BRPI0712399A2 - microorganismo produtor de precursor de l-metionina e método de produzir l-metionina e ácido orgánico a partir de precursor de l-metionina - Google Patents

Abstract

MICROORGANISMO PRODUTOR DE PRECURSOR DE L-METIONINA E MéTODO DE PRODUZIR L-METIONINA E áCIDO ORGáNICO A PARTIR DO PRECURSOR DE L-METIONINA. A presente invenção refere-se a um método para produzir L-metionina e ácido orgânico que compreende as seguintes etapas: Etapa 1) preparar uma cepa produtora de precursor de L-metionina e produzir precursor de L-metionina pela fermentação da cepa; Etapa 2) produzir L-metionia e ácido orgânico pelo processo de reação da enzima com o precursor de L-metionina como um substrato, e cepas de microorganismos usadas em cada etapa.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MICROOR- GANISMO PRODUTOR DE PRECURSOR DE L-METIONINA E MÉTODO DE PRODUZIR L-METIONINA E ÁCIDO ORGÂNICO A PARTIR DO PRE- CURSOR DE L-METIONINA".

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a um método para produzir L-metionina e ácido orgânico. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um método para produzir L-metionina e ácido orgânico com alto rendimento pela reação enzimática de conversão a partir do precursor de L-metionina produzido pela fermentação da cepa produtora de precursor de L-metionina preparada de acordo com a presente invenção. O método da presente invenção para produzir L-metionina é mais pró-ambiental do que o método convencional e permite a produção seletiva de L-metionina para usar L-metionina em vários campos da indústria como rações, aditivos alimenta- res e como uma matéria-prima para suprimentos médicos e fármacos, etc. Antecedente da Técnica

A metionina é um dos aminoácidos essenciais do corpo humano, a qual tem sido amplamente usada como aditivo de ração e alimentos e u- sada adicionalmente como uma matéria-prima sintética para soluções médi- cas e suprimentos médicos. A metionina age como um precursor de tais compostos como colina (Iecitina) e creatina e é usada ao mesmo tempo co- mo uma matéria-prima sintética para cisteína e taurina. A metionina pode também fornecer enxofre. A S-adenosil-metionina é derivada da L-metionina e desempenha um determinado papel em fornecer o grupo metila no corpo humano e também está envolvida na síntese de vários neurotransmissores no cérebro. A metionina e/ou S-adenosil-L-metionina (SAM) inibem o acúmu- lo de gordura no fígado e artérias e alivia a depressão, inflamação, doença hepática, e dor muscular, etc.

As funções in vivo da metionina e/ou da S-adenosil-L-metionina conhecidas até o momento são como se segue.

.1) Ela inibe o acúmulo de gordura no fígado e nas artérias pro- movendo o metabolismo lipídico e melhora a circulação sangüínea no cérebro, coração e rim (J Hepatol. Jeon BR et ai, 2001 mar.; 34(3): 395- .401).

2) Ela promove a digestão, detoxicação e excreção de substân- cias tóxicas e a excreção de metais pesados tais como o Pb.

3) Ela pode ser administrada como um agente antidepressão na dosagem de 800 a 1.600 mg/dia (Am J Clin Nutr. Mischoulon D. et ai, 2002 nov.; 76 (5): 1158S-61S).

4) Ela realça as funções do fígado (FASEB J. Mato JM., 2002 jan.; 16 (1): 15-26) e é particularmente eficaz na doença hepática causada pelo álcool (Cochrane Database Syst Rev., Rambaldi A., 2001; (4): CD002235).

5) Ela tem efeito antiinflamatório em doenças do osso e articula- ções e promove a recuperação de articulações (ACP J Club. Sander O., .2003 Jan-Fev; 138(1): 21, J Fam Pract, Soeken KL et ai, 2002 Maio; 51(5): .425-30).

6) É um nutriente essencial para o cabelo. Fornece nutrição ao cabelo e impede desse modo a queda de cabelo (Audiol Neurootol., Lock- wood DS et ai, 2000 Set.-Out.; 5 (5): 263 - 266).

A metionina pode ser sintetizada quimicamente ou biologicamen- te para ser aplicada a rações, alimentos, e medicamentos.

Na síntese química, a metionina é produzida na maior parte pela hidrólise de 5-(P-metilmercaptoetil)-hidantoína. A metionina sintetizada qui- micamente tem uma desvantagem de ser produzida apenas como uma for- ma mista do tipo-L e do tipo-D.

Na síntese biológica, a metionina é produzida por um método que usa proteínas envolvidas na síntese de metionina. A L-metionina é bios- sintetizada a partir de homosserina pela ação de enzimas expressas por ge- nes tais como metA, metB, metC, metE e metH. Particularmente, metA é o gene que codifica homosserina O-succinil transferase que é a primeira enzi- ma necessária para a biossíntese de metionina, e ela converte homosserina em O-succinil-L-homosserina. A O-succinil-homosserina Iiase ou cistationina gama sintase codificada pelo gene metB converte O-succinil-L-homosserina em cistationina. A cistationina beta Iiase codificada pelo gene metC converte cistationina em L-homocisteína. MetE codifica metionina sintase independen- te de cobalamina e metH codifica metionina sintase dependente de cobala- mina, ambas as quais convertem L-homocisteína em L-metionina. Neste momento, uma 5,10-metilenotetraidrofolato redutase codificada por metF e serina hidroximetitransferase codificada por glyA trabalham juntas para sinte- tizar N(5)-metiltetraidrofolato fornecendo o grupo metila necessário para a síntese de L-metionina.

A L-metionina é sintetizada por uma série de reações orgânicas pelas enzimas acima. A modificação genética nas proteínas acima ou em outras proteínas que afetam as proteínas acima pode resultar na regulação da síntese de L-metionina. Por exemplo, a Publicação de Patente Japonesa em aberto Nq 2000/139471 descreve um método de produzir L-metionina com a Escherichia sp. na qual os genes thrBC e metJ no genoma são dele- tados, metBL é superexpresso e metK é substituído por um mutante "leaky". Também, a publicação de patente US US2003/0092026 A1 descreve um método que usa um microorganismo knock-out para metD (inibidor da sínte- se de L-metionina) que pertence a Corynerbacterium sp. A publicação de patente US Nq US2002/0049305 descreve um método para aumentar a pro- dução de L-metionina pelo aumento da expressão de uma 5,10 metilenote- traidrofolato redutase (metF).

A patente US Ne US2005/0054060A1 descreve o método de preparar um microorganismo produtor de L-metionina usando mutante de cistationina sintase (O-succinil-homosserina liase). Este mutante de cistatio- nina sintase pode produzir homocisteína ou metionina diretamente a partir de H2S ou do CH3SH em vez de cisteína. Neste método, a cistationina sinta- se mutante é introduzida diretamente em uma célula e participa do procedi- mento de biossíntese de metionina intracelular. Neste método, a reação de cistationina sintase não é muito eficiente devido ao uso da via de biossíntese de metionina intracelular. Também, a toxicidade elevada de H2S ou CH3SH para as células reduz a eficácia deste método. No presente experimento, descobriu-se também que esta especificidade de substrato da cistationina sintase a CH3SH é muito baixa comparada a succinil-homosserina Iiase deri- vada de Pseudomonas ou de Chromobacterium sp.

De acordo com relatos anteriores, a cistationina sintase tende a produzir vários produtos pela reação com vários substratos. A cistationina sintase media a interação entre homocisteína e O-succinil-homosserina para produzir o homolantionina com alta eficiência (J. Bacteriol (2006) vol .188:p609-618). A cistationina sintase em uma célula pode interagir com os vários precursores de metionina e pode produzir vários subprodutos com alta eficácia. Conseqüentemente, a superexpressão de cistationina sintase pode reduzir a eficácia da reação devido à produção mais elevada do subproduto.

A metionina produzida pelo método biológico convencional é o tipo-L, que tem vantagens, mas a quantidade de produção é muito pequena. Isto é porque a via biossintética da metionina tem sistemas de regulação de retroalimentação muito rígidos. Uma vez que a metionina seja sintetizada em um determinado nível, o produto final de metionina inibe a transcrição do gene metA que codifica a proteína primária para iniciação da biossíntese de metionina. A superexpressão do gene metA em si não pode aumentar a pro- dução de metionina porque o gene metA é suprimido pela metionina no es- tágio de transcrição e então degradado pelas proteases intracelulares no estágio de tradução (Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan & Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecu- lar Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443). Portanto, várias patentes anterio- res focaram em como livrar o gene metA de seu sistema regulatório de re- troalimentação (W02005/108561, W01403813). Quando a metionina for produzida no sistema biológico, a metio- nina produzida estará convertida para S-adenosilmetionina pela S- adenosilmetionina sintase na via de degradação da metionina. A S- adenosilmetionina sintase não pode ser deletada porque a adenosilmetioni- na é uma substância essencial nas células. De acordo com as patentes an- teriores, o gene que codifica a S-adenosilmetionina sintase foi mutado para ter atividade baixa para aumentar a produção de metionina (W02005/108561). Descrição da Invenção

O método convencional de biossíntese de metionina usa a via do metabolismo de cistationina sintase para produzir metionina, então o proces- so da reação enzimática é ineficiente devido à toxicidade do sulfeto e à ge- ração de subprodutos. Além disso, a regulação de retroalimentação na via de síntese de metionina inibe a produção em massa de metionina.

É um objeto da presente invenção fornecer um método alternati- vo de produzir L-metionina para superar os problemas do método conven- cional acima. O método alternativo é composto de um processo em duas etapas nas quais o precursor de L-metionina é produzido por fermentação e o precursor de L-metionina é convertido em L-metionina por enzimas.

É outro objeto da presente invenção fornecer um método para produzir L-metionina seletivamente.

Adicionalmente é um objetivo da presente invenção fornecer um método para produzir simultaneamente ácido orgânico como um subproduto sem um processo adicional.

A presente invenção será descrita em detalhes a seguir.

Para atingir o objetivo da invenção, a presente invenção fornece um método para produzir L-metionina que compreende as etapas de 1) pre- parar a cepa produtora do precursor de L-metionina e produzir o precursor de L-metionina pela fermentação da cepa, e 2) produzir L-metionina e ácido orgânico pela reação da enzima com o precursor de L-metionina.

