JP2022511951A

JP2022511951A - Ｐｅｇ化された成長ホルモンアンタゴニスト

Info

Publication number: JP2022511951A
Application number: JP2021533244A
Authority: JP
Inventors: ブロディ、リチャード、エス．
Original assignee: モレキュラーテクノロジーズラボラトリーズエルエルシー
Priority date: 2018-12-11
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2022-02-01
Also published as: WO2020123450A1; EP3893919A1; CA3121241A1; EP3893919A4

Abstract

【要約】【解決手段】ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストである組成物であって、前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋの１つまたは２つのアミノ酸がシステインに変異したヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋと、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋ変異体の各置換システインに共役したポリエチレングリコール分子とを含む、組成物。【選択図】なし

Description

コンピュータ可読形式（ＣＲＦ）の配列表が保存される。配列表は、２０１８年１２月１０日に作成されたＳＥＱＩＤＮＯＳ＿１＿２４＿ＳＴ２５．ｔｘｔというタイトルのＡＳＣＩＩテキスト（．ｔｘｔ）ファイルであり、サイズは３３ＫＢである。配列表は、本明細書に完全に記載されるように参照により組み込まれる。

当該発明は、一般的には、受容体アンタゴニストとして使用するための組成物に関し、より具体的には、非常に効果的な治療薬となる可能性を有する新規のヒト成長ホルモンアンタゴニストに関するものである。

ヒト成長ホルモンは、ソマトトロピン（ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｉｎ）またはソマトロピン（ｓｏｍａｔｒｏｐｉｎ）としても知られており、ヒトおよび他の動物の成長、細胞の再製、および再生を刺激するペプチドホルモンである。成長ホルモンは、ある種の細胞にのみ特異的に作用するマイトジェンの一種であり、１９１アミノ酸の一本鎖ポリペプチドであり、下垂体前葉の側翼内のソマトトロピック細胞によって合成、貯蔵、分泌される。先端巨大症は、思春期に骨端板が閉じた後、下垂体前葉が成長ホルモン（ｈＧＨ）を過剰に分泌することで生じる症候群である。骨端板が閉じる前にｈＧＨが過剰に産生されると、結果として巨人症ｇｉｇａｎｔｉｓｍ（または巨人症ｇｉａｎｔｉｓｍ）となる。多くの疾患が下垂体のｈＧＨ産生量を増加させる可能性があるが、最も一般的なのは、異なるタイプの細胞（ソマトトロピン産生細胞ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈｓ）に由来する下垂体腺腫と呼ばれる腫瘍である。先端巨大症は、最も一般的には中年期の成人に発症し、未治療の場合、重度の外見障害、合併症、早死にを引き起こす可能性がある。この病気は、その病態と進行の遅さから、初期の段階では診断が難しく、外見上の変化、特に顔の変化が顕著になるまで、何年も見過ごされることが多い。

受容体とは、通常、細胞の細胞膜表面に埋め込まれるタンパク質分子で、細胞外からの化学シグナルを受け取る。このような化学信号が受容体に結合すると、例えば、細胞の電気的な活動が変化するなど、何らかの形で細胞や組織に反応が起こる。この意味で、受容体とは、内因性の化学信号を認識し、それに応答するタンパク質分子である。ヒト成長ホルモンのようなアゴニストは、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的反応を引き起こす化学組成物である。アゴニストが作用をもたらすのに対し、アンタゴニストはアゴニストの作用を阻害し、インバースアゴニストはアゴニストとは逆の作用をもたらす。受容体アンタゴニストは、受容体に結合したときに、それ自体が生物学的反応を引き起こすのではなく、アゴニストが媒介する反応をブロックしたり、弱めたりするタイプの受容体リガンドや薬剤である。これらの組成物はブロッカーと呼ばれることもあり、例としてはαブロッカー、βブロッカー、カルシウムチャネルブロッカーなどがある。薬理学的には、アンタゴニストは同種の受容体に対して親和性はあるが有効性はなく、結合することで相互作用が阻害され、受容体におけるアゴニストまたはインバースアゴニストの機能が阻害される。アンタゴニストは、受容体の活性部位（オルトステリック）や他の部位（アロステリック）に結合することでその効果を媒介する。また、受容体の活性の生物学的調節に通常は関与していない特異な結合部位で相互作用することもある。アンタゴニストの活性は、アンタゴニスト－受容体複合体の寿命に応じて可逆的にも不可逆的にも変化し、それはアンタゴニスト－受容体結合の性質にも依存する。アンタゴニストの大部分は、受容体上の構造的に定義された結合部位において、内因性リガンドまたは基質と競合することでその効力を発揮する。定義上、アンタゴニストは、結合した受容体を活性化する効力を示さず、アンタゴニストは受容体を活性化する能力を維持しない。しかし、いったん結合すると、アンタゴニストは、アゴニスト、インバースアゴニスト、パーシャルアゴニストの機能を阻害する。

ペグビソマント（ｐｅｇｖｉｓｏｍａｎｔ）（ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）で販売）のような成長ホルモン受容体アンタゴニストは、先端巨大症の治療に使用される。このような組成物は、先端巨大症の原因となる下垂体の腫瘍を手術や放射線で制御できず、ソマトスタチンアナログの使用がうまくいかない場合に使用される。ペグビソマントは、通常、水と混合して皮下に注射する粉末として送達される。

ＰＥＧ化とは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖を、薬物、ペプチド、抗体フラグメント、または治療用タンパク質などの分子やマクロ構造に共有結合および非共有結合の両方で結合させるプロセスである。ＰＥＧ化は、通常、ＰＥＧの反応性誘導体を標的分子とインキュベートすることで達成され、分子サイズや分子電荷の変化など、物理化学的特性の変化をもたらす。これらの物理的・化学的な変化は、治療薬の全身的な保持力を高め、細胞受容体への治療部分の結合親和性に影響を与え、吸収と分布のパターンを変えることができる。ＰＥＧを薬剤や治療用タンパク質に共有結合させることで、薬剤を宿主の免疫系から「マスクする（ｍａｓｋ）」ことができ（すなわち、免疫原性や抗原性を低下させることができる）、薬剤の流体力学的サイズ（すなわち、溶液中のサイズ）を大きくすることで、腎クリアランスを低下させて循環時間を長くすることができる。また、ＰＥＧ化は、疎水性の薬物やタンパク質に水溶性を与えることができる。

ＰＥＧ化は、分子量を増加させることにより、未修飾の分子と比較して、以下のようないくつかの重要な薬理学的利点を付与することができる。例えば、（ｉ）薬物の溶解性の向上、（ｉｉ）有効性を低下させることなく、また潜在的に毒性を低下させて、投与回数を減らす、（ｉｉｉ）循環寿命の延長、（ｉｖ）薬物の安定性の向上、および（ｖ）タンパク質分解からの保護の強化である。また、ＰＥＧ化された薬剤には、以下のような商業的な利点：（ｉ）新しいデリバリーフォーマットや投与レジメンの機会、および（ｉｉ）既に承認された薬剤の特許期間の延長である。ＰＥＧは共役のため特に魅力的なポリマーであり、医薬用途に関連するＰＥＧ部位の特定の特性には以下：（ｉ）水溶性、（ｉｉ）溶液中での高い移動性、（ｉｉｉ）毒性がなく、免疫原性が低い、および（ｖ）体内での分布変化、を含む。

