CN103261401A - 用细菌菌株的混合物发酵乳源进行多风味形成的风味调节 - Google Patents

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Abstract

发酵乳源来制备具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味的发酵乳产品。通过加入乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4404）或乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4405）来达到发酵。还向乳源中加入另一细菌乳酸乳球菌乳酸亚种变种（Lactococcus lactis subsp.lactis biovar）。乳源在发酵前包含氨基酸和柠檬酸盐。

Description

用细菌菌株的混合物发酵乳源进行多风味形成的风味调节
相关申请的交叉参考
无
技术领域
本发明涉及在基于乳的产品(milk-based product)中风味和香味的产生。在发酵乳源的过程中用细菌菌株来达到在基于乳的产品中产生风味和香味。
背景技术
发酵是用细菌菌株来将糖类转化为有机酸或其他化合物。
发酵乳产品是主要的消费品。发酵乳产品可以是例如干酪、酪乳和酸奶。通过发酵乳源来制备发酵乳产品。
乳源（例如牛奶）包含糖类乳糖。在发酵乳源的过程中，细菌菌株发酵糖类乳糖来产生乳酸。在制备发酵乳产品的过程中，乳酸的产生导致乳源的酸化。在发酵乳源的过程中，存在于乳源中的其他物质和细菌菌株之间可以发生其他反应。
细菌菌株对乳源的发酵负责在发酵乳产品中产生风味和香味。此外，细菌菌株对乳源的发酵增加了发酵乳产品的货架期。
用来发酵乳源的细菌菌株可以是乳酸菌菌株。乳酸菌菌株包括乳杆菌属（Lactobacillus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、片球菌属（Pediococcus）、乳球菌属（Lactococcus）和链球菌属（Streptococcus）；以及较为次要的气球菌属（Aerococcus）、肉杆菌属（Carnobacterium）、肠球菌属（Enterococcus）、酒球菌属（Oenococcus）、芽孢乳杆菌属（Sporolactobacillus）、Teragenococcus、漫游球菌属（Vagococcus）和Weisella；这些乳酸菌菌株隶属于乳杆菌目（Lactobacillales）。
申请人雀巢产品技术援助有限公司(Nestec SA)的国际专利申请公开号WO2008/049581标题为“通过乳产品中的生物转化调节味道和风味（Tasteand flavour modulation by biotransformation in milk products）”。国际专利申请公开号WO2008/049581公开了促进食品中的非开胃(non-savoury)风味的方法。
申请人新西兰奶牛协会（New Zealand Dairy Board）的国际专利申请公开号WO02/085131标题为“通过蛋白质的发酵制备开胃风味产品的方法（Method of preparing savoury-flavoured products by fermentation ofproteins）”。国际专利申请公开号WO02/085131公开了用两种不同细菌菌株的组合来从蛋白质源制备开胃风味产品的方法。该蛋白质源可以是植物大豆、小麦、稻、乳或乳清。第一菌株选自巨球菌属（Macrococcus）、微球菌属（Micrococcus）、肠球菌属、葡萄球菌属（Staphylococcus）、短杆菌属（Brevibacterium）、节杆菌属（Anthrobacter）和棒杆菌属（Corynebacterium），优选溶酪巨球菌（Macrococcus caseolyticus）。第二菌株选自乳酸菌——乳球菌属、乳杆菌属、片球菌属或明串珠菌属。该开胃风味产品可以与其他成分组合来形成诸如干酪、蛋白质-水凝胶、酸奶、奶油、牛奶蛋糊、调味汁和糖果产品的产品。
申请人荷兰乳品研究所（Nizo Food Research）的国际专利申请公开号WO02/00845标题为“通过培养多种食品级微生物增加食品中的风味产生或食品相关的风味产生（Enhanced flavour production in or relating tofood by cultivation of various food grade micro-organisms）”。国际专利申请公开号WO02/00845公开了两种或多种微生物菌株的新的混合培养物，其中包含在该混合培养物中的微生物菌株中的至少一种根据其进行部分酶促途径的能力单独选择，且该两种或多种所选择的微生物菌株一起形成通向希望的风味成分的完整途径。该混合培养物是用于产生诸如酸奶或干酪或香肠(sausage)的发酵产品的培养物。该两种或多种微生物菌株优选共培养。具体和优选的实施方案是用于制备干酪的起子培养物。混合培养物分别包含多种乳球菌属菌株的组合及短杆菌属菌株和葡萄球菌属菌株的组合。
