CN106190930B - 一株德氏乳杆菌保加利亚亚种mga17-6 及其用途 - Google Patents

一株德氏乳杆菌保加利亚亚种mga17-6 及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)MGA17‑6及其在制备乳类发酵制品中的用途，所述的乳类发酵制品是发酵乳或发酵稀奶油。所述发酵乳的制备方法包括制备活化培养基、制备发酵培养基、菌种活化与发酵等步骤。该菌株发酵乳在发酵和贮藏期间共检测出61种挥发性物质，主要是酸类、醇类、酮类、醛类、酯类等化合物，且一些主要特征风味物质如乙酸、乙醛、1‑庚醇、2‑庚酮、甲酸乙烯酯等相对含量较高。

Description

一株德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6 及其用途
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域。更具体地，本发明涉及一株德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)MGA17-6，还涉及所述德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6的用途。
【背景技术】
酸奶是以新鲜牛奶为原料，经乳酸菌发酵制成的一种传统发酵乳制品。酸奶中含有大量的活性乳酸菌，这些乳酸菌在发酵过程中可产生多种代谢产物，包括有机酸、胞外多糖、风味化合物以及人体营养所必需的多种维生素和矿物质等。这些菌体及其代谢产物具有改善酸奶风味，提高发酵乳营养价值，调节肠道菌群平衡，维持和保证肠道菌群最佳优势组合及稳定性，抑制肿瘤和免疫赋活等生理功能。
乳酸菌在发酵和贮藏过程中能产生独特的香气，使酸奶等乳制品具有独特的风味。近年来，一些国内外研究学者采用固相微萃取(SPME)和色质联用(Gaschromatography-mass spectrometry，GC-MS)技术从发酵乳制品中检测出多种风味化合物。例如Kaminarides等人(Kaminarides,S.et al,《International Journal of FoodScience and Technology》，42(9),1019-1028.2007)通过分析4种不同脂肪含量酸羊奶，发现脂肪含量对酸羊奶口感和风味有显著影响，同时发现这些发酵乳中的主要风味物质是乙酸，乙醛，丙酮，双乙酰，2-丁酮，乙偶姻，3-甲基-2-丁酮等。葛武鹏等人(《西北农林科技大学学报(自然科学版)》，7,64-69.2008)采用固相微萃取技术富集牛羊奶发酵乳中的风味物质，利用色质联用技术分析这些风味物质，发现在牛羊奶发酵乳中的主要风味物质均为双乙酰、2-呋喃甲醇和2-羟基-2-丁酮等。2014年，Pan等人(《Journal of Dairy Science》,97(2),624-31.2014)采用固相微萃取和气质联用技术检测在戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)发酵乳中的挥发性风味物质，确定主要特征风味物质是乙醇、2,3-丁二酮和 乙酸等。这些研究结果表明，采用固相微萃取和气质联用技术可以检测出发酵乳中的风味化合物，确定一些关键风味化合物和发酵乳风味之间的关系。
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)是酸奶及发酵乳饮料生产中制备发酵剂的常用菌株。该菌株在酸奶发酵和贮藏过程中能够产生多种风味物质，赋予酸奶特有的风味。其中，主要特征风味物质是乙醛、双乙酰等。乙醛是发酵乳中的主要特征风味化合物，其含量较高，远高于其他醛类化合物。一般认为，德氏乳杆菌保加利亚亚种高产乙醛的能力主要是因为该菌株不含有乙醛脱氢酶，可以使乙醛不被还原而在发酵乳中积累起来。双乙酰也是酸奶风味形成的关键芳香化合物之一，在发酵乳中的含量较低，但因为较低的风味阈值，对发酵乳的风味的改善具有重要作用。
本发明通过分析发酵乳中风味物质的指纹图谱，动态测定乳酸菌在发酵过程中产生的风味物质，对这些菌株在发酵和贮藏期间产生的风味化合物进行了系统评价，确定具有优良发酵特性的菌株。对于制备高效发酵剂、开发功能性乳制品、丰富现有乳制品种类、提高乳品的附加值具有重要意义。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一株德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)MGA17-6。