Particularmente, no processo na etapa 1), uma cepa produtora de precursor de L-metionina é gerada e fermentada para a acumulação do precursor de L-metionina nos meios de cultura. Neste momento, a cepa para a produção do precursor de L-metionina é preparada pelo método da inven- ção projetada pelos inventores, então esta invenção também inclui no seu escopo a cepa e o método para gerar a cepa.

O precursor de L-metionina aqui contido é representado por um grupo O-acil-homosserina composto da seguinte fórmula; [Fórmula 1]

<formula>formula see original document page 7</formula>

em que

R é uma substância que inclui C, Η, O, N e outros compostos com 15 moléculas de carbono no máximo. Por exemplo, o grupo O-acil- homosserina inclui, mas não é limitado a, O-acetil-homosserina, O-succinil- homosserina, propionil-homosserina, acetoacetil-homosserina, coumaroil- homosserina, malonil-homosserina, hidroximetilglutaril-homosserina e pime- lil-homosserina.

O precursor de L-metionina da presente invenção é preferivel- mente O-acetil- homosserina ou O-succinil-homosserina.

A "cepa produtora de precursor de L-metionina" conforme usado aqui refere-se a uma cepa de microorganismo procariótico ou eucariótico que é capaz de acumular o precursor de L-metionina por manipulação de acordo com a presente invenção. Por exemplo, a cepa pode ser selecionada do grupo que consiste nos microorganismos de Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacteria sp., Pseudomonas sp., Leptos- pira sp., SaImoneIiarsp., Brevibacteria sp., Hypomononas sp., Chromobaete- rium sp. e Noreardia sp. ou fungos ou leveduras. Preferivelmente, os micro- organismos de Pseudomonas sp., Noreardia sp. e Eseheriehia sp podem ser usados para produzir O-succinil-homosserina, e os microorganismos de Es- eheriehia sp., e Corynebaeterium sp., Reptospira sp. e leveduras podem ser usados para produzir O-acetil-homosserina. Mais preferivelmente, os micro- organismos de Eseheriehia sp. podem ser usados, e o mais preferivelmente Eseheriehia eoli (referida daqui em diante como "E. eolí') pode ser usada. Além disso, genes estranhos podem ser introduzidos mo microorganismo de Eseheriehia sp. para produzir seletivamente O-succinil-homosserina e O- acetil-homosserina.

A presente invenção fornece uma cepa produtora de precursor de L-metionina na qual os genes envolvidos na degradação de O-succinil- homosserina ou de O-acetil-homosserina são deletados ou enfraquecidos. A presente invenção fornece também uma cepa produtora de precursor de L- metionina na qual os genes envolvidos na síntese de O-succinil-homosserina ou de O-acetil-homosserina são introduzidos ou intensificados= A presente invenção também fornece seletivamente uma cepa na qual a via de biossín- tese de treonina é bloqueada ou enfraquecida para aumentar a produção de O-succinil-homosserina ou a O-acetil-homosserina. A presente invenção for- nece adicionalmente uma cepa na qual os genes que estão livres do sistema regulatório de retroalimentação e que codificam as proteínas envolvidas na síntese de O-succinil-homosserina ou de O-acetil- homosserina são introdu- zidos, superexpressos ou tem a atividade intensificada.

Mais particularmente, a presente invenção fornece uma cepa produtora de precursor de L-metionina por deletar o gene metB envolvido na degradação do precursor de L-metionina, o gene thrB envolvido na via de biossíntese de treonina e o gene metJ que reprime a transcrição do gene de síntese do precursor de L-metionina e por intensificar a expressão do gene metA ou metX envolvido na biossíntese do precursor de L-metionina ou in- troduzir o gene metA ou metX livre do sistema regulatório de retroalimenta- ção; ou suprimir por "knocking-out" do gene metA e ao invés disso introduzir o gene metX; ou deletar o gene metX e ao invés disso produzir o gene metA.

Na presente invenção, uma delação do gene pode ser executa- da por cortar uma região do gene ou modificar a seqüência da proteína por introduzir uma seqüência de DNA específica no cromossomo. O enfraqueci- mento do gene pode ser executado reduzir a atividade da proteína por intro- duzir a mutação na região ORF do gene-alvo ou por reduzir a expressão da proteína pela modificação de uma região promotora ou da seqüência de nu- cleotídeo de 5'- UTR do gene.

Na presente invenção, o aumento da expressão da proteína po- de ser realizado pela modificação da região do promotor do gene ou da se- qüência de nucleotídeo da região 5'-UTR, e o aumento da atividade da pro- teína pode ser realizado por introduzir a mutação na região ORF do gene- alvo, e o aumento da expressão da proteína também pode ser realizado pela introdução da cópia extra do gene-alvo no final do cromossomo ou pela in- trodução do vetor que carrega o gene-alvo com o autopromotor ou aumenta- do outro promotor na cepa.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, o método para preparar uma cepa produtora de precursor de L-metionina é como se segue:

Na etapa 1, um gene que codifica tais proteínas como cistationi- na gama sintase, O-succinil-homosserina sulfidrilase ou O-acetil- homosserina sulfidrilase são deletados ou enfraquecidos em uma cepa a fim acumular o precursor do L-metionina tal como O-succinil-homosserina ou O- acetil-homosserina.

O gene que codifica cistationina gama sintase é indicado como metB, o gene que codifica O-succinil-homosserina sulfidrilase é indicado como metZ, e o gene que codifica O-acetil-homosserina sulfidrilase é indica- do como metY. Um gene que codifica uma proteína que tem a atividade mencionada acima é exemplificado por metB o que é conhecido em E. coli. A seqüência genômica do gene pode ser obtida a partir da seqüência genô- mica de E. coli (Acesso Ns AAC75876) informado no relato anterior (Blattner et. ai, Science 277:1453 - 1462 (1997)). A seqüência genômica do gene também pode ser obtida de NCBI (National Center for Biotechnology Infor- mation) e DDBJ (DNA Data Bank Japan). Outros genes que têm a atividade acima são exemplificados por metB e por metY derivados de Corynebacteri- um, e metZ derivado de Pseudomonas. A cistationina gama sintase ou O-succinil-homosserina sulfidrilase ou O-acetil-homosserina sulfidrilase têm a atividade de converter O-succinil- homosserina ou O-acetil-homosserina em cistationina ou homocisteína como mostrado nas seguintes fórmulas de reação. Portanto, a cepa na qual os genes que têm estas atividades são deletados ou enfraquecidos, mostra o acúmulo de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina na solução de cultura.

L-cisteína + O-succinil-L-homosserina <=> succinato + cistatio- nina L-cisteína + O-acetil-L-homosserina <=> acetato + cistationina HS + O-succinil-L-homosserina <=> succinato + homocisteína HS " + O-acetil-L-homosserina <=> acetato + homocisteína Na etapa 2, o gene thrB que codifica homosserina quinase na cepa preparada na etapa 1 é deletado ou enfraquecido. O gene thrB está envolvido na síntese de O- fosfoomosserina a partir de homosserina, a qual é convertida então em treonina pelo gene thrC. O gene thrB é deletado ou enfraquecido para usar toda a homosserina produzida para a síntese do pre- cursor de metionina.

Na etapa 3, o gene metJ, o regulador da transcrição do gene metA, é deletado ou enfraquecido. O gene metA, envolvido na síntese do precursor de metionina, é regulado pelo sistema regulatório de retroalimen- tação de metionina e o gene metJ é um repressor envolvido na transcrição do gene metA. Para superexpressar o gene metA constitutivamente e ativar a síntese do precursor de metionina, a eliminação do repressor da transcri- ção do gene metA é benéfica. Portanto, o gene metJ é eliminado em E. coli e a expressão do gene metA é aumentada, o que pode levar à produção em massa de precursor de L-metionina.

As etapas 2 e 3 acima podem ser modificadas de acordo com uma cepa produtora de precursor e podem não ser necessárias para a cepa produtora de precursor. Entretanto, isso pode ser mais preferivelmente exe- cutado para aumentar a via de produção do precursor no microorganismo de Escherichia sp.

Na etapa 4, a expressão do gene metA ou metX que codificam homosserina O-succinil transferase ou homosserina O-acetil transferase que é a enzima que media o primeiro estágio da via de biossíntese de metionina é aumentada para promover a síntese do precursor de metionina. Gene me- tA é o termo geral para o gene que codifica homosserina O-succinil transfe- rase, e gene metX é o termo geral para o gene que codifica homosserina O- acetil transferase. Para aumentar a expressão do gene metA ou metX, uma cópia adicional do gene pode ser introduzida ou 5'- UTR ou um promotor pode ser modificado ou a ORF de cada gene pode ser mutada. O aumento da expressão deste gene resulta no aumento significativo da síntese do pre- cursor de L-metionina.

Se a metionina for considerada necessária para o crescimento de uma cepa, o gene metA ou metX livre da regulação de retroalimentação pode ser introduzido. Neste caso, o precursor de L-metionina pode ser sinte- tizado independentemente do conteúdo de metionina no meio e assim a adi- ção de metionina ao meio facilita a síntese do precursor de L-metionina e o crescimento das células.

Para aumentar a produção de O-acetil-homosserina a partir da cepa produtora de O-succinil-homosserina, o gene metA que codifica ho- mosserina O-succinil transferase existente no cromossomo pode ser deleta- do. Quando a produção de O-succinil-homosserina for inibida pela deleção do gene metA e O-acetil-homosserina for produzida por introduzir adicional- mente o gene metX, O-acetil-homosserina poderá ser produzida com maior rendimento comparando com o caso de introduzir o gene metX na presença do gene metA.

Também é possível aumentar a produção de O-succinil- homosserina na cepa produtora de O-acetil-homosserina por deletar o gene metX que codifica homosserina O-acetil transferase existente no cromosso- mo da cepa. Quando a produção de O-acetil-homosserina for inibida pela deleção do gene metX e O-succinil-homosserina é produzida por introduzir adicionalmente o gene metA, O-succinil-homosserina poderá ser produzida com maior rendimento.

