.2kbpサイズのバンドからDNAを精製した。回収されたDNA断片をpKD46ベクターで予め形質転換させたW3−BT菌株にエレクトロポレーションした。回収された菌株を、クロラムフェニコールを含んだLB平板培地に塗抹して37℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
選別された菌株を直接鋳型として配列番号7、8のプライマーを用いて同一の条件でPCRした後、1.0%アガロースゲル上で遺伝子のサイズが1.6Kbに変化することを確認することにより、metJ遺伝子の欠損を確認した。確認された菌株はさらにpCP20ベクターで形質転換してLB培地で培養し、さらに同一条件のPCRによって1.0%アガロースゲル上で遺伝子のサイズが600bpに小さくなった最終metJ遺伝子欠損菌株を製作し、クロラムフェニコールマーカーが除去されたことを確認した。製作された菌株をW3−BTJと命名した。
染色体にフィードバック抵抗性metA遺伝子を導入するために、W3−BTJ菌株の染色体上で本来のmetA遺伝子を欠損させた。metA遺伝子を除去するために、FRT one step PCR deletion方法を行った。
metA遺伝子欠損カセットを製作するために、配列番号9、10のプライマーを用いて、94℃で30秒の変性段階、55℃で30秒のアニーリング段階および72℃で1分の延長段階を1サイクルとして、これを30サイクル繰り返し行った。
その結果として得られたPCR産物は、1.0%アガロースゲルで電気泳動した後、1.2kbpサイズのバンドからDNAを精製した。回収されたDNA断片をpKD46ベクターで予め形質転換させたW3−BT菌株にエレクトロポレーションした。回収された菌株を、クロラムフェニコールを含んだLB平板培地に塗抹して37℃で一晩培養した後、耐性を示す菌株を選別した。
L−メチオニン前駆体であるO−スクシニルホモセリンの生産を増加させるために、ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼをコードするフィードバック抵抗性metA遺伝子を過発現させた。
フィードバック抵抗性metA10遺伝子は配列番号17に示されており、これをコードするアミノ酸配列は配列番号18に示されている。metA11遺伝子は配列番号19に示されており、これをコードするアミノ酸配列は配列番号20に示されている。metA32遺伝子は配列番号13に示されており、これをコードするアミノ酸配列は配列番号14に示されている。metA37遺伝子は配列番号15に示されており、これをコードするアミノ酸配列は配列番号16に示されている。metA41遺伝子は配列番号21に示されており、これをコードするアミノ酸配列は配列番号22に示されている(PCT/US2007/009146)。
PCRは、前記遺伝子を鋳型として配列番号11、12をプライマーとして用いて、94℃で30秒の変性段階、55℃で30秒のアニーリング段階および72℃で2分のアニーリング段階を1サイクルとして、これを25サイクル繰り返すことにより行った。
その結果として得られたPCR産物を1%アガロースゲルで電気泳動した後、1.2kbpサイズのバンドからDNAを精製した。回収されたDNA断片を制限酵素SmaIdmで切断されたpCL1920ベクターに連結した。連結されたベクターでE.coliを形質転換させ、50μg/Lのスペクチノマイシンが含まれたLB培地で培養した後、選別した。製造されたベクターの構成を図3に示した。
まず、pKD3ベクターを使用し、クロラムフェニコールマーカー遺伝子を鋳型として配列番号23、24のプライマーを用いてPCR増幅した。PCR断片はゲル−抽出によって精製した。metA遺伝子は配列番号9、10をプライマーとしてPCR増幅し、metA遺伝子の3’−UTR地域は鋳型としてW3110wt染色体を使用して配列番号25、26をプライマーとしてPCR増幅した。その結果として得られたPCR産物はゲル−抽出によって分離し、断片の混合物は配列番号9、26をプライマーとしてPCR増幅することにより、クロラムフェニコール標識を含んだmetA遺伝子断片を製造した。回収されたDNA断片を、pKD4ベクターで形質転換されたW3BTJA菌株にエレクトロポレーションし、クロラムフェニルコール抵抗性菌株を選別し、配列番号9、10のプライマーを用いて、metAが成功的にクローニングされたことを確認した。変形されたmetA遺伝子10、11および32が導入されたものと確認された菌株は、それぞれW3BTJ−A10、11および32と命名した。各菌株のO−スクシニルホモセリン生産量は各metAプラスミドを含有しているW3−BTJAの生産量と同様であった。
O−スクシニルホモセリンの生産をさらに効果的に増加させるために、thrA遺伝子を過発現させた。
このために、L−トレオニン生産菌株であるE.coli CJM002(KCCM10568)の染色体を鋳型として配列番号27、28のプライマーを用いてPCR増幅した。増幅されたDNA断片は、ゲル−抽出によって分離し、制限酵素EcoRVを用いてpCL1920ベクターのCJ1プロモーターに連結し、スペクチノマイシン(spectinomycin)を50μg/L含有するLB培地で選別した。選別されたベクターはpCJ−thrA(M)−CLと命名した。thrA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、配列番号29に示され、アミノ酸位置345に突然変異を持っている。また、E.coli W3110菌株の野生型thrA遺伝子は、前述した方法と同様の方法でPCR増幅し、pCJ−thrA−CLと命名したベクターにクローニングした。このベクターはそれぞれW3BTJ−A11でエレクトロポレーションし、各菌株のO−スクシニルホモセリン生産量を実施例2−1で説明されたフラスコ培養で検定した。その結果、突然変異形態のthrA遺伝子を持つベクターで形質転換された菌株は最も高い水準でO−スクシニルホモセリンを蓄積した。
