JP7335077B2 - 増大した天然の甘味を有する発酵食品を調製するための乳酸菌の使用 - Google Patents
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Description
本発明は、ラクトースの分解によって形成された高レベルのグルコースの分泌による甘味料特性を有するストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)菌株及び培養物、ラクトースの分解によって形成された高レベルのグルコースの分泌による甘味料特性を有するラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)菌株、当該菌株を含むスターター培養物 (starter cultures)、並びに前記培養を用いて発酵させた乳製品に関する。また、本発明は、当該菌株の獲得方法、並びに発酵乳製品の調製のため、及び発酵乳製品のラクトース含有量を減少させると同時に、発酵乳製品の甘味を増大させるためのそうした菌株の使用に関する。
不純物が入っていない発酵乳製品は、発酵中の乳酸菌によるラクトースの乳酸への変換の結果、刺激性の味又は酸っぱい味によって見分けられる。そのため、それらは、より甘い味の製品を求める購入者の願望を叶えるために、果物、はちみつ、糖又は人工甘味料の添加によって甘味が加えられることが多い。
本明細書中で使用される場合、「乳酸菌」という用語は、糖の発酵において主に産生される酸として乳酸、酢酸及びプロピオン酸を含む酸を産生する、グラム陽性微小好気性又は嫌気性細菌を指す。産業上最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス亜種(Lactococcus spp.)、ストレプトコッカス亜種(Streptococcus spp.)、ラクトバチルス亜種(Lactobacillus spp.)、ロイコノストック亜種(Leuconostoc spp.)、ペディオコッカス亜種(Pediococcus spp.)、ブレビバクテリウム亜種(Brevibacterium spp.)、エンテロコッカス亜種(Enterococcus spp.)及びプロピオニバクテリウム亜種(Propionibacterium spp.)を含む目である「ラクトバチルス目(Lactobacillales)」に属する。ラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)及びストレプトコッカス・サーモフィルスから成る属の細菌を含めた乳酸菌は、発酵乳製品などの酪農製品の生産のために発酵容器やバット内でそのままインキュベーションすることを意図した、バルクスターター繁殖(bulk starter propagation)のための冷凍若しくは凍結乾燥培養株、又はいわゆるダイレクトバットセット(Direct Vat Set)(DVS)培養株のいずれかとして通常、酪農業界に供給される。そのような培養株は、一般に、「スターター培養株」又は「スターター」と称される。
又は著しく遅い速度でしかグルコースのグルコース-6-リン酸へのリン酸化を促進できないタンパク質である。機能的グルコキナーゼタンパク質をコードする遺伝子と比較して、当該不活性グルコキナーゼタンパク質をコードする遺伝子は、その遺伝子のオープンリーディングフレーム(ORF)内に変異を含んでおり、前記変異は、これだけに限定されるものではないが、タンパク質の機能的特性を変更させる欠失、フレームシフト変異、終止コドンの挿入又はアミノ酸置換をもたらす変異、あるいは、遺伝子の転写又は翻訳を低減するか、又は停止するプロモーター変異を含み得る。
これにより、本発明のより好ましい実施形態において、変異株は、天然に存在する変異株又は誘発された変異株である。
グルコーストランスポーター活性は、Cochuら(2003. Appl Environ Microbiol 69(9); 5423-5432)によって説明されたグルコース取り込みアッセイによって測定できる。
ラクトースは、通常、ガラクトース上で増殖しないラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス及びこの種の菌株によって、単糖であるグルコース、フルクトース、及びマンノースより容易に発酵される(Buchanan R.E., Gibbons N.E., eds (1974): Bergey's manual of determinative bacteriology (The Williams & Wilkins Co. Baltimore, Md), 8th ed,)。
第十九の態様において、本発明は、発酵乳製品中にラクトース含有量を減少させるための、本発明の第三又は第四の態様によるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の使用を対象とする。
a)ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス母株を提供し、
b)前記母株から誘導された変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、2-デオキシグルコースに耐性がある変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールを選択して、単離し、そして
