KR20150006012A - 천연 감미가 증강된 발효 식품을 제조하기 위한 유산균의 용도 - Google Patents

천연 감미가 증강된 발효 식품을 제조하기 위한 유산균의 용도 Download PDF

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Abstract

오늘날 낙농업은 칼로리 증가 없이 목적하는 감미를 달성하기 위해, 발효유제품에 감미료를 첨가하는 것을 대체하기 위한 방법을 제공해야하는 과제에 직면하고 있다. 뿐만 아니라, 발효유제품 중 락토스를 락토스-불내성 소비자들에게까지 허용될 수 있을 정도의 레벨로 발유유제품 중의 락토스를 감소시키는 방법을 수립할 수 있다면 매우 유리할 것이다.
전술한 과제들은 밀크에 돌연변이 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 돌연변이 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 접종하여 발효될 경우 밀크에 글루코스를 분비하는 그러한 돌연변이 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 돌연변이 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 제공함으로써 해결된다.
따라서, 본 발명은 발효 도중 밀크 기질에 글루코스를 분비하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주, 그리고 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주들과 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들을 포함하는 혼합 배양체, 상기 균주들을 포함하는 스타터 배양체 및 이들 배양체로 만들어진 유제품에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 또한 발효유제품의 락토스 함량을 감소시키고 프로바이오틱 BB-12

Description

천연 감미가 증강된 발효 식품을 제조하기 위한 유산균의 용도{USE OF LACTIC ACID BACTERIA FOR PREPARING FERMENTED FOOD PRODUCTS WITH INCREASED NATURAL SWEETNESS}
본 발명은 스트렙토코커스 써모필러스 박테리아 균주 및 락토스의 분해에 의해 형성된 글루코스를 고수준으로 분비함으로써 감미 특성을 갖는 배양체, 락토스의 분해에 의해 형성된 글루코스를 고수준으로 분비함으로써 감미 특성을 갖는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 박테리아 균주, 이러한 균주들을 포함하는 스타터 배양체 및 이들 배양체에 의해 발효된 유제품에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 균주를 수득하는 방법 및 발효유제품(fermented milk products)의 제조 그리고 발효유제품의 락토스 함량을 감소시키는 한편 발효유제품의 감미는 증가시키기 위한 이러한 균주들의 용도에 관한 것이기도 하다.
순수한 발효유제품들은 발효가 일어나는 동안 유산균에 의한 락토스로부터 젖산으로의 전환의 결과로 톡쏘는 듯하거나 신맛이 나게 된다. 이들에는 따라서, 단맛이 더 많이 나는 제품을 선호하는 소비자의 욕구를 충족시키기 위해 과일, 꿀, 슈가 또는 인공 감미료를 첨가하여 감미처리를 하게 된다.
지난 20년간 만연하고 있는 과체중과 비만 문제를 해소하는데 도움이 되도록 식품업계에서는 저칼로리 감미 식품에 대한 요구가 증가일로에 있다. 대체로 기분좋은 감각이라 간주되는 감미는 슈가(sugars)과 몇몇 다른 물질들의 존재로 인해 생성된다. 슈가의 감각에는 많은 차이가 있다. 수크로스의 점수를 100점이라 치면, 락토스의 감미는 16, 갈락토스는 32 그리고 글루코스의 감미는 74이다 (Godshall (1988). Food Technology 42(11):71-78). 글루코스는 따라서 락토스에 비해 4배나 더 감미가 높으면서도 칼로리는 거의 동일한 수준이다.
발효식품 중의 슈가는 보다 낮은 칼로리 섭취로도 감미를 제공하게 해주는 아스파탐, 아세설팜 K, 수크랄로스 및 사카린과 같은 감미료들에 해 종종 대체된다. 그러나, 인공 감미료를 사용할 경우 이미(off-taste)가 날 수 있고 몇몇 연구 결과 인공 감미료를 소비할 경우 허기짐이 증가하고, 알레르기, 암 등과 같은 단점이 일어날 수 있으며 천연 감미료만을 함유하거나, 또는 좋기로는 감미료가 첨가되지 않은 발효유제품에 대한 소비자 선호도에 기여한다.
따라서, 천연(본연의) 감미가 높은 발효유제품을 개발하는 것이 중요한 과제이다.
발효유제품의 산도(acidity)는 부분적으로는 제품 내에 존재하는 유산균과 발효유제품의 제조에 사용된 제조 파라미터들에 의존한다.
이당류인 락토스의 발효는 유산균에서 대단히 집중적으로 연구되었는데 이는 이것이 밀크 중의 주요 탄소원이기 때문이다. 많은 종에 있어서 락토스는 섭취 후 β-갈락토시다제에 의해 글루코스와 갈락토스로 분해된다. 글루코스는 글루코키나제에 의해 글루코스-6-포스페이트로 포스포릴화되고 대부분의 유산균에 의해 엠덴-마이어호프-파르나스 경로(Embden-Meyerhof-Parnas pathway)(해당)를 경유하여 발효된다(도 1).
스트렙토코커스 써모필러스는 보통 또 다른 미생물인 락토바실러스 sp.와의 혼합 스타터 배양체의 일부로서 상업적인 호열성 밀크 발효 공정에 가장 널리 사용되는 균주로서, 예컨대 요구르트 제조시에는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스와, 또는 스위스 치즈의 제조시에는 락토바실러스 헬베티쿠스와 함께 혼합 스타터 배양체로서 사용된다.
많은 국가에서 요구르트의 법적 정의는 스트렙토코커스 써모필러스와 함께 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스를 요한다. 이들 두 가지 종은 모두 요구르트의 중요한 풍미 성분인 아세트알데히드를 소망되는 양으로 생성한다.
락토스와 수크로스는 이들을 이루는 단당류 성분보다 스트렙토코커스 써모필러스에 의해 보다 잘 발효된다. 스트렙토코커스 써모필러스가 사용될 경우, 갈락토스가 과량 존재하면 락토스 분자의 글루코스 부분만이 발효되고 갈락토스는 발효유제품 중에 축적된다. 높은 산 농도가 발효를 제한하는 요구르트에 있어서는 스위스 치즈 제조 초기 단게에서 생산된 유리 갈락토스가 락토바실러스 헬베티쿠스에 의해 후에 발효되는 한편 유리 갈락토스가 남는다.
그러나, 갈락토스 발효 균주들인 스트렙토코커스 써모필러스와 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 두 가지 모두 몇몇 연구자들에 의해 보고된 바 있고 (Hutkins 등 (1986) J. Dairy Sci. 69(1):1-8; Vaillancourt 등 (2002) J. Bacteriol. 184(3); 785-793) WO 2011/026863 (Chr. Hansen)에는 갈락토스를 발효하는 스트렙토코커스 써모필러스 균주들을 수득하는 방법이 설명되어 있다.
식품 산업에서의 요구사항을 만족시키기 위해, 글루코스 분비에 의해 발효제품에 여분의 칼로리를 직접 제공함이 없이 천연 감미를 보다 많이 제공하는 새로운 균주들, 특히 스트렙토코커스 써모필러스 균주와 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주가 요구되고 있다.
Pool 등 (2006. Metabolic Engineering 8(5); 456-464)은 새로이 발견된 글루코스-PTS EII(cel) 및 글루코키나제를 코딩하는 유전자 EII(man/glc)의 결실에 의해 글루코스 대사가 완전히 파괴되는 락토코커스 락티스 균주에 대해 개시하고 있다. 구축방법은 모든 돌연변이의 생산을 위한 유전자 재조합이며 결과적인 균주는 현재로서는 식품에 사용할 수 없는 유전자 변형 생물 (GMO: genetically modified organism)이다.
Thompson 등 (1985. J Bacteriol. 162(1); 217-223)은 스트렙토코커스 락티스 (오늘날 락토코커스 락티스로 재명명됨)에 있어서의 락토스 대사를 연구하였다. 이 연구에서는 만노스-PTS 시스템에서 돌연변이주를 얻기 위해 2-데옥시글루코스가 사용되었다. 이어서, 이 돌연변이주를 UV 돌연변이유발에 의해 돌연변이시킨 다음 레플리카 도말에 의해 글루코스-음성 콜로니를 스크리닝하였다. 이러한 방식으로 이중 돌연변이주(만노스 PTS 및 글루코키나제)를 분리하였다. 이 이중 돌연변이주를 이용하여 "스타터" 미생물에 의한 락토스 발효의 조절과 관련된 메카니즘을 연구하였다. 이들 돌연변이주들은 이들의 모균주에 비해 몇가지 단점들을 갖는데 이러한 단점들로 인해 이들은 상업적인 스타터 배양체에 이들을 포함되기에 부적합하다. 이 돌연변이주의 세포 수율은 발효되니 락토스 1 mole 당 모균주의 그것의 절반에 불과하였고 락토스에서 배양시 이 돌연변이주에서는 배가 시간이 훨씬 더 증가하였다. 마찬가지로, 젖산 수율은 발효된 락토스 1 mole 당 모균주의 절반이었다. 밀크에서의 이들 균주들의 거동은 분석되지 않았지만 산성화 속도가 유의적으로 감소한 것으로 예상된다.
뿐만 아니라, 락토코커스 락티스는 일반적으로 아세트알데히드 생산에 선택되지 않으며 요구르트의 법적 정의와 관련한 요구사항을 만족하는데 기여하지도 못한다.
Chervaux 등 (2000. Appl. 및 Environ. Microbiol., 66, 5306-5311)은 화학적으로 새롭게 정의된 배지에서의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들의 생리학을 연구하고 글루코스 발효가 결핍된 2-데옥시글루코스-내성 돌연변이주를 분리하였다. 몇몇 상이한 표현형들이 관찰되었으며 균주-특이적인 효과가 보고되었다.
전술한 접근법들 중 어느 것도 스트렙토코커스 써모필러스 균주들과 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들을 단독으로 또는 다른 유산균 균주들과 함께 이용하여 발효시킨 식품에 천연 감미가 증강된 특성을 부여하는데 성공하지 못하였다.
또한, 전술한 접근법들 중 어느 것도 이러한 균주들을 이용하여 발효된 식품에서의 락토스 함량을 락토스 불내성 개체들에게 관용가능한 수준까지 감소시킨다는 문제점을 해결하지 못하였다.
발명의 개요
전술한 종래기술과 대조적으로, 본 발명자들은 갈락토스를 발효하는(galactose-fermenting) 스트렙토코커스 써모필러스 균주들을 2-데옥시글룩소스에 노출시킴으로써, 글루코키나제(glcK) 유전자가 돌연변이된 스트렙토코커스 써모필러스 균주들이 선택될 수 있고 이들 세포들이 밀크 기질에서 생육될 경우 락토스와 갈락토스를 분해하여 주변 환경으로 글루코스를 분비한다는 것을 발견하였다.
놀랍게도, 이들 스트렙토코커스 써모필러스 균주들은, 비록 pH 5로의 산성화 시간이 2-5시간 지연되기는 하지만, 그 단독으로 밀크를 완전히 산성화시킬 수 있다. 이들은 따라서 그 자체로 발효유에 성공적으로 사용될 수 있다.
그러나, 글루코스는 많은 유산균에 의해 탄소원으로 이용되고 분비된 여하한 글루코스는 발효유제품 내에 존재하는 다른 미생물들에 의해 소비될 수 있다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명은 탄소원으로서의 글루코스 상에서 생육될 능력을 상실하였거나 이러한 조건 하에서 생육되기에는 손상된 능력을 나타내는, 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 2-데옥시글루코스-내성 돌연변이주들을 제공한다. 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 돌연변이 균주들은 존재할수도 있는 다른 미생물들에 의해 밀크 내로 분비된 글루코스를 소비할 뿐만 아니라, 주변의 배지로 대량의 글루코스를 분비하면서도, 놀랍게도 비록 pH 로의 산성화 시간이 2-5시간 늦기는 하지만, 밀크를 완전히 산성화시킬 수 있다. 이들은 따라서 발효유에 그대로 적용될 수 있다.
이러한 식품등급의 박테리아는 발효유제품에 글루코스를 강화시키는데 이용될 수 있다. 글루코스는 락토스 및 갈락토스 두 가지 모두에 비해 보다 더 높게 지각되는 감미를 가지며 따라서, 밀크 기질에 글루코스가 분비될 경우 발효유제품에서 보다 높게 지각되는(내부:inner) 감미를 결과시키게 된다.
본 발명의 발명자들은 밀크 기질이 본 발명에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주와 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주에 의해 발효될 경우 밀크 내의 락토스 레벨이 유의적으로 감소한다는 것을 발견하였다.
락토스 불내성은 락토스의 분해능력이 없기 때문에 일어나는 현상이다. 대부분의 락토스-불내성 개체들은 음식물 중 어느 정도의 락토스 양은 관용할 수 있지만 락토스 소비량이 증가함에 따라 그들의 증상 (구토, 경련, 고장증, 설사 및 위고창을 포함함)의 위중도도 증가한다.
따라서, 식품산업에 있어서 락토스 무함유 또는 락토스 함량이 감소된 식품을 생산하는 것이 매우 중요하다.
락토스 저함량 및 락토스 무함유 식품의 락토스 함량에 있어서 EU에서는 이제까지 아무런 공통적인 제한적 가치가 규정된 바 없지만, 핀란드 식품안전당국 에비라(Finnish Food Safety Authority Evira)는 노르딕 제한치는 락토스 무함유 식품의 경우 그러한 식품 100 g 또는 100 ml 당 락토스 함량 10 mg 미만이고 락토스 저함량 식품의 경우 그러한 식품 100 g 또는 100 ml 당 락토스 함량 1 g 미만이라고 천명하고 있다.
오늘날 낙농업은 칼로리 증가 없이 목적하는 감미를 달성하기 위해, 발효유제품에 감미료를 첨가하는 것을 대체하기 위한 방법을 제공해야하는 과제에 직면하고 있다. 뿐만 아니라, 발효유제품 중 락토스를 락토스-불내성 소비자들에게까지 허용될 수 있을 정도의 레벨로 발유유제품 중의 락토스를 감소시키는 방법을 수립할 수 있다면 매우 유리할 것이다.
전술한 과제들은 9.5% B-밀크에 본 발명에 따른 돌연변이 스트렙토코커스 써모필러스 균주 106-107 CFU/ml가 접종되거나 또는 본 발명에 따른 돌연변이 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 106-107 CFU/ml가 접종하여 본 발명에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 또는 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 의해 40℃에서 적어도 20시간 발효시킬 경우 밀크 내로 글루코스를 분비하는, 돌연변이 스트렙토코커스 써모필러스 균주들 및 돌연변이 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들을 제공함으로써 해결되었다. 좋기로는 이러한 돌연변이 균주들은 9.5% B-밀크에 본 발명에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주 106-107 CFU/ml를 접종하거나, 본 발명에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 06-107 CFU/ml를 접종하여 본 발명에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주 또는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주와 함께 발효시킬 40℃에서 적어도 20시간 발효될 경우 그 단독으로 적어도 5 mg/ml 글루코스를 생산한다. 이 균주들은 또한 pH 5에 이르는 산성화 시간이 비록 2-5 시간 지연되기는 하지만, 밀크를 완전히 산성화시킬 수도 있다. 최종 발효유는 그 발효유 내에 락토스를 15 mg/ml 미만으로 함유한다. 결과적으로 최종 발효유는 내부 감미 지수(inner sweetness index)가 대략 2배 더 높다.
스트렙토코커스 써모필러스 균주들을 제공하기 위해, 본 발명자들은 갈락토스를 발효하는 스트렙토코커스 써모필러스 모균주, 좋기로는 이전에는 낮게 발현되거나 발현되지 않은 오페론의 발현을 증가시키는, 갈락토스 오페론이 돌연변이된 균주로부터 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이 균주를 분리하는 방법을 발견하였는데, 여기서 상기 2-데옥시글루코스 내성 표현형은 인코딩된 단백질을 부분적으로 또는 전적으로 불활성화시키는 글루코키나제(glcK) 유전자의 돌연변이에 의해 야기되는 것이다. 이 방법은 모균주를 2-데옥시글루코스로 처리하고 본 명세서 실시예 1에 설명된 바와 같은 M17 배지 + 2% 갈락토스를 함유하는 한천 플레이트 상에서 2-데옥시글루코스의 존재 하에 생육가능한 돌연변이 균주들을 선택하는 것을 포함한다. 이들 돌연변이주들을 스크리닝하여 M17 배지 + 2% 글루코스에서보다 M17 배지 + 2% 갈락토스에서 생장률이 더 높은 균주들을 선택한다.
