CN1976593B - 一种乳糖酸高产率的酶工艺 - Google Patents
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Abstract
一种乳糖酶转化为乳糖酸工艺，该工艺具有增加了的乳糖酸产率和/或降低了的反应时间，该工艺包含添加乳品酶底物如奶、乳清或乳糖溶液，一种能将乳糖转化为乳糖酸的糖类氧化酶、其中在pH值稳定控制下进行该工艺。
Description
技术领域
一种乳糖酶转化为乳糖酸工艺，该工艺具有增加了的乳糖酸产率和/或降低了的反应时间，该工艺包含添加乳品酶底物如奶、乳清或乳糖溶液，一种能将乳糖转化为乳糖酸的糖类氧化酶、其中将工艺中的PH值控制和保持在特定的水平。
背景技术
通常被称为牛奶糖的乳糖是牛奶的初级糖类。在牛奶基乳品中如酸乳酪和干酪，乳糖被认为是低价值的糖类原因在于乳糖的不耐性并且还在于其还涉及褐变和结晶反应。乳糖产率占了乳清和聚集物中的整个干物质的75％，世界范围的年产量接近120万吨，但是没有很多直接利用其的有利方法。
然而，乳糖可以转化为医药中很有用的化合物即乳糖酸(4-o-β-D-吡喃半乳糖-D-葡萄糖酸)，此外还因为乳糖的甜酸味道而将其用在食品中。乳糖酸可以在奶制品的生产中产生并可以提供所需感官性质并且乳糖含量降低的结果产品。进一步，从本质上说，乳糖酸及其盐类是通过乳糖的酶转化而得的，并可将其用作特定食品产物的添加剂，如用作抗氧剂、乳化剂、食品产物中的常规酸化剂、饮食性矿物补充剂并且在干酪生产中用作干酪发酵剂培养物的替代物。在制药工业中，乳糖酸是器官保存溶液的重要组分。在美容业中，乳糖酸用作常规皮肤护理液和护理霜中的活性成分。此外，乳糖酸还可用在技术应用中如，用作清净剂中的成分。
在大多数的应用中，优选通过乳糖的酶转化来产生乳糖酸，并且众所周知，糖类氧化酶能将乳糖转化为乳糖酸。反应式如下：
乳糖+O2+H2O→乳糖酸+H2O2
乳糖酸的CAS登记号为96-82-2。
WO02/089592(Kraft Foods)描述了在牛奶基奶制品的生产中使用乳糖酸的优点，并且还描述了在牛奶基奶制品如奶酪的制备过程中，使用糖类氧化酶当场将乳糖转化为乳糖酸的优点。
关于奶制品制备中的优点在于具有降低的乳糖含量(如奶中乳糖的降低)，并且在生产已加工的乳酪制品(例如批萨)可以减少褐变的问题。此外，如在乳酪的生产过程中，可将乳糖酸用于增加酸度。通常，通过用乳酸菌来发酵奶来增加酸度，该乳酸菌通过对乳糖产生新成代谢来生产乳酸。因此，通过添加乳糖酸则有可能降低乳酸菌的使用来生产相关的奶制品。
关于糖类氧化酶将乳糖转化为乳糖酸，WO02/089592描述了将酶添加到奶制品酶底物并且接着在适宜的温度下发酵特定的一段时间以完成酶反应。该文献并没有清晰地教导关于在酶反应中保持特定的pH值所具有的优点。事实上，在反应过程中，因为产生了乳糖酸从而pH值有所降低，因此酸化了奶制品。
在WO02/089592的实施例9中，将奶用糖类氧化酶发酵一整夜。没有任何关于控制pH值的教导。在整夜的发酵后，已处理的奶中含有1.5％的乳糖和3.2％的乳糖酸，因此提供了乳糖转化为乳糖酸的68％的转化率。
在实施例12B)和C)中，将奶用糖类氧化酶在55℃下发酵了48小时。在反应过程中，pH值保持了7。在这些实施例中，并没有对此pH值控制给出解释也没有给出乳糖酸的产率。
WO03/037093(Novozymes)也描述了在牛奶基奶制品的制备过程中，使用糖类氧化酶将乳糖转化为乳糖酸。对于WO02/089592这篇文献而言，其并没有描述关于在酶反应中保持特定的pH值所具有的优点。仅有的特别工作实施例描述了全脂奶用氧化酶进行发酵并在40℃保持反应直到pH值为4.2。因为天然鲜奶的pH值接近6.6，可见其并没有对pH值进行控制。
WO02/39828(Danisco)涉及了一种工艺，其中将糖类氧化酶(已醣氧化酶)溶液和乳酪撒在批萨上，并且描述了批萨乳酪具有降低褐化的优点(术语为“梅拉德反应”)。该文献也没有描述关于在酶反应中保持特定的pH值所具有的优点。
因此，在该领域中有一些文献公开了涉及乳糖酶转化为乳糖酸的食品生产工艺。然而，还是需要改进用于上述目的的酶工艺，特别用于实质上是乳糖酸工业生产的酶工艺。
发明内容