c)前記2-デオキシグルコースに耐性がある変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、その変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株の増殖速度が、M17培地+2%のガラクトース中でM17培地+2%のグルコース中に比べて速いことを条件に、変異株ストレプトコッカス・サーモフィルス株を選択して、単離すること、
を含む。
好ましい実施形態において、前記方法は、ステップa1)前記母株を変異誘発に晒すこと、例えば化学的及び/又は物理的変異原などに母株を晒すこと、をさらに含む。
a)ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス母株を提供し、
b)前記母株から誘導された変異株ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のプールから、2-デオキシグルコースに耐性があるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のプールを選択して、単離し、そして
c)前記2-デオキシグルコースに耐性があるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株のプールから、そのラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株の増殖速度が、MRS-IM培地の+2%のラクトース中でMRS-IM培地の+2%のグルコース中に比べて速いことを条件に、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株を選択して、単離すること、
を含む。
培地:
ストレプトコッカス・サーモフィルスに関して、使用する培地は、当業者に知られているM17培地である。
アガロース、12.75g
アスコルビン酸、0.5g
カゼインペプトン(トリプシン消化物)、2.5g
β-グリセロリン酸二ナトリウム五水和物、19g
硫酸マグネシウム水和物、0.25g
肉エキス、5g
肉ペプトン(ペプシン消化物)、2.5g
大豆ペプトン(パパイン消化物)、5g
酵母抽出物、2.5g
最終的なpH7.1±0.2(25℃)、
そして、M17培養液は、1リットルのH2Oあたり以下の組成を有する:
アスコルビン酸、0.5g
硫酸マグネシウム、0.25g
肉エキス、5g
肉ペプトン(ペプシン消化物)、2.5g
グリセロリン酸ナトリウム、19g
大豆ペプトン(パパイン消化物)、5g
トリプトン、2.5g
酵母抽出物、2.5g
最終的なpH7.0±0.2(25℃)。
トリプトン Oxoid L42 10.0g
酵母抽出物 Oxoid L21 5.0g
Tween80 Merck nr8.22187 1.0g
K2HPO4 Merck nr105104 2.6g
酢酸Na Merck nr106267 5.0g
MgSO4、7H2O Merck nr105882 0.2g
MnSO4、H2O Merck nr105941 0.05g
アガロース SO-BI-GEL 13.0g
オートクレーブ後に、pHを25℃にて6.9±0.1に調整する。
トリプトン Oxoid L42 10.0g
酵母抽出物 Oxoid L21 5.0g
Tween80 Merck nr8.22187 1.0g
K2HPO4 Merck nr105104 2.6g
酢酸Na Merck nr106267 5.0g
クエン酸二アンモニウム Merck nr101154 2.0g
MgSO4、7H2O Merck nr105882 0.2g
MnSO4、H2O Merck nr105941 0.05g
ストレプトコッカス・サーモフィルスCHCC11976(GalK遺伝子に変異を有し、且つ、WO2011/026863に記載のようにエキソ多糖類を産生するガラクトース発酵株)。
ストレプトコッカス・サーモフィルスCHCC14994(ガラクトース発酵株)。
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスCHCC759。
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスCHCC10019。
ストレプトコッカス・サーモフィルスCHCC15757(CHCC14994の2-デオキシグルコース耐性変異株)。
ストレプトコッカス・サーモフィルスCHCC15887(CHCC11976の2-デオキシグルコース耐性変異株)。
ストレプトコッカス・サーモフィルスCHCC16404(CHCC15757の高ラクトース発酵及びグルコース分泌変異株)。
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスCHCC16159(CHCC759の2-デオキシグルコース耐性変異株)。
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスCHCC16160(CHCC10019の2-デオキシグルコース耐性変異株)。
ストレプトコッカス・サーモフィルス株CHCC11976及びストレプトコッカス・サーモフィルス株CHCC14994の変異株に単離するために、単一コロニーの増殖によって得られた細胞を、2%のラクトースを含有する10mlのM17培養液に植菌し、40℃で一晩培養した。