놀랍게도 글루코키나제 유전자(glck)가 돌연변이되었지만 겉보기에는 정상적으로 기능하는 글루코스 트랜스포터 시스템을 갖는 스트렙토코커스 써모필러스의 돌연변이 균주들이 글루코스를 분비한 것으로 밝혀졌다. 이들 돌연변이주들을 CHCC15757 및 CHCC15887이라 명명하였다.
뿐만 아니라, 본 발명자들은 글루코키나제 유전자가 돌연변이된 스트렙토코커스 써모필러스 균주들을 2-데옥시글루코스로 처리한 다음, 9.5% B-밀크에 수크로스가 0.01%라는 극히 낮은 농도로 첨가된 경우를 제외하고는 9.5% B-밀크에서 생육하지 못하는 균주들을 선택함으로써, 락토스 발효능과 글루코스 분비능이 보다 더 높은 스트렙토코커스 써모필러스 균주들을 선택할 수 있음을 발견하였다. 이러한 높은 락토스 발효능과 글루코스 분비능을 갖는 돌연변이주를 CHCC16404라 명명하였다.
CHCC16404는 글루코스를 세포 내로 수송하는데 책임이 있는 글루코스 수송 단백질의 불활성화를 결과시키는 글루코스 수송 유전자(manM)의 돌연변이를 갖는다.
락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 제공하기 위해 본 발명의 발명자들은 탄소원으로서 글루코스 상에서 생육하는 능력이 상실되거나 탄소원으로서 글루코스 상에서 생육되는 능력이 손상된, 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 모균주의 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이 균주들을 분리하는 방법을 발견하였다. 이 방법은 모균주를 2-데옥시글루코스로 처리하여, 본 발명 명세서의 실시예 5에 설명된 바와 같은, 2% 락토스를 함유하는 MRS-IM 배지를 함유하는 한천 플레이트 상에서 2-데옥시글르코스의 존재하에 생육할 수 있는 돌연변이 균주들을 선택하는 것을 포함하여 이루어진다. 이 돌연변이주들을 스크리닝하여, 글루코스 상에서 생육할 수 있는 모균주에 비해 2% 글루코스를 함유하는 MS-IM 상에서 생육할 수 있는 능력이 완전히 상실되거나 그러한 능력이 저하된 균주들을 선택한다.
이러한 놀라운 발견에 따라, 본 발명은 신규한 유산균 균주, 예컨대 특히, glcK 유전자가 돌연변이된 스트렙토코커스 써모필러스 또는 글루코스를 발효제품 내로 분비하여 여분의 칼로리 없이 천연 감미를 제공하는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 돌연변이주, 이러한 균주들의 생산 방법, 이러하나 균주들을 이용하여 만들어진 발효유제품, 및 락토스 레벨은 감소되고 감미는 증가된 발효유제품을 제조하는데 있어서의 이러한 균주들의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 및 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들은 놀랍게도, 밀크에 단독으로 존재할 경우 잘 생육하지 않는 프로바이오틱 세균인 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 균주 BB-12
Figure pct00001
의 생육을 촉진하는 것으로 밝혀졌다.
도 1은 스트렙토코커스 써모필러스에 있어서 락토스 이화작용을 도식적으로 나타낸 도면이다. GlcK, 글루코키나제; LacS, 락토스 수송체(transporter); LacZ, β-갈락토시다제; GalM, 뮤타로타제; GalK, 갈락토키나제; GalT, 갈락토스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제; GalE, UDP-글루코스 4 에피머라제; Gal1P, 갈락토스-1-포스페이트.
도 2는 스트렙토코커스 써모필러스의 글루코키나제 유전자(glcK)의 DNA 서열(SEQ ID NO. 1) 및 코딩된 아미노산 서열(SEQ ID NO. 2)을 나타낸 도면이다. CHCC15757 및 CHCC15887에서 발견된 단일 염기 치환(single nucleotide substitutions)이 각각 표시되어 있다.
도 3은 스트렙토코커스 써모필러스에 있어서 글루코스/만노스 포스포트랜스퍼라제 시스템 (PTS)을 코딩하는 man 오페론을 나타낸 도면이다. 모균주인 CHCC15757에 비해, 하이퍼-락토스 발효 및 글루코스 분비 돌연변이주인 CHCC16404는 글루코스/만노스 PTS의 IICMan 단백질을 코딩하는 manM 유전자가 돌연변이된 것으로 밝혀졌다. G에서 T로의 돌연변이는 아미노산 위치 209에서의 글루탐산에 대한 GAA 코돈을 TAA 종결 코돈(*)으로 변환시켜 CHCC16404에서 번역을 회피시킴으로써 이 단백질의 기능을 불활성화시킨다.
도 4는 스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC15757의 manM 유전자의 DNA 서열(SEQ ID NO. 5) 및 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열(SEQ ID NO. 6)을 나타낸다. CHCC16404에서 발견된 단일 염기 치환이 표시되어 있다.
본 명세서에서, "유산균(lactic acid bacterium)"이라 함은 슈가를 발효시켜주로 젖산을 생성하되 그 밖에도 아세트산 및 프로피온산을 비롯한 산을 생성하는 그램-양성, 미호기성(microaerophilic) 또는 혐기성(anaerobic) 세균을 가리킨다. 산업적으로 가장 유용한 유산균은 락토코커스 spp ., 스트렙토코커스 spp ., 락토바실러스 spp ., 류코노스톡 spp ., 페디오코커스 spp ., 브레비박테리움 spp ., 엔테로코커스 spp . 및 프로피오니박테리움 spp .을 포함하는 "락토바실라레스(Lactobacillales)" 목에서 발견된다. 락토바실러스 sp . 및 스트렙토코커스 써모필러스 종의 세균을 비롯한 유산균은 대개 벌크 스타터 증식을 위해 동결 또는 동결건조된 배양체로서 공급되거나 또는 발효유제품과 같은, 유제품 생산을 위해 발효 용기 또는 배트(vat)내로 직접 접종되도록 의도된 소위 "다이렉트 배트 세트(DVS)"로서 공급된다.
본 명세서에서 관사 "a" 및 "an" 그리고 "the"는 문맥상 달리 언급되거나 명시적으로 반대되는 의미를 나타내는 것이 아닌 한, 단수와 복수 모두를 포함하는 것으로 의도된다. "포함하는", "갖는", "비롯한", "함유하는" 등의 용어는 달리 언급되지 않는 한 개방형(open-ended) 의미 (즉 "포함하나, 이에 한정되지 않는")를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 어떤 값들의 범위를 나타낼 때 그것은 단지 그 범위에 속하는 각각의 값들을 개별적으로 간편하게 나타내기 위한 것일 뿐, 달리 언급하지 않는 한, 그 범위 내의 각각의 개별적인 값들 역시 마치 개별적으로 직접 인용된 것처럼 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 설명된 모든 방법들은 달리 언급하지 않거나 명시적으로 반대 의미를 나타내지 않는 한 어떤 적당한 순서로든 실시가능하다. 본 발명의 모든 실시예 또는 예시적인 언어 (예컨대, "와 같은..", "예컨대" 등)는 단지 본 발명을 보다 잘 설명하기 위해 제시된 것일 뿐 달리 언급하거나 청구되지 않는 한 본 발명의 범위가 그에 한정되는 것은 아니다. 명세서의 어떠한 언어든 본 발명을 실시하는데 필수적이면서 청구되지 않은 구성요소를 나타내는 것으로 이해되어서는 아니된다.
몇몇 국가에서는, 요구르트의 법적 정의 상 스트렙토코커스 써모필러스와 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스가 두 가지 모두가 존재할 것이 요구된다. 이들 두 가지 종들은 모두 요구르트에 있어서 중요한 풍미 성분인 아세트알데히드를 바람직한 양으로 생성한다.
모짜렐라 및 피자 치즈 및 페타 치즈와 같은 치즈들 역시도 스트렙토코커스 써모필러스 및 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 두 가지 모두를 이용한 발효에 의해 제조될 수 있다 (Hoeier 등 (2010)의 문헌 The Technology of Cheesemaking, 2nd Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192).
식품산업 상 요구사항을 충족하기 위해, 여분의 칼로리를 생성함이 없이, 발효제품 내에서 천연의 감미를 더 많이 직접 생산하는 (내부 감미) 새로운 균주들, 특히 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 및 스트렙토코커스 써모필러스 균주들을 개발하는 것이 요망되어 왔다.
스트렙토코커스 써모필러스는 상업적인 밀크 발효에 가장 널리 사용되는 유산균 중 하나로서, 이러한 상업적인 밀크 발효에서 이 균주는 대개 혼합 스타터 배양체의 일부로서 사용되는데, 이것과 혼합 사용되는 다른 성분은 락토바실러스 sp.로서, 예컨대 요구르트의 경우에는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스와 혼합 사용되고, 스위스 치즈의 제조시에는 락토바실러스 헬베티쿠스와 혼합 사용된다.
락토스와 수크로스는 이들의 구성 성분 단당류보다 더 잘 스트렙토코커스 써모필러스에 의해 쉽게 발효된다. 스트렙토코커스 써모필러스가 사용될 경우, 락토스 분자의 글루코스 부분만이 스트렙토코커스 써모필러스에 의해 발효되고 갈락토스는 발효유제품 중에 축적된다. 높은 산 농도가 발효를 제한하는 요구르트에 있어서는, 유리 갈락토스가 잔존하는 반면, 스위스 치즈 제조의 초기 단계에서 생산된 유리 갈락토스는 나중에 락토바실러스 헬베티쿠스에 의해 발효된다. 치즈 제조시 사용되는 많은 스타터 배양체들에서 발견되는 락토코커스 락티스는 또한 스트렙토코커스 써모필러스에 의해 생산된 갈락토스를 소비할 수도 있다.
스트렙토코커스 써모필러스 균주들이 가능한 한 최적의 생육 성능을 발휘하도록 하기 위해, 본 발명자들은 스트렙토코커스 써모필러스의 갈락토스-발효 균주들을 선택 물질(selective agent) 2-데옥시글루코스에 노출시켰다. 일반적으로, 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이주들은 글루코키나제를 코딩하는 유전자와 글루코스 수송을 코딩하는 유전자들이 돌연변이된 것들이다. 2-데옥시글루코스에 내성을 갖는 분리된 돌연변이주들인 CHCC15757, CHCC15887 및 CHCC16404는 그들의 글루코키나제 (glcK) 유전자에 돌연변이를 갖는다. 본 발명자들은 CHCC16404가 글루코키나제 유전자에서의 돌연변이에 더해, 글루코스/만노스 수송체 유전자에서 종결 코돈 돌연변이를 갖는 것을 발견하였는데 이러한 돌연변이는 분비된 글루코스가 왜 세포 내로 다시 수송되지 않는지를 설명해 줄 수 있는 단초가 될 수 있다.
놀랍게도, 이러한 돌연변이주들은 그 단독으로 밀크를 완전히 산성화시킬 수 있다 (다만 pH 5에 이르는 산성화시간이 2-5 시간 늦기는 하다). 이들은 따라서 그 자체로 발효유제품에 유용하게 적용될 수 있으며 요구르트의 특징인 밀크를 응집시키는 모균주의 능력을 그대로 보유한다. 이에 더해, 글루코스 수송체 돌연변이주를 분리할 필요없이, 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC15757 또는 CHCC15887를 접종하고 40℃에서 적어도 20 시간 발효시키거나, 또는 0.05% 수크로스가 함유된 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC16404를 접종하고 40℃에서 적어도 20시간 발효시키면, 이들 돌연변이주들이 5 mg/ml 초과하는 양으로 글루코스를 분비하는 것으로 나타났다. 이와 동시에, 발효유에는 약 10 mg/ml 락토스 및 1.5 mg/ml 미만의 락토스 (검출 한계)가 각각 잔류하였다. 따라서, 이러한 균주를 발효유제품 생산에 사용하는 것은 락토스 불내성이 있는 사람들에게 중요한 의미가 될 수 있다.
결과적으로, 최종 발효유는 Godshall의 문헌 (1988. Food Technology 42(11):71-78)에 설명된 바에 따라 계산할 경우 적어도 2.0이 넘는 높은 내부 감미(inner sweetness) 지수를 갖는다.
본 발명의 제1 측면은 따라서, 스트렙토코커스 써모필러스의 갈락토스-발효 돌연변이 균주에 관한 것으로서, 상기 돌연변이 균주는 글루코키나제 단백질을 코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열에 돌연변이를 가짐으로 해서, 상기 돌연변이로 인해, 코딩된 글루코키나제 단백질이 불활성화되거나 또는 상기 유전자의 발현에 네거티브한 영향을 끼치게 되는 것이다. 글루코키나제 활성 수준 또는 글루코키나제 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 널리 알려져 있으며 (Porter 외 (1982) Biochim. Biophys. Acta, 709;178-186) 이러한 방법에는 시판되는 키트 및 쉽게 입수가능한 재료들을 이용하는 정량적 PCR 또는 트랜스크립토믹스를 이용한 효소 분석법이 포함된다.
본 발명에서 세균 "균주(strain)"이라 함은 생육되거나 증식될 때 유전학적으로 변치않고 남아있는 세균을 가리킨다. 동일한 세균의 증식도 여기에 포함된다.
본 발명에서 "갈락토스-발효 스트렙토코커스 써모필러스 균주들(galactose-fermenting Streptococcus thermophilus strains)"라 함은 M17 배지 + 2% 갈락토스 상에서 또는 이러한 배지 내에서 자랄 수 있는 스트렙토코커스 써모필러스 균주들을 가리킨다. 본 명세서에서 갈락토스-발효 스트렙토코커스 써모필러스 균주들은 1% 농도로 오버나잇 배양체로부터 접종되어 37℃에서 24 시간 인큐베이션될 경우 유일한 탄수화물로서 2% 갈락토스를 함유하는 M17 브로쓰의 pH를 5.5 이하로 저하시키는 스트렙토코커스 써모필러스 균주들로서 정의된다.
갈락토스-발효 균주들은 WO 2011/026863에 설명된 방법에 의해 수득될 수 있다.
본 명세서에서 "돌연변이가 글루코키나제 단백질을 불활성화시키다"라는 표현은 "불활성화된 글루코키나제 단백질"을 야기하여, 세포 내에 존재할 경우, 글루코키나제 단백질이 그의 정상적인 기능을 발휘하지 못하게 되는 돌연변이 뿐만 아니라, 그 글루코키나제 단백질의 형성을 방지하거나 분해를 결과시키는 돌연변이 역시도 의미한다.
특히, 불활성화된 글루코키나제 단백질은 기능성 글루코키나제 단백질에 비해 글루코스의 글루코스-6-포스페이트로의 포스포릴화를 가능케하지 못하거나 또는 글루코스의 글루코스-6-포스페이트로의 포스포릴화를 유의적으로 감소된 속도로만 가능케하는 단백질이다. 이와 같이 불활성화된 글루코키나제 단백질을 코딩하는 유전자는 기능성 글루코키나제 단백질을 코딩하는 유전자에 비해, 당해 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 돌연변이를 갖는데, 상기 돌연변이는, 결실, 프레임쉬프트 돌연변이, 종결코돈의 도입 또는 아미노산 치환을 결과시키고, 단백질의 기능적 특성을 변화시키는 돌연변이, 당해 유전자의 전사 또는 번역을 감소 또는 폐지시키는 프로모터 돌연변이를 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
바람직한 구체예에서 상기 돌연변이는 글루코키나제 단백질의 활성 (글루코스를 글루코스-6-포스페이트로 포스포릴화시키는 비율/속도(rate))을 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90% 감소시킨다.
글루코키나제 활성은 Pool 등의 문헌 (2006. Metabolic Engineering 8;456-464)에 설명된 글루코키나제 효소 분석법에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 "기능성 글루코키나제 단백질(functional glucokinase 단백질)"이라 함은 만일 세포 내에 존재할 경우, 글루코스를 글루코스-6-포스페이트로 포스포릴화시킬 수 있는 글루코키나제 단백질을 가리킨다. 특히, 기능성 글루코키나제 단백질은 SEQ ID NO. 1에서 위치 1-966에 대응하는 서열 또는 SEQ ID NO. 1의 위치 1-966에 대응하는 서열에 대해 적어도 85% 동일성, 예컨대 적어도 90% 동일성, 예컨대 적어도 95% 동일성, 예컨대 적어도 98% 동일성, 예컨대 적어도 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 ORF를 포함하는 유전자에 의해 코딩된다.
