BR112021012116A2 - Bactérias formadoras de ácido láctico - Google Patents
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Abstract
bactérias formadoras de ácido láctico. a presente invenção refere-se a uma cepa de streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta uma mutação em 2 ou 3 genes selecionados dentre o grupo que consiste em 1) um gene que codifica uma proteína do pts específico para manose-glicose e um gene glck, 2) um gene que codifica uma proteína do pts específico para manose-glicose e um gene ccpa e 3) um gene que codifica uma proteína do pts específico para manose-glicose, um gene glck e um gene ccpa, em que a dita cepa, quando usada para fermentar leite, fornece um leite fermentado com baixo teor de lactose e/ou um leite fermentado que não passa por acidificação quando armazenado à temperatura de fermentação.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "BACTÉRIAS FORMADORAS DE ÁCIDO LÁCTICO".
[0001] A presente invenção refere-se a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, que porta uma mutação em genes selecionados dentre o grupo que consiste em 1) um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose- glicose e um gene glcK, 2) um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e um gene ccpA e 3) um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, um gene glcK e um gene ccpA, em que a dita cepa, quando usada para fermentar leite, fornece um leite fermentado com baixo teor de lactose e/ou um leite fermentado que não passa por pós-acidificação quando armazenado à temperatura de fermentação. A invenção também se refere a uma composição que compreende pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção e ao uso dessa cepa ou composição para fabricar um produto lácteo fermentado.
[0002] A indústria alimentícia usa bactérias a fim de melhorar o sabor e a textura de produtos alimentícios e de ração. No caso da indústria de laticínios, bactérias formadoras de ácido láctico são comumente usadas a fim de, por exemplo, produzir a acidificação de leite (por fermentação de lactose) e texturizar o produto no qual são incorporadas. Por exemplo, bactérias formadoras de ácido láctico da espécie Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) são usadas extensivamente, sozinhas ou em combinação com outras bactérias, na fabricação de produtos lácteos fermentados frescos, tal como queijo ou iogurte.
[0003] Uma das limitações do uso de bactérias formadoras de ácido láctico na tecnologia de laticínios é a pós-acidificação, isto é, a produção de ácido láctico pelas bactérias formadoras de ácido láctico após o pH alvo (aquele exigido pela tecnologia) ter sido obtido [terminação da fermentação]. Assim, o fenômeno pós-acidificação não é apenas uma questão para os fabricantes de produtos lácteos (que poderiam desejar ter um processo de fabricação flexível, sem necessariamente ter uma etapa de resfriamento rápida logo após o pH ser obtido), mas também para os consumidores (a produção de bactérias formadoras de ácido láctico leva a uma acidez elevada e vida útil reduzida do produto fermentado).
[0004] Além disso, há uma tendência de que os consumidores de laticínios adquiram produtos fermentados com teor reduzido ou baixo de lactose (intolerância à lactose).
[0005] O documento Nº WO2015/193459 propõe diversas soluções para superar estas questões: controlar a concentração de lactose no leite antes da fermentação, por exemplo, adicionando-se lactase, fornecendo bactérias formadoras de ácido láctico que não têm capacidade de hidrolisar lactose (cepas negativas para lactose). Essas soluções não são, entretanto, satisfatórias para os fabricantes de produtos lácteos, visto que exigem ou a adição de enzima exógena (tal como lactase) no leite antes da fermentação, tornando o processo de fabricação mais complexo e mais dispendioso, ou a adição de um carboidrato no leite (tal como sacarose), o que não está de acordo com a demanda crescente por produtos mais saudáveis, sem aditivos.
[0006] Portanto, há uma necessidade de aprimorar os métodos para produzir produtos lácteos fermentados que sejam tanto satisfatórios para os fabricantes quanto para os consumidores, não passando por pós-acidificação e com um teor de lactose reduzido.
[0007] Figura 1: Alinhamento da sequência de proteína GlcK das cepas DGCC7710 (DSM28255), DSM32587 e ST1m-glcK0-gal+. As diferenças com a proteína GlcK de DGCC7710 (SEQ ID Nº:2) estão destacadas. As Figuras 2 a 10 são gráficos que representam a evolução do pH ao longo do tempo (A) e que representam a velocidade como uma função do pH (B) de um leite fermentado respectivamente com a cepa DGCC7710 (Figura 2), ST1m-glcK+manM (Figura 3), ST1m- ccpA+manL (Figura 4), ST1m-ccpA+manM (Figura 5), ST1m- ccpA+manN (Figura 6), ST1m-glcK+ccpA+manM (Figura 7), ST1.1 (Figura 8), ST1.1m-glcK+manM (Figura 9) ou ST1.1m-ccpA+manL (Figura 10).
[0008] A presente invenção colocou em evidência que mutações que desregulam fortemente o metabolismo de açúcar podem ser usadas para projetar cepas de Streptococcus thermophilus que podem ser usadas para obter produtos de leite fermentado com baixo teor de lactose e/ou que podem ser usadas para produzir leite fermentado sem passar por pós-acidificação, mesmo quando armazenado à temperatura de fermentação.
[0009] Os inventores mostraram habilmente que tais cepas de Streptococcus thermophilus podem ser caracterizadas pela razão entre a quantidade de galactose liberada e a quantidade de lactose restante no leite fermentado. A razão traduz a capacidade da cepa de consumir lactose (absorção e hidrólise) e converter a mesma em galactose e glicose livres. Devido ao fenótipo negativo para galactose das cepas de Streptococcus thermophilus da invenção, a galactose liberada representa estequiometricamente a lactose consumida. Deve ser considerada como a eficiência da cepa para lactose usada em excesso.
Assim, os inventores mostraram que as cepas negativas para galactose da invenção, o catabolismo de carboidratos oriundos da hidrólise de lactose é fortemente desregulado, de modo que o consumo de lactose seja aumentado enquanto a cepa ainda mantém um crescimento aceitável para seu uso em um nível industrial. As cepas da invenção não precisam ser positivas para galactose (fenótipo que mostrou ser instável em lactose).
[0010] A presente invenção refere-se a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, em que, quando a dita cepa é usada para fermentar leite como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3.
[0011] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta uma mutação em genes selecionados dentre o grupo que consiste em 1) pelo menos um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e um gene glcK, 2) pelo menos um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e um gene ccpA e 3) um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, um gene glcK e um gene ccpA;
[0012] em que, quando a dita cepa é usada para fermentar leite como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3.
[0013] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose porta uma mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-
glicose e um gene glcK. Em uma modalidade, o gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é selecionado dentre o grupo que consiste no gene manL, no gene manM, no gene manN e no gene manO. Em uma modalidade, o gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é selecionado dentre o grupo que consiste no gene manL, no gene manM e no gene manN. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose porta uma mutação em um gene selecionado dentre o grupo que consiste no gene manL, no gene manM e no gene manN. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose porta uma mutação em 2 genes selecionados dentre o grupo que consiste no gene manL, no gene manM e no gene manN. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose porta uma mutação no gene manL, no gene manM e no gene manN.
[0014] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta uma mutação em 2 ou 3 genes selecionados dentre o grupo que consiste em 1) um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e um gene glcK, 2) um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e um gene ccpA e 3) um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, um gene glcK e um gene ccpA;
[0015] em que, quando a dita cepa é usada para fermentar leite como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3.
A razão entre a quantidade de galactose liberada e a quantidade de lactose restantes pelas cepas de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção durante a fermentação de leite.
[0016] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2. Em uma modalidade, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é selecionada dentre grupo que consiste em mais do que 1,2, mais do que 1,5, mais do que 2 e mais do que 3. Em uma modalidade, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,5. Em uma modalidade, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 2. Em uma modalidade, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 3.
[0017] De acordo com a invenção, a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) durante a fermentação do leite podem ser determinadas por métodos bem conhecidos na técnica. Em uma modalidade, a concentração de galactose e lactose em um leite fermentado é caracterizada pelo Teste B como definido abaixo: Teste B:
[0018] Leite semidesnatado UHT "Le Petit Vendéen ("leite de iogurte") contendo 3% (p/v) de leite em pó (BBA, Lactalis), previamente pasteurizado por 10 min a 90°C, é inoculado a 1% (v/v, cerca de 107 CFU/ml) com uma cultura da cepa de S. thermophilus a ser avaliada
(células ressuspensas sem carboidrato M17 de cultura de um dia para o outro cultivada em M17 suplementado com 3% de sacarose). O leite mostrou conter em torno de 175 mM de lactose. Os frascos de leite inoculado são estaticamente incubados em um banho-maria a 43°C durante 24 horas, para obter leite fermentado. Amostras T0 e amostras de leite fermentado (T24h) (5 g) são diluídas em 25 g de H2SO4 a 0,025 N, antes de serem centrifugadas a 4600 rpm por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante é filtrado através de um filtro de náilon de 0,2 μm (Phenomenex, Alemanha, Aschaffenburg) diretamente em um frasco de HPLC de 2 ml. As amostras são armazenadas a -20°C até a análise adicional. Os carboidratos [em particular galactose e lactose] são quantificados por cromatografia líquida de alto desempenho (Agilent 1200 HPLC) equipada com um detector de índice de refração com o uso de uma coluna de troca de ânions Aminex HPX-87H (Bio-Rad Laboratories Inc.) a 35°C, com H2SO4 a 12,5 mM como o fluido de eluição e uma taxa de fluxo de 0,6 ml min−1. A exploração de resultados é realizada com o software de reprocessamento Chemstation (Agilent).
[0019] Para evitar dúvidas, a espécie de Streptococcus thermophilus deve ser entendida como uma cepa de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus.
[0020] A expressão "positivo para lactose" significa uma cepa Streptococcus thermophilus que tem capacidade de proliferar em lactose como a única fonte de carboidrato, em particular em um meio M17 suplementado com 2% de lactose. Em uma modalidade particular, o fenótipo "positivo para lactose" é avaliado inoculando-se – em um caldo M17 contendo 2% de lactose - uma cultura de um dia para o outro da cepa de S. thermophilus a ser testada a uma taxa de 1% e incubando-se por 20 horas a 37°C, e em que um pH de 5,5 ou mais baixo ao final da incubação é indicativo de um fenótipo positivo para lactose.
[0021] A expressão "negativo para galactose" significa uma cepa Streptococcus thermophilus que não tem capacidade de proliferar em galactose como a única fonte de carboidrato, em particular em um meio M17 suplementado com 2% de galactose. Em uma modalidade particular, o fenótipo "negativo para galactose" é avaliado inoculando- se – em um caldo M17 contendo 2% de galactose - uma cultura de um dia para o outro da cepa de S. thermophilus a ser testada a 1% e incubando-se por 20 horas a 37°C, e em que um pH de 6 ou mais alto ao final da incubação é indicativo de um fenótipo negativo para galactose.
[0022] A expressão "derivado", em referência a uma cepa original (por exemplo, derivado de DGCC7710), significa uma cepa obtida a partir de uma cepa original (por exemplo, a partir da cepa DGCC7710) por substituição de um de seus genes (tal como glcK, ccpA, …) por outro alelo (em particular um alelo com mutação) do mesmo gene. Em uma modalidade, o derivado é obtido pela substituição do gene completo (sequência de codificação e promotor) da cepa original por outro alelo (sequência de codificação e promotor) do mesmo gene. Em uma modalidade, o derivado é obtido pela substituição da sequência de codificação de um gene da cepa original por outro alelo (sequência de codificação) do mesmo gene.
[0023] Assim, a invenção refere-se a: - uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta uma mutação em pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e que porta uma mutação no gene glcK, em que, quando a dita cepa é usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito fermentado é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3. Em uma modalidade, a mutação no gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose reduz ou abole a importação de glicose do meio para as bactérias.
Em uma modalidade, o gene glcK com mutação codifica uma glicoquinase, cuja atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula.
Em uma modalidade, a dita cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose porta uma mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose que reduz ou abole a importação de glicose do meio para as bactérias e porta uma mutação no gene glcK que codifica uma glicoquinase, de modo que a atividade glicoquinase do mesmo na dita cepa seja significativamente reduzida, mas não nula, na dita cepa.
Em qualquer uma dessas modalidades, o gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é selecionado dentre o grupo que consiste no gene manL, no gene manM e no gene manN. - uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta uma mutação em pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e que porta uma mutação no gene ccpA, em que, quando a dita cepa é usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito fermentado é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3. Em uma modalidade, a mutação no gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose reduz ou abole a importação de glicose do meio para as bactérias.
Em uma modalidade, a mutação no gene ccpA leva a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que exibe uma razão entre a atividade de beta-galactosidase da dita cepa, como avaliado pelo teste D, e a atividade de glicoquinase da dita cepa, como avaliado pelo teste E, que é pelo menos 4,10-6, pelo menos 5,10-6, pelo menos 6,10-6, pelo menos 7,10-6 ou pelo menos 8,10-6. Em uma modalidade, a dita cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose porta uma mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose que reduz ou abole a importação de glicose do meio para as bactérias e porta uma mutação no gene ccpA, de modo que a razão entre a atividade de beta- galactosidase da dita cepa, como avaliado pelo teste D, e a atividade de glicoquinase da dita cepa, como avaliado pelo teste E, seja pelo menos 4,10-6. Em qualquer uma dessas modalidades, o gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é selecionado dentre o grupo que consiste no gene manL, no gene manM e no gene manN; - uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta uma mutação em pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, que porta uma mutação no gene glcK e que porta uma mutação no gene ccpA, em que, quando a dita cepa é usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito fermentado é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3. Em uma modalidade, a mutação no gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose reduz ou abole a importação de glicose do meio para as bactérias.
Em uma modalidade, o gene glcK com mutação codifica uma glicoquinase, cuja atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula na dita cepa.
Em uma modalidade, a mutação no gene ccpA leva a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que exibe uma razão entre a atividade de beta-galactosidase da dita cepa, como avaliado pelo teste D, e a atividade de glicoquinase da dita cepa, como avaliado pelo teste
E, que é pelo menos 4,10-6, pelo menos 5,10-6, pelo menos 6,10-6, pelo menos 7,10-6 ou pelo menos 8,10-6. Em uma modalidade, a dita cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose porta uma mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose que reduz ou abole a importação de glicose do meio para as bactérias, porta uma mutação no gene glcK que codifica uma glicoquinase, de modo que a atividade de glicoquinase do mesmo na dita cepa seja significativamente reduzida, mas não nula, na dita cepa e porta uma mutação no gene ccpA, de modo que a razão entre a atividade de beta-galactosidase da dita cepa, como avaliado pelo teste D, e a atividade de glicoquinase da dita cepa como avaliado pelo teste E, seja pelo menos 4,10-6. Em qualquer uma dessas modalidades, o gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é selecionado dentre o grupo que consiste no gene manL, no gene manM e no gene manN.
[0024] As partes I a III a seguir descrevem respectivamente mutações do gene glcK, mutações do gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose (tais como mutações dos genes manL, manM e manN) e mutações do gene ccpA.
[0025] Embora essas mutações sejam descritas separadamente no presente documento (para fins de clareza), qualquer modalidade de uma parte pode ser combinada com qualquer modalidade de outra parte, ou com qualquer modalidade das duas outras partes, para projetar uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, como definido no presente documento, que, quando usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado seja maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3.
[0026] Para evitar dúvidas, a presente invenção refere-se a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, como definido no presente documento, em que, quando a dita cepa é usada para fermentar leite como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3, em que a dita cepa porta: 1) uma mutação em pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, como definido na parte II no presente documento, e uma mutação em seu gene glcK, como definido na parte I no presente documento; ou 2) uma mutação em pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, como definido na parte II no presente documento, e uma mutação em seu gene ccpA, como definido na parte III no presente documento; ou 3) uma mutação em pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, como definido na parte II no presente documento, e uma mutação em seu gene glcK, como definido na parte I no presente documento e uma mutação em seu gene ccpA, como definido na parte III no presente documento; I. Mutações do gene glcK
[0027] Essa parte descreve mutações do gene glcK que podem ser usadas em combinação com uma mutação de um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, como definido no presente documento, ou em combinação com uma mutação de um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, como definido no presente documento, e uma mutação do gene ccpA, como definido no presente documento, no contexto de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção.
[0028] Em uma modalidade, o gene glcK com mutação da cepa da invenção codifica uma glicoquinase, cuja atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula. De fato, os inventores colocaram em evidência que alguns alelos com mutação do gene glcK codificam uma glicoquinase (GlcK), cuja atividade de glicoquinase é significativamente reduzida, mas não nula, quando o dito gene glcK com mutação está presente em uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose.
[0029] A expressão " gene glcK que codifica uma glicoquinase" significa qualquer sequência de DNA de uma cepa de Streptococcus thermophilus que codifica a enzima glicoquinase que catalisa a conversão de glicose e ATP em glicose-6-fosfato (G6P) e ADP. Os exemplos não limitantes de sequências de glicoquinase de Streptococcus thermophilus são descritos como as SEQ ID Nos :2, 4, 6, 8, 10 12, 14, 16, 18 e 20.
[0030] Dentro da invenção, a atividade de glicoquinase em uma cepa de Streptococcus thermophilus é significativamente reduzida, mas não nula, como consequência de uma mutação em seu gene glcK. Em outras palavras, o alelo do gene glcK portado pela dita cepa é tal que a atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula.
[0031] A expressão "a atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula" refere-se a uma cepa cuja atividade de glicoquinase é: - significativamente reduzida na dita cepa, em particular, em comparação com a atividade de glicoquinase em uma cepa que porta um gene glcK sem mutação; e - não nula, isto é, que uma atividade é detectável pelo teste A, como definido no presente documento.
[0032] De acordo com a invenção, a característica "atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula"
pode ser determinada por métodos bem conhecidos na técnica. Assim, os métodos para medir a atividade de glicoquinase em uma cepa de Streptococcus thermophilus são conhecidos e incluem ensaios de enzima com reagentes comercialmente disponíveis. É feita referência no presente documento ao parágrafo 2.4 de Pool et al. (2006. Metabolic Engineering 8(5); 456-464) (incorporado ao presente documento a título de referência). Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase em uma cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é avaliada pelo teste A [isto é, o teste A é executado com o uso da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção]. Teste A:
[0033] Uma cultura fresca de um dia para o outro da cepa de Streptococcus thermophilus a ser avaliada em M17 contendo 30 g/l de lactose é obtida e usada para inocular a 1% (vol/vol) 10 ml de M17 fresco 30 g/l de lactose. As células são coletadas por centrifugação (6000 g, 10 min, 4°C) a uma densidade óptica de 600 nm (OD600) de 0,8 +/- 0,2, lavadas em 5 ml de tampão GLCK frio (MgCl2 5 mM, K2HPO4/KH2PO4 [pH 7,2] 10 mM) e ressuspensas em 500 µl de tampão GLCK frio. Inibidores de protease sem EDTA "cOmpleteTM" (Roche, referência do fornecedor 04693132001) são adicionados em tampão GLCK, como descrito pelo fornecedor. As células são rompidas pela adição de 100 mg de microesferas de vidro (150-212 µm, Sigma G1145) a 200 µl de células ressuspensas e oscilação a uma frequência de 30 ciclos/s por 6 min em um moinho oscilante MM200 (Retsch, Haan, Alemanha). Os restos de células e microesferas de vidro são removidos por centrifugação (14000 g, 15 minutos, 4°C), e o sobrenadante transferido para um tubo de centrifugação de 1,5 ml limpo mantido em gelo. O teor total de proteína é determinado com o uso do FLUKA Protein Quantification Kit-Rapid (ref 51254). A atividade de glicoquinase nos extratos celulares é determinada espectrofotometricamente por um ensaio acoplado a glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6PDH, EC1.1.1.49):NADPH (Porter et al., 1982), essencialmente como descrito por Pool et al. (2006). Cada amostra (5, 10 e 20 µl) é adicionada ao tampão de ensaio (K2HPO4/KH2PO4 [pH 7,2] 10 mM, MgCl2 5 mM, ATP 1 mM, glicose 20 mM, NADP 1 mM, G-6PDH 1 U) em um volume final de 250 µl, e a mistura foi deixada por 5 minutos a 30°C. A densidade óptica a 340 nm é medida por 5 minutos com o uso de um leitor de microplaca de detecção múltipla Synergy HT (BIO-TEK). Uma unidade de glicoquinase corresponde à quantidade de enzima que catalisa a fosforilação de 1 µmol de D-glicose em D-Glicose 6-fosfato por minuto sob as condições de ensaio. A atividade de glicoquinase é calculada como segue: Atividade de glicoquinase (U/g de extrato de proteína total) = dOD x V/[dt x l x ɛ x Qprot], em que: - dOD é a variação de densidade óptica (OD) a 340 nm - V é o volume da reação (no presente documento 250 µl) - dt = tempo de medição (em minutos) - l = comprimento de trajeto óptico (no presente documento 0,73 cm) - ɛ = coeficiente de atenuação molar de NADPH; H+ (no presente documento 6220 cm2/µmol) - Qprot = quantidade de proteína no cadinho (em g)
[0034] As medições são triplicadas para cada amostra, e os valores de atividade específica de glicoquinase fornecidos no presente documento sob o teste A são a média de três experimentos independentes.
[0035] Em uma primeira modalidade particular da característica "a atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula", a atividade de glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre 200 e 1500 U/g de extração de proteína total, como avaliado pelo teste A. Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre 300 e 1200 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A. Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre 400 e 1000 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A. Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre um valor mínimo selecionado dentre o grupo que consiste em 200, 300 e 400 U/g de extrato de proteína total e um valor máximo selecionado dentre o grupo que consiste em 1000, 1200 e 1500 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A. É importante observar que, como mencionado no teste A, os valores de atividade de glicoquinase descritos no presente documento são a média de três experimentos independentes (triplicatas).
[0036] Em uma segunda modalidade particular da característica "a atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula", a atividade de glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre 5 e 60% de atividade da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014. "A atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710" significa que a atividade da glicoquinase da cepa DGCC7710 (isto é, com SEQ ID Nº:2), como avaliado pelo teste A na cepa DGCC7710 [isto é, o teste A é executado com o uso da cepa DGCC7710]. O valor percentual é calculado com base na atividade de glicoquinase na cepa da invenção e a atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710, ambas avaliadas pelo teste A. Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase na cepa de
Streptococcus thermophilus da invenção está entre 10 e 50% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre 15 e 40% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre uma porcentagem mínima selecionada dentre o grupo que consiste em 5, 10 e 15% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 e uma porcentagem máxima selecionada dentre o grupo que consiste em 40, 50 e 60% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular e qualquer que seja a faixa de porcentagens, a atividade da atividade de glicoquinase é avaliada pelo teste A, como descrito no presente documento. É importante destacar que os valores de porcentagem descritos no presente documento são calculados com base em valores de atividade de glicoquinase que são a média de três experimentos independentes (triplicatas), como avaliado pelo teste A.
[0037] Na primeira e na segunda modalidades particulares, as seguintes cepas podem ser usadas como controles no teste A: - como um controle positivo (isto é, uma cepa de Streptococcus thermophilus, que é representativa de cepas que portam um gene glcK sem mutação): cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014; - como um controle negativo (isto é, uma cepa de Streptococcus thermophilus que não tem atividade de glicoquinase detectável): uma Streptococcus thermophilus cujo gene glcK sofreu knockout ou uma Streptococcus thermophilus cujo gene glcK porta uma das mutações descritas nos documentos Nos WO2013/160413, WO2017/103051 ou Sørensen et al. (2016) e resumidas na Tabela 1 abaixo:
Mutação no Alteração no Mutação descrita Cepas descritas nível de nível de na cepa no documento Nº gene glcK proteína GlcK depositada T214C S72P DSM25851 WO2013/160413 WO2013/160413 C422T T141I DSM25850 Sørensen (St1-GS- 1) WO2017/103051 G745A G249R DSM28889 Sørensen (St2-GS- 1) Tabela 1: Mutações glcK que levam a uma cepa cuja atividade de glicoquinase não é detectável
[0038] Durante fermentação de leite, a lactose contida no leite (como a fonte principal de carboidrato em leite) é importada para as cepas de Streptococcus thermophilus. A lactose intracelular é, então, clivada em glicose e galactose pela enzima beta-galactosidase (de modo que 1 mol de lactose gere 1 mol de glicose e 1 mol de galactose).