メチオニン要求性が解除されたL−トレオニン生産菌株である大腸菌CJM002(KCCM−10568号)を用いて、前記1−1〜1−5と同様の方法でO−スクシニルホモセリン生産菌株を製作した。染色体上に突然変異metA遺伝子を含有する菌株をそれぞれCJM−A10、CJM−A11およびCJM−A32と命名した。また、PCT/KR2005/00344に記載されたL−トレオニン生産菌株である大腸菌FTR2533(KCCM10541)を用いて、前記1−1〜1−5と同様の方法でメチオニン前駆体生産菌株を製作し、これをCJM−A11と命名した。また、それぞれの菌株は実施例1−6に説明されたようにthrA発現ベクターで形質転換させた。実施例2−1に記載されたフラスコ培養によってこれら菌株のメチオニン前駆体生産量を測定した。その結果、pCJ―thrA(m)−CLプラスミドを含有するCJM−A11は最も高いO−スクシニルホモセリンの生産を示した。
<2−1>フラスコ培養実験
実施例1で製作された菌株のメチオニン前駆体生産量を実験するために、三角フラスコ培養を行った。平板LB培地に各菌株を接種して31℃で一晩培養した。単一コロニーを3mLのLB培地に接種した後、31℃で5時間培養し、さらに25mLのメチオニン前駆体生産培地を含んだ250mLの三角フラスコに200倍希釈して31℃の200rpmで64時間培養し、HPLC分析によってメチオニン前駆体生産量を比較した。その結果、メチオニン生産能力はメチオニン要求性に対して自由なL−メチオニン生産菌株から製造されたメチオニン前駆体生産菌株において著しい増加を示した。
O−スクシニルホモセリンを大量生産するために、O−スクシニルホモセリン生産能力を示す幾つかの菌株を選択して5Lの発酵槽で培養した。それぞれの菌株を、抗生剤スペクチノマイシンの含有された平板LB培地に接種して31℃で一晩培養した。その後、単一コロニーを、スペクチノマイシンを含有するLB培地10mLに接種した後、31℃で5時間培養した。培養液は、200mLのメチオニン前駆体シード培地を含有する1000mLの三角フラスコに100倍希釈して31℃、200rpmで3〜10時間培養した後、5Lの発酵槽に接種して流加式(Fed batch)培養発酵法で20〜100時間培養した。このように培養した発酵液でメチオニン前駆体の濃度をHPLCで分析した結果は、表7のとおりであった。
Claims (12)
- 1)ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ活性(EC2.3.1.46)が増強され、前記ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ活性はメチオニンによるフィードバック阻害に対する抵抗性を有し、前記ホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼが配列番号14、16、18、20又は22のアミノ酸配列を有し;2)配列番号29により表わされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの発現により、アスパルトキナーゼまたはホモセリンデヒドロゲナーゼ活性(EC2.7.2.4または1.1.1.3)が増強されており;3)シスタチオニンガンマシンターゼが弱化または不活性化されていることを特徴とする、O−スクシニルホモセリンを生産することが可能なエシェリキア属(Escherichia sp.)由来菌株。
- 前記菌株は、L−トレオニン、L−イソロイシンまたはL−リシン生産菌株に由来する、請求項1に記載の菌株。
- 前記菌株は大腸菌(Escherichia coli.)である、請求項1に記載の菌株。
- 前記菌株は、O−スクシニルホモセリンスルフヒドリルリアーゼまたはO−アセチルホモセリンスルフヒドリルリアーゼが弱化または不活性化されている、請求項1に記載の菌株。
- 前記菌株はホモセリンキナーゼが弱化または不活性化されている、請求項1に記載の菌株。
- 前記菌株は、本来のホモセリンO−アセチルトランスフェラーゼ活性または本来のホモセリンO−スクシニルトランスフェラーゼ活性が弱化または不活性化されている、請求項1に記載の菌株。
- 前記菌株は、シスタチオニンガンマシンターゼをコードするmetB遺伝子、ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子、およびmetA遺伝子の転写調節因子であるmetJ遺伝子が弱化または不活性化されている、請求項1に記載の菌株。
- 前記微生物が、トレオニン生産菌株である大腸菌MF001(Escherichia coli MF001、寄託番号KCCM10568)に由来する、請求項1に記載の菌株。
- 前記微生物が、トレオニン生産菌株である大腸菌FTR2533(Escherichia coli FTR2533、寄託番号KCCM10541)に由来する、請求項1に記載の菌株。
- 前記微生物が、O−スクシニルホモセリン(O-succinylhomoserine) 生産菌株である大腸菌CJM−A11(pthrA(M)−CL)(Escherichia coli CJM−A11(pthrA(M)−CL))(KCCM 10922P)である請求項1に記載の菌株。
- 前記微生物が、O−スクシニルホモセリン(O-succinylhomoserine) 生産菌株である大腸菌CJM2−A11(pthrA(M)−CL)(Escherichia coli CJM2−A11(pthrA(M)−CL))(KCCM 10924P)である請求項1に記載の菌株。
- 1)請求項1〜11のいずれか1項記載の菌株を発酵させる段階と、2)培地または菌株内でO−スクシニルホモセリンを生産する段階と、3)生産されたO−スクシニルホモセリンを分離する段階とを含む、O−スクシニルホモセリンの生産方法。
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