高分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をタンパク質に添加すると、腎臓による排泄のサイズ依存的な減少により、これらのタンパク質のインビボでの半減期が長くなることがこれまでに示されてきた。また、ＰＥＧの添加は、タンパク質の免疫原性を低下させ、凝集やプロテアーゼによる切断を減少させる（ＰａｓｕｔａｎｄＶｒｏｎｅｓｅ，２０１２；およびＰａｒｖｅｅｎａｎｄＳａｈｏｏ，２００６）。ホルモン、サイトカイン、抗体フラグメント、および酵素を含む複数の既知のＰＥＧ化タンパク質が治療用としてＵＳＦＤＡに承認される（Ｐａｓｕｔ，ａｎｄＶｅｒｏｎｅｓｅ，２０１２；Ａｌｃｏｎｃｅｌｅｔａｌ，２０１１；ａｎｄＫｌｉｎｇ，２０１３）。したがって、特にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）受容体アンタゴニストまたは他の受容体アンタゴニストの使用に反応する疾患の治療に使用するための、ＰＥＧ化された治療薬のさらなる開発が現在必要とされる。

以下は、本発明の特定の例示的な実施形態の概要を提供するものである。この要約は、広範な概要ではなく、本発明の重要または重要な側面または要素を特定すること、またはその範囲を画定することを意図していない。しかし、本発明の説明および請求に使用される言語での不定冠詞の使用は、記載されたシステムを制限することを何ら意図していないことを理解されたい。むしろ、「ａ」または「ａｎ」の使用は、「少なくとも１つ」または「１またはそれ以上」を意味するように解釈されるべきである。当業者であれば理解できるように、本明細書で使用される一文字のアミノ酸略語は、ＩＵＰＡＣ形式に従う。

本発明の一態様によれば、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストとして機能する第１の組成物または化合物が提供される。このヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋを含み、前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋの１つのアミノ酸がシステインに変異するか、またはヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋの２つのアミノ酸がシステインに変異するものであり、システインに変異した前記１つのアミノ酸が、Ｎ９９、Ｔ１４２、およびＨ１５１からなる群から選択され、システインに変異した前記２つのアミノ酸が、Ｎ９９／Ｔ１４２、Ｎ９９／Ｈ１５１、およびＴ１４２／Ｈ１５１からなる群から選択される、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋと、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋ変異体の各置換されたシステインに共役されたポリエチレングリコール分子と、を含む。

本発明の別の態様によれば、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストとして機能する第２の組成物または化合物が提供される。このヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋであって、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋの１つのアミノ酸がシステインに変異するか、またはヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋの２つのアミノ酸がシステインに変異するものであり、システインに変異した前記１つのアミノ酸が、Ｎ９９、Ｔ１４２、およびＨ１５１からなる群から選択され、システインに変異した前記２つのアミノ酸が、Ｎ９９／Ｔ１４２、Ｎ９９／Ｈ１５１、およびＴ１４２／Ｈ１５１からなる群から選択される、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋと、およびヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋ変異体の各置換されたシステインに共役されたポリエチレングリコール分子であって、システインに変異した前記１つのアミノ酸に共役された前記ポリエチレングリコール分子が、多分散した４０ｋＤａの分岐ポリエチレングリコール分子であり、システインに変異した前記２つのアミノ酸に共役された前記ポリエチレングリコール分子が、３つのカルボン酸アニオンをそれぞれ含む２つの４０ｋＤａ分岐ポリエチレングリコール分子または２つの４．５ｋＤａの分岐ポリエチレングリコールである、ポリエチレングリコール分子と、を含む。

この発明のさらに別の態様では、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストとして機能する第３の組成物または化合物が提供される。このヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストは、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋであって、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋの２つのアミノ酸がシステインに変異し、システインに変異した前記２つのアミノ酸がＮ９９／Ｔ１４２、Ｎ９９／Ｈ１５１、およびＴ１４２／Ｈ１５１からなる群から選択される、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋと、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋ変異体の各置換されたシステインに共役したポリエチレングリコール分子と、を含む。

本発明の追加の特徴および側面は、例示的な実施形態の以下の詳細な説明を読んで理解すると、当業者には明らかになるだろう。当業者には理解されるように、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本発明のさらなる実施形態が可能である。

本発明の例示的な実施形態を以下に説明する。以下の詳細な説明は、説明のために多くの具体的な内容を含むが、当業者であれば、以下の詳細に対する多くの変形および変更が本発明の範囲内であることを理解するだろう。したがって、以下の本発明の実施形態は、請求項の発明に対する一般性を損なうことなく、また、制限を課すことなく記載される。

本発明は、主に治療薬として使用するための新規なヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）アンタゴニストを提供するものである。本発明のｈＧＨアンタゴニストは、典型的には、既知のｈＧＨアンタゴニストであるｈＧＨＧ１２０Ｋの１またはそれ以上の選択されたアミノ酸をシステインに変異させ、次いでそのシステインを化学的に活性化されたポリエチレングリコール分子に共役させることによって作られる。置換されたシステインの位置は、ポリエチレングリコールとの共役後に受容体結合活性の損失が最小限になるように選択される。本発明のポリエチレングリコール修飾剤の種類と数は、インビボでの半減期が長いアンタゴニストを製造するために選択される。

本発明に従ったＰＥＧ化タンパク質の調製における２つの重要な変数があり、（ｉ）ＰＥＧ付着に使用されるアミノ酸位置；および（ｉｉ）共役されたＰＥＧのサイズおよびタイプである。同様の組成物を用いた初期の研究は、タンパク質の表面にある複数のリジンに比較的小さなＰＥＧ（例えば、約５ｋＤａ）をランダムに付着させる方法を用いて行われた。この方法では、タンパク質のインビボの半減期を長くすることに成功したが、タンパク質の受容体に対する親和性が大きく低下した。最近の実験では、タンパク質の特定のアミノ酸部位にＰＥＧ分子を付加する方法が用いられる。サイト特異的なＰＥＧ化に用いられる一般的な方法は２つあり、（ｉ）低ｐＨ還元的アミノ化によりタンパク質のＮ－末端アミンにＰＥＧを付加する方法、（ｉｉ）タンパク質にもともと存在する、あるいは特定の位置に設計されたシステインのチオール基にＰＥＧを付加する方法である。他にも、非天然アミノ酸へのＰＥＧ付加、インテイン融合タンパク質を用いたタンパク質Ｃ末端へのＰＥＧ付加、トランスアミナーゼ触媒を用いたアクセス可能なグルタミンへのＰＥＧ付加などがある（ＰａｓｕｔａｎｄＶｅｒｏｎｅｓｅ，２０１２）。