本发明所解决的问题是提供了一种从酶底物中将乳糖酶转化为乳糖酸的工艺，该工艺具有增加了的乳糖酸产率和/或降低了的反应时间。产率定义为特定时间内乳糖转化为乳糖酸的分数。因此，在本文献中，产率等同于特定时间内的“转化率”。在所需特定转化率的场合中，本发明提供了一种具有降低了的反应时间的工艺。
本发明基于令人惊奇的观察而得到的，即通过在乳糖的糖类氧化酶基酶转化为乳糖酸的工艺中将pH值保持稳定从而在酶转化中获得了较高的产率和/或降低了的反应时间。
因此，本发明的第一个方面涉及了一种乳糖转化为乳糖酸的酶转化工艺，其获得了增高了的产率和/或降低了的反应时间，所述工艺包含：
i)将一种糖类氧化酶添加到奶制品酶底物中，
ii)对所述奶制品酶底物在使得糖类氧化酶将乳糖转化为乳糖酸的条件下进行发酵，
iii)通过添加碱类物质使得pH值在发酵过程中保持稳定，如果使用强碱来保持pH值，则所述稳定值不为7.0，并且因此获得了增高了的产率和/或降低了的反应时间。
在该工艺的一个非常有趣的实施方式中，添加到步骤iii)中的是弱碱。进一步，一个优选的实施方式中包含了可选择的，在该工艺的步骤i)中添加过氧化氢酶和H2O2。
在本发明进一步的一个重要方面，上述的工艺中包含在步骤i)中添加过氧化氢酶。乳糖转化为乳糖酸的酶转化中需要氧气并且在转化过程中产生了H2O2。通过添加过氧化氢酶而将所产生的H2O2转化为氧气。因此，当在工艺中引入过氧化氢酶时，则可降低氧气的供应。
本发明进一步的方面在于提供了将上述任意方面的工艺作为食品生产工艺的一个集成部分。
具体实施方式
奶制品酶底物(Dairy Substrate)
术语“奶制品酶底物”应该理解为任何奶或奶类似产物的溶液/悬浮液，该奶类似产物包含乳糖，如全脂或低脂奶、脱脂奶、黄油奶、压缩奶粉、全脂奶粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、乳糖结晶的母液、乳清蛋白质浓缩物、或来自任何动物的乳脂。酶底物上的乳糖并不需要完全溶解，即，如反应可以在浓缩的浆液与超过反应温度下可溶解含量的乳糖含量条件下进行。进一步，反应可在奶制品酶底物上进行，其中在部分该奶制品酶底物上有乳糖或部分该奶制品酶底物被乳糖酶水解了。在这种情况下，不仅产生了乳糖酸，而且还通过糖类氧化酶的作用还产生了半乳糖醛酸和葡萄糖酸。
优选，奶制品酶底物是奶，更优选是乳清或乳清馏分或乳糖溶液/悬浮液。
术语“奶”应该理解为是通过对任何哺乳动物进行挤奶而得到的乳液分泌物，该哺乳动物如奶牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼。
正如在此下文中所进一步描述的，本工艺特别适于乳糖酸的相对大规模生产。因此，在本发明的一个优选实施方式中，所用的奶制品酶底物为50kg至500000kg。
乳糖酸(Lactobionic acid)
术语“乳糖酸”应该理解为涉及乳糖酸或其盐类。适宜的盐类包含乳糖酸钠盐、乳糖酸钙盐、乳糖酸铵盐和乳糖酸钾盐。
所选用于pH值控制的碱类可以控制所产生的乳糖酸盐类。通过控制pH值而产生的乳糖酸盐中，可以通过去除阳离子如使用离子交换来获得纯化乳糖酸。此外，还可以通过利用强酸如硫酸或磷酸的沉淀来去除阳离子如钙离子。
糖类氧化酶(carbohydrate oxidase)
对于本领域技术人员来说，已熟知并可获得许多适宜的糖类氧化酶，该糖类氧化酶可以将乳糖转化为乳糖酸。例如，可以是己糖氧化酶或葡萄糖氧化酶。
目前所推荐的糖类氧化酶是微生物糖类氧化酶。
适宜的己糖氧化酶(EC1.1.3.5)在WO96/40935(Bioteknologisk Institut，丹麦)中得到了描述。该文献中描述了来自海藻类的一种适宜己糖氧化酶，尤为特别的是，其中海藻类选自角叉菜、Iridophycus flaccidum和Euthoracristata。
其他适宜的糖类氧化酶可以源自有丝分裂孢子的果囊菌亚纲的真菌，如支顶孢菌，特别是A.strictum，如ATCC34717或T1；A.fusidioide，如IFO6813；或A.potronii，如IFO31197。在一个优选的实施方式中，所获得的糖类氧化酶源自Lin等和JP-A-5-84074中的公开。
在一个优选的实施方式中，糖类氧化酶来自Microdochium真菌属，更优选其中真菌是Microdochium nivale，甚至更优选是Microdochium nivaleCBS100236。在WO99/31990(Novo Nordisk A/S)中详细地描述了该类优选氧化酶。
