CN104254600B - 乳酸菌用于制造具有增强的天然甜度的发酵食品的用途 - Google Patents
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Abstract
乳品工业如今面临着一个提供将甜味剂加入发酵乳制品中的替代法以达到所需甜味而不增加热量的问题。而且，建立一种将发酵乳制品中乳糖降至乳糖不耐症消费者可接受的水平的方法将是非常有利的。以上问题已通过提供突变的嗜热链球菌菌株和突变的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株加以解决，当利用所述的嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株接种并发酵乳时，所述菌株分泌出葡萄糖到乳中。因此，本发明涉及发酵期间将葡萄糖分泌到乳底物中的嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，以及包含所述嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的混合培养物，包含所述菌株的起子培养物以及利用所述培养物制造的乳制品。本发明还涉及所述菌株用于降低发酵食品中乳糖含量以及促进益生
Description
技术领域
本发明涉及通过分泌出高含量的因乳糖降解形成的葡萄糖而具有增甜性的嗜热链球菌细菌菌株以及培养物、通过分泌出高含量的因乳糖降解形成的葡萄糖而具有增甜性的德氏乳杆菌保加利亚亚种细菌菌株、包含所述菌株的起子培养物、以及利用所述培养物发酵的乳制品。本发明还涉及一种获得所述菌株的方法以及所述菌株用于制备发酵乳制品和用于增加发酵乳制品甜度同时降低该发酵乳制品的乳糖含量的用途。
背景技术
纯发酵乳制品是通过因发酵期间乳酸菌将乳糖转化为乳酸而导致的刺酸味或酸味识别。因此，通常加入水果、蜂蜜、糖或人造甜味剂使它们增甜以适应消费者对较甜产品的需求。
食品企业对低热量甜味食品具有日益增长的高需求以协助解决过重和肥胖问题，在过去的20年里，这些问题已变得非常突出。甜味，常被认为一种令人愉悦的感觉，通过糖和一些其它物质的存在加以产生。对糖的感知非常困难。将蔗糖作为100参照，乳糖甜度是16，半乳糖是32而葡萄糖是74(Godshall(1988).Food Technology42(11):71-78)。因此，葡萄糖被认为比乳糖甜4倍以上，但也具有大致相同水平的热量。
发酵食品中的糖更常见地是用甜味剂(例如，阿斯巴甜、乙酰舒泛钾、三氯蔗糖和糖精)替代，它们可以较低的热量摄入量提供甜度。但是，使用人造甜味剂可产生异味并且多项研究表明食用人造甜味剂与例如饥饿感增强、过敏、癌症等的缺点有关，所述研究促使消费者偏爱只含有天然甜味剂或优选地不含添加甜味剂的发酵乳制品。
因此，开发出高天然(内在)甜度的发酵乳制品存在特定挑战。
发酵乳制品的酸度很大程度上取决于存在的乳酸菌以及用于制备发酵乳制品的工艺参数。
大量地研究了乳酸菌的二糖乳糖的发酵，因为其是乳中的主要碳源。在很多物种中，乳糖在吸收后被β-半乳糖苷酶裂解成葡萄糖和半乳糖。葡萄糖因葡萄糖激酶磷酸化成6-磷酸葡萄糖，并被大部分乳酸菌通过埃姆登-迈耶霍夫-帕那斯途径(糖酵解)发酵。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是商业高温乳发酵中最常用乳酸菌中的一种，其中所述生物体一般用作混合的起子培养物的一部分，另一种组分是乳杆菌，例如，用于酸奶的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)或用于瑞士型奶酪的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。
在很多国家，酸奶的法律定义需要嗜热链球菌以及德氏乳杆菌保加利亚亚种。两物种均产生所期望量的乙醛，酸奶中一种重要的风味组分。
乳糖和蔗糖比其组分单糖更易经嗜热链球菌发酵。当使用嗜热链球菌时，在过量的半乳糖存在下，只有乳糖分子的葡萄糖部分得以发酵并且半乳糖积聚在发酵乳制品中。在高酸浓度限制发酵的酸奶中，游离半乳糖残留，而在瑞士奶酪制造的早期阶段所产生的游离半乳糖随后经瑞士乳杆菌发酵。
但是，嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的半乳糖发酵菌株已被多个研究者报道(Hutkins等(1986)J.Dairy Sci.69(1):1-8；Vaillancourt等(2002)J.Bacteriol.184(3)；785-793)并且在WO2011/026863(Chr.Hansen)中，描述了一种获得半乳糖发酵的嗜热链球菌菌株的方法。
为了满足食品工业的要求，需要提出新菌株，特别是嗜热链球菌菌株和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，它们通过分泌出葡萄糖而直接地提供给发酵产品无额外热量的更加自然的甜度(内在甜度)。
Pool等(2006.Metabolic Engineering8(5)；456-464)公开了乳酸乳球菌菌株，其中葡萄糖代谢通过编码葡萄糖激酶，EII(man/glc)和新发现的葡萄糖-PTS EII(cel)的基因的缺失被完全地破坏。构建方法是基因重组以生成所有的突变，所得菌株因此是一种转基因生物(GMO)，目前不能在食品中使用。
Thompson等(1985.J Bacteriol.162(1)；217-223)研究了乳酸链球菌(目前重命名为乳酸乳球菌)中的乳糖代谢。在此研究中，将2-脱氧葡萄糖用于获得甘露糖-PTS系统的突变体。随后，利用紫外诱变使此突变体被诱变，然后通过影印接种法筛选出葡萄糖阴性菌落。以此，分离出双重突变体(甘露糖PTS和葡萄糖激酶)。将此双重突变体用于研究通过“起子”生物体调节乳糖发酵所涉及的代谢。这些突变体与它们的母株相比具有多个不足，使其不适于包含在商用起子培养物中。突变体的每摩尔发酵乳糖的细胞得率是母株的一半，并且当在乳糖上生长时，突变体的倍增时间明显增加。同样，每摩尔发酵乳糖的乳酸得率是母株的一半。没有对这些菌株在乳中的行为进行分析，但预计酸化率将明显下降。
此外，乳酸乳球菌基本上不选来制得乙醛并且不促进满足对酸奶的法律定义的要求。
Chervaux等(2000.Appl.And Environ.Microbiol.,66,5306-5311)研究了德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在新颖的化学定义的培养基中的生理学，并分离了葡萄糖发酵缺陷的2-脱氧葡萄糖抗性突变体。观察到多种不同的表现型并报道了菌株特异性效应。
上述方法都没能解决提供以下嗜热链球菌菌株以及德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的问题，这些菌株具有天然地增甜使用这些菌株单独或与其它乳酸菌菌株一起发酵的食品的提高的性质。
另外，以上方法都没能解决将使用这些菌种发酵的食品中乳糖含量降至乳糖不耐受个体可耐受的水平的问题。
发明内容
与上述现有技术相比，本发明者发现葡萄糖激酶(glcK)基因突变的嗜热链球菌菌株可通过使半乳糖-发酵的嗜热链球菌菌株暴露于2-脱氧葡萄糖来选择，并且这些细胞当在乳底物上生长时消化乳糖和半乳糖并将葡萄糖分泌到环境中。
令人吃惊的是，这些嗜热链球菌菌株单独仍可完全地酸化乳，虽然酸化到pH5的时间延长了2-5小时。因此，它们可如此用于发酵乳的用途。
但是，葡萄糖被用作多种乳酸菌的碳源，并且任何分泌的葡萄糖均可被发酵乳制品中存在的其它微生物消耗。
为了解决这个问题，本发明提供了德氏乳杆菌保加利亚亚种的2-脱氧葡萄糖抗性突变体，其或者失去了在作为碳源的葡萄糖上生长的能力，或者表现出在这种条件下生长的受损能力。德氏乳杆菌保加利亚亚种的突变株不仅不消耗通过可能存在的其它微生物分泌到乳中的葡萄糖，它们还分泌出大量的葡萄糖到周围的培养基中，并且令人吃惊的是，该突变株仍完全能够酸化乳，虽然酸化到pH5的时间延长了2-5小时。因此，它们可如此用于发酵乳的应用中。
这种食品级细菌可用于以葡萄糖强化发酵乳制品。葡萄糖具有比乳糖和半乳糖更高的感知甜度，因此，葡萄糖分泌到乳底物中将使发酵乳制品得到更高的感知(内在)甜度。
本发明的发明者发现当乳底物利用根据本发明的嗜热链球菌菌株以及德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株发酵时，乳中乳糖水平明显降低。
乳糖不耐症是一种因不能消化乳糖而引起的病症。大多数乳糖不耐受个体可耐受他们饮食中的一定量乳糖并且他们症状的严重程度(包括恶心、腹痛、腹胀、腹泻和气胀)随着消耗的乳糖量增加。
因此，工业中非常重要的是可制得不含乳糖或具有低含量乳糖的食品。
迄今，在EU中，尚未对低乳糖和不含乳糖的食品的乳糖含量定义出一般限值，但是芬兰食品安全局Evira声明不含乳糖的食品的北欧限值是小于10mg/100g或100ml的乳糖含量而低乳糖食品是小于1g/100g或100ml的乳糖含量。
乳品工业如今面临着提供一种将甜味剂加入发酵乳制品中的替代选择以达到所期望的甜味但不增加热量。并且，建立一种将发酵乳制品中乳糖降至乳糖不耐受消费者可接受的水平的方法将是非常有利的。
以上问题已通过提供下述突变的嗜热链球菌菌株以及突变的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株得以解决：当使9.5％B-乳接种106-107CFU/ml的根据本发明的嗜热链球菌菌株或106-107CFU/ml的根据本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株并利用根据本发明的嗜热链球菌菌株或德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在40℃下发酵至少20小时后，所述菌株将葡萄糖分泌到所述乳中。优选地，当使9.5％B乳接种106-107CFU/ml的根据本发明的嗜热链球菌菌株或106-107CFU/ml的根据本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株并利用根据本发明的嗜热链球菌菌株或德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在40℃下发酵至少20小时后，这些突变菌株单独将分泌至少5mg/ml葡萄糖到B乳中。所述菌株仍完全能够酸化乳液，尽管酸化到pH5的时间延长了2-5小时。最终的发酵乳在所述发酵乳中包含少于15mg/ml乳糖。最终的发酵乳因此具有约2倍或更高的较高的内在甜度指数。
为了提供嗜热链球菌菌株，本发明者已发现一种从半乳糖-发酵的嗜热链球菌母株中分离出2-脱氧葡萄糖抗性突变菌株——优选地，在增加先前低表达或不表达操纵子的表达的半乳糖操纵子中具有突变的菌株——的方法，其中，2-脱氧葡萄糖抗性表型是由部分地或完全地使所编码蛋白质钝化的葡萄糖激酶(glcK)基因的突变引起的。本发明包括使母株经受2-脱氧葡萄糖并选择出可在2-脱氧葡萄糖存在下、在包含M17培养基+2％半乳糖的琼脂平板上生长的突变菌种，例如文中实施例1中所述。筛选出这些突变体并选出生长速率在M17培养基+2％半乳糖中比在M17培养基+2％葡萄糖中更高的菌种。
令人吃惊地发现，葡萄糖激酶基因(glcK)突变但具有明显正常功能的葡萄糖转运系统的嗜热链球菌的突变菌株分泌葡萄糖。这些突变体被称为CHCC15757和CHCC15887。
而且，发明者发现具有甚至更高的乳糖发酵以及葡萄糖分泌能力的嗜热链球菌菌株可通过使葡萄糖激酶基因突变的嗜热链球菌菌株经受2-脱氧葡萄糖并选择出在9.5％B乳中不能生长(除非将蔗糖以少到0.01％的浓度加入B乳中)的菌种而选出。将一种这样的高-乳糖发酵和葡萄糖分泌的突变体称为CHCC16404。
