JP2003009883A

JP2003009883A - マスト細胞の細胞死誘発剤

Info

Publication number: JP2003009883A
Application number: JP2001204567A
Authority: JP
Inventors: Yukitsugu Naito; 幸嗣内藤; Shusei Uno; 修正宇野; Eiji Asakura; 栄二朝倉
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Priority date: 2001-07-05
Filing date: 2001-07-05
Publication date: 2003-01-14
Also published as: EP1410802B1; EP1410802A1; US7217539B2; EP1410802A4; DE60222265D1; DE60222265T2; ATE372347T1; US20040248787A1; WO2003004047A1

Abstract

(57)【要約】【課題】ＭＩＴＦ変異体を用いた新規な医
薬用途を提供すること。【解決手段】ＰＤＴおよびＭＩＴＦ変異体から
構成される融合蛋白質を有効成分とするマスト細胞の細
胞死誘発剤、および、ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤおよびＭＩ
ＴＦ変異体から構成される融合蛋白質において、ＭＩＴ
Ｆ変異体がＭＩＴＦのｍｉ変異体、ｗｈ変異体またはｂ
ＨＬＨ−Ｚｉｐ断片である、当該融合蛋白質。本発明の
融合蛋白質はマスト細胞内に移行することにより内在性
ＭＩＴＦの活性を阻害する、前駆細胞からのマスト細胞
の分化を阻害する、マスト細胞の生存を阻害する、成熟
マスト細胞に細胞死（アポトーシス）を誘導する、など
の作用を有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の技術分野】本発明はＭＩＴＦ変異体を用いた
医薬用途に関する。より詳細にはＭＩＴＦ変異体を構成
要素とする融合蛋白質の医薬用途に関する。

【０００２】

【従来技術】ＭＩＴＦ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ
−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒの略）は生体内に存在する転写制御因子
の一種であり、マスト細胞に特有な、ｃ−ｋｉｔ遺伝子
発現調節能を有する蛋白質である。

【０００３】ＭＩＴＦは既知の物質である（Ｃｅｌｌ、
７４巻、３９５〜４０４頁、１９９３年）が、最初に見
出されたのはＭＩＴＦをコードする遺伝子であった。す
なわち、当該遺伝子は、ｍｉ／ｍｉマウスの原因遺伝子
として単離された。ｍｉ／ｍｉマウスにおいては、ＭＩ
ＴＦ遺伝子に突然変異、すなわちＭＩＴＦ遺伝子の転写
活性化領域の１アミノ酸欠失が生じたため、正常なＭＩ
ＴＦが発現されない。ｍｉ／ｍｉマウスは、眼球の形成
不全、メラノサイトの欠損、マスト細胞の消失、骨大理
石症を主な症状とする変異マウスであり、メラノサイ
ト、マスト細胞、網膜色素上皮細胞、破骨細胞などの組
織で分化異常を呈する。ｍｉ／ｍｉマウスにおけるこれ
らの細胞の分化異常は、正常ＭＩＴＦが発現されずＭＩ
ＴＦによる遺伝子転写活性化が行われないことに起因す
る。

【０００４】また、正常マウスの組織あるいは培養細胞
株を用いたノザンブロットによる発現組織分布の解析
で、ＭＩＴＦｍＲＮＡが、心臓、メラノサイト、マスト
細胞で発現していることが認められた。近年では、ＭＩ
ＴＦにはｃＤＮＡの５’末端の配列が異なるアイソフォ
ーム、すなわちメラノサイト型（Ｍタイプ）、心臓型
（Ｈタイプ）、Ａタイプが存在することが報告されてい
る（生化学、７１巻１号、６１〜６４頁、１９９９
年）。ＭＩＴＦ遺伝子は１０個（Ｍタイプ）あるいは１
１個（Ａ、Ｈタイプ）のエクソンから構成されており、
エクソン２以降は３タイプ共ほぼ共通である。Ｍタイプ
においては、６アミノ酸をコードする１８塩基からなる
エクソン５ｂの付加の有無によって、さらに２つのタイ
プに区別される。ＡとＨのタイプはエクソン１Ｂ以降が
完全に一致しており、５’末端のエクソン１が異なる。
Ａ、ＨタイプとＭタイプとは、エクソン２以降は共通で
あるが、Ｍタイプにはエクソン２の上流にエクソン１Ｂ
がなく、特異的なエクソン１がつながる。また、ゲノム
配列からそれぞれのタイプのプロモーターは異なってい
ることが明らかになっている。