2개 서열 간의 동일성 백분율은 수학적 알고리듬, 예컨대 Karlin 및 Altschul의 알고리듬 (1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87;2264), Karlin 및 Altschul (1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90;5873-5877)에 설명된 변형된 알고리듬; Myers 및 Miller의 알고리듬 (1988. CABIOS 4;11-17); Needleman 및 Wunsch의 알고리듬 (1970. J. Mol. Biol. 48;443-453); 및 Pearson 및 Lipman의 알고리듬 (1988. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85;2444-2448)에 의해 구할 수 있다. 이들 수학적 알고리듬에 기초하여 핵산 또는 아미노산 서열 동일성을 구하는 컴퓨터 소프트웨어 역시도 이용가능하다. 예컨대, 뉴클레오타이드 서열들을 BLASTN 프로그램, 점수=100, 단어길이=12를 이용하여 비교할 수 있다. 아미노산 서열들의 비교는 　BLASTX 프로그램, 점수=50, 단어길이=3에 의해 실시할 수 있다. BLAST 프로그램의 잔여 파라미터들, 디폴트 파라미터들을 이용할 수 있다.
많은 국가에서 발효유제품에 유전자 변형 생물(GMOs)을 사용하는 것이 불허되고 있다. 본 발명은 그 대안으로 발효유제품에서 글루코스의 소망되는 축적을 제공할 수 있는, 천연 또는 유도된 돌연변이 균주의 수득 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 매우 바람직한 구체예에서 이러한 돌연변이 균주는 자연발생적인 돌연변이주이거나 또는 유도된 돌연변이주이다.
본 명세서에서 "돌연변이 박테리아(mutant bacterium)" 또는 "돌연변이 균주(mutant strain)"이라 함은 그의 게놈(DNA)에 야생형 DNA에는 존재하지 않는 1개 이상의 돌연변이를 포함하는 천연(자연적, 자연발생적) 돌연변이 박테리아 또는 유도된 돌연변이 박테리아를 가리킨다. "유도된 돌연변이주(induced mutant)"라 함은 인간의 행위, 예컨대 화학적 돌연변이제, UV 조사 또는 감마선 조사 등에 의해 돌연변이가 유도된 것을 의미한다. 이와 대조적으로, "자연발생적 돌연변이주(spontaneous mutant 또는 naturally occurring mutant)"는 인간에 의해 돌연변이 되지 않은 돌연변이를 가리킨다. 본 명세서에서 돌연변이 박테리아는 비-GMO (non-genetically modified organism)로서, 즉, 재조합 DNA 기술에 의해 변형된 것이 아니다.
"야생형 균주"라 함은 자연에서 발견되는 것과 같은, 돌연변이되지 않은 박테리아 형태를 가리킨다.
"감미 특성을 갖는 균주", "발효유제품에서 글르코스의 바람직한 축적을 제공할 수 있는 균주" 및 "식품의 천연 감미를 위해 증강된 특성을 갖는 균주"라는 표현들은 발효유제품에 본 발명의 균주들을 사용하는 것과 관련하여 유리한 측면을 특징짓기 위해 호환적으로 사용된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 스트렙토코커스 써모필러스의 돌연변이 균주는 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 농도로 접종되어 40℃에서 적어도 20 시간 동안 생육될 경우 9.5% B-밀크 내의 글루코스의 양을 적어도 5 mg/mL의 양으로 증가시킨다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 스트렙토코커스 써모필러스의 돌연변이 균주는 0.05% 수크로스가 함유된 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 농도로 접종되어 40℃에서 적어도 20 시간 동안 생육될 경우 9.5% B-밀크 내의 글루코스의 양을 적어도 5 mg/mL의 양으로 증가시킨다.
본 발명의 문맥 상, 9.5% B-밀크는 9.5%의 건조물 수준으로 재조성된 저지방 탈지유 분말을 99℃에서 30분간 파스퇴르살균처리한 다음 40℃로 냉각함으로써 만든 끓인 밀크이다.
본 발명의 보다 바람직한 구체예에서 돌연변이 균주는 글루코스의 양을 적어도 6 mg/mL, 예컨대 적어도 7 mg/mL, 예컨대 적어도 8 mg/mL, 예컨대 적어도 9 mg/ml, 예컨대 적어도 10 mg/ml, 예컨대 적어도 11 mg/ml, 예컨대 적어도 12 mg/ml, 예컨대 적어도 13 mg/ml, 예컨대 적어도 14 mg/ml, 예컨대 적어도 15 mg/ml, 예컨대 적어도 20 mg/ml, 예컨대 적어도 25 mg/ml의 양으로 증가시키는 것이 좋다.
본 발명의 또 다른 구체예에서 스트렙토코커스 써모필러스의 돌연변이 균주는 2-데옥시글루코스에 내성이 있다.
본 명세서에서 "2-데옥시글루코스에 내성이 있다"라는 표현은 특정하게 돌연변이된 박테리아 균주가 40℃에서 20시간 인큐베이션된 후 20 mM 2-데옥시글루코스를 함유하는 M17 배지 플레이트 상에 도말될 경우 콜로니로 생육할 수 있는 능력이 있는 균주로 정의된다. 배양 배지 중에 2-데옥시글룩코스가 존재하면 비돌연변이 균주들의 생장은 방지하는 한편 돌연변이된 균주들의 생장은 그에 영향을 받지 않거나 미미하게만 영향을 받을 뿐이다. 이러한 내성 평가에서 감수성 레퍼런스 균주로서 사용가능한 비돌연변이 균주들에는 좋기로는 CHCC14994 및 CHCC11976이 포함된다.
본 명세서의 실시예 1 및 2에는 2-데옥시글루코스에 내성인 스트렙토코커스 써모필러스의 돌연변이 균주들의 분리가 예시되어 있다.
또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 돌연변이 균주는 그의 생장 패턴에 의해 특징지어질 수 있다. 이것은 해당 돌연변이 균주의 성장 속도가 M17 배지 + 2% 글루코스에서보다 M17 배지 + 2% 갈락토스에서 더 높다는 발견에 의해 설명된다. 성장 속도는 본 명세서의 실시예 2에 설명된 바와 같이 600 나노미터(OD600)에서 경시적으로 대수적으로 성장하는 배양체의 광학 밀도의 증가로서 측정된다.
바람직한 구체예에서 성장 속도는 M17 배지 + 2% 글루코스에서보다 M17 배지 + 2% 갈락토스에서 적어도 5% 더 높은, 예컨대 적어도 10% 더 높은, 예컨대 적어도 15% 더 높은, 예컨대 적어도 20% 더 높은 것이다.
바람직한 구체예에서 돌연변이는 SEQ ID NO. 2의 위치 72에서 세린을 코딩하는 코돈을 프롤린을 코딩하는 코돈으로 대체하는 결과를 일으키는 것이다.
좋기로는 glcK 유전자에서의 돌연변이가 SEQ ID NO. 1의 위치 422에서 C를 T로 치환하는 결과를 일으키는 것이 바람직하다.
스트렙토코커스 써모필러스의 glcK 유전자가 glcK 유전자의 다른 부위에서의 다른 유형의 돌연변이에 의해 불활성화될 될 수도 있음이 강조된다.
바람직한 구체예에서 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 글루코스의 세포 내로의 수송을 감소시키는 돌연변이를 지닌다.
본 명세서에서 "글루코스의 세포 내로의 수송을 감소시키는 돌연변이"라는 표현은 세포의 주변환경에 글루코스를 축적시키는 결과를 야기하는, 글루코스의 수송과 관련된 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 가리키는 것이다. 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 배양 배지 중의 글루코스 수준은 당업자에게 잘 알려진 방법 및 배양 배지가 밀크 기질일 경우 본 명세서의 실시예 4에 설명된 바와 같은 방법에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
바람직한 구체예에서 돌연변이는 글루코스의 세포 내로의 수송을 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90% 감소시킨다.
글루코스의 세포 내로의 수송은 Cochu 등의 문헌 (2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432)에 설명된 글루코스 흡수 분석법에 의해 측정될 수 있다.
좋기로는, 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 글루코스 수송체 성분을 코딩하는 유전자가 돌연변이된 것이 바람직하며, 여기서 상기 돌연변이는 글루코스 수송 단백질을 불활성화시키거나, 상기 유전자의 발현에 네거티브한 효과를 미치는 것을 의미한다.
이러한 성분은 글루코스의 수송에 필수적인 글루코스 수송 단백질의 어떤 성분이든 무방하다. 예를 들어, 도 3에 도시된 스트렙토코커스 써모필러스 중의 글루코스/만노스 PTS의 어떤 성분이 불활성화될 경우 글루코스 수송체 기능의 불활성화가 야기될 것이다.
본 명세서에서 "돌연변이가 글루코스 수송체를 불활성화시키다"라는 표현은 "불활성화된 글루코스 수송체"를 야기하여, 세포내에 존재할 경우 그의 정상적인 기능을 발휘하지 못하는 글루코스 수성 단백질을 야기하는 돌연변이 뿐만 아니라, 글루코스 수송 단백질의 형성을 방지하거나, 글루코스 수송 단백질의 분해를 초래하는 돌연변이를 의미한다.
특히, 불활성화된 글루코스 수송 단백질은 기능성 글루코스 수송 단백질에 비해 세포질막을 통해 글루코스를 수송시키지 못하거나 현저히 느린 속도로 세포질막을 통해 글루코스를 수송시키는 단백질이다. 이러한 불활성화된 글루코스 수송 단백질을 코딩하는 유전자는 기능성 글루코스 수송 단백질을 코딩하는 유전자에 비해, 당해 유전자의 오픈 리딩 프레임 (ORF)에 돌연변이를 포함하는 것으로서, 여기서 상기 돌연변이는 결실, 프레임쉬프트 돌연변이, 종결코돈의 도입 또는 당해 단백질의 기능적 특성을 변화시키는 아미노산 치환을 야기하는 돌연변이, 또는 당해 유전자의 전사 또는 번역을 감소 또는 폐지하는 프로모터 돌연변이를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
바람직한 구체예에서 이 돌연변이는 글루코스 수송 단백질의 활성(글루코스의 수송 속도)을 적어도 50%, 예컨대 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 80%, 예컨대 적어도 90% 감소시킨다.
글루코스 수송체의 활성은 Cochu 등의 문헌 (2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432)에 설명된 바와 같이 글루코스 흡수 분석에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 "기능성 글루코스 수송 단백질"라는 용어는 세포 내에 존재할 경우, 세포질 막을 통한 글루코스의 수송을 가능케하는 글루코스 수송 단백질을 가리키는 것이다.
보다 바람직한 구체예에서 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 글루코스/만노스 포스포트랜스퍼라제 시스템의 IICMan 단백질을 코딩하는 manM 유전자의 DNA 서열에 돌연변이를 지니는 것이 바람직한데, 여기서 상기 돌연변이는 IICMan 단백질을 불활성화시키거나 상기 유전자의 발현에 네거티브한 영향을 미치는 것이다.
보다 바람직한 구체예에서 돌연변이는 글루코스/만노스 포스포트랜스퍼라제 시스템의 IICMan 단백질의 SEQ ID NO. 6의 위치 209에서 글루탐산을 코딩하는 코돈을 종결 코돈으로 치환하는 결과를 일으키는 것이다. 좋기로는 상기 돌연변이가 SEQ ID NO. 5의 위치 625에서 G를 T로 치환시키는 결과를 일으키는 것이 바람직하다.
본 발명의 제2 측면은 독일생물자원센터 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)에 수탁번호 DSM 25850으로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC15757 균주, 독일생물자원센터에 수탁번호 25851로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC15887 균주, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 26722으로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC16404 균주 및 그로부터 유도된 균주들로 이루어진 군으로부터 선택된 스트렙토코커스 써모필러스 균주에 관한 것이다.
본 발명의 문맥 상, "그로부터 유도된 균주들"이라는 표현은 예컨대 유전자 조작, 광조사 및/또는 화학적 처리와 같은 수단에 의해 본 발명의 균주 (또는 그들의 모균주)로부터 유도될 수 있는 균주 또는 유도된 균주들로서 이해되어야 한다. "그로부터 유도된 균주들"은 또한 자연발생적인 돌연변이주일 수도 있다. "그로부터 유도된 균주들"은 그들의 모균주와 기능적으로 동등한 돌연변이주, 예컨대 실제로 동일하거나 더 개선된 특성 (예컨대 글루코스 분비와 관련하여)을 갖는 돌연변이주인 것이 바람직하다. 이러한 "그로부터 유도된 균주들"은 본 발명의 일부를 구성한다. 특히, "그로부터 유도된 균주들"은 본 발명의 균주를, 에탄 메탄 설포네이트(EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(NTG)와 같은 화학적 돌연변이제, UV 광선 처리하여 수득된 균주 또는 자연발생적인 돌연변이주를 일컫는다. 돌연변이주는 여러 가지 돌연변이 처리 (한 가지, 즉 단일 처리는 하나의 돌연변이 단계 뒤에 스크리닝/선별 단계가 이어지는 것으로 이해되어야 함)될 수도 있지만, 현재로서는 20가지 이하, 또는 10가지 이하 또는 5 가지 이하의 처리(또는 스크리닝/선별 단계)인 것이 바람직하다. 현재 바람직한 돌연변이주에서는 모균주에 비해 박테리아 게놈의 뉴클레오타이드들의 1% 미만, 0.1% 미만, 0.01% 미만, 0.001% 미만 또는 심지어 0.0001% 미만이 다른 뉴클레오타이드에 의해 치환되거나, 결실되는 것이 좋다.
따라서, 바람직한 구체예에서 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 25850으로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC15757 균주, 독일생물자원센터에 수탁번호 25851로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC15887 균주, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 26722으로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC16404 균주 및 그로부터 유도된 균주들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 좋으며, 여기서 돌연변이 균주는 상기 기탁된 균주들 중 한가지를 출발물질로 사용함으로서 수득되며 여기서 돌연변이주는 상기 기탁된 균주들의 락토스 발효 특성 및/또는 글루코스 분비 특성을 그대로 보유하거나 또는 더 개선된 것이다.
락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스는 상업적인 밀크 발효에서 대개 혼합 스타터 배양체의 일부로서 흔히 사용되는 미생물이다.
락토스는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스에 의해 단당류인 글루코스, 프럭토스, 및 만노스보다 더 잘 발효되며 이 종의 균주들은 보통 갈락토스에서는 자라지 않는다(Buchanan R.E., Gibbons N.E., eds (1974): Bergey's manual of determinative bacteriology (The Williams & Wilkins Co. Baltimore, Md), 8th ed.). 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스에 의하여 락토스가 발효되는 동안, 락토스 분자의 글루코스 부분만이 발효되며 그에 따라 갈락토스는 발효유제품에 축적된다.
탄소원으로서 글루코스에서 생장하지 못하는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들을 수득하기 위해, 본 발명의 발명자들은 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들을 2-데옥시글루코스에 노출시켰다. 분리된 돌연변이주들은 2-데옥시글루코스에 대해 내성을 가졌으며 탄소원으로서 글루코스를 이용하지 않고도 밀크 기질에서 자랄 수 있었다. 이들 돌연변이주들은 밀크의 글루코스 함량을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 균주들을 사용하여 생산된 발효유제품들은 글루코스 함량이 높다는 특징을 가지며 이로 인해 제품이 더 단맛을 내게 된다.
놀랍게도, 본 발명의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들은 그 단독으로 비록 pH 5에 이르는 산성화 시간이 2-5 시간 느리기는 하지만 밀크를 완전히 산성화시킬 수 있다. 이에 더해, 실시예들에 입증되어 있는 바와 같이, 9.5% B-밀크에 본 발명에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 106-107 CFU/ml의 양으로 접종하여 본 발명에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들과 함께 40℃에서 적어도 20 시간 발효시킬 경우, 발효유 중에 이 균주들이 약 5 mg/ml 이상의 글루코스를 분비하는 한편 락토스는 약 10 mg/ml 미만의 양으로 발효유 중에 잔류하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 균주들을 발효유제품 생산에 사용하는 것은 락토스 불내성이 있는 사람들에게 중요할 수 있다.