发现CHCC16404在葡萄糖转运体基因(manM)中出现突变，使负责葡萄糖进入细胞的转运的葡萄糖转运蛋白钝化。
为了提供德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，本发明者发现了一种分离德氏乳杆菌保加利亚亚种母菌株的2-脱氧葡萄糖抗性突变菌株的方法，该突变菌株或者失去了在作为碳源的葡萄糖上生长的能力，或者具有在作为碳源的葡萄糖上生长的受损能力。所述方法包括使所述母菌株经受2-脱氧葡萄糖并选择出可在2-脱氧葡萄糖存在下、在包含含有2％乳糖的MRS-IM培养基的琼脂平板上生长的突变菌株，如文中实施例5所述。筛选出这些突变体并选出当与可在葡萄糖上生长的母菌株相比，完全失去在含有2％葡萄糖的MRS-IM上生长的能力或该能力受损的菌株。
根据此惊人的发现，本发明涉及乳酸菌的将葡萄糖分泌到发酵产品中以提供天然甜度而没有额外热量的新颖菌株，例如特别是glcK基因突变的嗜热链球菌或德氏乳杆菌保加利亚亚种突变体，并涉及一种产生所述菌种的方法、使用所述菌株制得的发酵乳制品、以及所述菌株用于生产甜度增加并且乳糖含量降低的发酵乳制品的用途。
而且，令人吃惊地发现本发明的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株促进动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)菌株
(一种当单独存在于乳中时不能很好生长的益生菌)的生长。
附图说明
图1是嗜热链球菌中乳糖分解代谢的示意图。GlcK，葡萄糖激酶；LacS,乳糖转运体；LacZ，β-半乳糖苷酶；GalM，变旋酶；GalK，半乳糖激酶；GalT，半乳糖-1-磷酸尿苷转移酶；GalE，UDP-葡萄糖4表异构酶；Gal1P，半乳糖-1-磷酸。
图2描述了嗜热链球菌的葡萄糖激酶基因(glcK)的DNA序列(SEQ ID NO.1)以及编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。显示了分别在CHCC15757和CHCC15887中所发现的单核苷酸置换。
图3描述了嗜热链球菌中编码葡萄糖/甘露糖磷酸转移酶系统(PTS)的man操纵子。当与母菌株CHCC15757比较时，发现高-乳糖发酵和葡萄糖分泌的突变体CHCC16404在编码葡萄糖/甘露糖PTS的IICMan蛋白质的manM基因中发生突变。G到T的突变将氨基酸位置209的谷氨酸的GAA密码子变成TAA终止密码子(*)，使得CHCC16404中的翻译终止并且所述蛋白质的功能钝化。
图4描述了嗜热链球菌菌株CHCC15757的manM基因的DNA序列(SEQ ID NO.5)以及编码的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)。显示了CHCC16404中所见的单核苷酸置换。
具体实施方式
如文中所用，术语“乳酸菌”指一种革兰氏阳性的微需氧或厌氧菌，其发酵糖并产酸，包含作为主要所产生的酸的乳酸、乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸菌在目“乳杆菌”中可见，其包括乳球菌属、链球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属、短杆菌属、肠球菌属和丙酸杆菌属。通常将乳酸菌(包括物种乳杆菌和嗜热链球菌的细菌)以用于批量起子增殖的冷冻或冷冻干燥的培养物形式或以所谓的“直投式”(DVS)培养物形式供应给乳品工业，意欲直接接种到发酵容器或桶中以生产乳制品，例如发酵乳制品。一般将这种培养物称为“起子培养物”或“起子”。
在描述本发明的全文(尤其在以下的权利要求中)中的术语“a/an(一)”和“所述/该”的使用被视为涵盖单数和复数，除非文中另外指明或根据上下文明显矛盾。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被视为开放性术语(即，意指“包含/包括但不限于”)，除非另外指出。文中数值范围的叙述仅仅用作单独地指属于此范围内的每个单独数值的速记法，除非文中另外指出，将每个单独数值并入说明书中，好像文中单独地叙述一般。文中所述的所有方法可以任何适宜的顺序进行，除非文中另外指出或根据上下文明显矛盾。文中提供的任何和所有实施例，或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅用于更好地阐述本发明并不对本发明范围造成限制，除非另外要求。说明书中任何语言都不应被视为任何非要求保护的元素对对本发明实施是关键的。
在一些国家，酸奶的法律定义需要嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种二者的存在。两个物种均产生所期望量的乙醛，酸奶中一种重要的风味组分。
奶酪(例如马苏里拉奶酪和比萨奶酪以及羊乳酪(Feta))也可利用嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵制得(
等(2010)The Technology of Cheesemaking,第二版Blackwell Publishing,Oxford；166-192)。
为了满足食品工业的需求，理想的是开发新菌株，特别是德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和嗜热链球菌菌株，其在发酵产品中直接产生更高的天然甜度(内在甜度)，而不产生额外的热量。
嗜热链球菌是用于商业乳品发酵的最广泛使用的乳酸菌中的一种，其中所述生物体一般用作混合起子培养物的一部分，另一种组分是乳杆菌，例如用于酸奶的德氏乳杆菌保加利亚亚种和用于瑞士型奶酪的瑞士乳杆菌。
乳糖和蔗糖比其组分单糖更易经嗜热链球菌发酵。当使用嗜热链球菌时，只有乳糖分子的葡萄糖部分被嗜热链球菌发酵并且半乳糖积聚在发酵乳制品中。在高酸浓度限制发酵的酸奶中，游离半乳糖残留，而在瑞士奶酪制造的早期阶段所产生的游离半乳糖随后被瑞士乳杆菌发酵。在用于奶酪制造的多种起子培养物中所见的乳酸乳球菌也可消耗嗜热链球菌所产生的半乳糖。
为了确保嗜热链球菌菌株的生长性能尽可能最佳，本发明者使嗜热链球菌的半乳糖-发酵的菌株暴露于选择剂2-脱氧葡萄糖。一般而言，2-脱氧葡萄糖抗性突变体在编码葡萄糖激酶的基因中以及在针对葡萄糖转运编码的基因中发生突变。具有2-脱氧葡萄糖抗性的分离的突变体CHCC15757、CHCC15887和CHCC16404在它们的葡萄糖激酶(glcK)基因中有突变。除了葡萄糖激酶基因中的突变以外，本发明者发现CHCC16404在葡萄糖/甘露糖转运体基因中具有终止密码子突变，这可解释输出的葡萄糖没有再次被转运回细胞中的原因。
令人惊讶的是，这些突变体单独仍完全能够酸化乳，尽管酸化到pH 5的时间延长了2-5小时。因此，它们可如此用于发酵乳的应用并且它们保留了母菌株凝结乳(此为酸奶特征)的能力。此外，发现当使9.5％B乳接种106-107CFU/ml的嗜热链球菌菌种CHCC15757或CHCC15887并在40℃下发酵至少20小时(无需分离出葡萄糖转运突变体)后，或当使含有0.05％蔗糖的9.5％B乳接种106-107CFU/ml的嗜热链球菌菌株CHCC16404并在40℃下发酵至少20小时后，这些突变体分泌高于5mg/ml的葡萄糖。同时，少至约10mg/ml乳糖和少于1.5mg/ml乳糖(检测限)分别留存在发酵乳中。因此，使用这样的菌株来制造发酵乳品对于乳糖不耐症人士会是重要的。
因此，最终的发酵乳具有根据Godshall(1988.Food Technology42(11):71-78)所述计算的至少2.0的更高内在甜度指数。
因此，本发明的第一方面涉及一种嗜热链球菌的半乳糖-发酵的突变菌株，其中所述突变菌株在编码葡萄糖激酶蛋白的glcK基因的DNA序列中携带突变，其中所述突变使编码的葡萄糖激酶蛋白钝化或对所述基因的表达具有负作用。测量葡萄糖激酶活性水平或葡萄糖激酶基因表达水平的方法是已知的(Porter等(1982)Biochim.Biophys.Acta,709；178-186)并包括利用市售试剂盒的酶测定以及利用易获得的材料的转录组学或定量PCR。
如文中所用，细菌“菌株”指当生长或增殖时基因上保持不变的细菌。包含多个相同的细菌。
如文中所用，术语“半乳糖-发酵的嗜热链球菌菌株”指可在M17培养基+2％半乳糖上/中生长的嗜热链球菌菌株。半乳糖-发酵的嗜热链球菌菌株在文中被定义成当以1％自过夜培养物接种并在37℃下温育24小时后，将含有作为唯一碳水化合物的2％半乳糖的M17肉汤的pH降到5.5或更低的嗜热链球菌菌株。
半乳糖-发酵的菌株可通过WO 2011/026863中所述的方法获得。
如文中所用，术语“突变使葡萄糖激酶蛋白钝化”指产生“钝化的葡萄糖激酶蛋白”——一种如果存在于细胞中就不能发挥其正常功能的葡萄糖激酶蛋白——的突变、以及阻止葡萄糖激酶蛋白形成或使葡萄糖激酶蛋白降解的突变。
具体地讲，钝化的葡萄糖激酶蛋白是这样一种蛋白质，其相对于功能性葡萄糖激酶蛋白，不能促进葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸或以明显降低的速率促进葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸。相对于编码功能性葡萄糖激酶蛋白的基因，编码这样的钝化的葡萄糖激酶蛋白的基因在该基因的开放阅读框(ORF)中包含突变，其中该突变可包括但不限于缺失、移码突变、终止密码子的引入或导致氨基酸置换的突变，其改变了蛋白质的功能性质、或启动子突变，其减少或取消基因的转录或翻译。
在优选的实施方案中，所述突变以至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％降低葡萄糖激酶蛋白的活性(葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸的速率)。
葡萄糖激酶活性可通过Pool等(2006,Metabolic Engineering8；456-464)所述的葡萄糖激酶酶测定确定。
如文中所用，术语“功能性葡萄糖激酶蛋白”指一种葡萄糖激酶蛋白，其如果存在于细胞中，促使葡萄糖磷酸化成葡萄糖-6-磷酸。具体地讲，功能性葡萄糖激酶蛋白可通过包含下述ORF的基因编码，该ORF具有对应于SEQ ID NO.1的1-966位的序列或与对应于SEQID NO.1的1-966位的序列具有至少85％同一性，例如至少90％同一性，例如至少95％同一性，例如至少98％同一性，例如至少99％同一性的序列。
两个序列的同一性百分比可利用数学算法确定，例如Karlin和Altschul的算法(1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA87；2264)，在Karlin和Altschul(1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA90；5873-5877)中所述的改进的算法；Myers和Miller的算法(1988.CABIOS4；11-17)；Needleman和Wunsch的算法(1970.J.Mol.Biol.48；443-453)；以及Pearson和Lipman的算法(1988.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85；2444-2448)。也可利用根据这些数学算法用于确定核酸或氨基酸序列同一性的计算机软件。例如，核苷酸序列的对比可利用BLASTN程序进行，得分＝100，字长＝12。氨基酸序列的对比可利用BLASTX程序进行，得分＝50，字长＝3。对于BLAST程序的其他参数，可使用默认参数。