本发明的另一个目的是提供所述德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6的用途。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一株德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)MGA17-6，该菌株已于2016年09月02日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.12926。
本发明还涉及所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6在制备乳类发酵制品中的用途。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的乳类发酵制品是发酵乳或发酵稀奶油。
根据本发明的一种优选实施方式，所述发酵乳的制备步骤如下：
A、制备活化培养基
往以重量计10％脱脂乳粉培养基中添加以重量计0.1％酵母粉，混合均匀，然后在温度115℃下灭菌7min，得到所述的活化培养基；
B、制备发酵培养基
往以重量计11.5％全脂乳粉培养基中添加以重量计6.5％蔗糖，然后在温度60℃与压力20MPa的条件下进行均质，接着在温度95℃下灭菌10min，得到所述的发酵培养基；
C、菌种活化
按照以活化培养基重量计2％的接种量，把在温度-80℃下冷冻保藏的德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种到所述的活化培养基中，在温度37℃下培养24h，然后按照以MRS液体培养基重量计2％的接种量，将活化德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下继续培养20～24h，以同样方式传代培养2～3次，得到MGA17-6菌株活菌数为108CFU/g以上的活化培养物；
D、发酵
按照5×106CFU/mL接种量把步骤C得到的活化培养物接种到所述的发酵培养基中，在温度42℃的条件下发酵直到发酵乳的pH值降低到4.5时，停止发酵，于是得到所述的发酵乳。
根据本发明的一种优选实施方式，在步骤D中，在温度42℃条件下发酵至发酵乳pH值为4.5的时间是14.0h。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵乳在贮藏期间滴定酸度、脱水收缩性、黏度或蛋白质水解活力分别是52.02-67.47°T、43.0-47.8％、516-631cp或4.61-8.92mmol/L。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵乳含有61种酸类、醇 类、酮类、醛类、酯类化合物风味物质，其中主要特征风味化合物是乙酸、乙醛、2-庚酮、1-庚醇与甲酸乙烯酯。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的乳是牛乳、羊乳、马乳或骆驼乳。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一株德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)MGA17-6，该菌株已于2016年09月02日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.12926。
德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6是从蒙古国牧民家庭自然发酵酸牛奶中分离、筛选出的一株具有优良发酵特性的德氏乳杆菌保加利亚亚种。
德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6是采用下述方法分离、鉴定得到的：
A、样品来源
原始采集自蒙古国牧民家庭自然发酵酸牛奶。
B、样品采集
从牧民家庭酸牛奶中用灭菌移液器无菌采样2mL酸牛奶，在外界无污染的情况下放入带有胶塞的灭菌小试管中，封口，低温保存，以进行乳酸菌分离鉴定。
C、分离鉴定
样品直接画线于MRS琼脂培养基上，在温度37℃与厌氧的条件下培养48h；待菌落形成后，接种于MRS液体培养基，在温度37℃的条件下培养24h；再次画线于MRS琼脂培养基上，确认其为纯培养物后穿刺于MRS半固体培养基，在温度4℃下保存。观察记录纯培养物的菌落形态、革兰氏染色细胞形态特征，并进行常规的过氧化氢酶实验。
将革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性和细胞形态呈杆状的菌株暂时命名为德氏乳杆菌保加利亚亚种。该菌株在MRS培养基上形成菌落为白色或微黄色菌落，表面光滑，边缘整齐，无褶皱，呈针尖状，在显微镜下观测到细胞多为细长杆状，具体形态参见附图1。