Monnet等在Journal of Microbiological Methods37(1999)，第183-185页中的文章标题为“用于筛选产生α-乙酰乳酸的突变体的改进方法(Animproved method for screening alpha-acetolactate producing mutants)”。Monnet等的文章公开了乳产品产业中用细菌菌株乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（Lactococcus Lactis ssp.Lactis Biovar.Diacetylactis）来产生丁二酮(diacetyl)。丁二酮是培养乳产品中的主要风味化合物。
Boumerdassi等在Journal of Dairy Science第80卷第4期(1997)634-639页中的文章标题为“柠檬酸盐对在氧气存在下培养的乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus Lactis ssp.Lactis）CNRZ483产生丁二酮和3-羟基-2-丁酮的作用（Effect of citrate on production of diacetyl and acetoin byLactococcus Lactis ssp.Lactis CNRZ483cultivated in the presence ofoxygen）”。Monnet等的文章公开了柠檬酸三钠的加入对乳酸乳球菌乳酸亚种CNRZ483在基于乳清的培养基中的生长及丁二酮和3-羟基-2-丁酮的形成的作用。
Mutukumira等(2009)Milchwissenschaft64(1)，第26-29页的文章“分离自天然发酵乳的乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种(Lactococcus lactissubsp.lactis biovar.diacetylactis)C1菌株产生麦芽味化合物的特征（Characterisation of a malty-compound producing Lactococcus lactissubsp.lactis biovar.diacetylactis C1 strain isolated from naturallyfermented milk）”涉及产生感官评价小组可接受的发酵乳的菌株，尽管存在轻微的麦芽风味。
Hugenholtz和Starrenburg(1992)Appl.Microbiol.Biotechnol38,第17-22页的文章“乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种和明串珠菌属某种的不同菌株的丁二酮产生（Diacetyl production by different strains ofLactococcus lactis subsp.lactis biovar.diacetylactis and Leuconostoc spp.）”涉及用于在乳培养物中从柠檬酸盐形成产物的几种菌株的比较。
取决于乳源及用于发酵乳源的乳酸菌菌株，发酵乳产品具有多种风味和香味。但是，由于许多乳酸菌菌株及其与个体的相互作用，选择某些乳酸菌菌株来在发酵乳产品中产生某些风味和香味是不可预测的。
存在提供在发酵乳产品中负责特定风味和香味的方法和乳酸菌菌株的需要。
此外，消费者对人造添加剂具有负面理解。存在以避开人造添加剂的天然方式提供风味和香味的需要。
还存在提供可以用于广范围的食物的风味和香味的需要。
因此，本领域存在克服前述问题的需要。
发明概述
在第一方面，本发明涉及乳酸菌乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（Lactococcus lactis subsp.lactis diacetylactis）（CNCM No.I-4404）与乳酸菌乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）的组合。
