BR112021007244A2

BR112021007244A2 - enzimas lactase com propriedades melhoradas em ph ácido

Info

Publication number: BR112021007244A2
Application number: BR112021007244-6A
Authority: BR
Inventors: Hans RAJ; Johannes Maarten Van Den Brink; Christian Gilleladen
Original assignee: Chr. Hansen A/S
Priority date: 2018-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-08-10
Also published as: EP3866606B1; US20210348147A1; JP2022504684A; CN112654251A; EP3866606A1; WO2020079116A1

Abstract

ENZIMAS LACTASE COM PROPRIEDADES MELHORADAS EM PH ÁCIDO. A presente invenção refere-se a novos peptídeos melhorados ou peptídeos diméricos que apresentam atividade de enzima beta-galactosidase em que o peptídeo tem um pH ideal em condições ácidas.

Description

ENZIMAS LACTASE COM PROPRIEDADES MELHORADAS EM PH ÁCIDO Campo da invenção

[001] A presente invenção refere-se a novos peptídeos melhorados ou peptídeos diméricos que apresentam atividade da enzima beta- galactosidase, bem como métodos melhorados para reduzir o conteúdo de lactose em composições, como produtos lácteos. Antecedente da invenção

[002] Para crescer no leite, a hidrólise de lactose é uma ótima maneira de as bactérias de ácido láctico obterem glucose e galactose como fonte de carbono. Lactase (beta-galactosidase; EC

3.2.1.23) é a enzima que realiza a etapa de hidrólise da lactose de açúcar do leite nos monossacarídeos. O uso comercial de lactase é quebrar a lactose nos produtos lácteos. Pessoas intolerantes à lactose têm dificuldades em digerir produtos lácteos com níveis elevados de lactose. É estimado que cerca de 70% da população mundial tem uma capacidade limitada de digerir lactose. Assim sendo, há uma demanda crescente de produtos alimentícios lácteos que não contêm nenhum nível de lactose ou apenas níveis baixos.

[003] As lactases têm sido isoladas de uma grande variedade de organismos, inclusive microrganismos como Kluyveromyces e Bacillus. Kluyveromyces, especialmente K. fragilis e K. lactis, e outros fungos, como aqueles do gênero Candida, Torula e Torulopsis, são uma fonte comum de lactases fúngicas, enquanto B. coagulans e B. circulans são fontes bem conhecidas de lactases bacterianas. Várias preparações de lactase comercial derivadas desses organismos estão disponíveis, como Lactozym® (disponível pela Novozymes, Dinamarca), HA-Lactase (disponível pela Chr. Hansen, Dinamarca) e Maxilact® (disponível pela DSM, Holanda), todos de K. lactis. Todas essas lactases são as chamadas lactases neutras, que têm um pH ideal entre pH 6 e pH 8, bem como uma temperatura também ideal em torno de 37C. Quando essas lactases forem usadas na produção de, por ex., iogurte de baixa lactose, o tratamento da enzima terá de ser feito em uma etapa separada antes da fermentação ou dosagens elevadas de enzima terão que ser usadas, porque sua atividade cairá enquanto o pH diminui durante a fermentação.

[004] O documento WO 2009/071539 divulga uma lactase que se origina de Bifidobacterium bifidum, que é capaz de hidrólise muito eficiente no leite e que é ativa em uma ampla faixa de pH, incluindo pH baixo, por ex., um pH abaixo de 6. A lactase pode ser usada nos processos para produzir leite e produtos de leite fermentado, como queijo, iogurte, manteiga, leitelho, creme de leite etc., para reduzir o conteúdo de lactose.

[005] O documento WO 2013/160413 divulga um método de produção de produto lácteo fermentado usando uma combinação de cepas de bactérias de ácido lático negativas para glicose e uma lactase convencional com o objetivo de redução do teor de lactose no produto lácteo fermentado enquanto aumenta o teor de glicose.

[006] O documento EP-A1-2 957 180 divulga um método de produção de um produto lácteo fermentado com o uso de uma combinação de culturas iniciadoras e uma lactase convencional com o objetivo de reduzir o teor de lactose e o nível de pós-acidificação no produto lácteo fermentado.

[007] O documento WO2017216000 divulga um processo para a produção de um produto lácteo acidificado que compreende as etapas de fornecimento de um produto lácteo acidificado básico, que tem um pH entre 3 e 5 e um teor de lactose de pelo menos 1,5 mg/ml, adicionado ao produto lácteo acidificado básico uma lactase, que retém sua atividade em um pH de 5 e uma temperatura de 37°C em um nível de pelo menos 5%, em comparação com sua atividade no pH ideal da lactase, por ex. uma lactase originada de Bifidobacterium bifidum com uma atividade ideal a um pH de 6, conforme medido a uma temperatura de 37°C. Objetivo da invenção

[008] É objetivo das representações da invenção fornecer beta- galactosidases com propriedades que permitem a produção de produtos aprimorados livres de lactose ou de baixa lactose sob condições ácidas.

[009] O objetivo da presente invenção é fornecer um processo melhorado para a produção de um produto lácteo acidificado ou um produto derivado do leite com teor de lactose reduzido.

[010] É também objetivo das representações da invenção fornecer beta-galactosidases com propriedades que permitem os métodos de produção aprimorados, bem como mais fáceis, mais rápidos, mais confiáveis ou mais baratos para redução da lactose em um produto, como produtos livres de lactose ou de baixa lactose, em particular sob condições ácidas. Sumário da invenção

[011] Os presentes inventores identificaram beta-galactosidades com propriedades não descritas anteriormente que permitem a produção de produtos aprimorados livres de lactose ou de baixa lactose, bem como possibilitam métodos melhorados de produção para esses produtos livres de lactose ou de baixa lactose. Em particular, as beta-galactosidases têm se mostrado muito estáveis com atividade relativamente alta em valores de pH baixos. Isso permite o uso de beta-galactosidases em valores de pH e temperaturas específicos que não eram possíveis.

[012] A presente invenção baseia-se no reconhecimento de que uma lactase ácida (isto é, um peptídeo que apresenta atividade da enzima beta-galactosidase com um pH ideal abaixo de pH 6,7 ou abaixo de pH 5,5) tem várias vantagens quando usada em um processo para produzir um produto lácteo acidificado, por exemplo, um produto lácteo fermentado, como o iogurte, sujeito a tratamento térmico após a fermentação e adequado para armazenamento em temperatura ambiente. Esse produto também é chamado de iogurte pós-pasteurizado.

[013] Primeiramente, uma lactase ácida tem uma atividade ideal abaixo do pH 6,7, como abaixo do pH 5,5 e geralmente entre o pH 3,5 ao pH 4,5 e consequentemente tem uma atividade ideal no pH comum de um produto lácteo fermentado. Assim, a lactase tem atividade ideal tanto no final da fermentação quanto durante o armazenamento do produto lácteo fermentado, tratado termicamente ou não, o que permite uma redução na quantidade de lactase necessária para remover a lactose do produto lácteo acidificado para produzir um produto livre de lactose em comparação com uma lactase que tem uma atividade ideal em um pH neutro.

[014] Em segundo lugar, quando uma lactase for adicionada no início da fermentação a fim de produzir um produto livre de lactose, a lactase terá impacto no processo de fermentação porque a concentração de lactose será reduzida em comparação com a situação em que nenhuma lactase está presente, e esse impacto muitas vezes envolve uma série de efeitos indesejáveis. Assim, quando uma lactase é adicionada no início da fermentação, uma série de características de fermentação pode ser alterada, como o perfil do pH, o tempo e a taxa de fermentação, o metabolismo de carboidratos das bactérias de ácido láctico, a composição de carboidratos do líquido de fermentação e o pH final. Assim, as características básicas do processo de fermentação são alteradas e geralmente é necessário reajustar o funcionamento do processo de fermentação quando se usa lactases da técnica anterior.

[015] Este efeito de adicionar uma lactase no início da fermentação é particularmente forte quando uma lactase com uma atividade ideal em um pH neutro é usada, uma vez que a lactase reduzirá o nível de lactose de maneira acentuada no início da fermentação antes de qualquer queda significativa no pH ter ocorrido. A presente invenção baseia-se no reconhecimento adicional de que uma lactase ácida com uma atividade ideal em um pH baixo causará a maior parte da redução da lactose no final da fermentação e, portanto, os efeitos indesejados de submeter lactose à conversão de lactase serão minimizados.

[016] Em terceiro lugar, em um processo para a produção de um produto lácteo fermentado tratado termicamente, em que se deseja que a remoção enzimática da lactose ocorra durante o armazenamento após o tratamento térmico, até agora a única opção disponível foi adicionar a lactase após o tratamento térmico, porque as lactases são instáveis termicamente. A adição de lactase após o tratamento térmico requer uma etapa de processo especializada adicional e equipamento para adição estéril da lactase ao produto lácteo fermentado tratado termicamente. No entanto, a presente invenção baseia-se no reconhecimento adicional de que uma lactase ácida é resistente ao calor, o que em um processo que compreende um tratamento térmico após a fermentação permitirá que a lactase seja adicionada ao processo antes do tratamento térmico sem qualquer necessidade de esterilização da composição da lactase.

[017] Em quarto lugar, a presente invenção baseia-se no reconhecimento de que o fato de uma lactase ácida ser resistente tanto ao calor quanto às condições ácidas apresenta a possibilidade de usar a lactase para qualquer tipo de processo de produção de um produto lácteo acidificado e adicionar a lactase em qualquer etapa de qualquer um desses processos, incluindo no início da fermentação e antes e depois do tratamento térmico do produto lácteo acidificado. Assim, a presente invenção permite total flexibilidade no uso. Assim, para qualquer processo e fábrica existente para a produção de um produto lácteo acidificado, é possível selecionar livremente em qual etapa adicionar a lactase sem modificar o processo e de modo a otimizar o processo no que diz respeito à remoção da lactose. Da mesma forma, a flexibilidade total de uso torna possível selecionar livremente qual lactase ácida usar de forma a otimizar o processo no que diz respeito à remoção da lactose.

[018] Assim, a presente invenção refere-se a um peptídeo bacteriano que apresenta atividade da enzima beta-galactosidase que tem uma atividade ideal a um pH inferior a 6,7, como, por ex., entre o pH 3 e pH 5 quando medido a 37ºC e opcionalmente tendo uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das seguintes sequências de SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e/ou 20 ou seus fragmentos enzimaticamente ativos ou uma sequência de aminoácidos representada por uma das seguintes sequências SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 tendo não mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições de aminoácidos, adições ou exclusões.

[019] Em um aspecto relacionado, a presente invenção refere-se a um peptídeo bacteriano que apresenta atividade da enzima beta-

galactosidase que tem uma atividade ideal a um pH inferior a 5,5, como, por ex., entre o pH 3 e pH 5 quando medido a 37ºC. E opcionalmente tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 11, 12 4/ou 14 ou seus fragmentos enzimaticamente ativados ou uma sequência de aminoácidos representada pelo SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 11, 12 e/ou 14 tendo não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições de aminoácidos, adições ou exclusões.