本发明使用的MRS液体培养基是由10克蛋白胨、10克牛肉膏、5克酵母膏、2克柠檬酸氢二铵、20克葡萄糖、1.0ml吐温80、5克三水合乙酸钠、2克三水合磷酸氢二钾、0.58克七水合硫酸镁、0.25克一水合硫酸锰与1000ml蒸馏水组成，其pH 6.2-6.6。
本发明使用的MRS琼脂培养基由10克蛋白胨、10克牛肉膏、5克酵母膏、2克柠檬酸氢二铵、20克葡萄糖、1.0ml吐温80、5克三水合乙酸钠、2克三水合磷酸氢二钾、0.58克七水合硫酸镁、0.25克一水合硫酸锰、6克琼脂与1000ml蒸馏水组成，其pH 6.2-6.6。
本发明使用的MRS半固体培养基由10克蛋白胨、10克牛肉膏、5克酵母膏、2克柠檬酸氢二铵、20克葡萄糖、1.0ml吐温80、5克三水合乙酸钠、2克三水合磷酸氢二钾、0.58克七水合硫酸镁、0.25克一水合硫酸锰、18克琼脂与1000ml蒸馏水组成，其pH 6.2-6.6。MRS液体和琼脂培养基在使用前均需要在温度121℃下灭菌15min。
按照以MRS液体培养基重量计2％的接种量，让分离纯化的德氏乳杆菌保加利亚亚种在MRS液体培养基中在温度37℃的条件下扩大培养，接着对得到的培养物分别进行常规过氧化氢酶试验、运动性试验、葡萄糖产气试验、发育温度试验(20℃、37℃、55℃和60℃生长)、pH2、pH4、pH5、pH6、pH7和pH8生长试验、6.5％NaCl中生长试验、40％牛胆酸钠中生长试验等。具体地可以参见凌代文、东秀珠在《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，中国轻工业出版社,北京，pp54-57.1993中描述试验方法及其试验条件。
上述这些试验的试验结果列于表1中。
表1：分离纯化的德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6的生理性能试验
表中：
“+”表示阳性反应；
“-”表示阴性反应。
由表1列出的试验结果可以清楚看出，该菌株具有下述的生长特性：
(A)在温度20、60℃下不生长，在温度37-45℃之间生长良好；
(B)在pH值<7的弱酸性环境下生长良好，生长初始pH值在4-7之间；
(C)当培养基初始盐浓度达到6.5％时，菌株的生长受到抑制；
(D)发酵乳糖产生D型乳酸；
(E)过氧化氢酶实验结果为阴性。
D、菌种鉴定
采用16SrDNA序列同源性分析对前面得到的德氏乳杆菌保加利亚亚种进行了鉴定，所述菌株与Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus具有99.9％的同源性，因此，将所述菌株命名为Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus MGA17-6。
本发明还涉及所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6在制备乳类发酵制品中的用途。
所述的乳类发酵制品是发酵乳或发酵稀奶油。
在本发明中，所述的发酵稀奶油应该理解是稀奶油经德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6发酵后得到的奶油。所述的稀奶油是目前市场上广泛销售的产品。所述的发酵稀奶油是采用本技术领域里通常采用的方法制备得到的，具体可以参见本说明书的应用实施例4。
本发明发酵稀奶油具有一定的酸度，风味浓郁，且用于发酵的乳酸菌能抑制不良微生物的生长等特点。
在本发明中，所述的发酵乳应该理解是乳在脱脂粉乳培养基中经德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6发酵所制得的乳制品。
具体地，所述的发酵乳是采用下述方法制备得到的：
A、制备活化培养基
往以重量计10％脱脂乳粉培养基中添加以重量计0.1％酵母粉，混合均匀，然后在温度115℃下灭菌7min，得到所述的活化培养基；
在这个步骤中，使用的脱脂乳粉培养基是由Fonterra LTD,New Zealand公司销售的产品。使用的酵母粉是目前市场上销售的产品，例如由BIOSHARP公司以商品名酵母粉销售的产品。
B、制备全脂乳粉培养基
往以重量计11.5％全脂乳粉培养基中添加以重量计6.5％蔗糖，然后在温度60℃与压力20MPa的条件下进行均质，接着在温度95℃下灭菌10min，得到所述的发酵培养基；
在制备全脂乳粉培养基时添加蔗糖的主要作用是提供甜味、微生物生长碳源以及提高粘度等。如果蔗糖添加量高于6.5％的话，会导致渗透压过高，影响乳酸菌生长及风味物质的产生，从而对后续发酵不利。如果蔗糖添加量低于6.5％的话，导致最终发酵产品甜味不足，微生物生长所需碳源匮乏，对酸奶品质造成不良影响，因此选择这个添加量是恰当的。
本发明使用的11.5％全脂乳粉培养基是目前市场上销售的产品，例如FonterraLTD,New Zealand销售的产品。