在另一方面，本发明涉及乳酸菌乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCMNo.I-4405）与乳酸菌乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）的组合。
在另一方面，本发明涉及前述组合中的任一个在赋予乳源至少麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味中的用途。
在另一方面，本发明涉及用于制备发酵乳产品的方法。该发酵乳产品至少具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味。该方法包括提供乳源，然后形成补充了氨基酸的乳源，并加入柠檬酸三钠。然后加入乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4404）或乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4405）。然后加入乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCMNo.I-1962）来形成混合物；最后发酵该混合物来制备发酵乳产品。
在另一方面，本发明涉及可通过该方法获得的至少具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味的发酵乳产品。
在另一方面，本发明涉及用于哺乳动物消费的产品，其包含该发酵乳产品的。
在另一方面，本发明涉及包含乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4404）和乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）的食品，或包含乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4405）和乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）的食品，其中该食品包含丁二酮、3-羟基-2-丁酮和4-二羟基-3,4-二甲基-2,5-己二酮中的至少一种及2-甲基丙醛、2/3-甲基丁醛、苯乙醛和2/3-甲基丁醇中的至少一种。
本发明人惊奇地发现，细菌菌株的这种独特组合负责为发酵乳产品提供这种风味和香味谱。
发明详述
为了充分理解本发明及其优势，参考以下发明详述。
应理解，本发明的多种方面仅是说明实施和使用本发明的具体方式。
考虑权利要求和以下发明详述时，本发明的多种方面可以与本发明的其他方面组合，且不限制本发明的范围。
本发明涉及发酵乳产品。通过用乳酸菌混合物发酵乳源来为发酵乳产品提供风味和香味，以制备该发酵乳产品。
该乳酸菌混合物可以是乳酸菌乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCMNo.I-4404）与乳酸菌乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）的组合。
该乳酸菌混合物还可以是乳酸菌乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCMNo.I-4405）与乳酸菌乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）的组合。
乳酸菌乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4404）和乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4405）已于2010年11月25日保藏于法国微生物保藏中心（Institut Pasteur-Collection Nationale de Cultures deMico-organisme（CNCM））。
乳酸菌乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）已于1997年保藏于法国微生物保藏中心（Institut Pasteur–Collection Nationale deCultures de Mico-organisme（CNCM））。
乳源可以是任意类型的乳；如奶牛乳、绵羊乳、山羊乳和水牛乳或其任意混合物。乳源可以是UHT处理乳、巴氏灭菌乳或非巴氏灭菌乳。乳源可以是全脂乳、脱脂乳或半脱脂乳。此外，乳源可以是鲜乳、复原乳和含植物脂肪的乳及其任意混合物。