氧化酶的使用量通常取决于特定的需求和特定的酶。氧化酶的添加量优选，在特定时间内，足以产生所需程度的乳糖向乳糖酸的转化。通常，氧化酶添加量约1—10000OXU/奶制品酶底物(kg)是足够的，特别是约5—5000OXU/奶制品酶底物(kg)，并且更为特别是约5—100OXU/奶制品酶底物(kg)。对于特定奶制品酶底物转化所需特定酶含量的调节在本领域技术人员的普通知识范围内。
在文献中，氧化酶单元(OXU)通常被定义为在特定条件下每分钟氧化1μmol的乳糖所需的酶含量。然而，在此提供的实施例中，OXU被定义为相对一种酶标准所测得的1mg纯乳糖氧化酶。
在使得糖类氧化酶将乳糖转化为乳糖酸条件下进行的发酵(incubating)
本发明步骤i)中所得到的奶制品酶底物在使得糖类氧化酶将乳糖转化为乳糖酸条件下进行发酵。此类条件包含，但不限于，温度、氧气、糖类氧化酶的含量及特性、其他的添加剂如过氧化氢酶和反应/发酵时间。很明显，所选择的发酵条件将完成本发明，即在乳糖转化为乳糖酸的酶转化中获得了增加了的产率和/或降低了的反应时间。
通常，适宜的发酵时间使得乳糖转化为所感兴趣程度的乳糖酸。
因为乳糖转化为乳糖酸要消耗氧气，所以氧气是本发明中的一个重要因素。这可以从实施例1的表中看出。因此，如果在酶反应过程中监视氧气，则通常可以观察到，氧气含量有个起始降低，如果如持续提供空气，则氧气含量在酶反应结束时会恢复起始水平。当氧气恢复到起始水平的90％时，这就表明了酶反应已经结束或至少有了显著的降低。因此，优选的适宜发酵时间至少持续到发酵奶制品酶底物中氧气含量恢复到超过起始含量的90％。特别是，所需乳糖的最大转化率。
其后进一步描述了本发明的一个特别方面，优选在乳糖的酶转化过程中加入过氧化氢酶。可以在任意适合的时候加入过氧化氢酶如在该工艺的步骤i)中。可选择的，与过氧化氢酶一起加入H2O2。
为保持pH值恒定而加入了碱等同物，该碱等同物含量的确定也可用于监视反应。
通常，适宜的发酵时间为1/2小时至3天，最优选是2小时至48小时。
发酵温度通常取决于所用的糖类氧化酶，并且选自糖类氧化酶的最优反应温度。然而，随着反应温度的升高氧气的溶解度会降低，为了获得最佳工艺必须要考虑其他的因素。本领域技术人员知道怎样平衡关于如酶活性和氧气溶解度之间的最优温度。通常，适宜的温度为约0℃至约80℃。低温，如5℃会导致相对低的反应速度，但是其具有代表了冷藏产品常规温度的优点。因此，可能在奶制品的生产和/或储藏进行该反应。
适宜的氧气源包含常压空气、富集氧气的常压空气和纯氧。在高于1个大气压的压力下进行该工艺会增加氧气的溶解度并在任何应用中都是优选。
可以通过在发酵过程中将空气连续混入到奶制品酶底物中来为该工艺供给氧气。进一步，一种提供氧气的选择是在过氧化氢酶的存在下添加H2O2。
当工艺在利用氧气加入非常困难的固定酶时，特别优选使用H2O2作为氧气源。
稳定DH值下的发酵：
如上所解释的，在此所述本发明的一个重要特征在于在发酵(步骤(ii))中通过添加碱类来保持稳定的pH值，当使用强碱时，稳定的pH值不是7.0。在特定的实施方式中，通过添加弱碱使得稳定的pH值保持在约3.0至约9.0或通过添加任何碱使得稳定的pH值保持在约3.0至约6.9和从约7.1至约9.0，如约3.0至约6.8和从约7.2至约9.0，包含从约3.0至约6.5和从约7.5至约9.0，如从约3.0至约6.0和从约8.0至约9.0。优选，发酵所进行的时间足以使得乳糖转化为乳糖酸的转化率至少比相当的对照工艺高出2.5％，该对照工艺的唯一比较区别在于其不添加足够量的碱来保持发酵过程中的pH值。
除了不加入碱以保持pH值外，该相当的对照工艺与在此所述工艺在相同的条件下进行(即相同量的相同氧化酶、相同的奶制品酶底物、相同的发酵时间、温度和存在氧等)，在此所述的工艺在乳糖转化为乳糖酸酶转化中具有增大了的产率和/或降低了的反应时间。在此所用的对照组具有普通的含义，即对照组确定了保持pH值稳定的积极效果。
对于特定所感兴趣的工艺而言，正如本领域技术人员所欣赏的，优选的稳定pH值取决于许多因素。例如，如果所用的奶制品酶底物是奶，其天然pH值在6.6左右，则优选将pH值保持在6.6左右，如pH值为6.3-6.9。如前所述的，因为工艺常用于最终产品的酸化，所以常规乳糖转化为乳糖酸的酶转化中并不进行pH值的控制。在许多情况中描述了最终产品的pH值调整，例如在生产低乳糖的奶中，pH值的减少低于所需的水平。因此，纯粹为了与最终产品pH值相匹配，可以进行pH值先前调整，并不如此一样，是工艺的优选。