在这个步骤中均质的目的是将全脂粉乳中的脂肪颗粒破碎成较小的脂肪球，并均匀分散于乳中。均质使用的设备是目前市场上销售的产品，例如由上海申鹿公司以商品名SHR高压均质机销售的设备。这个步骤使用的灭菌设备灭菌使用的设备是目前市场上销售的产品，例如由KAQOSHIMASEISAKUSYOING(日本)公司以商品名SX-500 TOMY高压灭菌锅销售的设备。
C、菌种活化
按照以活化培养基重量计2％的接种量，把在温度-80℃下冷冻保藏的德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种到所述的活化培养基中，在温度37℃下培养24h，然后按照以MRS液体培养基重量计2％的接种量，将活化德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下继续培养20～24h，以同样方式传代培养2～3次，得到MGA17-6菌株活菌数为108CFU/g以上的活化培养物；
在这个步骤中，活化培养的目的在于使所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株恢复其活力。
活菌数测定方法如下：
将活化菌液依次作10倍的递增稀释，当稀释度为10-8时停止稀释。用移液枪吸取100μL稀释菌液，加入灭菌MRS固体培养基平板中。然后用涂布棒将菌液涂匀，使用封口膜封口。在温度42℃下培养24h，接着采用常规方法进行活菌计数。
在这个步骤中，灭菌使用的设备与前面描述的灭菌设备相同，因此不再赘述。活化培养与传代培养使用的设备是目前市场上销售的产品，例如由上海申贤公司以商品名DHP-9272电热恒温培养箱销售的设备。
D、发酵
按照5×106CFU/mL接种量把步骤C得到的活化培养物接种到所述的发酵培养基中，在温度42℃的条件下发酵直到发酵乳的pH值降低到4.5时，停止发酵，于是得到所述的发酵乳。
在这个步骤中，在温度42℃条件下发酵至发酵乳pH值为4.5的时间是14.0h。这个结果说明德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株在发酵期间具有较好的产酸能力，可以作为潜在的酸奶发酵剂菌株。
分别用本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6与从市场上购买获得的德氏乳杆菌保加利亚亚种L-YC(商业发酵剂)制备的发酵乳在温度4℃下贮藏7d，再将两种发酵乳各约25mL分别装入一次性品尝杯中，同时进行编号。
根据发酵乳感官评价指标的参照标准，对两种发酵乳的滋气味，组织状态，色泽进行品评，其评分结果列于表2中。
表2：两种发酵乳在贮藏7d时的感官品评结果
德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6发酵乳贮藏7d后乳清析出少，状 态细腻，拉丝性好，酸味适中，奶油味重，无酸臭味，具有发酵乳特有的香气，综合评定分数略高于商业发酵剂保加利亚乳杆菌L-YC发酵乳，说明德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6发酵乳和商业发酵剂保加利亚乳杆菌L-YC发酵乳相比，感官评价得分差异不显著。
另外，发酵乳的性能可以使用在贮藏期间滴定酸度、脱水收缩性、黏度或蛋白质水解活力进行表征。
在本发明中，滴定酸度应该理解是以酚酞为指示剂，采用滴定分析法测定中和100ml发酵乳所消耗0.1M NaOH溶液的毫升数。采用滴定分析法测定本发明发酵乳的滴定酸度是52.02-67.47°T，这个结果说明发酵乳在贮藏期间后酸化程度较弱，货架期较长。
在本发明中，脱水收缩性应该理解是一种反映发酵乳持水能力强弱的重要指标。低脱水收缩性有利于发酵乳贮存和保形能力，减少乳清析出。所述的脱水收缩性是根据秦南冰等人在《中国乳品工业》，39(2)，37-40.2011中描述的试验方法测定的，本发明发酵乳的脱水收缩性是43.0-47.8％，这个结果说明德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6发酵乳具有较好的持水力。
在本发明中，黏度应该理解是牛乳在其发酵过程中由酪蛋白沉淀及乳酸菌生产胞外多糖而增加的黏度。所述黏度是采用Brookfield DV-1VISCOMETER粘度仪测定的，本发明发酵乳的黏度是516-631cp，在贮藏期间发酵乳黏度呈上升的趋势，说明在贮藏期间德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株能产生胞外多糖，增加发酵乳的黏度。
