CN104322666A - 产生乳制品的方法 - Google Patents

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汉恩.V.亨里克森
斯蒂芬.厄恩斯特
莱因哈德.威尔廷
杰普.W.塔姆斯
梅特.O.朗格
赫勒.S.古尔达格
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Novo Nordisk AS
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Abstract

本发明涉及使用具有乳糖酶活性的酶产生乳制品的方法。

Description

产生乳制品的方法
本申请是申请日为2008年12月2日，申请号为“200880125837.1”(国际申请号为“PCT/EP2008/066624”)，名称为“产生乳制品的方法”的发明专利申请的分案申请。
涉及序列表
本申请包含序列表。
技术领域
本申请涉及使用具有乳糖酶活性的酶产生乳制品的方法。
发明背景
乳糖耐受性可能是美国和世界上其它地区最广为人知的食物敏感性。据估计，世界人群中约70％具有遗传控制的受限的消化乳糖的能力。因此，为了帮助不能消化乳品的人食用乳制食品，对于不包含乳糖或只包含较低水平乳糖的乳制食品的需要一直在增长。
乳糖酶在商业上用于分解乳中的乳糖以产生乳制品，该乳制品适合于乳糖不耐受的人们和/或具有更甜的口味。因为葡萄糖和半乳糖比乳糖更甜，所以乳糖酶产生的口味更好。乳糖酶也用于冰激凌的生产中。乳糖在冰激凌的低温结晶，而葡萄糖和半乳糖保持为液体并使质地更光滑。乳糖酶也用于将乳清变成糖浆转化中。乳糖酶也用于生产炼乳(condensed milk)。
已经从各种生物体，包括微生物中分离到了乳糖酶。乳糖酶经常是微生物如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)和芽孢杆菌属(Bacillus)的胞内成分。克鲁维酵母，特别是脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)，和其它真菌如念珠菌属(Candida)、圆酵母属(Torula)和球拟酵母属(Torulopsis)的真菌，是真菌乳糖酶的通常来源，而凝结芽孢杆菌(B.coagulans)和环状芽孢杆菌(B.circulans)是细菌乳糖酶的公知来源。提供源自这些生物体的几种商业乳糖酶制备物，如(可由Novozymes,Denmark获得)，HA-乳糖酶(可由Chr.Hansen,Denmark获得)和(可由DSM,the Netherlands获得)，其全部来自乳酸克鲁维酵母。所有这些乳糖酶也称作中性乳糖酶，其最适pH为pH 6-pH 8。当在例如低乳糖酸奶的生产中使用这种乳糖酶时，必须在发酵前在单独的步骤中进行酶处理，或者必须使用高酶剂量，因为它们的活性在发酵过程中随pH下降而下降。此外，这些乳糖酶不适于在高温进行的乳中乳糖的水解，在某些情况下这对于保持低的微生物计数有益，并且因此确保良好的乳品质。
已经描述了几种最适pH更低的胞外乳糖酶，参见，例如，美国专利5,736,374描述了这种乳糖酶的实例，所述酶由米曲霉(Aspergillus oryzae)产生。
已经描述了具有高转半乳糖基活性的来自双歧双歧杆菌(Bifidobacteriumbifidum)的乳糖酶，全长形式的和特别是从C-末端截短的(参见，例如，等(2001),Appl.Microbiol.Biotechnol.,57:647-652或EP专利1,283,876)。
本发明的一个目的是提供通过使用乳糖酶产生具有低乳糖水平的乳制品的方法，例如发酵乳制品，如酸奶。另一个目的是提供通过使用乳糖酶产生低乳糖饮料乳的方法，其中与已知方法相比，所述方法形成的异味(off-flavour)和/或棕色(brown color)较少。根据本发明待使用的乳糖酶应有效地水解乳糖，并且任选地允许几乎完全水解乳糖。特别地，这种乳糖酶应具有高的乳糖酶对转半乳糖基酶活性的比例。为了用于发酵乳制品的生产，乳糖酶应在宽的pH范围内有活性。
发明概述
本发明的发明人令人惊讶地发现，来自双歧双歧杆菌的胞外乳糖酶的C-末端截短片段，其由于能由乳糖得到大量半乳寡糖(galactooligosaccharides)的能力而最初得到分离并请求专利保护，它能非常成功地用于水解乳中的乳糖。当在37℃在水+100g/l乳糖中测试时，如现有技术所述，酶高效地产生半乳寡糖。然而，当在乳中测试时，水解活性与转半乳糖基活性的比例显著变化，导致有效水解并产生非常低水平的半乳寡糖。
因此，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:1的氨基酸28-1931或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
在一个优选的方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1331至少70％相同的氨基酸序列。
此外，发明人令人惊讶地发现在使用来自双歧双歧杆菌的乳糖酶时，与常用于乳处理的其它乳糖酶相比，可以获得非常低水平的乳糖。使用来自双歧双歧杆菌的乳糖酶的另一个令人预料不到的优势是酶在高温有活性，允许在，例如52℃，处理乳，由此减少微生物技术并从而改进乳的质量。
因此，在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
其中步骤b)在至少50℃进行。
在一个优选的实施方案中，步骤b)在至少52℃进行。
此外，发明人令人惊讶地发现，来自双歧双歧杆菌的乳糖酶在宽的pH范围内有活性。
因此，在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基的底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中乳糖酶活性在37℃的最适pH为pH 5以上，并且在37℃测定时，其中酶在pH 5的乳糖酶活性是其在pH 6的乳糖酶活性的至少50％。
使用在宽的pH范围内有活性的乳糖酶对于发酵乳制品的产生特别有用，其中其允许低酶剂量，因为酶在发酵过程中和之后仍有活性。此外，可以使用这种酶达到发酵乳制品中非常低水平的乳糖。
因此，在一个优选的方面，本发明涉及用于产生低乳糖的发酵乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物，
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中乳糖酶活性在37℃的最适pH为pH 5以上，并且在37℃测定时，其中酶在pH 5的乳糖酶活性时是在pH 6的乳糖酶活性的至少50％，和
c)用微生物发酵所述底物。
本发明的发明人还令人惊讶地发现，在货架期(shelf life)延长的低乳糖饮料乳的生产中，乳糖水解优选在高温进行，如在至少60℃的温度。优选地，这种生产可以包括同时的低巴氏灭菌和乳糖酶处理。因此，在一个优选的方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物，和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
其中步骤b)在62℃-64℃的温度进行10分钟-4小时。
在一个更优选的方面，所述方法中的步骤b)之后为冷却至10℃以下而不进行进一步的热处理。这允许酶在乳冷却后(即，在保存期间)仍然有活性。在另一个更优选的方面，所述方法中的步骤b)之后为UHT处理。
优选地，在本发明的方法中，乳基底物中至少70％的乳糖被水解。更优选地，乳基底物中至少80％，如至少85％，至少90％，至少95％或至少98％的乳糖被水解。
在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:3或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:4或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:5或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:6或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:7或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
具体地，本发明涉及如下各项：
1.用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1331至少70％相同的氨基酸序列。