O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, precursor de L-metionina, podem ser acumulados em uma cepa aproveitando-se de uma parte ou de todo o processo da etapa 1 a etapa 4 acima.

A cepa produtora de precursor de L-metionina pode ser prepa- rada a partir da cepa que produz L-lisina, L-treonina ou L-isoleucina. Preferi- velmente, ela pode ser preparada por usar cepa produtora de L-treonina. Com esta cepa, a síntese de homosserina já é mais alta e a produção do precursor de metionina pode ser conseqüentemente aumentada. Assim, o precursor de metionina pode ser acumulado por deletar ou enfraquecer um gene envolvido na via de biossíntese de treonina e então o gene metA ou metY ou MetZ1 usando a cepa produtora de L-treonina. É mais preferido de- Ietar ou enfraquecer primeiro o gene thrB e então o gene metB, metY ou metZ para sintetizar precursor de metionina. Por enquanto, o aumento da expressão do gene metA ou metX resulta no aumento da síntese do precur- sor de metionina.

A "cepa produtora de L-treonina" da invenção refere-se a uma cepa de microorganismo procariótico ou eucariótico que é capaz de produzir L-treonina in vivo. Por exemplo, a cepa pode estar incluída em cepas de mi- croorganismos produtoras de L-treonina que pertencem a Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacterium sp. e Brevibaete- rium sp. Entre estes, o microorganismo Eseheriehia sp. é preferido e Esehe- riehia eolié mais preferido.

A cepa produtora de L-treonina inclui não apenas os microorga- nismos na natureza, mas também seus mutantes que são exemplificados por microorganismos que tem uma exigência parcial (Ieaky) por isoleucina, e é resistente a análogos de L-Iisina e ácido α-aminobutírico; e é mutada por introduzir adicionalmente pelo menos uma cópia extra do gene de fosfoenol piruvato carboxilase (ppc) endógeno; e tem o gene pckA envolvido no pro- cesso de conversão de oxaloacetato (OAA) inativado, o qual é um interme- diário da síntese de L-metionina em fosfoenol piruvato (PEP); e tem o gene tyrR inativado, inibindo a expressão do gene tyrB envolvido na biossíntese de L-metionina; e é tem o gene gaIR inativado inibindo a expressão do gene galP envolvido no transporte de glicose. Os análogos de L-Iisina aqui conti- dos podem ser um ou mais compostos selecionados do grupo que consiste em S-(2-aminoetil)-L-cisteína e δ-metila-L-lisina.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, CJM002, a cepa produtora de L-treonina e independente de L-metionina mutadas de TF4076 (KFCC 10718, patente Coreana Ns 92-8365), a cepa de E. eoli mu- tante produtora de L-treonina, foi usada. TF4076 tem uma necessidade por metionina, e é resistente a análogos de metionina (por exemplo, ácido a- amino-p-hidroxivalérico, AHV), análogos de Iisina (por exemplo, S-(2- aminoetil)-L-cisteína, AEC), e análogos de isoleucina (por exemplo, ácido a- aminobutílico). A informação geral contida na Patente Coreana acima pode ser incluída no escopo da presente invenção pelas reivindicações. TF4076 não é capaz de sintetizar metionina in vivo porque é a cepa que tem neces- sidade de metionina. Para usar esta cepa como a cepa produtora de metio- nina da invenção por liberá-la da necessidade de metionina, os presentes inventores prepararam a cepa produtora de L-treonina E. coli CJM002 livre da necessidade de metionina por mutação artificial usando NTG. A E. coli CJM002 foi nomeada como Escherichia coli MF001 e depositada em KCCM (Korean Culture Center of Microorganism, Eulim Buld., Hongje-1-Dong, Seo- daemun-Ku, Seoul, 361-221, Coréia) em 9 de abril, 2004 (N- de Acesso: KCCM-10568). A Escherichia coli CJM-BTJ produtora de O-succinil- homosserina (pMetA-CL) preparada pelo método acima foi depositada tam- bém em 21 de julho de 2006 (Ns de Acesso: KCCM-10767) e a Escherichia coli CJM-BTJ (pCJ-MetA-CL) foi depositada em 5 de julho de 2007 (N2 de Acesso: KCCM-10872). A Escherichia coli CJM-BTJA produtora de O-acetil- homosserina (pCJ-MetX-CL) preparada pelo método da invenção acima tam- bém foi depositada em 5 de julho 2007 (Ns de Acesso: KCCM-10873).

A cultura da cepa produtora de precursor de L-metionina prepa- rada acima pode ser executada por um meio apropriado e condições conhe- cidas daqueles versados na técnica. É bem-compreendido por aqueles ver- sados na técnica que o método de cultura pode ser usado por ajustar facil- mente, de acordo com a cepa selecionada. Por exemplo, o método de cultivo incluindo, mas não-limitado à batelada, cultura contínua e batelada alimen- tada. Vários métodos de cultura estão descritos na seguinte referência: "En- gineering Biochemical" por James M. Lee, Prentice-Hall International Editi- ons, pp 138-176.

O meio tem que satisfazer as condições de cultura para uma cepa específica. Uma variedade de meios de cultura de microorganismo é descrita na seguinte referência: "Manual of Methods for General Bacterio- logy" pela American Society for Bacteriology, Washington D.C, USA, 1981. Estes meios incluem várias fontes de carbono, fontes de nitrogênio e ele- mentos-traço. A fonte de carbono é exemplificada por carboidrato tal como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido, celulose; gordura tal co- mo óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácido graxo tal como ácido palmítico, ácido esteárico, e ácido linoleico; álcool tal como glicerol e etanol; e ácido orgânico tal como ácido acético. Um desses com- postos o uma mistura desses pode ser usado como uma fonte de carbono. A fonte de nitrogênio é exemplificada por uma fonte de nitrogênio orgânica tal como peptona, extrato de levedura, caldo, extrato de malte, água de mace- ração de milho (CSL) e farinha de feijão e uma fonte inorgânica de nitrogênio tal como uréia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, car- bonato de amônio e nitrato de amônio. Um destes compostos, ou uma mistu- ra destes, pode ser usado como uma fonte de nitrogênio. O meio aqui conti- do pode incluir adicionalmente diidrogênio fosfato de potássio, hidrogênio fosfato dipotássico sais que contêm sódio correspondentes como uma fonte de fosfato. O meio também pode incluir um sal de metal tal como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro. Além disso, aminoácidos, vitaminas e precur- sores apropriados também podem ser adicionados. Os meios ou os precur- sores podem ser adicionados à cultura por batelada ou continuamente.

O pH da cultura pode ser ajustado durante o cultivo por adicio- nar da maneira apropriada um composto tal como hidróxido de amônio, hi- dróxido de potássio, amônia, ácido fosfórico e ácido sulfúrico. A geração de bolhas de ar pode ser inibida durante o cultivo pelo uso de um agente anti- espumante tal como éster poliglicólico de ácido graxo. Para manter a condi- ção aeróbica da cultura, o oxigênio ou gás contendo oxigênio (exemplo, ar) pode ser injetado na cultura. A temperatura da cultura é convencionalmente .20 a 45°C, preferivelmente 25 a 40°C. O período de cultivo pode ser conti- nuado até que a produção do precursor de L-metionina alcance um nível desejado, e o tempo preferível de cultivo é 10 a 160 horas.

O processo da etapa 2) inclui o processo para produzir L-metionina e ácido orgânico pela reação enzimática usando uma enzima que tem a atividade de cistationina sintase ou O-succinil-homosserina sulfi- drilase ou O-acetil-homosserina sulfidrilase ou a cepa que contém estas ati- vidades enzimáticas por usar O-succinil-homosserina ou O-acetil- homosserina produzida a partir da cepa produtora do precursor de L-metionina acima e metil mercaptano como um substrato.

Mais particularmente, a presente invenção fornece o método pa- ra produzir L-metionina pela reação enzimática de cistationina sintase ou O-succinil-homosserina sulfidrilase ou O-acetil-homosserina sulfidrilase por usar homosserina, O-fosfoomosserina, O-succinil-homosserina ou O-acetil- homosserina acumulados a partir do método acima como um substrato. É preferido na presente invenção usar O-succinil-homosserina ou O-acetil- homosserina como um substrato.

Na presente invenção, a cistationina gama sintase ou a O-succinil-homosserina sulfidrilase ou a O-acetil-homosserina sulfidrilase podem ser derivadas de Escherichia sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Corynebacterium sp., Saccharomyees sp., Chromobaeterium sp., Noeardia sp., Bradyrhizobium sp., Hyphomonas sp., Methyiococeus sp., Methylobacil- Ius sp., Nitrosomonas sp., Klebsiella sp., Baeillus sp., Shigella sp., Colwellia sp., Salmonella sp., levedura, ou fungos.

No processo da etapa 2), quando O-succinil-homosserina é usada como um precursor de L-metionina, preferivelmente cistationina gama sintase ou O-succinil-homosserina sulfidrilase ou O-acetil-homosserina sulfi- drilase, derivadas de Pseudomonas sp., Noeardia sp. ou Chromobaeterium sp, mais preferivelmente derivadas de Pseudomonas aurogenosa, Noeardia Farciniea, Pseudomonas putida ou Chromobaeterium violaeeum pode ser usadas.

No processo de etapa 2), quando O-acetil-homosserina é usada como um precursor de L-metionina, preferivelmente cistationina gama sinta- se ou O-succinil-homosserina sulfidrilase ou O-acetil-homosserina sulfidrila- se derivadas de Leptospira sp., Chromobaeterium sp., ou Hyphomonas sp., mais preferivelmente derivadas de Leptospira meyeri, Pseudomonas auro- genosa, Hyphomonas Neptunium ou Chromobaeterium Violaeeum.

As reações enzimáticas acima são como mostradas nas seguin- tes fórmulas de reação e as fórmulas estruturais são mostrados em 2. CH3SH + O-succinil-L-homosserina <=> succinato + metionina

CH3SH + O-acetil-L-homosserina <=> acetato +metionina

Nas reações acima, como mostrado nas fórmulas da Figura 2, resíduo CH3S- de metilmercaptano é substituído pelo resíduo de succinato ou de acetato de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina para pro- duzir metionina. O metil mercaptano (CH3SH) pode ser adicionado em dife- rentes formas durante a reação.