氨基酸转化为挥发性风味和香味化合物在食品技术中发挥重要作用。可以通过乳酸菌混合物来达到氨基酸转化为挥发性风味和香味化合物。因此，存在用氨基酸补充乳源的需要。这就是说，除天然存在于乳源中的任意氨基酸外，向乳源中补充氨基酸。为了补充乳源，向乳源中加入一种或多种氨基酸、蛋白酶或肽酶或其任意混合物中的至少一种。该氨基酸是L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸中的至少一种。该肽酶优选是作为酶制剂（例如由米曲霉（Aspergillus oryzae）、大豆曲霉（Aspergillussojae）、Rhizophus oryzae、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、Ananas comosus产生）或作为具有外蛋白水解活性的微生物菌株（例如瑞氏乳杆菌（L.helveticus）、嗜热链球菌（S.thermophilus）、植物乳杆菌（L.plantarum）、乳酸乳杆菌（L.lactis）亚种）应用的外肽酶。
氨基酸转化为挥发性风味和香味化合物，其是下文讨论的蜂蜜样、麦芽样或巧克力样挥发性风味和香味化合物。
可以在无一种或多种氨基酸或有氨基酸的情况下加入肽酶或蛋白酶。按0.01-5wt%、优选0.01-2wt%的量，更优选按0.03-1.0wt%、最优选0.05-0.3wt%的量向乳源中加入一种或多种氨基酸、蛋白酶或肽酶或其任意混合物中的至少一种。
柠檬酸盐转化为挥发性风味和香味化合物也在食品技术中发挥重要作用。可以通过乳酸菌混合物来达到柠檬酸盐向挥发性风味和香味化合物的转化。因此，存在用柠檬酸盐化合物（例如柠檬酸三钠）补充乳源的需要。
柠檬酸盐在发酵过程中转化为挥发性风味和香味化合物。该挥发性风味和香味化合物至少具有下文讨论的奶油样风味和香味。
按0.01-5wt%、优选0.01-2wt%的量，更优选按0.03-1.0wt%、最优选0.05-0.3wt%的量向乳源中加入柠檬酸三钠。
还可以在发酵前或在发酵过程中向乳源中加入脂肪酶来在发酵乳产品中产生增强的风味和香味。脂肪酶水解乳源中的脂肪来形成例如甘油二酯、甘油单酯和游离脂肪酸或其任意混合物。甘油二酯、甘油单酯和游离脂肪酸赋予发酵乳产品奶油样风味。因此，脂肪酶的使用增强了发酵乳产品中的奶油样风味。
还可以在发酵前或在发酵过程中向乳源中加入乳糖酶来在发酵乳产品中产生增强的风味和香味。乳糖酶将乳源中的二糖乳糖水解为半乳糖和葡萄糖。葡萄糖和半乳糖用作用于焦糖样和增甜浓缩乳样风味形成的风味前体。
如果乳源是非巴氏灭菌乳，则可以将乳源或补充乳源巴氏灭菌、进行超高温处理（UHT乳）或在本领域已知的条件下灭菌。巴氏消毒、超高温处理和灭菌在70℃至150℃的温度范围内进行2秒至20分钟的时间。备选地，乳源可以在成为补充乳源之前进行热处理。
一旦用氨基酸补充了乳源，即加入柠檬酸三钠。然后加入乳酸菌混合物来形成混合物。加入这些成分的顺序并不重要，重要的是所有成分都存在于混合物中。
然后发酵混合物来制备发酵乳产品。发酵乳产品令人惊奇地具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味。使发酵在约30℃的温度下进行6至24个小时。
还可以在发酵前或在发酵步骤过程中加入改善发酵的辅因子，如α-酮戊二酸、锰盐或镁盐。
取决于乳源，应理解，具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味的发酵乳产品可以是浆液（酸奶样）或液体的形式。
可以干燥或浓缩具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味的发酵乳产品。可以优选通过喷雾干燥来干燥具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味的发酵乳产品，然后转化为粉末。
具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味的发酵乳产品可以在食品中及在制备食品的过程中具有应用。例如，具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味的粉末可以在饮料产业中具有应用，以赋予饮料麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味。此外，具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味的粉末可以在食品产业中具有应用，以赋予食品原料麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味。
实施例