[0039] A característica "a atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula" pode também ser caracterizada pela velocidade direta máxima da glicoquinase (no presente documento denominada Vmáx e definida como a velocidade da conversão de Glicose + ATP em G6P + ADP) ou pelo inverso da afinidade da glicoquinase (denominada Km) para um ou dois de seus substratos, isto é, glicose e ATP. Em uma modalidade, a característica "a atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula" para a cepa da invenção é, ainda, caracterizada pela velocidade direta máxima (Vmáx) de sua glicoquinase na dita cepa.
[0040] Portanto, em combinação com a primeira e a segunda modalidades particulares da característica "a atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula" definida no presente documento, a velocidade direta máxima (Vmáx) da glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção é significativamente reduzida, mas não nula. A característica "a Vmáx de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula" pode ser definida por um ou dois desses parâmetros: - a Vmáx está entre 200 e 1500 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste C. - a Vmáx está entre 5 e 60% da Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando avaliada pelo teste C.
[0041] Em uma modalidade particular, o gene glcK com mutação de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção codifica uma glicoquinase, em que a atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula (como definido no presente documento), e em que a velocidade direta máxima (Vmáx) de sua glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula e definida por um ou dois desses parâmetros: - a Vmáx está entre 200 e 1500 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste C. - a Vmáx está entre 5 e 60% da Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando avaliada pelo teste C.
[0042] A glicoquinase velocidade direta máxima (Vmáx) em uma Streptococcus thermophilus da invenção é avaliada pelo teste C [isto é, o teste C é executado com o uso da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção]. Teste C:
[0043] A velocidade direta máxima (Vmáx) é determinada com o uso de várias concentrações de glicose (0, 5, 10, 15, 20 mM) em extrato bruto preparado como descrito no teste A. As medições são triplicadas para cada amostra, e os valores de Vmáx fornecidos sob o teste C são a média de três experimentos independentes. A regressão linear que representa o inverso da velocidade específica em função do inverso da concentração de glicose gera o inverso da velocidade direta máxima na interseção com o eixo geométrico Y do gráfico.
[0044] Em uma modalidade particular da velocidade direta máxima da glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção, a Vmáx está entre 200 e 1500 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste C. Em uma modalidade particular, a Vmáx está entre 300 e 1200 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste C. Em uma modalidade particular, a Vmáx está entre 400 e 1000 U/g de extrato de proteína total. Em uma modalidade particular, a Vmáx da glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre um valor mínimo selecionado dentre o grupo que consiste em 200, 300 e 400 U/g de extrato de proteína total e um valor máximo selecionado dentre o grupo que consiste em 1000, 1200 e 1500 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste C.
[0045] Em uma modalidade particular da velocidade direta máxima da glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção, a Vmáx está entre 5 e 60% da Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710. "Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710" significa a Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710 (isto é, com SEQ ID Nº:2) como avaliado pelo teste C na cepa DGCC 7710 [isto é, o teste C é executado com o uso da cepa DGCC7710]. O valor percentual é calculado com base na Vmáx da glicoquinase na cepa da invenção e na Vmáx da cepa DGCC7710, ambas avaliadas pelo teste C. Em uma modalidade particular, o Vmáx de glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre 10 e 50% da Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710, quando ambas foram testadas pelo teste C. Em uma modalidade particular, a Vmáx de glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre 15 e 40% da Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a Vmáx da glicoquinase na cepa de Streptococcus thermophilus da invenção está entre uma porcentagem mínima selecionada dentre o grupo que consiste em 5, 10 e 15% da Vmáx da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 e uma porcentagem máxima selecionada dentre o grupo que consiste em 40, 50 e 60% da Vmáx da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710.
[0046] A cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção porta uma mutação no gene glcK que codifica uma glicoquinase, cuja atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e opcionalmente em que a velocidade direta máxima da glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento.
[0047] "Mutação no gene glcK" dentro da presente invenção significa qualquer variação de nucleotídeo dentro do gene glcK, em que a dita variação no nível de nucleotídeo leva a uma atividade de glicoquinase em uma cepa que porta esse gene glcK com mutação (como o único gene glcK) que é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e opcionalmente leva a uma velocidade direta máxima da glicoquinase na dita cepa que é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento. Em uma modalidade particular, "mutação no gene glcK" dentro da presente invenção significa qualquer variação de nucleotídeo dentro do quadro de leitura aberto do gene glcK, em que a dita variação no nível de nucleotídeo leva a uma atividade de glicoquinase em uma cepa que porta esse gene glcK com mutação (como o único gene glcK)
que é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e opcionalmente leva a uma velocidade direta máxima da glicoquinase na dita cepa que é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento.
[0048] Assim, embora duas cepas de Streptococcus thermophilus possam diferir pela sequência de seu respectivo gene glcK, isso não significa necessariamente que um desses dois genes glcK tem mutação no sentido da invenção. De fato, não são consideradas como mutações dentro da presente invenção: - variações no nível de nucleotídeo que não levam a qualquer alteração no nível de proteína (variação silenciosa) e que não impactam a tradução do RNA de glcK; e - variações no nível de nucleotídeo que levam a uma alteração no nível de proteína, mas em que essa alteração não impacta a atividade de glicoquinase da proteína GlcK resultante e opcionalmente a velocidade direta máxima da proteína GlcK resultante, como definido no presente documento. De fato, tais variações podem ser observadas no nível do gene glcK da Streptococcus thermophilus da invenção sem impactar o escopo de proteção.
[0049] Os exemplos não limitantes de genes glcK que não são considerados com mutação no sentido da invenção são: - o polinucleotídeo que codifica a glicoquinase como definido na SEQ ID Nº:2 (GlcK tipo ST1), em particular o polinucleotídeo como definido na SEQ ID Nº:1; esse tipo de GlcK é aquele da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014; - o polinucleotídeo que codifica a glicoquinase como definido na SEQ ID Nº:4 (GlcK tipo ST2), em particular, o polinucleotídeo como definido na SEQ ID Nº:3; - o polinucleotídeo que codifica a glicoquinase como definido na SEQ ID Nº:6 (GlcK tipo ST3), em particular, o polinucleotídeo como definido na SEQ ID Nº:5; - o polinucleotídeo que codifica a glicoquinase como definido na SEQ ID Nº:8 (GlcK tipo ST4), em particular, o polinucleotídeo como definido na SEQ ID Nº:7; - o polinucleotídeo que codifica a glicoquinase como definido na SEQ ID Nº:10 (GlcK tipo ST5), em particular, o polinucleotídeo como definido na SEQ ID Nº:9; - o polinucleotídeo que codifica a glicoquinase como definido na SEQ ID Nº:12 (GlcK tipo ST6), em particular, o polinucleotídeo como definido na SEQ ID Nº:11; - o polinucleotídeo que codifica a glicoquinase como definido na SEQ ID Nº:14 (GlcK tipo ST7), em particular, o polinucleotídeo como definido na SEQ ID Nº:13; - o polinucleotídeo que codifica a glicoquinase como definido na SEQ ID Nº:16 (GlcK tipo ST8), em particular, o polinucleotídeo como definido na SEQ ID Nº:15; - o polinucleotídeo que codifica a glicoquinase como definido na SEQ ID Nº:18 (GlcK tipo ST9), em particular, o polinucleotídeo como definido na SEQ ID Nº:17; - o polinucleotídeo que codifica a glicoquinase como definido na SEQ ID Nº:20 (GlcK tipo ST10), em particular, o polinucleotídeo como definido na SEQ ID Nº:19.
[0050] As diferenças de aminoácidos no nível da glicoquinase juntamente com a porcentagem de identidade de cada tipo de GlcK para a SEQ ID Nº:2 são resumidas na Tabela 3 (exemplo 2). A atividade de glicoquinase nas cepas dos tipos de GlcK ST2 a ST10 é resumida na Tabela 4 (exemplo 3).
[0051] Entretanto, algumas mutações de nucleotídeo dentro do gene glcK não são consideradas adequadas para o propósito da invenção devido ao fato de que levam a uma glicoquinase cuja atividade é nula ou está abaixo do valor mínimo definido no presente documento, como avaliado pelo teste A. Os exemplos não limitantes de mutações não adequadas são descritos na Tabela 1. Em uma modalidade, a Streptococcus thermophilus da invenção não porta uma mutação selecionada dentre o grupo que consiste em uma mutação que leva ao knockout do gene glcK e grandes deleções dentro do gene glcK.
[0052] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção porta uma mutação no quadro de leitura aberto do gene glcK que leva à substituição de um aminoácido na proteína GlcK, cuja atividade de glicoquinase na dita cepa que porta o gene glcK com mutação é significativamente reduzida, mas não nula (como definido no presente documento) e opcionalmente em que a velocidade direta máxima da glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento. Em uma modalidade particular, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção porta uma mutação no gene glcK que leva à substituição de um aminoácido na proteína GlcK, cuja atividade de glicoquinase na dita cepa que porta o gene glcK com mutação é significativamente reduzida, mas não nula (como definido no presente documento) e opcionalmente em que a velocidade direta máxima da glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento. Em uma modalidade particular, a cepa de Streptococcus thermophilus da invenção porta uma mutação no gene glcK, de modo que a proteína GlcK tenha 322 aminoácidos de comprimento e em que a atividade de glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e opcionalmente em que a velocidade direta máxima da glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento.
[0053] Como discutido acima, podem ser observadas algumas modificações de DNA no nível do gene glcK da Streptococcus thermophilus da invenção que não impactam a atividade de glicoquinase da cepa. Com base no teste A definido no presente documento juntamente com as cepas de controle definidas no presente documento, o versado na técnica poderia saber como identificar 1) um gene glcK que codifica uma glicoquinase, cuja atividade de glicoquinase em uma cepa que porta esse glcK é significativamente reduzida, mas não nula (como definido no presente documento), e opcionalmente em que a velocidade direta máxima da glicoquinase em uma cepa que porta esse gene glcK com mutação é significativamente reduzida, mas não nula (como definido no presente documento), 2) um gene glcK que porta uma modificação que não tem impacto sobre a atividade de glicoquinase em uma cepa que porta essa modificação ou 3) um gene glcK que codifica uma glicoquinase, em que a atividade de glicoquinase em uma cepa que porta esse gene glcK é nula (como definido no presente documento).
[0054] A cepa DGCC7710 pode ser usada como um controle substituindo-se seu gene glcK pelo gene glcK a ser avaliado para obter um derivado de DGCC7710 e avaliando-se o derivado de DGCC7710 pelo teste A (atividade de glicoquinase) ou pelo teste C (Vmáx).
[0055] Os inventores identificaram duas posições dentro da glicoquinase, para as quais a natureza do aminoácido mostrou impactar a atividade da glicoquinase, de modo que a atividade de glicoquinase seja significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e impactar a Vmáx da glicoquinase, de modo que a Vmáx seja significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento: posição 144 e posição 275 da glicoquinase (isto é, códon 144 e 275 do gene glcK). É importante observar que, com base nos testes A e C definidos no presente documento juntamente com as cepas de controle, o versado na técnica poderia saber como identificar outras posições e aminoácidos adequados dentro da glicoquinase, para obter uma atividade de glicoquinase significativamente reduzida, mas não nula (como definido no presente documento), e opcionalmente uma velocidade direta máxima que é significativamente reduzida, mas não nula, e, assim, o gene glcK correspondente.
[0056] Em uma modalidade, o aminoácido na posição 275 da glicoquinase (codificada pelo gene glcK da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção) não é um ácido glutâmico (isto é, é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico); assim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção não é GAA nem GAG. Em uma modalidade particular, o aminoácido na posição 275 da glicoquinase não é um aminoácido ácido (isto é, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido); assim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que codifica um aminoácido não ácido. Em uma modalidade particular, o aminoácido na posição 275 da glicoquinase é selecionado dentre o grupo que consiste em lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos; assim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que codifica um aminoácido selecionado dentre o grupo que consiste em uma lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos. Em uma modalidade particular, o aminoácido na posição 275 da glicoquinase é uma lisina; assim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é AAA ou AAG. Em uma modalidade particular, os nucleotídeos 823-825 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção são AAA ou AAG.
[0057] Em uma modalidade particular, a sequência da proteína GlcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção é selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência como definido na SEQ ID Nº:25, em que o aminoácido na posição 275 é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina; e b) uma sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº: 25, em que o aminoácido da glicoquinase que corresponde à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK tem 322 aminoácidos de comprimento.
[0058] Em outra modalidade, o aminoácido na posição 144 da glicoquinase (codificada pelo gene glcK da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção) não é uma glicina (isto é, é qualquer aminoácido exceto uma glicina); assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção não é GGT, GGC, GGA ou GGG. Em uma modalidade particular, o aminoácido na posição 144 da glicoquinase não é um aminoácido alifático (isto é, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático). Em uma modalidade particular, o aminoácido na posição 144 da glicoquinase é selecionado dentre o grupo que consiste em serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos; assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que codifica um aminoácido selecionado dentre o grupo que consiste em uma serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos. Em uma modalidade particular, o aminoácido na posição 144 da glicoquinase é uma serina; assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é AGT, AGC, TCT, TCC, TCA ou TCG. Em uma modalidade particular, os nucleotídeos 430-432 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção são AGT, AGC, TCT, TCC, TCA ou TCG.
[0059] Em uma modalidade particular, a sequência da proteína GlcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção é selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência como definido na SEQ ID Nº:46, em que o aminoácido na posição 144 qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina; e b) uma sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº: 46, em que o aminoácido da glicoquinase que corresponde à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK tem 322 aminoácidos de comprimento.
[0060] Para a definição da variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, a similaridade ou a identidade é calculada no presente documento em relação ao comprimento total das duas sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácido similares ou idênticos na parte (ou partes) alinhada das sequências]; a posição 275, como definido na SEQ ID Nº:25, não é considerada para o cálculo da similaridade ou da identidade. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, em que o aminoácido correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. Em uma modalidade, a sequência variante GlcK tem pelo menos 95% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, em que o aminoácido correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. Em uma modalidade, a sequência variante GlcK tem pelo menos 97% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, em que o aminoácido correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina.
[0061] Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº:25 em de 1 a 30 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina (a posição 275 não é considerada para o cálculo do número de substituições). Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº:25 em de 1 a 20 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da
SEQ ID Nº: 25 em de 1 a 15 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº: 25 em de 1 a 10 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº: 25 em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina.
[0062] Para a definição da variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, a similaridade ou a identidade é calculada no presente documento em relação ao comprimento total das duas sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácido similares ou idênticos na parte (ou partes) alinhada das sequências]; a posição 144, como definido na SEQ ID Nº:46, não é considerada para o cálculo da similaridade ou da identidade. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, em que o aminoácido correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina. Em uma modalidade, a sequência variante GlcK tem pelo menos 95% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, em que o aminoácido correspondente à posição 144 da SEQ ID
Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina. Em uma modalidade, a sequência variante GlcK tem pelo menos 97% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, em que o aminoácido correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina.
[0063] Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº:46 em de 1 a 30 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina (a posição 144 não é considerada para o cálculo do número de substituições). Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº:46 em de 1 a 20 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº: 46 em de 1 a 15 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº: 46 em de 1 a 10 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da
SEQ ID Nº:46 em de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina.
[0064] Em uma modalidade, a sequência da proteína GlcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nºs: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34, em que o aminoácido na posição 275 da glicoquinase não é um ácido glutâmico, em particular não é um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina, respectivamente.
[0065] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:25 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) não é um ácido glutâmico; assim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção não é GAA nem GAG; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilusda invenção codifica uma proteína GlcK, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº: 25 que qualquer sequência variante
GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), em que o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) não é um ácido glutâmico.
[0066] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:25 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) não é um aminoácido ácido; assim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que não codifica um aminoácido ácido; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº: 25 que qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), em que o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) não é um aminoácido ácido.
[0067] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:25 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é selecionado dentre o grupo que consiste em lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos; assim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que codifica um aminoácido selecionado dentre o grupo que consiste em lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº: 25 que qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34, em que o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é uma lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos.
[0068] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:25 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é uma lisina; assim, em uma modalidade, o códon 275 do gene glcK portada pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que codifica uma lisina, respectivamente, em particular, é AAA ou AAG, respectivamente; assim, em uma modalidade particular, a sequência da proteína GlcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nºs: 22, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nºs: 22, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 e 43;, em uma modalidade particular, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é como definido na SEQ ID Nº:21.
[0069] Em outra modalidade, a sequência da proteína GlcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nºs: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 e 55, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nºs: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 e 55, em que o aminoácido na posição 144 da glicoquinase não é uma glicina, em particular, não é um aminoácido alifático, em particular, é uma serina.
[0070] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:46 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) não é uma glicina; assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção não é GGT, GGC, GGA ou GGG; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº: 46 que qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46,
como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), em que o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) não é uma glicina.
[0071] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:46 ou qualquer sequência variante GlcK que tem menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) não é um aminoácido alifático; assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que não codifica um aminoácido alifático; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº:46 e qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), em que o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) não é um aminoácido alifático.
[0072] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:46 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é selecionado dentre o grupo que consiste em serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos; assim, em uma modalidade, o códon
144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que codifica um aminoácido selecionado dentre o grupo que consiste em serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº: 46 que qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), em que o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é uma serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos.
[0073] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:46 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é uma serina; assim, em uma modalidade, o códon 144 do gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é um códon que codifica uma serina, em particular, é AAA ou AAG; assim, em uma modalidade particular, a sequência da proteína GlcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nºs: 45, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 e 64; assim, em uma modalidade, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína GlcK, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nºs: 45, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 e 64; em uma modalidade particular, o gene glcK portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é como definido na SEQ ID Nº:44.
[0074] Quando definida a sequência da proteína GlcK da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção, está de acordo com o ensinamento deste pedido que a atividade de glicoquinase na cepa que expressa essa proteína GlcK seja significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e opcionalmente, que a Vmáx da glicoquinase nessa cepa seja significativamente reduzida, mas não nula como definido no presente documento. II. Mutações de um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular, mutações dos genes manL, manM e manN.
[0075] Essa parte descreve mutações de um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular mutações dos genes manL, manM e manN, que podem ser usadas em combinação com uma mutação de um gene glcK, como definido no presente documento, ou em combinação com uma mutação de um gene ccpA, como definido no presente documento, ou em combinação com tanto uma mutação de um gene glcK quanto uma mutação de um ccpA, gene como definido no presente documento, no contexto de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção.
[0076] Qualquer mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é adequada, contanto que, quando combinada com um gene glcK com mutação, como definido no presente documento, ou combinada com uma mutação de um gene ccpA, como definido no presente documento, ou quando combinada tanto com um glcK com mutação quanto com um gene ccpA com mutação, como definido no presente documento, em uma cepa de
Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado seja maior que 1,2, como definido no presente documento, quando a dita cepa é usada para fermentar leite (pelo teste B).
[0077] Os inventores mostraram que mutações em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular, em um gene manL com mutação, um gene manM com mutação, um gene manN com mutação ou um gene manO com mutação, que reduzem ou abolem a importação de glicose do meio em uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, são particularmente vantajosas dentro da invenção. Em uma modalidade, a mutação do gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose leva à redução ou abolição da atividade de importação de glicose da proteína codificada por esse gene. Em uma modalidade, o gene com mutação é o gene manL e a mutação do gene manL leva à redução ou abolição da atividade de importação de glicose da proteína IIABMan. Em uma modalidade, o gene com mutação é o gene manM e a mutação do gene manM leva à redução ou abolição da atividade de importação de glicose da proteína IICMan. Em uma modalidade, o gene com mutação é o gene manN e a mutação do gene manN leva à redução ou abolição da atividade de importação de glicose da proteína IIDMan.
[0078] Em uma modalidade, a mutação do gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular, do gene manL, do gene manM ou do gene manN, é uma mutação que leva ao knockout (isto é, a interrupção completa) do gene.
[0079] Em uma modalidade, a mutação do gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular do gene manL, do gene manM ou do genemanN, é uma a mutação do promotor do gene, em particular, uma mutação do promotor do gene que reduz ou inibe a transcrição do gene.
[0080] Em uma modalidade, a mutação do gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular do gene manL, do gene manM ou do gene manN, é uma mutação introduzida na sequência de codificação do gene, em particular, uma mutação que leva à redução ou abolição da atividade de importação de glicose da proteína codificada pelo gene com mutação, em particular, à redução ou à abolição da atividade de importação de glicose da proteína IIABMan, da proteína IICMan ou da proteína IIDMan.
[0081] Em uma modalidade, a mutação do gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular do gene manL, do gene manM ou do gene manN é uma mutação na sequência de codificação do gene, que leva a uma proteína truncada, em particular a uma proteína IIABMan truncada, uma proteína IICMan truncada ou uma proteína IIDMan truncada, em particular, a uma proteína truncada (tal como uma proteína IIABMan truncada, uma proteína IICMan truncada ou uma proteína IIDMan truncada) que tem uma atividade de importação de glicose reduzida ou abolida. Qualquer que seja a posição do truncamento, a mutação introduzida no gene é uma substituição de nucleotídeo que leva a um códon de parada ou uma deleção, inserção ou deleção/inserção que leva a um deslocamento do quadro de leitura aberto e um códon de parada prematuro. Em uma modalidade, a mutação introduzida no gene é uma substituição de nucleotídeo que leva a um códon de parada. Em uma modalidade, a mutação introduzida no gene é uma deleção, inserção ou deleção/inserção que leva a um deslocamento do quadro de leitura aberto e um códon de parada prematuro.
[0082] Embora duas cepas de Streptococcus thermophilus possam diferir pela sequência de seu respectivo gene manL, manM ou manN,
isso não significa necessariamente que um desses genes tenha mutação no sentido da invenção. De fato, não são consideradas como mutações do gene manL, manM ou manN dentro da presente invenção: - variações no nível de nucleotídeo que não levam a qualquer alteração no nível de proteína (variação silenciosa) e que não impactam a tradução do RNA de manL, manM ou manN; e - variações no nível de nucleotídeo que levam a uma alteração no nível de proteína, mas em que essa alteração não possibilita, quando combinada com um gene glcK com mutação, como definido no presente documento, ou combinada com uma mutação de um gene ccpA, como definido no presente documento, ou quando combinada tanto com um gene glcK com mutação quanto com um gene ccpA com mutação em uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, atingir uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado maior do que 1,2, como definido no presente documento, quando a dita cepa é usada para fermentar leite (pelo teste B).
[0083] Os exemplos não limitantes de genes manL, manM e manN (que codificam, respectivamente, a proteína IIABMan, a proteína IICMan e a proteína IIDMan) que não são considerados mutantes no sentido da invenção são: - o polinucleotídeo que codifica a proteína IIABMan, como definido na SEQ ID Nº:78 (IIABMan tipo ST1), em particular, o polinucleotídeo, como definido na SEQ ID Nº:77; esse tipo de IIABMan é aquele da cepa DGCC7710; - o polinucleotídeo que codifica a proteína IIABMan, como definido na SEQ ID Nº: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 e 110 (IIABMan tipo ST2 a ST17), em particular, o polinucleotídeo, como definido na SEQ ID Nº: 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91,
93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107 e 109. A sequência das proteínas IIABMan, como definido na SEQ ID Nº: 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108 e 110 é de 98,4 a 99,6% idêntica à SEQ ID Nº:78; - o polinucleotídeo que codifica a proteína IICMan, como definido na SEQ ID Nº:130 (IICMan tipo ST1), em particular, o polinucleotídeo, como definido na SEQ ID Nº:129; esse tipo de IICMan é aquele de DGCC7710; - o polinucleotídeo que codifica a proteína IICMan, como definido na SEQ ID Nº:132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 e 156 (IICMan tipo ST2 a ST14), em particular, o polinucleotídeo, como definido na SEQ ID Nº:131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153 e 155. A sequência das proteínas IIC Man, como definido na SEQ ID Nº: 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154 e 156, é de 98,5 a 99,6% idêntica à SEQ ID Nº:130; - o polinucleotídeo que codifica a proteína IIDMan, como definido na SEQ ID Nº:167 (IIDMan tipo ST1), em particular, o polinucleotídeo, como definido na SEQ ID Nº:166; esse tipo de IIDMan é aquele da cepa DGCC7710; - o polinucleotídeo que codifica a proteína IIDMan, como definido na SEQ ID Nº:169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203 e 205 (IIDMan tipo ST2 a ST20), em particular, o polinucleotídeo, como definido na SEQ ID Nº:168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202 e 204. A sequência das proteínas IIDMan, como definido na SEQ ID Nº: 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203 e 205, é de 97,3 a 99,6% idêntica à SEQ ID Nº:167.