在很多国家，将转基因生物(GMO)用于发酵乳制品并不被接受。本发明反而提供了一种获得自然发生或诱发的突变株的方法，该突变株可提供发酵乳制品所期望的葡萄糖积聚。
因此，在本发明的一个非常优选的实施方案中，突变株是一种自然发生的突变体或诱发突变体。
如文中所用，“突变细菌”或“突变株”指一种自然(自发，自然发生)的突变细菌或诱发的突变细菌，其在其基因组(DNA)中包含一处或多处野生型DNA所缺少的突变。“诱发突变体”是一种突变是由人处理诱发的细菌，例如利用化学诱变剂、UV-或γ辐射等的处理。相比而言，“自发突变体”或“自然发生的突变体”没有被人类诱变。在本文中，突变细菌是非-GMO(非-转基因生物)，即没有经重组DNA技术修饰。
“野生型菌株”指细菌的非突变形式，如自然中所见。
例如“具有增甜性质的菌株”、“可提供发酵乳制品所期望的葡萄糖积聚的菌株”以及“具有用于食品自然增甜的提高的性质的菌株”的术语在文中可交换使用以表征在乳品发酵中使用本发明菌株的有利方面。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的嗜热链球菌的突变菌种当以106-107CFU/ml的浓度接种到9.5％B乳中并在40℃下生长至少20小时后，将所述9.5％B乳中的葡萄糖量增至至少5mg/mL。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的嗜热链球菌的突变株当以106-107CFU/ml的浓度接种到含有0.05％蔗糖的9.5％B乳中并在40℃下生长至少20小时后，将所述含有0.05％蔗糖的9.5％B乳中的葡萄糖量增至至少5mg/mL。
在本发明中，9.5％B乳液是由复原的低脂脱脂奶粉制得的干物质水平达9.5％的煮沸奶，并在99℃下巴氏灭菌30分钟，然后冷却到40℃。
在本发明的更优选实施方案中，突变株使葡萄糖量增至至少6mg/mL，例如至少7mg/mL，例如至少8mg/mL，例如至少9mg/ml，例如至少10mg/ml，例如至少11mg/ml，例如至少12mg/ml，例如至少13mg/ml，例如至少14mg/ml，例如至少15mg/ml，例如至少20mg/ml，例如至少25mg/ml。
在本发明的另一个实施方案中，嗜热链球菌的突变菌种具有2-脱氧葡萄糖抗性。
文中术语“2-脱氧葡萄糖抗性”根据以下定义：一种特定的突变细菌菌株种，当其在包含20mM2-脱氧葡萄糖的M17培养基平板上划线时，在40℃下温育20小时后，具有生长成菌落的能力。培养基中2-脱氧葡萄糖的存在将阻止非突变菌种的生长，但是突变菌种的生长没有受到影响或没有受到明显影响。在抗性评价中可用作敏感的参照菌株的非突变菌株优选地包括菌种CHCC14994和CHCC11976。
文中实施例1和2例示了嗜热链球菌的2-脱氧葡萄糖抗性突变菌株的分离。
在又另一个实施方案中，根据本发明的突变株可由其生长模式表征。此可通过以下发现阐明：突变株在M17培养基+2％半乳糖中的生长速率比在M17培养基+2％葡萄糖中高。将生长速率测量为在600纳米(OD600)下的以指数方式生长的培养物的光密度随时间的变化，如文中实施例2所述。
在一个优选的实施方案中，在M17培养基+2％半乳糖中的生长速率比在M17培养基+2％葡萄糖中高至少5％，例如高至少10％，例如高至少15％，例如高至少20％。
在一个优选的实施方案中，突变使SEQ ID NO.2的位置72的编码丝氨酸的密码子被编码脯氨酸的密码子替代。优选地，glcK基因中的突变使SEQ ID NO.1中位置214的T被C替代。
在另一个优选的实施方案中，突变使SEQ ID NO.2中位置141的编码苏氨酸的密码子被编码异亮氨酸的密码子替代。
优选地，glcK基因中的突变使SEQ ID NO.1中位置422的C被T替代。
应强调，嗜热链球菌的glcK基因可由glcK基因的其它部位的其他类型的突变而钝化。
在一个优选的实施方案中，嗜热链球菌菌种携带减少葡萄糖进入细胞的转运的突变。
如文中所用，术语“减少葡萄糖进入细胞的转运的突变”指编码葡萄糖转运所涉及的蛋白质的基因的突变，所述突变使葡萄糖积聚在细胞环境中。嗜热链球菌菌株的培养基中葡萄糖水平可通过技术人员已知的方法容易地测量并且当培养基是乳底物时，还可如文中实施例4中所述测量。
在优选的实施方案中，突变以至少50％、例如至少60％、例如至少70％、例如至少80％、例如至少90％减少葡萄糖进入细胞的转运。
葡萄糖进入细胞的转运可根据Cochu等(2003.Appl Environ Microbiol69(9)；5423-5432)所述的葡萄糖吸收测定确定。
优选地，嗜热链球菌菌株在编码葡萄糖转运体组分的基因中携带了突变，其中该突变使葡萄糖转运体蛋白钝化或对该基因的表达具有负作用。
该组分可为葡萄糖转运蛋白的对葡萄糖转运关键的任何组分。例如，预期图3所示的嗜热链球菌中葡萄糖/甘露醇PTS的任何组分的钝化将使葡萄糖转运体功能钝化。
如文中所用，术语“突变使葡萄糖转运体钝化”指产生“钝化的葡萄糖转运体”——一种如果存在于细胞中则不能发挥其正常功能的葡萄糖转运蛋白——的突变、以及阻止葡萄糖转运蛋白形成或使葡萄糖转运蛋白降解的突变。
具体地讲，钝化的葡萄糖转运蛋白是这样一种蛋白质，其相对于功能性葡萄糖转运蛋白，不能促进葡萄糖通过质膜转运或以明显降低的速率促进葡萄糖通过质膜转运。相对于编码功能性葡萄糖转运蛋白的基因，编码这样的钝化的葡萄糖转运蛋白的基因在该基因的开放阅读框(ORF)中包含突变，其中该突变可包括但不限于缺失、移码突变、终止密码子的引入或导致氨基酸置换的突变，其改变了蛋白质的功能性质、或启动子突变，其减少或取消基因的转录或翻译。
在优选的实施方案中，突变以至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％降低葡萄糖转运蛋白的活性(葡萄糖转运速率)。
葡萄糖转运体活性可通过Cochu等(2003.Appl Environ Microbiol69(9)；5423-5432)所述的葡萄糖吸收测定确定。
如文中所用，术语“功能性葡萄糖转运蛋白”指一种葡萄糖转运蛋白，其如果存在于细胞中，促使葡萄糖通过质膜转运。
更优选地，嗜热链球菌菌株在编码葡萄糖/甘露糖磷酸转移酶系统的IICMan蛋白的manM基因的DNA序列中携带突变，其中该突变使IICMan蛋白钝化或对所述基因的表达具有负作用。
在一个甚至更优选的实施方案中，所述突变使葡萄糖/甘露糖磷酸转移酶系统的IICMan蛋白的SEQ ID NO.6的位置209的编码谷氨酸的密码子被终止密码子替代。优选地，所述突变使SEQ ID NO.5的位置625的G被T替代。
本发明的第二方面涉及选自由以下组成的组的嗜热链球菌菌株：以保藏号DSM25850保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)的嗜热链球菌CHCC15757菌种、以保藏号DSM25851保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的嗜热链球菌CHCC15887菌种、以保藏号DSM26722保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的嗜热链球菌CHCC16404菌种以及其衍生的菌株。
在本发明中，术语“其衍生的菌株”应被理解成通过(例如)基因工程、辐射和/或化学处理由本发明菌株(或其母菌株)衍生的菌株，或可通过(例如)基因工程、辐射和/或化学处理由本发明菌株(或其母菌株)衍生的菌株。“其衍生的菌株”也可为自发突变体。优选地，“其衍生的菌株”是功能等效的突变体，例如具有与其母菌株基本上相同或改善的性质(例如，关于葡萄糖的分泌)的突变体。这样的“其衍生的菌株”是本发明的一部分。尤其，术语“其衍生的菌株”指通过使本发明菌种经受任何常用的诱变处理得到的菌株，所述处理包括利用化学诱变剂(例如乙烷甲烷磺酸盐(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG))处理、紫外光，或指自发突变体。可使突变体经受多次诱变处理(单次处理应被理解成一个诱变步骤，然后进行筛选/选择步骤)，但在本发明中，优选地进行至多20次，或至多10次，或至多5次处理(或筛选/选择步骤)。在一个本发明优选的突变体中，相对于母菌株，细菌基因组中少于1％，少于0.1％，少于0.01％，少于0.001％或甚至少于0.0001％的核苷酸已被另一个核苷酸替代或缺失。
因此，在一个优选的实施方案中，嗜热链球菌菌株选自由以下组成的组：以保藏号DSM25850保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的嗜热链球菌CHCC15757菌种、以保藏号DSM25851保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的嗜热链球菌CHCC15887菌种、以保藏号DSM26722保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的嗜热链球菌CHCC16404菌种以及其衍生的突变菌株，其中所述突变菌株是通过将所保藏的菌株之一作为起始物获得，其中突变体保留了或进一步改善了该保藏菌株的乳糖发酵性质和/或葡萄糖分泌性质。
德氏乳杆菌保加利亚亚种是一种常用于商业乳发酵的乳酸菌，其中所述生物体一般用作混合的起子培养物的一部分。
乳糖比单糖葡萄糖、果糖、和甘露糖更易经德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵并且此物种的菌株一般不在半乳糖上生长(Buchanan R.E.,Gibbons N.E.,eds(1974):Bergey'smanual of determinative bacteriology(The Williams&Wilkins Co.Baltimore,Md),8th ed.)。在利用德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵乳糖期间，仅乳糖分子的葡萄糖部分被发酵并因此半乳糖积聚在发酵乳制品中。
为了得到不能在作为碳源的葡萄糖上生长的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，本发明者使德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种暴露于2-脱氧葡萄糖。分离出的突变体具有2-脱氧葡萄糖抗性并可在没有利用葡萄糖作为碳源的乳底物中生长。发现突变体增加了乳中葡萄糖含量。因此，通过利用这些菌株制得的发酵乳制品的特征在于更大量的葡萄糖，此使产品味道更甜。
令人吃惊地是，本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株单独仍完全能够酸化乳，尽管酸化到pH5的时间延长了2-5小时。此外，如实施例中所述，当使9.5％B乳接种106-107CFU/ml的根据本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株并利用根据本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在40℃下发酵至少20小时后，发现所述菌株分泌出约5mg/ml或更多葡萄糖，而少于约10mg/ml乳糖留存在发酵乳中。因此，使用这种菌株来制造发酵乳制品对于乳糖不耐症人士会是重要的。
因此，最终的发酵乳具有根据Godshall(1988.Food Technology42(11)；71-78)所述计算的约2或更高的较高的内在甜度指数，例如2.5或更高或例如3或更高。