결과적으로, 최종 발효유는 Godshall에 의해 설명된 바와 같이 계산할 경우 (1988. Food Technology 42(11):71-78), 약 2를 초과하는, 예컨대 2.5 이상 또는 예컨대 3 이상의 높은 내부 감미 지수를 갖는다.
본 발명의 제3 측면은 2-데옥시글루코스에 대해 내성을 갖는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주에 관한 것이다.
락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주와 관련하여 "2-데옥시글루코스에 내성인"이라는 표현은 특정한 박테리아 균주가 2% 락토스 및 20 mM 2-데옥시글루코스를 함유하는 MRS-IM 배지 플레이트 상에서 도말되어 40℃에서 20 시간 인큐베이션 후, 콜로니로 성장하라 수 있는 능력을 갖는 것으로 정의된다. 배양 배지 중에 2-데옥시글루코스가 존재하면 비내성 균주들의 성장은 방지하는 한편 내성 균주들의 성장은 영향을 받지 않거나, 영향을 받는다 해도 유의적이지 않을 수준이다. 내성 평가에서 민감성 레퍼런스 균주로서 사용될 수 있는 비내성(Non-resistant) 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들에는 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 26419로 기탁된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 CHCC759 및 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 19252로 기탁된 CHCC10019가 포함된다.
2% 락토스 및 이에 더해 20 mM 2-데옥시글루코스 플레이트를 함유하는 MRS-IM 한천 플레이트들에 콜로니들이 과성장할 경우, 플레이트 내의 2-데옥시글루코스의 농도를 예컨대 30 mM 이상 또는 심지어 40 mM 이상으로 증가시키는 것이 적절하다. 콜로니들이 전혀 관찰되지 않을 경우에는, 플레이트 중의 2-데옥시글루코스의 농도를 예컨대 15 mM로 또는 10 mM로 또는 그보다 더 낮은 농도로 감소시키는 것이 적당하다. 필요하다면, 적절한 이화학적 돌연변이 프로토콜을 이용함으로써 돌연변이 속도를 증가시킬 수 있다.
좋기로는, 본 발명의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주는 9.5% B-밀크에 106 내지 107 CFU/ml의 농도로 접종되어 40℃에서 적어도 20시간, 예컨대 20 내지 30 시간, 예컨대 20 시간 동안 생육될 경우, 9.5% B-밀크 내의 글루코스의 양을 적어도 5 mg/ml로 증가시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 보다 바람직한 구체예에서 돌연변이 균주는 글루코스의 양을 적어도 6 mg/mL, 예컨대 적어도 7 mg/mL, 예컨대 적어도 8 mg/mL, 예컨대 적어도 9 mg/ml, 예컨대 적어도 10 mg/ml, 예컨대 적어도 11 mg/ml, 예컨대 적어도 12 mg/ml, 예컨대 적어도 13 mg/ml, 예컨대 적어도 14 mg/ml, 예컨대 적어도 15 mg/ml로 증가시키는 것이 좋다.
본 발명의 제4 측면은 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM26420으로 기탁된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 CHCC16159, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM26421로 기탁된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 CHCC16160,및 그로부터 유도된 균주들로 이루어진 군으로부터 선택된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주에 관한 것이다.
"그로부터 유도된 균주들"이라는 용어는 상기 정의한 바와 같은 의미로 이해되어야 한다.
따라서, 바람직한 구체예에서 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주는 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM26420으로 기탁된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 CHCC16159, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM26421로 기탁된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 CHCC16160 및 그로부터 유도된 돌연변이 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주로서, 여기서 상기 돌연변이 균주는 출발물질로서 기탁된 균주들 중 한가지를 이용하여 수득되며, 여기서 상기 돌연변이주는 상기 기탁된 균주의 락토스 발효 특성 및/또는 글루코스 분비 특성을 그대로 보유하거나 또는 더 상승된 상태로 갖는 것이다.
본 발명의 제5 측면은 본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 104 내지 1012 CFU (콜로니 형성 단위)/g, 예컨대 105 내지 1011 CFU/g, 예컨대 106 내지 1010 CFU/g, 또는 예컨대 107 내지 109 CFU/g의 양으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주는, 산성화를, 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 접종하여 40℃에서 14 시간 인큐베이션한 경우 pH가 1.0 미만으로 감소되는 것으로 정의할 경우, 9.5% B-밀크를 산성화시키지 못하는 것이며, 상기 조성물은 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 접종하여 14 시간 동안 40℃에서 인큐베이션시킬 경우 pH의 1.0 이상의 감소를 결과시키는 것으로 정의된 산성화를, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 26722로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC16404에 의해 9.5% B-밀크의 산성화를 유발할 수 있는 양의 화합물을 더 포함하는 것이다.
좋기로는 상기 화합물이 수크로스인 것이 바람직하다.
좋기로는, 수크로스의 양은 0.000001% 내지 2%, 예컨대 0.00001% 내지 0.2%, 예컨대 0.0001% 내지 0.1%, 예컨대 0.001% 내지 0.05%인 것이 바람직하다.
특히 바람직한 구체예에서 조성물은 추가로 본 발명에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 104 내지 1012 CFU/g, 예컨대 105 내지 1011 CFU/g, 예컨대 106 내지 1010 CFU/g, 또는 예컨대 107 내지 109 CFU/g의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 더 포함하는 것이 좋다.
본 발명의 바람직한 조성물은 예컨대 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 CHCC16159 및/또는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 CHCC16160를 스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC15757와 조합하여 포함한다. 더욱 바람직한 조성물은 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 CHCC16159 및/또는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC16160를 스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC15887와 조합하여 포함한다. 더더욱 바람직한 조성물은 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 CHCC16159 및/또는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC16160를 스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC16404와 조합하여 포함한다.
락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 , 스트렙토코커스 써모필러스 및 기타 유산균은 낙농업 예컨대 발효유제품과 같은 다양한 식품 생산시 기술적 목적을 뒷받침하는 스타터 배양체로서 흔히 사용된다. 따라서, 또 다른 바람직한 구체예에서 이 조성물은 스타터 배양체로서 적합하다.
스타터 배양체는 액상 스타터 배양체에 더해 동결되거나 건조된 스타터 배양체로서 제공될 수 있다. 따라서, 또 다른 바람직한 구체예에서 조성물은 동결, 동결-건조 형태 또는 액상 형태일 수 있다.
WO 2005/003327에 개시된 바와 같이, 스타터 배양체에 어떤 부동제(cryoprotective agents)를 첨가하는 것이 유리하다. 따라서, 본 발명에 따른 스타터 배양체 조성물은 이노신-5'-모노포스페이트 (IMP), 아데노신-5'-모노포스페이트 (AMP), 구아노신-5'-모노포스페이트 (GMP), 우라노신-5'-모노포스페이트 (UMP), 시티딘-5'-모노포스페이트 (CMP), 아데닌, 구아닌, 우라실, 시토신, 아데노신, 구아노신, 우리딘, 시티딘, 하이포잔틴, 잔틴, 하이포잔틴, 오로티딘, 티미딘, 이노신 및 이들 화합물들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 부동제(들)을 포함할 수 있다.
본 발명의 제6 측면은 밀크 기질에 본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 적어도 1종의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 접종하여 발효시키는 것을 포함하는, 발효유제품의 제조 방법에 관한 것이다.
"밀크(milk)"라는 용어는 예컨대 소, 양, 염소, 버팔로 또는 낙타와 같은 포유동물로부터 젖을 짜냄으로써 얻어지는 젖 분비물로서 이해하여야 한다. 바람직한 구체예에서, 밀크는 우유인 것이 좋다.
"밀크 기질(milk substrate)"이라는 용어는 본 발명의 방법에 따라 발효 처리될 수 있는 원료 밀크 및/또는 가공된 밀크 재료일 수 있다. 따라서, 유용한 밀크 기질의 비제한적인 예로는 단백질, 예컨대 전유 또는 저지방유, 탈지유, 버터유, 재조성된 분유, 농축유, 건조유, 유청, 유청 삼출물, 락토스, 락토스의 결정화로부터 수득되는 모액, 유청 단백질 농축물 또는 크림을 포함하는 여하한 밀크 또는 밀쿠 유사 제품의 용액/현탁액을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 밀크 기질은 포유동물로부터 기원할 수 있으며, 예컨대 실제로 순수한 포유동물의 밀크이거나 또는 재조성된 밀크 분말일 수 있다.
좋기로는, 밀크 기질 중 단백질의 적어도 일부는 카제인 또는 유청 단백질과 같이, 밀크에서 자연발생되는 단백질이다. 그러나, 단백질의 일부는 밀크에서 자연발생되지 않는 단백질일 수도 있다.
발효에 앞서, 밀크 기질은 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 균질화 및 파스퇴르살균 처리될 수도 있다.
본 명세서에서 "균질화(homogenizing)"라 함은 가용성 현탁액 또는 에멀젼을 얻기 위해 격렬히 혼합하는 것을 의미한다. 만일 발혀에 앞서 균질화가 수행되면, 이것은 유지방을 보다 작은 크기로 분해하여 밀크로부터 더 이상 분리되지 않도록 하기 위함이다. 이것은 밀크를 작은 오리피스를 통해 고압으로 통과시킴으로써 달성될 수 있다.
본 명세서에서 "파스퇴르 살균처리(pasteurizing)"라 함은 미생물과 같은 살아있는 생물의 존재를 감소 또는 제거하기 위해 밀크 기질을 처리하는 것을 의미한다. 좋기로는 파스퇴르화는 특정 온도를 특정 기간 동안 dbwlgkadmfhTJ 달성된다. 특정 온도는 대개 가열에 의해 달성된다. 이에 사용되는 온도 및 기간은 유해한 박테리아와 같은 특정 박테리아를 사멸시키거나 불활성화시키기 위해 선택될 수 있다. 급속 냉각 단계가 이어질 수 있다.
본 발명의 방법에서 "발효"는 미생물의 작용을 통해 탄수화물을 알코올이나 산으로 전환시키는 것을 의미한다. 좋기로는 본 발명의 방법에서 발효는 락토스를 젖산으로 전환시키는 것을 포함한다.
발ㅎ유제품 생산시 사용될 발효 공정은 잘 알려져 있으며 당업자라면 온도, 산소, 미생물(들)의 양과 특징화 및 공정 시간과 같은 적당한 공정 조건을 어떻게 선택하여야 할지 잘 알 것이다. 당연히, 발효 조건은 본 발명을 달성하기 위해, 즉, 고체 또는 액체 상태(발효유제품)로 유제품을 얻도록 선택된다.
본 명세서에서 "발효유제품(fermented milk product)"이라는 용어는 식품 또는 식제품이 유산균에 의한 밀크 기질의 발효와 연관된 식품 또는 식제품을 가리킨다. 본 발명에서 "발효유제품"에는 요구르트, 치즈, 사우어크림 및 버터유 그리고 발효된 유청이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
바람직한 구체예에서 접종되는 스트렙토코커스 써모필러스 세포의 농도는 밀크 기질 1 ml 당 104 내지 10109 CFU 스트렙토코커스 써모필러스 세포, 예컨대 밀크 기질 1 ml 당 104 CFU 내지 108 CFU 스트렙토코커스 써모필러스 세포이다.
또 다른 바람직한 구체예에서 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 산성화를, 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 접종하여 40℃에서 14 시간 인큐베이션한 경우 pH가 1.0 미만으로 감소되는 것으로 정의할 경우, 9.5% B-밀크를 산성화시키지 못하며, 밀크 기질에는, 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 접종하여 14 시간 동안 40℃에서 인큐베이션시킬 경우 pH의 1.0 이상의 감소를 결과시키는 것으로 정의된 산성화를, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 26722로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC16404에 의해 9.5% B-밀크의 산성화를 유발할 수 있는데 효과적인 양의 화합물이 포함된다.
좋기로는 상기 화합물은 수크로스이다.
좋기로는, 수크로스의 양은 0.000001% 내지 2%, 예컨대 0.00001% 내지 0.2%, 예컨대 0.0001% 내지 0.1%, 예컨대 0.001% 내지 0.05%이다.
본 발명의 제7 측면은 본 발명의 제3 또는 제4 측면에 따른 적어도 1종의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 접종하여 발효시키는 것을 포함하는, 발효유제품의 제조 방법에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 세포의 접종 농도는 밀크 기질 1 ml 당 104 내지 10109 CFU 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 세포, 예컨대 밀크 기질 1 ml 당 104 CFU 내지 108 CFU 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 세포이다.
바람직한 구체예에서 발효유제품의 제조 방법은 본 발명에 따른 적어도 1종의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 본 발명에 따른 적어도 1종의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 밀크 기질에 접종하여 발효시키는 것을 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서 발효유제품은 요구르트 또는 치즈이다.
스트렙토코커스 써모필러스 및 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스에 의해 발효됨으로써 제조되는 치즈의 예로는 모짜렐라 치즈와 피자 치즈를 들 수 있다(Hoeier 외 (2010), The Technology of Cheesemaking, 2nd Ed. Blackwll Publishing, Oxford; 166-192).
바람직한 발효유제품은 요구르트이다.
본 발명의 문맥상 요구르트 스타터 배양체는 적어도 1종의 락토바실러스 델브루에키 subsp 불가리쿠스 균주 및 적어도 1종의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 포함하는 박테리아 배양체이다. 본 발명에서, "요구르트"라 함은 락토바실러스 델브루에키 subsp 불가리쿠스 균주 및 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 포함하는 조성물을 밀크에 접종하여 밀크를 발효시킴으로써 수득되는 발효유제품을 가리킨다.
본 발명의 제8 측면은 본 발명의 제6 또는 제7 측면에 따른 방법에 의해 수득가능한 발효유제품에 관한 것이다.
본 발명의 제9 측면은 본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 적어도 1종 포함하는 발효유제품에 관한 것이다.
본 발명의 제10 측면은 본 발명의 제3 또는 제4 측면에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 적어도 1종 포함하는 발효유제품에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서 발효유제품은 본 발명에 따른 적어도 1종의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 본 발명에 따른 적어도 1종의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서 발효유제품은 발효유제품은 요구르트 또는 치즈이다. 좋기로는 발효유제품은 요구르트이다.
본 발명의 제11 측면은 발효유제품의 제조를 위한 본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제12 측면은 발효유제품의 제조를 위한 본 발명의 제3 또는 제4 측면에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제13 측면은 발효유제품의 제조를 위한, 본 발명에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 본 발명에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제14 측면은 발효유제품의 감미를 증가시키기 위한 본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제15 측면은 발효유제품의 감미를 증가시키기 위한 본 발명의 제3 또는 제4 측면에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제16 측면은 발효유제품의 감미를 증가시키기 위한 본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 본 발명의 제3 또는 제4 측면에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 용도에 관한 것이다.
특히 소비자군으로서의 어린이들은 단맛이 나는 식품을 선호하는데 본 발명의 스트렙토코커스 써모필러스 균주와 본 발명의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주는 어린이용 발효유제품의 감미를 증가시키는데 특히 유용할 수 있다.
본 발명의 제17 측면은 칼로리 섭취를 감소시키기 위한 본 발명의 발효유제품의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 발효유제품은 과체중이나 비만으로 고통받는 사람들의 다이어트에 특히 유용할 것으로 생각된다.
따라서, 바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 발효유제품은 과체중이나 비만으로 고통받는 사람들의 칼로리 섭취를 감소시키는데 사용된다.
과체중과 비만은 세계보건기구(WHO)가 건강을 위협하는 비정상적이거나 과다한 지방 축적으로 정의내린 의학적 병태이다. 성인에 있어서 과체중과 비만을 분류하는 대략적인 가이드로서 체질량 지수(Body Mass Index: BMI)가 이용될 수 있는데 해당 남성/여성의 킬로그램 단위의 체중을 키의 제곱으로 나눈 값이다 (kg/m2).
WHO 정의에 의하면 BMI가 25 이상이면 과체중이고 BMI가 30 이상이면 비만이다.