[0084] Os inventores identificaram pelo menos uma mutação no gene manL, que, quando inserida no gene manL de uma cepa de
Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose original [com mutação no gene glcK, no gene ccpA ou em ambos os genes glcK e ccpA, como definido no presente documento], possibilita, quando a dita cepa é usada para fermentar leite, atingir uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose liberada (mM) no dito leite fermentado que é maior que 1,2, como definido no presente documento (como avaliado pelo teste B).
[0085] Em uma modalidade, a mutação no gene manL leva ao truncamento da proteína IIABMan na posição 305. Em uma modalidade, a mutação no gene manL é a substituição do nucleotídeo G pelo nucleotídeo T na posição 916 (levando a um códon de parada na posição 306). Uma proteína IIABMan de Streptococcus thermophilus truncada na posição 305 é denominada no presente documento IIABMan305.
[0086] Em uma modalidade, a sequência da dita proteína IIABMan truncada na posição 305 é selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência como definido na SEQ ID Nº:112; e b) uma sequência variante de IIABMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:112, em particular, tendo 305 aminoácidos de comprimento.
[0087] Para a definição da variante IIABMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:112, a similaridade ou a identidade é calculada no presente documento em relação ao comprimento total das duas sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácido similares ou idênticos na parte (ou partes) alinhada das sequências]. Em uma modalidade particular, a sequência variante IIABMan tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº: 112.
[0088] Em uma modalidade particular, a sequência variante IIABMan difere da SEQ ID Nº:112 em de 1 a 30 substituições de aminoácido. Em uma modalidade particular, a sequência variante IIABMan difere da SEQ ID Nº: 112 em de 1 a 20 substituições de aminoácido. Em uma modalidade particular, a sequência variante IIABMan difere da SEQ ID Nº: 112 em de 1 a 15 substituições de aminoácido. Em uma modalidade particular, a sequência variante IIABMan difere da SEQ ID Nº: 112 em de 1 a 10 substituições de aminoácido. Em uma modalidade particular, a sequência variante IIABMan difere de SEQ ID Nº: 112 em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácido. Em uma modalidade, a sequência da proteína IIABMan da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nºs: 112 a 128.
[0089] Em uma modalidade, o gene manL portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína IIABMan, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº: 112 e qualquer sequência variante IIABMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº: 112, como definido no presente documento (em particular a SEQ ID Nº:113 a 128). Em uma modalidade, o gene manL portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é como definido na SEQ ID Nº:111.
[0090] Os inventores identificaram pelo menos uma mutação no gene manM, que, quando inserida no gene manL de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose original [com mutação no gene glcK, no gene ccpA ou em ambos os genes glcK e ccpA, como definido no presente documento], possibilita, quando a dita cepa é usada para fermentar leite, atingir uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose liberada (mM) no dito leite fermentado maior que 1,2, como definido no presente documento (como avaliado pelo teste B).
[0091] Em uma modalidade, a mutação no gene manM leva ao truncamento da proteína IICMan na posição 208. Em uma modalidade, a mutação no gene manM é a substituição do nucleotídeo G pelo nucleotídeo T na posição 625 (levando a um códon de parada na posição 209). Uma proteína IICMan de Streptococcus thermophilus truncada na posição 208 é denominada no presente documento IICMan208.
[0092] Em uma modalidade, a sequência da dita proteína IICMan truncada na posição 208 é selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência como definido na SEQ ID Nº:158; e b) uma sequência variante de IICMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:158, em particular, tendo 208 aminoácidos de comprimento.
[0093] Para a definição da variante IICMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:158, a similaridade ou a identidade é calculada no presente documento em relação ao comprimento total das duas sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácido similares ou idênticos na parte (ou partes) alinhada das sequências]. Em uma modalidade particular, a sequência variante IICMan tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº: 158.
[0094] Em uma modalidade particular, a sequência variante IICMan difere da SEQ ID Nº:158 em de 1 a 30 substituições de aminoácido. Em uma modalidade particular, a sequência variante IICMan difere da SEQ ID Nº:158 em de uma a 20 substituições de aminoácido. Em uma modalidade particular, a sequência variante IICMan difere da SEQ ID Nº:158 em de 1 a 15 substituições de aminoácido. Em uma modalidade particular, a sequência variante IICMan difere da SEQ ID Nº:158 em de uma a 10 substituições de aminoácido. Em uma modalidade particular, a sequência variante IICMan difere da SEQ ID Nº:158 em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácido. Em uma modalidade, a sequência da proteína IICMan da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nº:158 a 165.
[0095] Em uma modalidade, o gene manM portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína IICMan, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº:158 e qualquer sequência variante IICMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:158, como definido no presente documento (em particular as SEQ ID Nº:159 a 165). Em uma modalidade, o gene manM portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é como definido na SEQ ID Nº:157.
[0096] Os inventores identificaram pelo menos uma mutação no gene manN, que, quando inserida no gene manN de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose original [com mutação no gene glcK, no gene ccpA ou em ambos os genes glcK e ccpA, como definido no presente documento], possibilita, quando a dita cepa é usada para fermentar leite, atingir uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose liberada (mM) no dito leite fermentado maior que 1,2, como definido no presente documento (como avaliado pelo teste B).
[0097] Em uma modalidade, a mutação no gene manN leva ao truncamento da proteína IIDMan na posição 28. Em uma modalidade, a mutação no gene manN é uma inserção de um nucleotídeo A no estiramento de 5 nucleotídeos A nas posições 37-41 (que leva a um estiramento de 6 nucleotídeos A, um deslocamento do quadro de leitura aberto e um truncamento da proteína IIDMan na posição 28). Essa proteína IIDMan de Streptococcus thermophilus truncada na posição 28 é denominada no presente documento IIDMan28.
[0098] Em uma modalidade, a sequência da dita proteína IIDMan truncada na posição 28 é selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência como definido na SEQ ID Nº:207; e b) uma sequência variante de IIDMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:207, em particular, tendo 28 aminoácidos de comprimento.
[0099] Para a definição da variante IIDMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:207, a similaridade ou a identidade é calculada no presente documento em relação ao comprimento total das duas sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácido similares ou idênticos na parte (ou partes) alinhada das sequências]. Em uma modalidade particular, a sequência variante IICMan tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:207.
[0100] Em uma modalidade particular, a sequência variante IIDMan difere da SEQ ID Nº:207 em de 1 a 10 substituições de aminoácido. Em uma modalidade particular, a sequência variante IIDMan difere da SEQ ID Nº:207 em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de aminoácido. Em uma modalidade, a sequência da proteína IIDMan da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nº:207 a 211.
[0101] Em uma modalidade, o gene manN portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção codifica uma proteína IIDMan, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº:207 e qualquer sequência variante IIDMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:207, como definido no presente documento (em particular as SEQ ID Nº: 208 a 211). Em uma modalidade, o gene manN portado pela cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é como definido na SEQ ID Nº:206.
[0102] Qualquer que seja a mutação do gene glcK, como definido no presente documento, e a mutação do gene ccpA, como definido no presente documento (presente sozinha ou combinada em uma cepa de
Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção), pelo menos um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose tem mutação, como definido no presente documento. Qualquer que seja a modalidade, a invenção abrange uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta uma mutação em um, dois ou três genes selecionados dentre o grupo que consiste no gene manL, no gene manM e no gene manN. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção porta uma mutação em manL. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção porta uma mutação em manM. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção porta uma mutação em manN. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção porta uma mutação em manL e uma mutação em manM. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção porta uma mutação em manL e uma mutação em manN. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção porta uma mutação em manM e uma mutação em manN. Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção porta uma mutação em manL, uma mutação em manM e uma mutação em manN.
[0103] Qualquer método pode ser usado para identificar uma mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular, no gene manL, no gene manM ou no gene manN adequado com a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção.
[0104] Como um exemplo para identificar uma mutação adequada no gene manL, no gene manM ou no gene manN, o versado na técnica pode proceder pelo seguinte método: a) fornecer a cepa DSM32587 (com mutação em seu gene glcK) b) executar mutagênese no gene manL, manM ou manN da cepa em a), por exemplo, por mutagênese aleatória ou dirigida, para obter um gene manL, manM ou manN, cuja sequência é diferente da sequência do gene manL, manM ou manN de DSM32587, para obter uma cepa DSM32587 com mutação em man; c) determinar pelo teste B a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) em leite fermentado com a cepa DSM32587 com mutação em man da etapa b), em que uma razão maior do que 1,2 significa que o gene manL, manM ou manN com mutação está de acordo com a invenção. Em uma modalidade particular, um gene manL, manM ou manN com mutação é considerado como estando de acordo com a invenção quando a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no leite fermentado é maior do que 1,5, é maior do que 2 ou é maior do que 3.
[0105] Alternativamente, o versado na técnica pode proceder pelo seguinte método: a) fornecer uma cepa DGCC7710 em que seu gene ccpA foi substituído pelo gene ccpA com mutação, como definido na SEQ ID Nº:71 (ccpAΔ1A114-120), chamada no presente documento cepa DGCC7710-ccpAΔ1A114-120; b) executar mutagênese no gene manL, manM ou manN da cepa em a), por exemplo, por mutagênese aleatória ou dirigida, para obter um gene manL, manM ou manN, cuja sequência é diferente da sequência do gene manL, manM ou manN da cepa DGCC7710-
ccpAΔ1A114-120, para obter uma cepaDGCC7710-ccpAΔ1A114-120 com mutação em man; c) determinar pelo teste B a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) em leite fermentado com a cepa DGCC7710-ccpAΔ1A114-120 com mutação em man da etapa b), em que uma razão maior do que 1,2 significa que o gene manL, manM ou manN com mutação está de acordo com a invenção. Em uma modalidade particular, um gene manL, manM ou manN com mutação é considerado como estando de acordo com a invenção quando a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no leite fermentado é maior do que 1,5, é maior do que 2 ou é maior do que 3.
[0106] Uma vez identificado, o gene manL, manM ou manN com mutação de acordo com a invenção pode ser introduzido em vez do manL, manM ou manN de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, para obter uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção. III. Mutações do gene ccpA
[0107] Essa parte descreve mutações do gene ccpA que podem ser usadas em combinação com uma mutação de um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, como definido no presente documento, ou em combinação com uma mutação de um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, como definido no presente documento, e uma mutação do gene glcK, como definido no presente documento, no contexto de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção.
[0108] Qualquer mutação no gene ccpA é adequado, contanto que, quando combinada com um gene glcK com mutação, como definido no presente documento, ou combinada com um gene com mutação que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, como definido no presente documento, ou quando combinada com um gene glcK com mutação e um gene com mutação que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, como definido no presente documento, em uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado seja maior do que 1,2, como definido no presente documento, quando a dita cepa é usada para fermentar leite.
[0109] Os inventores mostraram que as mutações do gene ccpA, que levam a uma cepa de Streptococcus thermophilus da invenção, podem ser caracterizadas pela razão entre a atividade de beta- galactosidase, como avaliado pelo teste D, e a atividade de glicoquinase, como avaliado pelo teste E, em uma cepa que porta esse ccpA com mutação. Assim, uma mutação de ccpA, como definido no presente documento, é uma mutação do gene ccpA que leva a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que exibe uma razão entre a atividade de beta- galactosidase, como avaliado pelo teste D, e a atividade de glicoquinase, como avaliado pelo teste E, que é pelo menos 4,10-6. Em uma modalidade, a razão entre a atividade de beta-galactosidase, como avaliado pelo teste D, e a atividade de glicoquinase, como avaliado pelo teste E, é selecionada dentre o grupo que consiste em pelo menos 4,10-6, pelo menos 5,10-6, pelo menos 6,10-6, pelo menos 7,10-6 ou pelo menos 8,10-6. Em uma modalidade, a razão entre a atividade de beta-galactosidase, como avaliado pelo teste D, e a glicoquinase, como avaliado pelo teste E, é pelo menos 5,10-6. Em uma modalidade, a razão entre a atividade de beta-galactosidase, como avaliado pelo teste D, e a glicoquinase, como avaliado pelo teste E, é pelo menos 6,10-6. Em uma modalidade, a razão entre a atividade de beta-galactosidase, como avaliado pelo teste D, e a glicoquinase, como avaliado pelo teste E, é pelo menos 7,10-6. Em uma modalidade, a razão entre a atividade de beta-galactosidase, como avaliado pelo teste D, e a glicoquinase, como avaliado pelo teste E, é pelo menos 8,10-6. Qualquer que seja o valor mínimo da razão, como definido no presente documento, a razão entre a atividade de beta-galactosidase, como avaliado pelo teste D, e a atividade de glicoquinase, como avaliado pelo teste E, não é menor do que 8,10-3.
[0110] Para a determinação da razão entre a atividade de beta- galactosidase e a atividade de glicoquinase na cepa da invenção, o teste D e o teste E, como descrito no presente documento, são usados: Teste D:
[0111] A atividade de beta-galactosidase em uma cepa de Streptococcus thermophilus da invenção é avaliada pelo teste D [isto é, o teste D é executado com o uso da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção].
[0112] Uma cultura fresca de um dia para o outro da cepa de Streptococcus thermophilus a ser avaliada em M17 contendo 30 g/l de lactose é obtida e usada para inocular a 1% (vol/vol) 10 ml de M17 fresco 30 g/l de lactose. As células são coletadas por centrifugação (6000 g, 10 minutos, 4°C) após 3 horas de cultivo em M17 + 30 g/l de lactose a 42°C, lavadas em 1,5 ml de tampão de lise frio (KPO4 0,1 M) e ressuspensas em 300 de tampão de lise frio. Inibidores de protease sem EDTA "cOmpleteTM" (Roche, referência do fornecedor 04693132001) são adicionados em tampão de lise, como descrito pelo fornecedor. As células são rompidas pela adição de 100 mg de microesferas de vidro (150-212 µm, Sigma G1145) a 250 µl de células ressuspensas e oscilação a uma frequência de 30 ciclos/s por 6 minutos em um moinho oscilante MM200 (Retsch, Haan, Alemanha). Os restos de células e microesferas de vidro são removidos por centrifugação (14000 g, 15 minutos, 4°C), e o sobrenadante transferido para um tubo de centrifugação de 1,5 ml limpo mantido em gelo. O teor total de proteína é determinado com o uso do FLUKA Protein Quantification Kit-Rapid (ref 51254). A atividade de beta-galactosidase nos extratos celulares é determinada espectrofotometricamente por um monitoramento da hidrólise de O-nitro-Fenol-Beta-Glactosídeo (ONPG) em galactose e O-nitro-fenol (ONP). 20 µl do extrato de bactérias são misturados com 135 µl de Tampão de Reação (NaPO4 0,1 M + KCl 0,01 M + MgSO4 0,001 M + ONPG 3 mM + Beta Mercapto Etanol 60 mM, pH = 6). A produção de ONP leva a uma cor amarela no tubo. Quando essa cor aparece, a reação é bloqueada adicionando-se 250 µl de tampão de parada (Na2CO3 1 M). A densidade óptica a 420 nm é medida com o uso de um leitor de microplaca de múltipla detecção Synergy HT (BIO- TEK). Uma unidade de galactosidase corresponde à quantidade de enzima que catalisa a produção de 1 µmol de ONP por minuto sob as condições de ensaio. A atividade de beta-Galactosidase é calculada como segue:
[0113] Atividade de beta-Galactosidase (U/g de extrato de proteína total) = dOD x V/[dt x l x ɛ x Qprot], em que: - dOD é a variação de densidade óptica (OD) a 420 nm entre o branco e a amostra testada - V é o volume da reação em que a densidade óptica é medida (no presente documento 250 µl) - dt = representa duração em minutos entre a adição dos 20 µl de extrato bacteriano e a adição dos 250 µl de tampão de parada - l = comprimento de trajeto óptico (no presente documento 0,73 cm) - ɛ = coeficiente de atenuação molar de ONP (no presente documento 4500 cm2/µmol)
- Qprot = quantidade de proteína no cadinho (em g)
[0114] As medições são pelo menos triplicadas para cada amostra, e os valores de atividade específica de beta-galactosidase fornecidos no presente documento sob o teste D são a média de três experimentos independentes. Teste E
[0115] A atividade de glicoquinase em uma cepa de Streptococcus thermophilus da invenção, para a determinação da razão, é avaliada pelo teste E [isto é, o teste E é executado com o uso da cepa de Streptococcus thermophilus da invenção].
[0116] Uma cultura fresca de um dia para o outro da cepa de Streptococcus thermophilus a ser avaliada em M17 contendo 30 g/l de lactose é obtida e usada para inocular a 1% (vol/vol) 10 ml de M17 fresco 30 g/l de lactose. As células são coletadas por centrifugação (6000 g, 10 min, 4°C) após 3 horas de cultivo em M17 + 30 g/l de lactose a 42°C, lavadas em 1,5 ml de tampão de GLCK frio (MgCl2 5 mM, K2HPO4/KH2PO4 [pH 7,2] 10 mM) e ressuspensas em 300 µl de tampão de GLCK frio. Inibidores de protease sem EDTA "cOmpleteTM" (Roche, referência do fornecedor 04693132001) são adicionados em tampão GLCK, como descrito pelo fornecedor. As células são rompidas pela adição de 100 mg de microesferas de vidro (150-212 µm, Sigma G1145) a 250 µl de células ressuspensas e oscilação a uma frequência de 30 ciclos/s por 6 minutos em um moinho oscilante MM200 (Retsch, Haan, Alemanha). Os restos de células e microesferas de vidro são removidos por centrifugação (14000 g, 15 min, 4°C), e o sobrenadante transferido para um tubo de centrifugação de 1,5 ml limpo mantido em gelo. O teor total de proteína é determinado com o uso do FLUKA Protein Quantification Kit-Rapid (ref 51254). A atividade de glicoquinase nos extratos celulares é determinada espectrofotometricamente por um ensaio acoplado a glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6PDH,
EC1.1.1.49):NADPH (Porter et al., 1982), essencialmente como descrito por Pool et al. (2006). Cada amostra (5, 10 e 20 µl) é adicionada ao tampão de ensaio (K2HPO4/KH2PO4 [pH 7,2] 10 mM, MgCl2 5 mM, ATP 1 mM, glicose 20 mM, NADP 1 mM, G-6PDH 1 U) em um volume final de 250 µl, e a mistura foi deixada por 5 min a 30 °C. A densidade óptica a 340 nm é medida por 5 minutos com o uso de um leitor de microplaca de detecção múltipla Synergy HT (BIO-TEK). Uma unidade de glicoquinase corresponde à quantidade de enzima que catalisa a fosforilação de 1 µmol de D-glicose em D-Glicose 6-fosfato por minuto sob as condições de ensaio. A atividade de glicoquinase é calculada como segue:
[0117] Atividade de glicoquinase (U/g de extrato de proteína total) = dOD x V/[dt x l x ɛ x Qprot], em que: - dOD é a variação de densidade óptica (OD) a 340 nm - V é o volume da reação (no presente documento 250 µl) - dt = tempo de medição (em minutos) - l = comprimento de trajeto óptico (no presente documento 0,73 cm) - ɛ = coeficiente de atenuação molar de NADPH; H+ (no presente documento 6220 cm2/µmol) - Qprot = quantidade de proteína no cadinho (em g)
[0118] As medições são triplicadas para cada amostra, e os valores de atividade específica de glicoquinase fornecidos no presente documento sob o teste E são a média de três experimentos independentes.
[0119] Em uma modalidade, a mutação de gene ccpA não é uma mutação que leva ao knockout (isto é, a interrupção completa) do gene.
[0120] Em uma modalidade, a mutação de gene ccpA é uma mutação na sequência de codificação do gene ccpA, em particular, nos primeiros 270 nucleotídeos da sequência de codificação do gene ccpA. Em uma modalidade, a mutação é uma mutação selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma mutação sem sentido (isto é, que leva a um códon de parada) localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 270 da sequência de codificação do gene ccpA; e b) uma mutação, localizada no primeiro quarto da sequência de codificação do gene ccpA (isto é, entre nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 250), que leva a um deslocamento do quadro de leitura aberto do gene ccpA.
[0121] Em uma modalidade, a mutação que leva a um deslocamento do quadro de leitura aberto do gene ccpA está localizada entre o nucleotídeo 50 e o nucleotídeo 200 da sequência de codificação do gene ccpA. Em uma modalidade, a mutação que leva a um deslocamento do quadro de leitura aberto do gene ccpA está localizada entre o nucleotídeo 100 e o nucleotídeo 150 da sequência de codificação do gene ccpA. Qualquer que seja a localização da mutação que leva a um deslocamento, a mutação é selecionada dentre o grupo que consiste em uma deleção, uma inserção ou uma deleção/inserção (que não são múltiplos de 3).
[0122] Embora duas cepas de Streptococcus thermophilus possam diferir pela sequência de seu respectivo gene ccpA, isso não significa necessariamente que um desses dois genes ccpA tem mutação no sentido da invenção. De fato, não são consideradas como mutações do gene ccpA dentro da presente invenção: - variações do nível de nucleotídeo que não levam a uma alteração no nível de proteína, mas em que essa alteração não possibilita obter uma razão - entre a atividade de beta-galactosidase, como avaliado pelo teste D, e a atividade de glicoquinase, como avaliado pelo teste E, da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, que codifica essa proteína modificada – de pelo menos 4,10-6
[0123] Os exemplos não limitantes de genes ccpA que não são considerados com mutação no sentido da invenção são: - o polinucleotídeo, como definido na SEQ ID Nº:65 (ccpA tipo ST1); esse tipo de ccpA é aquele da cepa DGCC7710; - o polinucleotídeo, como definido na SEQ ID Nº:66 (ccpA tipo ST2), que tem 99,8% de identidade com a SEQ ID Nº:65; - o polinucleotídeo, como definido na SEQ ID Nº:67 (ccpA tipo ST3), que tem 99,8% de identidade com a SEQ ID Nº:65; - o polinucleotídeo, como definido na SEQ ID Nº:68 (ccpA tipo ST4), que tem 99,7% de identidade com a SEQ ID Nº:65; - o polinucleotídeo, como definido na SEQ ID Nº:69 (ccpA tipo ST5), que tem 99,8% de identidade com a SEQ ID Nº:65; e - o polinucleotídeo, como definido na SEQ ID Nº:70 (ccpA tipo ST6), que tem 99,7% de identidade com a SEQ ID Nº:65.
[0124] Os inventores identificaram pelo menos uma mutação, que, quando presente no gene ccpA de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, possibilita que essa cepa exiba uma razão entre a atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado pelo teste D, e a atividade de glicoquinase na dita cepa, como avaliado pelo teste E, de pelo menos 4,10-6, como definido no presente documento. Assim, a invenção refere-se a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta uma mutação no gene ccpA selecionada dentre o grupo que consiste em uma mutação sem sentido localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 270 da sequência de codificação do gene ccpA e uma mutação, localizada no primeiro quarto da sequência de codificação do gene ccpA, que leva a um deslocamento do quadro de leitura aberto do gene ccpA, em que a razão entre a atividade de beta-galactosidase na dita cepa, como avaliado pelo teste D, e a atividade de glicoquinase na dita cepa, como avaliado pelo teste E, é pelo menos 4,10-6, como definido no presente documento.
[0125] Em uma modalidade, a mutação do gene ccpA é uma deleção de um nucleotídeo A no estiramento de 7 nucleotídeos A nas posições 114-120 (que leva a um deslocamento do quadro de leitura aberto do gene ccpA). Tal gene ccpA com mutação de Streptococcus thermophilus é denominado no presente documento ccpAΔ1A114-120.
[0126] Em uma modalidade, a sequência do dito gene ccpA com um códon de parada no códon 66 é selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência como definido na SEQ ID Nº:71; e b) uma sequência variante de ccpA que tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº:71. A variante de ccpA, como definido no presente documento, porta uma mutação, como definido acima, isto é, é selecionada dentre o grupo que consiste em uma mutação sem sentido localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 270 da sequência de codificação do gene ccpA e uma mutação, localizada no primeiro quarto da sequência de codificação do ccpA, que leva a um deslocamento do quadro de leitura aberto do gene ccpA.