根据本发明，也欣赏将乳糖酸产品或包含乳糖酸的组合物的pH值在所进行的酶转化末期或其后调整为优选的pH值，如当已进行了95％的乳糖所需转化时，pH值可以降低到所需的值。pH值的降低以及空气的鼓泡进一步使得CO2脱离奶制品酶底物。当在反应中用碳酸盐来进行pH值控制时，这就特别的重要了。
在本文中“稳定pH值”应该被广义的理解为在该工艺中通过添加碱类将pH值控制和保持在特定范围内，或接近/为特定值。
在发酵过程中pH值的控制和调整/保持是一个标准步骤，其在高度精确性下进行。因此，稳定pH值是保持恒定的值，其变化量低于0.1个pH单位变化或甚至低于0.05个pH单位变化。根据本发明，最优范围由特定的酶工艺所决定，并且该pH值将以上述的精确度被控制并保持在该范围内。在本发明的工艺中，适宜的特定pH值范围或pH值选自约3-约9。当用强碱来进行pH值调整时，特定pH值的限制就是不能为7.0。
优选通过添加足量的碱而将pH值保持在约5.5至6.9，更优选为从6.0-6.9。
优选，从酶反应起始就保持在此所述的稳定pH值。即，将氧化酶添加到奶制品酶底物后，紧接着添加碱类以保持在此所述的稳定pH值。
特别的是，如果需要最大的乳糖转化率，则将在此所述的稳定pH值保持一段时间，至少持续到发酵奶制品酶底物中氧气量恢复为起始量的90％。
优选，将在此所述的稳定pH值保持30分钟至48小时，更优选为1小时至36小时，更为优选从2小时至24小时。
在本工艺中，可能使用任何碱类将pH值保持在上述范围内。原则上说，任何能中和所产生酸的物质均可用于本工艺。但是，在实际应用中，优选使用弱碱和碳酸盐。弱碱包含，但不限于，例如CaCO3、Na2CO3、K2CO3、(NH4)CO3和NH4OH。目前优选的弱碱是NH4OH和CaCO3。
本领域技术人员直到许多其他可以用于本发明工艺中的碱类，例如强碱如Ca(OH)2、KOH、NaOH和Mg(OH)2。
当所用的碱是例如Ca(OH)2或CaCO3时，则有可能利用上述工艺从适宜的奶制品酶底物中来生产乳糖酸钙盐。接着该产品可被用作例如奶制品添加剂或在此所描述工艺中的一种成分。
因此，如上所述，优选碱类通常是涉及最终产品所需矿物组分的碱类。在一个特别实施方式中会要求富含有钙的奶。在这种情况下，优选碱类为Ca(OH)2，因为碳酸盐会对口味产生不希望的影响所以碳酸盐并不适合。(实施例4)
术语“弱”对“强”碱指的是碱类的分解能力。在本文中，弱碱被定义为pKb值至少为3.5的碱类(对于像CO3 2-类的双质子碱类而言，该pKb值指的是第一步骤)。
优选，在发酵过程(步骤(ii))中，通过添加足量的碱类来将pH值保持一段时间从而足以使得乳糖转化为乳糖酸的转化率至少比相当的对照工艺高出5％，该对照工艺的唯一区别在于在发酵过程中不通过添加碱类来保持pH值，更优选至少比相当的对照工艺高出15％，甚至更优选至少比相当的对照工艺高出30％，最优选至少比相当的对照工艺高出45％。
为了说明，在此的工作实施例1和2中，对照组中乳糖转化为乳糖酸的转化率为41％而通过将pH值保持在5-6，则转化率增加到90％。进一步，如实施例5所述，令人惊奇的发现，使用弱碱(例如0.5M Na2CO3)比类似工艺的反应时间降低了24％，该类似工艺是通过添加强碱(1M NaOH)来保持pH值。因此，用弱碱来代替强碱会降低本工艺的反应时间。反应时间降低了至少5％如至少25％，至少50％，或甚至至少80％。
此外，如实施例5所述，在转化工艺结束后，发现残留酶活性接近100％。这就公开了可能操作，在一批新料中重新利用酶，例如通过膜过滤来回收酶。
本发明的一个特别方面，下述步骤所定义的一种乳糖转化为乳糖酸的酶转化工艺，其获得了增高了的产率和/或降低了的反应时间，所述步骤：
i)将一种糖类氧化酶添加到奶制品酶底物中，
ii)对所述奶制品酶底物在使得糖类氧化酶将乳糖转化为乳糖酸的条件下进行发酵，
iii)通过添加弱碱(A)使得pH值在发酵过程中保持为约3.0至约9.0或通过使用任意碱类(B)使得上述pH值保持为约3.0至6.9和7.1至约9.0，并且因此获得了增高了的产率和/或降低了的反应时间。
因此，从上文描述和在此所提供的实施例中可以看出，本发明对于乳糖工业转化为乳糖酸是很有价值的，原因在于本工艺所定义的特征使得可以进行乳糖酸的经济性生产。基于本发明公开的变化、改进、适应性改进都是被欣赏的，并且在本发明的范围和精神之内。