2.用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:1的氨基酸28-1931或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
3.用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:3-4中任一序列或这些序列中任一个的片段至少70％相同的氨基酸序列。
4.前述项中任一项的方法，其中所述酶源自双歧杆菌属(Bifidobacterium)的微生物。
5.用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:5-7中任一序列或这些序列中任一个的片段至少70％相同的氨基酸序列。
6.前述项中任一项的方法，其中在37℃乳糖酶活性的最适pH为pH 5以上，并且其中在37℃测定时，酶在pH 5的乳糖酶活性为在pH 6时其乳糖酶活性的至少50％。
7.用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中在37℃乳糖酶活性的最适pH为pH 5以上，并且其中在37℃测定时，酶在pH 5的乳糖酶活性为在pH 6时其乳糖酶活性的至少50％。
8.前述项中任一项的方法，其中步骤b)在至少50℃的温度进行。
9.用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
其中步骤b)在至少50℃的温度进行。
10.前述项中任一项的方法，其中在pH 6.5测定时，酶在52℃的温度的乳糖酶活性是其在38℃的温度的乳糖酶活性的至少70％。
11.前述项中任一项的方法，其中向乳基底物以所述乳基底物中小于30LAU每g乳糖的浓度加入酶。
12.前述项中任一项的方法，其中向乳基底物以小于1000LAU每升乳基底物的浓度加入酶。
13.前述项中任一项的方法，其中在水解乳基底物中的乳糖时，所述酶的乳糖酶与转半乳糖基酶的活性比例大于1:1。
14.前述项中任一项的方法，其进一步包括如下步骤
c)用微生物发酵所述底物，
其中所述乳制品是发酵乳制品。
15.项14的方法，其中所述发酵的乳制品是酸奶。
16.项14-15中任一项的方法，其中步骤b)和步骤c)基本上同时进行。
17.项14-16中任一项的方法，其中步骤b)的酶和步骤c)的微生物基本上同时加入所述乳基底物。
18.项14-17中任一项的方法，其中在发酵两小时后少于80％的乳糖已被水解，并且其中在最终的发酵乳制品中多于90％的乳糖已被水解。
19.项14-18中任一项的方法，其中在步骤c)完成时少于80％的乳糖已被水解，并且其中在最终的发酵乳制品中多于90％的乳糖已被水解。
20.项1-13中任一项的方法，其中步骤b)在至少60℃的温度进行。
21.项20的方法，其中所述乳基底物是生乳，其在步骤b)前未进行巴氏灭菌。
22.项20-21中任一项的方法，其中步骤b)在62℃-64℃的温度进行10分钟-4小时，并且其中步骤b)之后为冷却至10℃以下而不进一步加热处理。
23.项20-22中任一项的方法，其中在步骤b)完成时少于80％的乳糖已被水解，并且其中在一周后多于90％的乳糖已被水解。
24.项20-21中任一项的方法，其中步骤b)在62℃-64℃的温度进行10分钟-4小时，并且其中步骤b)之后为UHT处理。
发明详述
乳基底物
术语“乳”，在本发明的背景中，应理解为对任何哺乳动物如牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼挤奶而获得的乳状分泌物。
在本发明的上下文中，“乳基底物”可以是任何生的和/或加工的乳材料。有用的乳基底物包括，但不限于包含乳糖的任何乳或乳样产品的溶液/悬浮液，如全脂或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉(reconstituted milk powder)、炼乳、干乳的溶液(solutions of dried milk)、UHT乳、乳清、乳清渗透液(wheypermeate)、酸性乳清(acid whey)或乳脂(cream)。
优选地，乳基底物是乳或脱脂乳粉的水溶液。
乳基底物可以比生乳更浓缩的。
在一个实施方案中，乳基底物中蛋白质与乳糖的比例为至少0.2，优选至少0.3，至少0.4，至少0.5，至少0.6或者，最优选地，至少0.7。
乳基底物可以根据本领域公知的方法均质化和巴氏灭菌。
“均质化”在本文使用时表示充分混合以获得可溶的悬浮液或乳液。可以进行均质化而将乳脂分解成更小的尺寸，使其不再与乳分离。这可以通过迫使乳在高压通过小孔而完成。
“巴氏灭菌”在本文使用时表示减少或消除乳基底物中活生物体(如微生物)的存在。优选地，通过将特定温度保持特定时间而获得巴氏灭菌。通常通过加热而获得特定的温度。可以选择温度和持续时间，从而杀死或失活某些细菌，如有害的细菌，和/或失活乳中的酶。然后可以进行快速冷却步骤。
乳制品
在本发明的上下文中，“乳制品”可以是任何食品，其中主要成分之一为乳基成分。优选地，主要成分为乳基成分。更优选地，主要成分是乳基底物，其已经根据本发明的方法用具有乳糖酶活性的酶处理。在本发明的上下文中，“主要成分之一”表示该成分具有占乳制品总干物质的超过20％，优选超过30％或超过40％的干物质，而“主要成分”表示构成该成分具有占乳制品总干物质的超过50％，优选超过60％或超过70％的干物质。
根据本发明的乳制品可以是，例如，脱脂乳、低脂乳、全脂乳、乳脂、UHT乳、具有延长的货架期的乳品、发酵乳制品、乳酪、酸奶、奶油、乳质涂抹料(dairy spread)、酪乳、酸化乳饮料、酸奶油、乳清基饮料、冰激淋、炼乳、乳糖浆(dulce de leche)或调味乳饮料。乳制品可以由本领域已知的任何方法生产。
乳制品可以另外包括非乳成分，例如植物成分如，例如，植物油、植物蛋白和/或植物糖。乳制品还可以进一步包括添加剂如，例如，酶、调味剂、微生物培养物如益生培养物，盐、甜味剂、糖、酸、水果、果汁或本领域已知可作为乳制品成分或添加剂的任何其它成分。
在本发明的一个实施方案中，一种或多种乳成分(milk components)和/或乳级分(milk fractions)占乳制品的至少50％(重量/重量)，如至少70％，例如至少80％，优选至少90％。
在本发明的一个实施方案中，已根据本发明的方法用具有乳糖酶活性的酶处理的一种或多种乳基底物，占乳制品的至少50％(重量/重量)，如至少70％，例如至少80％，优选至少90％。
在本发明的一个实施方案中，乳制品是未通过加入半乳寡糖而富集的乳制品。
在本发明的一个实施方案中，用酶处理的乳基底物在作为乳制品的成分使用之前未干燥。
在本发明的一个实施方案中，乳制品是冰激凌。在本上下文中，冰激凌可以是任何种类的冰激凌，如全脂冰激凌、低脂冰激凌或基于酸奶或其它发酵乳制品的冰激凌。冰激凌可以通过本领域任何已知方法生产。
在本发明的一个实施方案中，乳制品是乳或炼乳。
在本发明的一个优选的实施方案中，乳制品是UHT乳。在本发明的上下文中，UHT乳是已经进行了灭菌过程的乳品，所述灭菌过程意欲杀死所有微生物，包括细菌孢子。UHT(超高温)处理可以是，例如，在130℃热处理30秒，或在145℃热处理一秒。
在本发明的一个优选的实施方案中，乳制品是ESL乳。在本发明的上下文中，ESL乳是由于微滤和/或热处理而具有延长的货架期的乳品，并且其能在2-5℃在货架上保持新鲜至少15天，优选至少20天。
在本发明的另一个优选的实施方案中，乳制品是发酵乳制品，例如，酸奶。
发酵乳制品
在本发明的上下文中，“发酵乳制品”应理解为任何乳制品，其中任何类型的发酵形成生产过程的一部分。发酵乳制品的实例是产品如酸奶、酪乳、鲜奶油(crème fraiche)、酸奶酪(quark)和鲜奶酪(fromage frais)。发酵乳制品可以由本领域任何已知的方法产生。
在本发明的方法中，“发酵”表示通过微生物的作用而将糖转化成醇或酸。优选地，本发明的方法中的发酵包括将乳糖转化成乳酸。
在本发明的上下文中，“微生物”可以包括能发酵乳底物的任何细菌或真菌。
用于大多数发酵乳品的微生物选自通常称为乳酸细菌的细菌组。如本文所使用的，术语“乳酸细菌”指革兰氏阳性、微嗜氧或厌氧细菌，其发酵糖并产生酸，包括乳酸作为主要产生的酸，以及乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸细菌可在乳杆菌目(Lactobacillales)中找到，其中包括乳球菌属菌种(Lactococcusspp.)、链球菌属菌种(Streptococcus spp.)、乳杆菌属菌种(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属菌种(Leuconostoc spp.)、假明串珠菌属菌种(Pseudoleuconostoc spp.)、片球菌属菌种(Pediococcus spp.)、短杆菌属菌种(Brevibacterium spp.)、肠球菌属菌种(Enterococcus spp.)和丙酸菌属菌种(Propionibacterium spp.)。此外，乳酸细菌组中通常包括属于厌氧细菌双歧杆菌，即双歧杆菌属菌种(Bifidobacterium spp.)的组的乳酸产生细菌，其常单独用作食品培养物或与乳酸细菌组合。