[0127] Para a definição da variante ccpA que tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº:71, a identidade é calculada no presente documento em relação ao comprimento total das duas sequências após alinhamento ideal [isto é, número de nucleotídeos idênticos na parte (ou partes) alinhada das sequências]. Em uma modalidade particular, a sequência variante ccpA tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de identidade com a SEQ ID Nº:71. Em uma modalidade particular, a sequência variante ccpA difere da SEQ ID Nº:71 em de 1 a 30 substituições de nucleotídeo. Em uma modalidade particular, a sequência variante ccpA difere da SEQ ID Nº:71 em de 1 a 20 substituições de nucleotídeo. Em uma modalidade particular, a sequência variante ccpA difere da SEQ ID Nº:71 em de 1 a 15 substituições de nucleotídeo. Em uma modalidade particular, a sequência variante ccpA difere da SEQ ID Nº:71 em de 1 a 10 substitui- ções de nucleotídeo. Em uma modalidade particular, a sequência variante ccpA difere da SEQ ID Nº:71 em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substituições de nucleotídeo. Em uma modalidade, a sequência do gene ccpA da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nºs: 71, 72, 73, 74, 75 e 76.
[0128] O versado na técnica recebe, nessa parte do pedido, orientação sobre como identificar mutações do gene ccpA diferentes daquela especificamente descrita. Com base na razão definida acima [da quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no leite fermentado, como definido no presente documento] juntamente com uma cepa de referência definida no presente documento, o versado na técnica saberia como identificar um gene ccpA com mutação de acordo com a invenção e obter uma cepa de Streptococcus thermophilus da invenção.
[0129] Assim, o versado na técnica pode proceder pelo seguinte método: a) fornecer uma cepa DGCC7710 em que seu gene manL foi substituído pelo gene manL com mutação, como definido na SEQ ID Nº:111 (gene manL que codifica a proteína IIABMan305), chamada no presente documento cepa DGCC7710-IIABMan305; b) executar mutagênese no gene ccpA da cepa em a), por exemplo, por mutagênese aleatória ou dirigida, para obter um ccpA cuja sequência é diferente da sequência do gene ccpA da cepa DGCC7710- IIABMan305, para obter uma cepa DGCC7710-IIABMan305 com mutação em ccpA;
c) determinar pelo teste B a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) de um leite fermentado pela cepa DGCC7710-IIABMan305 com mutação em ccpA da etapa b), em que uma razão maior do que 1,2 significa que a ccpA com mutação está de acordo com a invenção. Em uma modalidade particular, um gene ccpA com mutação é considerado como estando de acordo com a invenção quando a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no leite fermentado é maior do que 1,5, é maior do que 2 ou é maior do que
3.
[0130] Alternativamente, o versado na técnica pode proceder pelo seguinte método: a) fornecer uma cepa DGCC7710 em que seu gene manM foi substituído pelo gene manM com mutação, como definido na SEQ ID Nº:157 (gene manM que codifica a proteína IICMan208), chamada no presente documento cepa DGCC7710-IICMan208; b) executar mutagênese no gene ccpA da cepa em a), por exemplo, por mutagênese aleatória ou dirigida, para obter um ccpA cuja sequência é diferente da sequência do gene ccpA da cepa DGCC7710- IICMan208, para obter uma cepa DGCC7710-IICMan208 com mutação em ccpA; c) determinar pelo teste B a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) de um leite fermentado pela cepa DGCC7710-IICMan208 com mutação em ccpA da etapa b), em que uma razão maior do que 1,2 significa que a ccpA com mutação está de acordo com a invenção. Em uma modalidade particular, um gene ccpA com mutação é considerado como estando de acordo com a invenção quando a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no leite fermentado é maior do que 1,5, é maior do que 2 ou é maior do que 3.
[0131] O versado na técnica pode também proceder pelo seguinte método: a) fornecer uma cepa DGCC7710 em que seu gene manN foi substituído pelo gene manN com mutação, como definido na SEQ ID Nº:206 (gene manN que codifica a proteína IIDMan28), chamada no presente documento cepa DGCC7710-IIDMan28; b) executar mutagênese no gene ccpA da cepa em a), por exemplo, por mutagênese aleatória ou dirigida, para obter um ccpA cuja sequência é diferente da sequência do gene ccpA da cepa DGCC7710- IIDMan28, para obter uma cepa DGCC7710-IIDMan28 com mutação em ccpA; c) determinar pelo teste B a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) de um leite fermentado pela cepa DGCC7710-IIDMan28 com mutação em ccpA da etapa b), em que uma razão maior do que 1,2 significa que a ccpA com mutação está de acordo com a invenção. Em uma modalidade particular, um gene ccpA com mutação é considerado como estando de acordo com a invenção quando a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no leite fermentado é maior do que 1,5, é maior do que 2 ou é maior do que 3.
[0132] Uma vez identificado, um gene ccpA com mutação – como identificado no presente documento - pode ser introduzido em vez do gene ccpA de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, para obter uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção. Caracterização Adicional das Cepas da Invenção
[0133] É a parte da invenção que a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose definida no presente documento, quando usada para fermentar leite pelo teste B,
exiba uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) que maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3. Essa característica pode ser usada como descrito no presente documento para projetar e identificar as cepas da invenção. Os inventores mostraram que as cepas que exibem essa razão (como consequência de uma mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e uma mutação no gene glcK e/ou no gene ccpA) possibilitam, quando são usadas para fermentar leite: 1) obter um leite fermentado com baixo teor de lactose; e/ou 2) obter um leite fermentado que não passa por pós- acidificação, mesmo quando armazenado à temperatura de fermentação.
[0134] Assim, se necessário, essas duas vantagens podem ser usadas para caracterizar adicionalmente as cepas da invenção, além da razão entre a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM), como avaliado pelo teste B, e as mutações definidas no presente documento para o gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, o gene glcK e o gene ccpA.
[0135] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção - além de exibir, quando usada para fermentar leite pelo teste B, uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) que é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3 - é caracterizada pelo fato de que leva a um leite fermentado com baixo teor de lactose, quando usado para fermentar leite pelo teste B.
[0136] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção - além de exibir, quando usada para fermentar leite pelo teste B, uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) que é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3 - é caracterizada pelo fato de que leva a um leite fermentado, que não passa por pós-acidificação quando armazenado à temperatura de fermentação.
[0137] Em uma modalidade, a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção - além de exibir, quando usada para fermentar leite pelo teste B, uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) que é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3 - é caracterizada pelo fato de que leva a um leite fermentado com baixo teor de lactose que não passa por pós- acidificação quando armazenado à temperatura de fermentação (quando usado para fermentar leite pelo teste B).
[0138] A expressão "leite fermentado com baixo teor de lactose" significa um leite fermentado que tem uma quantidade de lactose restante no leite fermentado, ao final da fermentação pelo teste B, que é menor do que 60 mM, menor do que 50 mM, menor do que 45 mM, menor do que 40 mM, menor do que 35 mM ou menor do que 30 mM. Em uma modalidade, a concentração de lactose restante em um leite fermentado obtida pelo teste B com o uso de uma cepa da invenção é menor do que 60 mM. Em uma modalidade, a concentração de lactose restante em um leite fermentado obtida pelo teste B com o uso de uma cepa da invenção é menor do que 50 mM. Em uma modalidade, a concentração de lactose restante em um leite fermentado obtida pelo teste B com o uso de uma cepa da invenção é menor do que 45 mM. Em uma modalidade, a concentração de lactose restante em um leite fermentado obtida pelo teste B com o uso de uma cepa da invenção é menor do que 40 mM. Em uma modalidade, a concentração de lactose restante em um leite fermentado obtida pelo teste B com o uso de uma cepa da invenção é menor do que 35 mM. Em uma modalidade, a concentração de lactose restante em um leite fermentado obtida pelo teste B com o uso de uma cepa da invenção é menor do que 30 mM. Em uma modalidade, a concentração de lactose restante em um leite fermentado obtido pelo teste B com o uso de uma cepa da invenção é selecionada dentre o grupo que consiste em uma concentração que é menor do que 60 mM, menor do que 50 mM, menor do que 45 mM, menor do que 40 mM, menor do que 35 mM e menor do que 30 mM. É importante destacar que a quantidade de lactose no leite fornecido no teste B é, antes da fermentação, cerca de 300 mM (60 g/l).
[0139] A expressão "que não passa por pós-acidificação" significa um produto de leite que, quando inoculado com uma cepa da invenção e fermentado pelo teste B, tem seu pH diminuído até um pH em que a velocidade de acidificação definitivamente se torna menor do que 0,1 mUpH/min (definido no presente documento como pHPARADA), em que o dito pHPARADA está compreendido entre 4,6 e 5,3, e opcionalmente o declive entre pH 6 e pH 5,5 é pelo menos -0,008 UpH/min.
[0140] Assim, a ausência de pós-acidificação é caracterizada pelo fato de que o pH do leite fermentado para entre 4,6 e 5,3 ao usar o teste B. O pH é considerado como estando parado (pHPARADA), quando a velocidade de acidificação (ΔpH/Δtempo) definitivamente se torna menor do que 0,1 mUpH/min (menor do que 0,0001 UpH/min). "Definitivamente se torna" significa que a velocidade de acidificação permanece menor do que 0,1 mUpH/min pelo tempo restante do teste B (isto é, até 24 h à temperatura ambiente), uma vez que o pHPARADA é obtido.
[0141] Em uma modalidade, o pHPARADA obtido com o uso de uma cepa da invenção pelo teste B está compreendido entre 4,7 e 5,2. Em uma modalidade, o pHPARADA obtido com o uso de uma cepa da invenção pelo teste B está compreendido entre 4,8 e 5,1. Em uma modalidade, o pHPARADA obtido com o uso de uma cepa da invenção pelo teste B é compreendido entre um valor mínimo selecionado dentre o grupo que consiste em 4,6, 4,7 e 4,8 e um valor máximo selecionado dentre o grupo que consiste em 5,1, 5,2 e 5,3.
[0142] Em uma modalidade, o leite fermentado que não passa por pós-acidificação é também caracterizado pelo declive entre pH 6 e pH 5,5. O declive representa o inverso da velocidade (velocidade de acidificação). Em uma modalidade, o declive é pelo menos -0,009 UpH/min. Em uma modalidade, o declive é pelo menos -0,01 UpH/min. Exemplos de Algumas Cepas da Invenção
[0143] A invenção também se refere às seguintes cepas de para Streptococcus thermophilus positivas para lactose e negativas para galactose: - uma cepa correspondente à cepa DSM32587 (depositada no DSMZ em 15 de agosto de 2017) em que a sequência de codificação do gene manL é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:111 (que codifica IIABMan305) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta o mesmo gene manL com mutação, e que, quando usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2; - uma cepa correspondente à cepa DSM32587 em que a sequência de codificação do gene manM é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:157 (que codifica IICMan208) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa deStreptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta o mesmo gene manM com mutação, e que, quando usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2; - uma cepa correspondente à cepa DSM32587 em que a sequência de codificação do gene manN é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:206 (que codifica IIDMan28) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta o mesmo gene manN com mutação, e que, quando usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2; - uma cepa correspondente à cepa DSM32587 em que a sequência de codificação do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:71 (ccpAΔ1A114-120) e a sequência de codificação do gene manL é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:111 (que codifica IIABMan305) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta o mesmo gene ccpA com mutação e o mesmo gene manL com mutação, e que, quando usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2; - uma cepa correspondente à cepa DSM32587 em que a sequência de codificação do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:71 (ccpAΔ1A114-120) e a sequência de codificação do gene manM é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:157 (que codifica IICMan208) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta o mesmo gene ccpA com mutação e o mesmo gene manM com mutação, e que, quando usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2; - uma cepa correspondente à cepa DSM32587 em que a sequência de codificação do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:71 (ccpAΔ1A114-120) e a sequência de codificação do gene manN é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:206 (que codifica IIDMan28) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta o mesmo gene ccpA com mutação e o mesmo gene manN com mutação, e que, quando usada para fermentar leite como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2; - uma cepa correspondente à cepa DSM28255 em que a sequência de codificação do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:71 (ccpAΔ1A114-120) e a sequência de codificação do gene manL é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:111 (que codifica IIABMan305) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta o mesmo gene ccpA com mutação e o mesmo gene manL com mutação, e que, quando usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2. - uma cepa correspondente à cepa DSM28255 em que a sequência de codificação do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:71 (ccpAΔ1A114-120) e a sequência de codificação do gene manM é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:157 (que codifica IICMan208) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta o mesmo gene ccpA com mutação e o mesmo gene manM com mutação, e que, quando usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2; - uma cepa correspondente à cepa DSM28255 em que a sequência de codificação do gene ccpA é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:71 (ccpAΔ1A114-120) e a sequência de codificação do gene manN é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:206 (que codifica IIDMan28) e suas variantes; uma variante é definida no presente documento como uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta o mesmo gene ccpA com mutação e o mesmo gene manN com mutação, e que, quando usada para fermentar leite como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1.2.
[0144] Em uma modalidade particular, a sequência de genoma da variante de cepa, como definido no presente documento, tem uma identidade de pelo menos 90% com a sequência de genoma da cepa a partir da qual a variante é obtida, em particular, uma identidade de pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 95%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,1%, pelo menos 99,2%, pelo menos 99,3%, pelo menos 99,4%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8%, pelo menos 99,9%, pelo menos 99,92%, pelo menos 99,94%, pelo menos 99,96%, pelo menos 99,98% ou pelo menos 99,99% com a sequência de genoma da cepa da qual a variante é obtida. A identidade é descrita em comparação com as duas sequências de genoma sobre seu comprimento total (alinhamento global) e pode ser calculada com o uso de qualquer programa baseado no algoritmo de Needleman-Wunsch. Composição, método e uso de cepas de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção
[0145] A invenção também se refere a uma composição bacteriana que compreende ou consiste em pelo menos uma, em particular uma, cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção. Em uma modalidade particular, a composição bacteriana é uma cultura pura, isto é, compreende ou consiste em uma única cepa de bactéria. Em outra modalidade, a composição bacteriana é uma cultura mista, isto é, compreende ou consiste na cepa (ou cepas) de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção e pelo menos uma outra cepa de bactéria. "Pelo menos" (em referência a uma cepa ou bactéria) significa 1 ou mais e, em particular, uma, duas, 3, 4 ou 5 cepas.
[0146] Assim, em uma modalidade, uma composição bacteriana da invenção compreende ou consiste na cepa (ou cepas) de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção e pelo menos uma bactéria formadora de ácido láctico da espécie selecionada dentre o grupo que consiste em uma espécie de Lactococcus, uma espécie de Streptococcus, uma espécie de Lactobacillus, incluindo Lactobacillus acidophilus, uma espécie de Enterococcus, uma espécie de Pediococcus, uma espécie de Leuconostoc, uma espécie de Bifidobacterium e uma espécie de Oenococcus ou qualquer combinação das mesmas. As espécies de Lactococcus incluem Lactobacillus acidophilus e Lactococcus lactis, incluindo Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris e Lactococcus lactis subsp. lactis biovar diacetylactis. As espécies de Bifidobacterium incluem Bifidobacterium animalis, em particular Bifidobacterium animalis subsp lactis. Outras espécies de bactérias formadoras de ácido láctico incluem Leuconostoc sp., Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e Lactobacillus helveticus.
[0147] Em uma modalidade, a composição bacteriana compreende ou consiste na cepa (ou cepas) Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção e pelo menos uma cepa de Streptococcus thermophilus, diferente da cepa (ou cepas) de S. thermophilus da invenção e/ou pelo menos uma cepa da espécie de Lactobacillus, e/ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade particular, a composição bacteriana compreende ou consiste na cepa (ou cepas) de Streptococcus thermophilus da invenção, uma ou diversas ou da espécie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus e/ou uma ou diversas cepas da espécie Lactobacillus helveticus e/ou qualquer combinação das mesmas, e opcionalmente pelo menos uma cepa deStreptococcus thermophilus, diferente da cepa (ou cepas) de S. thermophilus da invenção. Em uma modalidade particular, a composição bacteriana compreende ou consiste na cepa (ou cepas) deStreptococcus thermophilus da invenção, pelo menos uma cepa da espécie Streptococcus thermophilus, diferente da cepa (ou cepas) de S. thermophilus da invenção, e uma cepa da espécie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Em outra modalidade particular, uma composição bacteriana compreende ou consiste na cepa (ou cepas) deStreptococcus thermophilus da invenção, e uma cepa da espécie Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.
[0148] Em uma modalidade, a composição bacteriana compreende ou consiste na cepa (ou cepas) de Streptococcus thermophilus da invenção, uma Lactococcus lactis subsp. lactis e/ou uma Lactococcus lactis subsp. cremoris.
[0149] Em uma modalidade particular de qualquer composição bacteriana definida no presente documento, como uma cultura pura ou mista, a composição bacteriana compreende, ainda, pelo menos uma cepa probiótica, tal como Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei ou Lactobacillus casei.
[0150] Em uma modalidade particular, a composição bacteriana, como uma cultura pura ou mista como definido acima, está sob formato congelado, seco, seco por congelamento, líquido ou sólido, na forma de péletes ou péletes congelados, ou em um pó ou pó seco. Em uma modalidade particular, a composição bacteriana da invenção está em um formato congelado ou na forma de péletes ou péletes congelados, em particular contida em uma ou mais caixas ou sachês. Em outra modalidade, a composição bacteriana como definido no presente documento está sob uma forma em pó, tal como um pó seco ou seco por congelamento, em particular contida em uma ou mais caixas ou sachês.
[0151] Em uma modalidade particular, a composição bacteriana da invenção, como uma cultura pura ou uma cultura mista como definido acima, e seja qual for o formato (formato congelado, seco, seco por congelamento, líquido ou sólido, na forma de péletes ou péletes congelados) compreende a cepa (ou cepas) de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção em uma concentração compreendida na faixa de 105 a 1012 cfu (unidades de formação de colônia) por grama da composição bacteriana. Em uma modalidade particular, a concentração da cepa (ou cepas) de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose dentro da composição bacteriana da invenção está na faixa de 107 a 1012 cfu por grama da composição bacteriana e, em particular, pelo menos 107, pelo menos 108, pelo menos 109, pelo menos 1010 ou pelo menos 1011 CFU/g da composição bacteriana. Em uma modalidade particular, quando na forma de concentrado congelado ou seco, a concentração da cepa (ou cepas) de Streptococcus thermophilus positivas para lactose e negativas para galactose - como cultura pura ou como uma cultura mista - dentro da composição bacteriana está na faixa de 108 a 1012 cfu/g de concentrado congelado ou concentrado seco e, mais preferencialmente, pelo menos 108, pelo menos 109, pelo menos 1010, pelo menos 1011 ou pelo menos 1012 cfu/g de concentrado congelado ou concentrado seco.
[0152] A invenção também se refere a um método para fabricar um produto fermentado que compreende a) inocular um substrato com a cepa (ou cepas) de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção e b) fermentar o dito substrato inoculado, para obter um produto fermentado. Em uma modalidade particular, a cepa (ou cepas) de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção é inoculada como uma composição bacteriana, como definido no presente documento, tal como uma cultura pura ou como uma cultura mista. Em uma modalidade, o substrato em que a cepa (ou cepas) de S. thermophilus ou a composição bacteriana da invenção é adicionado é substrato de leite. "Substrato de leite" significa leite de origem animal e/ou vegetal.
Em uma modalidade particular, o substrato de leite é de origem animal, tal como vaca, cabra, ovelha, búfalo, zebra, égua, jumento ou camelo e similares. O leite pode estar no estado original, ser um leite reconstituído, um leite desnatado ou um leite suplementado com compostos necessários para a proliferação das bactérias ou para o processamento subsequente do leite fermentado. Portanto, em uma modalidade particular, a invenção também fornece um método para fabricar um produto lácteo fermentado que compreende a) inocular um substrato de leite com a cepa (ou cepas) de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose ou composição bacteriana da invenção e b) fermentar o dito substrato de leite inoculado, para obter um produto lácteo fermentado.
[0153] A invenção também se refere ao uso da cepa (ou cepas) Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção ou uma composição da invenção para fabricar um produto lácteo fermentado.
[0154] A invenção também se refere a um produto lácteo fermentado que é obtido com o uso da positiva para lactose e negativa para galactose cepa (ou cepas) de Streptococcus thermophilus da invenção ou uma composição bacteriana da invenção, em particular, obtida ou obtenível pelo método da invenção. Assim, a invenção refere- se a um produto lácteo fermentado que compreende a cepa (ou cepas) Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção. Em uma modalidade particular, o produto alimentício lácteo fermentado da invenção é leite fermentado fresco. Em uma modalidade particular, o produto lácteo fermentado da invenção - em particular o leite fermentado fresco, como definido no presente documento - contém a cepa DSM32587 depositada no DSMZ em 15 de agosto de 2017 ou qualquer variante da mesma, como definido no presente documento.
Proteínas, ácidos nucleicos, vetores, construtos e seus usos
[0155] A invenção refere-se a um polinucleotídeo que codifica uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus, cuja atividade de glicoquinase é significativamente reduzida, mas não nula. Em uma modalidade, a atividade de glicoquinase reduzida, mas não nula é determinada em um derivado de DGCC7710, isto é, uma cepa DGCC7710 em que seu gene glcK foi substituído pelo polinucleotídeo glcK a ser avaliado. Para testar se um polinucleotídeo que codifica uma glicoquinase atende à característica de atividade de glicoquinase "significativamente reduzida, mas não nula" em um derivado de DGCC7710, o gene glcK da cepa DGCC7710 é substituído pelo gene glcK que codifica a glicoquinase de Streptococcus thermophilus a ser avaliado para obter o derivado de DGCC7710, e o derivado de DGCC7710 é avaliado pelo teste A (consultar o exemplo 4).
[0156] Uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus (codificada por um polinucleotídeo da invenção) atente à característica de atividade de glicoquinase "significativamente reduzida, mas não nula" em um derivado de DGCC7710, quando: a) a atividade de glicoquinase da dita glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 estar entre 200 e 1500 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A, em particular, entre 300 e 1200 U/g ou entre 400 e 1000 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A, ou b) a atividade de glicoquinase da dita glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 estar entre 5 e 60 % da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando são ambas avaliadas pelo teste A, em particular, entre 10 e 50% ou entre 15 e 40% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710, em que a atividade de glicoquinase no dito derivado de
DG7710 e a atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 são avaliadas pelo teste A.
[0157] Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 200 e 1500 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A. Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 300 e 1200 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A. Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 400 e 1000 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A. Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre um valor mínimo selecionado dentre o grupo que consiste em 200, 300 e 400 U/g de extrato de proteína total e um valor máximo selecionado dentre o grupo que consiste em 1000, 1200 e 1500 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A. É importante observar que, como mencionado no teste A, os valores de atividade de glicoquinase descritos no presente documento são a média dos três experimentos (triplicatas).
[0158] Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase da glicoquinase de Streptococcus thermophilus (codificada por um polinucleotídeo da invenção) em um derivado de DGCC7710 está entre 5 e 60% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de
2014. "A atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710" significa que a atividade da glicoquinase da cepa DGCC7710 (isto é, com SEQ ID Nº:2), como avaliado pelo teste A na cepa DGCC7710 [isto é, o teste A é executado com o uso da cepa DGCC7710]. O valor percentual é calculado com base na atividade de glicoquinase da glicoquinase de Streptococcus thermophilusem um derivado de DGCC7710 e a atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710, ambas avaliadas pelo teste A.
[0159] Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 5 e 60% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 10 e 50% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 15 e 40% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a atividade de glicoquinase da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 da invenção está entre uma porcentagem mínima selecionada dentre o grupo que consiste em 5, 10 e 15% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 e uma porcentagem máxima selecionada dentre o grupo que consiste em 40, 50 e 60% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular e qualquer que seja a faixa de porcentagens, a atividade de glicoquinase da glicoquinase de Streptococcus thermophilus é avaliada em um derivado de DGCC7710 pelo teste A, como descrito no presente documento. É importante destacar que os valores de porcentagem descritos no presente documento são calculados com base em valores de atividade de glicoquinase que são a média de três experimentos independentes (triplicatas), como avaliado pelo teste A.