[020] Em um aspecto aqui relacionado, a invenção refere-se a peptídeos que são caracterizados como uma enzima do tipo GH42 e tem um pH ideal abaixo de pH 6,7, como pH 5,5 e opcionalmente selecionada de uma lista que consiste no SEQ ID Nº.: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 18 ou seus fragmentos enzimaticamente ativos ou uma sequência de aminoácidos representada pelo SEQ ID Nº: 1, 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 18 tendo não mais de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições de aminoácidos, adições ou exclusões.

[021] Ainda um aspecto relacionado da invenção refere-se a um peptídeo bacteriano de acordo com qualquer um dos aspectos acima, em que o peptídeo tem uma sequência de aminoácidos representada por qualquer SEQ ID Nº: 1-20 ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequência para qualquer uma das referidas sequências; ou uma célula hospedeira que expressa qualquer um dos referidos peptídeos, para produzir um produto lácteo ou produto derivado do leite com um teor de lactose reduzido.

[022] O peptídeo da invenção pode ser derivado preferencialmente de uma bactéria de ácido lático, como, por ex., uma bactéria dos gêneros Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus.

[023] Preferencialmente, a atividade da enzima beta- galactosidase do peptídeo da invenção é determinada pela diluição de lactase em tampão (tampão de 50 mM de NaH2PO4 pH 6,7 contendo 100 µM de MgSO4) e adicionando a enzima beta- galactosidase (140 mM de lactose preparados em tampão de 100 mM de citrato de sódio de pH 4,5, contendo 100 µM de MgSO4) a uma mistura de reação que é preparada pela mistura de 13 µL de enzima diluída para 37 µL de solução de lactose e incubação por for 10 minutos a 37ºC.

[024] Dessa forma, a presente invenção também se refere a um processo para produção de um produto lácteo acidificado que compreende as etapas de: a) fornecimento de uma base láctea e b) conversão da base láctea em um produto lácteo acidificado, que tem um pH entre 3 e 5 e c) adição antes, durante ou após qualquer uma das etapas a) a b) de um peptídeo bacteriano que apresenta atividade da enzima beta-galactosidase, que tem uma atividade ideal em um pH abaixo de 6,7 quando medido a 37ºC, de preferência entre 1 e 6 quando medido a 37ºC , mais preferencialmente abaixo de 5,5 quando medido a 37ºC, ainda mais preferencialmente entre pH 3 e pH 5 quando medido a 37ºC.

[025] Ou, como alternativa, um processo para produção de um produto lácteo acidificado que compreende as etapas de: a) fornecimento de uma base láctea e b) conversão da base láctea em um produto lácteo acidificado, que tem um pH entre 3 e 5 e c) adição antes, durante ou após qualquer uma das etapas a) a b) de um peptídeo bacteriano como aqui divulgado.

[026] O processo da presente invenção pode compreender ainda a etapa de d) submissão do produto lácteo acidificado a um tratamento térmico de modo a reduzir o nível de bactérias a não mais do que 1X10exp02 CFU por g para obter um produto lácteo acidificado tratado termicamente e/ou o etapa de e) armazenamento do produto lácteo acidificado obtido na etapa b) ou o produto lácteo acidificado tratado termicamente obtido na etapa c) a uma temperatura de pelo menos 20ºC por pelo menos 1 dia.

[027] A base láctea usada na presente invenção pode ser convertida em um produto acidificado pela adição de um acidificante químico ou convertido em um produto acidificado pela fermentação com uma cultura iniciadora de bactérias de ácido lático. O peptídeo bacteriano que apresenta atividade da enzima beta-galactosidase pode preferencialmente ser adicionado na etapa b) ou, como alternativa, entre a etapa b) e c) e/ou entre a etapa c) e d).

[028] Ainda em um aspecto preferido, a presente invenção se refere a um processo onde o produto lácteo acidificado contendo o peptídeo bacteriano que apresenta atividade da enzima beta- galactosidase pode ser armazenado a uma temperatura de pelo menos 20°C ou onde o produto lácteo acidificado obtido na etapa b) ou o produto lácteo acidificado tratado termicamente obtido na etapa d) é armazenado a uma temperatura de pelo menos 20°C durante pelo menos 3 dias.

[029] Assim sendo, a presente invenção também refere-se a um produto lácteo acidificado em que o produto contém um peptídeo bacteriano que apresenta atividade da enzima beta-galactosidase, que tem uma atividade ideal a um pH abaixo de 6,7 quando medido a 37ºC, de preferência abaixo de 5,5 quando medido a 37ºC, mais preferencialmente entre 1 e 5, ainda mais preferencialmente entre pH 3 e pH 5 quando medido a 37ºC.

[030] Um produto lácteo acidificado, que tem um pH entre 3 e 5, em que o produto contém um peptídeo bacteriano de acordo com a presente invenção é incluído aqui.

[031] Além disso, a presente invenção refere-se a um produto lácteo acidificado, que tem um pH entre 3 e 5, em que o produto contém um peptídeo bacteriano que apresenta atividade da enzima beta-galactosidase que tem uma atividade ideal a um pH entre 1 e 5,5 também como o uso de uma lactase em um processo de produção de um produto lácteo acidificado a partir de uma base láctea para converter pelo menos parte da lactose presente na base láctea em glicose e galactose, em que a lactase é uma lactase ácida, que tem uma atividade ideal a um pH abaixo de 6,7 quando medido a 37ºC, de preferência abaixo de 5,5 quando medido a 37ºC, mais preferencialmente entre 1 e 5, ainda mais preferencialmente entre pH 3 e pH 5 quando medido a 37ºC.

[032] Incluído como um aspecto da presente invenção está o uso de uma lactase em um processo para a produção de um produto lácteo acidificado a partir de uma base láctea para converter pelo menos parte da lactose presente na base láctea em glicose e galactose, em que a lactase é uma lactase de ácido de acordo com a invenção. Legendas da figura

[033] Figura 1. A proporção da atividade entre os valores de pH selecionados (pH 6,7, pH 5,5 e pH 4,5 medidos a 37ºC. Divulgação detalhada da invenção

[034] Os presentes inventores descobriram que certos peptídeos e peptídeos multiméricos que apresentam atividade da enzima beta- galactosidase são surpreendentemente estáveis em muitas condições físicas diferentes, apresentando uma atividade relativamente alta fora dos intervalos normalmente vistos como ideais para esta categoria de enzimas.

[035] A lactase de ácido da presente invenção é definida como uma lactase, que tem uma atividade ideal abaixo do pH 6,7, como abaixo do pH 5,5.

[036] Em uma representação preferencial, a medição é feita de acordo com o seguinte protocolo que é também detalhado nos Exemplos aqui: As lactases, por ex., obtidas como extratos livres de célula são diluídas até 40x no tampão A (tampão de 50 mM de NaH2PO4 pH 6,7 contendo 100 µM de MgSO4). Em uma reação separada, a enzima diluída é incubada com solução de lactose preparada em tampão F (140 mM de lactose preparada em tampão de 100 mM de citrato de sódio de pH 4,5, pH 5,5 e 6,7 respectivamente, contendo 100 µM de MgSO4). A mistura da reação é preparada pela mistura de 13 µL de enzima diluída e 37 µL de solução de lactose em um tubo de PCR. A mistura da reação é incubada em um termociclador de DNA que usa os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 10 min a 37ºC, inativação de enzima; 10 min a 95ºC, armazenamento; 4ºC). As misturas da reação foram armazenadas a -20ºC até o uso posterior. O valor máximo de absorvância para cada lactase foi usado para determinar µmol de glicose formado por minuto, descrito como 1 Unidade de Atividade com Lactose ao pH 4,5, 5,5 e 6,7 a 37ºC. A alta atividade em pH relativamente baixo a 37ºC é relevante para a hidrólise da lactose nas aplicações de leite fermentado e hidrólise ácida da lactose do soro de leite.

[037] Em termos de aplicabilidade para produtos fermentados, é altamente vantajoso que as enzimas aqui descritas tenham uma alta atividade enzimática de beta-galactosidase em uma faixa de pH relativamente ampla de até 4,5, ou até 4,0, ou até 3,5, ou mesmo até o pH 3. Definições

[038] O termo “peptídeo bacteriano” ou como usado aqui e no contexto da presente invenção deve ser compreendido como um peptídeo de origem bacteriana ou um peptídeo derivado de uma bactéria. No contexto da presente invenção, as bactérias preferenciais compreendem bactérias de ácido lático, como membros dos gêneros Lactobacillus, Lactococcus ou Bifidobacterium.

[039] O termo "atividade ideal a um pH abaixo de 6,7 quando medido a 37°C", como aqui utilizado e no contexto da presente invenção, significa que uma determinada enzima é mais ativa a um pH abaixo de 6,7, como, por exemplo, entre pH 3 e pH 5, quando a referida atividade é medida a 37°C. Assim, o valor de pH mais favorável no qual a enzima é mais ativa é um pH abaixo de 6,7.

[040] O termo "atividade ideal a um pH abaixo de 5,5 quando medido a 37°C", como aqui utilizado e no contexto da presente invenção, significa que uma determinada enzima é mais ativa a um pH abaixo de 5,5, como, por exemplo, entre pH 3 e pH 5, quando a referida atividade é medida a 37°C. Assim, o valor de pH mais favorável no qual a enzima é mais ativa é um pH abaixo de 5,5.

[041] O termo "atividade ideal a um pH entre pH 3 e pH 5 quando medido a 37°C", conforme usado neste documento e no contexto da presente invenção, significa que uma determinada enzima é mais ativa a um pH entre pH 3 e pH 5, quando a referida atividade é medida a 37°C. assim, o valor de pH mais favorável no qual a enzima é mais ativa é um pH entre pH 3 e pH 5.

[042] O termo “leite”, conforme usado aqui e no contexto da presente invenção, deve ser compreendido como a secreção láctea obtida pela ordenha de qualquer mamífero, como vaca, ovelha, cabra, búfala ou camela.

[043] O termo "composição contendo lactose", como usado aqui, refere-se a qualquer composição, como qualquer líquido que contenha lactose em grau mensurável significativo, como um teor de lactose superior a 0,002% (0,002 g/100ml). Estão incluídos neste termo leite e substratos à base de leite.

[044] O termo "composição contendo teor de lactose reduzido", como usado aqui, refere-se a qualquer composição, como qualquer líquido que tenha um conteúdo de lactose inferior a 0,002% (0,002 g/100ml). Incluídos neste termo estão leite e substratos à base de leite com um teor de lactose inferior a 0,002% (0,002 g/100ml).

[045] O termo "produto lácteo ou produto derivado de leite com um teor de lactose reduzido", como usado neste documento, refere-se a um produto lácteo ou derivados de leite produzidos com um teor de lactose inferior a 0,002% (0,002 g/100ml).