A seqüência dos genes que codificam as enzimas que têm a ati- vidade enzimática acima pode ser obtida a partir da base de dados do NCBI, USA, e do banco de dados de DNA (KEGG), Japão.

Para a reação de conversão biológica, um gene é clonado a par- tir da seqüência obtida do gene, o qual é introduzido então em um vetor de expressão. A enzima é expressa na forma ativa a partir de uma cepa recom- binante. Tanto a cepa que expressa a quanto a enzima expressa podem ser usadas diretamente para a reação.

As enzimas expressas a partir dos genes acima ou as cepas mi- crobianas que expressam estas enzimas podem ser misturadas diretamente, parcialmente ou não, com o sobrenadante da fermentação ou com o caldo da fermentação acumulado com precursor de L-metionina para começar a reação. Em uma modalidade preferida da invenção, O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina acumulada na solução de fermentação podem ser convertidas em metionina por cistationina gama sintase ou por O-acetil- homosserina sulfidrilase ou por O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Pseudomonas sp., Chromobacterium sp. , Leptospira sp. ou Hyphomonas sp.

Mais preferivelmente, O-succinil-homosserina acumulada na so- lução de fermentação é convertida em metionina pela cistationina gama sin- tase ou O-acetil-homosserina sulfidrilase ou O-succinil-homosserina sulfidri- lase derivada de Pseudomonas aurogenosa, Pseudomonas putida ou Chro- mobacterium Violaceum.

O-acetil-homosserina acumulada na solução de fermentação é convertida em metionina pela cistationina gama sintase ou O-acetil- homosserina sulfidrilase ou O-succinil-homosserina derivada de Leptospira meyeri, Hyphomonas Neptunium ou Chromobacterium Violaceum.

Cada gene foi expresso no vetor do pCL-CJ1 (CJ, Coréia), o ve- tor de expressão para E. coli, e a proteína expressa foram obtidos a partir da solução enzimática preparada pela Iise da célula usando sonicação. A solu- ção enzimática foi adicionada à solução de fermentação com acúmulo de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, e solução de metilmercap- tano também foi adicionada a isso para começar a reação. A reação foi con- firmada usando DTNB (ácido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzóico, Sigma, USA) e o produto da reação foi analisado por HPLC.

Na presente invenção, os subprodutos tais como ácido succínico ou ácido acético podem ser obtidos adicionalmente, sem um processo de produção separado, pela reação de CH3SH com O-succinil-homosserina e O-acetil-homosserina, respectivamente.

Breve Descrição dos Desenhos

A aplicação das modalidades preferidas da presente invenção é mais bem-compreendida com referência às figuras anexas, nas quais:

Figura 1 é um diagrama que ilustra a manipulação genética da cepa produtora de precursor de metionina. Figura 2 é um diagrama que ilustra estruturas químicas do pro- cesso de 2 etapas para a produção de metionina.

Figura 3 é um diagrama esquemático de pMetA-CL para expres- são do gene metA.

Figura 4 é um diagrama esquemático de pCJ-MetB-CL para ex- pressão do gene metB.

Figura 5 é um gráfico que mostra curvas de reação que ilustram os consumos de O-succinil-homosserina por várias enzimas.

A origem de cada solução enzimática é como se segue. A solu- ção enzimática número 21 é um extrato celular que não contém um gene específico. <table>table see original document page 18</column></row><table>

Figura 6 é um gráfico que mostra as curvas de reação que ilus- tram os consumos de O-acetil-homosserina por várias enzimas. Cada núme- ro é como mostrado na Figura 5. Figura 7 é um diagrama que ilustra a seqüência de aminoácidos de cada enzima usada para a reação de conversão alinhada por "megalign" de DNAestar.

Melhor Maneira de Realizar a Invenção

Modalidades práticas e atualmente preferidas da presente in- venção são ilustrativas como mostrado nos seguintes exemplos.

Entretanto, será apreciado que aqueles versados na técnica, considerando essa descrição, podem fazer modificações e melhorias dentro do espírito e escopo da presente invenção.

Exemplo 1: construção de uma cepa produtora de precursor de metionina <1-1 > Delecão do gene metB Para a deleção do gene metB que codifica a cistationina sintase na cepa de E. coli, foi realizada a deleção por FRT-PCR de uma etapa (PNAS (2000) vol 97: P6640-6645). Iniciadores de SEQ ID N°: 1 e NQ: 2 foram usados para a PCR usando o vetor pKD3 (PNAS (2000) vol 97: P6640-6645) como um molde, resultando na construção de um cassete de deleção. A PCR foi realizada como se segue: 30 ciclos de desnaturação a 94-C por 30 segun- dos, anelamento a 55QC por 30 segundos, extensão a 72SC por 1 minuto.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de aga- rose 1,0%, seguido por purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,2 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi eletroporado em E. coli (K 12) W3110 transformada com vetor pKD46 (PNAS (2000) vol 97: P6640-6645). Antes da eletroporação, W311 transformada com pKD46 foi cultivada a 30°C em meio LB contendo 100 pg/L de ampicilina e de 1-arabinose a 5 mM até que OD6Oo atingisse 0,6. Então, a cepa cultivada foi lavada duas vezes com água destilada esterilizada e mais uma vez com glicerol a 10%. A eletropo- ração foi realizada a 2500 V. A cepa recuperada foi estriada sobre placa de meio LB contendo 25 pg/L de cloranfenicol, seguido pela cultura a 37SC du- rante a noite. Então, a cepa exibindo resistência foi selecionada.

A PCR foi realizada pelo uso da cepa selecionada como um molde com os mesmos iniciadores acima sob as mesmas condições. A dele- ção do gene metB foi identificada pela confirmação do gene de tamanho 1,2 kb em gel de agarose a 1,0%. A cepa foi então transformada com o vetor pCP20 (PNAS (2000) vol 97: P6640-6645) e cultivada em meio LB. A cepa knock-out para metB final foi construída, na qual o tamanho do gene metB foi reduzido para 150 bp em gel de agarose 1,0% por PCR sob as mesmas condições. Foi conformada a eliminação do marcador de cloranfenicol. A cepa construída foi denominada W3-B. <l-2> Delecão do gene thrB

Os inventores tentaram aumentar a síntese de O-succinil- homosserina a partir de homosserina por delação do gene thrB que codifica a homosserina quinase. Particularmente, quando uma cepa produtora de treonina foi usada, a deleção desse gene foi absolutamente necessária por que a atividade de uso de homosserina foi muito acentuada. Para a deleção do gene thrB na cepa W3-B construída acima, a deleção por FRT-PCR de uma etapa foi realizada da maneira descrita acima para a deleção do gene metB.

Para construir o cassete de deleção de thrB, foi realizada PCR usando o vetor pKD4 (PNAS (2000) vol 97: P6640-6645) como um molde com iniciadores de SEQ ID N°:3 e N2: 4 como se segue: 30 ciclos de desna- turação a 94QC por 30 segundos, anelamento a 55QC por 30 segundos, ex- tensão a 72-C por 1 minuto. O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de agarose 1,0%, seguido por purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,6 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi eletroporado na cepa W3-B transformada com vetor pKD46. A cepa recuperada foi estriada em placa com meio LB contendo 50 pg/L de canamicina, seguido por cultura a .379C durante a noite. Então, a cepa que exibiu resistência foi selecionada.

A PCR foi realizada pelo uso da cepa selecionada como um molde com iniciadores de SEQ ID N°:3 e N°:4 sob as mesmas condições acima. A deleção do gene thrB foi identificada por selecionar a cepa cujo tamanho era de 1,6 kb em gel de agarose a 1,0%. A cepa foi então transfor- mada com vetor pCP20 e cultivada em meio LB. A cepa knock-out para thrB final foi construída, na qual o tamanho do gene thrB foi reduzido para 150 kb em gel de agarose a 1,0% por PCR sob as mesmas condições. A eliminação do marcador de canamicina foi confirmada. A cepa construída foi denomina- da W3-BT.

<1-3> Delecão de gene metJ

Para a deleção do gene metJ que é o gene regulador do gene metA envolvido na síntese do precursor de metionina, FRT-PCR de uma e- tapa foi executada da mesma maneira usada para deleção do gene metB. Para construir o cassete de deleção de metJ, PCR foi realizada com iniciadores de SEQ ID N°:5 e N0: 6 como segue: 30 ciclos de desnatu- ração a 94QC por 30 segundos, anelamento a 55QC por 30 segundos, exten- são a 12-0 por 1 minuto.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de aga- rose a 1,0%, seguido por purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,2 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi eletroporado na cepa W3-BT trans- formada com vetor pKD46. A cepa recuperada foi estriada em uma placa com meio LB contendo cloranfenicol, seguido por cultivo a 37-C durante a noite. Então, a cepa que exibiu resistência foi selecionada.

A PCR foi realizada pelo uso da cepa selecionada como um molde com iniciadores de SEQ ID NQ: 7 e NQ: 8 sob as mesmas condições acima. A deleção de metJ foi identificada pela confirmação do gene com ta- manho de 1,6 kb em gel de agarose a 1,0%. A cepa foi então transformada com vetor pCP20 e cultivada em meio LB. A cepa knock-out para metJ final foi construída, na qual o tamanho do gene metJ foi reduzido para 600 kb em gel de agarose a 1,0% por PCR sob as mesmas condições e a eliminação do marcador de cloranfenicol da cepa foi confirmada. A cepa construída foi denominada W3-BTJ. <1-4-1> Superexpressão de gene metA

Para aumentar a síntese de precursor de metionina, o gene me- tA que codifica homosserina O-succinil transferase envolvida na síntese de O-succinil-homosserina, o precursor de metionina, foi superexpresso.