【０００５】ＭＩＴＦ蛋白質は、核移行領域、転写活性
化領域、ＤＮＡ結合領域、二量体形成領域およびＭＩＴ
Ｆ自体の活性化領域からなることが推定されており、こ
れら領域を含むことは既知の全てのタイプで共通であ
る。ＭＩＴＦ蛋白質は、その構造の中央にｂＨＬＨ−Ｚ
ｉｐ（ｂａｓｉｃ−ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ
／ｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒ）を有する転写制御因
子であり、二量体を形成してＤＮＡに結合し、対象とな
る遺伝子の転写を活性化する。ＡタイプとＨタイプの転
写活性能には大きな差違があることが報告されており、
両タイプ間で遺伝子配列の異なるエクソン１に、転写活
性を制御する機能があると推測される。

【０００６】また、ＭＩＴＦ蛋白質は、メラノサイトに
おいては転写制御因子として作用し、メラノサイトの増
殖分化、ならびにメラニン合成系等に関わっていること
が報告されている。

【０００７】マスト細胞においても、ＭＩＴＦ蛋白質は
ｃ−ｋｉｔ遺伝子発現を調節する転写制御因子（ｃ−ｋ
ｉｔプロモーターを活性化する転写因子）として作用す
ることが報告されている（Ｂｌｏｏｄ、８８巻４号、１
２２５〜１２３３頁、１９９６年）。ｃ−ｋｉｔ遺伝子
は造血前駆細胞、マスト細胞、色素細胞、生殖細胞で発
現されており、これら細胞の増殖分化を、Ｓｌ因子の作
用により制御している。マスト細胞において、ＭＩＴＦ
蛋白質は、ｃ−ｋｉｔ遺伝子発現を制御することにより
マスト細胞の生存維持に関わっていると考えられる。

【０００８】マスト細胞はアレルギー疾病に関与してい
ることが古くから報告されている［ＩｇＥ，ｍａｓｔ
ｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅａｌｌｅｒｇｉｃｒｅ
ｓｐｏｎｓｅ（ＣｉｂａＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｓｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ）１４７、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆
Ｓｏｎｓ出版社、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ．、１９
８９年］。また、アレルギー疾病以外にマスト細胞が関
わる疾病として、自己免疫疾患、肺線維症、癌等が挙げ
られる。

【０００９】一方、ＰＴＤ（ＰｒｏｔｅｉｎＴｒａｎ
ｓｄｕｃｔｉｏｎＤｏｍａｉｎの略）は、生体膜を貫
通して蛋白質を細胞内に移行させる（取り込ませる）働
きを有するドメインの総称である。例えば、ＨＩＶ抗原
中のドメイン単位で分析したところ、ＴＡＴ由来ペプチ
ドの部分が、ＨＩＶ抗原を正常なＴ細胞内に移行させる
働きを有しており、これが細胞感染の一因であることが
確認されている（Ｃｅｌｌ、５５巻、１１７９〜１１８
８頁、１９８８年）。こうした知見がベースとなって、
ＴＡＴと同じような働きを有する各種ＰＴＤが存在する
こと、これらのＰＴＤと各種蛋白質を融合させることに
より細胞内に移行させる手法が報告されている（Ｃｕｒ
ｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ２０００、２巻２号、１
６２〜１６７頁、２０００年）。

【００１０】しかしながら、ＭＩＴＦあるいはマスト細
胞に関して、ＰＴＤを利用して細胞内に移行させる技術
については、今までのところ報告例は見出されていな
い。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＭＩ
ＴＦ変異体を用いた新規な医薬用途を提供することにあ
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の事
情を考慮して研究を行った結果、ＭＩＴＦ変異体とＰＴ
Ｄ配列を組合せることにより、マスト細胞の細胞死を誘
発できることを見出して本発明を完成した。すなわち、
本発明は、１）ＰＴＤおよびＭＩＴＦ変異体から構成さ
れる融合蛋白質を有効成分とするマスト細胞の細胞死誘
発剤、および、２）ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤおよびＭＩＴ
Ｆ変異体から構成される特定の融合蛋白質、に関するも
のである。