ガラクトース上で増殖できる2-デオキシグルコース耐性変異株の選択を確実にするために、ガラクトース発酵菌株コレクションから選択した2つの菌株を使用した。これらのガラクトース発酵菌株は、それでも、M17培養液+2%のガラクトース中に比べて、M17培養液+2%のグルコース中で、対数期には少なくとも10%速く増殖したのに対して、その一方、CHCC11976及びCHCC14994の2-デオキシグルコース耐性変異株誘導体、例えばCHCC15757及びCHCC15887などは、M17培養液+2%のグルコースに比べて、M1.7培養液+2%のガラクトース中で、対数期にはさらに速く増殖することを特徴とした。対数期における増殖は、本明細書中では、指数増殖期培養物に関する40℃での経時的な600ナノメートル(OD600)の吸光度の上昇として計測した。当業者が知っているように、培養物が指数増殖の状態にあるとき、それは種ごとに異なっていてもよい。当業者は、対数期の増殖、例えばOD600 0.1~1.0の間、をどのように測定するか分かる。培養物の吸光度(OD)は、分光光度計で計測した。
この実施例2の2-デオキシグルコース耐性変異株の増殖パターンに基づいて、-着目の特定の菌株(例えば、関連する市販品からの菌株)に関して-、当業者は、この着目の特定の菌株が、選択した変異株の特性である本明細書中に関連する増殖パターンを有するかどうか、日常的に試験できる。
グルコースキナーゼをコードする遺伝子の変異解析アッセイを行うために、実施例1で同定した変異株から全DNAを分離した。グルコースキナーゼ遺伝子の配列決定では、CHCC15757の遺伝子がトレオニンコドンの代わりにイソロイシンを生じるコドン141における非保存変異を含んでいることが明らかになった。変異株CHCC15887からの遺伝子の配列決定では、セリンからプロリンへの非保存アミノ酸変化をもたらすコドン72における変異が明らかになった(図2)。
GK1F:5’ CTT GGG TAA AAG GCT CTA TG 3’(配列番号3)
GK1R:5’ CGT TTT TCA ACA AAA AAG TGC TACC 3’(配列番号4)
2μlの染色体DNA
1μlのプライマーGK1F
1μlのプライマーGK1R
25μlのマスターミックス
21μlのH2O
PCR増幅では、1168bpの断片が生じた。Biorad製のPCR精製キットを使用した精製後に、そのPCR断片を、増幅のために使用したのと同じ2つのプライマーを使用したMacrogenでのDNA配列決定のために提出した。配列決定法後に、DNA配列を母株のものと比較した。
別の実験において、関連糖の糖濃度は、それぞれCHCC14994、CHCC11976、CHCC15757及びCHCC15887で発酵させた乳で測定した。9.5%のB-乳に、2%のガラクトースを添加したM17培養液中で一晩培養した1%(106~107CFU/ml)の培養物を植菌した。酸性化を、INTAB PCロガー及びEasyviewソフトウェアを用いて観察した。40℃で30時間の酸性化後に、乳サンプルを、HPLC分析のために採取して、関連糖と酸の含有量を得た。酸性化カーブは、変異株がわずかに遅れて酸性化を開始したが、同等の最終pHで終わったことを示していた。そのHPLCデータを、表1に示す。
2-デオキシグルコース耐性変異株の選択
着目の2つのラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株、CHCC759及びCHCC10019を、互いに独立に、2%のラクトースを含有する10mlのMRS-IM培養液中に植菌し、そして、40℃で一晩嫌気的にインキュベートした。次のステップでは、約3×108細胞を含んでいるこれらの培養物のサンプルを、2%のラクトースを含み、さらに20mMの2-デオキシグルコースを含むMRS-IMアガロースプレート上で平板培養した。前記プレート上に生じたコロニーを、2%のラクトースを含み、さらに20mMの2-デオキシグルコースを含むMRS-IMアガロースプレート上に単一コロニーを画線接種することによって精製し、そして、以下で記載するようにさらに特徴づけした。
以下の方法は、着目の菌株が2-デオキシグルコースに耐性があるか否か判断するのに好適である。着目の菌株を、上記の2%のラクトースを含有する10mlのMRS-IM培養液中に植菌し、そして、40℃で一晩嫌気的にインキュベートした。次のステップでは、約104~105細胞を含んでいるこれらの培養物の希釈サンプルを、2%のラクトースを含み、さらに耐性変異株の選択のために使用した同じ2-デオキシグルコース濃度(典型的には20mMであるが、他の濃度も使用されるであろう)を含有するMRS-IMアガロースプレート上に平板培養する。前記アガロースプレートを、40℃で20時間、嫌気条件下でインキュベートし、そして、調べた。2-デオキシグルコースに耐性がないラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株は、あったとしてもごくわずかなコロニーしか生じないのに対して、2-デオキシグルコースに耐性がある菌株は、多数のコロニーを生じる。適当な対照としては、20mMの濃度にて2-デオキシグルコースに対して感受性であるラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株、CHCC759及びCHCC10019、並びに20mMの2-デオキシグルコースに耐性があるCHCC16159及びCHCC16160が挙げられる。
ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスの2-デオキシグルコース耐性変異株がグルコース上で増殖する能力を失ったか又は炭素源としてのグルコースで増殖する能力に欠陥があるのを確認するために、変異株の増殖パターンを、2%のグルコースを含有するMRS-IM培養液中で母株であるCHCC759及びCHCC10019と、変異株であるCHCC16159及びCHCC16160の両方を培養することによって母株の増殖パターンと比較した。