在本发明中，蛋白水解活力应该理解是这种乳酸菌具有的蛋白水解力。菌株中的蛋白水解酶和肽酶可以降解发酵乳样品中的酪蛋白颗粒，为菌株生长提供必要的短肽和氨基酸，具体参见Peterson,S.D.et al.《Journal of Dairy Science》,73(6),1454-1464.1990。适度的蛋白水解力对改善乳制品风味、质地是必不可少的。蛋白水解活力是根据吕加平、骆承庠在《东北农业大学学报》,30(1)，68-74.1999中描述的邻苯二甲醛(OPA)法测定的，本发明发酵乳在贮藏期间的蛋白水解活力是4.61-8.92mmol/L，说明在贮藏期间该菌株具有较强的蛋白质水解活力。
这些结果充分表明，德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6具有良好的发 酵特性。发酵乳发酵速度快，感官特性好，具有稳定的贮藏特性和质构，是良好的潜在酸乳发酵剂。
根据本发明，所述的发酵乳含有61种酸类、醇类、酮类、醛类或酯类化合物风味物质，其中主要特征风味化合物是乙酸、乙醛、2-庚酮、1-庚醇与甲酸乙烯酯。
德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6发酵乳在发酵和贮藏期间产生的风味物质是采用固相微萃取和色质联用技术分析得到的。数据分析是利用NIST 11标准库自动检索各组分质谱数据，采用面积归一化法计算各组分相对峰面积百分比得到的。
具体地，德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株发酵乳中风味物质检测方法如下：
采用固相微萃取技术对样品进行前处理：将5ml发酵乳样品装入15ml样品瓶中，在温度55℃下平衡10min，然后将老化萃取头(50/30μm DVB/CAR/PDMS)插入样品瓶中，萃取50min，拔出，再插入气相色谱仪进样口，在温度270℃下解吸3min。
气质联用条件：起始温度35℃，并在这个温度下保持5min；相继以4℃/min升温至140℃，并在这个温度下保持5min；再以10℃/min继续升温至250℃，并在这个温度下保持5min。进样口温度270℃；传输线250℃；载气为He，流速1.0mL/min；不分流进样。
质谱条件：电离方式为EI源；电子能量70eV；离子源温度230℃；质量扫描范围m/z40-400AMU；发射电流100μA。
采用50/30μm DVB/CAR/PDMS纤维涂层的萃取头对本发明德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6发酵乳样品进行风味物质富集，利用GC-MS联用技术对发酵和贮藏期间各阶段的挥发性风味物质进行检测分析，在贮藏0d时发酵乳挥发性成分的GC-MS总离子流图见附图2。
利用固相微萃取和色质联用等技术检测分析结果列于表3中。
表3：在发酵和贮藏期间德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6发酵乳挥发性风味物质鉴定结果
注：-表示没有检测到该物质。
本实验共检测出61种挥发性物质，主要包括6种羧酸类化合物、9种醛类化合物、7种酮类化合物、4种酯类化合物、12种醇类化合物、6种碳氢类化合物、7种含氮类化合物、10种杂环类及其它化合物。
I、酸类化合物
本实验共检测出6种酸类化合物，它们分别是乙酸、丁酸、己酸、苯甲 酸、辛酸和正癸酸。乙酸是乳酸菌发酵产生的重要酸类物质之一，在发酵(6h)和贮藏(0、1、3、7、14d)期间其相对含量分别为3.66％、4.01％、4.68％、6.09％、4.91％和7.88％。辛酸具有微弱水果酸味，在发酵(3、6h)和贮藏(0、1、3、7、14d)期间其相对含量分别为0.32％、1.22％、1.8％、1.8％、2.29％、1.55％和2.04％。此外，重要的酸类化合物还有己酸，该化合物在发酵和贮藏期间具有较高的相对含量，对发酵乳的风味影响较大。
II、醛类化合物
本实验共检测出9种醛类化合物，它们分别是乙醛、3-羟基丁醛、3-甲基-正丁醛、正戊醛、正庚醛、庚醛、苯甲醛、2-甲基-十一醛和正壬醛。醛类化合物一般阈值较低，对发酵乳风味构成有重要影响，如在发酵(3、6h)和贮藏(1、3、7、14d)期间检测到庚醛。庚醛具有强烈的油脂味，虽然本实验检测到庚醛的相对含量较低，但对发酵乳整体风味有较大的贡献。在醛类化合物中乙醛是发酵乳中重要的特征风味物质，一般认为，发酵乳中乙醛主要由保加利亚亚种产生。本实验在发酵(6h)贮藏(0、1、3、7、14d)期间检测到乙醛的相对含量分别为11.85％、30.09％、24.13％、9.42％、9.45％和8.22％，远高于其他类醛类化合物，这为德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6发酵乳具有良好风味的提供了理论基础。
III、酮类化合物