乳酸细菌通常以冷冻或冻干培养物形式供应给乳业，用于生产用起子增殖(bulk starter propagation)或者所谓的“直投式”(DVS)培养物，意欲直接接种入发酵容器或桶中用于产生发酵乳制品。这种培养物通常称作“起子培养物”或“起子”。
常用的乳酸细菌的起子培养物菌株通常分成嗜常温生物体(其最适生长温度约30℃)，和嗜热生物体(其最适生长温度在约40至约45℃的范围内)。属于嗜常温组的典型生物体包括乳酸乳球菌(Lactococus lactis)、乳酸乳球菌干酪亚种(Lactococus lactis subsp.cremoris)、肠膜状明串珠菌干酪亚种(Leuconostocmesenteroides subsp.cremoris)、肠膜状假明串珠菌干酪亚种(Pseudoleuconostocmesenteroides subsp.cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰生物突变株(Lactococus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis)、干酪乳杆菌干酪亚种(Lactococus casei subsp.casei)和副干酪乳杆菌副干酪亚种(Lactococus paracasei subsp.paracasei)。嗜热乳酸细菌菌种包括例如嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。
属于双歧杆菌属的厌氧细菌，包括双岐双歧杆菌、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，也常用作乳品起子培养物，并且通常包括在乳酸细菌组中。此外，丙酸杆菌属的菌种可用作乳品起子培养物，特别是在奶酪的生产中。此外，属于双歧杆菌属的生物体通常用作食物起子培养物。
另一组微生物起子培养物是真菌培养物，包括酵母培养物和丝状真菌的培养物，其特别用于某些类型的奶酪和饮料的生产中。真菌的实例包括娄地青霉(Penicillium roqueforti)、白青霉(Penicillium candidum)、白地霉(Geotrichumcandidum)、开菲尔圆酵母(Torula kefir)、开菲尔酵母(Saccharomyces kefir)和酿酒酵母。
在本发明的一个实施方案中，用于乳基底物发酵的微生物是干酪乳杆菌或嗜热链球菌和德氏乳酸杆菌保加利亚亚种的混合物。
本发明的方法中使用的发酵方法是公知的，并且本领域的技术人员了解如何选择合适的工艺条件，如温度、氧、微生物的量和性质、添加剂如糖、调味剂、矿物质、酶，和处理时间。明显地，可以选择发酵条件以支持本发明的实现。
作为发酵的结果，乳基底物的pH降低。本发明的发酵乳制品的pH可以是，例如，在3.5-6的范围中，如在3.5-5的范围中，优选在3.8-4.8的范围中。
在一个优选的实施方案中，发酵的乳制品是酸奶。
用于产生乳制品的方法
如上所述，本发明在一个方面涉及用于产生乳制品的方法，其包括：
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:1的氨基酸28-1931或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
在一个优选的方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括：
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1331至少70％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括：
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:3或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括：
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:4或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括：
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:5或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括：
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:6或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括：
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:7或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括：
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
其中步骤b)在至少50℃进行。
在另一个方面，本发明涉及用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物，
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中乳糖酶活性在37℃的最适pH为pH 5以上，并且在37℃测定时，其中酶在pH 5的乳糖酶活性是其在pH 6的乳糖酶活性的至少50％。
技术人员了解如何确定乳糖酶在不同pH的活性，并且从而确定酶的最适pH。通过测定乳糖在37℃水解30分钟，可以确定乳糖酶在不同pH的活性，优选在包含琥珀酸、HEPES、CHES、KCl、CaCl2和MgCl2的缓冲液中，例如通过使用本申请的实施例中所述方法进行测定。为免存疑，HEPES是缓冲剂，为4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸，CHES是缓冲剂，为N-环己基-2-氨基乙烷磺酸。
用酶处理的乳基底物可以可选地与其它成分混合以获得乳制品。在本发明的一个实施方案中，用酶处理的乳基底物与其它成分混合以获得乳制品。
在本发明的一个实施方案中，乳制品是乳。在另一个实施方案中，乳制品是炼乳。在另一个实施方案中，乳制品是冰激凌。在另一个实施方案中，乳制品是UHT乳。在另一个实施方案中，乳制品是ESL乳。在另一个实施方案中，乳制品是发酵的乳制品，例如，酸奶。
优选地，乳制品是低乳糖乳制品。“低乳糖”，在本发明的上下文中，表示乳制品如发酵的乳制品中的乳糖量已经降低至少70％，优选80％，90％，95％，98％，99％或99.5％。
用于产生低乳糖的发酵乳制品的方法
本发明的一个实施方案涉及用于产生低乳糖发酵乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物，
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中在37℃测定时，其中酶在pH 5的乳糖酶活性是其在pH 6的乳糖酶活性的至少50％，和
c)用微生物发酵所述底物。
本发明的另一个实施方案涉及用于产生低乳糖发酵乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物，
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQID NO:6、SEQ ID NO:7或这些序列中任一个的片段至少70％相同的氨基酸序列，和
c)用微生物发酵所述底物。
优选地，在这些实施方案中，步骤b)和步骤c)基本上同时进行。
在本发明方法的上下文中，“基本上同时”表示酶处理和发酵不作为单独的步骤进行，即，用酶温育乳基底物不是在用微生物接种之前以单独的步骤进行。而是可以基本上在同时向乳基底物加入酶和微生物，即，可以在即将用微生物接种之前向乳基底物中加入酶。“即将…之前”在本文表示无用于酶水解的单独温育步骤。可选地，可以在即将加酶之前加入微生物，或者微生物和酶可以同时加入。在本发明方法的上下文中，“基本上同时”可以表示酶在步骤c)的全部过程中是活性的。