本发明的第三方面涉及德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，其中该菌株具有2-脱氧葡萄糖抗性。
与德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株相关的术语“2-脱氧葡萄糖抗性”根据以下定义：一种特定的细菌菌株，当其在含有2％乳糖和20mM 2-脱氧葡萄糖的MRS-IM培养基平板上划线时，在40℃下温育20小时后，具有生长成菌落的能力。培养基中2-脱氧葡萄糖的存在将阻止非抗性菌株的生长而抗性菌株的生长不受影响或不受明显影响。在抗性评价中可用作敏感的参照菌株的非抗性德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株包括德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种CHCC759，其以保藏号DSM26419保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ)和CHCC10019，其以保藏号DSM19252保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ)。
在包含2％乳糖以及另包含20mM 2-脱氧葡萄糖的MRS-IM琼脂平板长满菌落的情况下，宜增加平板中2-脱氧葡萄糖浓度，例如增至30mM或甚至40mM或更高。在没有得到菌落的情况下，宜减少平板中2-脱氧葡萄糖的浓度，例如减至15mM或10mM或甚至更低。如果认为必要，可通过利用适宜的物理或化学诱变方法来提高突变速率。
优选地，本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株当以106至107CFU/ml的浓度接种到9.5％B乳中并在40℃下生长至少20小时(例如20至30小时，例如20小时)后，使所述9.5％B乳中葡萄糖量增至至少5mg/ml。
在本发明的更优选实施方案中，突变菌株使葡萄糖量增至至少6mg/mL，例如至少7mg/mL，例如至少8mg/mL，例如至少9mg/mL，例如至少10mg/mL，例如至少11mg/mL，例如至少12mg/mL，例如至少13mg/mL，例如至少14mg/mL，例如至少15mg/mL。
本发明的第四方面涉及德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，其选自由以下组成的组：德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种CHCC16159，其以保藏号DSM26420保藏德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ)、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种CHCC16160，其以保藏号DSM26421保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ)，以及其衍生的菌株。
术语“其衍生的菌株”应如上定义般理解。
因此，在一个优选的实施方案中，德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株选自由以下组成的组：德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种CHCC16159，其以保藏号DSM26420保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ)、德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种CHCC16160，其以保藏号DSM26421保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ)以及其衍生的突变菌株，其中所述的突变菌株是通过将所保藏的菌株之一用作起始物获得的，并且其中突变体保留了或进一步改善了该保藏菌种的乳糖发酵性质和/或葡萄糖分泌性质。
本发明的第五方面涉及一种组合物，其包含104至1012CFU(菌落形成单位)/g的根据本发明的第一或第二方面的嗜热链球菌菌株，例如105至1011CFU/g，例如106至1010CFU/g，或例如107至109CFU/g的嗜热链球菌菌株。
在一个优选的实施方案中，嗜热链球菌菌株不能酸化9.5％B乳，被定义成当使9.5％B乳接种106-107CFU/ml的所述嗜热链球菌菌株并在40℃下温育14小时后，使pH下降不足1.0，并且所述组合物还包含可引发由嗜热链球菌菌株CHCC16404引起的9.5％B乳的酸化的量的化合物，所述菌株以保藏号DSM26722保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心，被定义成当使9.5％B乳接种106-107CFU/ml的所述嗜热链球菌菌种并在40℃下温育14小时后，使pH下降1.0或更多。
优选地，所述化合物是蔗糖。
优选地，蔗糖量是0.000001％至2％，例如0.00001％至0.2％，例如0.0001％至0.1％，例如0.001％至0.05％。
在一个特别优选的实施方案中，所述组合物还包含104至1012CFU/g的根据本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，例如105至1011CFU/g，例如106至1010CFU/g，或例如107至109CFU/g的所述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。
本发明的一个优选组合物包含(例如)德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC16159和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC16160与嗜热链球菌菌株CHCC15757的组合。一个更优选的组合物包含德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC16159和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC16160与嗜热链球菌菌株CHCC15887的组合。一个甚至更优选的组合物包含德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC16159和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC16160与嗜热链球菌菌株CHCC16404的组合。
德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌和其它乳酸菌常用作起子培养物，其在多种食品制造中发挥着技术目的，例如在乳品工业中，例如用于发酵乳制品。因此，在另一个优选的实施方案中，组合物适用作起子培养物。
除了液态起子培养物外，起子培养物可以冷冻或干燥的起子培养物提供。因此，在又另一个优选的实施方案中，所述组合物是以冷冻、冻干或液态形式。
如WO 2005/003327所公开，将某些冷冻保护剂加入起子培养物中是有利的。因此，根据本发明的起子培养物组合物可包含一种或多种冷冻保护剂，其选自由肌苷-5'-单磷酸(IMP)、腺苷-5'-单磷酸(AMP)、鸟苷-5'-单磷酸(GMP)、尿苷-5'-单磷酸(UMP)、胞苷-5'-单磷酸(CMP)、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶、腺苷、鸟苷、尿苷、胞苷、次黄嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、乳清苷、胸苷、肌苷以及任何所述化合物的衍生物组成的组。
本发明的第六方面涉及一种生产发酵乳制品的方法，其包括利用至少一种根据本发明的第一或第二方面的嗜热链球菌菌株接种并发酵乳底物。
术语“乳”应被理解成通过挤乳任何哺乳动物(例如牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼)而得到的乳分泌物。在一个优选的实施方案中，乳是牛乳。
术语“乳底物”可为可根据本发明方法发酵的任何原料和/或加工乳材料。因此，有用的乳底物包括但不限于任何乳或包含蛋白质的类乳产品的溶液/悬浮液，例如，全脂奶或低脂奶、脱脂奶、酪乳、复原奶粉、炼乳、奶粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、乳糖结晶的母液、乳清蛋白浓缩物、或乳脂。明显地，乳底物可源自任何哺乳动物，例如，基本上纯的哺乳动物乳，或复原奶粉。
优选地，乳底物中至少一部分蛋白质是自然存在于乳中的蛋白质，例如酪蛋白或乳清蛋白。但是，部分蛋白质可为不是自然存在于乳中的蛋白质。
发酵前，乳底物可根据技术中已知的方法被均质化和巴氏杀菌。
如文中所用，“均质化”意指充分混合以得到可溶性悬浮液或乳液。如果均质在发酵前进行，可进行以将乳脂肪破碎成更小尺寸以不再从乳中分离出。此可通过使乳在高压下通过小孔实现。
如文中所用，“巴氏杀菌”意指乳底物的处理以减少或消除活生物体(例如微生物)的存在。优选地，巴氏杀菌是通过维持特定温度一段特定时间达成。所述的特定温度是通过加热获得。可对温度和时间长度加以选择以杀死某些细菌(例如有害菌)或使其失活。快速的冷却步骤可随后进行。
在本发明方法中，“发酵”意指通过微生物作用，将碳水化合物转化成醇或酸。优选地，在本发明方法中，发酵包含将乳糖转化成乳酸。
用于生产发酵乳制品的发酵法是已知的并且技术人员将了解如何选择适宜的加工条件，例如温度、氧、微生物量和特征以及加工时间。明显地，对发酵条件进行选择以支持本发明的完成，也就是，以得到呈固态或液态形式的乳制品(发酵乳制品)。
如文中所用，术语“发酵乳制品”指一种食品或饲料产品，其中该食品或饲料产品的制备涉及利用乳酸菌的发酵乳底物。如文中所用，“发酵乳制品”包括但不限于例如酸奶、奶酪、酸奶油和酪乳以及发酵乳清的产品。
在一个优选的实施方案中，所接种的嗜热链球菌细胞的浓度是104至109CFU嗜热链球菌细胞/ml乳底物，例如104CFU至108CFU嗜热链球菌细胞/ml乳底物。
在另一个优选的实施方案中，所述嗜热链球菌菌株不能酸化9.5％B乳，被定义成当使9.5％B乳接种106-107CFU/ml所述嗜热链球菌菌株并在40℃下温育14小时后，使pH下降不足1.0，并且将有效地引发由嗜热链球菌菌株CHCC16404引起的9.5％B乳的酸化的量的化合物加入所述乳底物中，所述菌株以保藏号DSM26722保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心，被定义成当使9.5％B乳接种106-107CFU/ml所述嗜热链球菌菌株并在40℃下温育14小时后，使pH下降1.0或更多。
优选地，所述化合物是蔗糖。
优选地，蔗糖量是0.000001％至2％，例如0.00001％至0.2％，例如0.0001％至0.1％，例如0.001％至0.05％。
本发明的第七方面涉及一种生产发酵乳制品的方法，其包括利用至少一种根据本发明的第三或第四方面的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株接种并发酵乳底物。
在一个优选的实施方案中，所接种的德氏乳杆菌保加利亚亚种细胞的浓度是104至109CFU德氏乳杆菌保加利亚亚种细胞/ml乳底物，例如104CFU至108CFU德氏乳杆菌保加利亚亚种细胞/ml乳底物。