[0160] A característica "atividade de glicoquinase em um derivado de DGCC7710 é significativamente reduzida, mas não nula" pode ser também caracterizada, em um derivado de DGCC7710, pela velocidade direta máxima da glicoquinase (Vmáx) ou pela afinidade da glicoquinase (chamada Km) para um ou dois desses substratos, isto é, glicose e ATP. Em uma modalidade, a característica "significativamente reduzida, mas não nula atividade de glicoquinase em um derivado de DGCC7710" da glicoquinase de Streptococcus thermophilus (codificada por um polinucleotídeo da invenção) é, ainda, caracterizada pela velocidade direta máxima dessa glicoquinase em um derivado de DGCC7710.
[0161] Portanto, em combinação com a modalidade da característica "atividade de glicoquinase em um derivado de DGCC7710 é significativamente reduzida, mas não nula" definida no presente documento, a velocidade direta máxima (Vmáx) da glicoquinase de Streptococcus thermophilus é significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710. Para testar se uma glicoquinase atente a característica de Vmáx "significativamente reduzida, mas não nula" em um derivado de DGCC7710, o quadro de leitura aberto do gene glcK da cepa DGCC7710 é substituído pelo quadro de leitura aberto do gene glcK que codifica a glicoquinase de Streptococcus thermophilus a ser avaliada (isto é, o polinucleotídeo da invenção) para obter um derivado de DGCC7710, e o derivado de DGCC7710 é avaliado pelo teste C (consultar o exemplo 4). A expressão "derivado de DGCC7710" é como definido acima.
[0162] A característica "significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710" da Vmáx da glicoquinase pode ser definida por um ou dois desses parâmetros: - a Vmáx da dita glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 estar entre 200 e 1500 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste C; - a Vmáx da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 5 e 60% da Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando avaliada pelo teste C.
[0163] Em uma modalidade particular, a invenção refere-se a um polinucleotídeo que codifica uma glicoquinase deStreptococcus thermophilus, cuja atividade de glicoquinase em um derivado de DGCC7710 é significativamente reduzida, mas não nula (como definido no presente documento) e em que a velocidade direta máxima (Vmáx) da dita glicoquinase em um derivado de DGCC7710 é significativamente reduzida, mas não nula, e definida por um ou dois desses parâmetros: - a Vmáx da dita glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 estar entre 200 e 1500 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste C; - a Vmáx da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 5 e 60% da Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando avaliada pelo teste C.
[0164] Em uma modalidade particular, a Vmáx da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 200 e 1500 U/g extrato de proteína total, como avaliado pelo teste C. Em uma modalidade particular, a Vmáx da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 300 e 1200 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste C. Em uma modalidade particular, a Vmáx da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 400 e 1000 U/g de extrato de proteína total. Em uma modalidade particular, a Vmáx da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre um valor mínimo selecionado dentre o grupo que consiste em 200, 300 e 400 U/g de extrato de proteína total e um valor máximo selecionado dentre o grupo que consiste em 1000, 1200 e 1500 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste C.
[0165] Em uma modalidade particular, a Vmáx da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 10 e 50% da Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710, ambas avaliadas pelo teste C. "Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710" significa que a Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710 (isto é, com a SEQ ID Nº:2), como avaliado pelo teste C na cepa DGCC7710 [isto é, o teste C é executado com o uso da cepa DGCC7710]. O valor percentual é calculado com base na Vmáx da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 e a Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710, ambas avaliadas pelo teste C. Em uma modalidade particular, a Vmáx da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 está entre 15 e 40% da Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710. Em uma modalidade particular, a Vmáx da glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 da invenção está entre uma porcentagem mínima selecionada dentre o grupo que consiste em 5, 10 e 15% da Vmáx da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 e uma porcentagem máxima selecionada dentre o grupo que consiste em 40, 50 e 60% da Vmáx da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710.
[0166] Em uma modalidade, o polinucleotídeo da invenção codifica uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus que tem uma atividade de glicoquinase significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710 e opcionalmente uma Vmáx significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710, cuja sequência tem em sua posição 275 (numeração baseada na sequência, como definido na SEQ ID Nº:25) um aminoácido que não é um ácido glutâmico (isto é, é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico). Em uma modalidade, o polinucleotídeo da invenção codifica uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus que tem uma atividade de glicoquinase significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710 e opcionalmente uma Vmáx significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710, cuja sequência tem em sua posição 275 (numeração baseada na sequência, como definido na SEQ ID Nº:25) um aminoácido que não é um aminoácido ácido (isto é, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido). Em uma modalidade, o polinucleotídeo da invenção codifica uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus que tem uma atividade de glicoquinase significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710 e opcionalmente uma Vmáx significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710, cuja sequência tem em sua posição 275 (numeração baseada na sequência, como definido na SEQ ID Nº:25) um aminoácido que é selecionado dentre o grupo que consiste em uma lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos. Em uma modalidade, o polinucleotídeo da invenção codifica uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus que tem uma atividade de glicoquinase significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710 e opcionalmente uma Vmáx significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710, cuja sequência tem em sua posição 275 (numeração baseada na sequência, como definido na SEQ ID Nº:25) um aminoácido que é uma lisina. Em uma modalidade particular, o polinucleotídeo da invenção codifica uma Streptococcus thermophilus que tem 322 aminoácidos de comprimento.
[0167] Em outra modalidade, o polinucleotídeo da invenção codifica uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus que tem uma atividade de glicoquinase significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710 e opcionalmente uma Vmáx significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de
DGCC7710, cuja sequência tem em sua posição 144 (numeração baseada na sequência, como definido na SEQ ID Nº:25) um aminoácido que não é uma glicina (isto é, é qualquer aminoácido exceto uma glicina). Em uma modalidade, o polinucleotídeo da invenção codifica uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus que tem uma atividade de glicoquinase significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710 e opcionalmente uma Vmáx significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710, cuja sequência tem em sua posição 144 (numeração baseada na sequência, como definido na SEQ ID Nº:25) um aminoácido que não é um aminoácido alifático (isto é, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático). Em uma modalidade, o polinucleotídeo da invenção codifica uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus que tem uma atividade de glicoquinase significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710 e opcionalmente uma Vmáx significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710, cuja sequência tem em sua posição 144 (numeração baseada na sequência, como definido na SEQ ID Nº:25) um aminoácido que é selecionado dentre o grupo que consiste em uma serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos. Em uma modalidade, o polinucleotídeo da invenção codifica uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus que tem uma atividade de glicoquinase significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710 e opcionalmente uma Vmáx significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710, cuja sequência tem em sua posição 144 (numeração baseada na sequência, como definido na SEQ ID Nº:25) um aminoácido que é uma serina. Em uma modalidade particular, o polinucleotídeo da invenção codifica uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus que tem 322 aminoácidos de comprimento.
[0168] Em uma modalidade particular, o polinucleotídeo da invenção codifica uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus que tem uma atividade de glicoquinase significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710 e opcionalmente uma Vmáx significativamente reduzida, mas não nula em um derivado de DGCC7710 é selecionado dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência como definido na SEQ ID Nº:25, em que o aminoácido na posição 275 é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina; e b) uma sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº: 25, em que o aminoácido da glicoquinase que corresponde à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina.
Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK tem 322 amino- ácidos de comprimento.
Em uma modalidade, a dita variante GlcK tem uma arginina em sua posição 278 e/ou uma serina em sua posição 279. c) uma sequência como definido na SEQ ID Nº:46, em que o aminoácido na posição 144 é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina; e d) uma sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº: 46, em que o aminoácido da glicoquinase que corresponde à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina.
Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK tem 322 aminoácidos de comprimento.
[0169] Para a definição da variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, a similaridade ou a identidade é calculada no presente documento em relação ao comprimento total das duas sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácido similares ou idênticos na parte (ou partes) alinhada das sequências]; a posição 275, como definido na SEQ ID Nº:25, não é considerada para o cálculo da similaridade ou da identidade. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, em que o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. Em uma modalidade, a sequência variante GlcK tem pelo menos 95% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, em que o aminoácido correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. Em uma modalidade, a sequência variante GlcK tem pelo menos 97% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, em que o aminoácido correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina.
[0170] Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº:25 em de 1 a 30 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina (a posição 275 não é considerada para o cálculo do número de substituições). Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº:25 em de 1 a 20 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº:25 em de 1 a 15 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequência GlcK difere da SEQ ID Nº:25 em de 1 a 10 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. Em uma modalidade particular, a sequência GlcK difere da SEQ ID Nº:25 em de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina.
[0171] Em uma modalidade particular, a sequência da glicoquinase de Streptococcus thermophilus (codificada por um polinucleotídeo da invenção) é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nºs: 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 e 34, em que o aminoácido na posição 275 da dita variante é qualquer aminoácido exceto um ácido glutâmico, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:25 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) não é um ácido glutâmico.
[0172] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:25 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glicoquinase (codificado por um polinucleotídeo da invenção) correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) não é um aminoácido ácido. Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:25 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, como definido no presente documento (em particular a SEQ ID Nº: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é selecionado dentre o grupo que consiste em uma lisina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos. Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:25 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da glicoquinase) é uma lisina; assim, em uma modalidade particular, a sequência da glicoquinase Streptococcus thermophilus (codificada por um polinucleotídeo da invenção) é selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 22, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 e
43.
[0173] Para a definição da variante GlcK que tem pelo menos 90%
de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, a similaridade ou a identidade é calculada no presente documento em relação ao comprimento total das duas sequências após alinhamento ideal [isto é, número de resíduos de aminoácido similares ou idênticos na parte (ou partes) alinhada das sequências]; a posição 144, como definido na SEQ ID Nº:46, não é considerada para o cálculo da similaridade ou da identidade. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK tem pelo menos 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, em que o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina. Em uma modalidade, a sequência variante GlcK tem pelo menos 95% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, em que o aminoácido correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina. Em uma modalidade, a sequência variante GlcK tem pelo menos 97% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, em que o aminoácido correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina.
[0174] Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº:46 em de 1 a 30 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina (a posição 144 não é considerada para o cálculo do número de substituições). Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº:46 em de 1 a 20 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina. Em uma modalidade particular, a sequência variante GlcK difere da SEQ ID Nº:46 em de 1 a 15 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina. Em uma modalidade particular, a sequência GlcK difere da SEQ ID Nº:46 em de 1 a 10 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina. Em uma modalidade particular, a sequência GlcK difere da SEQ ID Nº:46 em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácido, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante GlcK é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina.
[0175] Em uma modalidade particular, a sequência da glicoquinase de Streptococcus thermophilus (codificada por um polinucleotídeo da invenção) é selecionada dentre o grupo que consiste nas SEQ ID Nºs: 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 e 55, em que o aminoácido na posição 144 da dita variante é qualquer aminoácido exceto uma glicina, em particular, é qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático, em particular, é uma serina. Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:46 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição
144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) não é uma glicina.
[0176] Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:46 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glicoquinase (codificado por um polinucleotídeo da invenção) correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) não é um aminoácido alifático. Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:46 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, como definido no presente documento (em particular a SEQ ID Nº: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é selecionado dentre o grupo que consiste em uma serina e qualquer um de seus aminoácidos conservativos. Em uma modalidade particular, como a SEQ ID Nº:46 ou qualquer sequência variante GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:46, como definido no presente documento (em particular SEQ ID Nº: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 ou 55), o aminoácido da glicoquinase correspondente à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da glicoquinase) é uma serina; assim, em uma modalidade particular, a sequência da glicoquinase Streptococcus thermophilus (codificada por um polinucleotídeo da invenção) é selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 45, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63 e
64.
[0177] Quando definida a sequência da glicoquinase de Streptococcus thermophilus (codificada por um polinucleotídeo da invenção), está de acordo com o ensinamento deste pedido que a atividade de glicoquinase em um derivado de DGCC7710 que expressa essa glicoquinase seja significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e opcionalmente que a Vmáx dessa glicoquinase em um derivado de DGCC7710 seja significativamente reduzida, mas não nula, como definido no presente documento.
[0178] A invenção também se refere a um polinucleotídeo que codifica uma glicoquinase de 322 aminoácidos. Em uma modalidade particular, o dito polinucleotídeo é de uma cepa de Streptococcus thermophilus. Com base no código genético, o versado na técnica sabe se um polinucleotídeo codifica uma glicoquinase de Streptococcus thermophilus, como definido no presente documento. Em uma modalidade particular, quando a glicoquinase codificada tem 322 aminoácidos de comprimento, o polinucleotídeo da invenção tem 969 nucleotídeos de comprimento.
[0179] Um exemplo não limitante de um polinucleotídeo da invenção é descrito na SEQ ID Nº:21. Outro exemplo não limitante de um polinucleotídeo da invenção é descrito na SEQ ID Nº:44. Outros exemplos não limitantes de polinucleotídeos da invenção são as sequências como definidas nas SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19, mas em que o códon 144 ou 275 codifica qualquer aminoácido exceto uma glicina ou ácido glutâmico, respectivamente, em particular, codifica qualquer aminoácido exceto um aminoácido alifático ou ácido, respectivamente, em particular, codifica uma serina ou uma lisina, respectivamente. Em particular, os exemplos não limitantes de polinucleotídeos da invenção são as sequências como definidas nas SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19, mas em que o códon 275 é AAA ou AAG. Em particular, os exemplos não limitantes de polinucleotídeos da invenção são as sequências como definidas nas SEQ ID Nºs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 e 19, mas em que o códon 144 é AGT, AGC, TCT, TCC, TCA ou TCG.
[0180] A invenção também se refere a usar um polinucleotídeo da invenção (ou um construto, um plasmídeo ou um vetor) para projetar uma célula bacteriana, em particular, uma célula bacteriana gram- positiva, em particular, uma célula de Streptococcus thermophilus. Em uma modalidade particular, o polinucleotídeo da invenção (ou um construto, um plasmídeo ou um vetor) é usado para substituir o gene glcK de uma cepa de Streptococcus thermophilus, de modo que a cepa de Streptococcus thermophilus expresse uma glicoquinase, como definido no presente documento. Em uma modalidade particular, a única glicoquinase expressa pela dita Streptococcus thermophilus obtida é uma glicoquinase, como definido no presente documento. Em uma modalidade particular, o polinucleotídeo da invenção (ou um construto, um plasmídeo ou um vetor) é usado para substituir o gene glcK de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose. Em uma modalidade, o polinucleotídeo da invenção (ou um construto, um plasmídeo ou um vetor) é usado para substituir o gene glcK de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose.
[0181] A invenção também se refere a um polinucleotídeo ccpA de Streptococcus thermophilus (com mutação), como definido ou como identificado acima. Em uma modalidade, a invenção refere-se a um polinucleotídeo ccpA de Streptococcus thermophilus (com mutação) selecionado dentre o grupo que consiste em: a) um polinucleotídeo de ccpA que, quando inserido em vez do gene ccpA da cepa DGCC7710, leva a um derivado de DGCC7710 que exibe uma razão entre a atividade de beta- galactosidase como avaliado pelo teste D e a atividade de glicoquinase como avaliado pelo teste E de pelo menos 4,10-6, como definido no presente documento. b) um polinucleotídeo de ccpA que, quando inserido em vez do gene ccpA de uma cepa DGCC7710 no qual o gene manL foi anteriormente substituído por um gene manL como definido na SEQ ID Nº:111 (isto é, da cepa DGCC7710-IIABMan305) leva a um derivado de DGCC7710-IIABMan305 que, quando usado para fermentar leite como avaliado pelo teste B, exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2, maior do que 2,5 ou maior do que 3 c) um polinucleotídeo de ccpA que, quando inserido em vez do gene ccpA de uma cepa DGCC7710 no qual o gene manM foi anteriormente substituído por um gene manM como definido na SEQ ID Nº:157 (isto é, da cepa DGCC7710-IICMan208) leva a um derivado de DGCC7710-IICMan208 que, quando usado para fermentar leite como avaliado pelo teste B, exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2, maior do que 2,5 ou maior do que 3; d) um polinucleotídeo de ccpA que, quando inserido em vez do gene ccpA de uma cepa DGCC7710 no qual o gene manN foi anteriormente substituído por um gene manN como definido na SEQ ID Nº:206 (isto é, da cepa DGCC7710-IIDMan28) leva a um derivado de DGCC7710-IIDMan28 que, quando usado para fermentar leite como avaliado pelo teste B, exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2, maior do que 2,5 ou maior do que 3.
[0182] Para qualquer um dentre b) a d), o derivado de DGCC7710- IIABMan305, o derivado de DGCC7710-IICMan208 ou o derivado de DGCC7710-IIDMan28 pode ser, ainda, caracterizado pelo fato de que exibe uma razão entre a atividade de beta-galactosidase, como avaliado pelo teste D, e a atividade de glicoquinase, como avaliado pelo teste E, de pelo menos 4,10 -6, como definido no presente documento.
[0183] Nesse contexto, o termo "derivado", quando aplicado à cepa DGCC7710-IIABMan305, a cepa DGCC7710-IICMan208 e a cepa DGCC7710-IIDMan28, significa a cepa DGCC7710-IIABMan305, a cepa DGCC7710-IICMan208 e a cepa DGCC7710-IIDMan28 em que o gene ccpA original (aquele da cepa DGCC7710) foi substituído pelo gene ccpA com mutação a ser avaliado.
[0184] Nesse contexto, a cepa DGCC7710-IIABMan305 significa uma cepa DGCC7710 em que seu gene manL é substituído por um gene manL, como definido na SEQ ID Nº:111. Similarmente, a cepa DGCC7710-IICMan208 significa uma cepa DGCC7710 em que seu gene manM é substituído por um gene manM, como definido na SEQ ID Nº:157. Similarmente, a cepa DGCC7710-IIDMan28 significa uma cepa DGCC7710 em que seu gene manN é substituído por um gene manN, como definido na SEQ ID Nº:206.
[0185] Em uma modalidade, o polinucleotídeo ccpA com mutação não é um alelo com knockout (isto é, um alelo interrompido) do gene ccpA.
[0186] Em uma modalidade, a mutação de gene ccpA é uma mutação na sequência de codificação do gene ccpA, em particular, nos primeiros 270 nucleotídeos da sequência de codificação do gene ccpA. Em uma modalidade, a mutação é uma mutação selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma mutação sem sentido (isto é, que leva a um códon de parada) localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 270 da sequência de codificação do gene ccpA; e b) uma mutação, localizada no primeiro quarto da sequência de codificação do gene ccpA (isto é, entre nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 250), que leva a um deslocamento do quadro de leitura aberto do gene ccpA.
[0187] Em uma modalidade, a mutação que leva a um deslocamento do quadro de leitura aberto do gene ccpA está localizada entre o nucleotídeo 50 e o nucleotídeo 200 da sequência de codificação do gene ccpA. Em uma modalidade, a mutação que leva a um deslocamento do quadro de leitura aberto do gene ccpA está localizada entre o nucleotídeo 100 e o nucleotídeo 150 da sequência de codificação do gene ccpA. Qualquer que seja a localização da mutação que leva a um deslocamento, a mutação é selecionada dentre o grupo que consiste em uma deleção, uma inserção ou uma deleção/inserção (que não são múltiplos de 3).
[0188] Em uma modalidade, a sequência do polinucleotídeo ccpA com mutação é selecionada dentre o grupo que consiste em a) uma sequência, como definido na SEQ ID Nº:71; e b) uma sequência variante ccpA que tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº:71. A definição da variante ccpA que tem pelo menos 90% de identidade é como detalhado sob o parágrafo "III. mutações do gene ccpA" acima.
[0189] O polinucleotídeo glcK (com mutação), como definido no presente documento, [que codifica uma glicoquinase deStreptococcus thermophilus com mutação, como definido no presente documento] e o polinucleotídeo ccpA (com mutação), como definido no presente documento, podem ser usados para projetar uma cepa deStreptococcus thermophilus, em particular, uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose. O uso consiste em substituir o gene glcK e/ou o gene ccpA de uma cepa de Streptococcus thermophilus original por um polinucleotídeo glcK com mutação e/ou um polinucleotídeo ccpA com mutação, como definido no presente documento, para projetar uma cepa de Streptococcus thermophilus que tem seu gene (ou genes) original substituído por aquele (ou aqueles)
(com mutação) como definido no presente documento. A invenção também se refere a um método para projetar uma cepa de Streptococcus thermophilus que compreende 1) substituir o gene glcK e/ou o gene ccpA de uma cepa de Streptococcus thermophilus original por um polinucleotídeo glcK com mutação e/ou um polinucleotídeo ccpA com mutação, como definido no presente documento, e 2) obter uma cepa de Streptococcus thermophilus que tem seu gene (ou genes) original substituído por aquele (ou aqueles) (com mutação) como definido no presente documento.
[0190] Em uma modalidade do uso ou do método, a cepa de Streptococcus thermophilus original porta uma mutação em pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular, em seu gene manL, em seu gene manM e/ou em seu gene manN, como definido no presente documento; assim, a substituição do gene glcK e/ou do gene ccpA dessa cepa de Streptococcus thermophilus original por um polinucleotídeo glcK com mutação e/ou um polinucleotídeo ccpA com mutação, como definido no presente documento, levará a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção. Em outra modalidade do uso ou do método, a cepa de Streptococcus thermophilus original não porta uma mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose; assim, a substituição do gene glcK e/ou do gene ccpA dessa cepa de Streptococcus thermophilus original por um polinucleotídeo glcK com mutação e/ou um polinucleotídeo ccpA com mutação, como definido no presente documento, levará a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose intermediária, que pode ser usada como uma cepa de partida para causar mutação em pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular, o gene manL, o gene manM e/ou o gene manN, para projetar uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose da invenção.
[0191] A invenção também se refere ao uso de um gene com mutação (ou polinucleotídeo) que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular, um gene manL com mutação, um gene manM com mutação ou um gene manN com mutação para projetar uma cepa de Streptococcus thermophilus, em particular, uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose. Em uma modalidade, o uso consiste na substituição [ou troca] do gene manL, do gene manM ou do gene manN de uma cepa de Streptococcus thermophilus original, respectivamente, por um polinucleotídeo manL, manM ou manN com mutação, como definido no presente documento, para projetar uma cepa de Streptococcus thermophilus que tem seu gene original substituído por aquele (com mutação) como definido no presente documento. "Respectivamente" significa que o manL original é substituído pelo manL com mutação, o manM original é substituído pelo manM com mutação e/ou o manN original é substituído pelo manN com mutação. A invenção também se refere a um método para projetar uma cepa de Streptococcus thermophilus que compreende 1) substituir [ou trocar] o gene manL, o gene manM ou o gene manN de uma cepa de Streptococcus thermophilus original, respectivamente, por um polinucleotídeo manL, manM ou manN com mutação, como definido no presente documento, e 2) obter uma cepa de Streptococcus thermophilus que tem seu gene original substituído por aquele (com mutação) como definido no presente documento.
[0192] Em uma modalidade do uso ou do método, a cepa de Streptococcus thermophilus original porta uma mutação em seu gene glcK. Em uma modalidade do uso ou do método, a cepa de
Streptococcus thermophilus original porta uma mutação em seu gene ccpA. Em uma modalidade do uso ou do método, a cepa de Streptococcus thermophilus original porta uma mutação em seu gene glcK e uma mutação em seu gene ccpA. É um objetivo da invenção que a substituição do gene manL, do gene manM ou do gene manN em uma cepa de Streptococcus thermophilus original [que porta uma mutação em seu gene glcK e/ou uma mutação em seu gene ccpA], respectivamente, por um polinucleotídeo manL, manM ou manN com mutação, como definido no presente documento, leve a uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, como definido na invenção, isto é, uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) que é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2 ou maior do que 3, como definido no presente documento.
[0193] Em uma modalidade do uso ou do método, a cepa de Streptococcus thermophilus original porta uma mutação em seu gene glcK, como definido na parte I acima. Em uma modalidade do uso ou do método, a cepa de Streptococcus thermophilus original porta uma mutação em seu gene ccpA, como definido na parte III acima. Em uma modalidade do uso ou do método, a cepa de Streptococcus thermophilus original porta uma mutação em seu gene glcK, como definido sob a parte I acima, e uma mutação em seu gene ccpA, como definido sob a parte III acima.