A PCR foi realizada por usar o cromossomo de E. coli w3110 como um molde com iniciadores de SEQ ID Ns: 9 e NQ: 10 como segue: 25 ciclos de desnaturação a 94QC por 30 segundos, anelamento a 55QC por 30 segundos, extensão a 72QC por 2 minutos.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de aga- rose a 1,0%, seguido por purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,2 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi ligado a outro fragmento de DNA obtido pelo vetor pCL1920 por digestão com Smal. E. coli foi transformada com o vetor ligado, a qual foi então cultivada em meio LB contendo 50 pg/L de espectinomicina, seguido por seleção. O vetor construído desse modo foi denominado pMetA-CL. O diagrama esquemático de pMetA-CL é mostrado na Figura 3. A cepa W3-BTJ foi transformada com o dito vetor. A cepa cons- truída foi denominada W3-BTJ/pMetA-CL e o nível aumentado de O-succinil- homosserina nessa foi observado.

Como outro método para aumentar a expressão de gene metA, o gene metA foi ligado ao vetor pCL1920 pelo uso do promotor CJ1 (CJ, Co- réia) e EcoRV. E. coli foi transformada com o vetor ligado, a qual foi então cultivada em meio LB contendo 50 pg/L de espectinomicina, seguido por se- leção. O vetor construído desse modo foi denominado pCJ-MetA-CL. A cepa W3-BTJ foi transformada com o dito vetor. A cepa construída foi denominada W3-BTJ/pCJ-MetA-CL e o nível aumentado de O-succinil-homosserina nes- sa foi observado.

<1-4-2> Superexpressão de gene metX

Para sintetizar O-acetil-homosserina, o gene metX que codifica homosserina O-acetil transferase envolvida na síntese de O-acetil- homosserina, o precursor de metionina, foi superexpresso.

A PCR foi realizada usando o cromossomo de Leptospira meyeri como um molde com iniciadores de SEQ ID N9: 11 e N-: 12 como segue: 25 ciclos de desnaturação a 94eC por 30 segundos, anelamento a 55SC por 30 segundos, extensão a 72SC por 2 minutos.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de aga- rose a 1,0%, seguido por purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,1 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi ligado ao vetor pCL1920 pelo uso do promotor CJ 1e EcoRV. E. coli foi transformada com o vetor ligado, a qual foi então cultivada em meio LB contendo 50 pg/L de espectinomicina, segui- do por seleção. O vetor construído desse modo foi denominado pCJ1- MetXIme-CL. A cepa W3-BTJ foi transformada com o dito vetor. A cepa construída foi denominada W3-BTJ/ pCJ1-MetXIme-CL e o aumento da quantidade de O-succinil-homosserina nela foi observado.

Outro método para superexpressar o gene metX foi feito pela realização de PCR usando o cromossomo de Corynebacterium como molde com iniciadores de SEQ ID N°:68 e N°:69 como segue: 25 ciclos de desnatu- ração a 94QC por 30 segundos, anelamento a 55-C por 30 segundos, exten- são a 729C por 2 minutos.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de aga- rose a 1,0%, seguido por purificação do DNA. O fragmento de DNA recupe- rado foi ligado ao vetor pCL1920 pelo uso do promotor CJ1e EcoRV. E. coli foi transformada com o vetor ligado, a qual foi então cultivada em meio LB contendo 50 pg/L de espectinomicina, seguida por seleção. O vetor constru- ído desse modo foi denominado pCJ1-MetXcgI-CL. A cepa W3-BTJ foi transformada com o dito vetor. A cepa construída foi denominada W3-BTJ/ pCJ1-MetXcgI-CL e o nível aumentado de O-succinil-homosserina nela foi observado.

<1-4-3> Delecão do gene metA

Para aumentar a produção de O-acetil-homosserina, gene metA que codifica homosserina O-succinil transferase foi deletado na cepa W3- BTJ. Baseado na descoberta de que apenas a introdução do gene metX re- sultou no acúmulo de O-succinil-homosserina, esperou-se que a deleção do gene metA resultasse na promoção do acúmulo de O-acetil-homosserina (tabela 3). Para a deleção do gene metA, a deleção por FRT-PCR de uma etapa foi realizada.

Para construir o cassete de deleção de metA, PCR foi realizada com iniciadores de SEQ ID N°:70 e Ns: 71 como segue: 30 ciclos de desna- turação a 94SC por 30 segundos, anelamento a 559C por 30 segundos, ex- tensão a 729C por 1 minuto.

O produto de PCR foi submetido à eletroforese em gel de aga- rose a 1,0%, seguido por purificação do DNA obtido a partir da banda de 1,2 kbp. O fragmento de DNA recuperado foi eletroporado na cepa de E. coli W3-BTJ transformada com o vetor pKD46. A cepa recuperada foi estriada em placa com meio LB contendo cloranfenicol, seguido por cultura a 379C durante a noite. Então, a cepa que exibiu resistência foi selecionada.

A PCR foi realizada pelo uso da cepa selecionada como um molde com iniciadores de SEQ ID Ns: 70 e NQ: 71 sob as mesmas condições acima. A deleção do gene metJ foi identificada pela confirmação do gene com tamanho de 1,1 kb em gel de agarose a 1,0%. A cepa foi então trans- formada com vetor pCP20 e cultivada em meio LB. A cepa knock-out para metA final foi construída, na qual o tamanho do gene metA foi reduzido para .100 kb em gel de agarose a 1,0% por PCR sob as mesmas condições. A eliminação do marcador de cloranfenicol foi confirmada. A cepa construída foi denominada W3-BTJA. A cepa W3-BTJA foi transformada com o vetor pCJ-MeTXIme-CL e a cepa resultante foi denominada W3-BTJA/pCJ-MetX- CL. A cepa foi cultivada da maneira descrita acima e como um resultado não foi observado o acúmulo de O-succinil-homosserina, mas a produção de O-acetil-homosserina estava significativamente aumentada, em aproxima- damente 20%, comparada com W3-BTJ. <1-5> Conversão da cepa produtora de L-treonina

Cepas produtoras do precursor de metionina foram construídas de forma similar a descrita nos exemplos <1-1 > a <1-3> usando E. coli CJM002 (KCCM- 10568), uma cepa produtora de L-treonina livre da neces- sidade de metionina. As cepas construídas foram denominadas CJM-BTJ, CJM-BTJ/pMetA-CL e CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL, respectivamente. Uma cepa knock-out para o gene metA também foi construída de forma similar em <1-4-3> usando a cepa CJM-BTJ e a cepa resultante foi denominada CJM- BTJA.

Exemplo 2: fermentação para produção de precursor de L-metionina <2-1 > Experimento de cultura em frasco

Para investigar a capacidade de produção de precursor de L-metionina da cepa construída no exemplo 1, foi realizada cultura em frasco Erlenmeyer. W3-BTJ, CJM-BTJ e W3-BTJ transformadas com vetor de ex- pressão de metA e metX foram cultivadas em meio de placa LB contendo espectinomicina a 312C durante a noite. Uma colônia isolada foi inoculada em 3 ml de meio LB contendo espectinomicina, seguido por cultura a 319C por 5 horas. A solução de cultura foi diluída 200 vezes em frasco Erlenmeyer contendo 25 ml de meio produtor de precursor de metionina, seguido por cultura a 31QC, 200 rpm por 64 horas. HPLC foi realizado para comparar com a capacidade de produção de precursor de metionina (Tabela 2 e Tabe- la 3). Como um resultado, a capacidade de produção de metionina estava significativamente aumentada na cepa produtora de precursor de metionina preparada a partir da cepa produtora de L-treonina livre da necessidade de metionina. [Tabela 1]

Composição do meio do frasco para produção de precursor de metionina

<table>table see original document page 25</column></row><table>

[Tabela 2]

Produção de precursor de metionina (O-succinil-homosserina) por frasco de cultura

<table>table see original document page 25</column></row><table> [Tabela 31

Produção de precursor de metionina (O-acetil-homosserina) por frasco de cultura

<table>table see original document page 26</column></row><table>

<2-2> Fermentação em larga escala Uma cepa exibindo a maior capacidade de produção de precur- sor de metionina no exemplo 1 foi selecionada para produzir precursor de metionina em massa, a qual foi então cultivada em um fermentador de 5 L. CJM-BTJ/pCJ-metA-CL ou CJM-BTJA/pCJ-metXIme-CL foi inoculada em meio LB contendo espectinomicina, seguido por cultura a 31 qC durante a noite. A seguir, uma colônia isolada foi inoculada em 10 ml de meio LB con- tendo espectinomicina, a qual foi cultivada a 31 sC por 5 horas. A solução de cultura foi diluída 100 vezes em um frasco Erlenmeyer de 1000 ml contendo .200 ml de meio de semeadura de precursor de metionina, seguido por cultu- ra a 310C, 200 rpm por 3 a 10 horas. A solução de cultura foi inoculada em um fermentador de 5 L, seguido por cultura posterior por 50 a 100 horas por fermentação por batelada alimentada. A concentração de precursor de meti- onina na solução fermentada foi medida por HPLC e os resultados são mos- trados na tabela 5. ITabeIa 41

Composição do meio de fermentação para produção de precur- sor de metionina

<table>table see original document page 27</column></row><table>

[Tabela 51

Produção de precursor de metionina em um fermentador <table>table see original document page 27</column></row><table> Exemplo 3: Produção de enzima conversora de metionina <3-1 > Cistationina gama sintase derivada de E. coli

O gene metB que codifica cistationina gama sintase derivada de E. coli, a qual pode ser usada para a conversão de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metionina, foi clona- do.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de E. coli como um molde com iniciadores de SEQ ID NQ: 13 e Ns: 14 como segue; 25 ciclos de desnaturação a 94QC por 30 segundos, anelamento a 559C por 30 se- gundos, extensão a 72SC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ncol/Hindlll e clo- nado no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O vetor resultante foi denominado pCJ-MetB-CL e o diagrama esquemático é mostrado na Figura4. E. coli W3110 foi transformada com o vetor clonado e então cultivada em meio de placa LB contendo 50 pg/L de espectinomicina, seguido por seleção de colônia. A colônia selecionada foi inoculada em 3 ml de meio LB contendo 50 gg/L de espectinomicina, seguido por cultivo a 37-C durante a noite. As células cultivadas foram recuperadas, lavadas com tam- pão fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,5), suspensas em 200 μΙ de tampão fos- fato de potássio e Iisadas por sonicação 5 vezes em intervalos de 30 segun- dos. O Iisado celular foi centrifugado a 12.000 rpm por 10 minutos e o sobre- nadante foi obtido para quantificar o nível total de proteína usando a solução de quantificação de proteína de Bio-Rad (BIO-Rad, USA). A expressão de proteína foi identificada por SDS-PAGE. O sobrenadante obtido do extrato celular foi usado para reação de conversão enzimática. <3-2> O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Pseudomonas sp.

