JP2007535331A - ラクトビオン酸の高められた収率を得るための酵素方法 - Google Patents

ラクトビオン酸の高められた収率を得るための酵素方法 Download PDF

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Abstract

乳基質、例えばミルク、ホエー又はラクトース溶液に、ラクトースをラクトビオン酸（lactobionic acid）に転換できる炭水化物オキシダーゼを添加することを含んで成る、ラクトースのラクトビオン酸への酵素転換における高められた収率及び/又は低められた反応時間を得るための方法（前記方法のpHは、特定レベルで調節され、そして維持されている）に関する。

Description

発明の分野：
乳基質、例えばミルク、ホエー又はラクトース溶液に、ラクトースをラクトビオン酸（lactobionic acid）に転換できる炭水化物オキシダーゼを添加することを含んで成る、ラクトースのラクトビオン酸への酵素転換における高められた収率及び/又は低められた反応時間を得るための方法（前記方法のpHは、特定レベルで調節され、そして維持されている）に関する。
発明の背景：
通常乳糖として知られているラクトースは、ミルクの主要炭水化物である。ミルク基材の乳製品、例えばヨーグルト及びチーズにおいては、ラクトースは、例えばラクトース不耐性のために、及び褐変及び結晶化反応へのその関与のために低い価値の糖と見なされている。ラクトースは、ホエーにおいて75％までの合計乾燥材料を占め、そして利用できる直接的な使用のための多くの有益な経路を伴わないで、世界で毎年、約1.2百万トンの量で蓄積している。
しかしながら、ラクトースは、医学的において、又は、その甘くて酢っぱい味のために食品において有用であることが知られている化合物、すなわちラクトビオン酸（４−O−β−D−ガラクトピラノシル−D−グルコン酸）に転換され得る。ラクトビオン酸は、例えば乳製品、例えばチーズの製造の間、生成され、そして所望する官能的性質及びラクトースの低められた含有率を有する生成物を提供する。さらに、ラクトビオン酸自体及びその塩は例えば、ラクトースの酵素転換により生成され、そして特定食品において添加剤、例えば酸化防止剤、乳化剤、食品における一般的な酸味剤、ダイエットミネラルサプリメント及びチーズ製造におけるチーズ開始培養物の置換体として使用され得る。医薬産業においては、ラクトビオン酸は、例えば器官の保存のための溶液における主成分として、及び化粧産業において、一般的な皮膚ケアーのためのローション及びクリームにおける活性成分として使用される。さらに、ラクトビオン酸は、技術的な用途において、例えば洗剤における成分として使用され得る。
ラクトースの酸素転換により生成されるラクトビオン酸は、ほとんどの用途において好ましく、そしてラクトビオン酸にラクトースを転換できる炭水化物オキシダーゼ酵素は良く知られている。その反応スキームは、下記により記載され得る：
ラクトース＋O2＋H2O→ラクトビオン酸＋H2O2
ラクトビオン酸においてのCAS発録番号は、96−82−2である。
WO02/089592号（Kraft Foods）は、ミルク基材の乳製品へのラクトビオン酸の使用の多くの利点、及びミルク基材の乳製品、例えばチーズの調製の間、ラクトースのラクトビオン酸への炭水化物オキシダーゼに基づく酵素現場転換の使用の利点を記載する。
前記利点は例えば、低められたラクトース含有率を有する乳製品（例えば、ラクトースにおける低められたミルク）の調製、及び褐変に関する問題を低めたプロセスチーズ製品（例えば、ピザのための）の製造に関する。さらに、例えばチーズ製造においては、ラクトビオン酸が酸性度を進めるために使用され得る。一般的に、酸性度は、乳酸を生成するためにラクトースを代謝する乳酸菌と共にミルクを発酵することにより進められる。結果的に、ラクトビオン酸の添加により、低められた量の乳酸菌を用いて、適切な乳製品を生成することが可能である。
ラクトースのラクトビオン酸への炭水化物オキシダーゼに基づく酵素転換に関しては、WO02/089592号は、酵素が乳基質（例えば、ミルク又はホエー）に添加され、そして次に、酵素反応を達成するために適切な温度で一定の時間インキュベートされることを記載する。前記の記載は、酵素反応の間、pHを一定レベルで維持するいずれかの利点に関して、明白な教授を提供する。実際的には、pHは、ラクトビオン酸の生成のために、反応の間、低下し、そしてそれにより、乳製品を酸性化する。
WO02/089592号の例９においては、ミルクが炭水化物オキシダーゼと共に一晩インキュベートされる。pHのいずれかの調節については言及されていない。一晩のインキュベーションの後、処理されたミルクは、1.5％のラクトース及び3.2％のラクトビオン酸を含んで成り、従って、ラクトビオン酸へのラクトースの68％の転換率を提供する。
例12B）及びC)においては、ミルクが炭水化物オキシダーゼと共に55℃で48時間インキュベートされる。反応の間、pHはpH7で維持される。このpH調節についての説明はなく、そしてラクトビオン酸収率はそれらの例においては提供されていない。
WO03/037093号（Novozymes）はまた、ミルク基材の乳製品の調製方法の間、ラクトビオン酸へのラクトースの炭水化物オキシダーゼに基づく酵素転換を記載する。WO02/089592号に関しては、これはまた、酵素反応の間、一定レベルでpHを維持するいずれかの利点に関しても言及していない。唯一の特定の例は、十分な脂肪乳がオキシダーゼと共にインキュベートされ、そしてpHが4.2に達するまで、40℃で反応せしめられることを記載する。従って、そのpHは、天然の新鮮なミルクのpHは約6.6であるので、調節されなかったと思われる。
WO02/39828号（Danisco）は、炭水化物オキシダーゼ（ヘキソースオキシダーゼ）溶液がチーズと共にピザ上に噴霧され、そしてビザチーズの低い褐変（“Maillard反応”と呼ばれる）の利点が示されている方法に関する。この特許はまた、酵素反応の間、pHを一定レベルで維持するいずれの利点に関しても言及していない。