[046] O termo “substrato à base de leite” ou “base láctea”, no contexto da presente invenção, pode ser qualquer material de leite processado e/ou in natura. Substratos à base de leite úteis incluem, mas não estão limitados a soluções/suspensões de qualquer leite ou produtos semelhantes ao leite compreendendo lactose, como leite integral ou com baixo teor de gordura, leite desnatado, leitelho, leite com baixo teor de lactose, leite em pó reconstituído, leite condensado soluções de leite em pó, leite UHT, soro de leite, permeado de soro de leite, soro de leite ácido, nata, produtos lácteos fermentados, como iogurte, queijo, suplemento dietético e produtos dietéticos probióticos. Em geral, o termo substrato à base de leite refere-se a um material de leite processado ou in natura que é processado posteriormente a fim de produzir um produto lácteo.

[047] O termo “pasteurização” como usado aqui refere-se ao processo de redução ou eliminação da presença de organismos vivos, como microrganismos em um substrato à base de leite. Preferencialmente, a pasteurização é obtida pela manutenção de uma temperatura específica por um determinado período. A temperatura especificada é geralmente atingida por calor. A temperatura e a duração podem ser selecionadas para matar ou inativar determinadas bactérias, como bactérias nocivas e/ou inativar enzimas no leite. Uma etapa de resfriamento rápido pode ocorrer.

[048] O termo “produto lácteo” conforme usado aqui pode ser qualquer produto alimentício em que um dos principais constituintes é à base de leite. Em geral, o constituinte principal é à base de leite e, em algumas representações, o constituinte principal é um substrato à base de leite que foi tratado com uma enzima com atividade de beta-galactosidase de acordo com um método da presente invenção.

[049] Um produto lácteo de acordo com a invenção pode ser, por exemplo, leite desnatado, leite com baixo teor de gordura, leite integral, creme, leite UHT, leite com uma vida útil prolongada, um produto lácteo fermentado, queijo, iogurte, manteiga, margarina, leitelho, bebida láctea acidificada, creme de leite, bebida à base de soro de leite, sorvete, leite condensado, doce de leite ou uma bebida láctea saborizada.

[050] Um produto lácteo pode compreender também componentes não lácteos, por ex., componentes vegetais, como, por exemplo, óleo vegetal, proteína vegetal e/ou carboidratos vegetais. Os produtos lácteos também podem compreender outros aditivos, como, por exemplo, enzimas, agentes aromatizantes, culturas microbianas, como culturas probióticas, sais, adoçantes, açúcares, ácidos, frutas, preparação de frutas, sucos de frutas ou qualquer outro componente conhecido na técnica como um componente ou aditivo de um produto lácteo.

[051] Os termos "produto lácteo fermentado" ou "produto de leite fermentado", como usados aqui, devem ser entendidos como qualquer produto lácteo em que qualquer tipo de fermentação faz parte do processo de produção. Exemplos de produtos lácteos fermentados são produtos como iogurte, leitelho, creme de leite, queijo fresco e queijo fresco. Um produto lácteo fermentado pode ser produzido por ou incluir etapas de qualquer método conhecido na técnica.

[052] O termo “fermentação” conforme usado aqui refere-se à conversão de carboidratos em álcoois ou ácidos por meio da ação de um microrganismo. De acordo com a presente invenção, em algumas representações a fermentação compreende a conversão de lactose em ácido lático. No contexto da presente invenção, “microrganismo” pode incluir quaisquer bactérias ou fungos capazes de fermentar o substrato de leite.

[053] O termo "peptídeo que apresenta atividade da enzima beta- galactosidase", como usado aqui, refere-se a qualquer peptídeo, que tem atividade enzimática para catalisar a hidrólise do dissacarídeo lactose em seus monossacarídeos componentes glicose e galactose. Esse peptídeo pode também ser referido como lactase ou simplesmente beta-galactosidase (EC: 3.2.1.23).

[054] Os termos "peptídeo" e "oligopeptídeo", conforme usados no contexto do presente pedido, são considerados sinônimos (como é comumente reconhecido) e cada termo pode ser usado de forma intercambiável conforme requer o contexto para indicar uma cadeia de pelo menos dois aminoácidos acoplada por ligações de peptidil. A palavra “polipeptídeo” é usada aqui para cadeias que contêm mais de dez resíduos de aminoácidos. Todas as fórmulas ou sequências de peptídeo e polipeptídeo neste documento são escritas da esquerda para a direita e na direção do terminal amino para o terminal carboxi. Conforme usado aqui, o termo “proteínas” refere-se a sequências de peptídeo conforme são produzidas por algum organismo hospedeiro e pode incluir modificação pós-traducionais, como glicanos adicionados.

[055] Os termos "aminoácido" ou "sequência de aminoácidos", como usados aqui, referem-se a um oligopeptídeo, peptídeo, polipeptídeo ou sequência de proteína ou um fragmento de qualquer um destes, e a moléculas sintéticas ou de ocorrência natural. Neste contexto, “fragmento” refere-se a fragmentos de um peptídeo que apresenta atividade de enzima beta- galactosidase, que retém alguma atividade enzimática. Onde "sequência de aminoácidos" é citada neste documento para se referir a uma sequência de aminoácidos de uma molécula de proteína de ocorrência natural, "sequência de aminoácidos" e termos semelhantes não se destinam a limitar a sequência de aminoácidos à sequência de aminoácidos nativa completa associada à molécula de peptídeo citada.

[056] Peptídeos de exemplo da invenção também incluem fragmentos de pelo menos cerca de 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 900, 1000, 1100 ou mais resíduos de comprimento, ou ao longo de todo o comprimento de uma enzima. Consequentemente, um "fragmento de peptídeo" ou "fragmento enzimaticamente ativo" da invenção são fragmentos que retêm pelo menos alguma atividade enzimática funcional. De modo geral, um fragmento de peptídeo da invenção ainda conterá o domínio catalítico funcional ou outros locais ativos essenciais do peptídeo que apresenta atividade da enzima beta-galactosidase. Outros domínios podem ser excluídos.

[057] A menos que indicado de outra forma, o termo "identidade de sequência" para aminoácidos, como usado aqui, refere-se à identidade de sequência calculada como (nref - ndif)·100/nref, em que ndif é o número total de resíduos não idênticos nas duas sequências quando alinhadas e em que nref é o número de resíduos em uma das sequências.

[058] Em algumas representações, a identidade de sequência é determinada por métodos convencionais, por ex., Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, pela procura de método de similaridade de Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85:2444, usando o algoritmo CLUSTAL W de Thompson et al., 1994, Ácidos Nucleicos Res 22:467380, por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group). O algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990, Mol. Biol. 215:403-10) para o qual o software pode ser obtido por meio do National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov/) pode também ser usado. Ao usar qualquer um dos algoritmos mencionados acima, são usados os parâmetros padrão para comprimento da "janela", penalidade de intervalo, extensão de intervalo, etc.

[059] Um peptídeo com uma sequência de aminoácidos específica, conforme descrito neste documento, pode variar de uma sequência de peptídeos de referência por qualquer uma das substituições, adições/inserções ou exclusões de aminoácidos.

[060] De acordo com a presente invenção, algumas representações referem-se ao uso de um peptídeo com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID Nº.: 1-20 ou uma sequência com pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das referidas sequências. Em algumas representações, esta identidade de sequência pode ser de pelo menos cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, como um peptídeo com não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou exclusões de aminoácidos em comparação com qualquer sequência de aminoácidos de referência representada pela SEQ ID Nº: 1-20. A invenção também apresenta fragmentos biologicamente ativos dos peptídeos de acordo com a invenção. Os fragmentos biologicamente ativos de um peptídeo da invenção incluem peptídeos que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas ou derivadas da sequência de aminoácidos do peptídeo da invenção que incluem menos aminoácidos do que a proteína de comprimento completo, mas que apresentam uma parte considerável da atividade do peptídeo de comprimento total correspondente. Em geral, os fragmentos biologicamente ativos compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade de uma proteína variante da invenção. Um fragmento biologicamente ativo de um peptídeo da invenção pode ser um peptídeo que tem, por exemplo, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 ou mais aminoácidos no comprimento.

[061] O termo "célula hospedeira", como usado aqui, inclui qualquer tipo de célula que é suscetível a transformação, transfecção, transdução e semelhantes com um construto de ácido nucleico ou vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica os peptídeos da presente invenção. Uma célula hospedeira pode ser o tipo de célula, da qual uma enzima específica é derivada ou pode ser um tipo de célula alternativo suscetível à produção de uma enzima específica. O termo inclui o tipo selvagem e as cepas atenuadas.

[062] A célula hospedeira adequada pode ser qualquer bactéria, incluindo bactérias de ácido lático na ordem "Lactobacillales" que inclui Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. e Propionibacterium spp. Também estão incluídos ácidos láticos que produzem bactérias pertencentes ao grupo de bactérias anaeróbicas, bifidobactérias, ou seja, Bifidobacterium spp., que são frequentemente usadas como culturas alimentícias ou em combinação com bactérias de ácido lático. Também estão incluídas nesta definição Lactococcus lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis, Lactobacillus casei subsp. casei e Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei e espécies bacterianas de ácido lático termofílicas incluem como exemplos Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e Lactobacillus acidophilus. Outras bactérias específicas dentro desta definição incluem bactérias da família Bifidobacteriaceae, como do gênero Bifidobacterium, como de uma cepa de bifidobacterium animalis ou bifidobacterium longum, bifidobacterium adolescentis, bifidobacterium bifodum, bifidobacterium breve, bifidobacterium catenulatum, bifidobacterium infantus ou do gênero Lactobacillus, como L. sakei, L. amylovorus, L. delbrueckii subsp. Lactis e L. helveticus.