【００１３】

【発明の実施の態様】Ａ．ＭＩＴＦ変異体本発明で用いられるＭＩＴＦ変異体は、天然型（野生
型）ＭＩＴＦの変異体であって、ＭＩＴＦ阻害活性を有
するものであれば、特に限定されるものではない。具体
的には、ＭＩＴＦのｍｉ変異体、ＭＩＴＦのｗｈ変異
体、その他のＭＩＴＦ変異体、例えば、スプライシング
バリアント（△Ａ体、△Ｈ体、△Ｍ体、△Ｎ体。△は欠
失体であることを意味する）、あるいはＭＩＴＦの部分
構造であってＭＩＴＦ阻害活性を有するもの、例えば、
ｂＨＬＨ−Ｚｉｐ断片、その部分を含むＮ末側断片など
が例示される。具体的には、ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅ
ｎｅｔｉｃｓ、１１巻１１号、４４２〜４４８頁、１９
９５年；ＷＯ００／４７７６５；特願２０００−６３
９５９などに開示されたＭＩＴＦ変異体などが挙げられ
る。特に好ましい変異体は、ｍｉ変異体、ｗｈ変異体、
ｂＨＬＨ−Ｚｉｐ断片である。これらのアミノ酸配列、
塩基配列の関係は表１のとおりである。

【００１４】

【表１】

【００１５】また、これらの変異体の構造類似体であっ
ても、当該変異体と実質的に同程度のＭＩＴＦ阻害活性
を有するものも本発明の範疇に含まれる。

【００１６】Ｂ．ＰＴＤ本発明で用いられるＰＴＤは、細胞内に取り込まれる
（移行する）性質を有するものであれば、特に限定され
るものではなく、公知のものを利用できる。具体的に
は、前記の文献（ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉ
ｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ
２０００、２巻２号、１６２〜１６７頁、２０００年）
中の１６４頁表２に列挙された各種オリゴペプチド、Ｗ
Ｏ９９／１０３７６、同９９／２９７２１、特表平５
−５０５１０２で開示されたＰＴＤ用の各種オリゴペプ
チドなどが例示される。

【００１７】より好ましいＰＴＤは、ＴＡＴ由来ペプチ
ド（アミノ酸配列はＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号
７、塩基配列は同８で各々示される）である。

【００１８】ＰＴＤはＭＩＴＦ変異体のＮ末側、Ｃ末側
のいずれに結合していてもよい。また、結合は直接でも
よく、架橋剤（リンカー）を介して間接的なものであっ
てもよい。リンカーとしてはグリシンなどが例示され
る。

【００１９】Ｃ．その他の構成要素（ドメイン）本発明の融合蛋白質は、精製用アフィニティクロマトに
おけるリガンドに対して親和性を有するものを結合して
いてもよい。当該ドメインは特に限定されるものではな
く、公知のものを利用することができる。このような関
係にあるものとしては、抗原とその抗体、受容体とその
リガンド、Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）とＨｉｓＴ
ａｇ、アビジン（またはストレプトアビジン）とビオチ
ン、などが例示される。より好ましいのは、ＨｉｓＴａ
ｇ（アミノ酸配列はＭＧＧＳＨＨＨＨＨＨ、配列番号
９、塩基配列は同１０で各々示される）である。

【００２０】本ドメインは融合蛋白質のＮ末側、Ｃ末側
のいずれに結合していてもよい。また、結合は直接でも
よく、架橋剤（リンカー）を介して間接的なものであっ
てもよい。リンカーとしてはグリシンなどが例示され
る。