本発明では、２またはそれ以上の異なるタイプのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子が利用される。第１の種類のＰＥＧは、重合によって調製され、平均分子量の周りに分子量製品の分布があるという点で、本質的に多分散である。ポリエチレングリコールの第２のクラスは、離散型ＰＥＧ（ｄＰＥＧ（登録商標）；ＱｕａｎｔａＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）である。このようなｄＰＥＧ（登録商標）は、各ｄＰＥＧ（登録商標）種が特定の構造と分子量を持つ純粋な単一化合物となるように、段階的に有機化学的に調製された単一のＰＥＧ分子である（Ｐｏｖｏｓｋｙｅｔａｌ．，２０１３）。さまざまな種類のＰＥＧは、直鎖と分岐の両方の構造で製造される。大きな多分散型ＰＥＧの場合、分岐型ＰＥＧをタンパク質に添加すると、同じ分子量の直鎖型ＰＥＧを添加するよりも結合親和性の低下が少なく、半減期の増加が大きくなることがある（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．２０１２）。分岐したｄＰＥＧ（登録商標）はタンパク質の半減期を長くすることが示されており、負に帯電したｄＰＥＧ（登録商標）は特に効果的であることが示されている（Ｄｉｎｇｅｔａｌ．，２０１３）。

ＰＥＧ化された成長ホルモンアンタゴニスト
ｈＧＨの成長アゴニストから成長アンタゴニストへの変換には、ｈＧＨの１２０番目の位置で、ネイティブなグリシンからアラニンを除く任意のアミノ酸への単一のアミノ酸の変化だけが必要である（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，１９９４）。しかし、この分子は、インビボでの半減期が短いため、成長過剰の状態（先端巨大症など）の治療薬としては使用できない。そこで、研究者らは、ｈＧＨアンタゴニストであるｈＧＨＧ１２０Ｋにポリエチレングリコール分子を加え、腎臓からのクリアランスを減少させることで、この問題に対処してきた。ＦＤＡが承認した先端巨大症の治療薬であるＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）は、それぞれ５０００ダルトンの分子量を持つ４～６個の直鎖のＰＥＧ分子を含む。表面のリジンにランダムに結合するＰＥＧが加わることで（ｖａｎｄｅｒＬｅｌｙａｎｄＫｏｐｃｈｉｃｋ，２００６）、アンタゴニストのインビボでの半減期が１時間未満から約７２時間に延びる（Ｆｉｎｎ，２００９）。しかし、ＰＥＧ化されたアンタゴニストの膜結合型受容体への親和性は、未ＰＥＧ化分子に比べて約３０倍に低下する（Ｒｏｓｓｅｔａｌ．，２００１）。受容体親和性の低下にもかかわらず、ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）は先端巨大症の有効な治療法であるが、通常、１日５～３０ｍｇという大量の用量が処方される。

タンパク質上のランダムなリジンに複数の低分子量ＰＥＧ（約５ｋＤａ）を付加した後に起こる受容体結合の喪失は、初期のタンパク質－ＰＥＧ共役に共通して見られた（ＰａｒｖｅｅｎａｎｄＳａｈｏｏ，２００６）。しかし、最近では、標的タンパク質の特定のアミノ酸位置に高分子量のＰＥＧを１つだけ付加することで、より高い受容体結合活性をもつ共役が作られるようになった（ＰａｓｕｔａｎｄＶｅｒｏｎｅｓｅ，２０１２）。成長ホルモンアンタゴニストの場合、２０ｋＤａまたは４０ｋＤａの直鎖ＰＥＧを、低ｐＨでの還元的アルキル化を用いて、ＳＯＭＡＶＥＲＴ（登録商標）（Ｂ２０３６）の未ＰＥＧ化前駆体のＮ末端に付加した（Ｗｕｅｔａｌ．，２０１３）。２０ｋＤａのＰＥＧと４０ｋＤａのＰＥＧの添加により、可溶性ｈＧＨ受容体に対するアンタゴニストの親和性は、それぞれ約５０％および約９５％低下した。ラットにおけるインスリン成長因子－１（ＩＧＦ－１）の産生を阻害するこれらの分子の能力を試験した。４０ｋＤａのＰＥＧ共役は不活性であったが、２０ｋＤａ共役はＩＧＦ－１の産生を３０～４０％減少させた。

ＰＥＧ化された成長ホルモン
成長ホルモンアンタゴニストの活性および半減期に対する異なるＰＥＧ化戦略の予測される効果に関する洞察は、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のＰＥＧ化からの結果を分析することによって得ることができる（Ｆｉｎｎ，２００９）。Ｃｏｘおよび同僚研究者（２００７）は、ヒト成長ホルモンの３位のスレオニンをシステインに変異させ（Ｔ３ＣｈＧＨ）、そのシステインを２０ｋＤａの直鎖ＰＥＧに共役させた。増殖アッセイで測定したｈＧＨの活性は約４倍に低下し、半減期は約８倍に増加した。同様の半減期の増加は、Ｇｌｎ１４１への２０ｋＤａのＰＥＧの酵素触媒による付加や、Ｎ末端への２０ｋＤａのＰＥＧの化学的付加の後にも生じた（Ｆｒｅｉｔａｓｅｔａｌ．，２０１３）。化学的に活性のある非ネイティブなアミノ酸に変異させた異なるアミノ酸位置に３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧを付加したところ、最適なケースでは、増殖活性が約１０倍失われ、半減期が約１０倍増加した（Ｃｈｏｅｔａｌ．，２０１１）。１４１位に直鎖の４３ｋＤａＰＥＧ（Ｇｌｎをシステインに変異）を加えると半減期が～３０倍になり、ｈＧＨのＮ末端に分岐状の４０ｋＤａＰＥＧを加えると半減期が約２０倍になることが報告される（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎｅｔａｌ．，２０１０）。

ＰＥＧ化されたサイトカイン
ｈＧＨと同程度の分子量を持つサイトカインへのＰＥＧの部位特異的な付加は、単一のＰＥＧが半減期の著しい増加を引き起こすことを示す。Ｒｏｓｅｎｄａｈｌｅｔａｌ．（２００５）は、インターフェロンα－２の５位をシステインに変異させた後に、１０ｋＤａのＰＥＧ、２０ｋＤａのＰＥＧ、４０ｋＤａのＰＥＧを加えると、インビトロでの生物活性が２～３倍に低下することを報告している。一方、１０ｋＤａ、２０ｋＤａのＰＥＧ、４０ｋＤａのＰＥＧでは、半減期がそれぞれ１４倍、２３倍、４０倍に増加した。同様の結果は、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子に異なる分子量のＰＥＧを添加した場合にも見られた（Ｄｏｈｅｒｔｙｅｔａｌ．，２００５）。Ｂｅｌｌｅｔａｌ．（２００８）は、インターフェロンαの１１１位（Ｍ１１１Ｃ）に２０ｋＤａまたは４０ｋＤａのＰＥＧを添加すると、受容体結合活性が３倍に減少することを見出した。また、２０ｋＤａと４０ｋＤａの置換インターフェロンの半減期は、それぞれ２５倍と３９倍に増加した。一方、インターフェロンβ－１ｂに４０ｋＤａのＰＥＧを部位特異的に付加しても、半減期は約３倍にしかならなかった（Ｌｅｅｅｔａｌ．，２０１３）。