O gene metZ que codifica O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Pseudomonas sp., a qual pode ser usada para a conversão de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metionina, foi clonado. Como microorganismo de Pseudomonas sp., Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas putida foram usados.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de cada cepa co- mo um molde com iniciadores de SEQ ID NQ: 15 e NQ: 16 para Pseudomonas aeruginosa e iniciadores de SEQ ID Ns: 17 e NQ: 18 para Pseudomonas puti- da como segue: 30 ciclos de desnaturação a 94SC por 30 segundos, anela- mento a 55QC por 30 segundos, extensão a 72QC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Pacl e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <1-1 > e usado para a reação de conversão enzimática. <3-3> O-acetil-homosserina sulfidrilase derivada de Pseudomonas sp.

O gene metY que codifica O-acetil-homosserina sulfidrilase, de- rivada de Pseudomonas sp., a qual pode ser usada para a conversão de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Pseudomonas aeruginosa como um molde com iniciadores de SEQ ID NQ: 19 e N9: 20 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 94QC por 30 segundos, anelamento a .55-C por 30 segundos, extensão a 72SC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Pacl e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-4> Cistationina sintase derivada de Corynebacterium glutamicum

O gene metB que codifica cistationina sintase derivada de Cory- nebacterium glutamicum, a qual pode ser usada para a conversão de O- succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Corynebacteri- um glutamicum como um molde com iniciadores de SEQ ID Ns: 21 e N9: 22 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 949C por 30 segundos, anelamen- to a 559C por 30 segundos, extensão a 729C por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ncol/Hindlll e clo- nado no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O sobrenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de manei- ra similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-5> O-acetil-homosserina sulfidrilase derivada de Corvnebacterium gluta- micum

O gene metZ que codifica O-acetil-homosserina sulfidrilase deri- vada de Corynebacterium glutamicum, a qual pode ser usada para a conver- são de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de me- tionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Corynebaeteri- um glutamicum como um molde com iniciadores de SEQ ID NQ: 23 e Ns: 24 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 94SC por 30 segundos, anelamen- to a 55QC por 30 segundos, extensão a 72-C por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-6> O-acetil-homosserina sulfidrilase derivada de Leptospira sp

O gene metY que codifica O-acetil-homosserina sulfidrilase deri- vada de Leptospira meyeri, a qual pode ser usada para a conversão de Ο- succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Leptospira me- yeri como um molde com iniciadores de SEQ ID NQ: 25 e N2: 26 como segue: .30 ciclos de desnaturação a 94-C por 30 segundos, anelamento a 55-C por .30 segundos, extensão a 72QC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-7> O-acetil-homosserina sulfidrilase derivada de Saccharomvces sp

O gene met25 que codifica O-acetil-homosserina sulfidrilase de- rivada de Saccharomyees eerevisiae, a qual pode ser usada para a conver- são de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de me- tionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Saecharomy- ees eerevisiae como um molde com iniciadores de SEQ ID N2: 27 e N2: 28 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 94QC por 30 segundos, anelamen- to a 55SC por 30 segundos, extensão a 72SC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Pacl e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-8> O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Chromobacterium sp

O gene metZ que codifica O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Chromobacterium violaceum, a qual pode ser usada para a con- versão de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Chromobaete- rium violaceum como um molde com iniciadores de SEQ ID NQ: 29 e NQ: 30 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 949C por 30 segundos, anelamen- to a 55-C por 30 segundos, extensão a 729C por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-9> O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Noeardia sp.

O gene metZ que codifica O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Noeardia fareiniea, a qual pode ser usada para a conversão de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Noeardia farei- niea como um molde com iniciadores de SEQ ID Ns: 31 e Ns: 32 como se- gue: 30 ciclos de desnaturação a 94SC por 30 segundos, anelamento a 55SC por 30 segundos, extensão a 72SC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-10> O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Bradvrhizobium sp.

O gene metZ que codifica O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Bradyrhizobium japonicum, a qual pode ser usada para a con- versão de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Bradyrhizobium japonicum como um molde com iniciadores de SEQ ID Ns: 33 e Ns: 34 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 942C por 30 segundos, anelamento a .55QC por 30 segundos, extensão a 72QC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-11> O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Hyphomonas sp.

O gene metZ que codifica O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Hyphomonas neptunium, a qual pode ser usada para a conver- são de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de me- tionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Hyphomonas neptunium como um molde com iniciadores de SEQ ID N2: 35 e Ns: 36 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 949C por 30 segundos, anelamento a .55-C por 30 segundos, extensão a 72QC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com BamHII/Hindlll e clonado no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O sobrenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de ma- neira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conver- são enzimática. <3-12> O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Methvlococcus sp.

O gene metZ que codifica O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Methylococcus eapsulatus, a qual pode ser usada para a con- versão de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Methyloeoceus eapsulatus como um molde com iniciadores de SEQ ID NQ: 37 e Ne: 38 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 94QC por 30 segundos, anelamento a .55SC por 30 segundos, extensão a 72SC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-13> O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Methylobacillus sp.

O gene metZ que codifica O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Methylobacillus flagellatus, a qual pode ser usada para a con- versão de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Methylobacillus flagellatus como um molde com iniciadores de SEQ ID NQ: 39 e N9: 40 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 94QC por 30 segundos, anelamento a .55QC por 30 segundos, extensão a 72SC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clonado no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O sobrena- dante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática. <3-14> O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Nitrosomonas sp.

O gene metZ que codifica O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Nitrosomonas europaea, a qual pode ser usada para a conver- são de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de me- tionina, em metionina, foi clonado. A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Nitrosomonas europaea como um molde com iniciadores de SEQ ID Ns: 41 e NQ: 42 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 94SC por 30 segundos, anelamento a .55QC por 30 segundos, extensão a 72QC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-15> Cistationina sintase derivada de Klesiella sp.

O gene metB que codifica cistationina sintase derivada de Klesi- ella pneumoniae, a qual pode ser usada para a conversão de O-succinil- homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metio- nina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Klesiella pneumoniae como um molde com iniciadores de SEQ ID N2: 43 e Ns: 44 co- mo segue: 30 ciclos de desnaturação a 94QC por 30 segundos, anelamento a .55QC por 30 segundos, extensão a 72eC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clonado no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O sobrena- dante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática. <3-16> Cistationina sintase derivada de Bacillus sp.

O gene metB que codifica cistationina sintase derivada de Baeil- Ius subtilis, a qual pode ser usada para a conversão de O-succinil- homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metio- nina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Bacillus subtilis como um molde com iniciadores de SEQ ID NQ: 45 e Ne: 46 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 94SC por 30 segundos, anelamento a 55QC por 30 segundos, extensão a 72QC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-17> Cistationina sintase derivada de Shigella sp.

O gene metB que codifica cistationina sintase derivada de Shi- gella flexneri 2457T, a qual pode ser usada para a conversão de O-succinil- homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metio- nina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Shigella flexne- ri 2457T como um molde com iniciadores de SEQ ID Ns: 47 e Ns: 48 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 949C por 30 segundos, anelamento a .55QC por 30 segundos, extensão a 72SC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clona- 15 do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-18> Cistationina sintase derivada de Colwellia sp. 20 O gene metB que codifica cistationina sintase derivada de Col-

wellia psychrerythraea, a qual poderia ser usada para a conversão de O- succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de metionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Colwellia psyc- 25 hrerythraea como um molde com iniciadores de SEQ ID N2: 49 e N9: 50 co- mo segue: 30 ciclos de desnaturação a 94eC por 30 segundos, anelamento a 55QC por 30 segundos, extensão a 72SC por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- 30 brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática. <3-19> Cistationina sintase derivada de Salmonella sp.

0 gene metB que codifica cistationina sintase derivada de Sal- monella enterica serovar Paratyphi A, a qual pode ser usada para a conver- são de O-succinil-homosserina ou O-acetil-homosserina, o precursor de me- tionina, em metionina, foi clonado.

A PCR foi realizada pelo uso do cromossomo de Salmonella en- terica serovar Paratyphi A como um molde com iniciadores de SEQ ID Ng: 51 e NQ: 52 como segue: 30 ciclos de desnaturação a 94SC por 30 segundos, anelamento a 55SC por 30 segundos, extensão a 72-C por 2 minutos.

O fragmento de DNA obtido foi digerido com Ndel/Avrll e clona- do no vetor pCL-CJ1 (CJ, Coréia) digerido com as mesmas enzimas. O so- brenadante do extrato celular foi obtido usando o vetor clonado de maneira similar a descrita no exemplo <3-1 > e usado para a reação de conversão enzimática.

<3-20> Comparação das atividades das enzimas conversoras usando OSHS como substrato

A atividade de cada solução de enzima obtida nos exemplos <3- .1> a <3-19> foi comparada para selecionar a enzima conversora de metioni- na ótima.

Primeiro, O-succinil-homosserina (Sigma, USA) foi dissolvida em tampão fosfato de potássio 0,1 M (pH 7,5) com a concentração de 3 mM. Piridoxal 5'-fosfato (Sigma, USA) usado como coenzima foi adicionado na solução reacional com a concentração final de 10 μΜ. Metil mercaptano (Me- thyl mercaptan, Tokyo Kasei Organic Chemicals, Japão), usado como outro substrato foi adicionado na solução reacional com a concentração final de 2mM. 1ml da solução reacional foi colocado a 37QC, a qual 10 μΙ de cada solução de enzima (conc. de proteína: 5 mg/ml) foram adicionados. 100 μΙ da solução reacional foram coletados a cada 5 a 10 minutos e adicionados a .900 μΙ de solução de DTNB a 4 mg/ml (Sigma, USA). A OD415 foi medida para confirmar o desenvolvimento da reação.