[0194] Em uma modalidade, o gene manL, o gene manM ou o gene manN de Streptococcus thermophilus com mutação codifica, respectivamente, uma proteína IIABMan, uma proteína IICMan ou uma proteína IIDMan, cuja atividade de importação de glicose é diminuída ou abolida.
[0195] Em uma modalidade, o gene manL, o gene manM ou o gene manN de Streptococcus thermophilus é caracterizado pelo fato de que, quando individualmente inserido em vez do gene manL, do gene manM ou do gene manN da cepa DSM32587: - o derivado de DSM32587 que, quando usado para fermentar leite como avaliado pelo teste B, exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2. Em uma modalidade particular, um gene manL, manM ou manN com mutação é considerado como estando de acordo com a invenção quando a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no leite fermentado é maior do que 1,5, é maior do que 2 ou é maior do que 3.
[0196] Nesse contexto, o termo "derivado", quando aplicado à cepa DSM32587, significa a cepa DSM32587 em que o gene manL, manM ou manN original foi substituído pelo gene manL, manM ou manN com mutação a ser avaliado.
[0197] Em uma modalidade, o gene manL, o gene manM ou o gene manN de Streptococcus thermophilus com mutação é caracterizado pelo fato de que, quando individualmente inserido em vez do gene manL, do gene manM ou do gene manN da cepa DGCC7710 em que o gene ccpA foi anteriormente substituído pelo gene ccpA, como definido na SEQ ID Nº:71 (isto é, da cepa DGCC7710-ccpAΔ1A114-120): - o derivado de DGCC7710-ccpAΔ1A114-120 que, quando usado para fermentar leite como avaliado pelo teste B, exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2. Em uma modalidade particular, um gene manL, manM ou manN com mutação é considerado como estando de acordo com a invenção quando a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no leite fermentado é maior do que 1,5, é maior do que 2 ou é maior do que 3.
[0198] Nesse contexto, a expressão "derivado de DGCC7710- ccpAΔ1A114-120", quando aplicado à cepa DGCC7710-ccpAΔ1A114-120, significa a cepa DGCC7710-ccpAΔ1A114-120 em que o gene manL, manM ou manN original foi substituído pelo gene manL, manM ou manN com mutação a ser avaliado. Nesse contexto, a cepa DGCC7710-ccpAΔ1A114- 120 é a cepa DGCC7710 em que seu gene ccpA foi anteriormente substituído pelo gene ccpA, como definido na SEQ ID Nº:71.
[0199] "Individualmente inserido" significa que, para caracterização do gene man com mutação, apenas um gene man da cepa DSM32587 ou da cepa DGCC7710-ccpAΔ1A114-120 é trocado (ou substituído) pelo respectivo gene man com mutação a ser caracterizado.
[0200] Em uma modalidade, o gene com mutação que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é um gene manL com mutação. Em uma modalidade, o manL de Streptococcus thermophilus com mutação codifica uma proteína IIABMan de Streptococcus thermophilus, cuja atividade de importação de glicose é diminuída ou abolida, em particular uma proteína IIABMan de Streptococcus thermophilus truncada na posição 305 (IIABMan305). Em uma modalidade, o manL de Streptococcus thermophilus com mutação codifica uma proteína IIABMan de Streptococcus thermophilus truncada, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste em a) uma sequência, como definido na SEQ ID Nº:112, e b) uma sequência variante IIAB que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:112, em particular, que tem 305 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o gene manL com mutação codifica uma proteína IIABMan, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº: 112 a 128. Em uma modalidade, o gene manL de Streptococcus thermophilus com mutação é como definido na SEQ
ID Nº:111. A expressão "variante IIABMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade" é definida em "II. Mutações de um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular, mutações dos genes manL, manM e manN" acima.
[0201] Em uma modalidade, o gene com mutação que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é um gene manM com mutação. Em uma modalidade, o manM de Streptococcus thermophilus com mutação codifica uma proteína IICMan de Streptococcus thermophilus, cuja atividade de importação de glicose é diminuída ou abolida, em particular uma proteína IICMan de Streptococcus thermophilus truncada na posição 208 (IICMan208). Em uma modalidade, o manM de Streptococcus thermophilus com mutação codifica uma proteína IICMan de Streptococcus thermophilus truncada, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste em a) uma sequência, como definido na SEQ ID Nº:158, e b) uma sequência variante IICMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:158, em particular, que tem 208 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o gene manM com mutação codifica uma proteína IICMan, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº:158 a 165. Em uma modalidade, o gene manM de Streptococcus thermophilus com mutação é como definido na SEQ ID Nº:157. A expressão "variante IICMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade" é definida em "II. Mutações de um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular, mutações dos genes manL, manM e manN" acima.
[0202] Em uma modalidade, o gene com mutação que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é um gene manN com mutação. Em uma modalidade, o manN de Streptococcus thermophilus com mutação codifica uma proteína IIDMan de Streptococcus thermophilus, cuja atividade de importação de glicose é diminuída ou abolida, em particular uma proteína IIDMan de Streptococcus thermophilus truncada na posição 28 (IIDMan28). Em uma modalidade, o manN de Streptococcus thermophilus com mutação codifica uma proteína IIDMan de Streptococcus thermophilus truncada, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste em a) uma sequência, como definido na SEQ ID Nº:207, e b) uma sequência variante IIDMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:207, em particular, que tem 28 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o gene manN com mutação codifica uma proteína IIDMan, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº: 207 a 211. Em uma modalidade, o gene manN de Streptococcus thermophilus com mutação é como definido na SEQ ID Nº:206. A expressão "variante IIDMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade" é definida em "II. Mutações de um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular, mutações dos genes manL, manM e manN" acima.
[0203] Em uma modalidade, o polinucleotídeo, como definido no presente documento, é fornecido sob uma forma isolada. Um polinucleotídeo "isolado" é substancial ou essencialmente isento de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o gene como encontrado em seu ambiente de ocorrência natural. Assim, um polinucleotídeo isolado é substancialmente livre de outro material celular ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizada.
[0204] A invenção também se refere a um construto que compreende um polinucleotídeo, como definido no presente documento. Em uma modalidade, a presente invenção abrange um construto que compreende um polinucleotídeo da invenção ligada de modo operacional a uma sequência reguladora. O termo "ligado de modo operacional" se refere a uma justaposição, em que os componentes descritos estão em uma relação que permite que os mesmos funcionem de sua maneira pretendida. Uma sequência reguladora "ligada de modo operacional" a uma sequência de codificação é ligada de tal maneira que a expressão da sequência de codificação seja alcançada sob condições compatíveis com as sequências de controle. O termo "sequências reguladoras" incluem promotores e/ou intensificadores e outros sinais de regulação de expressão. O termo "promotor" é usado no sentido normal da técnica, por exemplo, um sítio de ligação da RNA polimerase. Em uma modalidade, independentemente ou em combinação com a modalidade de "sequência reguladora", o construto contém ou expressa outro gene, tal como um marcador que permite a seleção do construto. Existem vários marcadores que podem ser usados, por exemplo, aqueles marcadores que fornecem resistência a antibióticos - por exemplo, resistência a antibióticos bacterianos - tal como eritromicina, ampicilina, estreptomicina e tetraciclina.
[0205] Assim, em outro aspecto, é fornecido um vetor que compreende um polinucleotídeo ou um construto, como definido no presente documento. Como usado no presente documento, o termo "vetor" refere-se a qualquer molécula de ácido nucleico em que outro ácido nucleico (por exemplo, o polinucleotídeo da invenção) pode ser inserido e que pode ser introduzido e replicar dentro de uma cepa bacteriana, tal como uma cepa de Streptococcus thermophilus. Assim, o termo refere-se a qualquer construto de ácido nucleico (e, se necessário, qualquer sistema de entrega associado) que pode ser usado para introduzir material genético em uma cepa bacteriana, em particular, uma cepa de Streptococcus thermophilus. A seleção de vetores apropriados está dentro do conhecimento dos versados na técnica. Em uma modalidade, o vetor é um plasmídeo. Como usado no presente documento, o termo "plasmídeo" refere-se a um construto de
DNA de fita dupla (ds) circular que pode ser usado como um vetor para introduzir DNA em uma cepa bacteriana, em particular, uma cepa de Streptococcus thermophilus. Os construtos ou os vetores podem ser introduzidos em uma cepa bacteriana, como descrito no presente documento, tal como a cepa DGCC7710.
[0206] O polinucleotídeo, o construto, o vetor ou o plasmídeo da invenção descrita no presente documento podem ser introduzidos em uma cepa de Streptococcus thermophilus, com o uso de qualquer método disponível.
[0207] "Introduzir" (e "introduzido") se destina a significar apresentar à cepa de Streptococcus thermophilus, o polinucleotídeo, o construto, o vetor ou o plasmídeo da invenção, como definido no presente documento, de tal maneira que o componente (ou componentes) ganhe acesso ao interior da cepa de Streptococcus thermophilus. Os métodos e as composições não dependem de um método particular para introduzir em uma cepa de Streptococcus thermophilus, apenas que o polinucleotídeo, o construto, o vetor ou o plasmídeo da invenção ganhe acesso ao interior da cepa de Streptococcus thermophilus. Introduzir inclui a incorporação de um polinucleotídeo, um construto, um vetor ou um plasmídeo da invenção na cepa de Streptococcus thermophilus, em que o polinucleotídeo ou o construto pode ser incorporado ao genoma da cepa de Streptococcus thermophilus e inclui a provisão temporária (direta) de um polinucleotídeo ou construto da cepa de Streptococcus thermophilus.
[0208] A introdução de um polinucleotídeo, um construto, um vetor ou um plasmídeo da invenção em uma cepa de Streptococcus thermophilus pode ser executada por diversos métodos, incluindo transformação, conjugação, transdução ou fusão de protoplasto. Os métodos para introduzir polinucleotídeo, construto, vetor ou plasmídeo da invenção por transformação em uma cepa de Streptococcus thermophilus incluem, porém sem limitação, microinjeção, eletropo- ração, métodos de transformação estável, métodos de transformação temporária [tal como competência induzida com o uso de meios quími- cos (por exemplo, cátions bivalentes, tal como CaCl2) ou mecânicos (eletroporação)], aceleração de partícula balística (bombardeio de partículas), transferência de gene direta, introdução mediada por vírus, peptídeos de penetração celular ou entrega de proteína direta mediada por nanopartícula de sílica mesoporosa (MSN). A introdução de um polinucleotídeo, um construto, um vetor ou um plasmídeo da invenção em uma cepa de Streptococcus thermophilus pode ser executada por conjugação, que é um método específico de troca de DNA natural que exige contato físico de célula com célula. A introdução de um polinucleotídeo, um construto, um vetor ou um plasmídeo da invenção em uma cepa de Streptococcus thermophilus pode ser executada por transdução, que é a introdução de DNA por meio de uma infecção viral (por exemplo, fago) que é também um método natural de troca de DNA. Em geral, tais métodos envolvem a incorporação de um polinucleotídeo em uma molécula de RNA ou DNA viral.
[0209] A invenção também se refere aos seguintes genes man com mutação como tal e suas proteínas codificadas correspondentes: - o manL de Streptococcus thermophilus com mutação que codifica uma proteína IIABMan truncada de Streptococcus thermophilus, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste em a) uma sequência, como definido na SEQ ID Nº:112, e b) uma sequência variante IIAB que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:112, em particular, que tem 305 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o gene manL de Streptococcus thermophilus com mutação codifica uma proteína IIABMan, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº: 112 a 128. Em uma modalidade, o gene manL de
Streptococcus thermophilus com mutação é como definido na SEQ ID Nº:111. - o manN de Streptococcus thermophilus com mutação que codifica uma proteína IIDMan truncada de Streptococcus thermophilus, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste em a) uma sequência, como definido na SEQ ID Nº:207, e b) uma sequência variante IIDMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:207, em particular, que tem 28 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o gene manN de Streptococcus thermophilus com mutação codifica uma proteína IIDMan, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste na SEQ ID Nº: 207 a 211. Em uma modalidade, o gene manN de Streptococcus thermophilus com mutação é como definido na SEQ ID Nº:206.
[0210] A expressão "variante IIABMan e variante IIDMan que têm pelo menos 90% de similaridade ou identidade" é como definido em "II. Mutações de um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular, mutações dos genes manL e manN" acima.
[0211] A invenção também se refere a um método para projetar uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose: a) fornecer uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta um gene glcK que codifica uma glicoquinase, cuja atividade é reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e opcionalmente que porta um gene ccpA com mutação; b) causar mutação de pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose- glicose, em particular, um gene manL, um gene manM e/ou um gene manN; e c) selecionar uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, que, quando usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2.
[0212] Em uma modalidade, a cepa selecionada na etapa c) exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,5, maior do que 2, maior do que 2,5 ou maior do que 3, quando avaliada pelo teste B.
[0213] Em uma modalidade, o pelo menos um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose, em particular, um gene manL, manM ou manN gene, sofre mutação, tal como codificar uma proteína, em particular, uma proteína truncada, cuja atividade de importação de glicose é diminuída ou abolida.
[0214] A invenção também se refere a um método para projetar uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose: a) fornecer uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta pelo menos um gene, em particular, um gene, que codifica pelo menos uma proteína com mutação, em particular, uma proteína, do PTS específico para manose-glicose, em particular, uma proteína IIABMan com mutação, uma proteína IICMan com mutação e/ou uma proteína IIDMan com mutação, cuja atividade de importação de glicose é diminuída ou abolida; b) causar mutação em um gene glcK que codifica uma glicoquinase, cuja atividade é reduzida, mas não nula, como definido no presente documento, e/ou causa mutação em um gene ccpA; c) selecionar uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, que, quando usada para fermentar leite, como avaliado pelo teste B, exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2.
[0215] Em uma modalidade, a cepa selecionada na etapa c) exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,5, maior do que 2, maior do que 2,5 ou maior do que 3, quando avaliada pelo teste B.
[0216] Em uma modalidade, o gene que codifica uma proteína com mutação do PTS específico para manose-glicose, cuja atividade de importação de glicose é diminuída ou abolida, codifica uma proteína truncada, em particular uma proteína IIABMan truncada, uma proteína IICMan truncada ou uma proteína IIDMan truncada.
[0217] Em uma modalidade dos 2 métodos definidos acima, o método compreende, ainda: d) selecionar uma cepa, que, quando usada para fermentar leite pelo teste B, fornece um leite fermentado com baixo teor de lactose, em particular, um leite fermentado, cuja quantidade de lactose restante é menor do que 60 mM, menor do que 50 mM, menor do que 45 mM, menor do que 40 mM, menor do que 35 mM ou menor do que 30 mM
[0218] Em uma modalidade dos 2 métodos definidos acima, o método compreende, ainda d) selecionar uma cepa que, quando inoculada a um leite que é, então, fermentado pelo teste B, o pH do leite diminui a um pH no qual a velocidade de acidificação se torna definitivamente menor do que 0,1 mUpH/min, em que o dito pHPARADA está compreendido entre 4,6 e 5,3, e, opcionalmente, o coeficiente angular entre pH6 e pH5,5 é de pelo menos -0,008 UpH/min. Em uma modalidade, a cepa é selecionada quando o pHPARADA está compreendido entre um valor mínimo selecionado dentre o grupo que consiste em 4,6, 4,7 e 4,8 e um valor máximo selecionado dentre o grupo que consiste em 5,1, 5,2 e 5,3. Em uma modalidade, a cepa é selecionada quando o declive entre pH 6 e pH 5,5 é pelo menos 0,009 ou pelo menos 0,01 UpH/min. ---------------
[0219] Vários recursos e modalidades preferenciais da presente invenção serão agora descritos a título de exemplos não limitantes.
MATERIAIS E MÉTODOS Cepas e Condições de Crescimento
[0220] As cepas de S. thermophilus (ST) descritas no presente pedido foram cultivadas a 37°C em caldo M17 (Oxoïd, referência do fornecedor CM0817) suplementado com 30 g/l de carboidrato adequado e, se necessário, adição de 15 g/l de Ágar Tipo bacteriológico A (Biokar, referência do fornecedor Nº A1010HA) ou a 43°C em leite (leite semidesnatado UHT "Le Petit Vendéen" + 3% de leite em pó BBA Lactalis). O caldo M17 autoclavado foi suplementado com lactose, sacarose, galactose ou glicose filtrada a 0,2 µm. Estoques congelados de cepas ST foram obtidos por meia diluição de uma cultura de um dia para o outro em M17 suplementado com 5 g/l de lactose, e 10% de glicerol e armazenados a -20°C. Quantificação de catabolismo de carboidrato durante fermentação de leite [teste B]
[0221] Leite semidesnatado UHT "Le Petit Vendéen ("leite de iogurte") contendo 3% (p/v) de leite em pó (BBA, Lactalis), previamente pasteurizado por 10 minutos a 90°C, foi inoculado a 1% (v/v, cerca de 107 CFU/ml) com uma cultura da cepa de S. thermophilus a ser avaliada (células ressuspensas sem carboidrato M17 de cultura de um dia para o outro cultivada em M17 suplementado com 3% de sacarose). O leite mostrou conter em torno de 175 mM de lactose. Os frascos de leite inoculado foram estaticamente incubados em um banho-maria a 43°C durante 24 horas, para obter leite fermentado.
[0222] Amostras T0 e amostras de leite fermentado (T24h) (5 g) foram diluídas em 25 g de H 2SO4 0,025 N, antes de serem centrifugadas a 4600 rpm por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi filtrado através de um filtro de náilon de 0,2 μm (Phenomenex, Alemanha, Aschaffenburg) diretamente em um frasco de HPLC de 2 ml. As amostras foram armazenadas a -20°C até a análise adicional. Carboidratos foram quantificados por cromatografia líquida de alto desempenho (Agilent 1200 HPLC) equipada com um detector de índice de refração com o uso de uma coluna de troca de ânions Aminex HPX- 87H (Bio-Rad Laboratories Inc.) a 35°C, com H2SO4 12,5 mM como o fluido de eluição e uma taxa de fluxo de 0,6 ml min−1. A exploração de resultados foi realizada com o software de reprocessamento Chemstation (Agilent). Sequenciamento de glcK
[0223] A amplificação por PCR do gene de glicoquinase foi realizada com o uso dos iniciadores GlcK-F4 (5'- CAGGTATGAGTTTAGCAACGG-3') e GlcK-R12 (5'- ATTCACCACGGCCTGAGAC-3'), [etapa de incubação a 98°C, 5 minutos, seguida por 33 ciclos de 98°C, 45 s; 58°C, 30 s; 68°C, 3 minutos, com uma etapa de extensão final a 72°C, 7 minutos]. Os produtos de PCR de 2788 pares de bases foram, então, tratados com IllustraTM ExoProStarTM de acordo com as instruções do fabricante (GE Healthcare). As reações de sequenciamento foram realizadas com o uso do BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante com o uso de um AB3500 (Applied BiosystemsTM) e os iniciadores listados na Tabela
2.
Iniciadores Sequências GlcK-F4 CAGGTATGAGTTTAGCAACGG GlcK-R8 AGTTCAATCTTCATCATCTCG GlcK-F5 GTAGCCACATTGTTCCTGAC GlcK-R6 TTGCTGAAGCTACAGTTTCC GlcK-R4 TAAGCAAGACTAGCAGCTCC GlcK-F7 TTGCGTAGTCGTGTTGAAGG GlcK-R10 ATTGTCCCTTCATAAGCATCG GlcK-F11 CGAACTGGGTGCAGATGATG GlcK-R12 ATTCACCACGGCCTGAGAC Tabela 2: Listagem de iniciadores para sequenciar glcK. Atividade de glicoquinase [teste A]
[0224] Uma cultura fresca de um dia para o outro de uma cepa de Streptococcus thermophilus em M17 contendo 30 g/l de lactose foi obtida e usada para inocular a 1% (vol/vol) 10 ml de M17 fresco 30 g/l de lactose. As células foram coletadas por centrifugação (6000 g, 10 minutos, 4°C) a uma densidade óptica de 600 nm (OD600) de 0,8, lavadas em 5 ml de tampão GLCK frio (MgCl2 5 mM, K2HPO4/KH2PO4 [pH 7,2] 10 mM) e ressuspensas em 500 µl de tampão GLCK frio. Inibidores de protease sem EDTA "cOmpleteTM" (Roche, referência do fornecedor 04693132001) foram adicionados em tampão GLCK, como descrito pelo fornecedor. As células foram rompidas pela adição de 100 mg de microesferas de vidro (150-212 µm, Sigma G1145) a 200 µl de células ressuspensas e oscilação a uma frequência de 30 ciclos/s por 6 minutos em um moinho oscilante MM200 (Retsch, Haan, Alemanha). Os restos de células e microesferas de vidro foram removidos por centrifugação (14000 g, 15 min, 4°C), e o sobrenadante transferido para um tubo de centrifugação de 1,5 ml limpo mantido em gelo. O teor total de proteína foi determinado com o uso do FLUKA Protein Quantification Kit-Rapid (ref 51254). A atividade de glicoquinase nos extratos celulares foi determinada espectrofotometricamente por um ensaio acoplado a glicose-6-fosfato desidrogenase (G-6PDH, EC1.1.1.49):NADPH (Porter et al., 1982), essencialmente como descrito por Pool et al. (2006). Cada amostra (5, 10 e 20 µl) foi adicionada ao tampão de ensaio (K2HPO4/KH2PO4 [pH 7,2] 10 mM, MgCl2 5 mM, ATP 1 mM, glicose 20 mM, NADP 1 mM, G-6PDH 1 U) em um volume final de 250 µl, e a mistura foi deixada por 5 min a 30°C. A densidade óptica a 340 nm foi medida por 5 minutos com o uso de um leitor de microplaca de detecção múltipla Synergy HT (BIO-TEK). Uma unidade de glicoquinase corresponde à quantidade de enzima que catalisa a fosforilação de 1 µmol de D-glicose em D-Glicose 6-fosfato por minuto sob as condições de ensaio. A atividade de glicoquinase foi calculada como a seguir:
[0225] Atividade de glicoquinase (U/g de extrato de proteína total) = dOD x V/[dt x l x ɛ x Qprot], em que: - dOD é a variação de densidade óptica (OD) a 340 nm - V é o volume da reação (no presente documento 250 µl) - dt = tempo de medição (em minutos) - l = comprimento de trajeto óptico (no presente documento 0,73 cm) - ɛ = coeficiente de atenuação molar de NADPH ; H+ (no presente documento 6220 cm2/µmol) - Qprot = quantidade de proteína no cadinho (em g)
[0226] As medições foram triplicadas para cada amostra e os valores de atividade específica de glicoquinase fornecidos no presente documento sob o teste A são a média de três experimentos independentes.
Velocidade Direta Máxima de GlcK [teste C]
[0227] A velocidade direta máxima (Vmáx) de GlcK foi determinada com o uso de várias concentrações de glicose (0, 5, 10, 15, 20 mM) em extrato bruto preparado como descrito na "atividade de glicoquinase" (teste A). As medições foram triplicadas para cada amostra, e os valores de Vmáx fornecidos no presente documento sob o teste C são a média de três experimentos independentes. A regressão linear que representa o inverso da velocidade específica em função do inverso da concentração de glicose gera o inverso da velocidade direta máxima na interseção com o eixo geométrico Y do gráfico. Desempenho de Acidificação de Leite
[0228] As propriedades de acidificação de cepas de S. thermophilus foram avaliadas registrando-se o pH ao longo do tempo, durante fermentação de leite, como descrito no teste B. O pH foi monitorado por 24 horas com o uso do sistema CINAC (Alliance Instruments, França; eletrodo de pH Mettler 405 DPAS SC, Toledo, Espanha), como descrito anteriormente. O pH foi medido e registrado a cada 5 minutos. Com o uso do software CINAC v2.07, o declive entre pH 6,0 e pH 5,5 (UpH/minuto) [Declive pH 6-5,5] foi calculado. Transferência do alelo glcK da cepa ST0 no genoma de 3 outras cepas de S. thermophilus
[0229] Um produto de PCR de 1889 pares de bases que portam o gene glcK da cepa ST0 foi obtido com o uso dos iniciadores GlcK-F1 (5'- GAAGCAGTTTGGGGTAGTAG-3') e GlcK-R2 (5'- GAGTTATCTACAGGAGCTGG -3'). O produto de PCR foi então purificado com o uso do QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) e eluído em água livre de RNase. A concentração do produto de PCR foi determinada com o uso do espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, MA). O tamanho e a pureza do produto de PCR foram verificados pelo sistema QIAxcel® de eletroforese capilar à base de gel (Qiagen, Hilden, Alemanha). As cepas DGCC7710, ST1.1 e ST1.2 foram transformadas com o produto de PCR de 1889 pares de bases e mutantes que têm seu gene glcK substituído pelo alelo glcK da cepa ST0 foram selecionadas (a presença do alelo glcK da cepa ST0 foi verificada por sequenciamento).