【００２１】Ｄ．融合蛋白質の調製本発明の融合蛋白質の調製方法としては、融合蛋白質
全体を、化学的合成手法を用いて合成する方法、上記
の各構成要素（ドメイン）を各々別個に調製した後に、
化学的な反応手段を用いて結合する方法、各構成要素
をコードする遺伝子を連結した上で遺伝子工学的手法を
用いて一気に融合蛋白質として発現させる方法などが例
示される。の場合、各構成要素の調製方法としては、
化学的合成方法、細胞培養法、遺伝子工学的な手法を用
いる方法などが挙げられる。ＰＴＤはＨＩＶ抗原からの
切断・単離によっても調製することもできる。

【００２２】調製された融合蛋白質の精製は、自体公知
の手法により行うことができる（ＷＯ９９／５５８９９
など）。例えば、Ｎｉカラムを用いる方法、陰イオン交
換体処理法などが例示される。また、本発明の融合蛋白
質は尿素処理後に尿素を除去して得られたものを用いる
ことが好ましい。尿素処理時の条件としては、尿素濃度
１〜１０Ｍ程度が例示される。

【００２３】Ｅ．調製された融合蛋白質の性状本発明の融合蛋白質は、細胞内、特にマスト細胞内に移
行する性質を有するものである。好ましくは、ＨｉｓＴ
ａｇ、ＰＴＤおよびＭＩＴＦ変異体から構成される。こ
のものは１０〜１００キロダルトン程度の分子量を有す
る。好適には、Ｎ末側からみて、ＨｉｓＴａｇ、ＰＴ
Ｄ、ＭＩＴＦ変異体の順番に並んだものである。具体的
な配列としては、表２に示すとおりである。

【００２４】

【表２】

【００２５】Ｆ．製剤化本発明の融合蛋白質の製剤化には、自体公知の手法を用
いることができる。

【００２６】Ｇ．用途本発明のＭＩＴＦ変異体（または、それを用いた融合蛋
白質）はマスト細胞内に移行することにより内在性ＭＩ
ＴＦの活性を阻害する、前駆細胞からのマスト細胞の分
化を阻害する、マスト細胞の生存を阻害する、成熟マス
ト細胞に細胞死（アポトーシス）を誘導する、などの作
用を有する。従って、本発明の製剤は、マスト細胞が関
与する各種疾患の予防・治療に有用であることが期待さ
れる。

【００２７】Ｈ．用法・用量本発明の融合蛋白質の用法・用量としては、生体内にお
いて０．００１〜１０μｇ／ｍＬ程度の濃度で存在する
ように、投与量を選択すればよい。投与経路としては、
静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、気道内
投与などが例示される。

【００２８】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例、
製剤例および実験例を挙げるが、本発明はこれらにより
何ら限定されるものではない。

【００２９】実施例１）融合蛋白質発現プラスミドの構築発現プラスミドは、大腸菌用発現ベクターｐＴｒｃＨｉ
ｓＢ（インビトロゲン社、Ｎｏ．Ｖ３６０−２０）のＨ
ｉｓＴａｇ配列の上流に存在するＮｃｏＩサイトとマル
チクローニングサイト中のＨｉｎｄＩＩＩサイトの間
に、精製用のＨｉｓＴａｇの下流にＰＴＤ配列が接続
し、その下流にＭＩＴＦ変異体のｃＤＮＡを接続したＨ
ｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦ変異体の遺伝子を挿入す
ることにより構築した。図１を参照のこと。

【００３０】ＭＩＴＦのｃＤＮＡへのＨｉｓＴａｇ、Ｐ
ＴＤ配列の付加はＰＣＲ法を用いて行った。まず、ＭＩ
ＴＦＭタイプのｃＤＮＡ（ｐＳＵ０５４）を鋳型にし
て、ＭＩＴＦおよびＢａｍＨＩサイトを含む上流部分を
ＰＣＲ法により増幅した。さらに４種類のプライマー
（Ｍ−ｔａｔ、Ｔａｔ３、Ｔａｔ２、Ｔａｔ１）
を用いてＭＩＴＦの転写開始コドンの上流にＨｉｓＴａ
ｇと制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を付加するまで伸長さ
せた後に、大腸菌用発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（こ
のものはｌａｃＰ／ＯおよびＡｍｐｒを担持してな
る）のＮｃｏＩサイトとＢａｍＨＩサイトの間にクロー
ニングした。