従って、当業界において、いくつかの資料は、ラクトビオン酸へのラクトースの酵素転換を包含する食品製造方法を開示する。しかしながら、上記目的及び特に、ビオン酸自体の産業的生成のために有用な改良された酵素方法が必要とされる。
発明の要約：
本発明により解決されるべき問題は、乳基質からのラクトースのラクトビオン酸への酵素転換における高められた収率及び/又は低められた反応時間を得るための方法を提供することである。前記収率は、所定の時間でラクトビオン酸に転換されるラクトースの画分として定義される。従って、本発明においては、収率は、所定の時間での“転換度”に等しい。特定の転換度が所望される情況においては、本発明は、低められた反応時間をもたらす方法を提供する。
本発明は、ラクトビオン酸中へのラクトースの炭水化物オキシダーゼに基づく酵素転換の間、pHを安定値で維持することにより、酵素転換における高い収率及び/又は低められた反応時間が達成され得る驚くべき観察に基づかれる。
従って、本発明の第１の観点は、ラクトースのラクトビオン酸への酵素転換における高められた収率及び/又は低められた反応時間を得るための方法に関し、ここで
i)乳基質に炭水化物オキシダーゼを添加し、
ii)前記炭水化物オキシダーゼによるラクトースのラクトビオン酸への転換を可能にする条件下で前記乳基質をインキュベートし、
iii)塩基の添加により、インキュベーションの間、pHを安定レベルで維持し（但し強塩基が添加される場合、前記安定レベルは7.0のpHではなく）、それにより、前記高められた収率及び/又は低められた反応時間を得ることを含んで成る。
前記方法の非常に興味ある態様においては、段階iii)において添加される塩基は弱塩基である。さらなる好ましい態様は、前記方法の段階i)において、任意にはH2O2と組合して、カタラーゼの添加を含んで成る。
本発明のさらなる重要な観点は、カタラーゼが前記方法の段階i)において添加される、上記で定義されるような方法である。ラクトビオン酸へのラクトースの酵素転換は酵素を必要とし、そしてH2O2がその転換の間、生成される。カタラーゼの添加は、その生成されるH2O2を酸素に転換する。従って、酸素供給は、カタラーゼが前記方法に導入される場合、低められ得る。
さらなる観点においては、本発明は、食品製造方法の統合された部分としての上記観点のいずれかの方法を提供する。
発明の特定の記載：
乳基質：
用語“乳基質”とは、ラクトースを含むいずれかのミルク又はミルク様製品の溶液/緩衝液、例えばホエー又は低脂肪ミルク、脱脂乳、バターミルク、コンデンスミルク、ドライミルク、ホエー、ホエー浸透物、ラクトースの結晶化からの母液、ホエータンパク質濃縮物又はいずれかの動物起源のクリームとして理解されるべきである。前記基質に存在するラクトースは必ずしも十分に溶解性である必要はなく、すなわち反応は、例えば反応温度で溶解できる内容物を超えるラクトース内容物を含む濃縮されたスラリーにおいて行われ得る。さらに、反応は、ラクトースの一部がラクターゼにより加水分解されるか又はされている乳基質において行われる。この場合、ラクトビオン酸が生成されるのみならず、またガラクツロン酸及びグルコン酸が炭水化物オキシダーゼの作用により生成されるであろう。
好ましくは、乳基質はミルクであり、そしてより好ましくは、ホエー、又はラクトース溶液/懸濁液の画分である。
用語“ミルク”とは、いずれかの哺乳類から乳を搾ることにより得られる乳汁分泌として理解されるべきである。
この後、さらに記載されるように、本発明の方法は、ラクトビオン酸の比較的大規模生成のために特に適切である。従って、本発明の好ましい態様においては、乳基質は50kg〜500,000kgの量で使用される。
ラクトビオン酸：
用語“ラクトビオン酸”がラクトビオン酸又はその塩を言及することは理解されるべきである。適切な塩は、ラクトビオン酸ナトリウム、ラクトビオン酸カルシウム、ラクトビオン酸アンモニウム及びラクトビオン酸カリウムを包含する。
pH調節のために使用される塩基は、生成されるラクトビオネートの型を調節するために選択される。pHを調節することにより生成されるラクトビオネートから、精製されたラクトビオン酸が、例えばイオン交換を用いて、カチオンの排除により得られる。さらに、カチオン、例えばカルシウムは、強酸、例えば硫酸又はリン酸による沈殿を用いて排除され得る。
炭水化物オキシダーゼ：
ラクトースをラクトビオン酸に転換できる多くの適切な炭水化物オキシダーゼは、当業者に知られており、そして入手できる。それは例えば、ヘキソースオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼであり得る。
現在好ましい炭水化物オキシダーゼは、微生物炭水化物オキシダーゼである。
適切なヘキソースオキシダーゼ（EC1.1.3.5）は、WO96/40935 号(Bioteknologisk histitut, Denmark)に記載されている。この資料は、海洋藻類種からの適切なヘキソースオキシダーゼを記載し、より特定には、前記海洋藻類種は、コンドラス・クリスパス（Chondrus crispus）、イリドフィカス・フラシダム（Iridophycus flaccidum）及びユーソラ・クリスタタ（Euthora cristata）から成る群から選択された種である。
他の適切な炭水化物オキシダーゼは、栄養胞子性ピレノマイセテス（Pyrenomycetes）、例えばアクレモニウム（Acremonium）、特にA. ストリクタム（A. strictum）、例えばATCC34717、又はT1；A. フシジオイデス（A. fusidioides）、例えばIFO6813；又はA. ポトロニ）、例えばIFO31197に由来することができる。好ましい態様においては、炭水化物オキシダーゼは、Lin, など, (1991, Biochim. Biophys. Acta 1118:41-47)及びJP-A 5-84074号により開示される源から得られる。