RESULTADOS Exemplo 1: triagem de uma coleta de Streptococcus thermophilus para cepas que excretam glicose
[0230] Os inventores do presente pedido, com o desejo de selecionar cepas que secretam glicose, usaram outra abordagem. Uma coleta de Streptococcus thermophilus foi triada pelo teste B para cepas com capacidade de excretar glicose no leite fermentado. Uma quantidade de 10 mM de glicose foi usada como o limite mínimo para seleção. Uma cepa, ST0, que liberou 30 mM de glicose em leite fermentado com o uso do teste B, foi selecionada. Exemplo 2. Identificação de uma mutação no gene glcK
[0231] O sequenciamento de diversos genes - da cepa ST0 – conhecidos por estarem envolvidos no catabolismo de carboidratos em S. thermophilus foi executado e alinhado com as sequências de genes correspondentes de outra Streptococcus thermophilus de nossa coleta.
[0232] Uma diferença de aminoácido não conservativo, E275K, foi identificada na sequência GlcK da cepa ST0, que foi encontrada em qualquer uma das sequências GlcK das outras cepas de S. thermophilus da coleta; essa diferença de aminoácido é o resultado de um A na posição 823 do gene glcK em vez de um G. Outra comparação da glicoquinase codificada pelo gene glcK de outras cepas de S. thermophilus confirmou que uma lisina na posição 275 (em vez de um ácido glutâmico) era exclusiva para ST0 e não foi encontrada em qualquer uma das outras 107 cepas.
[0233] Outras diferenças de aminoácidos identificadas na glicoquinase deduzida dessas 108 cepas são representadas na Tabela
3. Assim, 10 tipos de glicoquinase diferentes poderiam ser distinguidos (GlcK tipo 1 a GlcK tipo 10, como apresentado, respectivamente, nas SEQ ID Nºs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20). Para os experimentos seguintes, foram selecionadas 10 cepas, ST1 a ST10, cada uma expressando uma glicoquinase exclusiva. A SEQ ID Nº:2 foi tomada como uma sequência de referência, devido ao fato de que esse tipo de GlcK foi encontrada em cerca de 70% das 108 cepas analisadas. Em particular, a cepa DGCC7710, depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, codifica uma glicoquinase, como definido na SEQ ID Nº:2. É importante observar que a única diferença de aminoácido entre a sequência da glicoquinase codificada pela cepa ST0 e a SEQ ID Nº:2 é a diferença de aminoácidos na posição 275.
posição 144 21 33 38 49 64 100 131 133 137 141 149 152 de aa ST1 T E E E D V N N I T G A N ST2 - - - - - - - - V - - - ST3 N G - - - - - V - V K ST4 - - - - A - - - - - - - ST5 - - - - - - - - - - - - ST6 - - - - - - - - - - - - ST7 - - - D - - - - V - - - ST8 N G - - - - - - V - V K ST9 - - D - - - S D V - - - ST10 - - D - - I - D V - - - ST0 - - - - - - - - - - - - ST20 - - - - - - - - - - S - -
posição diferença % de 182 188 197 198 209 220 227 252 265 275 de aa de aa identidade ST1 K V V A S F I T V E / / ST2 - - - - - - - - - - 1 99,7 ST3 - - I - - - L - - - 7 97,8 ST4 - - - - - - - - - - 1 99,7 ST5 - A - - - - - - - - 1 99,7 ST6 N - - T - - - - - - 2 99,4 ST7 - - - - - L L I - - 5 98,4 ST8 - - I - - - - - - - 6 98,1 ST9 - - - - - L L I - - 7 97,8 ST10 - - - - - L L I I - 8 97,5 ST0 - - - - - - - - - K 1 99,7 ST20 - - - - - - - - - - 1 99,7 Tabela 3: Diferenças de proteína GlcK identificadas por comparação da sequência de proteína GlcK codificada por 108 S. thermophilus e sequência de proteína GlcK codificada por ST0. As posições de aminoácido listadas indicam todas as diferenças de aminoácidos entre as proteínas GlcK. A sequência de proteína GlcK de ST1 (SEQ ID Nº:2) foi escolhida como uma sequência de referência. As posições de aminoácido não listadas nessa Tabela são idênticas para todas as glicoquinases desse estudo. A coluna "diferença de aa" fornece o número de diferenças de aminoácidos em comparação com a SEQ ID Nº:2. A coluna "% de identidade" fornece a porcentagem de identidade com a SEQ ID Nº:2 Exemplo 3. Medição da atividade de glicoquinase da cepa ST0 e comparação com outras cepas (ST1 a ST10)
[0234] A atividade de glicoquinase da cepa ST0 foi comparada com a atividade de glicoquinase das cepas ST1 a ST10 selecionadas como relatado no exemplo 2, com o uso do teste A. Os resultados estão resumidos na Tabela 4.
Atividade específica de glicoquinase atividade Cepa (U/g de extrato de proteína total) relativa (% de DGCC7710) Média STD DGCC7710 2756 140 100 (tipo ST1) ST2 2250 381 82 ST3 2595 173 94 ST4 2014 105 73 ST5 ND ND ND ST6 2892 354 105 ST7 2791 104 101 ST8 2471 293 90 ST9 2553 337 93 ST10 2718 280 99 ST0 977 29 35 Tabela 4: Atividade específica de glicoquinase de 11 cepas: 10 cepas - ST1 a ST10 - cada uma representando uma variante de proteína GlcK diferente, e ST0 identificada no exemplo 1; ND: não determinado
[0235] Esses dados mostram que a atividade de glicoquinase das cepas ST1 a ST10 é compreendida de 2014 a 2791 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A. A atividade de glicoquinase acima de 1800 U/g de extrato de proteína total foi considerada representação de uma atividade de glicoquinase normal. A atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 foi considerada como uma atividade de glicoquinase de referência (visto que expressa o tipo de GlcK mais frequente, definido como a SEQ ID Nº:2).
[0236] Em contrapartida, a cepa ST0, que expressa uma proteína GlcK que porta uma lisina na posição 275 tem uma atividade de glicoquinase que é em torno de 977 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A, isto é, é cerca de 3 vezes menor que a atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 (35%).
[0237] Esses dados mostram que a abordagem mantida pelos inventores possibilitou selecionar pela primeira vez uma cepa de S. thermophilus negativa para galactose que expressam uma glicoquinase, cuja atividade é significativamente reduzida, mas não nula. Exemplo 4: Comparação da atividade de glicoquinase, Vmáx e Km, da cepa DGCC7710, um derivado de DGCC7710 que porta a diferença de E275K e uma variante positiva para galactose de DGCC7710 que porta uma alteração de aminoácido nula para glicoquinase
[0238] Um derivado da cepa DGCC7710 foi projetado para que o gene glcK codifique uma glicoquinase com o ácido glutâmico (E) na posição 275 substituído pelo aminoácido lisina (K). O derivado (DGCC12534) foi depositado no DSMZ em 15 de agosto de 2017 sob o número de acesso DSM32587. A sequência dessa proteína GlcK é como identificado na SEQ ID Nº:22.
[0239] Em paralelo, um mutante de DGCC7710 foi gerado, em que a serina (S) na posição 72 foi substituída por uma prolina (P), para gerar uma proteína GlcK com uma sequência, como definido na SEQ ID Nº:23 [substituição de aminoácido S72P; relatada na cepa DSM25851 do pedido nº WO2013/160413]. Devido ao fato de que a substituição de aminoácido S72P leva a uma atividade de glicoquinase nula (isto é, uma cepa que não pode usar glicose por meio da glicoquinase), o mutante foi anteriormente tornado positivo para galactose (a fim de poder usar galactose, devido ao fato de que se espera que uma cepa de S. thermophilus negativa para galactose que exibe uma atividade de glicoquinase nula não seja viável em lactose). Assim, o promotor gal operon da cepa DGCC7710 foi sofreu anteriormente mutação de acordo com o pedido Nº WO2011/026863 para gerar um promotor gal operon que tem a sequência, como definido na SEQ Nº:24. Um mutante positivo para galactose que porta a substituição de aminoácido S72P na proteína GlcK foi obtido e chamado ST1m-glcK0-gal+.
[0240] Um alinhamento da sequência de proteína da glicoquinase das cepas DGCC7710, DSM32587 e ST1m-glcK0-gal+ é descrito na Figura 1.
[0241] A atividade de glicoquinase, a Vmáx e o Km da glicoquinase das cepas DGCC7710, DSM32587 e ST1m-glcK0-gal+ foi determinada como descrito em Material e Métodos. Os resultados obtidos são descritos nas Tabelas 5 e 6.
Atividade específica de glicoquinase atividade Cepa (U/g de extrato de proteína total) relativa (% de Média STD DGCC7710) DGCC7710 2756 140 100 DSM32587 907 32 33 ST1m-glcK0-gal+ 0 / 0 Tabela 5: Atividade específica de glicoquinase da cepa DGCC7710 e nas cepas DSM32587 e ST1m-glcK0-gal+ e % de atividade em comparação com a atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 Vmáx de glicoquinase Km de glicoquinase (U/g de extrato de proteína total) (mM) Cepa % de média STD média STD DGCC7710 DGCC7710 2855 178 100 1319 73 DSM32587 914 21 32 1328 56 ST1m-glcK0-gal+ ND / ND ND / Tabela 6: Vmáx de glicoquinase da cepa DGCC7710 e nas cepas DSM32587 e ST1m0gal+ e % de Vmáx de glicoquinase em comparação com a Vmáx de glicoquinase da cepa DGCC7710, e atividade de Km de glicoquinase das cepas DGCC7710, DSM32587 e ST1m-glcK0-gal+; ND: não determinado.
[0242] Os dados da Tabela 5 habilmente mostram que substituir o ácido glutâmico (E) na posição 275 da proteína GlcK por uma lisina (K) é suficiente sozinho para diminuir significativamente a atividade de glicoquinase de 2756 para 907 U/g (isto é, 33% de atividade de DGCC7710) no derivado de DGCC7710 (DSM32587). Os dados obtidos para o mutante ST1m-glcK0-gal+ confirmam que a alteração de aminoácido S72P é suficiente para abolir totalmente a atividade de glicoquinase. Juntamente com a atividade de glicoquinase, os inventores também estudaram se a diminuição observada de atividade de glicoquinase na cepa DSM32587 foi uma consequência de uma diminuição da afinidade (Km) da glicoquinase para seu substrato (glicose) e/ou uma diminuição na velocidade direta máxima (Vmáx) da glicoquinase. Os dados da Tabela 6 confirmam que substituir o ácido glutâmico (E) na posição 275 da proteína GlcK por uma lisina (K) é suficiente sozinho para diminuir significativamente a Vmáx da glicoquinase de 2855 para 914 U/g (isto é, 32% da Vmáx de DGCC7710) no derivado de DGCC7710 (DSM32587). Na ausência de uma glicoquinase funcional no mutante ST1m-glcK0-gal+, a Vmáx poderia não ser determinada. Exemplo 5: Identificação de uma proteína GlcK com mutação adicional
[0243] Uma cepa de Streptococcus thermophilus (ST20) foi identificada, cujo gene glcK contém uma diferença de aminoácido não conservativo, G144S. Essa alteração de aminoácido não foi encontrada em qualquer uma das sequências GlcK das outras cepas de S. thermophilus da coleta (GlcK tipos ST1 a ST10). É importante observar que a única diferença de aminoácido entre a sequência da glicoquinase codificada pela cepa ST20 e a SEQ ID Nº:2 é a diferença de aminoácido na posição 144 (Tabela 3). Exemplo 6: Comparação da cinética de catabolismo de açúcar e acidificação da cepa DGCC7710, da cepa DSM32587, da cepa ST20, da cepa ST1m-glcK0-gal+, da cepa ST1.1 e uma cepa ST1.1 com mutação em glcK, durante a fermentação de leite
[0244] Considerando, por um lado, o impacto das mutações E275K e G144S sobre a atividade de glicoquinase (reduzida, mas não nula) e, por outro lado, o papel da glicoquinase em metabolismo de glicose, a cepa DGCC7710, a cepa DSM32587, a cepa ST20, a cepa ST1m- glcK0-gal+ (todas descritas acima), assim como uma segunda cepa progenitora (cepa ST1.1, que codifica uma glicoquinase, como definido na SEQ ID Nº:22) e sua cepa ST1.1 com mutação em glcK (que tem a substituição E275K; cepa ST1.1m-glcK) foram usadas para fermentar leite pelo teste B e a concentração de glicose, galactose e lactose presentes no leite fermentado foi determinada (consultar material e métodos). Os resultados estão resumidos na Tabela 7 abaixo.
Galactose Lactose declive pH Glicose Cepa liberada restante 6-5,5 liberada (mM) (mM) (mM) (UpH/min) DGCC7710 < 0,1 53 116 -0,0140 DSM32587 32 73 95 -0,0148 ST20 49 62 101 -0,0124 ST1m-glcK0-gal+ 109 88 17 -0,0077 ST.1,1 < 0,1 44 119 -0,0180 ST1.1m-glcK 35 65 96 -0,0168 Tabela 7: Catabolismo de carboidrato em leite fermentado (24 h) com as cepas DGCC7710, DSM32587, ST20 e ST1m-glcK0-gal+.
[0245] Os dados da Tabela 7 mostram que:
- a cepa DSM32587 e a cepa ST20 liberam 32 mM e 49 mM de glicose, respectivamente, após fermentação de leite, enquanto a cepa DGCC7710 que tem uma alta atividade de glicoquinase não libera quantidade de glicose detectável. Essa diferença é também vista entre a cepa ST1.1 e seu mutante glcK (ST1.1m-glcK). Em relação ao mutante ST1m-glcK0-gal+, esse mutante positivo para galactose excreta 109 mM de glicose; - a cepa DSM32587 e a cepa ST20 liberam 73 mM e 62 mM de galactose, respectivamente, após fermentação de leite, enquanto a cepa DGCC7710 libera 53 mM. Essa ligeira diferença é também vista entre a cepa ST1.1 e seu mutante glcK (ST1.1m-glcK); - em relação à lactose restante no leite fermentado, o mutante ST1m-glcK0-gal+ consome quase toda a lactose presente no leite (158 mM de cerca de 175 mM), de modo que a concentração de lactose restante no leite fermentado seja 17 mM. Em contrapartida, com a cepa DSM32587 ou a cepa ST20, a concentração de lactose restante está na mesma faixa que para a cepa DGCC7710 [95 e 101 versus 116]. Isso é também visto entre a cepa ST1.1m-glcK e a cepa ST1.1 [96 versus 119].
[0246] Esses dados mostram que quase toda a porção química galactose (oriunda da hidrólise de lactose) é liberada no leite fermentado ao usar as cepas DGCC7710, DSM32587, ST20, ST1.1 e ST1.1m-glcK (59 mM, 80 mM, 66 mM, 56 mM e 79 mM de lactose consumida para 53 mM, 73 mM, 62 mM, 44 mM e 65 mM de galactose liberada). Deve-se lembrar que 1 mol de lactose gera, após hidrólise, 1 mol de glicose e 1 mol de galactose. A porção química glicose foi parcialmente consumida pela cepa. Assim, em um leite contendo 175 mM de lactose (teste B), isso significa que há mais lactose restante no leite do que lactose consumida pela cepa.
[0247] Esse comportamento pode ser também traduzido determinando-se a razão entre galactose liberada (mM) no leite fermentado e lactose restante (mM) no leite fermentado, quando avaliada pelo teste B. Essa razão é 0,452 em DGCC7710, 0,775 em DSM32587, 0,544 na cepa ST20, 0,373 em ST1.1 e 0,672 em ST1.1m- glcK, isto é, abaixo de 1 nas cepas com mutação em glcKacima e suas cepas precursoras. Essa razão representa a eficácia de absorção de lactose e hidrólise em cepa negativa para galactose. Exemplo 7: Determinação de catabolismo de açúcar e cinética de acidificação em cepas de S. thermophilus com mutação em man e com mutação em ccpA positiva para lactose e negativa para galactose
[0248] Com base nas observações realizadas no exemplo 6, os inventores determinaram o catabolismo de açúcar e cinética de acidificação de cepas de S. thermophilus com mutação no gene ccpA ou com mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose (gene manL, manM ou manN). Os seguintes mutantes foram projetados no fundo genético de DGCC7710 (ST1) e ST1.1 e usados para fermentação pelo teste B: - um derivado de DGCC7710, em que o gene ccpA foi substituído pelo gene ccpA que tem uma deleção de um nucleotídeo A no estiramento de 7 nucleotídeos A nas posições 114-120 (SEQ ID Nº:71), levando a um deslocamento do quadro de leitura aberto do gene ccpA (ST1m-ccpA); - um derivado de DGCC7710, que tem um gene ccpA com knockout (ST1m-KOccpA); - um derivado de DGCC7710, em que o gene manL foi substituído por um gene manL com a substituição do nucleotídeo G pelo nucleotídeo T na posição 916 (SEQ ID Nº:111), levando a um códon de parada na posição 306 da proteína IIABMan (ST1m-manL); - um derivado de DGCC7710, em que o gene manM foi substituído por um gene manM com uma substituição do nucleotídeo G pelo nucleotídeo T na posição 625 (SEQ ID Nº:157), levando a um códon de parada na posição 209 da proteína IICMan (ST1m-manM); - um derivado de DGCC7710, em que o gene manN foi substituído por um gene manN com uma inserção de um nucleotídeo A no estiramento de 5 nucleotídeos A nas posições 37-41 (SEQ ID Nº:206), levando a um deslocamento do quadro de leitura aberto e um truncamento da proteína IIDMan na posição 28 (ST1m-manN); - um derivado de ST1.1, em que o gene ccpA foi substituído por um gene ccpA que tem uma deleção de um nucleotídeo A no estiramento de 7 nucleotídeos A nas posições 114-120 (SEQ ID Nº:71) (ST1.1m-ccpA); e - um derivado de ST1.1, em que o gene manL foi substituído por um gene manL com a substituição do nucleotídeo G pelo nucleotídeo T na posição 916 (SEQ ID Nº:111) (ST1.1m-manL).
Os resultados estão Galactose Lactose Razão galactose declive pH resumidos na Tabela 8 liberada restante liberada/lactose 6-5,5 abaixo.Cepa restante (mM) (mM) (UpH/min) DGCC7710 53 116 0,452 -0,0140 ST1m-ccpA 60 109 0,544 -0,0125 ST1m-KOccpA 66 96 0,686 -0,0084 ST1m-manL 65 101 0,643 -0,0104 ST1m-manM 68 100 0,678 -0,0089 ST1m-manN 63 102 0,615 -0,0095 ST1.1 44 119 0,373 -0,0180 ST1.1m-ccpA 51 110 0,465 -0,0160 ST1.1m-manL 50 113 0,445 -0,0123 Tabela 8: Catabolismo de carboidrato em leite fermentado (24 h) com cepas com mutação em ccpA e mutação em man e suas cepas precursoras
[0249] Esses dados mostram que nenhuma das cepas com mutação em ccpA e mutação em man são adequadas para remover lactose durante a fermentação de leite (concentração de lactose entre 96 e 113 mM).
[0250] Esses dados confirmam que os valores das razões entre galactose liberada e lactose restante no leite fermentado obtido com as cepas com mutação no gene ccpA ou em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e com suas cepas precursoras estão em conformidade com os valores relatados no exemplo 6 acima (isto é, uma razão que é menor do que 1). Exemplo 8: Determinação de catabolismo de açúcar e cinética de acidificação em cepas de S. thermophilus positivas para lactose e negativas para galactose ambas com mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e com mutação em um gene glcK e/ou gene ccpA
[0251] Os inventores, então, projetaram cepas com mutação em um gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose (manL, manM ou manN) e com mutação em um gene glcK e/ou um gene ccpA. Assim, as cepas com mutação dupla e com mutação tripla, com base nos genes com mutação a seguir, foram projetadas, no fundo genético do DGCC7710 (ST1) ou no fundo genético de ST1.1. - ST1m-glcK+manM: derivado de DSM32587 (que porta o gene glcK que codifica uma glicoquinase com a substituição E275K; exemplo 2), em que o gene manM foi substituído pelo gene manM com mutação, como definido na SEQ ID Nº:157; - ST1m-ccpA+manL: derivado de ST1m-ccpA (DGCC7710 que porta o gene ccpA com mutação, como definido na SEQ ID Nº:71), em que o gene manL foi substituído pelo gene manM com mutação, como definido na SEQ ID Nº:111; - ST1m-ccpA+manM: derivado de ST1m-ccpA (DGCC7710 que porta o gene ccpA com mutação, como definido na
SEQ ID Nº:71), em que o gene manM foi substituído pelo gene manM com mutação, como definido na SEQ ID Nº:157; - ST1m-ccpA+manN: derivado de ST1m-ccpA, em que o gene manN foi substituído pelo gene manN com mutação, como definido na SEQ ID Nº:206; - ST1m-glcK+ccpA+manM: derivado de DSM32587, em que o gene ccpA foi substituído pelo gene ccpA com mutação, como definido na SEQ ID Nº:71, e o gene manM foi substituído pelo gene manM com mutação, como definido na SEQ ID Nº:157; - ST1.1m-glcK+manM: derivado de ST1.1m-glcK (cepa ST1.1 que porta o gene glcK que codifica uma glicoquinase com a substituição E275K), em que o gene manM foi substituído pelo gene manM com mutação, como definido na SEQ ID Nº:157; e - ST1.1m-ccpA+manL: derivado de ST1.1m-ccpA (ST1.1 que porta o gene ccpA com mutação, como definido na SEQ ID Nº:71), em que o gene manL foi substituído pelo gene manL com mutação, como definido na SEQ ID Nº:111.
[0252] Os resultados estão resumidos na Tabela 9 abaixo.
Galactose Lactose restante Razão galactose declive pH 6- Cepa liberada (mM) (mM) liberada/lactose restante 5,5 (UpH/min) DGCC7710 53 116 0,452 -0,0140 DSM32587 73 95 0,775 -0,0148 ST1m-glcK+manM 117 33 3,500 -0,0104 ST1m-ccpA+manL 131 25 5,252 -0,0089 ST1m-ccpA+manM 129 31 4,207 -0,0082 ST1m-ccpA+manN 128 28 4,606 -0,0109 ST1m-glcK+ccpA+manM 129 29 4,431 -0,0092 ST1.1 44 119 0,373 -0,0180 ST1.1m-glcK+manM 98 55 1,780 -0,0140 ST1.1m-ccpA+manL 117 34 3,460 -0,0091 Tabela 9: Catabolismo de carboidrato em leite fermentado (24 h) com cepas com mutação dupla e tripla e suas cepas precursoras
[0253] Surpreendentemente, enquanto todas as cepas com mutação única negativas para galactose (com mutação em um gene dentre o gene glcK, o gene ccpA, o gene manL, o gene manM e o gene manN) mostram concentração de lactose em torno ou maior do que 100 mM pelo teste B (entre 95 e 113) [consultar as tabelas 7 e 8], a introdução de 2 ou 3 genes com mutação (um gene com mutação que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e um gene glcK com mutação e/ou um gene ccpA com mutação) leva a cepas que, quando usadas para fermentar leite pelo teste B, removem entre 68% e 85% da lactose originalmente contida no leite (isto é, uma concentração de lactose entre 25 e 55 mM).
[0254] De modo interessante, a razão entre galactose liberada e lactose restante no leite fermentado definida acima é drasticamente aumentada em comparação com, não apenas as cepas sem mutação, mas também as cepas com mutação única. Assim, essa razão é compreendida entre 1,780 e 5,252. Isso demonstra que mais do que a concentração de lactose restante no leite fermentado, a razão entre galactose liberada e lactose restante no leite fermentado é um parâmetro excelente para distinguir cepas negativas para galactose que são adequadas para remover lactose durante a fermentação de leite de cepas que não são adequadas para remover lactose. Isso mostra o interesse das cepas mutantes duplas ou triplas para produtores fabricantes que desejem obter produtos de leite fermentado com baixo teor de lactose (com meros do que 60 mM). Exemplo 9: pH parada em leite fermentado com os mutantes duplos e triplos da invenção.