“基本上同时”不表示当发酵完成时，即当pH降至可防止微生物起子培养物进一步发酵活性的水平时，乳基底物中乳糖的酶水解就完成。
在本发明的一个优选实施方案中，酶在完成步骤c)后仍有活性。在一个更优选的实施方案中，与加至乳基底物时的酶活性相比，在完成步骤c)后，酶保持至少20％，如至少30％，至少40％，至少50％，至少60％或至少70％的乳糖酶活性。
在步骤c)完成后可以表示下述条件中至少一个条件为真：
-温度降至低于30℃
-pH达到4.55
-pH下降不再超过0.2单位每小时。
在另一个优选实施方案中，在发酵两小时后，少于80％，如少于70％，少于60％，少于50％，少于40％，少于30％，或者少于20％的乳糖已被水解。在本发明的上下文中，“发酵两小时后”表示在已经接种微生物后，在发酵过程合适的温度温育乳基底物两小时。
在另一个优选实施方案中，当乳基底物的pH降至pH 5时，少于80％，如少于70％，少于60％，少于50％，少于40％，少于30％，或者少于20％的乳糖已被水解。
在另一个优选实施方案中，当步骤c)完成时，少于80％，如少于70％，少于60％，少于50％，少于40％，少于30％，或者少于20％的乳糖已被水解。
在一个优选的实施方案中，在发酵开始后两天，即48小时，乳基底物中超过70％，如超过80％，超过90％，超过95％，超过97％，超过98％或者超过99％的乳糖已被水解。“发酵开始”是用微生物接种乳基底物并在发酵过程适合的温度温育时。
在另一个优选实施方案中，在步骤c)完成后两天，即48小时，乳基底物中超过70％，如超过80％，超过90％，超过95％，超过97％，超过98％或者超过99％的乳糖已被水解。
在另一个优选实施方案中，在最终的发酵乳制品中，乳基底物中的超过70％，如超过80％，超过90％，超过95％，超过97％，超过98％或者超过99％乳糖已被水解。“最终的发酵乳制品”是作为销售给顾客的产品的发酵乳制品。
在本发明的实施方案中，其中将乳基底物发酵，优选在发酵过程中在乳基底物的天然pH进行酶处理，即，pH将逐渐从未发酵的乳基底物的天然pH降至发酵乳基底物的pH。在这一方面，优选在发酵过程适合的温度进行酶处理。
用于产生具有延长的货架期的低乳糖饮料乳制品的方法
本发明的一个实施方案涉及用于产生低乳糖乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物，和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
其中步骤b)在至少60℃的温度进行。
在一个优选的实施方案中，步骤b)在至少62℃，如至少63℃，更优选在至少64，如至少65℃，至少67℃或者至少70℃，并且最优选在至少75℃的温度进行。
低乳糖乳制品可以是具有比新鲜乳品更长的货架期的饮料乳，新鲜乳品通常的货架期为4-7天。与其它具有延长的货架期的低乳糖饮料乳制品相比，其可以具有改进的质量。其可以，例如，具有更少的微生物计数，更淡的苦味和/或更浅的棕色。
优选地，乳制品是ESL乳。更优选地，乳制品是UHT乳。
在一个优选的方面，乳基底物是生乳。在另一个优选的方面，乳基底物，优选生乳，在步骤b)前未经巴氏灭菌。
在一个优选的方面，在步骤b)后不对经酶处理的乳基底物进行巴氏灭菌。
在一个优选的方面，在步骤b)前进行乳基底物的微滤。在这种情况下，酶应该优选是无菌的。在另一个优选的方面，在步骤b)后对经酶处理的乳基底物进行微滤。
在一个优选的方面，步骤b)在62℃-64℃的温度进行10分钟至4小时。在一个更优选的方面，步骤b)在62℃-64℃的温度进行20分钟至2小时。在甚至更优选的方面，步骤b)在约63℃的温度进行20分钟至60分钟，如约30分钟。对例如生乳的这种同时低温巴氏灭菌和乳糖酶处理所产生的低乳糖饮料乳与在低温进行乳糖酶处理(例如在5℃处理多至24小时，如乳品业常用的)所产生的低乳糖饮料乳相比，具有更高的质量。
在一个更优选的方面，步骤b)之后为冷却至10℃以下而不进一步热处理。这将允许酶在乳品冷却后，即在保存期间，仍保持活性。优选地，当步骤b)完成时，少于80％的乳糖已被水解，并且在一周后超过90％的乳糖已被水解。更优选地，当步骤b)完成时，少于60％的乳糖已被水解，并且在一周后超过95％的乳糖已被水解。
在另一个更优选的方面，步骤b)之后为UHT处理。
具有乳糖酶活性的酶
在本发明方法的步骤b)中，用具有乳糖酶活性的酶处理乳基底物。
本发明上下文中，乳糖酶是能将二糖乳糖水解成成分半乳糖和葡萄糖单体的任何糖苷水解酶。乳糖酶组包括但不限于指定为亚类EC 3.2.1.108的酶。指定为其它亚类如，例如，EC 3.2.1.23的酶也可以是本发明上下文中的乳糖酶。本发明上下文中的乳糖酶可以具有乳糖水解活性之外的其它活性，如转半乳糖基活性。在本发明的上下文中，乳糖酶的乳糖水解活性可称为其乳糖酶活性或其β-半乳糖苷酶活性。
本发明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶可以是动物、植物或微生物来源的。优选的酶获得自微生物来源，特别是来自丝状真菌或酵母，或来自细菌。
酶可以，例如，源自如下属或种的菌株：蘑菇属(Agaricus)，例如双孢蘑菇(A.bisporus)；Ascovaginospora；曲霉属，例如黑曲霉，泡盛曲霉，臭曲霉，日本曲霉，米曲霉；念珠菌属(Candida)；毛壳菌属(Chaetomium)；Chaetotomastia；网柄菌属(Dictyostelium)，例如盘基网柄菌(D.discoideum)；克鲁维酵母属(Kluveromyces)，例如脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)；毛霉属(Mucor)，例如爪哇毛霉(M.javanicus)，高大毛霉(M.mucedo)，细孢毛霉(M.subtilissimus)；脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N.crassa)；根毛霉属(Rhizomucor)，例如微小根毛霉(R.pusillus)；根霉属(Rhizopus)，例如少根根霉(R.arrhizus)，日本根霉(R.japonicus)，匍枝根霉(R.stolonifer)；核盘霉属(Sclerotinia)，例如白腐核盘霉(S.libertiana)；球拟酵母属(Torulopsis)；毛癣菌属(Trichophyton)，例如红色毛癣菌(T.rubrum)；维氏核盘菌属(Whetzelinia)，例如W.sclerotiorum；芽孢杆菌属，例如凝结芽孢杆菌，环状芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，B.novalis，枯草芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌；双歧杆菌属(Bifidobacterium)，例如长双歧杆菌，双歧双歧杆菌，动物双歧杆菌；金黄杆菌属(Chryseobacterium)；柠檬酸杆菌属(Citrobacter)，例如弗氏柠檬酸杆菌(C.freundii)；梭菌属(Clostridium)，例如产气荚膜梭菌(C.perfringens)；色二孢属(Diplodia)，例如棉色二孢(D.gossypina)；肠杆菌属(Enterobacter)，例如产气肠杆菌(E.aerogenes)，阴沟肠杆菌(E.cloacae)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)，迟钝爱德华菌(E.tarda)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如草生欧文氏菌(E.herbicola)；埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)；Miriococcum；Myrothesium；毛霉属；脉孢菌属，例如粗糙脉孢菌；变形菌属(Proteus)，例如普通变形菌(P.vulgaris)；普罗维登斯菌属(Providencia)，例如斯氏普罗维登斯菌(P.stuartii)；密孔菌属(Pycnoporus)，例如朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)，血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)；瘤胃球菌属(Ruminococcus)，例如扭链瘤胃球菌(R.torques)；沙门氏菌(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如液化沙雷氏菌(S.liquefasciens)，粘质沙雷氏菌(S.marcescens)；志贺氏杆菌(Shigella)，例如弗氏志贺菌(S.flexneri)；链霉菌属(Streptomyces)，例如抗生链霉菌(S.antibioticus)，栗色球孢链霉菌(S.Castaneoglobisporus)，紫红链霉菌(S.violeceoruber)；栓菌属(Trametes)；木霉属(Trichoderma)，例如里氏木霉(T.reesei)，绿色木霉(T.viride)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y.enterocolitica)。