[063] Também são incluídas nesta definição de células hospedeiras a cepa de Agaricus, por ex., A. bisporus; Ascovaginospora; Aspergillus, por ex., A. niger, A. awamori, A. foetidus, A. japonicus, A. oryzae; Candida; Chaetomium; Chaetotomastia; Dictyostelium, por ex., D. discoideum; Kluveromyces, por ex., K. fragilis, K. lactis; Mucor, por ex.,

M. javanicus, M. mucedo, M. subtilissimus; Neurospora, por ex., N. crassa; Rhizomucor, por ex., R. pusillus; Rhizopus, por ex., R. arrhizus, R. japonicus, R. stolonifer; Sclerotinia, por ex., S. libertiana; Torula; Torulopsis; Trichophyton, por ex., T. rubrum; Whetzelinia, por ex., W. sclerotiorum; Bacillus, por ex., B. coagulans, B. circulans, B. megaterium, B. novalis, B. subtilis, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. thuringiensis; Bifidobacterium, por ex., B. Iongum, B. bifidum, B. animalis; Chryseobacterium; Citrobacter, por ex., C. freundii; Clostridium, por ex., C. perfringens; Diplodia, por ex., D. gossypina; Enterobacter, por ex., E. aerogenes, E. cloacae Edwardsiella, E. tarda; Erwinia, por ex., E. herbicola; Escherichia, por ex., E. coli; Klebsiella, por ex., K. pneumoniae; Miriococcum; Myrothesium; Mucor; Neurospora, por ex., N. crassa; Proteus, por ex., P. vulgaris; Providencia, por ex., P. stuartii; Pycnoporus, por ex., Pycnoporus cinnabarinus, Pycnoporus sanguineus; Ruminococcus, por ex., R. torques; Salmonella, por ex., S. typhimurium; Serratia, por ex., S. liquefasciens, S. marcescens; Shigella, por ex., S. flexneri; Streptomyces, por ex., S. antibioticus, S. castaneoglobisporus, S. violeceoruber; Trametes; Trichoderma, por ex., T. reesei, T. viride; Corynebacteria; Pichia; Saccharomyces; Hansenula; Yersinia, por ex., Y. enterocolitica. Sequências

[064] Tabela 1. O número de genes com o número de identificação de sequência correspondente. Número de Número de identidade Nome da espécie genes de sequência Bifidobacterium G1 SEQ ID Nº 1 adolescentis Bifidobacterium G3 SEQ ID Nº 2 adolescentis Bifidobacterium G32 SEQ ID Nº 3 adolescentis G39 SEQ ID Nº 4 Lactobacillus amylovorus

SEQ ID Nº 5 (domínio a) G40 Lactobacillus amylovorus SEQ ID Nº 6 (domínio b) G46 SEQ ID Nº 7 Bifidobacterium bifidum G60 SEQ ID Nº 8 Lactobacillus brevis Bifidobacterium G62 SEQ ID Nº 9 catenulatum Bifidobacterium G67 SEQ ID Nº 10 pseudocatenulatum G137 SEQ ID Nº 11 Lactobacillus gasseri G140 SEQ ID Nº 12 Lactobacillus helvaticus G162 SEQ ID Nº 13 Bifidobacterium longum G166 SEQ ID Nº 14 Bifidobacterium longum G169 SEQ ID Nº 15 Bifidobacterium longum G217 SEQ ID Nº 16 Lactobacillus reuteri Lactobacillus G262 SEQ ID Nº 17 delbreuckii lactis Bifidobacterium G311 SEQ ID Nº 18 angulatum SEQ ID Nº 19 (domínio a) G330 Lactobacillus fermentum SEQ ID Nº 20 (domínio b) G500 SEQ ID Nº 21 Kluyveromyces lactis G600 SEQ ID Nº 22 Bifidobacterium bifidum SEQ ID Nº 1: G1

MRRNFEWPKLLTADGRGIAFGGDYNPDQWSEDIWDDDIRLMKQAGVNTVALAIFSWDRIQPTED RWDFGWLDRIIDKLGNAGIAVDLASATATAPLWLYESHPEVLPRDKYGHPVNAGSRQSWSPTSP VFKEYALTLCRKLAERYGTNPYVTAWHMGNEYGWNNREDYSDNALDAFRAWCRRKYGTIGALNQ AWGTTFWGQEMNGFDEVLIPRFMGADSMVNPGQKLDFERFGNDMLLDFYKAERDAIAEICPDKP FTTNFMVSTDQCCMDYAAWAEEVNFVSNDHYFHEGESHLDELACSDALMDSLALGKPWYVMEHS TSAVQWKPLNTRKRKGETVRDSLAHVAMGADAINFFQWRASAFGAESFHSAMVPHAGEDTKLFR QVCELGASLHTLADAGVQGTELAHSDTAILFSAESEWATRSQTLPSMKLNHWHDVRDWYRAFLN AGSRADIVPLAYDWSSYKTVVLPTVLILSAADTQRLADFAAAGGRVVVGYATGLIDEHFHTWLG GYPGAGDGLLRSMLGVRGEEFNILGAEAEGEPGEIRLSSADDSAALDGTTTRLWQNDVNVTGEH AQVLATYAGEEADEWELDGTAAVTRNPYGSGEAYFVGCDLDVADLTKLVRAYLAAPSQDNADVL

HTVRESADATFDFYLPRGKETVELQGIEGEPVILFQTERGKKPGSYTVHRNGVLVVRR SEQ ID Nº 2: G3

MNQRREHRWPRPLEGRRARIWYGGDYNPDQWPEEVWDEDVRLMVKAGVNLVSVGIFSWAKIEPR EDMYDFGWLDRIIDKLGKAGIAVDLASATASPPMWLTQAHPEVLWKDYRGDVCQPGARQHWRPT SPVFCEYALKLCRAMAEHYKDNPYVVAWHVGNEYGCHNRFDYSEDAERAFQDWCEERYGTIEAV NDAWGTAFWAQHLNDFSEIVPPRFIGDGNFMNPGKLLDFKRFSSDALKSFYVAERDALAEITPE KPLTTNFMVSAGGSVLDYDDWGGEVDFVSNDHYFIPGEAHLDELAFSASLVDGISRKDPWFLME HSTSAVNWRPINYRKEPGQLVRDSLAHVAMGADAVCYFQWRQSRSGAEKFHSAMLPHAGEDSQT FRDVCELGRDLGTLADEGLLGTKLAKSSVAIVFDYESEWASEHTATPTQNVHHIDEPLAWFRAL ADVGVTADVVPIRSNWDEYDVAILPSVYILSEENTRRVRDYVANGGKLIATYYTGISDERDHVW LGGYPGSIRDVVGVRIEEFAPMGSDWPGVPDHLDLDNGAVAHDIVDVIGSIGKDAKVLASFKDD PWTGMDGRPAIVSNPYGEGRSVYVGARLGRDGIARSLPMILETLGVEVKDSSDPDLLRIERVDE

STGARFTFLFNRTKEPVSMLVEGRPVVMSLADCAGATVTINPNGVLVVKQ SEQ ID Nº 3: G32

MRRNFEWPKLLTADGRGIAFGGDYNPDQWSEDIWDDDIRLMKQAGVNTVALAIFSWDRIQPTED RWDFGWLDRIIDKLGNAGIAVDLASATATAPLWLYESHPEVLPRDKYGHPVNAGSRQSWSPTSP VFKEYALTLCRKLAERYGTNPYVTAWHMGNEYGWNNREDYSDNALDAFRAWCRRKYGTIGALNQ AWGTTFWGQEMNGFDEVLIPRFMGADSMVNPGQKLDFERFGNDMLLDFYKAERDAIAEICPDKP FTTNFMVSTDQCCMDYAAWAEEVNFVSNDHYFHEGKSHLNKLACSDALMDSLALGKPWYVMEHS TSAVQWKPLNTRKRKGETVRDSLAHVAMGADAINFFQWRASAFGAESFHSAMVPHAGEDTKLFR QVCELGASLHTLADAGVQGTELAHSDTAILFSAESEQATRSQTLPSMKLNHWHDVRDWYRAFLD AGSRADIVPLAYDWSSYKTVVLPTVLILSAADTQRLADFAAAGGRVVIGYATGLIDEHFHTWLG GYPGAGDGLLRLMLGVRGEEFNILGAEAEGEPSEIRLASADDSVAMDGSTTRLWQNDVNVTGEH AQVLATYAGEEADEWELDGTAAVTRNPYGSGEAYFVGCDLDVADLTKLVRAYLAAPSQDNADVL

HTVRESADATFDFYLPRGKETVELQGIEGEPVILFQTERGKKPGSYTVHRNGVLVVRR SEQ ID Nº 4: G39

MTKTLSRFLYGGDYNPDQWTEETWPEDIKVFKKVDLNSATINIFSWAVLEPREGVYDFSKLDKI VQELSDANFDIVMGTATAAMPAWMFKKYPDIARVDYQGRRHVFGQRHNFCPNSKNYQRLDSELV EKLAQHYADNSHIVVWHVNNEYGGNCYCGNCQNAFRDWLRNKYKTLGALNKAWNMNVWSHTIYD WDEIVVPNELGDAWGPESSETIVAGLSIDYLRFQSESLQNLFKMEKAVIKKYDPETPVTTNFHS LPNKMIDYQKWAKDQDIISYDSYPTYDAPAYKPAFLYDLMRSLKHQPFMLMESAPSQVNWQSYS PLKRPGQMAATELQAVAHGADTVQFFQLKQAVGGSEKFHSAIIAHSQRTDTRAFCELADLGQKL KEAGPTILGSKTKAKVAIVFDWSNFWSYEYVDGITQDLNYVDSILDYYRQFYERNIPTDIIGVD DDFSNYDLVVAPVLYMVKAGLAEKINSYVEKGGHLVTTYMSGMVDSTDNVYLGGYPGPLKDVTG IWVEESDAMVPGQKVRVTMDGKEYETNLMCDLIHPNKAKVLASYADEFYTGTAAITENDYGKGK AWYVGTKLGHQGLTQLFNHIVLETGVESLVCDSHKLEVTKRVTADGKELYFVLNMSNEERELPN

KFADYEDILTGEKAKSSMKGWDVQVLTK SEQ ID Nº 5 (G40 domínio a)

MKANIKWLDDPEVFRINQLPAHSDHPFYKDYREWQNHSSSFKQSLNGAWQFHFSKDPQSRPIDF YKRSFDSSSFDTIPVPSEIELNGYAQNQYTNILYPWESKIYRKPAYTLGRGIKDGDFSQGKDNT VGSYLKHFDLNPALAGHDIHIQFEGVERAMYVYLNGHFIGYAEDSFTPSEFDLTPYIQAKDNIL AVEVFKHSTASWLEDQDMFRFSGIFRSVELLALPRTHLMDLDIKPTVVNDYHDGVFNAKLHFMG KTSGNVHVLIEDIDGKTLLNKKLPLKSTVEIENETFANVHLWDNHDPYLYQLIIEVHDQDGKLV ELIPYQFGFRKIEITKDHVVLLNGKRLIINGVNRHEWDAKRGRSITLADMKQDIATFKHNNINA VRTCHYPNQIPWYYLCDQNGIYMMAENNLESHGTWQKLGQVEATSNVPGSIPEWREVVVDRARS NYETFKNHTAILFWSLGNESYAGSNIAAMNKLYKDHDSSRLTHYEGVFHAPEFKKEISDLESCM YLPPKEAEEYLQNPKKPLVECEYMHDMGTPDGGMGSYIKLIDKYPQYMGGFIWDFIDQALLVHD

PVSGQDVLRYGGDFDDRHSDYEFSGDGLMFADRTPKPAMQEVRYYYGLHK SEQ ID Nº 6 (G40 domínio b)

MAYTNNLHVVYGEASLGVNGQDFAYLFSYERGGLESLKIKDKEWLYRTPTPTFWRATTDNDRGS GFNQKAAQWLGADMFTKCVGIHVQVDDHRFDELPVAPINNQFSNQEFAHEVKVAFDYETLTTPA TKVKIIYNINDFGHMTITMHYFGKKGLPPLPVIGMRFIMPTKAKSFDYTGLSGETYPDRMAGAE RGTFHIDGLPVTKYLVPQENGMHMQTNELVITRNSTQNNADKDGDFSLKITQTKQPFNFSLLPY