好ましい態様においては、炭水化物オキシダーゼは、ミクロドキウム（Microdochium）属に属する菌類から得られる炭水化物オキシダーゼであり、より好ましくは前記菌類は、ミクロドキウム・ニバレ（Microdochium nivale）であり、そしてさらにより好ましくは、前記菌類はミクロドキウム・ニバレCBS100236である。そのような好ましいオキシダーゼは、WO99/31990号（Novo Nordisk A/S）に詳細に記載されている。
使用されるべきオキシダーゼの量は一般的に、特定の必要条件及び特定の酵素に依存するのであろう。オキシダーゼ添加の量は好ましくは、特定される時間以内にラクトビオン酸へのラクトースの所望する転換度を得るために十分である。典型的には、オキシダーゼ転換は、乳基質1kg当たり約１〜10000 OXU、特に約５〜5000 OXU, 及びより特定には５〜100 OXUの範囲である。特定の乳基質の転換のために必要とされる特定酵素の量を調節することは、当業者の一般的な知識内である。
文献においては、オキシダーゼ単位（OXU）は通常、特定条件下で１分当たり１μモルのラクトースを酸化する酵素の量として定義される。しかしながら、本明細書において提供される例においては、OXUは、酵素標準に対して測定される場合、1mgの純粋なラクトースオキシダーゼ酵素として定義される。
炭水化物オキシダーゼによるラクトビオン酸へのラクトースの転換を可能にする条件下でのインキュベーション：
本発明の工程の段階i)において得られる乳基質が、炭水化物オキシダーゼによるラクトビオン酸へのラクトースの転換を可能にする条件下でインキュベートされる。そのような条件は、温度、酸素、炭水化物オキシダーゼの量及び特徴、他の添加剤、例えばカタラーゼ、及び反応/インキュベーション時間を包含するが、但しそれらだけには限定されない。明らかに、インキュベーション条件は、本発明の達成を支持するために、すなわちラクトビオン酸へのラクトースの酵素転換の高められた収率及び/又は低められた反応時間を得るために選択される。
一般的に、適切なインキュベーション時間は、興味あるラクトビオン酸へのラクトースの転換度を可能にすべきである。
酸素は、ラクトビオン酸へのラクトースの転換が酸素を消費するので、本発明においては重要な要因である。これは、本明細書における例１の表に見られ得る。従って、酸素が酵素反応の間モニターされる場合、一般的に、例えば空気が一定して供給される場合、初期レベル近くに戻るであろう、酸素量の初期低下を観察し、この場合、酵素反応は停止する。酸素が初期レベルの90％以上に戻る場合、酵素反応は終結するか、又は少なくとも有意に遅くされたことを示す。従って、適切なインキュベーション時間は好ましくは、インキュベートされた乳基質の酸素レベルが初期レベルの90％以上に戻るまで、少なくとも続く時間であり得る。これは特に、ラクトースの最大転換が所望される場合である。
本発明の特定の観点において、この後さらに記載されるように、ラクトースの酵素転換の間、カタラーゼを添加することが好ましい。カタラーゼは、いずれかの適切な時間で、例えば前記工程の段階i)において添加される。任意には、H2O2がカタラーゼと組合して添加される。
pHを一定に維持するために添加される塩基同等物の量の決定がまた、反応をモニターするために使用され得る。
一般的に、0.5時間〜３日、最も好ましくは２〜48時間の範囲の適切なインキュベーション時間が選択される。
インキュベーション温度は一般的に、使用される炭水化物オキシダーゼに依存し、そして典型的には、炭水化物オキシダーゼのための最適反応温度に従って選択される。しかしながら、酸素の溶解性は上昇する温度と共に低下するので、他の因子が、最適工程を得るために考慮されるべきである。当業者は、例えば酵素活性及び酸素溶解性に関して、最適温度をいかにして平衡化するかを知っているであろう。一般的に、適切な温度は、約0℃〜約80℃の範囲であろう。例えば5℃のような低い温度は、比較的遅い反応速度をもたらすが、しかし冷たい冷蔵された生成物に関する典型的な温度を提供する利点を有する。従って、乳製品の製造及び/又は貯蔵の間、反応を行うことが可能であろう。
酸素の適切な源は、大気空気、酸素を富化された大気空気及び純粋な酸素を包含する。１大気圧以上の圧力下での工程の実施は、酸素の溶解性を高め、そして適用できる場合いつでも好ましい。
酸素は、例えばインキュベーションの間、空気を乳基質中に連続して混合することにより、工程に供給され得る。O2を供給するためのさらなる選択は、カタラーゼの存在下でH2O2を添加することである。酸素源としてのH2O2の使用は、前記工程が、酸素の添加がより困難である固定化された酵素を用いて行われる場合、特に好ましい。
安定pHでのインキュベーション：
上記で説明されたように、本明細書に記載されるような本発明の方法の実質的な特徴は、インキュベーションの間（段階（ii））、pHが、塩基の適切な添加により、安定レベルで維持されるべきであるが、但し強塩基が使用される場合、前記安定レベルには7.0のpHではないことである。特定の態様においては、安定pHレベルは、弱塩基の添加によれば、約3.0〜約9.0又は約3.0〜6.9の範囲、及びいずれかの塩かの添加によれば、7.1〜約9.0、例えば約3.0〜6.8及び7.2〜9.0、例えば約3.0〜6.5及び7.5〜約9.0、例えば約3.0〜6.0及び8.0〜約9.0の範囲で維持される。好ましくは、インキュベーションは、唯一の比較差異が、インキュベーションの間、pHが塩基の適切な添加により維持されないことである比較対照工程におけるよりも少なくとも2.5％高い、ラクトビオン酸へのラクトースの転換度を得るのに十分である時間、行われる。