본 발명의 제18 측면은 발효유제품 중 락토스 함량을 감소시키기 위한 본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제19 측면은 발효유제품 중 락토스 함량을 감소시키기 위한 본 발명의 제3 또는 제4 측면에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제20 측면은 발효유제품 중 락토스 함량을 감소시키기 위한 본 발명의 제1 또는 제2 측면에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 본 발명의 제3 또는 제4 측면에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제21 측면은 락토스 불내성 증상을 회피하기 위한 본 발명에 따른 발효유제품의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제22 측면은 본 발명의 조성물의 의약으로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 제23 측면은 비피도박테리움 균주의 성장을 향상시키기 위한 본 발명에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 용도에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서 비피도박테리움 균주는 비피도박테리움 롱엄 , 비피도박테리움 비피둠 , 비피도박테리움 락티스 , 비피도박테리움 브레비스 , 비피도박테리움 아니말리스 , 비피도박테리움 아돌레센티스 및 비피도박테리움 인판티스로 이루어진 군으로부터 선택되는 종, 예컨대 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 15954로 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB-12
Figure pct00002
균주, 수탁번호 DSM 15954로 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 균주, 수탁번호 DSM 15953로 기탁된 비피도박테리움 롱엄 아종 인판티스 균주 수탁번호 DSM 15955로 기탁된 비피도박테리움 롱엄 아종 롱엄 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 종에 속한 것이 바람직하다.
가장 바람직한 비피도박테리움 균주는 DSMZ에 수탁번호 DSM 15954로 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB-12
Figure pct00003
이다.
본 발명의 제24 측면은 비피도박테리움 균주의 성장을 향상시키기 위한 본 발명에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 용도에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서 비피도박테리움 균주는 비피도박테리움 롱엄 , 비피도박테리움 비피둠 , 비피도박테리움 락티스 , 비피도박테리움 브레비스 , 비피도박테리움 아니말리스 , 비피도박테리움 아돌레센티스 및 비피도박테리움 인판티스로 이루어진 군으로부터 선택되는 종, 예컨대 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 15954로 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB-12
Figure pct00004
균주, 수탁번호 DSM 15954로 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 균주, 수탁번호 DSM 15953로 기탁된 비피도박테리움 롱엄 아종 인판티스 균주 수탁번호 DSM 15955로 기탁된 비피도박테리움 롱엄 아종 롱엄 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 종에 속한 것이 바람직하다. 가장 바람직한 비피도박테리움 균주는 DSMZ에 수탁번호 DSM 15954로 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB-12
Figure pct00005
이다.
본 발명의 제25 측면은 DSMZ에 수탁번호 DSM 15954로 기탁된 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB-12
Figure pct00006
의 성장을 향상시키기 위한 본 발명에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 본 발명에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 용도에 관한 것이다.
글루코키나제 (glcK) 유전자에 돌연변이를 갖는 박테리아의 선별을 위해 2-데옥시글루코스 및 이 박테리아의 M17 배지 + 2% 글루코스에서의 성장 패턴과 M17 배지 + 2% 갈락토스에서의 성장 패턴을 비교 측정하는 것을 이용하였다.
본 발명의 제26 측면에 따라 glcK 유전자가 돌연변이된 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 스크리닝 및 분리 방법이 제공된다. 이 방법은 다음 단계들, 즉:
a) 갈락토스-발효 스트렙토코커스 써모필러스 모균주를 제공하는 단계;
b) 상기 모균주로부터 유도된 돌연변이 스트렙토코커스 써모필러스 균주들의 풀(pool)로부터 2-데옥시글루코스에 내성인 돌연변이 스트렙토코커스 써모필러스 균주들의 풀을 선별 및 분리하는 단계; 및
c) 2-데옥시글루코스에 내성인 돌연변이 스트렙토코커스 써모필러스 균주들의 풀로부터, 만일 M17 배지 + 2% 글루코스에서보다 M17 배지 + 2% 갈락토스에서 돌연변이 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 성장속도가 더 높을 경우 그 돌연변이 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선별 및 분리하는 단계
를 포함한다.
본 명세서에서 "2-데옥시글루코스에 내성이다"라는 표현은 돌연변이된 어떤 박테리아 균주가 2% 락토스 또는 2% 갈락토스를 함유하고 20 mM 2-데옥시글루코스를 함유하는 M17 배지 플레이트 상에 도말되어 40℃에서 20 시간 인큐베이션될 경우 콜로니로 성장하는 능력이 있음을 의미하는 것이다. 배양 배지 중에 2-데옥시글루코스가 존재할 경우 돌연변이되지 않은 균주의 성장은 방지되는 반면 돌연변이된 균주의 성장은 그에 영향받지 않거나 영향을 받는다 해도 유의적이지 않을 정도이다. 내성 평가에 있어서 감수성 레퍼런스 균주로서 사용될 수 있는 비돌연변이 균주들에는 CHCC14994 및 CHCC11976 균주가 포함된다.
본 명세서의 실시예 1 및 2에는 2-데옥시글루코스에 내성인 스트렙토코커스 써모필러스의 돌연변이 균주들의 분리가 예시되어 있다.
바람직한 구체예에서 상기 방법은 단계 a1)으로서 모균주를 예컨대 화학적 및/또는 물리적 돌연변이제(mutagen)으로 처리하는 것과 같이 모균주를 돌연변이 처리하는 단계를 더 포함한다.
또 다른 바람직한 구체예에서 상기 방법은 단계 d)로서, 단계 c)에서 선택된 스트렙토코커스 써모필러스 균주로부터 유도된, 2-데옥시글루코스 내성 스트렙토코커스 써모필러스 균주들의 풀로부터, 만일 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 M17 배지 + 2% 수크로스에서의 성장 속도가 높지만 M17 배지 + 2% 글루코스에서의 모균주의 성장 속도에 비해 제로이거나 적어도 0-50% 감소된 경우 그 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선별 및 분리하는 단계를 더 포함한다.
갈락토스-발효 스트렙토코커스 써모필러스 모균주들은 M17 배지 + 2% 갈락토스에서 성장할 수 있으면서, 1% 농도로 오버나잇 배양체로부터 접종되어 37℃에서 24 시간 인큐베이션될 경우 2% 갈락토스를 유일한 탄수화물로서 함유하는 M17 브로쓰의 pH를 5.5 이하로 저하시키는 능력을 갖는 것으로 정의된다. 이러한 갈락토스-포지티브 균주들은 종래기술에 설명되어 있으며 WO2011/026863 (Chr. Hansen A/S)에는 이러한 균주들을 수득하는 방법이 설명되어 있다.
특히 바람직한 구체예에서 모균주는 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 25838로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC14994 균주, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 22934로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC11976 균주 및 그로부터 유도된 균주들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 좋다.
본 발명의 문맥 상, "그로부터 유도된 균주들"이라는 표현은 예컨대 유전자 조작, 광조사 및/또는 화학적 처리 등의 수단에 의해 스트렙토코커스 써모필러스 모균주를 갈락토스-발효시킴으로써 유도되거나 유도될 수 있는 균주들인 것으로 이해되어야 한다. "그로부터 유도된 균주들"은 또한 자연발생적인 돌연변이주들일 수도 있다. "그로부터 유도된 균주들"은 그들의 모균주와 실제로 동일하거나 향상된 특성 (예컨대 갈락토스 발효능과 관련하여)을 갖는 돌연변이주들처럼, 기능적으로 균등한 돌연변이주인 것이 바람직하다. 이러한 "그로부터 유도된 균주들"은 본 발명의 일부이다. 특히, "그로부터 유도된 균주들"이라는 용어는 본 발명의 균주를, 예컨대 에탄 메탄 설포네이트(EMS) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(NTG)과 같은 화학적 돌연변이제로 처리하거나 UV 광선 처리하는 것을 비롯한 통상적인 돌연변이 처리에 의해 얻어진 균주 또는 자연발생적인 돌연변이에 의해 얻어진 균주를 가리킨다. 돌연변이주는 여러가지 돌연변이 처리를 거친 것일 수 있지만 (단일 처리는 하나의 돌연변이화 단계 후에 스크리닝/선별 단계가 이어지는 것으로 이해되어야 한다), 돌연변이 처리는 20가지 이하의 처리, 또는 10가지 이하의 처리 또는 5가지 이하의 처리 (또는 스크리닝/선별 단계)로 수행하는 것이 바람직하다. 바람직한 돌연변이주는 모균주에 비해, 박테리아 게놈의 뉴클레오타이드의 1% 미만, 0.1% 미만, 0.01% 미만, 0.001% 미만 또는 심지어 0.0001% 미만이 다른 뉴클레오타이드로 치환되거나, 결실된 것이다.
본 발명의 제27 측면은 제27 측면에 따른 방법에 의해 수득가능한 스트렙토코커스 써모필러스 돌연변이 균주에 관한 것이다.
본 발명의 제28 측면에서는 글루코스 대사가 손상된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 균주들을 스크리닝 및 분리하기 위한 방법이 제공된다. 이 방법은 다음 단계들, 즉:
a) 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 모균주를 제공하는 단계;
b) 상기 모균주로부터 유도된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 돌연변이 균주들의 풀로부터 2-데옥시글루코스에 내성인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들의 풀을 선별 및 분리하는 단계; 및
c) 2-데옥시글루코스에 내성인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들의 풀로부터, 만일 어떤 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주가 MRS-IM 배지 + 2% 글루코스에서보다 MRS-IM 배지 + 2% 락토스에서 성장 속도가 더 높을 경우 그 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 선별 및 분리하는 단계
를 포함한다.
2-데옥시글루코스에 내성인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들의 돌연변이 균주들의 분리는 실시예에 자세히 설명되어 있다. 실시예 5의 2-데옥시글루코스 내성 선별 분석에 기초해서, 당업자는 관심 대상인 특정 균주 (예컨대 대상 상업제품으로부터의 균주)에 대해 이 관심 대상인 특정 균주가 2-데옥시글루코스에 내성을 갖는지를 통상적으로 시험해볼 수 있다. 실시예 6의 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이 성장 패턴에 기초해서, 당업자는 관심 대상인 특정 균주 (예컨대 대상 상업제품으로부터의 균주)에 대해 이 관심 대상인 특정 균주가, 선별된 돌연변이주의 특성인 해당 성장 패턴을 갖는지를 통상적으로 시험해볼 수 있다.
바람직한 구체예에서 상기 방법은 단계 a1)으로서, 모균주를 화학적 및/또는 물리적 처리하는 것과 같이 모균주를 돌연변이 처리하는 단계를 더 포함한다.
락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 모균주들은 MRS-IM 배지 + 2% 락토스에서 성장할 수 있으며, 이들은 오버나잇 배양체로부터 1% 농도로 접종되어 37℃에서 24 시간 인큐베이션될 경우, 2% 락토스를 유일한 탄수화물로서 함유하는 MRS-IM 브로스의 pH를 5.5 이하로 저하시킬 수 있는 능력을 갖는 것들로 정의된다.
특히 바람직한 구체예에서 모균주는 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 26419으로 기탁된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC759 균주, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 19252로 기탁된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC10019 균주로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제29 측면은 제28 측면에 따른 방법에 의해 수득가능한 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 제공한다.
이하에 비제한적인 실시예로서 본 발명의 구체예들을 설명한다.
실시예
재료 및 방법
배지:
스트렙토코커스 써모필러스의 경우, 사용된 배지는 당업자에게 공지인 M17 배지이다. H2O 1 리터 당 다음의 조성을 갖는다:
한천, 12.75 g
아스코르브산, 0.5 g
카제인 펩톤(tryptic), 2.5 g
디소듐 β-글리세로포스페이트 오수화물, 19 g
마그네슘 설페이트 수화물, 0.25 g
고기 추출물, 5 g
고기 펩톤(peptic), 2.5 g
대두 펩톤(papainic), 5 g
효모 추출물, 2.5 g
최종 pH 7.1±0.2 (25℃)
또한 M17 브로쓰는 H2O 1 리터 당 다음의 조성을 갖는다:
아스코르브산, 0.5 g
마그네슘 설페이트, 0.25 g
고기 추출물, 5 g
고기 펩톤 (peptic), 2.5 g
소듐 글리세로포스페이트, 19 g
대두 펩톤 (papainic), 5 g
트립톤, 2.5 g
효모 추출물, 2.5 g
최종 pH 7.0±0.2 (25℃)
첨가된 탄소원은 멸균 락토스 20 g/l, 글루코스 20 g/l 또는 갈락토스 20 g/l이다.
당업자에게 알려진 바와 같이, M17 배지는 스트렙토코커스 써모필러스의 성장에 적합한 것으로 여겨지는 배지이다. 또한, 당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명의 문맥 상, M17 농축물은 여러 공급자로부터, 그리고 특정 공급자와 무관하게 제공될 수 있으며 (표준 측정 오차 내에서), 관심 대상인 세포에 대해 동일한 2-데옥시글루코스 내성 결과를 얻을 것이다.
락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스를 배양하는데 사용된 배지는 MRS-IM 배지였다. MRS-IM은 한천 플레이트 또는 브로쓰로서 사용되었다.
MRS-IM 한천 배지는 H2O 1 리터 당 다음의 조성을 갖는다:
트립톤 Oxoid L 42 10.0 g
효모 추출물 Oxoid L 21 5.0 g
Tween 80 Merck nr 8.22187 1.0 g
K2HPO4 Merck nr 105104 2.6 g
Na-아세테이트 Merck nr 106267 5.0 g
디암모늄-히드로겐-시트레이트 Merck nr 101154 2.0 g
MgSO4, 7 H2O Merck nr 105882 0.2 g
MnSO4, H2O Merck nr 105941 0.05 g
한천 SO-BI-GEL 13.0 g
pH는 오토클라브 처리 후 25℃에서 6.9±0.1로 조정되었다.
하기 실시예 들에서 액체 배지에 사용된 MRS-IM 브로쓰는 H20 1 리터 당 다음의 조성을 갖는다:
트립톤 Oxoid L 42 10.0 g
효모 추출물 Oxoid L 21 5.0 g
Tween 80 Merck nr 8.22187 1.0 g
K2HPO4 Merck nr 105104 2.6 g
Na-아세테이트 Merck nr 106267 5.0 g
디암모늄-히드로겐-시트레이트 Merck nr 101154 2.0 g
MgSO4, 7 H2O Merck nr 105882 0.2 g
MnSO4, H2O Merck nr 105941 0.05 g
pH는 오토클라브 처리 후 25℃에서 6.9±0.1로 조정되었다. 탄소원, 락토스 20g/l 또는 글루코스 20g/l를 먼저 살균 여과한 다음 오토클라브 브로쓰에 첨가하였다.
전술한 MRS-IM 배지는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 성장을 뒷받침하는 배지의 능력에 영향을 미침이 없이 어느 정도 변형시킬 수 있다. 또한, 당업자라면 잘 이해하는 바와 같이, MRS-IM 농축물 또는 전술한 다양한 성분들을 다양한 공급자로부터 수득하여 MRS-IM 배지를 만드는데 이용할 수 있다. 이 배지들역시 마찬가지로 하기 실시예에서, 특히 2-데옥시글루코스 내성 선별 분석에 이용될 것이다.
모균주들 ( Mother strains )
스트렙토코커스 써모필러스 CHCC11976 (WO 2011/026863에 설명된 바와 같이 엑소폴리사카라이드를 생산하고 GalK 유전자가 돌연변이된 갈락토스-발효 균주).
스트렙토코커스 써모필러스 CHCC14994 (갈락토스-발효 균주).
락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC759.
락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC10019.
2- 데옥시 - 글루코스 내성 균주들
스트렙토코커스 써모필러스 CHCC15757 (CHCC14994의 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이주).
스트렙토코커스 써모필러스 CHCC15887 (CHCC11976의 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이주).
스트렙토코커스 써모필러스 CHCC16404 (CHCC15757의 하이퍼-락토스 발효 및글루코스 분비 돌연변이주).
락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC16159 (CHCC759의 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이주).
락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC16160 (CHCC10019의 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이주).
실시예 1: 글루코스 분비가 증가된 스트렙토코커스 써모필러스의 글루코스 키나제 돌연변이주를 분리하기 위한 2- 데옥시글루코스 의 사용
스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC11976의 돌연변이주와 스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC14994의 돌연변이주를 분리하기 위해, 2% 락토스를 함유하는 M17 브로쓰 10 ml에 단일 콜로니 성장물로부터 유도된 세포들을 접종하여 40℃에서 밤새 배양하였다.