很明显，所公开的工艺使用于本质上是乳糖酸的工业生产。然而，该工艺也可以组成奶制品制备的生产工艺中的一部分，该奶制品如乳酪、酸奶、奶等等。
乳糖酸的纯化：
可选择的，可能以任何适宜的方法来纯化乳糖酸以获得所需乳糖酸纯度的乳糖酸产品或包含乳糖酸的组合物。
本领域技术人员知道如何进行纯化，并且取决于特定所感兴趣的需要，可以获得含有至少30％乳糖酸的组合物，至少为90％的乳糖酸或甚至是95％或99％的乳糖酸。
纯化乳糖酸的适宜方法包含过滤、离子交换、浓缩和干燥。
含有乳糖酸的组合物可作为食品添加剂或食品成分而用在食品产品的生产中。此外，该组合物还可具有如上所述的其他应用。
含有乳酸菌的发酵液培养物：
通常，按照特定的需求在此所述的工艺中还包含附加的元素或成分。本领域技术人员知道所需的很多此类附加元素或成分。
在一个优选的实施方式中，在此所述的工艺中包含了含有乳酸菌的发酵液培养物。可以在奶制品酶底物添加氧化酶前或后，加入发酵液培养物，并且可任选将过氧化氢酶加入到酶底物中。这取决于所感兴趣的特定发酵分布。
在此的术语“乳酸菌”指的是革兰氏阳性菌、非孢子菌类，其进行糖类的乳酸发酵。
在其他，其包含乳酸菌类，其属于乳酸杆菌类例如瑞士乳酸杆菌、保加利亚德尔布吕克乳酸杆菌亚类等等，属于乳球菌类，如乳酸乳球菌，乳酸菌属于链状球菌类，如唾液链状球菌，乳酸菌属于明串珠菌类，如乳酸明串珠菌。乳酸菌属于双歧杆菌类，如长双歧杆菌或短双歧杆菌，乳酸菌属于小球菌类。
乳酸菌可以和其他微生物如酵母菌混合来使用。
过氧化氢酶(catalase)：
过氧化氢酶是一种催化下式反应的酶：2H2O2→O2+2H2O。EC号是EC1.11.1.6。
如在此的工作实施例3所示，过氧化氢酶的使用显著的改进了乳糖转化为乳糖酸的转化率。此外，过氧化氢酶的使用减少了乳糖转化为乳糖酸过程中所产生的H2O2。
因此，在木发明的一个优选实施方式中，将过氧化氢酶加入到了本发明的工艺中。
如上所述，当糖类氧化酶将乳糖转化为乳糖酸时会产生H2O2。反应式如下所述：
乳糖+O2+H2O→乳糖酸+H2O2
可以在糖类氧化酶反应产生乳糖酸后加入过氧化氢酶。然而，优选，在本工艺的步骤(i)与糖类氧化酶一起加入过氧化氢酶。在本工艺的步骤(i)与糖类氧化酶一起加入过氧化氢酶的优点在于氧需求量会显著降低(达到50％)。因此，供应氧，例如以空气的形式，会显著的降低。实际上，如果与H2O2一起加入了足够量的过氧化氢酶，就没必要供应额外的氧气了例如以空气的形式。该额外添加H2O2可以来自任何经济性的来源。
因此，一个优选的实施方式中，基本上在本工艺的步骤(ii)中所需的全部氧气可以通过添加额外H2O2来获得并且其中过氧化氢酶通过转化可用的H2O2来产生所需的氧气。
在本文中，“基本上所有的氧气”这样的表达用来描述了酶反应充分进行所需供应的氧气，并且特别是在发酵过程中不需要主动加入额外的氧气，例如在发酵中连续将空气混入到奶制品酶底物中。
一个优选实施方式中，通过添加足量的碱类来将发酵过程中的pH值保持一段时间从而足以使得乳糖转化为乳糖酸的转化率至少比相当的对照工艺高出2.5％，该对照工艺的唯一区别在于在发酵过程中不通过添加碱类来保持pH值。
一个优选实施方式中，在工艺的步骤(i)中加入了过氧化氢酶，与不加入过氧化氢酶的类似工艺相比，该过氧化氢酶的加入量足以降低H2O2的浓度。
优选，过氧化氢酶的添加量还可以改进乳糖转化为乳糖酸的转化率。
本领域技术人员已知许多适宜的过氧化氢酶。例如，来自Novozymes A/S的商业可够过氧化氢酶
。
在此所述工艺中过氧化氢酶的添加量通常取决于最终产品所需H2O2的量。因此，取决于所感兴趣的特别奶制品，特别是如果奶制品是奶时，在此所述工艺中所添加的过氧化氢酶的量足以使得H2O2的含量至少比相当的对照工艺下降了10％，该对照工艺的唯一区别在于不加入过氧化氢酶。
更优选，在此所述工艺中所添加的过氧化氢酶的量足以使得H2O2的含量至少比相当的对照工艺下降了25％，该对照工艺的唯一区别在于不加入过氧化氢酶，甚至更优选，在此所述工艺中所添加的过氧化氢酶的量足以使得H2O2的含量至少比相当的对照工艺下降了75％，该对照工艺的唯一区别在于不加入过氧化氢酶。
除了不加入过氧化氢酶以外，该相当的对照工艺与在此所述用于改进乳糖酸的工艺在相同的条件下进行(即相同量的相同氧化酶、相同的奶制品酶底物、相同的发酵时间、温度、存在氧以及加入碱类等)。在此所用的对照组具有普通的含义，因为对照组确定了加入过氧化氢酶的积极效果。