pHを維持するために塩基の添加を伴わないで比較対照工程は、本明細書に記載されるようなラクトビオン酸へのラクトースの酵素転換において収率を改良し、そして/又は反応時間を低めるための方法と同一に行われるべきである（すなわち、同一の量での同一のオキシダーゼ、同じ乳基質、同じインキュベーション時間、温度、及び酸素等の存在）。これは、対照がpHを安定して維持する陽性効果を同定するために製造されるので、本明細書に使用されるような対照の通常の理解に従ってである。
興味ある特定の方法のための好ましい安定pH値は、当業者により認識されるように、多くの要因に依存するであろう。例えば、乳基質がミルクである場合、天然のpHは約6.6であることが知られており、そして約6.6のpH例えば6.3〜6.9のpHを維持することが好ましい。前に言及されたように、ラクトビオン酸へのラクトースの従来の酵素転換は、前記工程が典型的には、最終生成物の酸性化のために使用されるので、いずれのpH調節も伴わないで実施される。工程の最終でのpHの調節は記載されており、この場合、pHは、低ラクトースミルクの製造において所望するレベル以下に低下する。従って、pHのいずれかのこれまでの調節は、最終生成物とpHを適合するためであって、そして工程自体の最適化のためではない。
ラクトビオン酸生成物、又は本発明の方法に従ってのラクトビオン酸を含んで成る組成物のpHはまた、実施される酵素転換の後又はその最終で、好ましいpHレベルに調節され得、例えば所望するラクトースの転換の95％が達成される場合、そのpHは所望するレベルに低下することができることは理解されるであろう。空気散布と組合してのpHの低下はさらに、乳基質過のCO2の漏れを可能にする。これは、カーボネートが反応の間、pH調節のために使用される場合、特に興味あるものである。
本発明においては、“安定pHレベル”とは、前記工程の間、塩基の添加により、特定の範囲内での、又は特定の値に近いか/その値でのpHの調節及び維持として広く理解されるべきである。酵素工程の間、pHの調節及び調整/維持は、非常に高い精度で行われ得る標準方法である。従って、安定pHは、0.1pH単位以下の変動、又は0.05pH単位以下の変動を有する一定レベルで維持される値であり得る。最適範囲は、本発明の特定の酵素工程のために定義され得、そしてpHは、この範囲内で記載される精度で調節され、そして維持され得る。本発明の方法においては、適切な特定のpH範囲又は特定のpH値は、約pH3〜約pH9の範囲で選択される。強塩基がpH調節のために使用される場合、特定のpH値は7.0ではない制限が存在する。
好ましくは、pHは、塩基の適切な添加により、5.5〜6.9のpH、より好ましくは6.0〜6.9のpHで維持される。
好ましくは、pHは、酵素反応の開始から、本明細書に記載されるような安定pHレベルで維持される。換言すれば、オキシダーゼが乳基質に添加されたすぐ後、塩基が本明細書に記載されるような安定pHを維持するために添加される。
特に、ラクトースの最大転換が所望される場合、pHは、インキュベートされた乳基質の酸素レベルが初期レベルの90％以上に戻るまで少なくとも続く時間、本明細書に記載されるような安定レベルで維持される。
好ましくは、pHは、30分〜48時間、より好ましくは１〜36時間、及びさらにより好ましくは２〜24時間、本明細書に記載されるような安定pHレベルで維持される。
本発明の工程においては、いずれかの塩基を用いて、前記範囲内にpHを維持することが可能である。主に、生成される酸を中和できるいずれかの物質が、前記工程に適用できるであろう。しかしながら、実質的な使用のためには、弱塩基及びカーボネートが好ましい。弱塩基の例は、CaCO3、Na2CO3, K3CO3, (NH4)2CO3及びNH4OHを包含するが、但しそれらだけには限定されない。現在好ましい弱塩基は、NH4OH及びCaCO3である。
当業者は、本発明の方法に適用され得る多くの他の塩基、例えば強塩基、例えばCa(OH)2, KOH, NaOH及びMg(OH)2を知っている。
塩基が例えばCa(OH)2又はCaCO3である場合、適切な乳基質からラクトビオン酸カルシウムを生成することが、本明細書に記載されるような方法を用いることにより可能にされる。次に、この生成物は、例えば当業界において記載されるように、乳製品添加物又は成分として使用され得る。
従って、前述のように、好ましい塩基は一般的に、最終製品の所望する鉱物組成物に関する塩基であろう。特定の態様においては、カルシウムに富んだミルクを生成することが所望される。この場合、好ましい塩基は、カーボネートが味覚に対する所望しない影響のために適切でないので、Ca(OH)2である（例４）。
用語“弱”対“強”塩基とは、解離する塩基の能力を言及する。本発明においては、弱塩基は、少なくとも3.5のpKb−値を有する塩基として定義される（CO3 2-のような二酸塩基の場合、このpKb−値は第１段階を言及する）。
好ましくは、インキュベーションの間（段階（ii）、pHは、唯一の比較差異が、インキュベーションの間、pHが塩基の適切な添加により維持されていないものである比較対照工程におけるよりも少なくとも５％高い、より好ましくは少なくとも15％高い、さらにより好ましくは少なくとも30％高い、及び最も好ましくは少なくとも45％高い、ラクトビオン酸へのラクトースの転換度を得るために十分な時間、塩基の適切な添加により維持される。
例示に関して、本明細書における例１及び2においては、対照のラクトビオン酸へのラクトースの転換度は41％であり、そして５〜６の範囲でpHを維持することにより、転換度は90％に高められる。さらに、例５に示されるように、弱塩基（例えば、0.5MのNa2CO3）の使用は、pHが強塩基（1MのNaOH）の添加により維持される類似する方法に比較して、反応時間を24％低めたことが驚くべきことには見出された。従って、強塩基の代わりに弱塩基の使用は、本発明の方法の反応時間を低める。作用時間は、少なくとも５％、例えば少なくとも25％、少なくとも50％、又はさらに少なくとも80％、低められ得る。
さらに、例５に示されるように、100％に近い残留酵素活性は、転換工程が終結された後、見出された。これは、例えば膜濾過により酵素を回収することにより、新しいバッチにおける酵素の再使用の可能性についての選択を提供する。