Ｑｉｕｅｔａｌ．（２０１３）は、ヒト甲状腺刺激ホルモンの２２位を直鎖の４０ｋＤａＰＥＧ、２分岐した４０ｋＤａＰＥＧ、３分岐した４０ｋＤａＰＥＧで置換したところ、受容体結合活性がそれぞれ５倍、１４倍、１１倍減少したことを明らかにした。これらの異なる共役の半減期の比較は報告されていない。Ｆａｍｅｔａｌ．（２０１４）は、インターフェロンγの位置１０３に１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、および４０ｋＤａのＰＥＧを加えた場合の効果を調べ、ＰＥＧはサイトカインのインビトロ活性に有意な影響を与えなかったが、すべてのケースで半減期が約３０倍になったことを明らかにする。

抗体フラグメント
体内での滞留時間を長くするために、抗体断片にＰＥＧを添加することについては、広範な研究が行われる。Ｌｅｅｅｔａｌ．（１９９９）は、一本鎖の抗体断片（ｓｃＦｖＭＡｂ；２６ｋＤａ）を、ＭＷが２～２０ｋＤａの範囲にある６種類のＰＥＧポリマーと共役した。これらの共役は、ＰＥＧ化されていない親と比較して、より長い半減期を示した。半減期の延長には、ＰＥＧの総量を増やすよりも、ＰＥＧポリマーの長さを増やす方が効果的であることがわかった。Ｌｉｅｔ．ａｌ．（２０１０）は、ジアボディ上のランダムなリジンに共役した２つの離散的な直鎖ＰＥＧユニットを加えると、未ＰＥＧ化または多分散のＰＥＧ化製品よりも血中滞留時間が長くなることを示した。Ｃｈａｐｍａｎｅｔａｌ．（２００２）は、抗体のＦａｂ'フラグメント（約５０ｋＤａ）の半減期は、部位特異的なＰＥＧのサイズと数に直接関係することを示した。

Ｌｅｅｅｔａｌ．（２０１３）は、ｓｃＦｖ－ＰＥＧ共役における直線的でランダムな共役ＰＥＧ質量（４～２０ｋＤａ）の増加が、質量にほぼ線形に半減期を効果的に増加させることを見出した。これらの研究者は、２０ｋＤａのＰＥＧ１個の方が５，０００個のＰＥＧ４個よりも効果的であることを見出し、ＰＥＧの長さはＰＥＧの質量よりも重要であると結論づけた。約５０ｋＤａのＦａｂ'抗体断片の研究では、４．４ｋＤａの分岐型離散ＰＥＧ（ｄＰＥＧ）を部位特異的に添加することで、非共役Ｆａｂ'に比べて半減期が約２倍に増加した（Ｄｉｎｇｅｔａｌ．，２０１３）。

システインに変異するｈＧＨＧ１２０Ｋのアミノ酸位置の選択
本発明の様々な実施形態において、アンタゴニストｈＧＨＧ１２０ＫのＰＥＧ化されたバージョンは、遺伝子工学によってアンタゴニスト配列に組み込まれたシステイン残基にＰＥＧを付着させることによって調製された。システインに対する変異のために選択されたアンタゴニストの位置は、ｈＧＨとｈＧＨ受容体二量体（ｈＧＨＲ_２；Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍｅｔａｌ．，１９９６）との複合体のＸ線構造を用いて選択した。ｈＧＨＲ_２に結合した時のｈＧＨの構造は、ｈＧＨのアンタゴニストであるｈＧＨＧ１２０Ｒが同じ受容体に結合した時の構造とほぼ同じである（Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍｅｔａｌ．，１９９６）。

ｈＧＨ－ｈＧＨＲ_２の結晶構造に基づき、システイン変異の対象となるアミノ酸を選択するために、２つの基準：ｉ）アミノ酸の溶媒へのアクセス性、および（ｉｉ）選択されたアミノ酸に対するシステインの置換をエネルギー的に中立なプロセスに近づける必要があることである。ｈＧＨ－ｈＧＨＲ_２の各アミノ酸の溶媒へのアクセス性は、モデリングプログラムＳｗｉｓｓＰＤＢＶｉｅｗｅｒ（ＧｕｅｘａｎｄＰｅｉｔｓｃｈ，１９９７）およびＰｏＰＭｕＳＩＣ（Ｄｅｈｏｕｃｋｅｔａｌ．，２００９；Ｄｅｈｏｕｃｋｅｔａｌ．，２０１１）の方法によって決定された。各アミノ酸位置にシステインを置換した場合のエネルギーコストは，ＰｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎＭｕｔａｎｔＳｔａｂｉｌｉｔｙＣｈａｎｇｅｓ（ＰｏＰＭｕＳＩＣ）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂａｂｙｌｏｎｅ．ｕｌｂ．ａｃ．ｂｅ／ｐｏｐｍｕｓｉｃ／）を用いて決定した。

溶媒（例えば、水）へのアクセス性と変異エネルギーを考慮して選択されたアミノ酸は、以下の表１の「すべての選択された位置」に、７つの空間的に分離したドメインで記載される。しかし、水にアクセス可能であることは、必ずしも唯一の選択基準ではない。ＰＥＧ化されたアンタゴニストが標的受容体に結合するためには、アミノ酸がはるかに大きなＰＥＧ分子にアクセス可能である必要があるのだ。ｈＧＨ－ｈＧＨＲ_２のＸ線構造を調べて、選択したアミノ酸の側鎖が溶媒の方に向いているのか、それともｈＧＨ－ｈＧＨＲ_２タンパク質複合体の方に向いているのかを確認した。側鎖が溶媒に向いているアミノ酸の位置は、ＰＥＧ置換の最も望ましい候補であり、表１の「最終選択」に以下のように記載される。また、追加の位置であるＨ１５１もシステイン変異のために選択された。この位置は、結晶構造では明らかになっていないループ３のセクションの一部である。この欠落したセグメントの一般的な位置は、ｈＧＨ－ｈＧＨＲ_２タンパク質複合体から離れたところを指す。