TAEELENATHIEELPLARRSVLVIAGAVRGVGGIDSWGSDVEEQYHIDPEQDHEFSFTLN SEQ ID Nº 7: G46

MERNMSKRRKHSWPQPLKGAESRLWYGGDYNPDQWPEEVWDDDIRLMKKAGVNLVSVGIFSWAK IEPEEGKYDFDWLDRAIDKLGKAGIAVDLASATASPPMWLTQAHPEVLWKDERGDTVWPGAREH WRPTSPVFREYALNLCRRMAEHYKGNPYVVAWHVSNEYGCHNRFDYSDDAMRAFQKWCKKRYKT IDAVNEAWGTAFWAQHMNDFSEIIPPRYIGDGNFMNPGKLLDYKRFSSDALKELYIAERDVLES ITPGLPLTTNFMVSAGGSMLDYDDWGAEVDFVSNDHYFTPGEAHFDEVAYAASLMDGISRKEPW FQMEHSTSAVNWRPINYRAEPGSVVRDSLAQVAMGADAICYFQWRQSKAGAEKWHSSMVPHAGE DSQIFRDVCELGADLGRLSDEGLMGTKTVKSKVAVVFDYESQWATEYTANPTQQVDHWTEPLDW FRALADNGITADVVPVRSDWDSYEIAVLPCVYLLSEETSRRVREFVANGGKLFVTYYTGLSDEN DHIWLGGYPGSIRDVVGVRVEEFAPMGNDMPGALDHLDLDNGTVAHDFADVITSTADTSTVLAS YKAERWTGMNEVPAIVANGYGDGRTVYVGCRLGRQGLAKSLPAMLGSMGLSDLAGDGRVLRVER

ADAAAASHFEFVFNRTHEPVTVDVEGEAIAASLAHVDDGRATIDPTGVVVLRR SEQ ID Nº 8: G60

MKRELKSKVFLHGGDYNPEQWLGEPEIINEDFALFKNAAINTVTVGIFSWAKLEPEEGKYDFAW LDDIFDRVEKMNGYVILATPSGARPAWLARKYPEVLRTDFNNQKRGFGGRHNHCLTSPIYRKKV REINTKLAEHFGKRPSLILWHISNEYSGECYCDLCQQAFRDWLKKKYRTLERLNHSWWNTFWSH TFSDWNQIHAPSPLSEMGNKGMNLDWKRFVSDQAISFIDNEVEPLRKITSEIPVTTNMMAGNPL MDPFTGYNYQEMAKHLDVISWDSYPLWGNDFQSTEKLGQNVGLIHDFFRSLKHQNFMIMENTPS RVNWADIDRAKRPGMHQLASLQDIAHSSDSVLYFQLRASRGSAEMFHGAVIEHRHPEKTRVFHD VKDVGHDLEKLESIYSTSYTKAKVGIVYDYNNIWALEDAEGYSKDKKIWQTIQSQYQYFYQNDI PVDFVSPNDNFTQYKLLIDPMHFLMTKEYMDKLESFVKKCGYVVGTYISGVVDENGLAYMNEWP KQLQSIYGIEPLETDSLYPKQSNSIEFAGHRYQAYDFCETIFKHDAKVLAKYTTDFYSGTPALT AHKCGEGKGYYIACRTDTDFLSAIYGQIVKELDLLPNLPIKKETTKISLQVRENDDEKYLFVQN

FSHEQQSILLKQKMKEMLSDEFEENKVIVKPYGTKIYQMN SEQ ID Nº 9: G62

MTQRRSYRWPQPLAGQQARIWYGGDYNPDQWPEEVWDDDVRLMKKAGVNLVSVGIFSWAKIETS EGVYDFDWLDRIIDKLGEAGIAVDLASATASPPMWLTQAHPEVLWKDYRGDVCQPGARQHWRPT SPVFREYALKLCRAMAEHYKGNPYVVAWHVSNEYGCHNRFDYSEDAERAFRKWCEERYGTIDAV NDAWGTAFWAQRMNDFTEIVPPRFIGDGNFMNPGKLLDFKRFSSDALKAFYVAERDALAEITPD LPLTTNFMVSAAGSVLDYDDWGREVDFVSNDHYFIPGEAHLDELAFSASLVDGIARKDPWFLME HSTSAVNWRPVNYRKEPGQLVRDSLAHVAMGADAVCYFQWRQSKAGAEKFHSAMVPHTGEDSAV FRDVCELGADLNTLADNGLLGTKLAKSKVAVVFDYESEWATEHTATPTQKVHHVDEPLQWFRAL ADHGVTADVVPVSSNWDEYEVVVLPSVYILSEETTRRVRDYVVNGGRLIVTYYTGLSDEKDHVW LGGYPGSIRDVVGVRVEEFMPMGDDFPGVPDCLGLSNGAVAHDIADVIGSVDGTATVLETFRDD PWTGMDGAPAIVANTFGEGRSVYVGARLGRDGIAKSLPEIFESLGMAETGENDSRVLRVEREGS

DGSRFVFSFNRTHEAVQIPFEGKIVVSSFAEVSGENVSIKPNGVIVTKQ SEQ ID Nº 10: G67

MTQRRAYRWPQPLAGQQARIWYGGDYNPDQWPEEVWDDDVRLMKKAGVNLVSVGIFSWAKIETS EGVYDFDWLDRIINKLGEAGIAVDLASATASPPMWLTQAHPEVLWKDYRGDVCQPGARQHWRPT SPVFREYALKLCRAMAEHYKGNPYVVAWHVSNEYGCHNRFDYSEDAERAFRKWCEERYGTIDAV NDAWGTAFWAQRMNDFTEIVPPRFIGDGNFMNPGKLLDFKRFSSDALKAFYVAERDALAEITPD LPLTTNFMVSAAGSVLDYDDWGREVDFVSNDHYFIPGEAHLDELAFSASLVDGIARKDPWFLME HSTSAVNWRPVNYRKEPGQLVRDSLAHVAMGADAVCYFQWRQSKAGAEKFHSAMVPHAGEDSAV FRDVCELGADLNTLADNGLLGTKLAKSKVAVVFDYESEWASEHTATPTQKVHHVDEPLQWFRAL ADHGVTADVVPVRGAWDDYEMVVLPSVYLLSEETTRRVRDYVVGGGRLVVTYYTGISDEKDHVW LGGYPGSIRDVVGVRVEEFMPMGDDFPGVPDCLGLSNGAVAHDIADVIGSVDGTATVLETFKDD PWTGMDGAPAIVAHTFGEGRSVYVGARLGRDGIALSLPEILDSLGMAEAGGNDGRVLRVEREGA

DGSRFVFSFNRTHETVRVPVEGEVVVSSFAEVSGETISIKPNGVIVTKQ SEQ ID Nº 11: G137

MKRILNTNEFLHGGDYNPEQWWDEPDVINQDFALFKQAKINTVTVGIFSWAKLEPEEGNYDFSW LDSIFDRVEEMNGHVVLATPSGARPAWLAQKYPEVLRTDNLGNKRGFGGRHNHCLTSPIYREKV REINTKLAEHFGQRKSLVLWHISNEYSGECYCESCKNAFRDWLKNKYGNLDNLNHAWWNTFWSH TYNDWSQVNPPSPLGEMGNKGMNLDWKRFITDQTISFIDNEAAPLRKITPNVPVTTNMMAGNPL MDPFAGFDYQKVAKHLDFISWDSYPAWGNDNQTTAELGRNVGLVHDFFRSLKHQNFLVMENTPS RVNWHSVDRAKRPGMHELASLQDVARGSQGVLYFQLRASRGSSEMFHGAVIEHLHPEQTRAFKD VTTVGKDLENIRPIINTNYAKARVAIVFSYDSYWALQDAESYSKDKKIWQTIQKHYRYFYKHDI PVDFVSVEDDFSNYDLLIDPMHFLMSKAYLKKLASYVKNGGRVVGTYISGVVDENDLAYMNEWP KELQDIYGVEPLETDVLYPGQSNTLNFDGHEYKAHDYCETLINCRGKVLAKYASDFYQDTPAVV EHEYGAGKGYYLACRTDYDLLEKFYEKITANLIPEFPVKKFSSNISIQVRENKDQKYYFVQNFS

DKSEQIKVDGELEDLLEKKIDRGEVVLNPFGSKIYYKKGN SEQ ID Nº 12: G140

MLEPEEGKYDFSELDKVVKKLSDANFDIVIGTSTAAMPAWMFKKYPDVARVDYQGRRHVFGQRY NFCPNSKNYQRLAGNLVEELAKHYQNNPNIVVWHVNNEYGGNCYCENCQHEFRKWLKDKYQTLD ALNKAWNMNVWSHTIYDWDEIVVSNELGDAWGPEGSETIVAGLSIDYLRFQSESLQNLFKMEKQ IIKKHDSEAPVTTNFHSLPNKMIDYQKWAKDQDIISYDSYHTYDAPTYKPAFLYNLMRSLKHQP FMLMESAPSQVNWQPYSPLKRPGQMAATELQAVAHGADTVQFFQLKQAVGGSEKFHSAVIAHSQ RTDTRVFKELVDLGHKLKRAGSTILGSTINAKVGIVFDWSNFWSYEYVDGISQDMDYVDSILDY YRQFYERNIPTDIISVDDDFSKYDLIVAPVLYMVKDGLAEKINNYVECGGNFVTTYMSGMVDST DNVYLGGYPGPLKNVTGIWVEESDAVVPGHTTTVSLKGKDYKAGFVCDLIHPEQAKVLAEYSNE FYAGTPAITENKYGQGKAWYVGTRLDHTGLTQLFNHIVLESNIESLVCDGDKLEVTKRVTQDGQ

ELYFVLNMSNEVRNLPQKFIGYQDILTDKKASDKLERWGVQVLTK SEQ ID Nº 13: G162

MTTHRAFRWPSLLTESGRGIAFGGDYNPDQWPEETLDEDIRLMGEAGVNVVSLAIFSWDKIEPV EGAFTFEWLDHVIDRLGRAGIAVDLASATAAAPLWLYESHPEVLPVDRYGHTVNAGSRQSWQPT SPVFKEYALRLCRKLAEHYKDNPYVTAWHMGNEYGWNNRYDYSDNALAAFRTWCEAKYGTIDAL NEAWGTAFWSQHVNSFDEVLLPRHMGGDAMVNPSQQLDYERFGNDMLLDFYKAERDAIEQICPD KPFTTNFMVSTDQCVMNYAKWADEVDFVSNDHYFHEGESHLDELACSDALMDSLALGKPWYVME HSTSAVQWKPLNTRKRAGELMRDSLAHVAMGADAICFFQWRQSKSGAEAFHSAMLPHAGADSKV FRGVCELGKALKTLSDAGLQGTELERAGTAILFSAESEWATRSETLPSMKLNHWHDVRDWYRGF LDAGLRADVVPLAYDWTGYKTIVLPTVLSLSDEDVLRIADFAKAGGTVIVGYAAGLIDEHFHIG LGGYPGAGNGLLRDMLGIRSEEFNILGEEAEGEPSEISLSNGLTTRLWQNDVTSVAADTTVLAS YAGESAADWELERTPAITSRPYGNGTAIYVGCDLNRHDIAQLLKALGSRWQELSAQPTESGQTP TYPTTDPRILHTIRRSADGSTRFDFYLNRSNQPVAINGVEGDPIIAHRCETDAVGYTLNRNAIL