在一个优选的实施方案中，酶是来自细菌，例如来自双歧杆菌科，如来自双歧杆菌属，如来自双歧双歧杆菌、动物双歧杆菌或长双歧杆菌的菌株的乳糖酶。在一个更优选的实施方案中，酶是来自双歧双歧杆菌的乳糖酶。优选的酶是包含序列的乳糖酶，所述序列与SEQ ID NO:1的氨基酸28-1931或其乳糖酶活性片段至少50％，如至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少98％相同。SEQ ID NO:1的这种乳糖酶活性片段可以是SEQID NO:1具有乳糖酶活性的任何片段。SEQ ID NO:1的乳糖酶活性片段可以是，例如，SEQ ID NO:1的氨基酸28-979，氨基酸28-1170，氨基酸28-1323，氨基酸28-1331，或氨基酸28-1600。
在一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序列，所述序列与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1331至少50％相同。在一个更优选的实施方案中，酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1331至少60％，如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少98％相同。
在另一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序列，所述序列与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1331至少50％相同。在一个更优选的实施方案中，酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1331至少60％，如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少98％相同。
在另一个实施方案中，本发明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序列，所述序列与SEQ ID NO:3至少50％相同。优选地，酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:3至少60％，如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少98％相同。
在另一个实施方案中，本发明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序列，所述序列与SEQ ID NO:4至少50％相同。优选地，酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:4至少60％，如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少98％相同。
在另一个实施方案中，本发明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序列，所述序列与SEQ ID NO:5至少50％相同。优选地，酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:5至少60％，如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少98％相同。
在另一个实施方案中，本发明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序列，所述序列与SEQ ID NO:6至少50％相同。优选地，酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:6至少60％，如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少98％相同。
在另一个实施方案中，本发明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶包含氨基酸序列，所述序列与SEQ ID NO:7至少50％相同。优选地，酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:7至少60％，如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或至少98％相同。
就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度通过Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)使用EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology OpenSoftware Suite,Rice等(2000)Trends in Genetics 16:276-277)的Needle程序来测定，优选3.0.0或更高的版本。使用的可选参数为缺口罚分(gap penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62取代矩阵(BLOSUM62的EMBOSS版)。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-no brief选项获得)作为同一性百分比，并计算如下：
(相同的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)
本发明的方法中使用的乳糖酶可以是胞外酶。它们可以在其N-末端包含信号序列，所述信号序列在分泌过程中被切去。
本发明方法中使用的乳糖酶可以源自本文所述的任何来源。术语“源自”在本上下文中表示酶可以从天然存在所述酶的生物体分离，即酶的氨基酸序列的身份(identity)与天然酶相同。术语“源自”还表示酶可以在宿主生物体中重组产生，其中重组产生的酶具有与天然酶相同的身份，或具有修饰的氨基酸序列，例如，缺失、插入和/或取代一个或多个氨基酸，即，重组产生的酶是天然氨基酸序列的突变体和/或片段。天然酶的意义中包含天然变体。此外，术语“源自”包括通过例如肽合成而合成产生的酶。术语“源自”还包括已经通过例如糖基化、磷酸化等在体内或体外修饰的酶。对于重组产生的酶，术语“源自”指酶的身份而不是重组产生酶的宿主生物体的身份。
可以通过使用任何合适的技术从微生物获得乳糖酶。例如，乳糖酶制备物可通过发酵合适的微生物和之后通过本领域公知的方法从所得的发酵液或微生物分离乳糖酶制备物而获得。乳糖酶还可以通过使用重组DNA技术而获得。这种方法通常包括培养用重组DNA载体转化的宿主细胞，所述载体包含编码所讨论的乳糖酶的DNA序列，并且DNA序列与合适的表达信号可操作地连接，使其能在允许酶表达的条件下在培养基中表达乳糖酶，并从培养物回收酶。还可将DNA序列掺入宿主细胞的基因组中。DNA序列可以是基因组、cDNA或合成来源，或它们的任何组合，并且可以按照本领域公知的方法分离或合成。
可纯化本发明的方法中使用的乳糖酶。本文中使用的术语“纯化”包括基本上不含来自酶的生产生物体的不溶成分的乳糖酶蛋白。术语“纯化”还包括基本上不含来自获得酶的天然生物体的不溶组分的乳糖酶蛋白。优选地，还可以从酶的来源生物体和培养基的一些可溶成分分离。更优选地，可以通过一种或多种单元操作来进行分离：过滤、沉淀或色谱/层析。
因此，可纯化具有乳糖酶活性的酶，即仅存在少量的其它蛋白质。表述“其它蛋白质”具体涉及其它酶。本文使用的术语“纯化”还指去除其它成分，特别是(存在于乳糖酶的来源细胞中的)其它蛋白质，最特别是存在于乳糖酶的起源细胞中的其它酶。乳糖酶可为“基本上纯的”，即，不含来自酶的生产生物体(即，例如，用于重组产生乳糖酶的宿主生物体)的其它成分。优选地，乳糖酶是至少40％(w/w)纯，更优选至少50％，60％，70％，80％或者甚至至少90％纯的酶蛋白制备物。