DTNB foi reagido com o grupo SH de metal mercaptano rema- nescente na solução reacional e assim foi sintetizada uma substância ama- rela. Assim, a ocorrência da reação foi checada pela observação do desapa- recimento da cor amarela da solução reacional resultante da reação de con- versão de metil mercaptano em metionina.

Como mostrado na Figura 5, O-succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Chromobacterium sp., O-succinil-homosserina sulfidrilase deri- vada de Norcardia sp., O-succinil-homosserina sulfidrilase e O-acetil- homosserina sulfidrilase derivada de Pseudomonas sp. mostraram ter altas atividades enzimáticas. Outras enzimas também mostraram algum grau de atividade, mas suas velocidades de reação eram relativamente lentas. A rea- tividade ao substrato de cada enzima foi resumida na tabela 6. Após comple- tar uma hora de reação, foi realizado HPLC para confirmar as produções finais de metionina e ácido succínico. Os resultados estão mostrados na ta- bela 7.

<3-21 > Comparação das atividades das enzimas conversoras usando OAHS como substrato

O experimento foi realizado com O-acetil-homosserina de ma- neira similar a descrita no exemplo <3-20>. O-acetil-homosserina foi purifi- cada do sobrenadante da solução fermentada. As mesmas soluções de rea- ção e soluções de enzima usadas para o experimento com O-succinil- homosserina foram usadas para a reação. Como mostrado na Figura 6, O- succinil-homosserina sulfidrilase derivada de Hypomononas sp., O-acetil- homosserina sulfidrilase derivada de Pseudomonas sp., O-succinil- homosserina sulfidrilase derivada de Chromobacterium sp. e O-acetil- homosserina sulfidrilase derivada de Leptospira sp. mostraram ter altas ati- vidades enzimáticas. Outras enzimas também mostraram algum grau de ati- vidade, mas suas velocidades de reação eram relativamente lentas. A reati- vidade ao substrato de cada enzima foi resumida na tabela 6. Após comple- tar uma hora de reação, foi realizado HPLC para confirmar as produções finais de metionina e ácido succínico. Os resultados estão mostrados na ta- bela 8. [Tabela 6]

Reação de conversão de O-succinil-homosserina e O-acetil ho- mosserina pela enzima derivada de cada cepa

<table>table see original document page 38</column></row><table> [Tabela 7]

Capacidade de produção de metionina e ácido succínico a partir de O-succinil-homosserina por cada enzima

<table>table see original document page 39</column></row><table>

[Tabela 8]

Produção de metionina e ácido acético a partir de O-acetil-homosserina por cada enzima

<table>table see original document page 39</column></row><table> <1-22> Identificação da inibicão por retroalimentacão para enzima conversora

A inibição por retroalimentação na presença ou ausência de me- tionina foi identificada de maneira similar à descrita nos exemplos <3-20> e <3-21 >. As soluções de reação foram preparadas de maneira similar à des- crita acima e a mesma reação foi realizada pela adicionar ou não adicionar 5 g/L de metionina em cada solução reacional. A velocidade da reação na so- lução reacional sem metionina foi considerada como 100%, e baseando-se nisso, a atividade remanescente na presença de metionina foi calculada co- mo %. Os resultados são mostrados na tabela 9. Como um resultado, a atividade da O-acetil homosserina sulfidri- Iase derivada de Pseudomonas sp., O-succinil-homosserina sulfidrilase deri- vada de Nocardia sp. e O-acetil-homosserina sulfidrilase derivada de Lep- tospira sp. foi inibida pela metionina, sugerindo que estas atividades enzimá- ticas foram inibidas pelo sistema de retroalimentação na presença de metio- nina. Enzimas sem o sistema de retroalimentação foram usadas para rea- ções posteriores. Foi suposto que a enzima foi inibida pelo sistema de re- troalimentação na modalidade acima para ser usada na mesma reação onde uma cepa mutante livre do sistema de retroalimentação foi usada.

[Tabela 9]

Inibição de atividade enzimática por metionina

<table>table see original document page 40</column></row><table>

<1-23> Comparação de homologia entre as enzimas conversoras

A homologia entre as enzimas conversoras usadas para a rea- ção de conversão foi comparada para investigar as interações da reatividade de O-succinil-homosserina e O-acetil-homosserina e a inibição por retroali- mentação.

A partir da comparação de homologia entre as enzimas conver- soras usadas nesse, foi confirmado que a homologia entre metZs que codifi- cam O-succinil-homosserina sulfidrilase e a homologia entre metYs que codi- ficam O-acetil-homosserina sulfidrilase era maior do que a homologia entre metZs e metYs. Em relação à modalidade acima, há vários casos de metZ que codifica O-succinil-homosserina sulfidrilase que não exibe inibição por retroalimentação. Entretanto, foi identificado que metY que codifica O-acetil- homosserina sulfidrilase foi inibido por um sistema de retroalimentação rela- tivamente alto por que todas as enzimas usadas nos exemplos foram inibi- das por retroalimentação. Com relação à seletividade para O-succinil- homosserina e O-acetil-homosserina, o grupo do gene metZ exibiu alta sele- tividade para O-succinil-homosserina, enquanto que o grupo do gene metY exibiu alta seletividade para O-acetil-homosserina. Entretanto, metY deriva- do de Pseudomonas putida e metZ derivado de Chromobacterium Violaceum exibiram especificamente alta reatividade para ambos os substratos.

As seqüências de aminoácidos de todas as enzimas usadas a- qui foram alinhadas pelo programa Clustal W (DNAstar). Como um resulta- do, todas tinham os domínios representados pelas seguintes seqüências. Portanto, as enzimas que têm os seguintes domínios podem produzir metio- nina da mesma maneira.

Domínio 1: Y-(S, I, T, V)-R-X-X -(N1S) Domínio 2:

(V,A,I)-(V,L,I)-D-N-X-(F,V,M,I)-X-(T,S)-(P,A)-X-(L,I)-(Q,C,V)-X- (P,G)-(L,F)-X-(L,M,H)-G-(A,V)-(D,H) Domínio 3:

(S,A,G,P)-(P,A,V)-F-(N,D)-(A,S)-(W,F,Y)-X-X-X-(K,Q,R,S)-G- (L,M,V,I,M)-(E,K,D,R)-T-(L,M)-

Domínio 5: (H,Y)-(P,A)-(A,S)-(T,S)-(T,M,Q)-(T,S)-H Domínio 6: (V1I1L)-R-(V1I1L1F)-(SjAMV1I1T)-G-(U)-E- Exemplo 4: Reação de conversão de metionina pela enzima conversora de metionina

<4-1 > Produção em massa de enzima conversora

Para a produção em massa da cepa produtora de enzima con- versora de metionina construída no exemplo 2 (2-2 e 2-8), a cepa foi cultiva- da em um fermentador de 1L. Uma cepa (W3110) foi transformada com o vetor de expressão metZ derivado de Pseudomonas sp. ou vetor de expres- são de metZ derivado de Hyphomonas sp. As cepas transformadas foram inoculadas em um meio de placa LB contendo espectinomicina, seguido por cultivo a 30 a 40°C durante a noite. A colônia isolada obtida foi inoculada em .40 ml de meio LB contendo espectinomicina, seguido por cultivo a 30 a 40°C por 5 horas. A cepa que expressa metZ cultivada derivada de Pseudomonas sp. e a cepa que expressa metZ derivada de Hyphomonas sp. foram cultiva- das em um fermentador de 1 L a 30 a 40°C, 600 a 900 rpm por 15 a 30 ho- ras. A composição do meio para o cultivo é mostrada na tabela 10.

A solução da enzima conversora de metionina foi preparada por homogeneizar as células da solução fermentada usando sonicação. [Tabela 10] Composição do meio para a produção de enzima conversora

<table>table see original document page 42</column></row><table>

<4-2> Reação de conversão de metionina

A reação de conversão de metionina foi realizada pelo uso de solução de enzima conversora de O-succinil-homosserina derivada de Pseu- domonas sp. e solução de enzima conversora de O-acetil-homosserina deri- vada de Hyphomonas sp. preparadas no exemplo 4 (4-1), respectivamente, na solução de fermentação de O-succinil-homosserina e O-acetil- homosserina preparada no exemplo 2 (2-2).

.0,1 L de solução de cultura de enzima de células Iisadas foi adi- cionado a 2,0 L de solução de fermentação de precursor de metionina, a qual não teve as células removidas, a qual 0,3 L de Na-metilmercaptano a .15% foi adicionado para iniciar a reação. Duas horas depois, a solução de fermentação foi recuperada e as células foram removidas. HPLC foi realiza- do para confirmar a produção de metionina. Os resultados são mostrados na tabela 11. ITabeIa 111

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Como um resultado, embora a L-metionina tenha sido produzida com baixa concentração de até 10 g/L no método convencional, a L-metionina poderia ser produzida em massa pelo método da presente in- venção na concentração de até 30 g/L.

Aplicabilidade Industrial

O método da invenção permite a produção seletiva de L-metionina, o qual é superior à síntese química convencional que produz D- metionina e L-metionina juntas, e a produção de ácido orgânico tal como ácido succínico ou ácido acético como um subproduto sem processos inde- pendentes adicionais.