通过基于质谱分析法及偶联质谱分析法的气相层析（GC-MS）的电子鼻来分析所制备的具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味的发酵乳产品。
基于质谱分析法的电子鼻分析是直接分析法，其中将发酵乳产品直接放入离子源而无需进行分离流程，因此节约时间。来自这类得到的质谱的挥发性物质的测定包含用于鉴定香味成分的有限信息。在无之前的分离和选择性片段化（即GC-MS）的情况下，不可能明确鉴定所存在的单种化合物。
偶联质谱分析法的气相层析（GC-MS）提供了挥发性物质的必要的分离和检测。用GC-MS来获得属于特定香味成分的MS片段。通过与嗅觉测量法组合的GC-MS来明确鉴定分子是分析具有特定气味的挥发性物质的强制性要求。
用于从发酵乳产品分离挥发性物质的常用萃取方法是真空蒸馏，然后溶剂萃取，吹扫和捕集（PT）及顶空技术，如顶空固相微萃取（HS-SPME）。吹扫和捕集（PT）及顶空技术法鉴定具有不同收率表现，但具有可比再现性的挥发性物质。PT似乎更灵敏，而SPME是更快且更便宜的技术。
在使用试剂时，除非另有说明，按收到的原样使用而无之前的处理。
实施例1
A-乳酸菌-细菌混合物的复活
在无菌条件下用1ml复原乳复活安瓿中的乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4404），转入含有9ml复原乳的无菌玻璃管中，并在有氧条件下30℃避光孵育24小时。然后将细菌于6℃保存两周，随后按0.5%（（v/v）0.05/10ml培养基）接种在培养物中。培养物为M17x（M17TerzaghiBouillon,Merck1.15029和5g/l葡萄糖（Merck8342））。生长期（3天）后，将培养瓶保存于6℃，以形成复活的乳酸菌。
在无菌条件下用1ml复原乳复活安瓿中的乳酸菌乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962），转入含有9ml复原乳的无菌玻璃管中，并在有氧条件下30℃避光孵育24小时。然后将乳酸菌乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）于6℃保存两周，随后按0.5%（（v/v）0.05/10ml培养基）接种在培养物中。培养物为M17x（M17TerzaghiBouillon,Merck1.15029和5g/l葡萄糖（Merck8342））。生长期（3天）后，将培养瓶保存于6℃，以形成复活的乳酸菌。
通过按1:1的比例混合以上两种复活的乳酸菌来制备乳酸菌混合物。
备选地，培养物可以是脱脂乳。
B-用柠檬酸三钠和氨基酸补充乳源
制备100mM柠檬酸三钠水溶液。将柠檬酸三钠溶液滤过0.45μm的孔径（Schleicher&Schuell,Whatmann,FP30/0.45μm,最大7巴，CA-S）。
制备100mM浓度的氨基酸溶液。将L-苯丙氨酸（Fluka,Buchs,瑞士）（1.65g/100ml）、L-亮氨酸（Merck,Darmstadt,德国）（1.31g/100ml）、L-异亮氨酸（Merck,Darmstadt,德国）（1.31g/100ml）、L-缬氨酸（Merck,Darmstadt,德国）（1.17g/100ml）溶解在无菌水中。将氨基酸溶液滤过0.45μm的孔径（Schleicher&Schuell,Whatmann,FP30/0.45μm,最大7巴，CA-S）。
向4.5ml UHT乳中加入250μl柠檬酸三钠溶液，并加入250μl氨基酸溶液。
C-发酵
通过两种方法（I-II）来进行UHT乳中的发酵。
I：未补充的UHT乳中挥发性化合物片段的Index（针管内动态萃取；Hamilton）顶空取样。
II：补充乳源UHT乳中挥发性化合物的Tenax（累积吸附剂,Marin-Epagnier,瑞士）顶空取样。
在无菌条件下将50μl乳酸菌混合物的整分试样转入5ml补充乳源UHT乳（1%接种），并在有氧条件下30℃避光孵育22小时。
顶空管中加入2.8g NaCl有助于将挥发性物质从发酵乳产品挤入顶空来获得挥发性物质的更强烈释放。
对于未补充的UHT乳（即无柠檬酸三钠）的实验，电子鼻在m/z40-100的范围内检测挥发性化合物片段，对于补充UHT乳（即含柠檬酸三钠）的实验，电子鼻在m/z10-160的范围内检测挥发性化合物片段。
用软件程序“The Unscrambler”（9.7版）计算主成分分析（PCA）。用对数化的原始数据计算结果，并排除水和乳空白。纳入所有变量（MS片段）进行计算来就相似的MS片段模式和化合物丰度分组菌株。
D-电子鼻测量
进行了补充乳源UHT乳中的发酵乳产品的电子鼻测量分析。II：补充UHT乳的Tenax顶空测量。GC-MS片段[M]+为27、29、43、45、60、70、86、87、88和135。