在本发明的一个单独方面，涉及了一种乳糖转化为乳糖酸的酶转化工艺，其获得了增高了的产率和/或降低了的反应时间，所述工艺包含：
将一种糖类氧化酶和一种过氧化氢酶添加到奶制品酶底物中，
对所述奶制品酶底物在使得糖类氧化酶将乳糖转化为乳糖酸的条件下进行发酵
通过添加碱类物质使得pH值在发酵过程中保持稳定，并且因此获得了增高了的产率和/或降低了的反应时间。
在此所描述的所有实施方式，关于本发明的第一方面也是关于本发明该单独方面的优选实施方式。
制备奶制品的工艺
如上所述，根据本发明任一方面的工艺可以是任何其它工艺的集成部分，例如在食品生产工艺中，如奶制品制备工艺中，其中需要将乳糖转化为乳糖酸。因此，利用本发明可以得到最终食品产品。此外，根据本发明工艺所生产的包含乳糖酸的组合物可以用在例如奶制品的生产中。本领域技术人员知道此类乳糖酸和包含乳糖酸的组合物的相关用途，并且可以参考上述的先前技术以及在本发明背景技术部分所提到的应用。因此，一旦通过本工艺获得了包含乳糖酸组合物或本质上是乳糖酸的产品，则可以用任意适宜的方式来利用该组合物或产品。
术语“奶制品”应被理解为如上所定义的，包含奶制品酶底物的任何奶制品。应用在本发明中的奶制品实施例是像酸奶、奶这类的，例如富含钙的奶和乳酪如混合干酪(例如用在批萨中)，奶乳酪和小乳酪。
在此所描述的所有实施方式，关于本发明的先前方面也是关于本发明该方面的优选实施方式。
已经对本发明工艺的方面和实施方式作了一般性的描述，在此要用特别实施例对本发明进行描述。这些实施例进一步描述了发明的不同特征和优点，但是目的并不在于限制本发明的范围。
实施例：
实施例1：
以大型试验方式用了400kg含有6％乳清渗透性粉末(来自EPI，法国)的酶底物溶液进行了试验。温度调整到49℃。所用的糖类氧化酶用量相对于400升溶液中的40000OXU，即使用了1250g的酶溶液。如专利WO9931990中所描述的，从Microdochium nivale中获得了酶。在文献中，一个氧化酶单元(OXU)通常定义为在特定条件下每分钟氧化1μmol的乳糖所需的酶含量。然而，在此提供的实施例中，OXU被定义为相对一种酶标准所测得的1mg纯乳糖氧化酶。
通过监视溶液的pH值和氧气张力来进行反应。利用泵湍流(Landia泵5.5kWh)通过将酶底物循环回到箱中而将空气混入到酶底物中。
当氧气恢复量>90％时，反应结束，并将产品加热到85℃以进行酶灭活。在反应中取出样本，并且将其加热到85℃以进行酶灭活。
在加入酶前，酶底物溶液的pH值是6.52。在反应结束后(反应时间为5个小时)pH值降低到3.62。在时间＝0时，酶底物中氧气含量为5.82mg/L，在酶加入后的5分钟内，其降低到小于0.5mg/L。可从下表中看来自实验的数据。
| 时间，分钟 | pH | 氧气 |
| 0 | 6.52 | 5.82 |
| 5 | 6.39 | 0.50 |
| 15 | 6.02 | 0.49 |
| 30 | 5.63 | 0.33 |
| 60 | 5.12 | 0.40 |
| 65 | 5.02 | 0.40 |
| 90 | 4.82 | 0.42 |
| 120 | 4.46 | 0.32 |
| 175 | 4.00 | 0.12 |
| 240 | 3.70 | 0.90 |
| 250 | 3.66 | 1.70 |
| 260 | 3.64 | 3.66 |
| 270 | 3.64 | 4.00 |
| 280 | 3.64 | 4.45 |
| 290 | 3.62 | 5.45 |
| 300 | 3.62 | 5.52 |
氧气含量的单位是mg/L。
乳糖转化为乳糖酸的转化率为41％。
实施例2
与实施例1类似，将833g(相对应于26700 OXU)糖类氧化酶加入到166kg的酶底物中。所用的氧化酶与实施例1相同。通过加入5N NaOH溶液将pH值保持在5-6。当氧气含量恢复到起始水平时(5个小时后)，总共用了3910mL用于pH值控制的5N NaOH溶液。根据下述反应式，该使用量相对应于乳糖转化为乳糖酸的转化率>90％：
乳糖+O2+H2O→乳糖酸+H2O2，其中NaOH用来中和所产生的酸。
实施例3