IAKTSC SEQ ID Nº 14: G166

MERKEFKWPQPLAGNKPRIWYGGDYNPDQWPEEVWDEDVALMQQAGVNLVSVAIFSWAKLEPEE GVYDFDWLDRVIDKLGKAGIAVDLASGTASPPMWMTQAHPEILWVDYRGDVCQPGARQHWRATS PVFLDYALSLCRKMAEHYKDNPYVVSWHVSNEYGCHNRFDYSEDAERAFQKWCEKKYGTIDAVN DAWGTAFWAQRMNNFSEIIPPRFIGDGNFMNPGKLLDWKRFSSDALLDFYKAERDALLEIAPKP QTTNFMVSAGGTGIDYDKWGYDVDFVSNDHYFTPGEAHFDELAYSASLCDGIARKNPWFLMEHS SSAVNWRPINYRVEPGELVRDSLAHLAMGSDAICYFQWRQSKAGAEKWHSSMVPHAGPDSQIFR DVCELGADLNKLADEGLLSTKLVKSKVAVVFDYESQWVTEHTATPTQEVRHWTEPLAWFRALAD NGLTADVVPVRGSWDEYEAVVLPSLTILSEETTRRVREYVANGGKLFVTYYTGLVDDKDHVWLG GYPGSIRDVVGVRVEEFAPMGNDFPGAMDHLDLDNGTVAHDFADVITSVADTAHVVASFKADKW TGFDGAPAITVNDFGDGKAAYVGARLGREGLAKSLPALLEELGIETSAEDDRGEVLRVERADET

GENHFVFLFNRTHDVAVVDVEGEPLVASLAQVNESERTAAIQPNGVLVVKL SEQ ID Nº 15: G169

MTTRRTFRWPSLLTESGRGIAFGGDYNPDQWPEETLDEDIRLMVQAGVNTVALAIFSWDKIEPR EGEFTFEWLDHVIDKLGAASIAVDLASATATAPLWLYERHPEVLPIDRYGHVVNAGSRQSWQPT SPVLKEYALRLCRKLAEHYKDNPYVTAWHMGNEYGWNNRYDYSDNALAAFRTWCEAKYGTVDAL NEAWGTAFWSQHVNSFDEVLLPRHMGGDSMVNPPQQLDYERFGNDMLLDFYKAERDAIEEICPG KPFTTNFMVSTDQCTMDYAQWANEVDFVSNDHYFHEGESHLDELACSDALMDSLALGKPWYVME HSTSAVQWKPLNTRKRAGELMRDSLAHVAMGADAINFFQWRQSASGAEAFHSAMVPHAGSDTKL FRGVCELGAALKTLSDAGVQDTELKRADTAILFSAESEWATRSETLPSMKLNHWHDVRDWYRGY LDAGARADVVPLAYDWSGYQTIVLPTVIALSDEDTRRIADFAENGGTVIVGYATGLIDEHFHIG LGGYPGAGNGLLRDMLGIRSEEFNILGEEAEDEPAEIGLSNGLTTRLWQNDVTSVAPDTRVLAT YVGTAAADWELDGVPAITSHPHGQGAAIYVGCDLGRHDITHLLKELNTTAPSDERAPDQRPGGG EINAATTTAAATTHDPRILHTIRQSSDGTIRFDFYLNRSKQPVAVNGVEGDPIIAHRCETDAVG

YTLNRNAILIAKTSC SEQ ID Nº 16: G217

MMKKELPRFLYGGDYNPEQWPEETWDEDIKVFKQADINSATINVFSWALLEPQEGKYDFTKLDK IIKELTVADFDIVLATSTAAMPAWMFKKYPDVARVDYQGRRHVFGARHNFCPSSKNYRRLAKNL VEQLAKRYGDNPHIVAWHVNNEYGGNCYCEECQTEFQQWLKARYQTLDNLNHAWNMNVWSHTIH DWNEIVVPNELGDAWGPEGSETIVAGLSIDYLRFQSAQMLDLFKMEKQIIEKYDPTTLVTTNFH SLPNKMIDYQQWASAQDIISYDSYPAYDAPIYQPAFLYDLMRSLKHQPFMLMESTPSQVNWQPY SPLKRPGQMAATELQAVAHGADTVQFFQLKQALGGSEKFHGAVISHANRTDTRVFKEVAKLGHD LRKVGPVIKDSQTKARVALIFDWSNFWSFEYVDGITQDLKYVPIILDYYRQFYELNIPTDVISV DDDFRQYDLVVAPVLYMVKGGLGKKITDYVANGGNFITSFMSGMVNESDNIYPGGYPGPLKDVM GLWVEESDAILPNKDVKLTMTTGDELTGYLIADLIRLNGAHVLAEYASEFYAGTPAVTENTYSK GKAWYVGSRLDHASLRKIIMHIVDDVHLSALVKEPTELEITKRQNSAGQDIYFVLNMGKGKQPL

PVEFQKGYRDLLTGDSPETMLDSWDVEILVQE SEQ ID Nº 17: G262

MSNKLVKEKRVDQADLAWLTDPEVYEVNTIPPHSDHESFQSQEELEEGKSSLVQSLDGNWLIDY AENGQGPINFYAEDFDDSNFKSVKVPGNLELQGFGQPQYVNIQYPWDGSEEIFPPQVPSKNPLA SYVRYFDLDEALWDKEVSLKFAGAATAIYVWLNGHFVGYGEDSFTPSEFMVTKFLKKEGNRLAV ALYKYSSASWLEDQDFWRLSGLFRSVTLEAKPLLHLEDLKLTASLTDNYQKGKLEVEANIAYRL PNASFKLEVRDSEGDLVAEKVGPIRSEKLGFSLADLPVAAWSAEKPNLYQVRLYLYQAGSLLEV SRQEVGFRNFELKDGIMYLNGQRIVFKGVNRHEFDSKLGRAITEADMIWDIKTMKQSNINAVRC SHYPNQSLFYRLCDKYGLYVIDEANLESHGTWEKVGHEDPSFNVPGDDQHWLGASLSRVKNMMA RDKNHASILIWSLGNESYAGTVFAQMADYVRKADPTRVQHYEGVTHNRKFDDATQIESRMYAPA KEIEEYLTKKPAKPFISVEYAHAMGNSVGDLAAYTALEKYPHYQGGFIWDWIDQGLEKDGHLLY GGDFDDRPTDYEFCGDGLVFADRTTSPKLANVKALYSNLKLEVKDGQLFIKNDNLFTNSSAYYF LASLLVDGKLTYQSQPLTFGLEPGESGTFVLPWPEVEDEKGEIVYQVTAHLKEDLPWADEGFTV AEAEEAVTKLPEFYPAGRPELVDSDFNLGLKGNGFRILFSKAKGWPVSIKYAGREYLKRLPEFT FWRALTDNDRGAGYGYDLAKWENAGKYARLQDISYEIKENSALVKTTFTLPVALKGDLTITYEV DSLGKIAVTANFPGAVENGLLPAFGLNFALPKELSDYRYYGLGPNESYADRLEGSYLGIYQGAV EKNFTPYLRPQEAGNRSKVRYYQLFDEEGGLEFTANGADLNLSALPYSAAQIEAADHAFELTNN

YTWVRALAAQMGVGGDDSWGQKVHPEFCLDAQEARQLKLVIQPLLLK SEQ ID Nº 18: G311

MAHRRTFHWPSLLTESGRGIAFGGDYNPDQWPEDVWDDDIRLMKQAGVNTVALAIFSWDRIQPE KHRWEFGWLDCIIDKLGKAGIAVDLASATATAPLWLYEQHPEVLPHDKYGHPINAGSRQSWSPT SPVFKEYALTLCRKLAERYGTNPYVTAWHMGNEYGWNNRYDYCDNALHAFRAWCERKYGTIEAL NAAWGTTFWGQEMNGFDEVLIPRFMGADSMVNPGQKLDFERFGNDMLLDFYRAERDAIAEICPD KPFTTNFMVSTDQCCMDYADWANEVDFVSNDHYFHEGESHIDELFCSDALMDSLALGRPWYVME HSTSAVQWKDLNIRKRKGETVRDSVAHVAMGADAINFFQWRASAFGAESFHSAMVPHAGEHTKL YRSVCELGAALKTLGDAGVQGSELVRSDTAILFSAESEWATRSETLPSKKLNHWHDVRDWYRAY LDAGTRADIVPLKYDWSGYATVVLPTVLMLSAADTARLERFVRDGGTVVVGYASGLIDENFHTW LGGYPGAGDGMLRTMLGIRGEEFNILGAQAEGEPSEIRLSNGMVTRLWQNDIAVDGADTEVLAS YAGTQADEWELDGTAAITRNPYGKGMAYFVGCDLNVADLAVFVGDHLTVGQACEAGDGADYDPT ITLHTERASAEAIFDFYLPRGKNETVVSGISGEPVYRFQCDEGEAPGVYTIRRNGVLVVKRYNR

Q SEQ ID Nº 19. (G330 domínio a)

MEAELKWLDDPEVFRVNQLPAHSDHRFYRDQEEAALEKSSYVQNLNGRWGFKFSKNPMERPVDF YKLDFDRNDFGEIEVPSEIELSNFAQINYTNITMPWTGKIYRRPAYTLGDNKEEGSFSQGQDNT VGSYVRHFTLAEGLKNHDVHVVFEGVERAMYVWLNGHFIGYAEDSFTPSEFDLTPYLVDGDNLL AVEVYKHATSSWIEDQDMFRFSGIFRDVNLVAQPSIHVQDLKINARVADDMKTGSLGLVLKMVG QPGSVQVEVADQTGAAVLNRQLNADGNWTMAPVQLVGIHLWDNHHPYLYQLTLTVRDATGRVVE VIPYQFGFRRVEIDQDKVLRLNGKRLIINGVNRHEWNCHRGRAVTIEDMHTDLGIFKENNINAV RTSHYPDQIPWYYLCDREGIYMMAENNLESHATWQKFGQDEPSYNVPGSLPQWKEAVVDRARSN YEIFKNHTAILFWSVGNESYAGEDILAMNNYYKEVDDTRPVHYEGVVHTKEYRDQISDFESWMY LPPKEVEAYLKKNPDKPFIECEYMHSMGNSVGGMGSYIKLLDKYPQYCGGFIWDFVDQAIEVVD

PVTGQKSMRYGGDFDDHHADNEFSGDGICFADRTPKPAMQEVKYYYGLHK SEQ ID Nº 20: (G330 domínio b)