本实验共检测出7种醇类化合物，它们分别是2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、苯乙酮、2-壬酮和2-十一烷酮。酮类化合物是由多不饱和脂肪酸经氧化或热降解、氨基酸降解或微生物代谢所产生的。在鉴定的酮类化合物中，2-庚酮具有轻微的药香气味，在发酵(3、6h)贮藏(0、1、3、7、14d)期间检测到2-庚酮的相对含量分别为26.83％、14.62％、11.99％、16.90％、11.53％、14.10％和8.35％，远高于其他类酮类化合物。此外，相对含量较高的酮类化合物还有2-壬酮。2-壬酮具有乳酪、奶香气味，在发酵(3、6h)和贮藏(0、1、3、7)期间其相对含量分别为10.57％、6.34％、4.37％、7.33％、5.51％和4.59％。
IV、酯类化合物
本实验共检测出4种酯类化合物，它们分别是甲酸乙烯酯、(3-甲基丁酯)- 环氧乙烷、丁酸-2-甲基丙酯和戊酸-2-甲基-甲酯。酯类化合物是发酵乳中重要挥发性化合物，具有很低的香味阈值，对发酵乳风味的贡献非常重要。在本实验中检测到的4种酯类化合物中，相对含量较高的有甲酸乙烯酯，其在发酵(3、6h)和贮藏(0、1、3)期间其相对含量分别为2.68％、20.68％、7.92％、6.23％和4.63％。甲酸乙烯酯具有水果和花香味，能极大限度地降低脂肪酸和胺带来的苦味，是发酵乳中重要的风味物质。
V、醇类化合物
本实验共检测出12种醇类化合物，它们分别是(S)-1,3-丁二醇、2-己氧基-乙醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基正乙醇、2-丙基-正丁醇、3-壬烯-1-醇、2,5-二甲基环己醇、2-壬醇、1-壬醇和2-丁基辛醇。在这些醇类化合物中，一些低分子醇在发酵(3、6h)和贮藏(0、1、3、7、14d)期间的相对含量较高，如1-庚醇相对含量分别为5.45％、5.65％、3.75％、5.23％、5.6％、4.9％和3.85％。尽管有很多关于发酵乳中醇类化合物的报道，但至今为止发酵乳中醇类化合物对发酵乳风味的影响机理还不清楚。
VI、碳氢类化合物
本实验共检测出6种碳氢类化合物，它们分别为甲苯、乙苯、对二甲苯、1-十一炔、2-壬炔和正十三烷。其中，重要的碳氢类化合物是甲苯，其在发酵(3、6h)和贮藏(0、1、3、7、14d)期间检测到的相对含量分别为0.39％、0.39％、1.54％、0.48％、0.25％和2.15％。这类化合物在发酵和贮藏期间具有较低的相对含量，对发酵乳的风味影响较低。
VII、含氮类化合物
本实验共检测出7种含氮类化合物，它们分别是二甲胺、甲酰胺、2-甲酰组胺、肼甲酸苄酯、m-苯乙基苯基氰、甲氧基苯肟和3-羟基-2-硝基-1-丁烯。牛乳中的酪蛋白、乳清蛋白以及一些低分子量肽对乳酸菌的生长及其发酵乳整体风味的形成具有促进作用。本实验检测到含氮化合物的种类较少，其中相对含量较高的含氮化合物有甲氧基苯肟，但该化合物对发酵乳风味的影响机理还不清楚。
VIII、杂环及其他类化合物
本实验共检测出10种杂环及其他类化合物，它们分别是环氧乙烷、二 硫乙烷、1-氯己烷、1-氯-正戊烷、正庚丙醚、1,3-二氯苯、氯乙酸壬酯、甘菊环烃、2-丁基四氢噻吩和己酸酸酐。这类化合物在发酵和贮藏期间相对含量较低，对发酵乳的整体风味影响不大。
总之，采用固相微萃取和气质联用法对德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6发酵乳在发酵和贮藏期间不同时间段的挥发性风味物质进行采集和分析，发现发酵乳中挥发性风味成分复杂，在发酵和贮藏期间共鉴定出61种挥发性成分。这些风味化合物可归为酸类、醇类、酮类、醛类、酯类、碳氢类、含氮类、杂环及其他类等八大类香气成分。其中，一些主要的风味化合物如乙酸、乙醛、2-庚酮、1-庚醇、甲酸乙烯酯等，对于构成其特征风味具有重要作用。
[有益效果]
本发明的有益效果是：本发明筛选得到一株可作为发酵乳发酵剂使用的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株MGA17-6，分类命名为Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus MGA17-6。该菌株在发酵和贮藏期间共检测出61种挥发性物质，主要是酸类、醇类、酮类、醛类、酯类等化合物，且一些主要特征风味物质如乙酸、乙醛、2-庚酮、1-庚醇、甲酸乙烯酯等相对含量较高，可作为发酵剂在发酵食品中应用。
使用所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株MGA17-6生产发酵乳、发酵稀奶油，能赋予产品具有一定的酸度和良好的风味，同时延长产品的货架期，改善产品的营养价值，增加产品的安全性。
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)MGA17-6已于2016年09月02日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.12926。