本発明の特定の観点においては、ラクトビオン酸へのラクトースの酵素転換における高められた収率及び/又は低められた反応時間を得るための方法は、
i)乳基質に炭水化物オキシダーゼを添加し、
ii)前記炭水化物オキシダーゼによるラクトースのラクトビオン酸への転換を可能にする条件下で前記乳基質をインキュベートし、
iii)インキュベーションの間、pHを、弱塩基（A）の添加により約3.0〜約9.0の範囲で、又はいずれかの塩基（B）を用いて、約3.0〜6.0及び7.1〜約9.0の範囲で維持し、そしてそれにより、前記高められた収率及び/又は低められた反応時間を得る段階により定義される。
従って、上記の記載及び本明細書に提供される例から明らかなように、本発明は、本発明の方法を定義する特徴がラクトビオン酸の経済的生成を可能するので、ラクトビオン酸へのラクトースの産業的転換において価値ある寄与である。種々の変更、修飾及び適合が本発明の開示に基づかれ、そして本発明の範囲内で意図されることは理解されている。
明らかに、開示されている方法は、ラクトビオン酸自体の産業的生成のための製造方法の一部を生成できる。
ラクトビオン酸の精製：
任意には、所望する程度のラクトビオン酸純度を有するラクトビオン酸を含んで成るラクトビオン酸生成物又は組成物を得るために、いずれかの適切な手段でラクトビオン酸を精製することは可能である。
当業者は、いかにして精製を実施するかを知っており、そして興味ある特定の必要性に依存して、少なくとも30％のラクトビオン酸、少なくとも90％のラクトビオン酸、又はさらに95％又は99％のラクトビオン酸を含んで成る組成物が得られる。
ラクトビオン酸の精製のための適切な方法は、濾過、イオン交換、濃縮及び乾燥を包含する。
ラクトビオン酸を含んで成る組成物は、例えば食品添加物又は食品成分として、食品の製造に使用され得る。さらに、組成物は、前述のように他の用途にも使用され得る。
乳酸菌を含んで成る開始培養物：
一般的に、特定の要素又は成分が、特定の必要に応じて、本明細書に記載されるような方法に包含され得る。当業者は、必要とされるそのような多くの特別の要素又は成分を知っている。
好ましい態様においては、乳酸菌を含んで成る開始培養物が、本明細書に記載されるような方法に包含される。開始培養物は、オキシダーゼ、任意にはカタラーゼが基質に添加される前又は後、乳基質に添加され得る。これは、興味ある特定の発酵プロフィールに依存するであろう。
用語“乳酸菌”とは、糖の乳酸発酵を実施する、グラム陽性の非胞子性細菌類を本明細書において示す。
他の中で、それは、ラクトバシラス（Lactobacillus)属に属する乳酸菌、例えばL. ヘルベチカス（L. helveticus）、L. デルブルキsubsp. ブルガリカス（L. delbruckii subsp. bulgaricus）、等、ラクトコーカス（Lactococcus）属に属する乳酸菌、例えばL.ラクチス（L. lactis）、ストレプトコーカス（Streptococcus）属に属する乳酸菌、例えばS. サリバリウス（S. salivarius）、レウコノストク（Leuconostoc）属に属する乳酸菌、例えばL. レクチス（L. lactis）、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する乳酸菌、例えばB. ロングニ（B. longuni）又はB. ブレブ（B. breve）、及びペジオコーカス（Pediococcus）属に属する乳酸菌の種を包含する。
乳酸菌は、他の微生物、例えば酵母との混合物として使用され得る。
カタラーゼ：
カララーゼは、次の反応を触媒する酵素である：2H2O2→O2＋2H2O. EC番号は、EC 1.11.1.6である。
例３に示されるように、カタラーゼの使用は、ラクトビオン酸へのラクトースの転換度を有意に改良する。さらに、カタラーゼの使用は、ラクトビオン酸へのラクトースの転換の間に生成されるH2O2の量を低める。
従って、本発明の好ましい態様においては、カタラーゼは、本発明の方法に添加される。
上記のように、炭水化物オキシダーゼがラクトースをラクトビオン酸に転換する場合、H2O2が生成される。その反応スキームは、次の通りに記載される：
ラクトース＋O2＋H2O→ラクトビオン酸＋H2O
カタラーゼは、炭水化物オキシダーゼがラクトビオン酸を生成するために反応した後、添加され得る。しかしながら、好ましくはカタラーゼは、前記工程の段階（i）において炭水化物オキシダーゼと一緒に添加される。前記工程の段階（i）における炭水化物オキシダーゼと一緒にカタラーゼを添加する利点は、酸素必要性が有意に低められ得る（50％まで）ことである。従って、例えば空気の形での酸素の供給が有意に低められ得る。実際、H2O2と共に適切な量のカタラーゼを添加する場合、例えば空気の形で特別の酸素を供給する必要はない。この特別な添加されるH2O2は、いずれかの市販源にも起因する。
従って、好ましい態様は、前記方法の段階（ii）における必要とされる実質的にすべての酸素がH2O2の特別な添加により得られ、そしてカタラーゼが利用できるH2O2の転換によりその必要とされる酸素を生成することである。
本発明においては、表現“実質的にすべての酸素”とは、適切に作用する酵素反応のために必要とされる酸素供給を記載するために使用され、そして特に、インキュベーション段階の間、例えばインキュベーション下で乳基質中に空気を連続的に混合することにより、特別な酸素を活動的に添加する必要はないことを記載するために使用される。
好ましい態様は、インキュベーションの間、pHが、唯一の比較差異が、インキュベーションの間、pHが塩基の適切な添加により維持されていないものである比較対照工程におけるよりも少なくとも2.5％高いラクトビオン酸へのラクトースの転換度を得るために十分な時間、塩基の適切な添加により維持されることである。