在一个优选的实施方案中，所述生产发酵乳制品的方法包括利用至少一种根据本发明的嗜热链球菌菌株和至少一种根据本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株接种和发酵乳底物。
在另一个优选的实施方案中，所述发酵乳制品是酸奶或奶酪。
利用嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵生产的奶酪的实例包括马苏里拉(Mozzarella)奶酪和比萨奶酪(
等(2010)The Technology of Cheesemaking,2ndEd.Blackwll Publishing,Oxford；166-192)。
优选地，发酵乳制品是酸奶。
在本文中，酸奶起子培养物是一种细菌培养物，其包含至少一种德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和至少一种嗜热链球菌菌株。据此，术语“酸奶”指一种通过用包含德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株和嗜热链球菌菌株的组合物接种和发酵乳可得到的发酵乳制品。
在第八方面中，本发明涉及一种通过根据本发明的第六或第七方面的方法可得到的发酵乳制品。
在第九方面中，本发明涉及一种包含至少一种根据本发明的第一或第二方面的嗜热链球菌菌株的发酵乳制品。
在第十方面中，本发明涉及一种包含至少一种根据本发明的第三或第四方面的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的发酵乳制品。
在一个优选的实施方案中，所述发酵乳制品包含至少一种根据本发明的嗜热链球菌菌株和至少一种根据本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株。
在另一个优选的实施方案中，所述发酵乳制品是酸奶或奶酪。优选地，所述发酵乳制品是酸奶。
在第十一方面中，本发明涉及根据本发明的第一或第二方面的嗜热链球菌菌株用于制备发酵乳制品的用途。
在第十二方面中，本发明涉及根据本发明的第三或第四方面的德氏乳杆菌保加利亚亚种用于制备发酵乳制品的用途。
本发明的第十三方面涉及根据本发明的嗜热链球菌菌株和根据本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种用于制备发酵乳制品的用途。
第十四个方面涉及根据本发明的第一或第二方面的嗜热链球菌菌株用于增加发酵乳制品甜度的用途。
在第十五个方面中，本发明涉及根据本发明的第三和第四方面的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株用于增加发酵乳制品甜度的用途。
在第十六个方面中，本发明涉及根据本发明的第一或第二方面的嗜热链球菌菌株和根据本发明的第三和第四方面的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株用于增加发酵乳制品甜度的用途。
尤其，儿童作为消费者群体偏爱甜食，并预期本发明的嗜热链球菌菌株和本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株可特定地用于增加用于儿童的发酵乳制品的甜度。
本发明的第十七方面涉及一种用于减少热量摄入量的根据本发明的发酵乳制品。
根据本发明的发酵乳制品被认为在患有过重或肥胖症人士的膳食中尤其有用。
因此，在一个优选的实施方案中，根据本发明的发酵乳制品用于减少患有过重或肥胖症人士的热量摄入量。
过重和肥胖症是医学病症，被世界卫生组织(WHO)定义为对健康造成风险的异常或过多脂肪积累。体重指数(BMI)可用作分类成人过重和肥胖症的粗略指标并计算为以千克计的人体重除以他/她以米计的身高的平方(kg/m2)。WHO定义指出BMI大于或等于25是过重而BMI大于或等于30是肥胖症。
本发明的第十八方面涉及根据本发明的第一或第二方面的嗜热链球菌菌株用于减少发酵乳制品中乳糖含量的用途。
在第十九方面中，本发明涉及根据本发明的第三或第四方面的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株用于减少发酵乳制品中乳糖含量的用途。
本发明的第二十方面涉及根据本发明的第一或第二方面的嗜热链球菌菌株和根据本发明的第三或第四方面的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株用于减少发酵乳制品中乳糖含量的用途。
本发明的第二十一方面涉及用于避免乳糖不耐受症症状的根据本发明的发酵乳制品。
第二十二方面涉及用作药品的本发明组合物。
在第二十三方面中，本发明涉及根据本发明的嗜热链球菌菌株用于改善双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株生长的用途。
在一个优选的实施方案中，双歧杆菌菌株属于选自由以下组成的组的物种：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium brevis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)和婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，例如选自由以下组成的组的菌株：动物双歧杆菌乳亚种
菌株，其以保藏号DSM15954保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ)、动物双歧杆菌菌株，其以保藏号DSM15954保藏在DSMZ、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)菌株，其以保藏号DSM15953保藏在DSMZ以及长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)菌株，其以保藏号DSM15955保藏在DSMZ。
最优选地，双歧杆菌菌株是以保藏号DSM15954保藏在DSMZ的动物双歧杆菌乳亚种
在第二十四方面中，本发明涉及根据本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株用于改善双歧杆菌菌株生长的用途。
在一个优选的实施方案中，所述双歧杆菌菌株属于选自由以下组成的组的物种：长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、乳双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、青春双歧杆菌和婴儿双歧杆菌，例如选自由以下组成的组的菌株：动物双歧杆菌乳亚种
菌株，其以保藏号DSM15954保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ)、动物双歧杆菌菌株，其以保藏号DSM15954保藏在DSMZ、长双歧杆菌婴儿亚种菌株，其以保藏号DSM15953保藏在DSMZ以及长双歧杆菌长亚种菌株，其以保藏号DSM15955保藏在DSMZ。
最优选地，双歧杆菌菌株是以保藏号DSM15954保藏在DSMZ的动物双歧杆菌乳亚种
第二十五方面涉及根据本发明的嗜热链球菌菌株和根据本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株用于改善以保藏号DSM15954保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的动物双歧杆菌乳亚种菌株
的生长的用途。
2-脱氧葡萄糖和细菌在M17培养基+2％半乳糖中相对于在M17培养基+2％葡萄糖中的生长模式的确定被用于选择在葡萄糖激酶(glcK)基因中存在突变的细菌。
在本发明的第二十六方面中，提供了一种筛选并分离具有突变的glcK基因的嗜热链球菌菌株的方法。该方法包括以下步骤：
a)提供一种半乳糖-发酵的嗜热链球菌母菌株；
b)从衍生自所述母菌株的突变嗜热链球菌菌株库中选择并分离具有2-脱氧葡萄糖抗性的突变嗜热链球菌菌株库；以及
c)从具有2-脱氧葡萄糖抗性的突变嗜热链球菌菌株库中选择并分离如下突变嗜热链球菌菌株，条件是所述突变嗜热链球菌菌株在M17培养基+2％半乳糖中的生长速率大于在M17培养基+2％葡萄糖中的生长速率。
文中术语“2-脱氧葡萄糖抗性”根据以下定义：一种特定的突变细菌菌株，当其在含有2％乳糖或2％半乳糖并包含20mM2-脱氧葡萄糖的M17培养基平板上划线时，在40℃下温育20小时后，具有生长成菌落的能力。培养基中2-脱氧葡萄糖的存在将阻止非突变菌株的生长而突变菌株的生长不受影响或不受明显影响。在抗性评价中可用作敏感的参照菌株的非突变菌株包括菌株CHCC14994和CHCC11976。
文中实施例1和2例示了2-脱氧葡萄糖抗性嗜热链球菌突变菌株的分离。
在一个优选的实施方案中，该方法还包括步骤a1)使所述母菌株经受诱变，例如使所述母菌株经受化学和/或物理诱变剂。
在另一个优选的实施方案中，该方法还包含步骤d)：从在步骤c)中选择的衍生自所述嗜热链球菌菌株的2-脱氧葡萄糖抗性嗜热链球菌菌株库中选择并分离如下嗜热链球菌菌株，条件是所述嗜热链球菌菌株在M17培养基+2％蔗糖上的生长速率高、而在M17培养基+2％葡萄糖上的生长速率为零或相对于所述母菌株减缓至少0-50％。
半乳糖-发酵的嗜热链球菌母菌株可在M17培养基+2％半乳糖上/中生长并在文中根据以下定义：当它们以1％自过夜培养物接种并在37℃温育24小时后，具有将包含2％半乳糖作为唯一碳水化合物的M17肉汤的pH降低至5.5或更低的能力。这些半乳糖-阳性菌株已在先前技术中有所描述并且WO2011/026863(Chr.Hansen A/S)描述了一种获得这种菌株的方法。
在一个非常优选的实施方案中，所述母菌株选自由以下组成的组：以保藏号DSM25838保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的嗜热链球菌CHCC14994菌株、以保藏号DSM22934保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的嗜热链球菌CHCC11976菌株、以及其衍生的菌株。
在本文中，术语“其衍生的菌株”应被理解成通过例如基因工程、辐射和/或化学处理由半乳糖-发酵的嗜热链球菌母菌株衍生的菌株，或可通过例如基因工程、辐射和/或化学处理由半乳糖-发酵的嗜热链球菌母菌株衍生的菌株。“其衍生的菌种”也可为自发突变体。优选地，“其衍生的菌株”是功能等效的突变体，例如具有与其母菌株基本上相同或改善的性质(例如，关于半乳糖的发酵)的突变体。这样的“其衍生的菌株”是本发明的一部分。尤其，术语“其衍生的菌株”指通过使本发明菌株经受任何常用的诱变处理而得到的菌株，所述处理包括利用化学诱变剂(例如乙烷甲烷磺酸盐(EMS)或N-甲基-N'-硝基-N-硝基胍(NTG))的处理、紫外光、或指自发突变体。可使突变体经受多次诱变处理(单次处理应被理解成一个诱变步骤，然后进行筛选/选择步骤)，但在本发明中，优选地进行至多20次，或至多10次，或至多5次处理(或筛选/选择步骤)。在一个本发明优选的突变体中，相对于母菌株，细菌基因组中少于1％，少于0.1％，少于0.01％，少于0.001％或甚至少于0.0001％的核苷酸已被另一个核苷酸替代或缺失。
在第二十七方面中，通过根据第二十七方面的方法可得到的突变嗜热链球菌菌株包含在本文中。
在本发明的第二十八方面中，提供了一种用于筛选并分离具有受损的葡萄糖代谢的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的方法。该方法包括以下步骤：
a)提供一种德氏乳杆菌保加利亚亚种母菌株；