Claims (53)

1. Método para produzir L-metionina e ácido orgânico, o qual compreende as seguintes etapas:

2. preparar uma cepa produtora de precursor de L-metionina e produzir precursor de L-metionina pela fermentação da cepa; e

3. produzir L-metionina e ácido orgânico pela reação enzimática com uma enzima conversora usando o precursor de L-metionina como um substrato.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o precursor de L-metionina é O-acil-homosserina representada pela fórmula 1; [Fórmula 1] <formula>formula see original document page 44</formula> em que o grupo R é uma substância que contém C, Η, O, N e outros compostos com 15 moléculas de carbono no máximo.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o precursor de L-metionina é O-acetil-homosserina ou O-succinil-homosserina.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa pro- dutora de precursor de L-metionina da etapa 1) é selecionada do grupo que consiste em Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Cory- nebacterium sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., SaimoneIIar sp., Brevi- bacterium sp., Hypomononas sp., Chromobacterium sp. e Norcardia sp. ou fungos ou leveduras.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa pro- dutora de precursor de L-metionina da etapa 1) é derivada de uma cepa pro- dutora de L-treonina, L-isoleucina ou L-lisina.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa produ- tora de precursor de L-metionina da etapa 1) é derivada de uma cepa produ- tora de L-treonina. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a cepa pro- dutora de L-treonina é selecionada dentre Escherichia sp. ou Corynebacteri- um sp. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa pro- dutora de precursor de L-metionina da etapa 1) é Escherichia eoii.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa pro- dutora de precursor de L-metionina é preparada por deletar ou enfraquecer a atividade de cistationina gama sintase ou O-succinil-homosserina sulfidrilase ou O-acetil-homosserina sulfidrilase envolvida na degradação do precursor de L-metionina.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que a cistatio- nina gama sintase ou O-succinil-homosserina sulfidrilase ou O-acetil- homosserina sulfidrilase é codificada, respectivamente pelos genes metB ou metZ ou metY ou seus genes mutantes.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa pro- dutora de precursor de L-metionina da etapa 1) é caracterizada por usar a cepa cuja via de biossíntese de treonina, isoleucina ou Iisina está enfraque- cida ou deletada.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que a cepa é caracterizada pela deleção ou enfraquecimento da homosserina quinase envolvida na via de biossíntese de treonina.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o gene que codifica a homosserina quinase é thrB.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa pro- dutora de precursor de L-metionina da etapa 1) é caracterizada pelo uso da cepa cuja via de síntese de precursor de L-metionina a partir de homosseri- na está aumentada.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a cepa é preparada por aumentar a expressão ou atividade de homosserina O-succinil transferase ou homosserina O-acetil transferase envolvidas na via de síntese de precursor de L-metionina a partir de homosserina.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a síntese do precursor de L-metionina é aumentada pela superexpressão do gene me- tA que codifica homosserina O-succinil transferase ou do gene metX que codifica homosserina O-acetil transferase.

17. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a síntese do precursor de L-metionina é aumentada pela introdução de homosserina O-succinil transferase ou homosserina O-acetil transferase livre do sistema de regulação de retroalimentação.

18. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a síntese do precursor de L-metionina é aumentada por deletar ou enfraquecer o gene regulador envolvido na transcrição do gene de síntese do precursor de L- metionina.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o gene regulador envolvido na transcrição do gene de síntese do precursor de L- metionina é metJ.

20. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a homos- serina O-succinil transferase autêntica de uma cepa de microorganismo é deletada ou enfraquecida e então uma nova homosserina O-acetil transfera- se externa ou autêntica é introduzida ou aumentada, a fim de aumentar a síntese de O-acetil-homosserina, o precursor de L-metionina.

21. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a homos- serina O-acetil transferase autêntica de uma cepa de microorganismo é dele- tada ou enfraquecida e então uma nova homosserina O-succinil transferase externa ou autêntica é introduzida ou aumentada, a fim de aumentar a sínte- se de O-succinil-homosserina, o precursor de L-metionina.

22. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa pro- dutora de precursor de L-metionina é preparada pelo processo completo ou por uma parte do método de acordo com as reivindicações 4 a 21.

23. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa produtora de precursor de L-metionina é derivada da cepa produtora de tre- onina Escherichia coli MF001 livre da dependência de metionina (N2 de A- cesso: KCCM-10568).

24. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa pro- dutora de precursor de L-metionina é Escherichia coli CJM-BTJ (pMetA-CL) (N5 de Acesso: KCCM- 10767), a cepa produtora de O-succinil-homosserina.

25. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa pro- dutora de precursor de L-metionina é Escherichia coli CJM-BTJ (pCJ-MetA- CL) (Ns de Acesso: KCCM- 10872), a cepa produtora de O-succinil- homosserina.

26. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a cepa pro- dutora de precursor de L-metionina é Eseheriehia coli CJM-BTJA (pCJ-MetX- CL) (N5 de Acesso: KCCM-10873), a cepa produtora de O-acetil- homosserina.

27. Cepa usada para a produção de precursor de L-metionina na etapa 1 como definida na reivindicação 1, a qual é selecionada a partir do grupo que consiste em Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacterium sp., Pseudomonassp., Leptospira sp., Salmonellar sp., Brevibacterium sp., Hypomononas sp., Chromobacterium sp. e Noreardia sp. ou fungos ou leveduras.

28. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 27, em que a cepa tem deletada ou enfraquecida uma enzima que tem a atividade de cistationina gama sintase ou O-succinil- homosserina sulfidrilase ou O-acetil-homosserina sulfidrilase envolvida na degradação de precursor de L-metionina.

29. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 28, em que a enzima que tem atividade de cistationi- na gama sintase ou O-succinil-homosserina sulfidrilase ou O-acetil- homosserina sulfidrilase é codificada pelos genes metB ou metZ ou metY ou seus genes mutantes.

30. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 27, em que a cepa é derivada de cepa produtora de treonina, isoleucina ou lisina.

31. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 27, em que a atividade de homosserina quinase é enfraquecida ou deletada.

32. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 31, em que o gene thrB que codifica a homosserina quinase está enfraquecido ou deletado.

33. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 27, em que a via de síntese de precursor de L-metionina a partir de homosserina é aumentada.

34. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acordo com a reivindicação 33, em que a expressão ou a atividade de homosserina O-succinil transferase ou homosserina O-acetil transferase é aumentada.

35. Cepa para a produção de precursor de precursor de L-metionina de acordo com a reivindicação 34, em que o gene metA que codifica homosserina O-succinil transferase ou o gene metX que codifica homosserina O-acetil transferase é superexpresso.

36. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 33, em que a homosserina O-succinil transferase ou homosserina O-acetil transferase livre do sistema de regulação de retroali- mentação é introduzida.

37. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 33, em que o gene regulador envolvido na transcri- ção do gene da síntese de precursor de L-metionina é deletado ou enfraque- cido.

38. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 37, em que o gene metJ, o gene regulador envolvido na transcrição do gene de síntese de precursor de L-metionina, é deletado ou enfraquecido.

39. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 33, em que a homosserina O-succinil transferase autêntica de uma cepa de microorganismo é deletada ou enfraquecida e en- tão uma nova homosserina O-acetil transferase externa ou autêntica é intro- duzida ou aumentada.

40. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 33, em que a homosserina O-acetil transferase au- têntica de uma cepa de microorganismo é deletada ou enfraquecida e então uma nova homosserina O-succinil transferase externa ou autêntica é intro- duzida ou aumentada.

41. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 27, em que a cepa é Escherichia coli.

42. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 27, em que a cepa é preparada por usar o processo completo ou por uma parte do método como definido nas reivindicações 4 a .21.

43. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 27, em que a cepa é derivada da cepa produtora de treonina Escherichia coli MF001 livre da dependência de metionina (Ns de Acesso: KCCM-10568).

44. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 27, em que a cepa é Eseheriehia coli CJM-BTJ (pMe- tA-CL) (N- de Acesso: KCCM- 10767), a cepa produtora de O-succinil- homosserina.

45. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 27, em que a cepa é Escherichia coli CJM-BTJ (pCJ- MetA-CL) (N9 de Acesso: KCCM-10872), a cepa produtora de O-succinil- homosserina.

46. Cepa para a produção de precursor de L-metionina de acor- do com a reivindicação 27, em que a cepa é Escherichia coli CJM-BTJA (pCJ-MetX-CL) (NQ de Acesso: KCCM-10873), a cepa produtora de O-acetil- homosserina.

47. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima conversora que converte o precursor de L-metionina em metionina da etapa .2) é derivada de uma cepa selecionada a partir do grupo que consiste em Escherichia sp., Erwinia sp., Serratia sp., Providencia sp., Corynebacterium sp., Pseudomonas sp., Leptospira sp., Salmonellar sp., Brevibacterium sp., Hypomononas sp., Chromobacterium sp. e Norcardia sp. ou fungos ou leve- duras.

48. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima conversora que converte o precursor de L-metionina em metionina da etapa .2) é derivada de uma cepa selecionada a partir do grupo que consiste em Pseudomonassp., Chromobacterium sp., Leptospira sp. e Hypomononas sp.

49. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima conversora que converte o precursor de L-metionina em metionina da etapa .2) é derivada de uma cepa selecionada a partir do grupo que consiste nas <table>table see original document page 50</column></row><table>

50. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima conversora que converte o precursor de L-metionina em metionina da etapa .2) é derivada de uma cepa selecionada a partir do grupo que consiste em Pseudomonas sp., Chromobacterium Violaceum, Leptospira Meyeri e Hy- phomonas Neptunium.

51. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a reação enzimática que converte o precursor de L-metionina em metionina é induzida por uma enzima ou por uma cepa que tem a atividade de cistationina gama sintase ou O-succinil-homosserina sulfidrilase ou O-acetil-homosserina sulfi- d ri Iase.

52. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a enzima conversora que converte o precursor de L-metionina em metionina da etapa .2) contém pelo menos uma parte de ou a seqüência de aminoácido inteira de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 mostrada na Figura 7. Seqüência 1: Y-(S, I, T, V)-R-X-X -(N, S)- Seqüência 2: (V,A,I,)-(V,L,I)-D-N-X-(F,V,M,I)-X-(T,S)-(P,A)-X-(L,I)-(Q,C,V)-X- (P1G)-(L1F)-X-(L1M1H)-G-(A1V)-(D1H)- Seqüência 3: (D1G1N1T)-G-(Q1H1N)-(S1G1NMR1T1D1S)-X- (V1I1L1M)-(GAL)-G-(I1VAL)-(I1V1A1L)-(I1V1A1L) Seqüência 4: (S1A1G1P)-(PiA1V)-F-(N1D)-(A1S)-(WiFjY)-X-X-X-(KiQiRjS)-G- (L1M1V1I1M)- (E1K1D1R)-T-(L1M)- Seqüência 5: (H1Y)-(P1A)-(A1S)-(T1S)-(T1M1Q)-(T1S)-H- Seqüência 6: (V1I1L)-R-(V1I1L1F)-(S1A)-(V1I1T)-G-(L1I)-E-

53. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o ácido orgânico é ácido succínico ou ácido acético.