实施例1类似，将441g(相对应于14100 OXU)糖类氧化酶溶液和39g过氧化氢酶25L加入到166kg的酶底物中。所用的氧化酶与实施例1相同。氧化氢酶为来自Novozymes A/S的
过加入5N的NaOH溶液将pH值保持在5-6。当氧气含量恢复到起始水平时(4小时40分钟后)，总共用了4860g用于pH值控制的5N NaOH溶液。该使用量相对应于乳糖转化为乳糖酸的转化率为100％。
实施例4
目标
目标是要测试生产富含Ca奶的方法，其在奶的乳糖氧化酶催化反应中添加Ca(OH)2并保持了pH值。在不同碱性添加剂中进行了取样并将奶进行了热处理和评估(口感和稳定性)。
方法
酶底物脱脂奶1.5kg
温度50℃
新鲜空气流过搅动酶底物的表面
酶是M.nivale所制备的一种糖类氧化酶，其为0.085OXU/g的溶液＝3.98g的酶溶液。
所用氧化酶与实施例1相同。
过氧化氢酶25L剂量是0.5g(来自Novozymes A/S的)。
如下所述，将氧化酶和过氧化氢酶添加到酶底物中并进行发酵。
通过添加1N Ca(OH)2来使得pH值保持恒定。
在碱消耗量为22.2mL和41.15mL后，取了100mL的样，并在85℃加热了15分钟。
冷却样品后测试了其口味和稳定性。
结果
50℃下脱脂奶的pH值为6.65，该值作为pH滴定单元的原点。
室温下测得样品pH值为6.76和6.88。
样品均不呈现颗粒状或均未发现沉积物。最后的样品似乎有轻微的粘着。所有样品的口感都良好，均未检测到风味不对。
在添加了Ca(OH)2后，奶中Ca的含量有所增加：
样品1：48％
样品2：88％
所用碱量对应的乳糖到LBA的转化率为：
样品1：22.2mL对应于11％的转化率
样品2：41.15mL对应于20％的转化率
结论
本实施例说明了，只要在滴定设备中添加碱类来保持pH值恒定，则通过在乳糖转化为乳糖酸的酶氧化过程中添加Ca(OH)2就可以制备出没有口味缺点的富Ca奶。Ca在脱脂奶中的富集量可以达到88％。该量远远超过了奶饮料的正常目标值。
实施例5
目标
目标是要测试在乳糖转化为乳糖酸的乳糖氧化酶催化氧化的pH值控制中使用不同碱类的效果。
方法
在实验室规模工作体积为1.0L的生物反应器中进行实验。该反应器中装有两个Rushton搅拌器，其工作速率为1000转/分钟(RPM)。用Mettler-Toledo极谱法传感器来测量溶解氧气，通过分别控制氮气和空气的两个质量物流控制器来进行回料控制从而将溶解氧控制在44.1％(相对于38℃时与空气的饱和度)。物流总流速设定为200mL/分钟。
酶底物：1.0L水性50g/L乳糖以及50mMHPO4 2-/H2PO4 -的缓冲液
温度：38℃
pH：通过添加碱类来测定并保持恒定为6.40。
酶是M.nivale所制备的一种糖类氧化酶，其为60OXU/g的溶液。过氧化氢酶25L剂量是0.25g(来自Novozymes A/S的
)。通过监控用于pH值调节的碱含量来追踪反应速度以及反应的变化。
结果
在其他方面均相同的实验中，用了五种不同的碱类来进行中和。在所有的5个实验中，乳糖的转化率(通过加入碱量来计算)为100％。然而，总反应时间取决于所用碱的碱度，参见下表。使用如NaOH类强碱的反应时间要长于使用类似NH3或CO3 2-弱碱的反应时间。当使用NaOH时，反应速率会随着时间下降，而使用NH3或CO3 2-时则不会出现这种情况(在乳糖耗尽前)。这反映在相对于表中所给时间＝0时的残留活度。
结论
该实施例说明了使用弱碱进行中和具有很大的优点。
Claims (36)
1.一种乳糖转化为乳糖酸的酶转化工艺，其获得了增高了的产率和／或降低了的反应时间，所述工艺包含：
i）将糖类氧化酶添加到奶制品酶底物中，
ii）对所述奶制品酶底物在使得糖类氧化酶将乳糖转化为乳糖酸的条件下进行发酵，
iii）通过添加弱碱使发酵过程中的pH值保持在3.0-9.0的范围，并且因此获得了所述的增高了的产率和／或降低了的反应时间。
2.一种如权利要求1所述的工艺，进一步包含纯化乳糖酸的步骤以获得基本纯的乳糖酸产品。
3.一种如权利要求1或2所述的工艺，进一步包含在一批新料中重新利用添加到步骤i）中的糖类氧化酶。
4.一种如权利要求1所述的工艺，其中弱碱是Na2CO3或NH4OH。
5.一种如权利要求1所述的工艺，其中步骤iii)中的pH在一段时间内通过添加所述碱保持，所述一段时间足以获得这样的乳糖转化为乳糖酸的转化率，所述转化率比其中在发酵过程中不保持pH值的相当的对照工艺高至少2.5％。