术语具有乳糖酶活性的酶包括酶的催化活性必需的任何辅助化合物，如，例如，合适的受体或辅因子，其可以或者可以不天然存在于反应系统中。
酶可以是适合于所述用途的任何形式，如，例如，为干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定化液体或受保护酶的形式。
以合适的量加入酶，以在所选反应条件下实现理想程度的乳糖水解。可以以100-5000LAU每升乳基底物，优选小于3000，如小于1500，小于1000，小于750或小于500，LAU每升乳基底物的浓度加入酶。
在一个优选的实施方案中，以乳基底物中5-100LAU每g乳糖，优选乳基底物中小于50，如小于40，小于30，小于20或小于10，LAU每g乳糖酶的浓度加入酶。
在本申请的上下文中，1个乳糖酶单位(1LAU)是在pH 6.5和37℃，乳糖浓度为4.75％w/v，在M-缓冲液中每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。如下制备M-缓冲液：在4升水中溶解3.98g C6H5Na3O7-2H2O，8.31g柠檬酸，0.9g K2SO4，2.6g K2HPO4，7.35g KH2PO4，5.45g KOH，4.15g MgCl2-6H2O，3.75g CaCl2-2H2O和1.4g NaHCO3，加入12.5ml 4N NaOH，使用HCl调至pH 6.5，并加水至总体积为5升。
通过在上述条件下直接测定从乳糖释放的葡萄糖可以确定特定乳糖酶的以LAU表示的活性。技术人员了解如何确定这种活性。可选地，通过使用本申请实施例1中所述的乳糖酶活性试验可以确定活性。在此处，通过与用已知活性的乳糖酶获得的标准曲线进行比较而获得活性，并由此计算未知样品的活性。已知活性的乳糖酶可，例如，是获得自Novozymes A/S,Denmark的Lacozym。
在一个优选的实施方案中，本发明的方法中使用的具有乳糖酶活性的酶在37℃和pH 5具有的乳糖酶活性是其在37℃和pH 6的乳糖酶活性的至少55％，如至少60％，至少65％，至少70％或至少75％。
在另一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶在37℃和pH 4.5具有的乳糖酶活性是其在37℃和pH 6的乳糖酶活性的至少10％，如至少20％，至少30％，至少35％或至少40％。
在另一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶在37℃的乳糖酶活性的最适pH为pH 5.5以上。
在另一个优选的实施方案中，本发明方法中使用的具有乳糖酶活性的酶在52℃和pH 6.5的乳糖酶活性是其在38℃和pH 6.5的乳糖酶活性的至少50％，如至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％或至少80％。
技术人员了解如何确定不同在pH和温度的乳糖酶活性。优选通过使用本申请的实施例中所述的方法确定不同pH和温度的乳糖酶活性。
在本发明的一个优选实施方案中，具有乳糖酶活性的酶在5℃的Km为25mM以下，如20mM以下，15mM以下或10mM以下。在另一个优选的实施方案中，具有乳糖酶活性的酶在37℃的Km为25mM以下，如20mM以下或15mM以下。技术人员了解如何确定在特定的温度时乳糖酶活性的Km。可以通过本申请的实施例中使用的方法确定Km。
在另一个优选的实施方案中，水解乳基底物中的乳糖时，酶具有超过1:1，如超过2:1或超过3:1的乳糖酶与转半乳糖基酶活性的比例。在另一个优选的实施方案中，在酶的乳糖酶活性高于转半乳糖基酶活性的条件下进行酶处理，如乳糖酶活性为转半乳糖基酶活性的至少两倍高或者至少三倍高。乳基底物中乳糖酶活性与转半乳糖基酶活性的比例可以，例如，由HPLC分析确定。在另一个优选的实施方案中，在水解的乳糖的至少50％(w/w％)转化成游离半乳糖的条件下进行酶处理。在另一个优选的实施方案中，在水解的乳糖转化成等量的游离葡萄糖和游离半乳糖的条件下进行酶处理。
实施例1
在37℃，pH 6.5，在微量离心管(eppendorf tube)中的乳糖酶活性试验
原理：
乳糖酶将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。根据修正版本的普通葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试验(Werner,W.等(1970)Z.analyt.Chem.252:224)测定葡萄糖。
LAU定义为在37℃，pH 6.5，在M-缓冲液(M-缓冲液在本专利申请的描述中定义)中每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。可选地，对于特定乳糖酶，以LAU表示的活性可以通过本文所述方法确定。将获得的数值与用活性已知的乳糖酶得到的标准曲线进行比较，并且由此计算未知样品的活性。已知活性的乳糖酶可以是，例如，获得自Novozymes A/S,Denmark的Lactozym。
溶液：
试验缓冲液：50mM琥珀酸，50mM HEPES，50mM CHES，150mM KCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2，0.01％Triton X100，pH 6.5。
GOD-Perid溶液：65mM磷酸钠,pH 7，0.4g/l葡萄糖氧化酶，0.013g/l HRP(辣根过氧化物酶)，0.65g/l ABTS(2,2’-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)))。
底物：
160mM乳糖，50mM琥珀酸，50mM HEPES，50mM CHES，150mMKCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2，pH 6.5。
标准品：
将具有以LAU/g表示的已知活性的Lactozym(可由Novozymes A/S，Denmark获得)用作标准品，用试验缓冲液稀释至0.09-0.7LAU/g的范围内。
样品：
将酶样品在试验缓冲液中适当稀释。
过程：
1.将375μl底物在37℃温育5分钟。
2.加入在试验缓冲液中稀释的25μl酶。
3.在30分钟后通过加入60μl 1M NaOH而终止反应
4.将20μl转移至96孔微量滴定板并加入200μl GOD-Perid溶液。在室温30分钟后，在420nm测定吸光度。
实施例2
通过在91ml离子水中混合9g脱脂乳粉(Kerry)而制得具有约5％乳糖的100ml 9％脱脂乳溶液。将10ml溶液转移至包含磁力搅棒的试管中并置于37℃的水浴中。15分钟后加入酶。测试的酶是Lactozym，一种来自NovozymesA/S,Denmark的商业上可得到的乳糖酶(活性为3060LAU/g)，和来自双歧双歧杆菌的实验乳糖酶，其具有SEQ ID NO:2中所示的编码序列并且活性为295LAU/g。SEQ ID NO:2的氨基酸1至27是信号序列，其据推测可切割，并且氨基酸1332至1341是用于纯化实验酶的标签。
剂量为5640LAU/l乳的Lactozyme和2700LAU/l乳的双歧杆菌属乳糖酶。每隔固定时间取乳样品，直至4小时，并且通过在热混合器中加热至99℃10分钟而使酶失活。将样品适当稀释并通过0.20μm滤器过滤。
使用配备有Dionex PA1柱和Pulsed Amperiometrisk Detektor(PAD)的Dionex BioLC测定乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品比较而鉴定和定量峰。结果如下。
表1：用Lactozym或双歧杆菌属乳糖酶处理后的复原脱脂乳中的乳糖、葡萄糖和半乳糖。
在测试具有5％乳糖的乳品时，使用双歧杆菌属乳糖酶未观察到转移酶活性。葡萄糖和半乳糖产生的量相等，并且总单糖产生量符合由水解的乳糖所预计的数值。为了进行比较，Lactozym产生的半乳糖少于葡萄糖，这清楚表明已经产生了半乳寡糖。而且，在使用双歧杆菌属乳糖酶时最终的乳糖水平明显较低，说明这种酶的Km值较低。
实施例3
通过分别在85或70ml离子水中混合15或30g喷雾干燥的乳清渗透粉末(Variolac,Arla)，产生主要包含乳糖和离子的100ml 15或30％(w/w)乳清渗透液。将溶液注入包含磁力搅棒的烧瓶，并置于37℃水浴中。15分钟后，加入酶。测试的酶是Lactozym，来自Novozymes A/S,Denmark的商业上可得到的乳糖酶(其活性为3060LAU/g)，和来自双歧双歧杆菌的实验乳糖酶，其具有SEQ ID NO:2中所示的编码序列，和295LAU/g的活性。