好ましい態様においては、本発明の段階（i）におけるカタラーゼは、触媒が添加されない類似する方法に比較して、H2O2の濃度を低める量で添加される。
好ましくは、カタラーゼは、ラクトビオン酸へのラクトースの転換度を改良する量で添加される。
多くの適切なカタラーゼが当業者に知られている。例えば、市販のカタラーゼCatazyme（商標）は、Novozymes A/Sから入手できる。
本明細書に記載されるような方法に添加されるカタラーゼの量は一般的に、最終生成物において所望されるH2O2の量に依存するであろう。従って、興味ある特定の乳製品に依存して、特に乳製品がミルクである場合、本明細書に記載されるような方法に添加されるカタラーゼの量は、唯一の比較差異がカタラーゼが添加されていないことである比較対照工程に比較して、H2O2の量において少なくとも10％の低下を得るために十分である量で存在する。
より好ましくは、本明細書に記載されるような方法に添加されるカタラーゼの量は、唯一の比較差異がカタラーゼが添加されていないことである比較対照工程に比較して、H2O2の量において少なくとも25％の低下を得るために十分である量で存在し、さらにより好ましくは、本明細書に記載されるような方法に添加されるカタラーゼの量は、唯一の比較差異がカタラーゼが添加されていないことである比較対照工程に比較して、H2O2の量において少なくとも75％の低下を得るために十分である量で存在する。
比較対照工程は、カタラーゼの非添加を除いて、本明細書に記載されるようなラクトビオン酸を改良するための方法と同一に実施されるべきである（同じ量での同じオキシダーゼ、同じ乳基質、同じインキュベーション温度、酸素の存在及び塩基の添加、等）。これは、対照がカタラーゼの添加の陽性効果を同定するために製造されるので、本明細書において使用されるような対照の通常の理解に従ってである。
本発明の別の観点は、ラクトースのラクトビオン酸への酵素転換における高められた収率及び/又は低められた反応時間を得るための方法に関し、ここで前記方法は、
i)乳基質に炭水化物オキシダーゼ及びカタラーゼを添加し、
ii)前記炭水化物オキシダーゼによるラクトースのラクトビオン酸への転換を可能にする条件下で前記乳基質をインキュベートし、
iii)塩基の添加により、インキュベーションの間、pHを安定レベルで維持し、それにより、前記高められた収率及び/又は低められた反応時間を得ることを含んで成る。
本発明の第１の観点に関して、本明細書に記載されるようなすべての態様はまた、本発明のこの別の観点の方法に関して好ましい態様である。
乳製品製造方法：
上記のように、本発明のいずれかの観点の方法は、いずれか他の方法、例えば食品製造方法、例えばラクトビオン酸へのラクトースの転換が所望される、乳製品の製造方法の離統合された一部であり得る。従って、最終食品が、本発明の方法を用いて得られる。さらに、本発明の方法に従って、生成されるラクトビオン酸を含んで成る組成物は、例えば乳製品の製造に使用され得る。当業者は、ラクトビオン酸自体、及びラクトビオン酸を含んで成る組成物の適切な使用について知っており、そして上記で論じられた従来技術の出版物及び発明の背景に言及される用途は言及されている。従って、ラクトビオン酸を含んで成る組成物又はラクトビオン酸生成物自体が本発明の方法により得られると、その組成物又は生成物は、いずれかの適切な手段で使用され得る。
用語“乳製品”とは、上記で定義されるように、乳基質を含むいずれかの乳製品として理解されるべきである。本発明のために適用できる乳製品の例は、ヨーグルト、ミルク、例えばカルシウム強化されたミルク、及びチーズ、例えばプロセスチーズ（例えば、ピザのための）、クリームチーズ及びコッテージチーズのような製品である。
本発明の前記観点の方法に関して、本明細書に記載されるようなすべての態様はまた、本発明のこの観点の方法に関しての好ましい態様でもある。
本発明の方法の観点及び態様を一般的に記載して来たが、本発明は現在、特定の例を用いて記載されるであろう。例はさらに、本発明の種々の特徴及び利点を例示するが、しかしそれらは本発明の範囲を制限するためのものではない。
例１：
実験を、６％ホエー浸透粉末（EPI, Franceからの）から成る基質溶液400kgにより、大規模試験で行なった。温度を49℃に調節した。400Lの溶液において40000 OXUに対応する炭水化物オキシダーゼ酵素用量（＝1250gの酵素溶液）を使用した。酵素は、特許出願WO9931990号に記載されるように、ミクロドキウム・ニバレ（Microdochium nivale）から達成された。文献においては、オキシダーゼ単位（0XU）は通常、特定組の条件下で１分当たり1μモルのラクトースを酸化する酵素の量として定義される。しかしながら、この例においては、1 OXUとは、酵素標準に対して測定される場合、1mgの純粋なラクトースオキシダーゼ酵素として定義される。
反応を、溶液のpH及び酸素状態をモニターすることにより追跡した。空気を、ポンプ乱流（Landiaポンプ5.5kWk）を用いてのタンクへの基質の再循環により基質と混合した。
酸素が90％以上に戻った場合、反応を終結し、そして生成物を、酵素不活性化のために85℃に加熱した。サンプルを、反応の間、採取し、そして酵素の不活性化のために85℃に加熱した。
酵素添加の前の基質溶液のpHは6.52であった。反応の終結（5時間の反応時間）の後、pHは3.62に低下した。基質における酸素含有率は、時間0で5.82mg/lであり、そして酵素添加の後、5分以内に0.5mg/lに低下した。試験からのデータは、下記の表に見られる。
Figure 2007535331
 ラクトビオン酸のラクトースの転換度は41％であった。
例２：
833g（26700 OXUに対応する）の炭水化物オキシダーゼを、例１に記載される基質に類似する基質166kgに添加した。使用されるオキシダーゼは、例１におけるのと同じであった。pHは、5NのNaOH溶液の添加により５〜６の範囲で維持された。酸素レベルが初期レベルに戻った場合（５時間後）、合計量3910mlの５NのNaOHを、pH 調節のために使用した。この量は、下記反応スキームに従って、ラクトビオネートへの90％以上のラクトースの転換に対応する：