다음 날, 2% 갈락토스, 그리고 2-데옥시글루코스 농도를 20 mM(CHCC14994) 또는 30 mM (CHCC11976)로 함유하는 M17 한천 플레이트 상에서 상기 균주들을 계대 희석, 도말하여 40℃에서 20 시간 인큐베이션시켰다. 내성 콜로니들을 먼저 이들이 선별되었던 것과 동일한 유형의 한천 플레이트 상에 재스트리킹하였다. 생존 개체들을 이용하여 2% 락토스, 2% 갈락토스 또는 2% 글루코스를 함유하는 신선한 M17 브로쓰에 접종하고 성장을 측정하였다.
이로부터, 글루코스에서보다 갈락토스에서 더 빨리 성장할 수 있는 몇몇 돌연변이주들이 실시예 2에 개략된 바와 같이 동정되었다. 이들 2가지 돌연변이주들은 각각 CHCC14994 및 CHCC11976로부터 유도된 CHCC15757 및 CHCC15887이었다.
실시예 2: 2- 데옥시글루코스 내성 돌연변이주의 성장 패턴
갈락토스 상에서 성장할 수 있는 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이주들을 선별하기 위해, 갈락토스-발효 균주 컬렉션으로부터 선별된 2 균주들을 이용하였다. 이들 갈락토스-발효 균주들은 M17 브로쓰 + 2% 갈락토스 보다 M17 브로쓰 + 2% 글루코스에서 적어도 10% 더 빨리 대수상에서 성장하는 반면, CHCC15757 및 CHCC15887와 같은 CHCC11976 및 CHCC14994의 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이주들은 M17 브로쓰 + 2% 글루코스에서보다 M17 브로쓰 + 2% 갈락토스에서 대수상에서 더 빨리 성장한다는 특징을 갖는다.
대수상에서의 성장은 본 발명에서, 40℃에서 경시적으로, 600 나노미터에서 대수 성장하는 배양체의 광학 밀도(OD600)의 디벨롭먼트로서 측정한다.
당업자에게 알려진 바와 같이, 배양체의 대수성장기에는 종 간에 차이가 있을 수 있다. 당업자라면 예컨대 OD600 0.1-1.0에서와 같이 대수기에서의 성장을 어떻게 측정하는지 알 것이다.
배양체의 광학 밀도(OD)는 분광광도계로 측정한다.
결론:
이 실시예 2의 2- 데옥시글루코스 내성 돌연변이주 성장 패턴에 기초해서 - 목적하는 특정 균주에 있어서 (예컨대 당해 시판 제품으로부터 것) - 당업자라면 이 목적하는 특정 균주가 선별된 돌연변이주의 특성에 해당하는 성장 패턴을 갖는지를 일상적으로 검사할 수 있다.
실시예 3: 글루코스 키나제를 코딩하는 유전자의 돌연변이 분석법.
글루코스 키나제를 코딩하는 유전자의 돌연변이 분석을 실시하기 위해 실시예 1에서 동정된 돌연변이주들로부터 총 DNA를 분리하였다. 이 글루코스 키나제 유전자의 시퀀싱 결과 CHCC15757의 유전자는 쓰레오닌 코돈 대신 이소류신을 생성하는 코돈 141에서 비보존적 돌연변이를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 돌연변이주 CHCC15887로부터의 유전자의 시퀀싱 결과 코돈 72의 돌연변이의 존재로 인해 세린이 프롤린으로 비보존적 아미노산 변화가 초래된 것으로 나타났다 (도 2).
실시예 1 및 2에 특정된 조건 하에 따라 그리고 실시예 1에 설명된 바와 같이 분리된 2-데옥시글루코스 내성 균주들은 글루코스 키나제를 코딩하는 유전자 (glcK)가 돌연변이되었다는 특징을 갖는다. 이 돌연변이는 코딩된 효소의 아미노산 변화를 일으키거나 종결코돈을 생성시킴으로 해서 코딩된 효소를 트렁케이트시키게 된다.
glcK 유전자에서의 돌연변이를 밝혀내기 위해, 2% 락토스가 첨가된 액체 브로써(M17)에서 목적하는 특정 균주를 40℃에서 밤새 배양하였다. 염색체 DNA를 분리한 후, 이 DNA를 글루코스 키나제를 코딩하는 유전자의 바로 상류와 바로 하류의 보존된 영역에 상보적인 2개의 프라이머를 이용하여 PCR 분석하였다. 이들 프라이머의 서열을 다음과 같다:
GK1F: 5' CTT GGG TAA AAG GCT CTA TG 3' (SEQ ID NO. 3)
GK1R: 5' CGT TTT TCA ACA AAA AAG TGC TACC 3' (SEQ ID NO. 4)
PCR 반응의 조건은 PCR 증폭 키트(ROCHE) 제조업체에 의해 특정된 바와 같으며, 예컨대 다음과 같다;
2 μl 염색체 DNA
1 μl 프라이머 GK1F
1 μl 프라이머 GK1R
25 μl 마스터 믹스
21 μl H2O
PCR-프로그램: (94℃ - 1.5분, 50℃ - 1분, 72℃ - 1.5분) x 30
PCR 증폭에 의해 1168 bp 단편이 생성된다. Biorad사로부터의 PCR 정제 키트를 이용하여 정제 후, 상기 PCR 단편을 증폭에 사용된 것과 동일한 2개의 프라이머를 이용하여 Macrogen사에 DNA 시퀀싱을 의뢰하였다.
시퀀싱 후, DNA 서열을 모균주의 그것과 비교하였다.
실시예 4. 발효유의 탄수화물 분석
또 다른 실험에서, 당해 슈가의 슈가 농도를 CHCC14994, CHCC11976, CHCC15757 및 CHCC15887로 각각 발효시킨 밀크 중에서 측정하였다. 2% 갈락토스가 첨가된 M17 브로쓰에서 밤새 배양한 배양체 1% (106-107 CFU/ml)를 9.5% B-밀크에 접종하였다. 이 산성화 후 INTAB PC 로거(logger) 및 Easyview 소프트웨어 처리하였다. 40℃에서 30시간 동안 산성화시킨 후 HPLC 분석하여 해당 슈가 및 산의 함량을 구하였다. 산성화도 곡선은 이들 돌연변이주들이 비록 산성화 개시는 늦지만 유사한 종말 pH에서 종결됨을 보여준다. HPLC 데이터를 표 1에 나타내었다.
표 1로부터 이들 2가지 glcK 돌연변이 균주들인 CHCC15757 및 CHCC15887이 락토스 적어도 71% 소비하는 반면, 모균주들은 약 28%의 락토스만을 소비하는 것을 알 수 있다. 락토스 소비가 가장 높은 돌연변이주인 CHCC15887는 발효유 중에 단지 11.9 mg/ml이라는 소량으로 잔존하는데 이는 이 제품이 락토스 불내성 개체에 있어서조차 어떤 역할으르 함을 가리킨다. 이들 2가지 glcK 돌연변이주들이 8.3 내지 11.3 mg/ml의 글루코스를 분비하는 반면 모균주의 글루코스 분비는 검출 한계 미만인 점은 대단히 유의적인 일이다. 또한, 이와 동시에 2가지 돌연변이 균주들 모두는 모균주에 비해 갈락토스를 더 많이 분비한다: 34 내지 52%. 수크로스의 감미도를 100 레퍼런스로 할 경우, 락토스의 감미도는 16, 갈락토스의 감미도는 32, 그리고 글루코스의 감미도는 74.3이며, 최종 발표제품 중의 해당 감미도의 계산 결과 대응하는 모균주 CHCC14994를 이용하여 발효시킨 경우에 비해 최우수 돌연변이주 CHCC15757를 이용하여 발효시킬 경우 감미도가 2.0배 더 증가한 것으로 나타났다.
Figure pct00007
Figure pct00008

2 가지 glcK 돌연변이 균주들로서, CHCC15757 및 CHCC15887은 글루코스를 고수준으로 분비하는데, 이것은 glcK 유전자의 돌연변이가, 코딩된 글루코키나제 단백질을 불활성화시키는 것으로 여겨진다.
실시예 5: 2- 데옥시글루코스 내성 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들의 선별
2- 데옥시글루코스 내성 돌연변이주들의 선별
관심 대상인 2가지 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들, CHCC759 및 CHCC10019를, 2% 락토스를 함유하는 전술한 MRS-IM 브로스 10 ml 내로 상호 독립적으로 접종하고 40℃에서 밤새 혐기적으로 인큐베이션시켰다. 다음 단계에서, 약 3 X 108 세포들을 함유하는 이들 배양체 샘플들을 2% 락토스 및 추가로 20 mM 2-데옥시글루코스를 함유하는 MRS-IM 한천 플레이트 상에 플레이팅하였다. 이 플레이트 상에 생성된 콜로니들을 2% 락토스 및 추가로 20 mM 2-데옥시글루코스를 함유하는 MRS-IM 한천 플레이트 상에 단일 콜로니 스트리킹함으로써 정제한 다음 후술하는 바와 같이 추가 특징화하였다.
2- 데옥시글루코스 내성 분석:
다음의 방법은 관심 대상 균주가 2-데옥시글루코스에 대해 내성을 갖는지 아닌지를 결정하는데 적합하다. 관심 대상 균주들을 2% 락토스를 함유하는 전술한 MRS-IM 브로쓰 10 ml에 접종하고 40℃에서 밤새 혐기적으로 인큐베이션시켰다. 다음 단계에서, 약 104-105 세포들을 함유하는 이들 배양체의 희석된 샘플들을, 2% 락토스 및 추가로, 내성 돌연변이주들의 선별에 사용된 농도(대개 20mM 이지만 다른 농도로도 사용가능함)와 동일한 농도의 동일한 2-데옥시글루코스를 함유하는 MRS-IM 한천 플레이트 상에 도말하였다. 이 한천 플레이트를 40℃에서 20 시간 동안 혐기적으로 인큐베이션시킨 다음 검사하였다. 2-데옥시글루코스에 대한 내성이 없는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들은 콜로니를 거의 생성하지 않는 반면 2-데옥시글루코스에 내성인 균주들은 콜로니들을 많이 생성할 것이다. 적절한 대조군으로는 20 mM의 농도의 2-데옥시글루코스에 민감한 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들, CHCC759 및 CHCC10019, 그리고 20 mM 2-데옥시글루코스에 내성인 CHCC16159 및 CHCC16160을 들 수 있다.
결과: 2-데옥시글루코스의 존재 하 선별 조건에서 성장할 수 있는 몇몇 클론들을 이 접근법에 의해 분리하였다. 2-데옥시글루코스가 있는 플레이트에서 급속 성장하는 것으로 나타난 돌연변이 균주들을 CHCC16159 (모균주 CHCC759로부터 유도됨) 및 CHCC16160 (모균주 CHCC10019로부터 유도됨)이라 명명하였다. 이들 돌연변이 균주들을 독일생물자원센터[Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH)]에 기탁하였다.
실시예 6: 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 2- 데옥시글루코스 내성 돌연변이주들의 성장 패턴
락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이주들이 글루코스 상에서의 자랄 수 있는 능력을 상실하였거나 탄소원으로서 글루코스 상에서 자라는 능력이 손상되었음을 확실히 하기 위해, 이들 돌연변이주들의 성장 패턴을, 대응하는 모균주 2가지 모두의 성장과 비교하였다. 이를 위해, 모균주들인 CHCC759 및 CHCC10019와 돌연변이주들인 CHCC16159 및 CHCC16160를 2% 글루코스를 함유하는 MRS-IM 브로쓰에서 배양하였다.
2 가지 모균주들, CHCC759 및 CHCC10019는 2% 글루코스가 첨가된 MRS-IM 브로쓰에서 배가 시간 10 시간 미만으로 대수 성장하는데 반하여, 2 가지 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이주들인 CHCC16159 및 CHCC16160은 이 배지에서 성장하지 않거나 성장한다 해도 지극히 느린 성장을 보였다. 분광광도기를 이용하여 40℃에서 600 나노미터(OD600)에서 대사 성장하는 배양체의 광학 밀도를 측정함으로써 대수기의 성장을 모니터링하였다. 성장의 대수기는 OD600 0.1-1.0 사이에 도달하였다.
실시예 7: 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 균주들에 의해 발효된 밀크의 탄수화물 분석.
또 다른 실험으로서, 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들 CHCC759, CHCC10019, CHCC16159, 및 CHCC16160으로 각각 발효시킨 밀크들에 있어서 여러가지 종류의 상이한 슈가들의 슈가 농도를 구하였다. 2% 락토스를 함유하는 MRS-IM 배지 중에서 밤새 혐기 배양된 액상 배양체 1% (106-107 CFU/ml)를 9.5 % B-밀크에 접종하였다. 이 산성화에 이어서 INTAB PC 로거 및 Easyview 소프트웨어 처리하였다. 40℃에서 30시간 동안 산성화 처리한 후, 밀크 샘플들을 HPLC 분석하여 다양한 슈가와 유기산들의 양을 구하였다. 산성화 곡선은 돌연변이주들이 다소 지연된 산성화 개시를 나타내고 약간 높은 종말 pH에서 종결되었음을 보여준다. 이 HPLC 데이터를 표 2에 나타내었다.
표 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 이들 2가지 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이 균주들, CHCC16159 및 CHCC16160은 락토스의 적어도 약 94%를 소비하는 반면, 모균주들은 락토스를 적어도 약 37% 소비하였다. 젖산을 최대량으로 생산하는 것으로 나타난 돌연변이주인 CHCC16160의 경우, 발효유 중에 겨우 2.9 mg/ml의 락토스만이 남았다. 이렇게 락토스 수준이 낮은 발효유 제품은 락토스 불내성이 있는 개체들이 소비하기에 적합할 수 있다.
2 가지 돌연변이 균주들인 CHCC16159 및 CHCC16160이 15.2 내지 15.8 mg/ml의 글루코스를 분비하는 반면, 모균주들의 글루코스 분비량은 CHCC10019의 경우 검출 한계 미만이었고 CHCC759의 경우 4.2 mg/ml 이었다는 것은 유의할만하다. 이와 동시에 돌연변이 균주 2 가지 모두는 또한 모균주에 비해 갈락토스를 더 많이 분비하였다. 수크로스의 감미도 레퍼런스를 100이라 할 때, 락토스의 감미도는 16, 갈락토스의 감미도는 32, 그리고 글루코스의 감미도는 74인데, 최종 발효 제품 중의 상대 감미도를 계산하자, 돌연변이주 CHCC16160은 대응하는 모균주 CHCC10019에 비해 감미도가 2.5배 더 높은 제품을 생산하는 것으로 나타났다.
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 8: 스트렙토코커스 써모필러스의 하이퍼 -락토스 발효 및 글루코스 분비 돌연변이주의 선별
스트렙토코커스 써모필러스 균주 CHCC15757의 하이퍼-락토스 발효 및 글루코스 분비 돌연변이주를 분리하기 위해, 단일 콜로니 성장으로부터 유도된 세포들을, 2% 갈락토슬 함유하는 M17 브로쓰 10 ml에 접종하여 40℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
다음 날 , 이 균주들을 2% 갈락토스 및 30 mM 농도의 2- 데옥시글루코스를 함유하는 M17 한천 플레이트 상에서 계대 희석하여 도말하고 40℃에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 내성 콜로니들을 이들이 선별된 것과 동일한 종류의 한천 플레이트 상에서 먼저 재-스트리킹시켰다. 생존 콜로니들을 이용하여 2% 락토스, 2% 갈락토스, 2% 수크로스 또는 2% 글루코스를 함유하는 신선한 M17 브로쓰에 접종하였다.
이로부터, 본 발명자들은 B- 밀크에서는 성장하지 못하였지만 2% 수크로스가 첨가된 M17 에서 40℃에서는 성장할 수 있었던, CHCC15757 로부터 유도된 돌연변이주 CHCC16404를 분리할 수 있었다. 또한, CHCC16404 는 2% 글루코스가 첨가된 M17 에서는 성장하지 못하였다.
대수기 성장은 600 나노미터에서의 대수 성장 배양체의 광학 밀도( OD 600 )의 40℃에서의 경시적인 디벨롭먼트를 측정함으로써 구하였다.