E-发酵乳产品的感官评估
发酵后，保持玻璃管密封，直至开始感官评价。七人参加了发酵乳产品的感官评估。感官评估基于以下特性，用X标注得分。提供空白样品（孵育乳）作为参考。为了测试柠檬酸三钠的影响，还制备了不含柠檬酸三钠（仅加入无菌水）的样品，并提供给评估小组。下文显示结果，其中X表示评估小组成员对发酵乳产品的感官知觉。
Figure BDA0000337716560000101
Figure BDA0000337716560000111
发酵乳产品的感官评估结果证明，发酵乳产品具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味。
麦芽风味和香味可以归因于通过电子鼻测量测定的2-甲基丙醛、2/3-甲基丁醛、苯乙醛和2/3-甲基丁醇的存在。黄油/奶油风味和香味是由于存在丁二酮、3-羟基-2-丁酮和3,4-二羟基-3,4-二甲基-2,5-己二酮。细菌菌株的组合负责发酵乳产品中的总体风味和香味。
实施例2
A-乳酸菌-细菌混合物的复活
在无菌条件下用1ml复原乳复活安瓿中的乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4405），转入含有9ml复原乳的无菌玻璃管中，并在有氧条件下30℃避光孵育24小时。然后将细菌于6℃保存两周，随后按0.5%（（v/v）0.05/10ml培养基）接种在培养物中。培养物为M17x（M17TerzaghiBouillon,Merck1.15029和5g/l葡萄糖（Merck8342））。生长期（3天）后，将培养瓶保存在6℃，以形成复活的乳酸菌。
在无菌条件下用1ml复原乳复活安瓿中的乳酸菌乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962），转入含有9ml复原乳的无菌玻璃管中，并在有氧条件下30℃避光孵育24小时。然后将乳酸菌乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）于6℃保存两周，随后按0.5%（（v/v）0.05/10ml培养基）接种在培养物中。培养物为M17x（M17TerzaghiBouillon,Merck1.15029和5g/l葡萄糖（Merck8342））。生长期（3天）后，将培养瓶保存于6℃，以形成复活的乳酸菌。
备选地，培养物可以是脱脂乳。
通过按1:1的比例混合以上两种复活的乳酸菌来制备乳酸菌混合物。
B-用柠檬酸三钠和氨基酸补充乳源
制备100mM柠檬酸三钠水溶液。将柠檬酸三钠溶液滤过0.45μm的孔径（Schleicher&Schuell,Whatmann,FP30/0.45μm,最大7巴，CA-S）。
制备100mM浓度的氨基酸溶液。将L-苯丙氨酸（Fluka,Buchs,瑞士）（1.65g/100ml）、L-亮氨酸（Merck,Darmstadt,德国）（1.31g/100ml）、L-异亮氨酸（Merck,Darmstadt,德国）（1.31g/100ml）、L-缬氨酸（Merck,Darmstadt,德国）（1.17g/100ml）溶解在无菌水中。将氨基酸溶液滤过0.45μm的孔径（Schleicher&Schuell,Whatmann,FP30/0.45μm,最大7巴，CA-S）。
向4.5ml UHT乳中加入250μl柠檬酸三钠溶液，并加入250μl氨基酸溶液。
C-发酵
通过两种方法（I-II）来进行UHT乳中的发酵。
I：未补充的UHT乳中挥发性化合物片段的Index（针管内动态萃取；Hamilton）顶空取样。
II：补充UHT乳源中挥发性化合物的Tenax（累积吸附剂,Marin-Epagnier,瑞士）顶空取样。
在无菌条件下将50μl乳酸菌混合物的整分试样转入5ml补充乳源UHT乳（1%接种），并在有氧条件下30℃避光孵育22小时。
顶空管中加入2.8g NaCl有助于将挥发性物质从发酵乳产品挤入顶空来获得挥发性物质的更强烈释放。
对于未补充的UHT乳的实验，电子鼻在m/z40-100的范围内检测挥发性化合物片段，对于补充UHT乳的实验，电子鼻在m/z10-160的范围内检测挥发性化合物片段。
用软件程序“The Unscrambler”（9.7版）计算主成分分析（PCA）。用对数化的原始数据计算结果，并排除水和乳空白。纳入所有变量（MS片段）进行计算来就相似的MS片段模式和化合物丰度分组菌株。
D-电子鼻测量
进行了补充乳源UHT乳中的发酵乳产品的电子鼻测量分析。II：补充UHT乳的Tenax顶空测量。GC-MS片段[M]+为43、55、71、77、60、88、89、99、114、120和131。