ｈＧＨＧ１２０Ｋ変異体への共役のためのＰＥＧの選択
本発明では、２つの異なるクラスのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子が利用される。ＰＥＧの第１のクラスは、重合によって調製され、インビボの半減期を増加させるためにタンパク質を修飾するために使用されてきた（Ｋｌｉｎｇ，２０１３）。このタイプのＰＥＧは、もともと多分散であり、平均分子量の周りに分子量製品の分布があることを意味する。ＰＥＧには、２０ｋＤａの直鎖ＰＥＧ（ＬａｙｓｏｎＢｉｏ，ＭＰＥＧ－ＭＡＬ－２０，０００）、４０ｋＤａの分岐状ＰＥＧ（ＮＯＦ，ＳｕｎｂｒｉｇｈｔＧＬ２－４００ＭＡ）、および直鎖４０ｋＤａＰＥＧ（ＮＯＦ，ＳｕｎｂｒｉｇｈｔＭＥ－４００ＭＡ）がある。これらのＰＥＧはそれぞれ、変異タンパク質の遊離のスルフヒドリル基に共役するためのマレイミド基を含む。第２のクラスのポリエチレングリコールは、「離散型」ＰＥＧ（ｄＰＥＧ（登録商標）；ＱｕａｎｔａＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）である。これらのｄＰＥＧ（登録商標）は、各ｄＰＥＧ（登録商標）種が特定の構造と分子量を持つ純粋な単一の化合物となるように、段階的に有機化学を用いて調製された純粋な単一のＰＥＧ分子である（Ｐｏｖｏｓｋｙｅｔａｌ．，２０１３）。本発明で使用されるｄＰＥＧは、典型的には、遊離チオールにカップリングするためのマレイミド基を含むものであり、以下のものが含まれる：分子量４４７３ダルトンの３分岐分子で、各分岐の末端にカルボン酸アニオンを有するもの（ＱｕａｎｔａＢｉｏＤｅｓｉｇｎ＃１０４５１、ＭＡＬ－ｄＰＥＧＡ）；分子量４２９９ダルトンの中性３分岐分子（ＱｕａｎｔａＢｉｏＤｅｓｉｇｎ＃４２２９、ＭＡＬ－ｄＰＥＧＢ）；分子量８３２４の中性９分岐分子（ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ＃１０４８４、ＭＡＬ－ｄＰＥＧＥ）；および分子量１５，５９２の中性９分岐分子（ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ＃１１４８７、ＭＡＬ－ｄＰＥＧＦ）である。３つに分岐した４４７３Ｄａの分子は、抗体フラグメントと結合しており、マウスの血液クリアランスに及ぼす影響が調べられる（Ｄｉｎｇｅｔａｌ．，２０１３）。添加されたｄＰＥＧ（登録商標）は、５０ｋＤａのタンパク質の分子量を約８％しか増加させなかったが、血液クリアランスの「曲線下面積」（ＡＵＣ）は、ＰＥＧ化されていないタンパク質のＡＵＣに比べて約２．５倍に増加した。

ｈＧＨＧ１２０Ｋ変異体の精製とＰＥＧ化
細胞の破壊
発現した変異体を含む増殖培地２５０ｍＬを遠心分離して得られた細胞ペレットを１０ｍＬのＰＢＳに懸濁し、ＥＤＴＡを含まないプロテアーゼインヒビターカクテル（ＳｉｇｍａＰ８８４９）０．０５ｍＬと混合した。この溶液を氷水で冷やし、３０秒のバーストで４分間超音波処理した。各々の超音波処理の後、サンプルを氷水混合液中で４℃以下になるまで冷却した。その後、超音波処理した懸濁液を４℃、２５，０００Ｘｇで３０分間遠心分離し、上澄み液を回収して氷上に保存した。

アフィニティ精製
超音波処理した上澄み液を０．３Ｍ塩化ナトリウムに調整し、１５０ｍＭイミダゾールのｐＨ７溶液を加えて５ｍＭイミダゾールとした。このサンプルを、ＴＡＬＯＮ（登録商標）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）固定化メタルアフィニティー樹脂（ＩＭＡＣ）５ｍＬを充填した栓付きアウトレットを有する重力流カラムに適用した。この樹脂は、上澄み液を加える前に、５ｍＭのイミダゾールと０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化された。その後、カラムの上部も栓をして、室温で３０分間、カラムを端から端まで混合した。その後、カラムを排出させ、少なくとも５ｍＬの平衡化バッファーのアリコート５本で洗浄した。洗浄は、溶出液のＡ（２８０）ｎｍが減少しなくなるまで続けた。その後、１５０ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ７の平衡化緩衝液でカラムを溶かし、ｐＨ７に調整したＥＤＴＡ二ナトリウムの１００ｍＭ溶液を加えて、生成物を含む画分を５ｍＭＥＤＴＡにした。

ＴＥＶプロテアーゼによるＨｉｓ－Ｔａｇの切断
ＩＭＡＣで精製した変異体を分子濾過で２ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、その溶液０．５ｍＬに、１５ｍＭ還元型グルタチオン＋１．５ｍＭ酸化型グルタチオンを含む溶液０．０５ｍＬを加えた。その後、０．０４ｍｇのＴＥＶプロテアーゼ（ＴｕｒｂｏＴｅｖ，Ａｃｃｅｌａｇｅｎ）のアリコートを加え、溶液を室温で２時間インキュベートした後、４℃で一晩インキュベートした。イミダゾールを含む緩衝液は、スピンカラム上で、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０および０．３Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液に交換した。

ＰＥＧ化と精製
脱塩された変異体は、溶液を０．５ｍＭのマレイミド－ＰＥＧとし、室温で２時間反応させた後、４℃で一晩インキュベートすることでＰＥＧ化された。次に、ＰＥＧ化された変異体を、スピンカラムバッファーで平衡化された１ｍＬのＴＡＬＯＮ（登録商標）樹脂を含む重力流ＩＭＡＣカラムに適用し、カラムを同じバッファーの５ＣＶで洗浄した。ＴＡＬＯＮ（登録商標）フロースルーおよび洗浄液には生成物が含まれており、これを遠心濃縮器で０．３ｍＬに濃縮し、０．０５Ｍトリスバッファー（ｐＨ８）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ＧＬカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび１０％グリセロールを含んだ。生成物のフラクションを合わせ、Ａ（２８０）ｎｍでの吸収によるタンパク質濃度の分析とＳＤＳ－ＰＡＧＥによる純度の分析を行った。シングルシステイン変異体には１つのｄＰＥＧＢが、ダブルシステイン変異体には２つのｄＰＥＧＢが付加されることが、ＭＡＬＤＩ質量分析法により確認された。

ｈＧＨ受容体に対する相対的な親和性の競合ＥＬＩＳＡアッセイ
競合ＥＬＩＳＡでは、ビオチン化したｈＧＨを調製する必要があったが、これはＢｉｏｔｉｎ－ｄＰＥＧ１２－ＮＨＳ（ＱｕａｎｔａＢｉｏＤｅｓｉｇｎ）を用いて標準的な方法（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，２００８）で調製した。マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェルプレート、ハーフエリア、ポリスチレン）に、ｐＨ９の０．０５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液中のｈＧＨ受容体（Ｒ&ＤＳｙｓｔｅｍｓ，１２１０－ＧＲ－５０；抗体Ｆｃ領域を持つキメラとしてクローン化される）の０．１２５μｇ／ｍＬ溶液を０．０５ｍＬでコーティングした。０．１２５ｍＬＰＢＳ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＷａｓｈＢｕｆｆｅｒ）で３回洗浄した後、ＰＢＳ中の２％ＢＳＡで１時間インキュベートしてプレートをブロックした。