MDYTNKLHVVYDDNILGLDGKDFQYLFSYEQGGPESFKIKGKEWLYRSPRPTFWRATTDNDRGN GFNVSSVQWLAADYVLPCQDIALQVDGKDKKLPLAPKTNRYSNQEFAKKVKITFTYQTQTVPAT TVQVSYTVKASGKIKVNVHYTGAQLPSLPVLGWRMIMPTPATSFDYEGLSGETYPDRMAGGIEG TYHVEGLPVTPYLVPQENGMHMANKWVQITRATTLNNADPDAAPFRLKFEAPKKGKLNFSCLPY

TSAELENATHPEELPAAHRTVLVIAGEVRGVGGIDSWGADVEEKYHIDATVDHDFSFKIVPELN SEQ ID Nº 21: G500 (Enzima de referência)

MSCLIPENLRNPKKVHENRLPTRAYYYDQDIFESLNGPWAFALFDAPLDAPDAKNLDWETAKKW STISVPSHWELQEDWKYGKPIYTNVQYPIPIDIPNPPTVNPTGVYARTFELDSKSIESFEHRLR FEGVDNCYELYVNGQYVGFNKGSRNGAEFDIQKYVSEGENLVVVKVFKWSDSTYIEDQDQWWLS GIYRDVSLLKLPKKAHIEDVRVTTTFVDSQYQDAELSVKVDVQGSSYDHINFTLYEPEDGSKVY DASSLLNEENGNTTFSTKEFISFSTKKNEETAFKINVKAPEHWTAENPTLYKYQLDLIGSDGSV IQSIKHHVGFRQVELKDGNITVNGKDILFRGVNRHDHHPRFGRAVPLDFVVRDLILMKKFNINA VRNSHYPNHPKVYDLFDKLGFWVIDEADLETHGVQEPFNRHTNLEAEYPDTKNKLYDVNAHYLS DNPEYEVAYLDRASQLVLRDVNHPSIIIWSLGNEACYGRNHKAMYKLIKQLDPTRLVHYEGDLN ALSADIFSFMYPTFEIMERWRKNHTDENGKFEKPLILCEYGHAMGNGPGSLKEYQELFYKEKFY QGGFIWEWANHGIEFEDVSTADGKLHKAYAYGGDFKEEVHDGVFIMDGLCNSEHNPTPGLVEYK KVIEPVHIKIAHGSVTITNKHDFITTDHLLFIDKDTGKTIDVPSLKPEESVTIPSDTTYVVAVL KDDAGVLKAGHEIAWGQAELPLKVPDFVTETAEKAAKINDGKRYVSVESSGLHFILDKLLGKIE SLKVKGKEISSKFEGSSITFWRPPTNNDEPRDFKNWKKYNIDLMKQNIHGVSVEKGSNGSLAVV TVNSRISPVVFYYGFETVQKYTIFANKINLNTSMKLTGEYQPPDFPRVGYEFWLGDSYESFEWL GRGPGESYPDKKESQRFGLYDSKDVEEFVYDYPQENGNHTDTHFLNIKFEGAGKLSIFQKEKPF NFKISDEYGVDEAAHACDVKRYGRHYLRLDHAIHGVGSEACGPAVLDQYRLKAQDFNFEFDLAF

E SEQ ID Nº 22: G600 (Enzima de referência)

MVEDATRSDSTTQMSSTPEVVYSSAVDSKQNRTSDFDANWKFMLSDSVQAQDPAFDDSAWQQVD LPHDYSITQKYSQSNEAESAYLPGGTGWYRKSFTIDRDLAGKRIAINFDGVYMNATVWFNGVKL GTHPYGYSPFSFDLTGNAKFGGENTIVVKVENRLPSSRWYSGSGIYRDVTLTVTDGVHVGNNGV AIKTPSLATQNGGNVTMNLTTKVANDTEAAANITLKQTVFPKGGKTDAAIGTVTTASKSIAAGA SADVTSTITAASPKLWSIKNPNLYTVRTEVLNGDTVLDTYDTEYGFRWTGFDATSGFSLNGEKV KLKGVSMHHDQGSLGAVANRRAIERQVEILQKMGVNSIRTTHNPAAKALIDVCNEKGVLVVEEV FDMWNRSKNGNTEDYGKWFGQTIAGDNAVLGGDKDETWAKFDLTSTINRDRNAPSVIMWSLGNE MMEGISGSVSDFPATSAKLVAWTKAADSTRPMTYGDNKIKANWNESNTMGDNLTANGGVVGTNY SDGANYDKIRTTHPSWAIYGSETASAINSRGIYNRTTGGAQSSDKQLTSYDNSAVGWGAVASSA WYDVVQRDFVAGTYVWTGFDYLGEPTPWNGTGSGAVGSWPSPKNSYFGIVDTAGFPKDTYYFYQ SQWNDDVHTLHILPAWNENVVAKGSGNKVPVVVYTDAAKVKLYFTPKGSTEKRLIGEKSFTKKT TAAGYTYQVYEGTDKDSTAHKNMYLTWNVPWAEGTISAEAYDENNRLIPEGSTEGNASVTTTGK AAKLKADADRKTITADGKDLSYIEVDVTDANGHIVPDAANRVTFDVKGAGKLVGVDNGSSPDHD SYQADNRKAFSGKVLAIVQSTKEAGEITVTAKADGLQSSTVKIATTAVPGTSTEKTVRSFYYSR NYYVKTGNKPILPSDVEVRYSDGTSDRQNVTWDAVSDDQIAKAGSFSVAGTVAGQKISVRVTMI DEIGALLNYSASTPVGTPAVLPGSRPAVLPDGTVTSANFAVHWTKPADTVYNTAGTVKVPGTAT VFGKEFKVTATIRVQRSQVTIGSSVSGNALRLTQNIPADKQSDTLDAIKDGSTTVDANTGGGAN PSAWTNWAYSKAGHNTAEITFEYATEQQLGQIVMYFFRDSNAVRFPDAGKTKIQISADGKNWTD LAATETIAAQESSDRVKPYTYDFAPVGATFVKVTVTNADTTTPSGVVCAGLTEIELKTATSKFV TNTSAALSSLTVNGTKVSDSVLAAGSYNTPAIIADVKAEGEGNASVTVLPAHDNVIRVITESED HVTRKTFTINLGTEQEFPADSDERD

EXEMPLOS Material e métodos gerais Clonagem molecular e técnicas genéticas

[065] As técnicas para digestão com enzimas de restrição, ligação, transformação e outras manipulações de biologia molecular padrão foram baseadas em métodos descritos na literatura (Maniatis et al. “Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª edição” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Sambrook e Russell “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª edição” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; Miller “Experiment in molecular genetics” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1972); ou como sugerido pelo fabricante. O PCR foi executado em um termociclador de DNA obtido com a (Bio-Rad, EUA). O sequenciamento de DNA foi realizado pela LGC, Berlim, Alemanha. As proteínas foram analisadas por eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) sob condições de desnaturação usando dodecil sulfato de sódio em géis contendo 10% de SDS (Mini- PROTEAN® gel TGX stain-freeTM, Biorad, EUA). As concentrações de proteína foram determinadas usando o método BCA seguindo o protocolo fornecido com o kit. Cepas bacterianas, plasmídeo e condições de crescimento

[066] A cepa de Escherichia coli TOP10 (Invitrogen) foi usada para a clonagem e o isolamento de plasmídeos. A cepa de E. coli deficiente em beta-galactosidase BW25113 (Δ(araD-araB)567, ΔlacZ4787(::rrnB-3), λ-, rph-1, Δ(rhaD-rhaB)568, hsdR514) (Datsenko KA, Wanner BL; 2000, Proc Natl Acad Sci EUA. 97: 6640- 6645) foi usada em combinação com o vetor pBAD/His (obtido por meio da InvitrogenTM Life Technologies Corporation Europe BV) para produção de proteína recombinante. Meio de crescimento para expressão da proteína

[067] Foi usado meio 2xPY contendo (16 g/L BD BBLTM Phyton TM Peptona, 10 g/L de extrato de levedura, 5 g/L NaCl) para a produção de proteína recombinante. O meio de crescimento foi complementado com ampicilina (100 µg/ml) para manter o plasmídeo. A produção de proteína foi iniciada pela adição de 0,05% de arabinose para o meio de cultura.

[068] Exemplo 1: Construção do vetor de expressão para a produção de lactases

[069] O DNA genômico da bactéria de ácido lático ou bifidobactéria foi extraído com o uso de um kit comercial de extração genômica seguindo o protocolo fornecido (DNeasy, Qaigen, Alemanha). O gene da lactase foi amplificado por PCR usando dois primers sintéticos, tendo como biomassa a fonte de DNA genômico purificado, e os reagentes de PCR foram fornecidos no kit Phusion U Hot start DNA polimerase (Thermo Scientific, EUA). O gene da lactase foi clonado no códon inicial do vetor de expressão pBAD/His usando o método de clonagem USER (Nour-Eldin HH, Geu-Flores F, Halkier BA, Plant Secondary Metabolism Engineering, Methods in Molecular Biology, 643; 2010), resultando no construto de expressão. Com o método de clonagem USER foram geradas saliências complementares longas no produto PCR e no vetor de destino. Essas saliências podem se emparelhar umas com as outras para formar um produto de hibridização estável que foi usado para se transformar em E. coli sem ligação. Para a geração de saliências no produto PCR, um único resíduo de desoxiuradina é incluído na região a montante de cada primer para amplificar o DNA alvo. O gene de lactase foi amplificado usando o primer avançado (5’- ATTAACCAUGCGACGCAACTTCGAATGGCC-3’) e o primer reverso

(ATCTTCTCUTTACCGCCTTACCACGAGCACG) contendo uma uridina na 9ª posição (como mostrado em negrito), seguido pela sequência do gene de lactase. Em paralelo, o vetor DNA foi amplificado por PCR usando o par de primer avançado (5’- AGAGAAGAUTTTCAGCCTGATACAGATTAAATC-3’) e o reverso (5’- ATGGTTAAUTCCTCCTGTTAGCCCAAAAAACGG-3’) contendo resíduo de deoxiuracil único nas 9ª posições (como destacado em negrito) seguido pela sequência do vetor DNA. Os produtos PCR foram purificados com o uso do kit de purificação de PCR comercial (Qiagen, Dinamarca). Os produtos PCR purificados (gene da lactase e o vetor DNA) foram misturados em quantidade equimolar e incubados com uma mistura enzimática comercial USER (New England Biolabs, EUA) seguindo o protocolo fornecido. Essas enzimas removem o resíduo de uracil e também o pequeno fragmento a montante da uridina, criando assim uma saliência complementar nos produtos PCR. Essas saliências complementares sem emparelham umas com as outras resultando no vetor de expressão pBAD- lactase. Alíquotas da mistura de ligação foram transformadas em células de E. coli TOP 10 quimicamente competentes. Os transformantes foram selecionados a 37ºC em placas LB-Amp (LB; Luria-Bertani, Amp; 100 µg/ml de ampicilina). No dia seguinte, o PCR da colônia foi realizado com o uso de uma pequena biomassa proveniente do transformante que cresceu durante a noite usando os primers de vetor (primer 1; 5’-CGGCGTCACACTTTGCTATGCC-3’ e primer 2; 5’-CCGCGCTACTGCCGCCAGGC-3’). Os clones positivos do PCR da colônia foram cultivados em 5 mL de meio LB-Amp e o DNA de plasmídeo foi isolado das células. O gene da lactase clonado foi sequenciado para verificar se nenhuma mutação adicional foi introduzida durante a amplificação do gene. O DNA de plasmídeo foi transformado no hospedeiro de expressão da cepa de E. coli BW25113.