E-发酵乳产品的感官评估
细菌发酵后，保持玻璃管密封，直至开始感官评价。七人参加了发酵乳产品的感官评估。感官评价是为了得到关于所获得的发酵乳产品的口感和味道的信息的味道评价。
每种情况下，对样品进行巴氏灭菌（水浴中85℃15分钟），并在UHT乳中稀释至1%（在20-25℃的温度下）。下表中显示的结果详细说明了评估小组成员的结论。
评估小组成员 空白孵育的UHT乳 发酵乳产品
1 轻微乳样 麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油
2 乳样，UHT乳 麦芽-巧克力-蜂蜜-奶油
3 微酸 麦芽-蜂蜜-黄油-奶油
4 乳样，轻微 麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油
5 乳样 麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油
6 乳样，脂肪 麦芽-蜂蜜-黄油-奶油
7 奶粉，甜 麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油
发酵乳产品的感官评估结果证明，发酵乳产品主要具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油样风味和香味。
麦芽风味和香味可以归因于通过电子鼻测量测定的2-甲基丙醛、2/3-甲基丁醛、苯乙醛和2/3-甲基丁醇的存在。黄油/奶油风味和香味主要是由于存在丁二酮、3-羟基-2-丁酮和3,4-二羟基-3,4-二甲基-2,5-己二酮。细菌菌株的组合负责发酵乳产品中的总体风味和香味。
实施例3
A-乳酸菌-细菌混合物的复活
见实施例2
B-用柠檬酸三钠和氨基酸补充乳源
制备100mM柠檬酸三钠水溶液。将柠檬酸三钠溶液滤过0.45μm的孔径（Schleicher&Schuell,Whatmann,FP30/0.45μm,最大7巴，CA-S）。
制备100mM浓度的氨基酸溶液。氨基酸溶液由L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸组成。通过将氨基酸溶解在无菌水中来制备溶液。将氨基酸溶液滤过0.45μm的孔径（Schleicher&Schuell,Whatmann,FP30/0.45μm,最大7巴，CA-S）。
向4.5ml UHT乳中加入250μl柠檬酸三钠溶液，并加入250μl氨基酸溶液。
C-发酵
通过两种方法（I-II）来进行UHT乳中的发酵。
I：未补充的UHT乳中挥发性化合物片段的Index（针管内动态萃取；Hamilton）顶空取样。
II：补充UHT乳源中挥发性化合物的Tenax（累积吸附剂,Marin-Epagnier,瑞士）顶空取样。
在无菌条件下将50μl乳酸菌混合物的整分试样转入5ml补充乳源UHT乳（1%接种），并在有氧条件下30℃避光孵育18小时。
顶空管中加入2.8g NaCl有助于将挥发性物质从发酵乳产品挤入顶空来获得挥发性物质的更强烈释放。
对于未补充的UHT乳的实验，电子鼻在m/z40-100的范围内检测挥发性化合物片段，对于补充UHT乳的实验，电子鼻在m/z10-160的范围内检测挥发性化合物片段。
用软件程序“The Unscrambler”（9.7版）计算主成分分析（PCA）。用对数化的原始数据计算结果，并排除水和乳空白。纳入所有变量（MS片段）进行计算来就相似的MS片段模式和化合物丰度分组菌株。
D-电子鼻测量
进行了补充乳源UHT乳中的发酵乳产品的电子鼻测量分析。II：补充UHT乳的Tenax顶空测量。GC-MS片段[M]+为43、55、71、77、60、88、89、99、114、120和131。
E-发酵乳产品的感官评估
细菌发酵后，保持玻璃管密封，直至开始感官评价。七人参加了发酵乳产品的感官评估。感官评价是为了得到关于所获得的发酵乳产品的口感和味道的信息的味道评价。
每种情况下，对样品进行巴氏灭菌（水浴中85℃15分钟），并在UHT乳中稀释至1%（在20-25℃的温度下）。下表中显示的结果详细说明了评估小组成员的结论。
评估小组成员 空白孵育的UHT乳 发酵乳产品
1 轻微乳样 麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油
2 乳样，UHT乳 巧克力-蜂蜜-奶油
3 微酸 麦芽-蜂蜜-黄油-奶油
4 乳样，轻微 麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油
5 乳样 麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油