完了ＥＬＩＳＡで使用するビオチン－ｈＧＨの濃度を決定するために、予備的なＥＬＩＳＡアッセイを行った。ｈＧＨ受容体をコーティングしてブロックしたプレートを、ＰＢＳ，０．１％ＢＳＡ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ）に溶解した異なる濃度のビオチン化ｈＧＨとともにＲＴで１時間インキュベートした。その後、プレートをＷａｓｈＢｕｆｆｅｒで３回洗浄し、ＤｉｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒに溶解した０．５ｕｇ／ｍＬのＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ，２１１３０）とともに室温で１時間インキュベートした。プレートを再び３回洗浄し、０．０５ｍＬＴＭＢ（ＫＰＬ）を加えて現像した。室温で２～２０分インキュベートした後、０．１ｍＬの１ＭＨＣｌを加えてプレートを急冷し、プレートリーダーで４５０ｎｍの波長で読み取った。

ビオチン－ｈＧＨの濃度は、アッセイ反応がビオチン－ｈＧＨ対Ａ（４５０）ｎｍのプロットの線形範囲（約１ＯＤ単位）になるように選択した。競合アッセイは、選択した濃度のビオチン－ｈＧＨと、様々な濃度のｈＧＨ、ｈＧＨＧ１２０Ｋ変異体、またはＰＥＧ化ｈＧＨＧ１２０Ｋ変異体を含む溶液を、ポリプロピレン９６ウェルプレートに調製することによって行った。９６ウェルイムノアッセイプレートをｈＨＧ受容体でコーティングし、上記のようにブロックした後、選択された濃度のビオチン－ｈＧＨおよび異なる濃度の阻害剤を含む溶液とともにＲＴで１時間インキュベートした。その後、プレートを洗浄し、上述のようにＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰおよびＴＭＢで処理した。

ｈＧＨ受容体に対する変異体の相対的な親和性を決定するために、アッセイ反応の５０％阻害を与える組換えｈＧＨの濃度（ＩＣ_５０）を標準として使用した。各アッセイプレートには、一連の濃度のｈＧＨ標準物質と試験対象の変異体が含まれており、相対的なＩＣ_５０値が決定された。２種類の多分散ＰＥＧ（ＭＥ４００ＭＡおよびＧＬ２－４００ＭＡ）をｈＧＨＧ１２０Ｋ－Ｈ１５１ＣおよびｈＧＨＧ１２０Ｋ－Ｎ９９Ｃの遊離チオールに共役した。Ｇ１２０Ｋ－Ｈ１５１Ｃ－ＭＥ４００ＭＡおよびＧ１２０Ｋ－Ｈ１５１Ｃ－ＧＬ２－４００ＭＡは、それぞれＧ１２０Ｋの２０％と５０％の阻害活性を有していた。Ｎ９９Ｃ－ＭＥ４００ＭＡおよびＮ９９Ｃ－ＧＬ２－４００ＭＡは、Ｇ１２０Ｋの阻害活性の２０％および２％であった。

ＰＥＧ化されたｈＧＨアンタゴニストｈＧＨＧ１２０Ｋ－Ｔ１４２Ｃ－ＧＬ２－４００ＭＡは、本明細書に記載された手順を用いて調製され、精製された。ＧＬ２－４００ＭＡは、ｈＧＨＧ１２０Ｋ－Ｔ１４２Ｃの挿入されたシステインと反応させたマレイミド基を含む４０ｋＤａの２分岐ＰＥＧである。血清中での半減期が長いことが予想されるこの分子（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．２０１２）は、未修飾のｈＧＨの５０％のｈＧＨ受容体結合活性を保持していた。また、本明細書に開示されている分子ｈＧＨＧ１２０Ｋ－Ｈ１５１Ｃ－ＧＬ２－４００ＭＡも、未修飾のｈＧＨのｈＧＨ受容体結合活性の５０％を保持することが示された。

本発明の異なるｄＰＥＧ（登録商標）共役変異体のｈＧＨのそれに対する結合親和性を以下の表２に示す。７つの単一変異体と３つの二重変異体を、分子量４４７３ダルトンの単一の３分岐分子ｄＰＥＧ（登録商標）（ｄＰＥＧＡ）に共役し、その分子を記載のように精製した。表２に示すように、これらの単一変異体の一部は、他の３つのｄＰＥＧにも結合した。また、表２に示すように、３つの二重システイン変異体を調製し、異なるｄＰＥＧに共役した。

１受容体結合活性は、組換え受容体をプレートに結合された競合ＥＬＩＳＡを用いて決定され、コーティングされたプレートへのビオチン－ｈＧＨの結合を５０％（Ｉ５０）阻害するのに必要な各試料の濃度が決定された。表の項目は、１００％と定義されたｈＧＨのＩ_５０に対するＩ_５０を示しており、有効数字１桁に切り上げられる。ほとんどの変異体について競合ＥＬＩＳＡを１回のみ実施したため、推定相対標準偏差は２５％となった。ＮＴと記されたエントリーは、このアッセイではテストされなかった。
２ｄＰＥＧＡは分子量４４７３ダルトンの３分岐分子で、各分岐の末端にカルボン酸アニオンを持ち、ｄＰＥＧＢは分子量４２９９ダルトンの中性３分岐分子、ｄＰＥＧＥは分子量８３２４の中性９分岐分子、およびｄＰＥＧＦは分子量１５，５９２の中性９分岐分子である。
３これらの反応は、二重ＰＥＧ化された製品には進まなかった。