【附图说明】
图1是德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6在MRS培养基上的菌落形态和显微镜下观测的细胞形态；
图2是德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株发酵乳在贮藏0d时挥发性风味组分的总离子流图；
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：使用德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6制备发酵乳
该实施例的实施步骤如下：
A、制备活化培养基
往以重量计10％脱脂粉乳粉培养基中添加以重量计0.1％酵母粉，混合均匀，然后在温度115℃下灭菌7min，得到所述的活化培养基；
B、制备全脂乳粉培养基
往以重量计11.5％全脂乳粉培养基中添加以重量计6.5％蔗糖，然后在温度60℃与压力20MPa的条件下进行均质，接着在温度95℃下灭菌10min，得到所述的发酵培养基；
C、菌种活化
按照以活化培养基重量计2％的接种量，把在温度-80℃下冷冻保藏的德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种到所述的活化培养基中，在温度37℃下培养24h，然后按照以MRS液体培养基重量计2％的接种量，将活化德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下继续培养20h，以同样方式传代培养2次，得到MGA17-6菌株活菌数为1.1×108CFU/g的活化培养物；
D、发酵
按照5×106CFU/mL接种量把步骤C得到的活化培养物接种到所述的发酵培养基中，在温度42℃的条件下发酵直到发酵乳的pH值降低到4.5时，停止发酵，得到所述的发酵乳。
所述的发酵乳在温度4℃条件下贮藏21d时的滴定酸度、脱水收缩性、黏度或蛋白质水解活力分别是62.03°T、46.3％、623cp或8.46mmol/L。
所述发酵乳含有61种风味物质，主要包括酸类、醇类、酮类、醛类或酯类等挥发性风味化合物。其中，主要特征风味化合物有乙酸、乙醛、2-庚酮、1-庚醇、甲酸乙烯酯等。
实施例2：使用德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6制备发酵乳
该实施例的实施步骤如下：
A、制备活化培养基
往以重量计10％脱脂粉乳粉培养基中添加以重量计0.1％酵母粉，混合均匀，然后在温度115℃下灭菌7min，得到所述的活化培养基；
B、制备全脂乳粉培养基
往以重量计11.5％全脂乳粉培养基中添加以重量计6.5％蔗糖，然后在温度60℃与压力20MPa的条件下进行均质，接着在温度95℃下灭菌10min，得到所述的发酵培养基；
C、菌种活化
按照以活化培养基重量计2％的接种量，把在温度-80℃下冷冻保藏的德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种到所述的活化培养基中，在温度37℃下培养24h，然后按照以MRS液体培养基重量计2％的接种量，将活化德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下继续培养22h，以同样方式传代培养3次，得到MGA17-6菌株活菌数为1.4×108CFU/g的活化培养物；
D、发酵
按照5×106CFU/mL接种量把步骤C得到的活化培养物接种到所述的发酵培养基中，在温度42℃的条件下发酵直到发酵乳的pH值降低到4.5时，停止发酵，于是得到所述的发酵乳。
所述发酵乳在温度4℃条件下贮藏21d时的滴定酸度、脱水收缩性、黏度或蛋白质水解活力分别是64°T、46.8％、629cp或8.79mmol/L。
所述发酵乳含有61种风味物质，主要包括酸类、醇类、酮类、醛类或酯类等挥发性风味化合物。其中，主要特征风味化合物有乙酸、乙醛、2-庚酮、1-庚醇、甲酸乙烯酯等。
实施例3：使用德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6制备发酵乳
该实施例的实施步骤如下：
A、制备活化培养基
往以重量计10％脱脂粉乳粉培养基中添加以重量计0.1％酵母粉，混合均匀，然后在温度115℃下灭菌7min，得到所述的活化培养基；
B、制备全脂乳粉培养基
往以重量计11.5％全脂乳粉培养基中添加以重量计6.5％蔗糖，然后在温度60℃与压力20MPa的条件下进行均质，接着在温度95℃下灭菌10min，得到所述的发酵培养基；
C、菌种活化