6.一种如权利要求1所述的工艺，其中奶制品酶底物是奶、乳清或乳清馏分或乳糖溶液／悬浮液。
7.一种如权利要求1所述的工艺，其中糖类氧化酶是微生物糖类氧化酶。
8.一种如权利要求7所述的工艺，其中糖类氧化酶是来自Microdochium真菌属的真菌。
9.一种如权利要求7所述的工艺，其中糖类氧化酶来自真菌，所述真菌是Microdochium nivale。
10.一种如权利要求7所述的工艺，其中糖类氧化酶来自真菌，所述真菌是Microdochium nivale CBS 100236。
11.一种如权利要求1所述的工艺，其中氧化酶添加量为0.1－1000OXU／kg奶制品酶底物。
12.一种如权利要求1所述的工艺，其中氧化酶添加量为5－100OXU／kg奶制品酶底物。
13.一种如权利要求1所述的工艺，其中步骤ii）的条件选自温度、氧气添加、糖类氧化酶的类型及使用量、过氧化氢酶的类型及使用量和时间。
14.一种如权利要求13所述的工艺，温度为0℃至80℃。
15.一种如权利要求1所述的工艺，其中通过添加足量的碱类来将步骤iii）的pH值保持一段时间从而足以使得乳糖转化为乳糖酸的转化率至少比相当的对照工艺高出5％，该对照工艺的唯一区别在于在发酵过程中不通过添加足量的碱类来保持pH值。
16.一种如权利要求1所述的工艺，其中通过添加足量的碱类来将步骤iii）的pH值保持一段时间从而足以使得乳糖转化为乳糖酸的转化率至少比相当的对照工艺高出30％，该对照工艺的唯一区别在于在发酵过程中不通过添加足量的碱类来保持pH值。
17.一种如权利要求1所述的工艺，其中通过添加足量的碱类使得pH值保持在3.0至6.9或从7.1至9.0。
18.一种如权利要求1所述的工艺，其中通过添加足量的碱类使得pH值保持在5.0至6.9或从7.1至8。
19.一种如权利要求1所述的工艺，其中将pH值稳定保持一段时间至少使得发酵奶制品酶底物中氧气恢复到超过90％的起始水平。
20.一种如权利要求1所述的工艺，其中在此所述的稳定pH值保持30分钟至48小时。
21.一种如权利要求1所述的工艺，其中在工艺步骤（i）中以减少乳糖转化过程所产生的H2O2量的量加入过氧化氢酶。
22.一种如权利要求21所述的工艺，其中所添加的过氧化氢酶的量足以使得H2O2的含量至少比相当的对照工艺下降了10％，该对照工艺的唯一区别在于不加入过氧化氢酶。
23.一种如权利要求21所述的工艺，其中步骤（ii）中所需的氧气通过额外添加H2O2来获得，并且其中过氧化氢酶通过转化可用的H2O2来产生所需的氧气。
24.一种如权利要求1所述的工艺，其中可选择纯化使得组合物中含有至少30％的乳糖酸。
25.一种如权利要求24所述的工艺，其中可选择纯化使得组合物中含有至少90％的乳糖酸。
26.一种如权利要求1所述的工艺，其中该工艺中包含了含有乳酸菌的发酵液培养物并且其中可以在奶制品酶底物添加氧化酶前或后，加入发酵液培养物。
27.一种乳糖转化为乳糖酸的酶转化工艺，其获得了增高了的产率和／或降低了的反应时间，所述工艺包含：
i）将糖类氧化酶和过氧化氢酶添加到奶制品酶底物中，
ii）对所述奶制品酶底物在使得糖类氧化酶将乳糖转化为乳糖酸的条件下进行发酵，
iii）通过添加碱类物质使得pH值在发酵过程中保持稳定，并且因此获得了所述的增高了的产率和／或降低了的反应时间。
28.一种根据权利要求1或27所述的工艺，其作为食品生产工艺的一个集成部分。
29.一种如权利要求28所述的工艺，其中食品生产工艺是生产奶制品的工艺。
30.如权利要求1或27所述的工艺，其中稳定pH值是保持恒定的值，其变化量低于0.1个pH单位变化。
31.如权利要求1或27所述的工艺，其中稳定pH值是保持恒定的值，其变化量低于0.05个pH单位变化。
32.如权利要求27所述的工艺，其中：
-pH值维持在3.0至9.0；
-pH值的变化量低于0.1个pH单位变化；且
-所述碱是弱碱。
33.如权利要求1或27所述的工艺，其中所述pH值维持在6.0-6.9。
34.如权利要求27所述的工艺，其中所述pH值维持在3.0-6.9或7.1-9.0。
35.如权利要求1或27所述的工艺，其中所述pH值维持在6.3-6.9。
36.如权利要求32所述的工艺，其中，所述弱碱是Na2CO3或NH4OH。
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