[0255] As cepas DGCC7710, ST1m-glcK+manM, ST1m- ccpA+manL, ST1m-ccpA+manM, ST1m-ccpA+manN, ST1m- glcK+ccpA+manM, ST1.1, ST1.1m-glcK+manM e ST1.1m-ccpA+manL (todas descritas acima) foram usadas para fermentar leite pelo teste B [24 horas à temperatura de fermentação].
[0256] O pH foi arredondado com o uso de um dispositivo CINAC. A evolução do pH ao longo do tempo é representada nas Figuras 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A, 8A, 9A e 10A. A velocidade entre pH 6 e pH 5,5 foi calculada como o declive do modelo linear deduzido da evolução do pH como uma função do tempo para um valor de pH entre 6 e 5,5. O valor de declive é o oposto da velocidade (Tabela 10). A evolução da velocidade como uma função do pH foi também representada (Figuras 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B, 8B, 9B e 10B). A velocidade é determinada como o derivado instantâneo da evolução de pH como uma função do tempo. O pHPARADA foi caracterizado como o valor de pH em que a diminuição de velocidade se torna não detectável (abaixo de 0,1 mupH/minutos) (Tabela 10). O tempo correspondente ao pHPARADA (TpHPARADA) foi também determinado (Tabela 10).
Declive pH 6 - TpHPARADA Cepa pHPARADA 5,5 (UpH/min) (min) DGCC7710 4,21 -0,0140 952 ST1m-glcK+manM 4,95 -0,0104 392 ST1m-ccpA+manL 4,96 -0,0089 388 ST1m-ccpA+manM 4,97 -0,0082 298 ST1m-ccpA+manN 4,93 -0,0109 312 ST1m-glcK+ccpA+manM 4,98 -0,0092 328 ST1.1 4,31 -0,0180 602 ST1.1m-glcK+manM 4,74 -0,0140 458 ST1.1m-ccpA+manL 4,66 -0,0091 512 Tabela 10: Cinética de acidificação obtida com cepas com mutação dupla e tripla e suas cepas precursoras
[0257] Os dados da Tabela 10 mostram que um leite fermentado com as cepas mutantes duplas e triplas (da invenção) têm um pHPARADA mais alto (entre 4,66 e 4,98) do que um leite fermentado com as cepas precursoras (4,21 e 4,31). Em outras palavras, isso significa que o pH obtido ao final do teste B (24 h à temperatura de fermentação) é mais alto com o uso das cepas mutantes duplas ou triplas (da invenção) do que as cepas precursoras. Essa Tabela também mostra que o pHPARADA é obtido entre 298 e 512 minutos após a inoculação e mantido até 24 horas (isto é, mais de 15 horas). As Figuras 3A, 4A, 5A, 6A, 7A, 9A e 10A mostram a estabilidade do pH do leite fermentado ao longo do tempo, uma vez que o pHPARADA tenha sido obtido (com as cepas mutantes duplas ou triplas), em comparação com um pH regularmente decrescente ao usar as cepas precursoras (Figuras 2A e 8A). As Figuras 3B, 4B, 5B, 6B, 7B, 9B e 10B mostram que a velocidade de acidificação (velocidade) para em um pH alto entre 4,6 e 5 com as cepas mutantes duplas ou triplas, enquanto a velocidade de acidificação para em um pH baixo (4,21 e 4,31) ao usar as cepas precursoras (Figuras 2B e 8B). Em conjunto, esses resultados mostram a ausência de pós-acidificação de leite fermentado com as cepas mutantes duplas ou triplas da invenção.
[0258] Esses dados também mostram que a cinética de acidificação (declive entre pH 6 e 5,5) é aceitável no nível industrial para fabricar produtos lácteos fermentados.
[0259] Em conjunto, esses resultados mostram o interesse das cepas mutantes duplas ou triplas para produtores fabricantes que desejem, não apenas obter produtos fermentados cujo pH é parado em uma faixa mais alta (4,6 - 5,3), mas também manter seu processo à temperatura de fermentação sem impactar o pH dos produtos lácteos fermentados.
SEQUÊNCIAS SEQ ID Nº:2
SLAYSIDK SEQ ID Nº:22
SLAYSIDK SEQ ID Nº:45
SLAYSIDK SEQ ID Nº:23
SEQ ID Nº:65
TAATCATGGTCTAACTTTACGCCAGTCAACAAAATAA SEQ ID Nº:71
SEQ ID Nº:78
DKDDVACFEKLRDLGVEFDVRKVPNDSKKDLFELIKKANVQ SEQ ID Nº:111
SEQ ID Nº:112
VPIKELNVGSMAHSTGKTMVNNVLSMDKDDVACFEKLRDLGV SEQ ID Nº:130
KQGGGNGGGNGGGTSSGSGDPIGDILEDY SEQ ID Nº:157
SEQ ID Nº:158
LLAIPAQSVQHALGLMPDWLTHGLVVGGGMVVAVGYAMIINMMATR SEQ ID Nº:166
GIM SEQ ID Nº:206
SEQ ID Nº:207
[0260] Os números DGCC são referências internas à coleção DuPont Danisco; os números DSM são os números atribuídos pelo Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH (Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig), após depósito sob o Budapest Treaty.
[0261] Em relação à cepa de Streptococcus thermophilus DGCC7710 depositada sob o Budapest Treaty no Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH, em 14 de janeiro de 2014 sob o número DSM28255, é confirmado que o depositante, Danisco Deutschland GmbH (de Busch- Johannsen-Strasse 1, D-25899 Niebüll, Alemanha) autorizou o requerente (DuPont Nutrition Biosciences ApS) a mencionar o material biológico depositado neste pedido. As expressões "cepa DGCC7710" e "derivado de DGCC7710" são usadas de forma intercambiável com as expressões "cepa DSM28255" e "derivado de DSM28255".
[0262] A cepa de Streptococcus thermophilus depositada sob o Budapest Treaty no Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH, em 15 de agosto de 2017 sob o número DSM32587 foi depositada pela DuPont Nutrition Biosciences ApS.
[0263] O requerente solicita que uma amostra dos micro- organismos depositados determinados no presente documento possa ser apenas disponibilizada para um especialista, até a data em que a patente é concedida.
[0264] Em relação a essas designações nas quais uma Patente europeia é solicitada, uma amostra desses micro-organismos depositados será disponibilizada até a publicação da menção do concedimento da patente europeia ou até a data em que o pedido foi recusado ou retirado ou é considerado retirado, apenas pelo fornecimento de tal amostra a um especialista indicado pela pessoa solicitando a amostra e aprovado ou i) pelo Requerente e/ou ii) pelo Escritório Europeu de Patentes, o que for aplicável.
Claims (30)
1. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose caracterizada pelo fato de que porta uma mutação nos genes selecionados dentre o grupo que consiste em 1) pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e um gene glcK, 2) pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e um gene ccpA e 3) pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose- glicose, um gene glcK e um gene ccpA; em que, quando a dita cepa é usada para fermentar leite como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2, maior do que 2,5 ou maior do que 3.
2. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que porta uma mutação em pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e que porta uma mutação em um gene glcK, em particular, na sequência de codificação de seu gene glcK, de modo que a atividade de glicoquinase da dita cepa seja reduzida, mas não nula.
3. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a atividade de glicoquinase na dita cepa está entre 300 e 1200 U/g ou entre 400 e 1000 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A.
4. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a atividade de glicoquinase na dita cepa está entre 10 e 50 % da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, em particular entre 15 e 40% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710, em que tanto a atividade de glicoquinase da dita cepa quanto a atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 são avaliadas pelo teste A.
5. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizada pelo fato de que a velocidade direta máxima (Vmáx) de sua glicoquinase na dita cepa é significativamente reduzida, mas não nula e é definida por um ou dois destes parâmetros: - a Vmáx de glicoquinase na dita cepa está entre 300 e 1200 U/g ou entre 400 e 1000 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste C; - a Vmáx de glicoquinase na dita cepa está entre 10 e 50% da Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando ambas são avaliadas pelo teste C, em particular, está entre 15 e 40% da Vmáx da glicoquinase da DGCC7710.
6. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de que a) o aminoácido na posição 275 da glicoquinase não é um ácido glutâmico, em particular, não é um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina; b) a sequência de proteínas da dita glicoquinase é como definido na SEQ ID Nº:25, em que o aminoácido na posição 275 da dita SEQ ID não é ácido glutâmico, em particular, não é um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina; c) a sequência de proteínas da dita glicoquinase é uma sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:25, em particular, tendo 322 aminoácidos de comprimento, em que o aminoácido da glicoquinase que corresponde à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da dita glicoquinase) não é um ácido glutâmico, em particular, não é um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina.
7. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizada pelo fato de que: a) o aminoácido na posição 144 da glicoquinase não é uma glicina, em particular, não é um aminoácido alifático, em particular, é uma serina; b) a sequência de proteínas da dita glicoquinase é uma sequência como definida na SEQ ID Nº:46, em que o aminoácido na posição 144 não é uma glicina, em particular, não é um aminoácido alifático, em particular, é uma serina; ou c) a sequência de proteínas da dita glicoquinase é uma sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº: 46, em que o aminoácido da dita glicoquinase que corresponde à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da dita glicoquinase) não é uma glicina, em particular, não é um aminoácido alifático, em particular, é uma serina.
8. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizada pelo fato de que porta adicionalmente uma mutação no gene ccpA.
9. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que porta uma mutação em pelo menos um,
em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose e que porta uma mutação no gene ccpA.
10. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que o gene ccpA porta uma mutação selecionada dentre o grupo que consiste em uma mutação sem sentido localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 270 da sequência de codificação do gene ccpA e uma mutação, localizada no primeiro quarto da sequência de codificação do gene ccpA, levando a uma mudança na fase de leitura do quadro de leitura aberto do gene ccpA.
11. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a sequência do dito gene ccpA com mutação é selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência como definida na SEQ ID Nº:71; e b) uma sequência variante de ccpA que tem pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID Nº:71.
12. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um, em particular um, gene que codifica uma proteína do PTS específico para manose-glicose é selecionado dentre o grupo que consiste no gene manL, no gene manM e no gene manN.
13. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o gene com mutação que codifica uma proteína do PTS específico para manose- glicose codifica uma proteína, cuja atividade de importação de glicose é diminuída ou abolida, em particular, uma proteína selecionada dentre o grupo que consiste em:
a) uma proteína IIABMan de Streptococcus thermophilus truncada na posição 305 (IIABMan305); b) uma proteína IICMan de Streptococcus thermophilus truncada na posição 208 (IICMan208); e c) uma proteína IIDMan de Streptococcus thermophilus truncada na posição 28 (IIDMan28).
14. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a sequência de proteínas da dita proteína IIABMan305 é selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência como definida na SEQ ID Nº:112; e b) uma sequência variante de IIAB que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:112, em particular, tendo 305 aminoácidos de comprimento; em que a sequência de proteínas da dita IICMan208 é selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência como definida na SEQ ID Nº:158; e b) uma sequência variante de IICMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:158, em particular, tendo 208 aminoácidos de comprimento; em que a sequência de proteínas da dita proteína IIDMan28 é selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência como definida na SEQ ID Nº:207; e b) uma sequência variante de IIDMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:207, em particular, tendo 28 aminoácidos de comprimento.
15. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que, quando a dita cepa é usada para fermentar leite como avaliado pelo teste B durante 24 horas à temperatura de fermentação: a) a concentração de lactose restante no leite fermentado é menor do que 60 mM; e/ou b) o pH do leite diminui a um pH no qual a velocidade de acidificação se torna definitivamente menor do que 0,1 mUpH/min (pHPARADA), em que o dito pHPARADA está compreendido entre 4,6 e 5,3, e, opcionalmente, o coeficiente angular entre pH6 e pH5,5 é de pelo menos -0,008 UpH/min.
16. Composição caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma, em particular uma, cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em particular, em combinação com outras bactérias formadoras de ácido láctico, em particular, com uma ou mais cepas selecionadas dentre o grupo que consiste em uma cepa do gênero Lactobacillus, tal como uma cepa de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus, uma cepa do gênero Lactococcus, tal como uma cepa de Lactococcus lactis ou uma cepa do gênero Bifidobacterium.
17. Método para fabricar um produto lácteo fermentado, em particular, um leite fermentado, caracterizado pelo fato de que compreende inocular um substrato de leite com a cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou uma composição, como definida na reivindicação 16, e fermentar o dito leite inoculado, para obter um produto lácteo fermentado.
18. Uso da cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou composição, como definida na reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que se destina a fabricar um produto lácteo fermentado.
19. Produto lácteo fermentado caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma, em particular uma, cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou como obtido por um método, como definido na reivindicação 17.
20. Polinucleotídeo de ccpA de Streptococcus thermophilus caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre o grupo que consiste em: a) um polinucleotídeo de ccpA que, quando inserido em vez do gene ccpA da cepa DGCC7710, leva a um derivado de DGCC7710 que exibe uma razão entre a atividade de beta- galactosidase como avaliado pelo teste D e a atividade de glicoquinase como avaliado pelo teste E de pelo menos 4,10-6; b) um polinucleotídeo de ccpA que, quando inserido em vez do gene ccpA de uma cepa DGCC7710 no qual o gene manL foi anteriormente substituído por um gene manL como definido na SEQ ID Nº:111 (isto é, da cepa DGCC7710-IIABMan305) leva a um derivado de DGCC7710-IIABMan305 que, quando usado para fermentar leite como avaliado pelo teste B, exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2, maior do que 2,5 ou maior do que 3; c) um polinucleotídeo de ccpA que, quando inserido em vez do gene ccpA de uma cepa DGCC7710 no qual o gene manM foi anteriormente substituído por um gene manM como definido na SEQ ID Nº:157 (isto é, da cepa DGCC7710-IICMan208) leva a um derivado de DGCC7710-IICMan208 que, quando usado para fermentar leite como avaliado pelo teste B, exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2, maior do que 2,5 ou maior do que 3; e d) um polinucleotídeo de ccpA que, quando inserido em vez do gene ccpA de uma cepa DGCC7710 no qual o gene manN foi anteriormente substituído por um gene manN como definido na SEQ ID Nº:206 (isto é, da cepa DGCC7710-IIDMan28) leva a um derivado de DGCC7710-IIDMan28 que, quando usado para fermentar leite como avaliado pelo teste B, exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2, maior do que 2,5 ou maior do que 3.
21. Polinucleotídeo de ccpA de Streptococcus thermophilus, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que porta uma mutação selecionada dentre o grupo que consiste em uma mutação sem sentido localizada entre o nucleotídeo 1 e o nucleotídeo 270 da sequência de codificação do gene ccpA e uma mutação, localizada no primeiro quarto da sequência de codificação do gene ccpA, levando a uma mudança na fase de leitura do quadro de leitura aberto do gene ccpA, em particular, um polinucleotídeo, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste em a) uma sequência como definida na SEQ ID Nº:71; e b) uma sequência variante de ccpA que tem pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID Nº:71.
22. Uso de um gene manL, gene manM e/ou gene manN de Streptococcus thermophilus com mutação que codificam, respectivamente, uma proteína IIABMan, uma proteína IICMan e uma proteína IIDMan, caracterizado pelo fato de que a atividade de importação de glicose da dita proteína é diminuída ou abolida, para substituir, respectivamente, o gene manL, gene manM e/ou gene manN correspondentes de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose que porta um gene glcK com mutação, ou um gente ccpA com mutação, ou tanto um gene glcK com mutação quanto um gene ccpA com mutação.
23. Uso de um gene manL, gene manM e/ou gene manN de Streptococcus thermophilus com mutação que codificam, respectiva- mente, uma proteína IIABMan, uma proteína IICMan ou uma proteína IIDMan, caracterizado pelo fato de que a atividade de importação de glicose da dita proteína é diminuída ou abolida, para substituir, respecti- vamente, o gene manL, gene manM e/ou gene manN correspondentes de uma cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose selecionada dentre o grupo que consiste em uma cepa que porta um gene glcK com mutação, uma cepa que porta um gene ccpA cuja sequência é como definido na reivindicação 20 ou 21 e uma cepa que porta um gene ccpA gene cuja sequência é como definido na reivindicação 20 ou 21 e um gene glcK com mutação, em que a sequência do dito gene glcK com mutação codifica uma glicoqui- nase de Streptococcus thermophilus, cuja atividade de glicoquinase é significativamente reduzida, mas não nula, em uma cepa DGCC7710 na qual seu gene glcK foi substituído pelo dito gene glcK com mutação (para gerar um derivado de DGCC7710), como definido por: a) a atividade de glicoquinase da dita glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 estar entre 300 e 1200 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A, em particular, entre 400 e 1000 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste A, ou b) a atividade de glicoquinase da dita glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 estar entre 10 e 50% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando são ambas avaliadas pelo teste A, em particular, entre 15 e 40% da atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710, em que a atividade de glicoquinase no dito derivado de DGCC7710 e a atividade de glicoquinase da cepa DGCC7710 são avaliadas pelo teste A.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, em que o dito gene glcK com mutação é adicionalmente caracterizado pelo fato de que codifica uma glicoquinase que tem uma velocidade direta máxima (Vmáx) "significativamente reduzida, mas não nula" em uma cepa DGCC7710 na qual seu gene glcK foi substituído pelo dito gene glcK com mutação (para gerar um derivado de DGCC7710), como definido por um ou dois destes parâmetros: a) a Vmáx da dita glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 estar entre 300 e 1200 U/g de extrato de proteína total, como avaliado pelo teste C, em particular, está entre 400 e 1000 U/g de extrato de proteína total; - Vmáx da dita glicoquinase de Streptococcus thermophilus em um derivado de DGCC7710 que está entre 10 e 50% da Vmáx da glicoquinase da cepa DGCC7710 depositada no DSMZ sob o número de acesso DSM28255 em 14 de janeiro de 2014, quando ambas são avaliadas pelo teste C, em particular, está entre 15 e 40% da Vmáx da glicoquinase da DGCC7710.
25. Uso, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que o dito gene glcK com mutação codifica uma glicoquinase selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma glicoquinase que tem um aminoácido na posição 275 que não é um ácido glutâmico, em particular, que não é um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina, b) uma glicoquinase que tem um aminoácido na posição 275 que não é um ácido glutâmico, em particular, que não é um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina, e que tem uma arginina na posição 278 e/ou uma serina na posição 279; e c) uma glicoquinase que tem um aminoácido em sua posição 144 que não é uma glicina, em particular, que não é um aminoácido alifático, em particular, é uma serina,
26. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que o dito gene glcK com mutação codifica uma glicoquinase, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência como definida na SEQ ID Nº:25, em que o aminoácido na posição 275 não é um ácido glutâmico, em particular, não é um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina; e b) uma sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº: 25, em que o aminoácido da dita glicoquinase que corresponde à posição 275 da SEQ ID Nº:25 (ou o aminoácido na posição 275 da dita glicoquinase) não é um ácido glutâmico, em particular, não é um aminoácido ácido, em particular, é uma lisina. c) uma sequência como definida na SEQ ID Nº:46, em que o aminoácido na posição 144 não é uma glicina, em particular, não é um aminoácido alifático, em particular, é uma serina; e d) uma sequência variante de GlcK que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº: 46, em que o aminoácido da dita glicoquinase que corresponde à posição 144 da SEQ ID Nº:46 (ou o aminoácido na posição 144 da dita glicoquinase) não é uma glicina, em particular, não é um aminoácido alifático, em particular, é uma serina.
27. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, em que o dito gene manL, gene manM ou gene manN de Streptococcus thermophilus com mutação gene é caracterizado pelo fato de que: a) quando individualmente inserido em vez do gene manL, gene manM ou gene manN da cepa DSM32587: - o derivado de DSM32587 que, quando usado para fermentar leite como avaliado pelo teste B, exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2, maior do que 2,5 ou maior do que 3; ou b) quando individualmente inserido em vez do gene manL, gene manM ou gene manN de uma cepa DGCC7710 na qual o gene ccpA foi anteriormente substituído pelo gene ccpA como definido na SEQ ID Nº:71 (isto é, da cepa DGCC7710-ccpAΔ1A114-120): - o derivado de DGCC7710-ccpAΔ1A114-120 que, quando usado para fermentar leite como avaliado pelo teste B, exibe uma razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado que é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2, maior do que 2,5 ou maior do que 3.
28. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 27, caracterizado pelo fato de que o dito gene (ou genes) man de Streptococcus thermophilus com mutação é selecionado dentre o grupo que consiste em: a) um gene manM de Streptococcus thermophilus com mutação que codifica uma proteína IIABMan de Streptococcus thermophilus truncada na posição 305 (IIABMan305), em particular uma proteína IIABMan305 truncada, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste em a) uma sequência como definida na SEQ ID Nº:112 e b) uma sequência variante de IIABMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:112, em particular, tendo 305 aminoácidos de comprimento. b) um gene manM de Streptococcus thermophilus com mutação que codifica uma proteína IICMan de Streptococcus thermophilus truncada na posição 208 (IICMan208), em particular uma proteína IICMan truncada, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste em a) uma sequência como definida na SEQ ID Nº:158 e b) uma sequência variante de IICMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:158, em particular, tendo 208 aminoácidos de comprimento. c) um gene manN de Streptococcus thermophilus com mutação que codifica uma proteína IIDMan de Streptococcus thermophilus truncada na posição 28 (IIDMan28), em particular uma proteína IIDMan truncada, cuja sequência é selecionada dentre o grupo que consiste em a) uma sequência como definida na SEQ ID Nº:207 e b) uma sequência variante de IIDMan que tem pelo menos 90% de similaridade ou identidade com a SEQ ID Nº:207, em particular, tendo 28 aminoácidos de comprimento.
29. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizado pelo fato de que a sequência do dito gene manL, gene manM ou gene manN de Streptococcus thermophilus é como definido, respectivamente, na SEQ ID Nº:111, SEQ ID Nº:157 e SEQ ID Nº:206.
30. Cepa de Streptococcus thermophilus positiva para lactose e negativa para galactose caracterizada pelo fato de que é selecionada dentre o grupo que consiste em: - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 (depositada no DSMZ em 15 de agosto de 2017) na qual a sequência de codificação do gene manL é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:111 (que codifica IIABMan305); - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência de codificação do gene manM é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:157 (que codifica IICMan208); - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência de codificação do gene manN é substituída pela sequência como apresentada na SEQ ID Nº:206 (que codifica IIDMan28); - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência de codificação do gene ccpA é substituída pela sequência como definida na SEQ ID Nº:71 (ccpAΔ1A114-120), e a sequência de codificação do gene manL é substituída pela sequência como definida na SEQ ID Nº:111 (que codifica IIABMan305); - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência de codificação do gene ccpA é substituída pela sequência como definida na SEQ ID Nº:71 (ccpAΔ1A114-120), e a sequência de codificação do gene manM é substituída pela sequência como definida na SEQ ID Nº:157 (que codifica IICMan208); - uma cepa que corresponde à cepa DSM32587 na qual a sequência de codificação do ccpA; - uma cepa que corresponde à cepa DSM28255 na qual a sequência de codificação do gene ccpA é substituída pela sequência como definida na SEQ ID Nº:71 (ccpAΔ1A114-120), e a sequência de codificação do gene manL é substituída pela sequência como definida na SEQ ID Nº:111 (que codifica IIABMan305); - uma cepa que corresponde à cepa DSM28255 na qual a sequência de codificação do gene ccpA é substituída pela sequência como definida na SEQ ID Nº:71 (ccpAΔ1A114-120), e a sequência de codificação do gene manM é substituída pela sequência como definida na SEQ ID Nº:157 (que codifica IICMan208); e - variantes das mesmas que, quando usadas para fermentar leite como avaliado pelo teste B, a razão entre a quantidade de galactose liberada (mM) e a quantidade de lactose restante (mM) no dito leite fermentado é maior do que 1,2, maior do que 1,5, maior do que 2, maior do que 2,5 ou maior do que 3.
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