b)从衍生自所述母菌株的突变德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株库中选择并分离2-脱氧葡萄糖抗性德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株库；以及
c)从所述2-脱氧葡萄糖抗性德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株库中选择并分离如下德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，条件是所述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株在MRS-IM培养基+2％乳糖中的生长速率大于在MRS-IM培养基+2％葡萄糖中的生长速率。
2-脱氧葡萄糖抗性德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的突变菌株的分离在实施例中进行了详细描述。根据实施例5中2-脱氧葡萄糖抗性选择测定，技术人员可例行性地针对所关注的特定菌种(例如，来自相关商品的菌种)测试该所关注的特定菌种是否具有文中相关的2-脱氧葡萄糖抗性。根据实施例6中2-脱氧葡萄糖抗性突变体生长模式，技术人员可例行性地针对所关注的特定菌种(例如，来自相关商品的菌种)测试该所关注的特定菌种是否具有作为所述被选择的突变体的性质的相关生长模式该。
在一个优选的实施方案中，所述方法还包含步骤a1)使所述母菌株经受诱变，例如使所述母菌株经受化学和/或物理诱变剂。
德氏乳杆菌保加利亚亚种母菌株可在MRS-IM培养基+2％乳糖上/中生长并根据以下定义：当它们以1％自过夜培养物接种并在37℃下温育24小时后，具有将包含2％乳糖作为唯一碳水化合物的MRS-IM肉汤的pH降至5.5或更低的能力。
在一个非常优选的实施方案中，所述母菌株选自由以下组成的组：以保藏号DSM26419保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC759菌株、以保藏号DSM19252保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC10019菌株、以及其衍生的菌株。
在第二十九方面中，通过根据第二十八方面的方法可得到的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株包含在本文中。
以下通过非限制性实施例阐述本发明的实施方案。
实施例
材料和方法
培养基：
对于嗜热链球菌，所用的培养基是本领域技术人员已知的M17培养基。
M17琼脂培养基具有以下组分/升H2O：
琼脂，12.75g
抗坏血酸，0.5g
酪蛋白胨(胰蛋白酶)，2.5g
β-甘油磷酸二钠五水合物，19g
硫酸镁水合物，0.25g
肉提取物，5g
肉蛋白胨(胃蛋白酶)，2.5g
大豆蛋白胨(木瓜蛋白酶)，5g
酵母提取物，2.5g
最终pH7.1±0.2(25℃)
M17肉汤具有以下组分/升H2O：
抗坏血酸，0.5g
硫酸镁，0.25g
肉提取物，5g
肉蛋白胨(胃蛋白酶)，2.5g
甘油磷酸钠，19g
大豆蛋白胨(木瓜蛋白酶)，5g
胰蛋白胨，2.5g
酵母提取物，2.5g
最终pH7.0±0.2(25℃)
所添加的碳源是无菌乳糖20g/l、葡萄糖20g/l或半乳糖20g/l。
如技术人员已知，M17培养基是一种被认为适于嗜热链球菌生长的培养基。而且，如技术人员所理解，在本文中，M17浓缩物可由不同供应商提供并且不取决于特定的供应商，(在标准的测量不确定度内)对于本文中相关的所关注细胞，将得到相同的本文中相关的2-脱氧葡萄糖抗性结果。
用于培养德氏乳杆菌保加利亚亚种的培养基是MRS-IM培养基。MRS-IM采用了琼脂平板或肉汤形式。
MRS-IM琼脂培养基具有以下组分/升H2O：
在高压灭菌后，在25℃下，将pH调节到6.9±0.1。
以下实施例中用于液态培养物的MRS-IM肉汤具有以下组分/升H2O：
在高压灭菌后，在25℃下，将pH调节到6.9±0.1。先无菌过滤碳源，乳糖20g/l或葡萄糖20g/l，然后加入高压灭菌的肉汤中。
可在一定程度上变化上述MRS-IM培养基，而不影响培养基支持德氏乳杆菌保加利亚亚种生长的能力。而且，如技术人员所理解，MRS-IM浓缩物或上述多种组分可获自不同供应商并用于制备MRS-IM培养基。这些培养基同样将用于以下实施例，特别用于2-脱氧葡萄糖抗性选择测定。
母菌株
嗜热链球菌CHCC11976(如WO 2011/026863所述，在GalK基因中突变并产生表多糖的半乳糖-发酵的菌株)。
嗜热链球菌CHCC14994(半乳糖-发酵的菌株)。
德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC759。
德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC10019。
2-脱氧葡萄糖抗性菌株
嗜热链球菌CHCC15757(CHCC14994的2-脱氧葡萄糖抗性突变体)。
嗜热链球菌CHCC15887(CHCC11976的2-脱氧葡萄糖抗性突变体)。
嗜热链球菌CHCC16404(CHCC15757的高-乳糖发酵和葡萄糖分泌的突变体)。
德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC16159(CHCC759的2-脱氧葡萄糖抗性突变体)。
德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC16160(CHCC10019的2-脱氧葡萄糖抗性突变体)。
实施例1：2-脱氧葡萄糖用于分离具有增强的葡萄糖分泌的嗜热链球菌的葡萄糖激酶突变体的用途
为了分离出嗜热链球菌菌株CHCC11976和嗜热链球菌菌株CHCC14994的突变体，使衍生自单菌落生长的细胞接种到10ml包含2％乳糖的M17肉汤中并在40℃下生长过夜。
第二天，将菌种以连续稀释的方式平板接种在包含2％半乳糖和浓度为20mM(CHCC14994)或30mM(CHCC11976)的2-脱氧葡萄糖的M17琼脂平板上并在40℃下温育20小时。先将抗性菌落在与选择它们的相同类型的琼脂平板上再划线。将存活者用于接种包含2％乳糖、2％半乳糖或2％葡萄糖的新鲜M17肉汤并测定生长。
由此，鉴定了能够在半乳糖上比在葡萄糖上生长更快的许多突变体，如实施例2所述。两种这样的突变体是CHCC15757和CHCC15887，分别衍生自CHCC14994和CHCC11976。
实施例2：2-脱氧葡萄糖抗性突变体生长模式
为了确保可在半乳糖上生长的2-脱氧葡萄糖抗性突变体的选择，使用从半乳糖-发酵菌株收集物中选择的两种菌株。虽然这些半乳糖-发酵菌株在指数期在M17肉汤+2％葡萄糖中的生长比在M17肉汤+2％半乳糖中的生长仍然快至少10％，但另一方面，CHCC11976和CHCC14994的2-脱氧葡萄糖抗性突变体衍生物(例如CHCC15757和CHCC15887)表征为在指数期在M17肉汤+2％半乳糖中的生长比在M17肉汤+2％葡萄糖中的生长更快。
在文中，指数期生长被测量为在40℃下，指数生长的培养物在600纳米下的光密度(OD600)随时间的变化。
如技术人员所知，当培养物以指数生长时，物种间可不同。技术人员知道如何确定指数期生长，例如OD6000.1-1.0。
培养物的光密度(OD)可在分光光度计中测定。
总结：
根据此实施例2的2-脱氧葡萄糖抗性突变体生长模式-针对所关注的特定菌株(例如，来自相关商品的菌株)-技术人员可例行地测试所关注的此特定菌株是否具有文中相关的生长模式，该模式是所选择突变体的特性。
实施例3：编码葡萄糖激酶的基因的突变分析测定
将整个DNA从实施例1中鉴定的突变体分离出以进行编码葡萄糖激酶的基因的突变分析测定。葡萄糖激酶基因的测序揭露出CHCC15757的基因在密码子141包含非保守突变，产生异亮氨酸密码子而非苏氨酸密码子。来自突变体CHCC15887的基因的测序揭露出密码子72中的突变，使非保守氨基酸从丝氨酸变成脯氨酸(图2)。
遵循实施例1和2中说明的条件并如实施例1所述分离的2-脱氧葡萄糖抗性菌株表征为在编码葡萄糖激酶(glcK)的基因中具有突变。所述突变可使被编码的酶的氨基酸变化，或导致产生使得所编码的酶缩短的终止密码子。
为揭露glcK基因的突变，在40℃下，使所关注的特定菌株在添加了2％乳糖的液态肉汤(M17)中生长过夜。分离出染色体DNA后，利用与紧邻编码葡萄糖激酶的基因的上游和下游的保守区互补的两条引物，使DNA进行PCR分析。所述引物序列是：
GK1F：5′CTT GGG TAA AAG GCT CTA TG3′ (SEQ ID NO.3)
GK1R：5′CGT TTT TCA ACA AAA AAG TGC TACC3′ (SEQ ID NO.4)
PCR反应条件如PCR扩增试剂盒(ROCHE)制造商说明，例如
2μl染色体DNA
1μl引物GK1F
1μl引物GK1R
25μl Master混合物
21μl H2O
PCR-程序:(94℃-1.5min.,50℃-1min.,72℃-1.5min)×30
PCR扩增产生1168bp片段。在利用来自Biorad的PCR纯化试剂盒纯化后，利用用于扩增的相同的两条引物，使PCR片段在Macrogen进行DNA测序。测序后，使DNA序列与母菌株的DNA序列对比。
实施例4.发酵乳的碳水化合物分析
在另一个试验中，确定分别利用CHCC14994、CHCC11976、CHCC15757和CHCC15887发酵的乳中相关糖的糖浓度。使9.5％B乳接种1％(106-107CFU/ml)的在添加了2％半乳糖的M17肉汤中过夜生长的培养物。利用INTAB PC记录器和Easyview软件追踪酸化。在40℃下酸化30小时后，取乳液样品进行HPLC分析以得到相关糖和酸的含量。酸化曲线表明突变体具有略微延迟的酸化启始，但在相似的终止pH下结束。HPLC数据显示在表1中。
从表1中，显而易见地是，两种glcK突变菌种CHCC15757和CHCC15887消耗至少71％乳糖，而母菌株消耗约28％乳糖。对于发酵乳糖程度最高的突变体，CHCC15887，少到11.9mg/ml残留在发酵乳中，表明此产品甚至针对于乳糖不耐受症人士的作用。非常显著地，两种glcK突变体已分泌出8.3至11.3mg/ml葡萄糖而母菌株的葡萄糖分泌量低于检测限。同时，两种突变菌种也分泌出比母菌株更多的半乳糖：34％-52％。考虑到蔗糖是100参照，则乳糖的甜度是16，半乳糖的甜度是32，而葡萄糖的甜度是74.3，最终的发酵产品的相对甜度的计算值表明利用最佳突变体CHCC15757发酵的甜度比利用相应的母菌株CHCC14994甜2.0倍。
表1：乳样的HPLC数据
甜度计算值：mg/ml葡萄糖*74+mg/ml乳糖*16+mg/ml半乳糖*32。
当两种glcK突变菌株CHCC15757和CHCC15887分泌高水平的葡萄糖时，预期在glcK基因中的突变使编码的葡萄糖激酶蛋白钝化。
实施例5：2-脱氧葡萄糖抗性德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种的选择
2-脱氧葡萄糖抗性突变体的选择
将两种所关注的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC759和CHCC10019彼此独立地接种到10ml上述包含2％乳糖的MRS-IM肉汤中并以厌氧的方式在40℃下过夜温育。在下一个步骤中，将包含约3×108个细胞的这些培养物的样品平板接种于包含2％乳糖以及另包含20mM2-脱氧葡萄糖的MRS-IM琼脂平板上。平板上长出的菌落通过在包含2％乳糖以及另包含20mM2-脱氧葡萄糖的MRS-IM琼脂平板上进行单菌落划线而纯化，并如下所述被进一步表征。
2-脱氧葡萄糖抗性测定：