ラクトース＋O2＋H2O→ラクトビオン酸＋H2O2
ここでNaOHが形成される酸を平衡化する。
例３：
441g（14100 OXUに対応する）の炭水化物オキシダーゼ溶液及び39gのカタラーゼ25Lを、例1に記載される基質に類似する基質166kgに添加した。使用されるオキシダーゼは、例１におけるのと同じであった。カタラーゼは、Novozymes A/SからのCatazyme（商標）であった。pHは、5NのNaOH溶液の添加により５〜６の範囲に維持された。酸素レベルが初期レベルン戻った場合（４時間40分後）、合計量4860gの5NのNaOHを、pH調節のために使用した。この量は、ラクトビオン酸への100％のラクトースの転換に対応する。
例４：
目的：
この目的は、Ca(OH)2添加によりpHを一定に維持することにより、ミルクにおけるラクトースオキシダーゼ触媒反応によるCa強化されたミルクの製造の概念を試験することであった。サンプルを、異なった塩基添加で採取し、そしてミルクを熱処理し、そして評価した（味覚及び安定性）。
方法：
基質脱脂乳1.5kg。温度50℃。新鮮な空気を、撹拌された基質の表面上にフラッシュした。酵素は、M. ニバレからの炭水化物オキシダーゼ調製物であった。用量、0.085 OXU/g溶液＝3.98gの酵素溶液。使用されるオキシダーゼは、例１におけるのと同じであった。カタラーゼ25Lの用量は0.5gであった（Novozymes A/SからのCatazyme（商標））。オキシダーゼ及びカタラーゼを、基質に添加し、そして下記のようにしてインキュベートした。pHを、1NのCa(OH)2の添加により一定に維持した。100mlのサンプルを、22.2ml及び41.15mlの塩基消費の後、採取し、そして85℃で15分間、熱処理した。冷却の後、サンプルを、味覚及び安定性について評価した。
結果：
脱脂乳におけるpHは50℃で6.65であり、これを、pH滴定ユニットにおいて整定値として使用し、サンプルにおけるpHは、室温で測定される場合、6.76及び6.88であった。いずれのサンプルも粒状ではなく、又は沈殿のいずれの徴候も依存しなかった。最後のサンプルは、わずかにより粘性のように思えた。味覚は、両サンプルにおいて良好であり、そして異風味は検出されなかった。
Ca(OH)2添加の後のミルク中のCaレベルは次のように増加した：
サンプル１：48％
サンプル２：88％
使用される塩基の量から評価される、LBAへのラクトースの転換度は次の通りであった。
サンプル１：22.2mlは、11％の転換率に対応する。
サンプル２：41.15mlは、20％の転換率に対応する。
結論：
この例は、味学的欠点を有さないCa強化されたミルクが、塩基の添加が、pHを一定に維持する滴定装置において行われる限り、ラクトビオン酸へのラクトースの酵素酸化の間、Ca(OH)2の添加により生成され得ることを示す。脱脂乳における88％までのCa富化が得られた。このレベルは、ミルク飲料において通常目的とするレベルをはるかに越える。
例５：
目的；
この目的は、ラクトビオン酸へのラクトースのラクトースオキシダーゼ触媒された酸化の間、pH調節のために異なった塩基を用いることの効果を試験することであった。
方法：
実験を、1.0Lの体積を有する実験規模のバイオリアクターにおいて行った。反応器は、１分当たり1,000回転（RPM）で作用する２個のRushtonタービンを備えた。溶解された酸素を、Mettler-Taledoポーラログラフセンサーにより測定し、そしてそれぞれ窒素及び空気を分配する２種の多量流コンとロオーラーのフィードバック調節により、44.1％（38℃で空気による飽和に対する）で調節した。合計流速は、200ml/分に設定された。
基質：50g/lの水性ラクトース及び50mMのHPO4 2-/H2PO4 -緩衝液（1.0L）。
温度：38℃。
pH：測定し、そして塩基の添加により6.40で一定に維持した。
使用される酵素は、M. ニバレからの炭水化物オキシダーゼ調製物であり、用量は60OXU/Lの溶液であった。カタラーゼ25Lの用量は、0.25gであった（Novozymes A/SからのCatazyme（商標））。反応速度及び従って、反応の進行を、pH調節のために使用される塩基の量をモニターすることにより追跡した。
結果：
５種の異なった塩基を、すべての他の観点において同一である実験において中和のために使用した。すべての５種の場合、ラクトースの転換率（塩基添加により計算された）は100％であった。しかしながら、合計の反応時間は、使用される塩基のアルカリ度に依存した（下記表を参照のこと）。NaOHのような強塩基を用いる場合、反応時間は、NH3又はCO3 2-のような弱塩基が使用される場合よりも長かった。反応速度は、NaOHが使用される場合、時間と共に遅くなり、ところが、これは、NH3又はCO3 2-が使用される場合（ラクトースが消耗される前）、そうではなかった。これは、下記表に与えられる、時間＝0での活性に対する残留活性において表される。
Figure 2007535331
結論：
この例は、中和のために弱塩基を使用することが非常に好都合であることを示す。

Claims (26)

  1. ラクトースのラクトビオン酸（lactobionic acid）への酵素転換における高められた収率及び/又は低められた反応時間を得るための方法であって、
    i)乳基質に炭水化物オキシダーゼを添加し、
    ii)前記炭水化物オキシダーゼによるラクトースのラクトビオン酸への転換を可能にする条件下で前記乳基質をインキュベートし、
    iii)塩基の添加により、インキュベーションの間、pHを安定レベルで維持し（但し強塩基が添加される場合、前記安定レベルは7.0のpHではなく）、それにより、前記高められた収率及び/又は低められた反応時間を得ることを含んで成る方法。