6 乳样，脂肪 麦芽-蜂蜜-黄油-奶油
7 奶粉，甜 麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油
发酵乳产品的感官评估结果证明，发酵乳产品主要具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油样风味和香味。
麦芽风味和香味可以归因于通过电子鼻测量测定的2-甲基丙醛、2/3-甲基丁醛、苯乙醛和2/3-甲基丁醇的存在。黄油/奶油风味和香味是由于存在丁二酮、3-羟基-2-丁酮和3,4-二羟基-3,4-二甲基-2,5-己二酮。细菌菌株的组合负责发酵乳产品中的总体风味和香味。
已这样详细描述了本发明，应理解，本详述并非旨在限制本发明的范围。
以下权利要求中显示希望通过专利证书来保护的内容。
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仅供受理局使用
Figure BDA0000337716560000181
仅供国际局使用
0-5 该表格由国际局接受于：
0-5-1 授权官员

Claims (14)

1.乳酸菌乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4404）与乳酸菌乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）的组合或乳酸菌乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4405）与乳酸菌乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）的组合。
2.权利要求1的组合的用途，用于赋予乳源至少麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味。
3.用于制备至少具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味的发酵乳产品的方法，其包括：
-提供乳源；
-形成补充了氨基酸的乳源，并可选地加入柠檬酸盐；
-加入乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4404）或乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4405）；
-加入乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）来形成混合物；和
-发酵所述混合物来制备所述发酵乳产品。
4.权利要求3的方法，其中形成所述补充了氨基酸的乳源包括向所述乳源中加入至少一种氨基酸、加入蛋白酶或加入肽酶中的至少一种。
5.权利要求4的方法，其中所述至少一种氨基酸选自L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸。
6.权利要求3至5中任一项的方法，其进一步包括浓缩所述发酵乳产品，并形成发酵乳产品浓缩物。
7.权利要求3至6中任一项的方法，其进一步包括干燥所述发酵乳产品或发酵乳浓缩物，并形成粉末。
8.权利要求3至7中任一项的方法，其中所述乳源选自全脂乳、脱脂乳、半脱脂乳、鲜乳、复原乳、奶油、酪乳、乳清及含植物脂肪的乳。
9.权利要求3至8中任一项的方法，其进一步包括向所述乳源中加入脂肪酶和乳糖酶中的至少一种。
10.权利要求3至9中任一项的方法，其进一步包括向所述乳源中加入发酵辅因子。
11.权利要求2至10中任一项的方法，其中就所述乳源而言，所述柠檬酸盐和所述氨基酸的总量在0.01至5wt%之间。
12.至少具有麦芽-巧克力-蜂蜜-黄油-奶油风味和香味的发酵乳产品，其通过权利要求3至11中任一项的方法获得。
13.用于哺乳动物消费的产品，其包含权利要求12的发酵乳产品。
14.包含乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4404）和乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）的食品或包含乳酸乳球菌乳酸丁二酮亚种（CNCM No.I-4405）和乳酸乳球菌乳酸亚种丁二酮变种（CNCM No.I-1962）的食品，其中所述食品包含丁二酮、3-羟基-2-丁酮和4-二羟基-3,4-二甲基-2,5-己二酮中的至少一种，及2-甲基丙醛、2/3-甲基丁醛、苯乙醛和2/3-甲基丁醇中的至少一种。
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