以下方法适于确定所关注菌种是否具有2-脱氧葡萄糖抗性。将所关注菌株接种到10ml上述包含2％乳糖的MRS-IM肉汤中并以厌氧的方式在40℃下过夜温育。在下一个步骤中，将包含约104-105个细胞的这些培养物的稀释样品平板接种在包含2％乳糖以及另包含用于选择所述抗突变体的相同2-脱氧葡萄糖浓度(一般而言20mM但可使用其它浓度)的MRS-IM琼脂平板上。使琼脂平板在40℃下，在厌氧条件下温育20小时并进行检查。没有2-脱氧葡萄糖抗性的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株将产生少量(如果有)菌落，而2-脱氧葡萄糖抗性菌株将产生大量菌落。适宜对照包括德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC759和CHCC10019，其对20mM浓度下的2-脱氧葡萄糖敏感，以及CHCC16159和CHCC16160，其对20mM2-脱氧葡萄糖具有抗性。
结果：利用此方法将在2-脱氧葡萄糖存在下，可在所述选择性条件下生长的多种菌落分离出。将表现出在含有2-脱氧葡萄糖的平板上快速生长的突变菌株称为CHCC16159(衍生自母菌株CHCC759)和CHCC16160(衍生自母菌株CHCC10019)。将这些突变菌株保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ)有限公司。
实施例6：德氏乳杆菌保加利亚亚种的2-脱氧葡萄糖抗性突变体的生长模式
为了确保德氏乳杆菌保加利亚亚种的2-脱氧葡萄糖抗性突变体或者失去了在葡萄糖上生长的能力，或者具有在作为碳源的葡萄糖上生长的受损能力，通过使母菌株CHCC759和CHCC10019以及突变体CHCC16159和CHCC16160在包含2％葡萄糖的MRS-IM肉汤中生长，使突变体的生长模式与母菌株相比较。
虽然两种母菌株CHCC759和CHCC10019以指数的方式在添加了2％葡萄糖的MRS-IM肉汤中生长并且倍增时间少于10小时，但是两种2-脱氧葡萄糖抗性突变体CHCC16159和CHCC16160在此培养基中不生长或生长非常缓慢。指数期生长是通过在40℃下，利用分光光度计，在600纳米(OD600)下测量以指数方式生长的培养物的光密度进行监测。指数期生长达到OD6000.1-1.0。
实施例7：利用德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株发酵的乳的碳水化合物分析
在另一个试验中，确定分别利用德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC759、CHCC10019、CHCC16159、和CHCC16160发酵的乳中的不同糖的糖浓度。使9.5％B乳接种1％(106-107CFU/ml)的在包含2％乳糖的MRS-IM肉汤中以厌氧的方式过夜生长的液体培养物。利用INTAB PC记录器和Easyview软件追踪酸化。在40℃下酸化30小时后，取乳样品进行HPLC分析以测量多种糖和有机酸的量。酸化曲线表明突变体具有略微延迟的酸化启始，但在略微更高的终止pH下结束。HPLC数据显示在表2中。
从表2可看出，两种2-脱氧葡萄糖抗性突变菌株CHCC16159和CHCC16160消耗至少约94％乳糖，而母菌株消耗至少约37％乳糖。对于显示出最高乳酸生产的突变体CHCC16160而言，少至2.9mg/ml乳糖残留在发酵乳中。具有如此低水平乳糖的发酵乳品可适于乳糖不耐受症人士食用。
明显地是，两种突变菌株CHCC16159和CHCC16160分泌出15.2至15.8mg/ml葡萄糖，而分别地，母菌株的葡萄糖分泌量对于CHCC10019低于检测值，对于CHCC759是4.2mg/ml。同时，两种突变菌株也比母菌株分泌出更多半乳糖。如果蔗糖甜度的参照值是100，则乳糖的甜度是16，半乳糖的甜度是32而葡萄糖的甜度是74，最终发酵产品的相对甜度的计算表明突变体CHCC16160产生比利用相应的母菌株CHCC10019甜2.5倍的发酵乳制品。
表2：乳样品的HPLC数据
| 样品 | 量 | 量 | 量 | 量 | 量 | 量 | 量 | |
| No. | mg/ml | mg/ml | mg/ml | mg/ml | mg/ml | mg/ml | mg/ml | |
| 柠檬酸 | 乳酸 | 乙酸 | 半乳糖 | 葡萄糖 | 乳糖 | 果糖 | 甜度 | |
| 检测限 | <1.25 | <1.25 | <1.25 | <1.5 | <1.5 | <1.5 | <1.5 | |
| 乳 | 1.9 | <1.25 | <1.25 | <1.5 | <1.5 | 55.5 | <1.5 | 888 |
| CHCC759 | 1.8 | 9.6 | <1.25 | 13.1 | 4.2 | 18.1 | <1.5 | 1021 |
| CHCC16159 | 2.0 | 7.9 | <1.25 | 21.4 | 15.2 | 1.7 | <1.5 | 1841 |
| CHCC10019 | 1.8 | 11.1 | <1.25 | 12.4 | >1.5 | 20.8 | <1.5 | 730 |
| CHCC16160 | 1.9 | 5.4 | <1.25 | 19.4 | 15.8 | 2.9 | <1.5 | 1841 |
甜度计算值：mg/ml葡萄糖*74+mg/ml乳糖*16+mg/ml半乳糖*32
实施例8：嗜热链球菌的高-乳糖发酵和葡萄糖分泌突变体的选择
为分离出嗜热链球菌菌株CHCC15757的高-乳糖发酵和葡萄糖分泌突变体，使衍生自单菌落生长的细胞接种到10ml包含2％半乳糖的M17肉汤中并在40℃下过夜生长。
第二天，将菌种以连续稀释的方式平板接种到包含2％半乳糖和浓度30mM的2-脱氧葡萄糖的M17琼脂平板上并在40℃下温育20小时。先将抗性菌落再次划线到与选择它们的相同类型的琼脂平板上。将存活者用于接种包含2％乳糖、2％半乳糖、2％蔗糖或2％葡萄糖的新鲜M17肉汤。
从其中，我们可分离出衍生自CHCC15757的突变体CHCC16404，其不可在B乳中生长但可在添加了2％蔗糖的M17中40℃下生长。而且，CHCC16404不可在添加了2％葡萄糖的M17中生长。
在文中，指数期生长被测量为在40℃下，按指数生长的培养物在600纳米下的光密度(OD600)随时间的变化。
实施例9：高-乳糖发酵和葡萄糖分泌的嗜热链球菌突变体CHCC16404的生长模式
为确保突变体CHCC16404的维持以及适当的生长，使菌种40℃下在添加了2％蔗糖的M17中生长。令我们吃惊的是，我们发现只有当所述菌株以1％(106-107CFU/ml)的在添加了2％蔗糖的M17肉汤中过夜生长的培养物接种9.5％B乳时或当所述乳添加了蔗糖时，突变菌株CHCC16404才能酸化所述9.5％B乳。我们发现将少到0.01％的蔗糖加入所述乳中可使CHCC16404酸化9.5％B乳。而且，CHCC16404不可在添加了2％葡萄糖的M17中40℃下生长，与相同条件下，可在添加了葡萄糖的M17中生长的母菌株CHCC15757相反。所有这些结果表明产生CHCC16404的CHCC15757的2-脱氧葡萄糖处理选择了使葡萄糖吸收系统钝化的突变，使得不能从培养基中吸收分泌出的葡萄糖。
实施例10：利用高-乳糖发酵和葡萄糖分泌的嗜热链球菌突变体CHCC16404发酵的乳的碳水化合物分析
在另一个试验中，确定利用CHCC16404发酵的乳中的相关糖的糖浓度。使包含分别添加了0.01％、0.02％、0.03％和0.05％蔗糖的9.5％B乳的瓶子接种1％(106-107CFU/ml)的在添加了2％蔗糖的M17肉汤中过夜生长的培养物。利用INTAB PC记录器和Easyview软件追踪酸化。在40℃下酸化30小时后，取乳样品进行HPLC分析以获得相关糖和酸的含量。
从表3中，显而易见的是，高-乳糖发酵和葡萄糖分泌的突变体CHCC16404令人惊讶地消耗了在此试验中所测试的所添加蔗糖的所有浓度下的所有乳糖。我们也观察到当添加了更高浓度的蔗糖时(例如，>0.1mg/ml)，在达到最终pH前，乳糖发酵不完全。而且，表3也表明所有乳糖转化成葡萄糖和半乳糖并且仅部分半乳糖用于在所添加蔗糖的所有浓度下的发酵。令人感兴趣地是，所分泌的葡萄糖没有再次吸收，从而在乳中留下高于23.9mg/ml的葡萄糖。因为约25％半乳糖被发酵，所以发酵后，高于16mg/ml的半乳糖残留在乳中。这些数据表明，CHCC16404，除了遗传自母菌株CHCC15757的glcK突变，也具有使葡萄糖吸收系统钝化的突变，使得不能从培养基吸收分泌出的葡萄糖。使表3中数据与表1中数据比较并考虑到蔗糖是100参照，乳糖的甜度是16，半乳糖的甜度是32而葡萄糖的甜度是74.3，利用CHCC16404发酵时，最终发酵物的相对甜度的计算产生比利用菌株CHCC14994发酵时高约3.5倍的甜度。
表3：乳样品的HPLC数据
甜度计算值：mg/ml葡萄糖*74+mg/ml乳糖*16+mg/ml半乳糖*32
实施例11：利用嗜热链球菌菌株与德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株的组合发酵的乳的碳水化合物分析
在这个试验中，确定利用德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株(选自CHCC759、CHCC10019、CHCC16159以及CHCC16160)与嗜热链球菌菌株(CHCC14994、CHCC15757或CHCC16404)的组合发酵的乳中糖和有机酸的浓度。
酸奶的生产一般涉及使用包含德氏乳杆菌保加利亚亚种与嗜热链球菌菌株的混合起子培养基。一般来说，使酸奶生产中所用的乳底物接种1份德氏乳杆菌保加利亚亚种和9份嗜热链球菌。为分析酸奶生产的标准设置中的葡萄糖分泌能力，使9.5％B乳接种0.1％的在包含2％乳糖的MRS-IM肉汤中以厌氧的方式过夜生长的德氏乳杆菌保加利亚亚种培养物和0.9％的在包含2％半乳糖(CHCC15757)或2％蔗糖(CHCC16404)的M17肉汤中过夜生长的嗜热链球菌培养物。利用INTAB PC记录器和Easyview软件追踪酸化。酸化30小时后，取乳样品进行HPLC分析以测量不同糖和酸的量。HPLC数据显示在表4中。
从表4可得出，使用嗜热链球菌的2-脱氧葡萄糖抗性突变菌株CHCC15757和CHCC16404导致葡萄糖分泌到乳中，不管是否与德氏乳杆菌保加利亚亚种母菌株或与其2-脱氧葡萄糖抗性突变体组合。但是，当使用两种物种的2-脱氧葡萄糖抗性突变菌株的组合(例如，CHCC15757和CHCC16159的组合，或CHCC15757和CHCC16160的组合)时，葡萄糖浓度更高。当使用这些混合的培养物时，发现至少消耗了82％乳糖，发现分泌出11.8mg/ml至14.1mg/ml的葡萄糖。当嗜热链球菌菌株是CHCC15887时，得到类似结果，CHCC15887也是一种glcK基因中有突变的2-脱氧葡萄糖抗性突变体。
同时，起子培养基中2-脱氧葡萄糖抗性突变菌株的存在也导致更多半乳糖的分泌。当使用突变菌株的组合(例如，CHCC15757和CHCC16159)时，与包含相应母菌株CHCC14994和CHCC10019的起子培养物相比，半乳糖分泌量高出约3倍(17.1mg/ml)。
当使用高-乳糖发酵和葡萄糖分泌的嗜热链球菌突变株CHCC16404和德氏乳杆菌保加利亚亚种的2-脱氧葡萄糖抗性突变菌株的组合(例如，CHCC16404和CHCC16159的组合，或CHCC16404和CHCC16160的组合)时，葡萄糖分泌甚至更有效。