別の実験において、様々な糖の糖濃度を、それぞれラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株CHCC759、CHCC10019、CHCC16159、及びCHCC16160で発酵させた乳で測定した。9.5%のB-乳に、2%のラクトースを含有するMRS-IM培養液中で嫌気的に一晩培養した1%(106~107CFU/ml)の液体培養物を植菌した。酸性化を、INTAB PCロガー及びEasyviewソフトウェアを用いて観察した。40℃で30時間の酸性化後に、HPLC分析のために乳サンプルを採取して、様々な糖及び有機酸の量を計測した。酸性化カーブは、変異株が酸性化をいくらか遅れて開始し、そして、わずかに高い最終pHで終わったことを示した。HPLCデータを、表2に示した。
ストレプトコッカス・サーモフィルス株CHCC15757の高ラクトース発酵及びグルコース分泌変異株を単離するために、単一コロニーの増殖物由来の細胞を、2%のガラクトースを含有する10mlのM17培養液中に植菌し、40℃で一晩培養した。
変異株CHCC16404の維持及び適切な増殖を確認するために、前記菌株を、40℃で2%のスクロースを添加したM17中で培養した。我々が驚いたことに、我々は、変異株CHCC16404が、その菌株が2%のスクロースを添加したM17培養液中で一晩培養した1%(106~107CFU/ml)の培養物を植菌したときか、又は乳にスクロースが添加されたときのみ、9.5%のB-乳を酸性化することができることを観察した。我々は、わずか0.01%のスクロースの乳への添加が、CHCC16404が9.5%のB-乳を酸性化するのを可能にしたことを観察した。さらに、CHCC16404は、同じ条件下でグルコースを添加したM17中で増殖できる母株CHCC15757とは対照的に、40℃で2%のグルコースを添加したM17中で増殖できなかった。これらの結果を総合すると、CHCC16404を生じたCHCC15757の2-デオキシグルコース処理は、培地から分泌したグルコースの取り込みを不可能にしているグルコース取り込み系を不活化する変異を選択した。
別の実験において、関連糖の糖濃度を、CHCC16404で発酵させた乳で測定した。それぞれ0.01%、0.02%、0.03%及び0.05%のスクロースを添加した9.5%をB-乳の入ったボトルに、2%のスクロースを添加したM17培養液中で一晩培養した1%(106~107CFU/ml)の培養物を植菌した。酸性化を、INTAB PCロガー及びEasyviewソフトウェアを用いて観察した。40℃で30時間の酸性化後に、HPLC分析のための乳サンプルを採取して、関連糖及び酸の含有量を得た。
この実験では、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス株(CHCC759、CHCC10019、CHCC16159及びCHCC16160から選択)と、CHCC14994、CHCC15757又はCHCC16404のいずれかであるストレプトコッカス・サーモフィルス株との組み合わせで発酵させた乳中の糖と有機酸の濃度を測定した。
ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBB-12(登録商標)(Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Denmarkから市販されている)のような最も認知されているプロバイオティック細菌のうちのいくつかは、乳のようなラクトースベースの媒質中に単独で存在しているとき、うまく増殖しない。そのため、この実験において、我々は、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBB-12(登録商標)を、ストレプトコッカス・サーモフィルス又はラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクスのグルコース分泌株と組み合わせることの効果を調査した。
CHCC5445(BB-12(登録商標))を、MRS+0.05%のシステイン塩酸塩中、40℃で、嫌気条件下にて一晩培養した。
CHCC14994を、2%のガラクトースを含んだM17中、40℃で一晩培養した。
CHCC15757を、2%のガラクトースを含んだM17中、40℃で一晩培養した。
CHCC5445(BB-12(登録商標))を、MRS+0.05%のシステイン塩酸塩中、40℃で、嫌気条件下にて一晩培養した。
CHCC10019を、2%のラクトースを含んだMRS中、40℃で一晩、嫌気的に培養した。
CHCC16159を、2%のラクトースを含んだMRS中、40℃で一晩、嫌気的に培養した。
1. 1%のCHCC5445(BB-12(登録商標))
2. 0.5%のCHCC5445(BB-12(登録商標))+0.5%のCHCC14994
3. 0.5%のCHCC5445(BB-12(登録商標))+0.5%のCHCC15757
4. 1%のCHCC5445(BB-12(登録商標))
5. 0.5%のCHCC5445(BB-12(登録商標))+0.5%のCHCC10019
6. 0.5%のCHCC5445(BB-12(登録商標))+0.5%のCHCC16159
出願人は、以下に記載した寄託された微生物のサンプルが、本特許を取得する日まで、専門家にのみ入手可能にすべきであることを要求する。
菌株ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスCHCC5445(BB-12(登録商標))は、2003年9月30日に、受託番号DSM15954でDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germanyに寄託された。
寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件下でおこなわれた。
Claims (17)
- グルコキナーゼタンパク質をコードするglcK遺伝子のDNA配列内に変異を有するガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス株であって、
前記変異が、配列番号1のT214C若しくはC422Tに対応するヌクレオチド変異、又は配列番号2のSer72Pro若しくはThr141Ileに対応するアミノ酸変異からなる群から選択され、前記変異により、グルコキナーゼタンパク質が部分的又は完全に不活化して、前記株が2-デオキシグルコースに耐性となることにより、前記株が、2%(w/v)ラクトース又は2%(w/v)ガラクトース、及び2-デオキシグルコース20mMを含有するM17培地のプレート上に画線して40℃で20時間インキュベーションしたときコロニーを形成できる、前記株。 - 細胞内へのグルコースの輸送を低減する変異を有する、請求項1に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株。
- グルコーストランスポーターの成分をコードする遺伝子内に変異を有し、前記変異が、グルコーストランスポーターを不活化するか、又は前記遺伝子の発現に負の効果を有する、請求項2に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株。
- グルコース/マンノースホスホトランスフェラーゼ系のIIC Man タンパク質をコードするmanM遺伝子のDNA配列内に変異を有し、前記変異が、IIC Man タンパク質を不活化するか、又は前記遺伝子の発現に負の効果を有する、請求項3に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株。
- 104~1012CFU/gの、請求項1~4のいずれか1項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株を含む組成物。
- 104~1012CFU/gの1種以上のラクトバチルス・デルブルエッキ亜種ブルガリクス変異株を更に含み、前記株が、2-デオキシグルコースに耐性を有することにより、2%(w/v)ラクトース及び2-デオキシグルコース20mMを含有するMRS-IM培地のプレート上に画線して40℃で20時間インキュベーションしたときコロニーを形成できる、請求項5に記載の組成物。
- 乳基質に、請求項1~4のいずれか1項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株を少なくとも1つ植菌し、そして、発酵させることを含む、発酵乳製品を製造する方法。
- 乳基質に、請求項5又は6のいずれかに記載の組成物を少なくとも1つ植菌し、そして、発酵させることを含む、発酵乳製品を製造する方法。
- 請求項1~4のいずれか1項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株の少なくとも1つを含む発酵乳製品。
- 請求項5又は6のいずれかに記載の組成物を含む発酵乳製品。
- 発酵乳製品の製造のための、請求項5又は6のいずれかに記載の組成物の使用。
- 発酵乳製品の甘味を強くするための、請求項5又は6のいずれかに記載の組成物の使用。
- 発酵乳製品中にラクトース含有量を低減するための、請求項5又は6のいずれかに記載の組成物の使用。
- ラクトース不耐症の症状を避ける際に使用するための、請求項9又は10のいずれかに記載の発酵乳製品。
- ラクトースを含有する乳中でのビフィドバクテリウム株の増殖を改善するための、請求項1~4のいずれか1項に記載のストレプトコッカス・サーモフィルス株の使用。
- 乳中でのビフィドバクテリウム株の増殖を改善するための、請求項5又は6のいずれかに記載の組成物の使用。
- 請求項1に記載の変異glcK遺伝子を有するストレプトコッカス・サーモフィルス株のスクリーニング及び単離の方法であって、以下のステップ:
a)ガラクトース発酵ストレプトコッカス・サーモフィルス母株を提供し;
b)前記母株から誘導された変異ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、2-デオキシグルコースに耐性があることにより、2%(w/v)ラクトース又は2%(w/v)ガラクトース、及び2-デオキシグルコース20mMを含有するM17培地のプレート上に画線して40℃で20時間インキュベーションしたときコロニーを形成できる、変異ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールを選択して、単離し;
c)前記2-デオキシグルコースに耐性がある変異ストレプトコッカス・サーモフィルス株のプールから、その変異ストレプトコッカス・サーモフィルス株の増殖速度が、M17培地+2%のガラクトース中でM17培地+2%のグルコース中に比べて速いことを条件に、変異ストレプトコッカス・サーモフィルス株を選択して、単離し;
d)前記工程c)において単離された変異ストレプトコッカス・サーモフィルス株から、配列番号1のT214C若しくはC422Tに対応するヌクレオチド変異、又は配列番号2のSer72Pro若しくはThr141Ileに対応するアミノ酸変異からなる群から選択される変異を有する株を選択して、単離すること、
を含む前記方法。
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