【００３１】各プライマーは以下の塩基配列を有する。Ｍ−ｔａｔ（配列番号１７）：ＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡ
ＧＧＴＡＴＧＣＴＡＧＡＡＴＡＣＡＧＴＣＡＣＴＡＣＣＴａｔ３（配列番号１８）：ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡ
ＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴ
ＧＴａｔ２（配列番号１９）：ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡ
ＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＴａｔ１（配列番号２０）：ＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧ
ＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡ
ＴＧＧＴＧ

【００３２】次いで、Ｍタイプ（ｐＳＵ０５４）、ｍｉ
変異体（ｐＳＵ０６１）、ｗｈ変異体（ｐＳＵ０６２）
をそれぞれＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ消化することに
より、ＭＩＴＦｃＤＮＡの下流部分を単離した。この部
分に変異部分も含まれる。単離したｃＤＮＡ断片を、上
流部分をクローニングしたプラスミドのＢａｍＨＩサイ
トとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に挿入した。プラスミド
ｐＳＵ８１は正常型ＭＩＴＦであるＭタイプを含む融合
蛋白質の遺伝子を挿入したものである。ｐＳＵ０８２は
ｍｉ変異体を、ｐＳＵ０８３はｗｈ変異体を含む融合蛋
白質を各々挿入したものである（図１）。

【００３３】２）融合蛋白質の発現構築した発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５α（東洋紡）に
導入し形質転換した。５０ｍＬのＬ−Ｂｒｏｔｈ（５０
μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に、大腸菌を１白金
耳量となるように植菌し、３７℃で１７時間培養した。
さらに、１ＬのＬ−Ｂｒｏｔｈ（５０μｇ／ｍＬのアン
ピシリンおよび０．２％のグルコースを含む）に培養液
を１％となるように植菌した。Ａ６００の濁度が約０．
１となるまで３７℃で培養した後に、ＩＰＴＧ（イソプ
ロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度０．４ｍ
Ｍとなるように添加した。２時間培養後に大腸菌を集菌
した。

【００３４】３）融合蛋白質の精製大腸菌を遠心分離にて回収し、８Ｍの尿素、０．１Ｍの
塩化ナトリウム、１０ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０、ｐＨは以下同様）中で超
音波粉砕し可溶化した。得られたＬｙｓａｔｅを８Ｍの
尿素、０．１Ｍの塩化ナトリウム、１０ｍＭのイミダゾ
ール、１ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝
液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ
社）カラムにアプライし、同緩衝液で洗浄した。カラム
に結合した蛋白をＡ液として同緩衝液とＢ液として２０
０ｍＭのイミダゾールを含む同緩衝液を用いたイミダゾ
ールの濃度直線勾配法で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｔ
ｅｆｃｏ社製）で解析して目的の分子量を示す画分をプ
ールした。

【００３５】溶出液１容量に対して、２０ｍＭのＨＥＰ
ＥＳ緩衝液を１容量、４Ｍの尿素を含む同緩衝液を２容
量、各々添加して希釈した溶液を、４Ｍの尿素、２５ｍ
Ｍの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液
で平衡化した四級アンモニウム塩型強陰イオン交換体
（商品名Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ファルマシア社）に
アプライし、同緩衝液で洗浄した。次に、２０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳ緩衝液で洗浄して尿素を除去した後に、１Ｍの
塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムに結合した蛋白
を溶出した。溶出した融合蛋白質は１０％グリセロール
を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ（等張化リン酸緩
衝液）に対して透析した後に分注して−８０℃で保存し
た。

【００３６】得られた最終産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
析したところ、還元条件下で約５０キロダルトンの分子
量を示すバンドが観察された。このバンドはウサギ抗Ｍ
ＩＴＦ抗体と反応した。なお、このウサギ抗ＭＩＴＦ抗
体は、ウサギにＭＩＴＦのＣ末２０アミノ酸残基のペプ
チドを免疫して得られた抗血清を、同ペプチドを結合し
たカラムを用いてアフィニティ精製を行うことにより、
同ペプチドを特異的に認識する抗体を調製したものであ
る。