剂量为4225LAU/l乳的Lactozym和2025LAU/l乳的双歧杆菌属乳糖酶。固定间隔取乳样品，直至5.5小时，并且通过在热混合器中加热至99℃10分钟而使酶失活。将样品适当稀释并通过0.20μm过滤器过滤。
使用配备有Dionex PA1柱和Pulsed Amperiometrisk Detektor(PAD)的Dionex BioLC测定乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品比较而鉴定并定量峰。结果如下所示。
表2：用Lactozym或双歧杆菌属乳糖酶处理后，15％DS乳清渗透液中的乳糖、葡萄糖和半乳糖。
表3：用Lactozym或双歧杆菌属乳糖酶处理后，30％DS乳清渗透液中的乳糖、葡萄糖和半乳糖。
如在15％或30％乳清渗透物中在更高的乳糖浓度测定时，不产生半乳寡糖或者产生非常少的半乳寡糖。此外，产生的半乳糖和葡萄糖的水平相等，与水解的乳糖量相符。为了进行比较，Lactozym产生的半乳糖少于葡萄糖，清楚表明已经产生了半乳寡糖。
实施例4
使用乳糖作为底物时，来自双岐双歧杆菌的实验乳糖酶的pH曲线(37℃)和温度曲线(pH 6.5)。
原理：
乳糖酶水解乳糖并形成葡萄糖+半乳糖。根据普通葡萄糖氧化酶/过氧化物酶测定法的修订版本(Werner,W.等(1970)Z.analyt.Chem.252:224)测定葡萄糖。
pH曲线
底物：
167mM乳糖，50mM琥珀酸，50mM HEPES，50mM CHES，150mMKCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2并用NaOH将pH调至pH 3、4、5、6、7、8、9和10。
酶样品：
将来自双岐双歧杆菌的具有SEQ ID NO:2中所示编码序列的实验乳糖酶在150mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、0.01％Triton X100中适当稀释。
过程：
·在室温向PCR管中加入在酶稀释缓冲液中稀释的10μl酶样品。
·在室温加入90μl底物并在37℃迅速放入Peltier Thermal Cycler(PCT-200,MJ research)中并温育30分钟，然后置于冰上。
·通过加入100μl 0.25M NaOH而终止反应。
·将20μl转移至96孔微量滴定板中，并加入230μl 65mM磷酸钠,pH 7，0.4g/l葡萄糖氧化酶，0.013g/l HRP，0.65g/l ABTS溶液。室温30分钟后，在420nm测定吸光度。
表4：
温度曲线
底物：
167mM乳糖，50mM琥珀酸，50mM HEPES，50mM CHES，150mMKCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2并用NaOH将pH调至pH 6.5。
酶样品：
将来自双岐双歧杆菌的具有SEQ ID NO:2中所示编码序列的实验乳糖酶在50mM琥珀酸、50mM HEPES、50mM CHES、150mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、0.01％Triton X100中适当稀释，并将pH调至pH 6.5。
过程：
·在室温向PCR管中加入在酶稀释缓冲液中稀释的10μl酶样品。
·加入90μl预热的(在Peltier Thermal Cycler中，30-70℃)底物，并以30-70℃的温度梯度进行30分钟温育，然后置于冰上。
·通过加入100μl 0.25M NaOH而终止反应。
·将20μl转移至96孔微量滴定板中，并加入230μl 65mM磷酸钠,pH 7，0.4g/l葡萄糖氧化酶，0.013g/l HRP，0.65g/l ABTS溶液。室温30分钟后，在420nm测定吸光度。
表5：
实施例5
在5℃的乳糖酶Km的测定
原理：
乳糖酶水解乳糖并形成葡萄糖+半乳糖。根据普通葡萄糖氧化酶/过氧化物酶测定法的修订版本(Werner,W.等(1970)Z.analyt.Chem.252:224)测定葡萄糖。
底物：
不同的乳糖浓度，从Km/5至10*Km，50mM琥珀酸，50mM HEPES，50mM CHES，150mM KCl，2mM CaCl2，1mM MgCl2，并用NaOH将pH调至pH 6.5。
酶样品：
将来自双岐双歧杆菌的具有SEQ ID NO:2中所示编码序列的实验乳糖酶在50mM琥珀酸、50mM HEPES、50mM CHES、150mM KCl、2mM CaCl2、1mM MgCl2、0.01％Triton X100中适当稀释，用NaOH将pH调至pH 6.5。
在相同的缓冲液中将12g/l Lactozym(来自Novozymes A/S,Denmark的商业上可得到的乳糖酶)稀释6000倍。
过程：
-向冰上的96孔微量滴定板加入10μl酶样品(5℃)。
-在5℃加入90μl底物(5℃)，并在5℃温育2小时。
-通过加入100μl 0.25M NaOH而终止反应。
-将20μl转移至96孔微量滴定板中，并加入230μl 65mM磷酸钠,pH 7，0.4g/l葡萄糖氧化酶，0.013g/l HRP，0.65g/l ABTS溶液。室温30分钟后，在420nm测定吸光度。
Km测定：
使用计算机化非线性最小均方拟合和Michaelis-Menten方程：
v＝(Vmax*S)/(Km+S)
分别测定双歧杆菌属乳糖酶和Lactozym的Km为8mM和30mM。
在37℃进行的相似测试中，分别测定双歧杆菌属乳糖酶和Lactozym的Km为13mM和30mM。
实施例6
酸奶试验
将含有1.5％脂肪的商业均质化乳品在90℃巴氏灭菌20分钟。将200ml乳品转移进婴儿奶瓶中并调至43℃。使用0.02％的接种水平，将乳品接种来自Chr.Hansen,Denmark,(F-DVS ABY-3)的冷冻益生酸奶培养物。同时，向乳品加入酶。测试的酶产品是Ha-乳糖酶，来自Chr.Hansen,Denmark的商业上可得到的乳糖酶(活性为8021LAU/g)，和来自双歧双歧杆菌的实验乳糖酶，其具有SEQ ID NO:2中所示的编码序列和295LAU/g的活性。
剂量为1500、3000和3750LAU/l乳品的Ha-乳糖酶和710、1420和1780LAU/l的双歧杆菌属乳糖酶。在43℃发酵乳样品，直至在约五小时内pH到达4.55。然后搅拌酸奶，冷却至25℃，并放置在8℃保存。在加入培养物和酶后2小时，在末期pH(pH 4.55)，和在8℃保存20-24小时(第1天)后收集样品。通过加入硫酸而终止生物活性。加入高氯酸而使蛋白质沉淀，然后加入包含MQW的标准品。
使用配备有与电化学检测器(ED)连接的Carbopac20的Dionex ICS-3000系统测定乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品比较来鉴定和定量峰。乳糖水解的结果如下。
表6：用不同剂量的Ha-乳糖酶或双歧杆菌属乳糖酶处理的酸奶中的乳糖。还测试了未加酶的参照样品
酸奶样品中的乳糖水平表明在发酵开始时，发酵的前两个小时中，Ha-乳糖酶的活性最高。两小时后，由于pH下降，Ha-乳糖酶明显失活。另一方面，在全部发酵过程中，双歧杆菌属乳糖酶保持活性，并且在冷冻保存过程中也保持一定程度的活性。在最低的测试剂量710LAU/L，当使用双歧杆菌属乳糖酶时，在冷冻保存期间，乳糖水平显著降低。
实施例7
酸奶实验
将包含1.5％脂肪的商业均质化乳品在90℃巴氏灭菌20分钟。将200ml乳品转移进婴儿奶瓶中并调至43℃。用来自Chr.Hansen,Denmark,(F-DVSABY-3)的冷冻益生酸奶培养物使用0.02％的接种水平接种乳品。同时向乳品中加入酶。测试的酶产物是Ha-乳糖酶，来自Chr.Hansen,Denmark的商业上可得到的脂肪酶(活性为8021LAU/g)，和来自双歧双歧杆菌的实验乳酶，其具有SEQ ID NO:2中所示的编码序列和295LAU/g的活性。
剂量是1500LUA/L乳品的Ha-乳糖酶和710、530和360LAU/L双歧杆菌属乳糖酶。在43℃发酵乳样品，直至在约五小时内pH达到4.55。然后搅拌酸奶，冷却至25℃并置于8℃保存。在加入培养物和酶后两小时，在结束pH(pH 4.55)时，和在8℃保存的第1、2、3和7天后收集样品。通过加入硫酸而停止生物活性。加入高氯酸沉淀蛋白质，然后加入包含标准品的MQW。
使用配备有与电化学检测仪(ED)相连接的Carbopac 20oscan的DionnexICS-3000系统来测定乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品相比较，鉴定并定量峰。乳糖水解的结果如下所示。