考虑到蔗糖甜度是100(参照值)，乳糖甜度是16，半乳糖甜度是32和葡萄糖甜度是74，表4中最后一列所示的最终发酵物的相对甜度的计算值表明不同菌株组合可定义最终发酵物中残存乳糖、葡萄糖和半乳糖的最终浓度。如果需要因为高浓度的分泌葡萄糖和半乳糖而具有最大内在甜度并不残存乳糖的酸奶，则最有效的菌株组合是CHCC16404和CHCC16160。此组合提供的酸奶比嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的2-DG敏感性菌株CHCC14994和CHCC10019的相应组合甜3.6倍，并且在发酵中没有可检测的乳糖残留下来。
表4：利用混合的培养物发酵的乳样品的HPLC数据
*添加0.05％蔗糖
甜度计算值：mg/ml葡萄糖*74+mg/ml乳糖*16+mg/ml半乳糖*32
实施例12.通过利用嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的葡萄糖分泌突变体改善双歧杆菌的生长
一些最公认的益生细菌如动物双歧杆菌乳亚种
(购自Chr.Hansen A/S,Hoersholm,Denmark)当单独存在于基于乳糖的培养基(如乳)中时，生长得不好。在此试验中，因此我们研究了将动物双歧杆菌乳亚种/>
与嗜热链球菌或德氏乳杆菌保加利亚亚种的葡萄糖分泌菌株组合的效果。
试验1：
使CHCC5445
在厌氧条件下，在MRS+0,05％半胱氨酸氯(cysteinechloride)中在40℃下过夜生长。
使CHCC14994在含有2％半乳糖的M17中在40℃下过夜生长。
使CHCC15757在含有2％半乳糖的M17中在40℃下过夜生长。
试验2：
使CHCC5445
在厌氧条件下，在MRS+0,05％半胱氨酸氯中在40℃下过夜生长。
使CHCC10019在含有2％乳糖的MRS中在40℃下以厌氧的方式过夜生长。
使CHCC16159在含有2％乳糖的MRS中在40℃下以厌氧的方式过夜生长。
使装有200ml B乳的六只瓶子在40℃下过夜接种具有近似光密度的总共1％的长出培养物：
1.1％CHCC5445
2.0.5％CHCC5445
+0.5％CHCC14994
3.0.5％CHCC5445
+0.5％CHCC15757
4.1％CHCC5445
5.0.5％CHCC5445
+0.5％CHCC10019
6.0.5％CHCC5445
+0.5％CHCC16159
由于BB-12在乳中表现不佳，仅瓶子2-3和5-6酸化。发酵后，将100μl每种培养物以不同稀释度(10-5、10-6、10-7、10-8)平板接种到用于生长
所选择的琼脂平板(具体地讲，也就是，MRS+0.05％半胱氨酸氯+添加了10ug/ml四环素的四环素)上，然后，在40℃下厌氧培养过夜。随后，通过计数确定菌落数并将结果平均值以CFU/ml在表5中给出。
表5.发酵的乳培养物中BB-12的CFU/ml
| 试验 | 培养物 | Cfu/ml |
| 1 | 1％CHCC5445(BB-12) | 4,50E+07 |
| 1 | 0,5％CHCC5445(BB-12)+0,5％CHCC14994 | 4,00E+07 |
| 1 | 0,5％CHCC5445(BB-12)+0,5％CHCC15757 | 4,00E+08 |
| 2 | 1％CHCC5445(BB-12) | 6,00E+07 |
| 2 | 0,5％CHCC5445(BB-12)+0,5％CHCC10019 | 2,00E+07 |
| 2 | 0,5％CHCC5445(BB-12)+0,5％CHCC16159 | 1,40E+08 |
只有当嗜热链球菌的葡萄糖分泌突变体CHCC15757和德氏乳杆菌保加利亚亚种的葡萄糖分泌突变体CHCC16159与
一起存在时，/>
的生长被促进并且以CFU/ml所示的细胞总数在这些培养物中约高10×(1对数)。此结果表明葡萄糖分泌菌种当在培养物中混合在一起时，可用于提高益生菌(如/>
)的含量。
实施例13：CHCC15757和CHCC16404的基因组对比以及编码葡萄糖/甘露糖磷酸转移酶系统(PTS)的IICMan蛋白的manM基因中的突变的识别
使CHCC15757和CHCC16404的基因组DNA制品在北京基因组研究所(BGI,Beijing,China)测序并利用CLC基因组平台软件(CLCBio,
Denmark)组装以及完成。利用Mauve2.3.1软件，使CHCC15757和CHCC16404的基因组序列比对，将CHRZ1066的注释基因组序列用作参照。比对后，利用免费的Mauve2.3.1软件，对CHCC15757和CHCC16404二者进行单核苷酸多态性(SNP)分析。此可识别编码葡萄糖/甘露糖PTS的IICMan蛋白的manM基因中氨基酸位置209的GAA密码子(谷氨酸)中G到T的突变。此变化在蛋白的位置209引入TAA终止密码子(图3)，产生截短的，因此，非功能性IICMan蛋白。因此，预期此突变阻止葡萄糖通过葡萄糖/甘露糖PTS转运到细胞中。
保藏以及专家方案
申请人要求以下所述的所保藏的微生物的样品仅可由专家利用，直到专利授予之日。
菌株嗜热链球菌CHCC15757在2012年4月3日以保藏号DSM25850被保藏在德国布伦瑞克的德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen(DSMZ)GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany)。
菌株嗜热链球菌CHCC15887在2012年4月3日以保藏号DSM25851被保藏在德国布伦瑞克的德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen(DSMZ)GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany)。
菌株嗜热链球菌CHCC16404在2012年12月12日以保藏号DSM26722被保藏在德国布伦瑞克的德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen(DSMZ)GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany)。
菌株嗜热链球菌CHCC14994在2012年4月3日以保藏号DSM25838被保藏在德国布伦瑞克的德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen(DSMZ)GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany)。
菌株嗜热链球菌CHCC11976在2009年9月8日以保藏号DSM22934被保藏在德国布伦瑞克的德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen(DSMZ)GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany)。
菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC759在2012年9月6日以保藏号DSM26419被保藏在德国布伦瑞克的德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany)。
菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC10019在2007年4月3日以保藏号DSM19252被保藏在德国布伦瑞克的德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany)。
菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC16159在2012年9月6日以保藏号DSM26420被保藏在德国布伦瑞克的德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany)。
菌株德氏乳杆菌保加利亚亚种CHCC16160在2012年9月6日以保藏号DSM26421被保藏在德国布伦瑞克的德国微生物与细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany)。
菌株动物双歧杆菌乳亚种CHCC5445
在2003年9月30日以保藏号DSM15954被保藏在德国布伦瑞克的德国微生物与细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)GmbH,Inhoffenstr.7B,D-38124Braunschweig,Germany)。
保藏物是根据“国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约”准备的。
参考文献
WO 2011/026863
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Chervaux等.(2000).Appl and Environ Microbiol,66,5306-5311
Cochu等.(2003).Appl and Environ Microbiol,69(9),5423-5432
Claims (13)
1.一种嗜热链球菌菌株，其中所述菌株选自由以下组成的组：以保藏号DSM 25850保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的嗜热链球菌CHCC15757菌株、以保藏号DSM 25851保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的嗜热链球菌CHCC15887菌株、以保藏号DSM 26722保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的嗜热链球菌CHCC16404菌株。
2.一种组合物，其包含104至1012CFU/g的根据权利要求1所述的嗜热链球菌菌株。
3.根据权利要求2所述的组合物，其还包含104至1012CFU/g的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株，其中所述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株选自由以下组成的组：以保藏号DSM 26420保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC16159、以保藏号DSM 26421保藏在德国微生物与细胞培养物保藏中心的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株CHCC16160。
4.一种生产发酵乳制品的方法，其包括利用根据权利要求1项所述的至少一种嗜热链球菌菌株接种并发酵乳底物。
5.一种生产发酵乳制品的方法，其包括利用根据权利要求2或3所述的组合物接种并发酵乳底物。
6.一种发酵乳制品，其包含根据权利要求1所述的至少一种嗜热链球菌菌株。
7.一种发酵乳制品，其包含根据权利要求2或3所述的组合物。
8.根据权利要求2或3所述的组合物用于制备发酵乳制品的用途。
9.根据权利要求2或3所述的组合物用于增加发酵乳制品甜度的用途。
10.根据权利要求2或3所述的组合物用于降低发酵乳制品中乳糖含量的用途。
11.根据权利要求6或7所述的发酵乳制品，其用于避免乳糖不耐症症状。
12.根据权利要求1所述的嗜热链球菌菌株用于改善双歧杆菌(Bifidobacterium)菌株在含有乳糖的乳中生长的用途。
13.根据权利要求2或3所述的组合物用于改善双歧杆菌菌株在乳中生长的用途。
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