按照以活化培养基重量计2％的接种量，把在温度-80℃下冷冻保藏的德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种到所述的活化培养基中，在温度37℃下培养24h，然后按照以MRS液体培养基重量计2％的接种量，将活化德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下继续培养24h，以同样方式传代培养3次，得到MGA17-6菌株活菌数为1.2×108CFU/g的活化培养物；
D、发酵
按照5×106CFU/mL接种量把步骤C得到的活化培养物接种到所述的发酵培养基中，在温度42℃的条件下发酵直到发酵乳的pH值降低到4.5时，停止发酵，得到所述的发酵乳。
所述发酵乳在温度4℃条件下贮藏21d时的滴定酸度、脱水收缩性、黏度或蛋白质水解活力分别是67.47°T、47.8％、631cp或8.92mmol/L。
所述发酵乳含有61种风味物质，主要包括酸类、醇类、酮类、醛类或酯类等挥发性风味化合物。其中，主要特征风味化合物有乙酸、乙醛、2-庚酮、1-庚醇、甲酸乙烯酯等。
实施例4：使用德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6制备发酵稀奶油
该实施例的实施步骤如下：
A、菌种活化
按照以脱脂粉乳粉培养基重量计2％的接种量，把在温度-80℃下冷冻保藏的德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种到脱脂粉乳粉培养基中，然后在温度37℃的条件下活化培养24h，再按照以MRS液体培养基重量计2.5％的接种量，将上述活化德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种于MRS液体培养基中，在温度37℃的条件下培养24h，以同样方式传代培养3次，得到MGA17-6菌株活菌数为1.5×108CFU/g的活化培养物；
B、均质
将目前市场上销售的稀奶油预热到60℃使脂肪液化，然后在温度60℃与20MPa的条件下进行均质；
C、发酵
让在步骤B得到的均质稀奶油在温度95℃下杀菌5min，再冷却至温度20℃，然后按照5×106CFU/mL接种量把步骤A活化培养物加到冷却的稀奶油中，在温度32℃的条件下发酵6h，再在温度6℃的条件下贮藏，得到所述的发酵稀奶油。

Claims (6)

1.一株德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)MGA17-6，该菌株已于2016年09月02日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCCNo.12926。
2.根据权利要求1所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6在制备乳类发酵制品中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于所述的乳类发酵制品是发酵乳或发酵稀奶油。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于所述发酵乳的制备步骤如下：
A、制备活化培养基
往以重量计10％脱脂乳粉培养基中添加以重量计0.1％酵母粉，混合均匀，然后在温度115℃下灭菌7min，得到所述的活化培养基；
B、制备发酵培养基
往以重量计11.5％全脂乳粉培养基中添加以重量计6.5％蔗糖，然后在温度60℃与压力20MPa的条件下进行均质，接着在温度95℃下灭菌10min，得到所述的发酵培养基；
C、菌种活化
按照以活化培养基重量计2％的接种量，把在温度-80℃下冷冻保藏的德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种到所述的活化培养基中，在温度37℃下培养24h，然后按照以MRS液体培养基重量计2％的接种量，将活化德氏乳杆菌保加利亚亚种MGA17-6菌株接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下继续培养20～24h，以同样方式传代培养2～3次，得到MGA17-6菌株活菌数为108CFU/g以上的活化培养物。
D、发酵
按照5×106CFU/mL接种量把步骤C得到的活化培养物接种到所述的发酵培养基中，在温度42℃的条件下发酵直到发酵乳的pH值降低到4.5时，停止发酵，于是得到所述的发酵乳。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于在步骤D中，在温度42℃条件下发酵至发酵乳pH值为4.5的时间是14.0h。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于所述的乳是牛乳、羊乳、马乳或骆驼乳。
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