실시예 9: 하이퍼 -락토스 발효 및 글루코스 분비 스트렙토코커스 써모필러스 돌연변이주 CHCC16404 의 성장 패턴
돌연변이주 CHCC16404의 유지 및 적절한 성장을 위해, 2% 수크로스가 첨가된 M17 배지에서 40℃에서 이 균주를 배양하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 2% 수크로스가 첨가된 M17 브로쓰에서 밤새 배양된 배양체 1% (106-107 CFU/ml)가 접종되거나 또는 밀크에 수크로스가 첨가된 경우에만, 돌연변이 균주 CHCC16404가 9.5% B-밀크를 산성화시킬 수 있음을 발견하였다. 본 발명자들은 밀크에 수크로스를 0.01 %라는 극히 소량으로 첨가하여도 CHCC16404가 9.5% B-밀크를 산성화시킬 수 있음을 관찰하였다. 이에 더해, CHCC16404는 동일한 조건 하에, 글루코스가 첨가된 M17에서 성장할 수 있는 모균주 CHCC15757와는 반대로 2% 글루코스가 첨가된 M17에서 40℃에서 성장하지 못하였다. 이러한 결과들은 한결같이, CHCC16404를 발생시킨 CHCC15757의 2-데옥시글루코스 처리가, 글루코스 흡수 시스템을 불활성화시킴으로써, 분비된 글루코스를 배지로부터 흡수하지 못하게 하는 돌연변이를 선택하였음을 가리키는 것이다.
실시예 10: 하이퍼 -락토스 발효 및 글루코스 -분비 스트렙토코커스 써모필러스 돌연변이주 CHCC16404 로 발효된 밀크의 탄수화물 분석
또 다른 실험으로서, 대상 슈가의 슈가 농도를 CHCC16404로 발효된 밀크에서 구하였다. 0.01%, 0.02%, 0.03% 및 0.05% 수크로스가 각각 첨가된 9.5% B-밀크를 함유하는 각각의 보틀에 2% 수크로스가 첨가된 M17 브로쓰에서 밤새 배양된 배양체 1% (106-107 CFU/ml)를 접종하였다. 산성화에 이어 INTAB PC 로거 및 Easyview 소프트웨어 처리를 실시하였다. 40℃에서 30 시간 동안 산성화시킨 후, HPLC 분석을 위해 밀크 샘플을 채취하여 대응하는 슈가 및 산의 함량을 구하였다.
표 3으로부터, 하이퍼-락토스 발효 및 글루코스 분비 돌연변이주인 CHCC16404가 놀랍게도, 이 실험에서 테스트된 모든 수크로스 첨가 농도에서, 락토스를 모두 소비하였다는 것을 알 수 있다. 본 발명자들은 또한, 수크로스가 보다 높은 농도로 첨가될수록 (예컨대 > 0.1 mg/ml), 최종 pH에 도달하기 전에는 락토스 발효가 완결되지 않음을 관찰하였다. 또한, 표 3은 모든 락토스가 글루코스와 갈락토스로 전환되었음과, 첨가된 모든 수크로스 농도에서 갈락토스의 일부만이 발효에 사용되었음을 가리키고 있다. 분비된 글루코스가 다시 흡수되지 않음으로 해서 밀크 내에 23.9 mg/ml 이상의 글루코스가 남아있다는 것은 흥미로운 일이다. 갈락토스의 약 25%가 발효되었으므로, 발효 후 밀크에는 16 mg/ml 이상의 갈락토스가 남아있다. 이러한 데이터는 모균주인 CHCC15757로부터 물려받은 glcK 돌연변이에 더해, CHCC16404가 글루코스 흡수 시스템을 불활성화시켜, 분비된 글루코스가 배지로부터 흡수되지 못하게 하는 돌연변이를 일으킴을 가리키는 것이다. 표 3의 데이터를 표 1의 데이터와 비교하되 수크로스의 감미도 레퍼런스가 100일 경우 락토스의 감미도는 16, 갈락토스의 감미도는 32 그리고 글루코스의 감미도는 74.3으로 할 경우, 최종 발효 제품의 상대적인 감미도 계산 결과, 균주 CHCC14994로 발효시킨 경우보다 CHCC16404로 발효시킨 경우 감미가 약 3.5배 더 증가한 것으로 나타났다.
Figure pct00011

실시예 11: 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 조합에 의해 발효된 밀크의 탄수화물 분석
이 실험에서는, 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 (CHCC759, CHCC10019, CHCC16159 및 CHCC16160으로부터 선택됨) 및 CHCC14994, CHCC15757 또는 CHCC16404인 스트렙토코커스 써모필러스 균주와의 조합에 의해 발효된 밀크에서 슈가와 유기산의 농도를 측정하였다.
요구르트는 보통 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스와 스트렙토코커스 써모필러스 균주 두 가지 모두를 함유하는 혼합 스타터 배양체를 사용하여 생산된다. 일반적으로, 요구르트 생산에 사용되는 밀크 기질에 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 1부와 스트렙토코커스 써모필러스 9부가 접종된다. 요구르트 생산에 대한 표준 셋업에서 글루코스 분비능을 분석하기 위해, 2% 락토스를 함유하는 MRS-IM 브로쓰에서 밤새 혐기적으로 배양된 0.1%의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 배양체 및 2% 갈락토스 (CHCC15757) 또는 2% 수크로스 (CHCC16404)를 함유하는 M17 브로쓰에서 밤새 배양된 스트렙토코커스 써모필러스 배양체 0.9%를, 9.5%-B 밀크에 접종하였다. 산성화에 이어 INTAB PC 로거 및 Easyview 소프트웨어 처리를 실시하였다. 30시간 동안 산성화시킨 후, 밀크 샘플을 채취하여 HPLC 분석함으로써 여러가지 슈가와 산의 양을 측정하였다. HPLC 데이터를 표 4에 나타내었다.
표 4로부터 스트렙토코커스 써모필러스의 2-데옥시글루코스-내성 돌연변이 균주 CHCC15757 및 CHCC16404의 사용으로 인해 이것이 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 모균주와 조합되었건 또는 그의 2-데옥시글루코스-내성 돌연변이주와 조합되었건 간에 글루코스를 밀크 내로 분비하는 결과를 초래하였다는 것을 알 수 있다. 그러나, 2가지 종 모두의 2-데옥시글루코스-내성 돌연변이 균주들의 조합, 예컨대 CHCC15757 및 CHCC16159의 조합이나 또는 CHCC15757 및 CHCC16160의 조합이 사용된 경우, 글루코스 농도가 더 높았다. 이들 혼합 배양체를 사용할 경우, 락토스의 적어도 82%가 소비된 것으로 밝혀졌으며, 11.8 mg/ml 내지 14.1 mg/ml의 글루코스가 분비된 것으로 나타났다. 스트렙토코커스 써모필러스 균주가 glcK 유전자가 돌연변이된 2-데옥시글루코스 내성 돌연변이주인 CHCC15887인 경우에도 유사한 결과가 얻어진다.
이와 동시에, 스타터 배양체에 2-데옥시글루코스-내성 돌연변이 균주가 존재하면 갈락토스 분비가 더 많아진다. 돌연변이 균주들의 조합, 예컨대 CHCC15757 및 CHCC16159가 사용될 경우, 대응하는 모균주들인 CHCC14994 및 CHCC10019를 포함하는 스타터 배양체를 사용한 경우에 비해 갈락토스 분비가 약 3배 더 높다(17.1 mg/ml).
하이퍼-락토스 발효 및 글루코스 분비 스트렙토코커스 써모필러스 돌연변이주인 CHCC16404와 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 2-데옥시글루코스-내성 돌연변이 균주와의 조합이 사용될 경우, 예컨대 CHCC16404와 CHCC16159의 조합, 또는 CHCC16404와 CHCC16160의 조합이 사용될 경우, 글루코스 분비는 더더욱 효과적이다.
수크로스의 감미도를 100이라 하면 (레퍼런스 값임), 락토스의 감미도는 16, 갈락토스의 감미도는 32이고 글루코스의 감미도는 74이므로, 표 4의 마지막 열에 제시된, 최종 발효 제품의 상대 감미도 계산 결과는 균주들의 여러가지 상이한 조합이 최종 발효 제품 중의 잔여 락토스, 글루코스 및 갈락토스의 최종 농도를 결정할 수 있음을 시사하는 것이다. 만일 분비된 글루코스와 갈락토스의 농도가 높고 잔여 락토스는 없엄으로 해서 내부 감미도가 최대인 요구르트가 소망될 경우, 가장 효과적인 균주들의 조합은 CHCC16404와 CHCC16160이다. 이 조합은 스트렙토코커스 써모필러스와 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 2-DG 감수성 균주들 CHCC14994 및 CHCC10019와의 대응하는 조합에 비해 감미가 3.6배 더 높은 요구르트를 제공하였으며 발효유에는 검출가능한 락토스가 남아있지 않았다.
Figure pct00012
Figure pct00013
실시예 12. 스트렙토코커스 써모필러스 및 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 글루코스 분비 돌연변이주들의 사용에 의한 비피도박테리아의 성장 증진.
비피도박테리움 , 아니말리스 아종 락티스 BB-12
Figure pct00014
(덴마크 회르스홀름에 소재하는 Chr. Hansen A/S에 의해 시판됨)와 같이 가장 널리 알려진 프로바이오틱 박테리아 중 일부는 밀크와 같이 락토스계 배지에 단독으로 제공될 경우 잘 자라지 못한다. 이 실험에서 본 발명자들은 따라서 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 BB-12
Figure pct00015
를 스트렙토코커스 써모필러스 또는 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스의 글루코스 분비 균주와 조합시킨 경우의 효과에 대해 연구 조사하였다.
실험 1:
CHCC 5445 (BB-12
Figure pct00016
)를 40℃, MRS+0,05% 시스테인 클로라이드에서 혐기적 조건 하에 밤새 배양하였다.
CHCC14994를 40℃, 2% 갈락토스가 첨가된 M17에서 밤새 배양하였다.
CHCC 15757를 40℃, 2% 갈락토스가 첨가된 M17에서 밤새 배양하였다.
실험 2:
CHCC 5445 (BB-12
Figure pct00017
)를 40℃, MRS+0,05% 시스테인 클로라이드에서 혐기적 조건 하에 밤새 배양하였다.
CHCC10019를 40℃, 2% 락토스가 첨가된 MRS에서 밤새 혐기 배양하였다.
CHCC16159를 40℃, 2% 락토스가 첨가된 MRS에서 밤새 혐기 배양하였다.
200 ml B-밀크가 들어있는 하기 6개의 보틀에 광학 밀도가 유사한 과성장(outgrown) 배양체들을 총 1%로 접종하여 40℃에서 밤새 인큐베이션하였다:
1. 1% CHCC 5445 (BB-12
Figure pct00018
)
2. 0.5% CHCC 5445 (BB-12
Figure pct00019
) + 0.5 % CHCC14994
3. 0.5% CHCC 5445 (BB-12
Figure pct00020
) + 0.5 % CHCC15757
4. 1% CHCC5445 (BB-12
Figure pct00021
).
5. 0.5% CHCC 5445 (BB-12
Figure pct00022
) + 0.5 % CHCC10019
6. 0.5% CHCC 5445 (BB-12
Figure pct00023
) + 0.5 % CHCC16159
보틀 2-3 및 5-6만이 밀크 중의 BB-12의 저조한 성능으로 인해 산성화되었다.
발효 후, 각 배양체 100 μl를, 여러가지 희석배수로 하여 (10-5, 10-6, 10-7, 10-8) 한천 플레이트 상에 플레이팅하고 BB-12의 성장에 대해 특이적으로, 즉 MRS + 0.05% 시스테인 클로라이드 + 10 ug/ml의 농도로 첨가된 테트라사이클린에 대해 선별한 다음 40℃에서 밤새 혐기적으로 인큐베이션하였다. 이어서 콜로니의 수를 센 다음 결과를 평균내어 표 5에 CFU/ml (밀리리터 당 콜로니 형성 단위)로서 나타내었다.
Figure pct00024
스트렙토코커스 써모필러스의 글루코스 분비 돌연변이주 CHCC15757와 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스, CHCC16159가 BB-12
Figure pct00025
와 함께 존재할 경우에만, BB-12
Figure pct00026
의 성장이 촉진되어, CFU/ml로서 표시되는 총 세포계수가 이들 배양체에서 약 10 x (1 log)가 된다. 이 결과는 글루코스 분비 균주들이 배양체 중에 한데 혼합될 경우, BB-12
Figure pct00027
와 같은 프로바이오틱 균주들의 함량을 부스트하는데 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 13. CHCC15757 와 CHCC16404 의 게놈 비교 및 글루코스 / 만노스 포스포트랜스퍼라제 시스템 ( PTS )의 IIC Man 단백질을 코딩하는 manN 유전자에 있어서의 돌연변이의 동정.
CHCC15757 및 CHCC16404의 게놈 DNA 조제물을 Beijing Genomics Institute (BGI, Beijing, China)에서 시퀀싱하고 어셈블링한 다음 CLC 게놈 워크벤치 소프트웨어(CLCBio, Arhus, Denmark)를 이용하여 마무리하였다. CHCC15757 및 CHCC16404의 게놈 서열들을 레퍼런스로서 CHRZ1066의 주석형 게놈 서열을 이용하여 Mauve 2.3.1 소프트웨어에 의해 정렬하였다. 정렬 후, CHCC15757 및 CHCC16404 두 가지 모두에 대해 무료 Mauve 2.3.1 소프트웨어를 이용하여 단일-염기 다형성(SNP) 분석을 실시하였다. 이것에 의해 글루코스/만노스 PTS의 IICMan 단백질을 코딩하는 manM 유전자의 아미노산 위치 209에서의 GAA 코돈(글루탐산)에 있어서 G의 T로의 돌연변이를 동정할 수 있다. 이 변화는 이 단백질의 위치 209에 TAA 종결 코돈을 도입함으로 해서 (도 3), 트렁케이트화된, 그에 따라 비기능성 IICMan 단백질의 생성을 결과시킨다. E따라서, 이 돌연변이는 글루코스 /만노스 PTS를 경유한 글루코스의 세포 내로의 수송을 방지를 초래하는 것으로 믿어진다.
기탁 및 엑스퍼트 솔루션
출원인은 하기 언급된 기탁 미생물들의 샘플들이 특허 허여 전까지 오직 엑스퍼트에게만 제공될 것을 요구한다.
균주 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC15757은 2012년 4월 3일자로, 독일 데-38124 브라운쉬바이크 인호펜슈트라세 7베에 소재하는 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH)에 기탁되어 수탁번호 DSM 25850를 부여받았다.
균주 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC15887은 2012년 4월 3일자로, 독일 데-38124 브라운쉬바이크 인호펜슈트라세 7베에 소재하는 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH)에 기탁되어 수탁번호 DSM 25851을 부여받았다.
균주 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC16404는 2012년 12월 12일자로, 독일 데-38124 브라운쉬바이크 인호펜슈트라세 7베에 소재하는 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH)에 기탁되어 수탁번호 DSM 26722를 부여받았다.
균주 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC14994는 2012년 4월 3일자로, 독일 데-38124 브라운쉬바이크 인호펜슈트라세 7베에 소재하는 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH)에 기탁되어 수탁번호 DSM 25838을 부여받았다.
균주 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC11976은 2009년 9월 8일자로, 독일 데-38124 브라운쉬바이크 인호펜슈트라세 7베에 소재하는 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH)에 기탁되어 수탁번호 DSM 22934를 부여받았다.
균주 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC759는 2012년 9월 6일자로, 독일 데-38124 브라운쉬바이크 인호펜슈트라세 7베에 소재하는 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH)에 기탁되어 수탁번호 DSM 26419를 부여받았다.
균주 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC10019는 2007년 4월 3일자로, 독일 데-38124 브라운쉬바이크 인호펜슈트라세 7베에 소재하는 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH)에 기탁되어 수탁번호 DSM 19252를 부여받았다.
균주 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC16159는 2012년 9월 6일자로, 독일 데-38124 브라운쉬바이크 인호펜슈트라세 7베에 소재하는 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH)에 기탁되어 수탁번호 DSM 26420을 부여받았다.
균주 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC16160은 2012년 9월 6일자로, 독일 데-38124 브라운쉬바이크 인호펜슈트라세 7베에 소재하는 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH)에 기탁되어 수탁번호 DSM 26421을 부여받았다.
균주 비피도박테리움 아니말리스 아종 락티스 CHCC5445 (BB-12
Figure pct00028
)는 2009년 9월 30일자로, 독일 데-38124 브라운쉬바이크 인호펜슈트라세 7베에 소재하는 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) GmbH)에 기탁되어 수탁번호 15954를 부여받았다.
전술한 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 협약에 따라 이루어진 것이다.