【００３７】製剤例本発明の融合蛋白質、および、１０％グリセロールを含
むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳからなる組成物を調製し
た。

【００３８】実験例１１）まず、本発明の融合蛋白質が細胞内に移行している
かどうかを確認した。実施例で調製したＭＩＴＦ変異体
の融合蛋白質をＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソチオシ
アネート）で常法により蛍光標識し、ＣＯＳ７細胞に添
加した。添加１時間後にＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ）
Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディキンソン社）を用い
て、蛍光強度を測定した。その結果を表３に示す。

【００３９】

【表３】

【００４０】表３から明らかなように強い蛍光が細胞に
会合（アソシエート）していることが観察され、当該融
合蛋白質が細胞内に効率よく移行していることが確認さ
れた。

【００４１】２）本発明の融合蛋白質が細胞内に移行し
て内在性ＭＩＴＦの活性を阻害するか調べる目的でルシ
フェラーゼ分析を行った。

【００４２】発現用プラスミドとして、正常ＭＩＴＦ発
現用プラスミドｐＳＵ０６３（ＭＩＴＦ−Ｍ／ｐＣＤＮ
Ａ３）、ｃ−ｋｉｔ遺伝子プロモーターの下流にルシフ
ェラーゼ遺伝子を接続したプラスミドを調製するための
各種ベクター、すなわち、Ｃ−ｋｉｔ−Ｒｌｕｃ発現用
ベクターｐＳＵ０５３（Ｃ−ｋｉｔ／Ｒ−ｌｕｃ）、ル
シフェラーゼ発現用ベクターｐＧＬ２（Ｌｌｕｃ、プロ
メガ社）を用いた。各プラスミドを、ＣＯＳ７細胞に導
入（トランスフェクト）した。その条件は以下のとお
り。プラスミドの使用量は、６ｃｍのディッシュ当たり
３μｇ（ｐＳＵ０６３：ｐＳＵ０５３：ｐＧＬ２＝１：
１：０．１）。プラスミドの導入にはトランスフェクシ
ョンキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、＃２００３８
５）を用いた。

【００４３】６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１
０^５個の細胞を植え込み、１７時間ＣＯ_２インキュベー
タに静置した。１０μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ１（前記キ
ットに添付されている試薬。２．５ＭＣａＣｌ_２から
なる）に９０μＬの蒸留水と３μｇのＤＮＡを添加した
後に、等量のＳｏｌｕｔｉｏｎ２［前記キットに添付さ
れている試薬。２×ＰＢＳ（ｐＨ６．９５）からなる］
を加え、室温で２０分間静置した。混合したＤＮＡ溶液
を培養液に添加した。２４時間後に上記の培地を交換
し、１μｇ／ｍＬの本発明の融合蛋白質（実施例で調
製）を添加した。

【００４４】本発明の融合蛋白質の添加４８時間後に細
胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、６穴のディシュ当たり０．
５ｍＬのｐａｓｓｉｖｅｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒを
添加し、スクレーバーを用いて細胞を掻き採った。細胞
を１．５ｍＬ容のチューブに移し、１４０００ｒｐｍ、
４℃で５分間遠心した。ルシフェラーゼ活性の測定は、
Ｄｕａｌｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｓｓａｙｋｉｔ
（プロメガ社）を用いて行った。９６穴プレート上で２
０μＬの遠心上清に、１００μＬのＬｕｃｉｆｅｒａｓ
ｅＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔＩＩを添加・混合
し、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。さらに混合
液に１００μＬのＳｔｏｐ＆ＧｏＲｅａｇｅｎｔを添
加・混合し、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒ−ｌｕ
ｃ）活性を測定した。

【００４５】Ｒ−ｌｕｃの数値をｐＧＬ２で補正後、Ｐ
ＢＳ添加におけるＲ−ｌｕｃを１としたときの値に換算
した。その結果を表４に示す。

【００４６】

【表４】

【００４７】なお、表中のｍｉはＨｉｓＴａｇ−ＰＤＴ
−ＭＩＴＦのｍｉ変異体からなる融合蛋白質、ｗｈはＨ
ｉｓＴａｇ−ＰＤＴ−ＭＩＴＦのｗｈ変異体からなる融
合蛋白質、を各々示す。