[070] Exemplo 2: Expressão de lactases em hospedeiro de expressão de E. coli

[071] A enzima lactase foi produzida em E. coli BW25113 usando o sistema de expressão pBAD. As células de E. coli BW25113 recém- transformadas carregando DNA de plasmídeo foram coletadas de uma placa Lb-Amp usando uma alça estéril e usada para inocular 5 mL de meio Lb-Amp. A cultura que cresceu durante a noite (200 µL) foi usada para inocular 50 mL do meio 2X PY (contendo 100 µg/mL de ampicilina) em um frasco de 250 mL em um agitador (Innova® 42). A cultura cresceu a 37ºC a 220 rpm até que o OD600 ficou entre 0,6-0,8. A expressão da lactase foi iniciada pela adição de arabinose a 0,05% ao meio de cultura e as células foram cultivadas por mais 16-20 horas a 18°C a 180 rpm. As células foram cultivadas por centrifugação (5000 rpm, 10 min a 4ºC) e foram armazenadas a -20ºC até o uso futuro.

[072] Exemplo 3: Determinação da atividade usando enzimas em lactose como substrato em pH 6,7 a 37ºC

[073] Para medir a atividade beta-galactosidase, as lactases foram diluídas para 40x em tampão A (tampão de 50 mM de NaH2PO4 pH 6,7 contendo 100 µM de MgSO4). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com solução de lactose preparada em tampão B (140 mM de lactose preparada em tampão de 100 mM de citrato de sódio de pH 6,7, contendo 100 µM de MgSO4). A mistura da reação foi preparada pela mistura de 13 µL de enzima diluída e 37 µL de solução de lactose em um tubo de PCR. A mistura da reação foi incubada em um termociclador de DNA com os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 10 min a 37ºC, inativação de enzima; 10 min a 95ºC, resfriamento; 4ºC). As misturas da reação foram armazenadas a -20ºC até o uso posterior. Para determinar a quantidade de glicose formada durante a reação, 10 µL da mistura de reação foram transferidos para um poço de placa de microtitulação padrão (Thermo Fischer Scientific, Dinamarca) contendo 80 µL de tampão C (tampão de 100 mM de NaHNaH2PO4, pH 7, contendo glicose oxidase; 0,6 g/L (Sigma Aldrich), 2,2'-azino-bis(sal de 3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico diamônio); ABTS: 1,0 g/L (Sigma Aldrich), peroxidase de rábano; 0,02 g/L (Sigma Adrich)) e incubado a 30ºC por 40 min. Após 40 min, a absorvância foi determinada a 610 nm usando o leitor de placa UV SpectroStar Omega (BMG Labtech, Alemanha). Os valores de absorbância entre 0,1 e 1,5 foram usados para os cálculos, se o valor de A610 nm> 1,5, a mistura de reação foi diluída até 10x com tampão A. Com cada enzima, as reações foram realizadas três vezes e o valor médio da medição triplicada foi usado para o cálculo. A purificação da proteína realizada com as células de E. coli transformadas com pBAD/His vazio foi usada para normalização. Usando uma concentração conhecida de glicose (0–2,5 mM), uma curva padrão foi desenhada e a inclinação da curva foi usada para calcular a glicose formada durante a reação. O valor máximo de absorvância para cada lactase foi usado para determinar µmol de glicose formado por minuto, descrito como 1 Unidade de Atividade com Lactose ao pH 6,7 a 37ºC. A atividade das sequências de referência SEQ ID Nº: 21 e SEQ ID Nº: 22 foi determinada em condições semelhantes.

[074] Exemplo 4: Determinação da atividade usando enzimas em lactose como substrato em pH 5,5 a 37ºC

[075] As lactases, foram diluídas até 40x no tampão A (tampão de 50 mM de NaH2PO4 pH 6,7 contendo 100 µM de MgSO4). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com solução de lactose preparada em tampão E (140 mM de lactose preparada em tampão de 100 mM de citrato de sódio de pH 5,5, contendo 100 µM de MgSO4). A mistura da reação foi preparada pela mistura de 13 µL de enzima diluída e 37 µL de solução de lactose em um tubo de PCR. A mistura da reação foi incubada em um termociclador de DNA que usa os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 10 min a 37ºC, inativação de enzima; 10 min a 95ºC, armazenamento; 4ºC). As misturas da reação foram armazenadas a -20ºC até o uso posterior. O valor máximo de absorvância para cada lactase foi usado para determinar µmol de glicose formado por minuto, descrito como 1 Unidade de Atividade com Lactose ao pH 5,5 a 37ºC. O valor máximo de absorvância para cada lactase foi usado para determinar µmol de glicose formado por minuto, descrito como 1 Unidade de Atividade com Lactose ao pH 5,5 a 37ºC. A atividade das sequências de referência SEQ ID Nº: 21 e SEQ ID Nº: 22 foi determinada em condições semelhantes.

[076] Exemplo 5: Determinação da atividade usando enzimas em lactose como substrato em pH 4,5 a 37ºC

[077] As lactases, foram diluídas até 40x no tampão A (tampão de 50 mM de NaH2PO4 pH 6,7 contendo 100 µM de MgSO4). Em uma reação separada, a enzima diluída foi incubada com solução de lactose preparada em tampão F (140 mM de lactose preparada em tampão de 100 mM de citrato de sódio de pH 4,5, contendo 100 µM de MgSO4). A mistura da reação foi preparada pela mistura de 13 µL de enzima diluída e 37 µL de solução de lactose em um tubo de PCR.

A mistura da reação foi incubada em um termociclador de DNA que usa os seguintes parâmetros de incubação (tempo de reação; 10 min a 37ºC, inativação de enzima; 10 min a 95ºC, armazenamento; 4ºC). O valor máximo de absorvância para cada lactase foi usado para determinar µmol de glicose formado por minuto, descrito como 1 Unidade de Atividade com Lactose ao pH 4,5 a 37ºC.

O valor máximo de absorvância para cada lactase foi usado para determinar µmol de glicose formado por minuto, descrito como 1 Unidade de Atividade com Lactose ao pH 4,5 a 37ºC.

A atividade das sequências de referência SEQ ID Nº: 21 e SEQ ID Nº: 22 foi determinada em condições semelhantes.

Claims

Reivindicações

1. Um peptídeo bacteriano caracterizado por apresentar atividade da enzima beta-galactosidase que tem uma atividade ideal a um pH abaixo de pH 6,7 quando medido a 37ºC e em que o peptídeo bacteriano tem uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das seguintes sequências ID SEQ Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 e/ou 20 ou seus fragmentos enzimaticamente ativos ou uma sequência de aminoácidos representada por uma das seguintes sequências ID SEQ Nº: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 não tendo mais do que 1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou exclusões de aminoácidos ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das referidas sequências.

2. Peptídeo bacteriano, de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado pelo fato de o peptídeo bacteriano ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequência com qualquer uma das referidas sequências, de preferência com pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da identidade de sequência a qualquer uma das referidas sequências.

3. Peptídeo bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de ter uma atividade ideal a um pH abaixo de pH 5,5 quando medido a 37ºC, de preferência por ter uma atividade ideal a um pH entre pH 3 e pH 5 quando medido a 37ºC.

4. Peptídeo bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de o peptídeo bacteriano ter uma sequência de aminoácidos representada por ID SEQ Nº: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 11, 12 e/ou 14 ou seus fragmentos enzimaticamente ativos ou uma sequência de aminoácidos representada por ID SEQ Nº: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 11, 12 e/ou 14 tendo não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 substituições, adições ou exclusões de aminoácidos ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 80% de identidade de sequência com qualquer uma das referidas sequências, de preferência com pelo menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer uma das referidas sequências.

5. Peptídeo bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de o peptídeo bacteriano ser derivado de uma bactéria de ácido lático, de preferência derivada de uma bactéria de ácido lático dos gêneros Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus.

6. Peptídeo bacteriano, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a atividade da enzima beta-galactosidase ser determinada pela diluição do peptídeo bacteriano em tampão (tampão de 50 mM de NaH2PO4 pH 6,7 contendo 100 µM de MgSO4) e adicionando o referido peptídeo bacteriano (140 mM de lactose preparada em tampão de 100 mM de citrato de sódio de pH 4,5, contendo 100 µM de MgSO4) para uma mistura de reação que é preparada pela mistura de 13 µL de peptídeo bacteriano diluído com 37 µL de solução de lactose e incubação por 10 min a 37ºC.

7. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de expressar o peptídeo bacteriano de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para a produção de um produto lácteo ou um produto derivado de lácteo com um teor de lactose reduzido.

8. Processo para produção de um produto lácteo acidificado caracterizado por compreender as etapas de: a) fornecimento de uma base láctea e b) conversão da base láctea em um produto lácteo acidificado, que tem um pH entre 3 e 5 e c) adição antes, durante ou após qualquer uma das etapas a) a b) de um peptídeo bacteriano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 anteriores.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8 anterior, caracterizado também por compreender as etapas de: d) submissão do produto lácteo acidificado a um tratamento térmico de modo a reduzir o nível de bactérias a não mais do que 1X10exp02 UFC por g para obter um produto lácteo acidificado tratado termicamente.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-9 anteriores, caracterizado também por compreender as etapas de: e) armazenamento do produto lácteo acidificado obtido na etapa b) ou do produto lácteo acidificado tratado termicamente obtido na etapa d) a uma temperatura de pelo menos 20°C, de preferência por pelo menos 1 dia, mais preferencialmente por pelo menos 3 dias.

11. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 8-10, caracterizado pelo fato de a base láctea ser convertida em um produto de leite acidificado por adição de um acidificante químico e/ou por fermentação com uma cultura do iniciador de bactéria de ácido lático.

12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 8-11, caracterizado pelo fato de o peptídeo bacteriano que apresenta atividade da enzima beta-galactosidase ser adicionado na etapa b) e/ou o peptídeo bacteriano que apresenta atividade da enzima beta-galactosidase ser adicionado entre as etapas b) e c) e/ou o peptídeo bacteriano que apresenta atividade da enzima beta-galactosidase ser adicionado entre a etapa c) e d).

13. Um produto lácteo acidificado, que tem um pH entre 3 e 5, caracterizado pelo fato de o produto conter um peptídeo bacteriano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6.

14. Uso de um peptídeo bacteriano de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores 1-6 caracterizado por ser como uma lactase em um processo para a produção de um produto lácteo acidificado a partir de uma base láctea para converter pelo menos parte da lactose presente na base láctea em glicose e galactose.

15. Uma composição caracterizada por compreender um peptídeo bacteriano de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 anteriores.