ＰＥＧ化変異体のｈＧＨによるＳＴＡＴ５のリン酸化の刺激を抑制する能力についてのウエスタンブロットアッセイ
本発明のＰＥＧ化変異体が、ｈＧＨによるＳｔａｔ５Ｐｒｏｔｅｉｎリン酸化の刺激を阻害する能力を、細胞ベースのアッセイで測定した。ＩＭ９細胞をＲＰＭＩ培地で２時間インキュベートした。その後、細胞を１００万個／ｍＬの新しいＲＰＭＩ培地に再懸濁し、０～５０００ｎｇ／ｍＬの濃度でｈＧＨ、ＰＥＧ化ｈＧＨ変異体、またはｈＧＨ＋ＰＥＧ化変異体のいずれかで処理した。その後、処理した細胞を５％炭酸ガスインキュベーター内で３７℃で１５分間インキュベートした。その後、細胞をスピンダウンし、１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００とオルトバナジン酸ナトリウムを含む緩衝液で溶解し、ＳＤＳＰＡＧＥゲルにのせた。このゲルを標準的な条件で実行し、タンパク質をＰＶＤＦ膜に電気泳動で移した。膜をブロッキングした後、ウサギの抗Ｓｔａｔ５Ｐｒｏｔｅｉｎ抗体とウサギのβ抗－ａｃｔｉｎ抗体（ポジティブセルコントロール）の混合物を用いて４℃で一晩インキュベートした。その後、膜を洗浄し、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体と室温で１時間インキュベートした。最後に、ＰｉｅｒｃｅＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＷｅｓｔ化学発光基質を用いてバンドを可視化した。ＰＥＧ化された変異体の定性的な結果は、以下の表３に示される。ウェスタンブロットアッセイによって測定された、ｈＧＨによるＳＴＡＴ５のリン酸化の刺激を阻害する本発明のｈＧＨＧ１２０ＫＰＥＧ化二重変異体の相対的な能力は、以下の表４に示される。

１ウエスタンアッセイでは、ｈＧＨによるＳＴＡＴ５のリン酸化刺激を阻害するｈＧＨアンタゴニストの能力を定性的に測定する。阻害は、親アンタゴニストであるｈＧＨＧ１２０Ｋで得られた阻害に対する相対値として表される。すべてのケースにおいて、ＰＥＧ化アンタゴニストのＳＴＡＴ５のリン酸化を阻害する相対的な能力は、ｈＧＨＧ１２０Ｋのそれと比べて～２０％および～１００％の間であった。重複した実行の間の変動は、これを定量的なアッセイとするには大きすぎた。ＮＴと記されたエントリーは、このアッセイではテストされなかった。
２ｄＰＥＧＡは分子量４４７３ダルトンの３分岐分子で、各分岐の末端にカルボン酸アニオンを持ち、ｄＰＥＧＢは分子量４２９９ダルトンの中性３分岐分子、ｄＰＥＧＥは分子量８３２４の中性９分岐分子、およびｄＰＥＧＦは分子量１５，５９２の中性９分岐分子である。

１このウェスタンブロットアッセイは、ＰＥＧ化ｈＧＨアンタゴニストが、ｈＧＨによるＳＴＡＴ５のリン酸化の刺激を阻害する能力を測定するものである。阻害率は、親アンタゴニストであるｈＧＨＧ１２０Ｋで得られた阻害率に対する相対値として表される。定量化は、ウェスタンブロット上のリン酸化されたＳＴＡＴ５のバンドの強度から得られた。
２ｄＰＥＧＡは、分子量４４７３ダルトンの３分岐分子で、各分岐の末端にはカルボン酸アニオンが存在する。

上記の開示によって示されるように、本発明の組成物は、治療用途に有用な新規のヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストを提供する。参照目的のために、配列ＩＤ番号：１は、ヒト成長ホルモンＷＴｈＧＨのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号：２で、ヒト成長ホルモンＷＴｈＧＨ（成熟型）のアミノ酸配列を提供する。ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋは、本発明の組成物のための親受容体アンタゴニストであり、参照目的のために、配列ＩＤ番号：３は、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０ＫのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号：４は、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋ（成熟型）のアミノ酸配列を提供する。先に述べたように、本明細書で使用される一文字のアミノ酸略語は、ＩＵＰＡＣ形式に従う。

本発明の例示的な実施形態による第１のヒト成長ホルモンアンタゴニストは、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋを含み、前記アミノ酸Ｔ３がシステインに変異しており、ポリエチレングリコール分子がシステインの変異に共役する。配列ＩＤ番号：５は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｔ３ＣのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号：６は、配列ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｔ３Ｃのアミノ酸を提供する。

本発明の例示的な実施形態による第２のヒト成長ホルモンアンタゴニストは、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋを含み、アミノ酸Ｅ３９がシステインに変異しており、ポリエチレングリコール分子がシステイン変異に共役する。配列ＩＤ番号：７は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｅ３９ＣのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号：８は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｅ３９Ｃのアミノ酸配列を提供する。

本発明の例示的な実施形態による第３のヒト成長ホルモンアンタゴニストは、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋを含み、アミノ酸Ｐ４８がシステインに変異しており、ポリエチレングリコール分子がシステイン変異に共役する。配列ＩＤ番号：９は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｐ４８ＣのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号：１０は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｐ４８Ｃのアミノ酸配列を提供する。

本発明の例示的な実施形態による第４のヒト成長ホルモンアンタゴニストは、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋを含み、アミノ酸Ｑ６９がシステインに変異しており、ポリエチレングリコール分子がシステイン変異に共役する。配列ＩＤ番号：１１は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｑ６９ＣのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号：１２は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｑ６９Ｃのアミノ酸配列を提供する。

本発明の例示的な実施形態による第５のヒト成長ホルモンアンタゴニストは、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋを含み、アミノ酸Ｎ９９がシステインに変異しており、ポリエチレングリコール分子がシステイン変異に共役する。配列ＩＤ番号：１３は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｎ９９ＣのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号：１４は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｎ９９Ｃのアミノ酸配列を提供する。

本発明の例示的な実施形態による第６のヒト成長ホルモンアンタゴニストは、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋを含み、アミノ酸Ｔ１４２がシステインに変異しており、ポリエチレングリコール分子がシステインの変異に共役する。配列ＩＤ番号：１５は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｔ１４２ＣのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号：１６は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｔ１４２Ｃのアミノ酸配列を提供する。

本発明の例示的な実施形態による第７のヒト成長ホルモンアンタゴニストは、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋを含み、アミノ酸Ｈ１５１がシステインに変異しており、ポリエチレングリコール分子がシステイン変異に共役する。配列ＩＤ番号：１７は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｈ１５１ＣのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号：１８は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｈ１５１Ｃのアミノ酸配列を提供する。

本発明の例示的な実施形態による第８のヒト成長ホルモンアンタゴニストは、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋを含み、アミノ酸Ｎ９９およびＨ１５１がシステインに変異しており、ポリエチレングリコール分子が各システイン変異に共役する。配列ＩＤ番号：１９は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｎ９９Ｃ－ｄＰＥＧＸ－Ｈ１５１ＣのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号：２０は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｎ９９Ｃ－ｄＰＥＧＸ－Ｈ１５１Ｃのアミノ酸配列を提供する。

本発明の例示的な実施形態による第９のヒト成長ホルモンアンタゴニストは、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋを含み、アミノ酸Ｔ１４２およびＮ９９がシステインに変異しており、ポリエチレングリコール分子が各システイン変異に共役する。配列ＩＤ番号：２１は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｔ１４２Ｃ－ｄＰＥＧＸ－Ｎ９９ＣのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号：２２は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｔ１４２Ｃ－ｄＰＥＧＸ－Ｎ９９Ｃのアミノ酸配列を提供する。