【００４８】ＣＯＳ細胞が発現するルシフェラーゼ活性
も本発明の融合蛋白質存在下で阻害され、当該融合蛋白
質が細胞内に移行して内在性ＭＩＴＦを阻害することが
示唆された。

【００４９】実験例２本発明の融合蛋白質がＳＣＦで誘導されるマスト細胞の
分化系にどのように影響するかを確認した。

【００５０】正常マウスから骨髄細胞を調製し、その２
×１０^６個／穴を、１０％のＦＣＳ、０．１ｍＭの非必
須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭの
グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ
／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプ
トエタノール、２μｇ／ｍＬの本発明の融合蛋白質（Ｈ
ｉｓＴａｇ−ＰＤＴ−ＭＩＴＦのｗｈ変異体）を含むＲ
ＰＭＩ１６４０中で骨髄細胞因子（ＳＣＦ、ＩＢＬ社）
５０〜１００ｎｇ／ｍＬの存在下に２４穴プレートにて
培養した。週に一度培地を半量交換し、その際にＳＣＦ
も添加した。３７℃で２１日間培養した後に、マスト細
胞数、ｃ−ｋｉｔおよびＩｇＥ受容体の発現量を測定し
た。

【００５１】マスト細胞数の測定はトルイジン青染色法
によった。トルイジン青染色はＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏ
ｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅ
ｙ）ｓｅｃｔｉｏｎ７．２５．２に従い、ｐＨ２．７
の染色液を用いて行った。

【００５２】ｃ−ｋｉｔの発現量の測定はＦＡＣＳを用
いて行った。細胞を、０．１％のＮａＮ_３、０．１％の
ＢＳＡを含むＰＢＳ１００μＬに懸濁し、５〜１０μｇ
／ｍＬのＲ−ＰＥ（Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）
標識抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ
社）あるいはＲ−ＰＥ標識ラットＩｇＧ２Ｂ，ｋｉｓ
ｏｔｙｐｅｓｔａｎｄａｒｄ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ
社）と氷中で１時間インキュベーションした。洗浄後に
１μｇ／ｍＬのヨウ化ピリジウムを添加して、ＦＡＣＳ
Ｃａｌｉｂｕｒ（前記）で解析した。ＩｇＥ受容体の
発現量の測定は、５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識マウスＩ
ｇＥを用いて同様にＦＩＴＣによる解析を行った。

【００５３】マスト細胞数に関する結果を表５に示す。

【００５４】

【表５】

【００５５】本発明の融合蛋白質の添加群では、培養２
１日目でマスト細胞数が未添加群に比べて１０分の１以
下に減少していた。

【００５６】ｃ−ｋｉｔの発現に関する培養２１日目の
結果を表６に示す。

【００５７】

【表６】

【００５８】本発明の融合蛋白質の添加群では、培養２
１日目でｃ−ｋｉｔの発現量が未添加群に比べて１０分
の１以下に減少していた。また、ＩｇＥ受容体の発現量
は変化がなかった（実験データは示さず）。

【００５９】このように本発明の融合蛋白質はマスト細
胞前駆細胞のＳＣＦ受容体ｃ−ｋｉｔの発現を特異的に
阻害し、その結果、マスト細胞の分化を強く阻害するこ
とが確認された。

【００６０】実験例３本発明の融合蛋白質の、成熟マスト細胞への影響を確認
する目的で、線維芽細胞との共培養系でのマスト細胞生
存への影響を確認した。

【００６１】正常マウスから脾細胞を調製し、１０％の
ＦＣＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビ
ン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬ
のペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシ
ン、５０μＭの２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭ
Ｉ１６４０中でＩＬ−３（ＧＥＮＺＹＭＥ社）またはＷ
ＥＨＩ−３細胞ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地（ＷＥＨＩ
−３ＣＭ）存在下に３週間以上培養して、脾臓由来培養
マスト細胞（ＳＭＣ）を得た。６穴プレートに線維芽細
胞のＮＩＨ−３Ｔ３（理研セルバンク）をコンフルエン
トまで培養し、当該ＳＭＣをＩＬ−３およびＷＥＨＩ−
３ＣＭを含まず、かつ、１μｇ／ｍＬの本発明の融合蛋
白質を含む、上記の培地に懸濁し、３×１０^５個で播種
した。２〜３日ごとに新鮮培地に交換した。３７℃で１
５日間培養した後に、マスト細胞数、ヒスタミン量およ
びキマーゼ活性を測定した。