  2. 実質的に純粋なラクトビオン酸生成物を得るために前記ラクトビオン酸を精製する段階をさらに含んで成る請求項１記載の方法。
  3. 新たなバッチのために段階i)において添加される炭水化物オキシダーゼを再使用する段階をさらに含んで成る請求項１又は２記載の方法。
  4. 前記塩基が弱塩基である請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
  5. 前記弱塩基が、Na2CO3又はNH4OHである請求項４記載の方法。
  6. 前記乳基質がミルクであり、そして前記塩基がCaOH2である請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
  7. 段階iii)におけるpHが、pHがインキュベーションの間、維持されていない比較対照工程におけるよりも少なくとも2.5％高い、ラクトビオン酸へのラクトースの転換度を得るために十分である時間、前記塩基を添加することにより維持される請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
  8. 前記乳基質がミルク、ホエー又はホエーの画分、又はラクトース溶液/懸濁液である請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
  9. 前記炭水化物オキシダーゼが、微生物炭水化物オキシダーゼである請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
  10. 前記炭水化物オキシダーゼが、ミクロドキウム（Microdochium）属に属する菌類から得られる炭水化物オキシダーゼであり、より好ましくは前記菌類は、ミクロドキウム・ニバレ（Microdochium nivale）であり、そしてさらにより好ましくは、前記菌類はミクロドキウム・ニバレCBS100236である請求項９記載の方法。
  11. 使用されるオキシダーゼの量が、乳基質1kg当たり0.1〜1000 OXU（オキシダーゼ単位）、より好ましくは１〜500 OXU, 及びさらにより好ましくは５〜100 OXUの範囲である請求項１〜10のいずれか１項記載の方法。
  12. 前記段階ii)における条件が、温度、酸素の添加、炭水化物オキシダーゼの量及び型、カタラーゼの量及び型、及び時間から成る群から選択される請求項１〜11のいずれか１項記載の方法。
  13. 前記温度が、０℃〜80℃の範囲である請求項12記載の方法。
  14. 段階iii)におけるpHが、唯一の比較差異が、インキュベーションの間、pHが塩基の適切な添加により維持されていないものである比較対照工程におけるよりも少なくとも５％高い、より好ましくは少なくとも15％高い、さらにより好ましくは少なくとも30％高い、及び最も好ましくは少なくとも45％高い、ラクトビオン酸へのラクトースの転換度を得るために十分な時間、塩基の適切な添加により維持される請求項１〜13のいずれか１項記載の方法。
  15. 前記pHが、塩基の適切な添加により、約3.0〜6.9のpH、及び7.1〜約9.0のpH、より好ましくは５〜6.9のpH及び7.1〜8のpHで維持される請求項１〜14のいずれか１項記載の方法。
  16. 前記pHが、酵素反応の開始から安定pHで維持され、所望する転換の95％が達成される場合、pHが所望するレベルに低められる請求項１〜15のいずれか１項記載の方法。
  17. pHが、インキュベートされた乳基質の酸素レベルが初期レベルの90％以上に戻るまで、少なくとも続く時間、安定pHレベルで維持される請求項１〜16のいずれか１項記載の方法。
  18. pHが、30分〜48時間、より好ましくは１〜36時間及びさらにより好ましくは２〜24時間、本明細書に記載されるような安定pHレベルで維持される請求項１〜17のいずれか１項記載の方法。
  19. カタラーゼが、前記工程の段階i）において、ラクトースの転換の間に生成されるH2O2の量を低める量で添加される請求項１〜18のいずれか１項記載の方法。
  20. 添加されるカタラーゼの前記量が、唯一の比較差異がカタラーゼが添加されない差異である対照工程に比較して、H2O2の濃度の少なくとも10％の低下を得るために十分な量で存在する請求項19記載の方法。
  21. 段階ii）において必要とされる酸素の適切な量の実質的にすべてが、適切な量のH2O2の追加の添加により得られ、そして前記カタラーゼが利用できるH2O2から必要とされる酸素を生成する請求項19又は20記載の方法。
  22. 任意の精製が、少なくとも30％のラクトビオン酸又は少なくとも90％のラクトビオン酸を含んで成る組成物をもたらす請求項１〜21のいずれか１項記載の方法。
  23. 乳酸菌を含んで成る開始培養物が前記工程に包含され、そして前記開始培養物が、オキシダーゼが添加される前又は後、乳基質に添加され得る請求項１〜22のいずれか１項記載の方法。
  24. ラクトースのラクトビオン酸への酵素転換における高められた収率及び/又は低められた反応時間を得るための方法であって、
    i)乳基質に炭水化物オキシダーゼ及びカタラーゼを添加し、
    ii)前記炭水化物オキシダーゼによるラクトースのラクトビオン酸への転換を可能にする条件下で前記乳基質をインキュベートし、
    iii)塩基の添加により、インキュベーションの間、pHを安定レベルで維持し、それにより、前記高められた収率及び/又は低められた反応時間を得ることを含んで成る方法。
  25. 食品製造工程の統合された部分としての請求項１〜24のいずれか１項記載の方法。
  26. 前記食品製造工程が、乳製品、例えばヨーグルト、ミルク、例えばカルシウム強化されたミルク、及びチーズ、例えばプロセスチーズ（例えば、ピザのための）、クリームチーズ及びコッテージチーズの製造工程である請求項24記載の方法。
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