참조문헌
WO 2011/026863
Pool 등 (2006) Metabolic Engineering 8(5); 456-464
Thompson 등 (1985) J. Bacteriol. 162(1); 217-223
Chervaux 등 (2000). Appl and Environ Microbiol, 66, 5306-5311
Cochu 등 (2003). Appl and Environ Microbiol, 69(9), 5423-5432
Hoeier 등 (2010) The Technology of Cheesemaking, 2nd Ed. Blackwell Publishing, Oxford; 166-192.
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM25850 20120403 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM25851 20120403 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM26722 20121212 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM25838 20120403 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM22934 20120908 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM26419 20120906 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM19252 20070403 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM26420 20120906 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM26421 20120906 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH DSM15954 20030930

Claims (30)

  1. 갈락토스를 발효시키는 스트렙토코커스 써모필러스 균주로서, 상기 균주는 글루코키나제 단백질을 코딩하는 glcK 유전자의 DNA 서열에 돌연변이를 지니되, 상기 돌연변이는 글루코키나제 단백질을 불활성화시키거나 또는 상기 유전자의 발현에 부정적인 영향을 미치는 것인 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 글루코스의 세포 내로의 수송을 감소시키는 돌연변이를 갖는 것인 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
  3. 제2항에 있어서, 상기 균주는 글루코스 수송체의 성분을 코딩하는 유전자에 돌연변이를 지니되, 상기 돌연변이는 글루코스 수송체를 불활성화시키거나 상기 유전자의 발현에 부정적인 영향을 미치는 것인 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
  4. 제3항에 있어서, 상기 균주는 글루코스/만노스 포스포트랜스퍼라제 시스템의 IICMan 단백질을 코딩하는 manM 유전자의 DNA 서열에 돌연변이를 지니되, 상기 돌연변이는 IICMan 단백질을 불활성화시키거나 상기 유전자의 발현에 부정적인 영향을 미치는 것인 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
  5. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 균주는 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 농도로 접종되어 40℃에서 20 시간 배양될 경우, 9.5% B-밀크 중의 글루코스의 양을 적어도 5 mg/ml로 증가시키는 것인 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
  6. 선행하는 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 균주는 0.05% 수크로스가 첨가된 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 농도로 접종되어 40℃에서 20 시간 배양될 경우, 0.05% 수크로스가 첨가된 9.5% B-밀크 중의 글루코스의 양을 적어도 5 mg/ml로 증가시키는 것인 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
  7. 독일생물자원센터(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)에 수탁번호 DSM 25850으로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC15757 균주, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 25851로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC15887 균주, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 26722로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC16404 균주, 및 이들로부터 유도된 돌연변이 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는 스트렙토코커스 써모필러스 균주로서, 상기 돌연변이 균주는 상기 기탁된 균주들의 락토스 발효 특성 및/또는 글루코스 분비 특성을 그대로 유지하거나 더욱 향상된 특성을 갖는 것인 스트렙토코커스 써모필러스 균주.
  8. 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주로서, 상기 균주는 2-데옥시글루코스에 대해 내성이고 상기 균주는 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 농도로 접종되어 40℃에서 적어도 20 시간 배양될 경우, 9.5% B-밀크 중의 글루코스의 양을 적어도 5 mg/ml로 증가시키는 것인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주.
  9. 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 26420으로 기탁된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 CHCC16159, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 26421로 기탁된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주 CHCC16160, 이들로부터 유도된 돌연변이 균주로 이루어진 군으로부터 선택된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주로서, 상기 돌연변이 균주는 상기 기탁된 균주들 중 하나를 출발물질로 이용함으로써 수득된 것이고, 상기 돌연변이 균주는 상기 기탁된 균주의 락토스 발효 특성 및/또는 글루코스 분비 특성을 그대로 유지하거나 더욱 향상된 특성을 갖는 것인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 104 내지 1012 CFU/g의 양으로 포함하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 접종하여 40℃에서 14 시간 인큐베이션시킬 경우 1.0 미만의 pH 감소를 야기하는 것으로 정의되는, 9.5% B-밀크의 산성화를 일으키지 못하고, 상기 조성물은 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 접종하여 40℃에서 14 시간 인큐베이션시킬 경우 1.0 이상의 pH 감소를 야기하는 것으로 정의되는, 9.5% B-밀크의 산성화를 촉발하는데 효과적인 양의 수크로스를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 제8항 또는 제9항에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 104 내지 1012 CFU/g의 양으로 더 포함하는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 기재된 1종 이상의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 밀크 기질에 접종하여 발효시키는 것을 포함하는, 발효유제품의 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 스트렙토코커스 써모필러스 균주는 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 접종하여 40℃에서 14 시간 인큐베이션시킬 경우 1.0 미만의 pH 감소를 야기하는 것으로 정의되는, 9.5% B-밀크의 산성화를 일으키지 못하고, 상기 밀크 기질에는 9.5% B-밀크에 106-107 CFU/ml의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 접종하여 40℃에서 14 시간 인큐베이션시킬 경우 1.0 이상의 pH 감소를 야기하는 것으로 정의되는, 9.5% B-밀크의 산성화를 촉발하는데 효과적인 양의 수크로스가 첨가되는 것인 방법.
  15. 제8항 또는 제9항에 따른 적어도 1종의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가 리쿠스 균주를 밀크 기질에 접종하여 발효시키는 것을 포함하는, 발효유제품의 제조방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 적어도 1종의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 제8항 또는 제9항에 따른 적어도 1종의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 밀크 기질에 접종하여 발효시키는 것을 포함하는 방법.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 적어도 1종의 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 포함하는 발효유제품.
  18. 제8항 또는 제9항에 따른 적어도 1종의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 포함하는 발효유제품.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 적어도 1종의 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 제8항 또는 제9항에 따른 적어도 1종의 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 포함하는 발효유제품.
  20. 발효유제품을 제조하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 제8항 또는 제9항에 따른 락토바실러스 델브루 에키 아종 불가리쿠스 균주의 용도.
  21. 발효유제품의 감미를 증가시키기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 제8항 또는 제9항에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 용도.
  22. 발효유제품 중의 락토스 함량을 감소시키기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주 및 제8항 또는 제9항에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 용도.
  23. 제17항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 락토스 불내성 증상을 회피하는데 사용되기 위한 것인 발효유제품.
  24. 비피도박테리움 균주의 성장을 향상시키기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 용도.
  25. 비피도박테리움 균주의 성장을 향상시키기 위한, 제8항 또는 제9항에 따른 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 용도.
  26. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 따른 비-GMO 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 스크리닝 및 분리하는 방법으로서, 상기 방법은 다음 단계들:
    a) 갈락토스를 발효하는 스트렙토코커스 써모필러스 모균주를 제공하는 단계;
    b) 상기 모균주로부터 유도된 스트렙토코커스 써모필러스 균주들의 풀(pool)로부터 2-데옥시글루코스에 내성인 스트렙토코커스 써모필러스 균주들의 풀을 선별 및 분리하는 단계; 및
    c) 2-데옥시글루코스에 내성인 스트렙토코커스 써모필러스 균주들의 풀로부터, 만일 M17 배지 + 2% 글루코스에서 보다 M17 배지 + 2% 갈락토스에서 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 성장속도가 더 높을 경우 그 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 풀을 선별 및 분리하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 방법은 단계 d)로서 단계 c)에서 선택된 스트렙토코커스 써모필러스 균주로부터 유도된, 2-데옥시글루코스 내성 스트렙토코커스 써모필러스 균주들의 풀로부터, 만일 스트렙토코커스 써모필러스 균주의 M17 배지 + 2% 수크로스에서의 성장 속도가 높지만 M17 배지 + 2% 글루코스에서의 모균주의 성장 속도에 비해 제로이거나 적어도 0-50% 감소된 경우 그 스트렙토코커스 써모필러스 균주를 선별 및 분리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 갈락토스를 발효하는 모균주는 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 25838로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC14994 균주, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 22934로 기탁된 스트렙토코커스 써모필러스 CHCC11976 균주 및 이들로부터 유도된 균주들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  29. 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주를 스크리닝 및 분리하는 방법으로서 상기 방법은 다음 단계들:
    a) 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 모균주를 제공하는 단계;
    b) 상기 모균주로부터 유도된 돌연변이 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들의 풀(pool)로부터 2-데옥시글루코스에 내성인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들의 풀을 선별 및 분리하는 단계; 및
    c) 2-데옥시글루코스에 내성인 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들의 풀로부터, 만일 MRS-IM 배지 + 2% 글루코스에서 보다 MRS-IM 배지 + 2% 락토스에서 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주의 성장속도가 더 높을 경우 그 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 균주들의 풀을 선별 및 분리하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 모균주는 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 26419로서 기탁된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC759 균주, 독일생물자원센터에 수탁번호 DSM 19252로 기탁된 락토바실러스 델브루에키 아종 불가리쿠스 CHCC10019 균주, 및 이들로부터 유도된 균주들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013160413A1 (en) * 2012-04-25 2013-10-31 Chr. Hansen A/S Use of lactic acid bacteria for preparing fermented food products with increased natural sweetness
WO2015014940A1 (en) * 2013-07-31 2015-02-05 Tine Sa Glucose secreting lactic acid bacteria strains
BR122021023753B1 (pt) 2014-06-19 2022-09-13 Chr. Hansen A/S Produto de alimento fermentado, cepa de lab isolada e composição compreendendo a mesma
AR101545A1 (es) * 2014-06-19 2016-12-28 Chr Hansen As Método para producir un producto lácteo fermentado con baja concentración de lactosa
EP2957180B1 (en) 2014-06-19 2018-03-14 Chr. Hansen A/S Method of producing a fermented milk product with improved control of post acidification
EP3389384A1 (en) * 2015-12-18 2018-10-24 Chr. Hansen A/S Lactic acid bacteria for preparing fermented food products with increased natural sweetness and high texture
CN108882718A (zh) * 2016-01-21 2018-11-23 科·汉森有限公司 使用干酪乳杆菌生产发酵乳制品的方法
CN109068672A (zh) * 2016-03-31 2018-12-21 科·汉森有限公司 葡萄糖缺陷型嗜热链球菌菌株在用于生产发酵乳制品方法中的用途
KR20240005243A (ko) 2016-06-14 2024-01-11 시에이치알. 한센 에이/에스 락토오스 함량이 감소된 발효유제품
CN106190930B (zh) * 2016-09-06 2019-09-10 内蒙古农业大学 一株德氏乳杆菌保加利亚亚种mga17-6 及其用途
WO2018091063A1 (en) * 2016-11-15 2018-05-24 Compagnie Gervais Danone Streptococcus thermophilus for use in preparation of fermented products
BR112019010024B1 (pt) 2016-12-02 2023-01-31 Fairlife, Llc Processos para a preparação de uma composição láctea seca, composição láctea seca, processo de reconstituição de um produto de leite e produto de leite reconstituído
PL3568024T3 (pl) * 2017-01-13 2021-05-17 Chr. Hansen A/S Sposób wytwarzania fermentowanego produktu mlecznego
ES2927829T3 (es) * 2017-03-28 2022-11-11 Chr Hansen As Composición de bacterias del ácido láctico para preparar productos alimenticios fermentados con dulzor natural y sabor aumentados
EP3676368A1 (en) 2017-08-28 2020-07-08 Chr. Hansen A/S Streptococcus thermophilus (st) cell to make e.g. mozzarella cheese
CN107974420B (zh) * 2017-12-17 2020-09-25 石家庄君乐宝乳业有限公司 高产乙醛的保加利亚乳杆菌jmcc0018、其分离纯化方法及应用
CN111527196A (zh) * 2017-12-22 2020-08-11 杜邦营养生物科学有限公司 具有增甜特性的新型乳酸细菌及其用途
US20210161163A1 (en) * 2018-04-24 2021-06-03 Chr. Hansen A/S Composition and process for producing a fermented milk product comprising application of a lactose-deficient s. thermophilus strain, a lactose-deficient l. bulgaricus strain and a probiotic strain
CN108902305B (zh) * 2018-06-06 2021-08-13 上海应用技术大学 一种具有内源增香的酸奶发酵剂及其制备方法和应用
CN112367843A (zh) * 2018-06-20 2021-02-12 科·汉森有限公司 生产半乳糖量减少的奶酪的方法
CN109105491B (zh) * 2018-09-12 2021-07-23 内蒙古农业大学 一株产黏产酪香味的乳酸乳球菌imau11823及其应用
BR112021007244A2 (pt) 2018-10-17 2021-08-10 Chr. Hansen A/S enzimas lactase com propriedades melhoradas em ph ácido
CA3118166A1 (en) 2018-10-30 2020-05-07 Dupont Nutrition Biosciences Aps Methods and cultures to manufacture pizza cheese
EP3898655A1 (en) * 2018-12-21 2021-10-27 DuPont Nutrition Biosciences ApS New lactic acid bacteria
JP7260493B2 (ja) 2019-02-22 2023-04-18 株式会社明治 発酵食品の製造方法、発酵食品、乳酸菌、及び乳酸菌組成物
WO2020239761A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Chr. Hansen A/S Process for producing a fermented milk product with an enhanced level of probiotics
CN114286623A (zh) 2019-06-20 2022-04-05 科·汉森有限公司 ST Gal(+)细菌用于生产具有相对高稳定pH的发酵乳制品的用途
JP6739602B1 (ja) * 2019-07-24 2020-08-12 雪印メグミルク株式会社 記憶・学習能維持および／または向上用組成物及び組成物を含む食品、医薬品、飼料
WO2021037986A1 (en) * 2019-08-30 2021-03-04 Chr. Hansen A/S Production of lactase enzymes using altered regulation strains
EP3845069B1 (en) 2019-12-30 2022-08-24 Compagnie Gervais Danone Sucrose negative streptococcus thermophilus for use in preparation of fermented products
CN116096240A (zh) 2020-05-29 2023-05-09 科·汉森有限公司 用于制备发酵食品的乳酸菌组合物
JP2024510896A (ja) 2021-02-26 2024-03-12 セーホーエル．ハンセン アクティーゼルスカブ 発酵製品製造用の乳酸菌組成物
CN113215053B (zh) * 2021-05-31 2023-01-17 内蒙古农业大学 一种嗜热链球菌imau 80287y菌株及其应用、酸奶及其制备方法
CN113444664B (zh) * 2021-07-01 2023-12-12 陕西广播电视大学（陕西工商职业学院） 一株产γ-氨基丁酸短乳杆菌及其应用
EP4112715A1 (en) 2021-07-01 2023-01-04 Compagnie Gervais Danone Bifidobacteria for use in preparation of fermented products
WO2023110858A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Chr. Hansen A/S Method for producing a fermented milk product
CN114703103B (zh) * 2022-04-22 2024-04-26 大理来思尔乳业有限公司 一株嗜热链球菌菌株wgy001，其复合菌株及其应用
CN115975877B (zh) * 2022-12-12 2024-06-18 内蒙古农业大学 嗜热链球菌imau80285y、发酵剂的应用及酸奶和酸奶的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011026863A1 (en) * 2009-09-01 2011-03-10 Chr. Hansen A/S Lactic bacterium with modified galactokinase expression for texturizing food products by overexpression of exopolysaccharide

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1493806A1 (en) 2003-07-02 2005-01-05 Chr. Hansen A/S Use of compounds involved in biosynthesis of nucleic acids as cryoprotective agents
BRPI0404152A (pt) 2004-09-17 2006-06-13 Unicamp alimento funcional, composição probiótica, composição alimentìcia e processo de produção de alimento funcional fermentado a base de soja, contendo agentes probióticos e prebióticos
CN101586087B (zh) 2009-06-25 2011-09-14 江苏省农业科学院 一种酸敏性保加利亚乳杆菌菌株及其用法
CN105713853B (zh) 2010-01-28 2020-07-17 科·汉森有限公司 基于噬菌体抗性选择的用于对食品进行质构化的乳酸细菌
WO2013160413A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 Chr. Hansen A/S Use of lactic acid bacteria for preparing fermented food products with increased natural sweetness

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011026863A1 (en) * 2009-09-01 2011-03-10 Chr. Hansen A/S Lactic bacterium with modified galactokinase expression for texturizing food products by overexpression of exopolysaccharide

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Bacteriol., Vol.162, pp.217-223(1985.) *
J. Bacteriol., Vol.184, pp.785-793(2002.) *
J. Dairy Sci., Vol.69, pp.1-8(1986.) *

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