本発明の例示的な実施形態による第１０のヒト成長ホルモンアンタゴニストは、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋを含み、アミノ酸Ｔ１４２およびＨ１５１がシステインに変異しており、ポリエチレングリコール分子が各システイン変異に共役する。配列ＩＤ番号：２３は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｔ１４２Ｃ－ｄＰＥＧＸ－Ｈ１５１ＣのＤＮＡ配列を提供し、配列ＩＤ番号：２４は、ヒト成長ホルモンアンタゴニストＧ１２０Ｋ－Ｔ１４２Ｃ－ｄＰＥＧＸ－Ｈ１５１Ｃのアミノ酸配列を提供する。

本発明をその例示的な実施形態の説明によって示し、実施形態を一定の詳細に説明してきたが、添付の請求項の範囲をそのような詳細に限定したり、いかなる方法でも制限したりする意図はない。追加の利点や変更点は、当業者には容易にわかるだろう。したがって、より広い側面における本発明は、示されて説明された特定の詳細、代表的な装置および方法、および／または例示的な実施例のいずれにも限定されない。したがって、一般的な発明概念の精神または範囲から逸脱することなく、そのような詳細から逸脱することができる。

Claims

ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストであって、
ａ）ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋであって、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋの１つのアミノ酸がシステインに変異しているか、または、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋの２つのアミノ酸がシステインに変異しているものであり、システインに変異した前記１つのアミノ酸が、Ｎ９９、Ｔ１４２、およびＨ１５１からなる群から選択され、システインに変異した前記２つのアミノ酸が、Ｎ９９／Ｔ１４２、Ｎ９９／Ｈ１５１、およびＴ１４２／Ｈ１５１からなる群から選択される、前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋと、
ｂ）前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋ変異体の各置換されたシステインに共役したポリエチレングリコール分子と、
を含む、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト。
請求項１に記載の組成物において、前記ポリエチレングリコール分子が、重合によって調製され、および多分散されているか、または前記ポリエチレングリコール分子が、段階的な有機化学によって調製され、実質的に純粋な単一化合物である、組成物。
請求項１に記載の組成物において、前記ポリエチレングリコール分子が、直鎖構造であるか、またはポリエチレングリコール分子が分岐構造である、組成物。
請求項１に記載の組成物において、システインに変異した前記１つのアミノ酸に共役した前記ポリエチレングリコール分子が、多分散した４０ｋＤａの分岐ポリエチレングリコール分子である、組成物。
請求項１に記載の組成物において、システインに変異した前記２つのアミノ酸に共役した前記ポリエチレングリコール分子が、３つのカルボン酸アニオンをそれぞれ含む２つの４０ｋＤａ分岐ポリエチレングリコール分子または２つの４．５ｋＤａ分岐ポリエチレングリコールのいずれかである、組成物。
請求項１に記載の組成物において、前記ポリエチレングリコール分子が、遊離のスルフヒドリル基に共役するためのマレイミド基を含む、組成物。
請求項１に記載の組成物において、前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストが、配列ＩＤ番号：１３、１５、１７、１９、２１、および２３からなる群から選択されるＤＮＡ分子と少なくとも９５％の同一性を有するＤＮＡ配列によってコード化される、組成物。
請求項１に記載の組成物において、前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストが、配列ＩＤ番号：１４、１６、１８、２０、２２、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、組成物。
ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストに反応する疾患または状態を治療するための方法であって、請求項１に記載の前記組成物の有効量を患者に投与する工程を含む、方法。
ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストであって、
ａ）ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋであって、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋの１つのアミノ酸がシステインに変異しているか、または、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋの２つのアミノ酸がシステインに変異しているものであり、システインに変異した前記１つのアミノ酸が、Ｎ９９、Ｔ１４２、およびＨ１５１からなる群から選択され、システインに変異した前記２つのアミノ酸が、Ｎ９９／Ｔ１４２、Ｎ９９／Ｈ１５１、およびＴ１４２／Ｈ１５１からなる群から選択される、前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋと、
ｂ）ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋ変異体の各置換されたシステインに共役したポリエチレングリコール分子であって、
ｉ）システインに変異した前記１つのアミノ酸に共役した前記ポリエチレングリコール分子が、多分散した４０ｋＤａの分岐ポリエチレングリコール分子であり、
ｉｉ）システインに変異した前記２つのアミノ酸に共役した前記ポリエチレングリコール分子が、３つのカルボン酸アニオンをそれぞれ含む２つの４０ｋＤａの分岐ポリエチレングリコール分子または２つの４．５ｋＤａ分岐ポリエチレングリコールのいずれかである、前記ポリエチレングリコール分子と、
を含む、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト。
請求項１０に記載の組成物において、前記ポリエチレングリコール分子が、重合によって調製され、および多分散されているか、または前記ポリエチレングリコール分子が、段階的な有機化学によって調製され、実質的に純粋な単一化合物である、組成物。
請求項１０に記載の組成物において、前記ポリエチレングリコール分子が、直鎖構造であるか、またはポリエチレングリコール分子が分枝構造である、組成物。
請求項１０に記載の組成物において、前記ポリエチレングリコール分子が、遊離のスルフヒドリル基に共役するためのマレイミド基を含む、組成物。
請求項１０に記載の組成物において、前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストが、配列ＩＤ番号：１３、１５、１７、１９、２１、および２３からなる群から選択されるＤＮＡ分子と少なくとも９５％の同一性を有するＤＮＡ配列によってコード化される、組成物。
請求項１０に記載の組成物において、前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストが、配列ＩＤ番号：１４、１６、２０、２２、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、組成物。
ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストに反応する疾患または状態を治療するための方法であって、請求項１０に記載の前記組成物の有効量を患者に投与する工程を含む、方法。
ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストであって、
ａ）ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋであって、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋの２つのアミノ酸がシステインに変異しており、システインに変異した前記２つのアミノ酸が、Ｎ９９／Ｔ１４２、Ｎ９９／Ｈ１５１、およびＴ１４２／Ｈ１５１からなる群から選択される、前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋと、
ｂ）ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストＧ１２０Ｋ変異体の各置換されたシステインに共役したポリエチレングリコール分子と、
を含む、ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニスト。
請求項１７に記載の組成物において、システインに変異した前記２つのアミノ酸に共役した前記ポリエチレングリコール分子が、３つのカルボン酸アニオンをそれぞれ含む２つの４０ｋＤａの分岐ポリエチレングリコール分子または２つの４．５ｋＤａ分岐ポリエチレングリコールのいずれかである、組成物。
請求項１７に記載の組成物において、前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストが、配列ＩＤ番号：１９、２１、および２３からなる群から選択されるＤＮＡ分子と少なくとも９５％の同一性を有するＤＮＡ配列によってコード化される、組成物。
請求項１７に記載の組成物において、前記ヒト成長ホルモン受容体アンタゴニストが、配列ＩＤ番号：２０、２２、および２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、組成物。