表7：
如前面的实施例中所述，两种测试酶的活性阶段不同。Ha-乳糖酶在发酵开始时表现出高活性，而双歧杆菌属乳糖酶在全部发酵时间期间和冷冻保存期间都保持活性。因此，保存两天后，用双歧杆菌属乳糖酶处理的样品中乳糖水平与用Ha-乳糖酶处理的样品相比相似或更低。
在用1500LAU/L Ha-乳糖酶处理的酸奶样品和用360LAU/L双歧杆菌属乳糖酶处理的酸奶样品中，在第2天获得的乳糖水解程度相似。
实施例8
乳试验
将包含1.5％脂肪的商业均质化乳品转移至管(10ml)中，并在水浴中分别加热至40℃、50℃和55℃。然后向乳样品加入酶。测试的酶产品是Ha-乳糖酶，来自Chr.Hansen,Denmark的商业上可得到的乳糖酶(活性为8040LAU/g)，和来自双岐双歧杆菌的实验乳糖酶，其具有SEQ ID NO:2中所示的编码序列和295LAU/g的活性。
剂量为1500LAU/L乳的Ha-乳糖酶和710LAU/L双歧杆菌属乳糖酶。在加入酶后2小时和4小时收集样品。通过加入硫酸而终止生物活性。加入高氯酸沉淀蛋白，然后加入包含MQW的标准品。
使用配备有与电化学检测器(ED)连接的Carbopac20的Dionex ICS-3000系统测定乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品比较而鉴定和定量峰。乳糖水解的结果如下。
表8：
在最高温度，50℃和55℃，与Ha-乳糖酶相比，双歧杆菌属乳糖酶明显表现出更高的活性。此外，在4小时的反应时间中双歧杆菌属乳糖酶保持活性，而对于Ha-乳糖酶，观察不到活性或者只有非常低的活性。
实施例9
乳试验-高温
将包含1.5％脂肪的商业均质化乳品转移至管(10ml)中，并调至63℃。向乳样品加入酶。测试的酶产品是Ha-乳糖酶5200，其为来自Chr.Hansen(Denmark)的商业上可得到的乳糖酶(活性为8040LAU/g)，和Lactoles，其为来自Daiwa Kasei(Japan)的商业芽孢杆菌属乳糖酶(活性为约1500LAU/g)。
施用的剂量分别为1500LAU/L乳品的Ha-乳糖酶和Lactoles。在加入酶后15分钟、30分钟、2小时和4小时在63℃收集样品。通过加入硫酸而终止生物活性，并在HPLC分析前通过加入高氯酸而沉淀蛋白。
使用配备有与电化学检测器(ED)连接的Carbopac20的Dionex ICS-3000系统测定乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品比较而鉴定和定量峰。乳糖水解的结果如下所示。
表9：
在63℃，Ha-乳糖酶5200失活，因为在反应的4小时过程中未发生水解。另一方面，在这个温度，Lactoles在全部反应时间中表现出高活性。4小时后，获得了93.4％的水解程度。
实施例10
通过在91ml离子水中混合9g脱脂乳粉(Kerry)，制得具有约5％乳糖的100ml 9％脱脂乳溶液。将10ml溶液转移至包含磁力搅棒的试管中，并置于5℃水浴中。15分钟后加入酶。测试的酶是Lactozym，其为来自Novozymes A/S,Denmark的商业上可得到的乳糖酶(活性为3060LAU/g)，和来自双岐双歧杆菌的实验乳糖酶，其具有SEQ ID NO:2中所示的编码序列和295LAU/g的活性。SEQ ID NO:2的氨基酸1至27是信号肽，其据推测可切割，并且氨基酸1332至1341是用于纯化实验酶的标签。
剂量为3000LAU/L乳的Lactozym和1420LAU/l乳的双歧杆菌属乳糖酶。以一定间隔取乳样品，直至48小时，并且通过在热混合器中加热至99℃10分钟而使酶失活。适当稀释样品并通过0.20μm过滤膜过滤。
使用配备有Dionex PA1柱和Pulsed Amperiometrisk Detektor(PAD)的Dionex BioLC测定乳糖水解。通过与乳糖、葡萄糖和半乳糖的已知标准品比较而鉴定和定量峰。乳糖水解的结果如下所示。
表10：在5℃用Lactozym或双歧杆菌属乳糖酶处理后复原脱脂乳中的乳糖、葡萄糖和半乳糖。
使用双歧杆菌属乳糖酶，在5℃在包含5％乳糖的乳中测试时，仍然没有观察到转移酶活性。产生的葡萄糖和半乳糖相等，并且总单糖产生量与由水解的乳糖得到的期望值相符。为了比较，Lactozyme产生的半乳糖比葡萄糖少，清楚地表明已经产生了半乳寡糖。此外，使用双歧杆菌属乳糖酶时最终的乳糖水平明显降低，进一步说明这种酶的Km值更低。

Claims (24)

1.用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:2的氨基酸28-1331至少70％相同的氨基酸序列。
2.用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:1的氨基酸28-1931或其片段至少70％相同的氨基酸序列。
3.用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:3-4中任一序列或这些序列中任一个的片段至少70％相同的氨基酸序列。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酶源自双歧杆菌属(Bifidobacterium)的微生物。
5.用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，并且具有与SEQ ID NO:5-7中任一序列或这些序列中任一个的片段至少70％相同的氨基酸序列。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中在37℃乳糖酶活性的最适pH为pH 5以上，并且其中在37℃测定时，酶在pH 5的乳糖酶活性为在pH 6时其乳糖酶活性的至少50％。
7.用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，其中在37℃乳糖酶活性的最适pH为pH 5以上，并且其中在37℃测定时，酶在pH 5的乳糖酶活性为在pH 6时其乳糖酶活性的至少50％。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中步骤b)在至少50℃的温度进行。
9.用于产生乳制品的方法，其包括
a)提供包含乳糖的乳基底物；和
b)用酶处理所述底物，所述酶具有乳糖酶活性，
其中步骤b)在至少50℃的温度进行。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中在pH 6.5测定时，酶在52℃的温度的乳糖酶活性是其在38℃的温度的乳糖酶活性的至少70％。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中向乳基底物以所述乳基底物中小于30LAU每g乳糖的浓度加入酶。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中向乳基底物以小于1000LAU每升乳基底物的浓度加入酶。
13.前述权利要求中任一项的方法，其中在水解乳基底物中的乳糖时，所述酶的乳糖酶与转半乳糖基酶的活性比例大于1:1。
14.前述权利要求中任一项的方法，其进一步包括如下步骤
c)用微生物发酵所述底物，
其中所述乳制品是发酵乳制品。
15.权利要求14的方法，其中所述发酵的乳制品是酸奶。
16.权利要求14-15中任一项的方法，其中步骤b)和步骤c)基本上同时进行。
17.权利要求14-16中任一项的方法，其中步骤b)的酶和步骤c)的微生物基本上同时加入所述乳基底物。
18.权利要求14-17中任一项的方法，其中在发酵两小时后少于80％的乳糖已被水解，并且其中在最终的发酵乳制品中多于90％的乳糖已被水解。
19.权利要求14-18中任一项的方法，其中在步骤c)完成时少于80％的乳糖已被水解，并且其中在最终的发酵乳制品中多于90％的乳糖已被水解。
20.权利要求1-13中任一项的方法，其中步骤b)在至少60℃的温度进行。
21.权利要求20的方法，其中所述乳基底物是生乳，其在步骤b)前未进行巴氏灭菌。
22.权利要求20-21中任一项的方法，其中步骤b)在62℃-64℃的温度进行10分钟-4小时，并且其中步骤b)之后为冷却至10℃以下而不进一步加热处理。
23.权利要求20-22中任一项的方法，其中在步骤b)完成时少于80％的乳糖已被水解，并且其中在一周后多于90％的乳糖已被水解。
24.权利要求20-21中任一项的方法，其中步骤b)在62℃-64℃的温度进行10分钟-4小时，并且其中步骤b)之后为UHT处理。
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