【００６２】各種実験系を表７に示す。

【００６３】

【表７】

【００６４】ヒスタミンの定量はＲＩＡ法（栄研化学）
によった。顆粒中のキマーゼ活性の測定は特異的な合成
基質であるＮ−サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−
Ｐｈｅ−ｐＮＡ（シグマ社）を用いて行った。結果を表
８に示す。

【００６５】

【表８】

【００６６】線維芽細胞と正常マスト細胞を共培養する
とマスト細胞は長期間生存し続けた。また、ＭＩＴＦに
異常を持つ人為的に作成したｍｉマスト細胞（ｍｉ／ｍ
ｉＳＭＣ、天然には存在しない）は線維芽細胞との共培
養においてアポトーシスにより２週間以内に死滅した。
正常マスト細胞と線維芽細胞の共培養に本発明の融合蛋
白質（ｍｉ変異体型、ｗｈ変異体型）を添加すると、マ
スト細胞の生存は阻害され、ｍｉマスト細胞と同様に２
週間後にはほとんどが死滅した。マスト細胞数の低下
は、ヒスタミン量の低下およびキマーゼ活性の低下によ
っても確認された。この結果、本発明の融合蛋白質は、
成熟マスト細胞にアポトーシスを誘導することが示唆さ
れた。

【００６７】実験例４本発明の融合蛋白質の添加濃度における影響を調べた。
ＭＣ／９マスト細胞株（ＡＴＣＣより入手）をＦＩＴＣ
標識したＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｗｈ変異体
からなる融合蛋白質の存在下または非存在下に、ＦＡＣ
Ｓ染色緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．
１％アジ化ナトリウムを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰ
ＢＳ）中で氷上１時間インキュベートした。洗浄後にヨ
ウ化ピリジウムを添加して死細胞をゲートアウトし、Ｆ
ＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（前記）で解析した。結果を表
９に示す。

【００６８】

【表９】

【００６９】表９の結果から、本発明の融合蛋白質の添
加濃度に依存して、当該融合蛋白質が細胞内により高濃
度で移行していることが判明した。

【００７０】

【発明の効果】本発明によれば、ＭＩＴＦ変異体を用い
て、マスト細胞の細胞死を誘発することができる。よっ
て、マスト細胞が関与する各種疾患の予防・治療に有用
な薬剤を臨床の場に提供することができる。

【００７１】

【配列表】配列表配列番号１：ＭＩＴＦのｍｉ変異体
のアミノ酸配列配列表配列番号２：その塩基配列配列表配列番号３：ＭＩＴＦのｗｈ変異体のアミノ酸
配列配列表配列番号４：その塩基配列配列表配列番号５：ｂＨＬＨ−Ｚｉｐ断片のアミノ酸
配列配列表配列番号６：その塩基配列配列表配列番号７：ＴＡＴ由来ペプチドのアミノ酸配
列配列表配列番号８：その塩基配列配列表配列番号９：ＨｉｓＴａｇのアミノ酸配列配列表配列番号１０：その塩基配列配列表配列番号１１：ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴ
Ｆのｍｉ変異体からなる融合蛋白質のアミノ酸配列配列表配列番号１２：その塩基配列配列表配列番号１３：ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴ
Ｆのｗｈ変異体からなる融合蛋白質のアミノ酸配列配列表配列番号１４：その塩基配列配列表配列番号１５：ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴ
ＦのｂＨＬＨ−Ｚｉｐ断片からなる融合蛋白質のアミノ
酸配列配列表配列番号１６：その塩基配列配列表配列番号１７：プライマーＭ−Ｔａｔの塩基配
列配列表配列番号１８：プライマーＴａｔ３の塩基配
列配列表配列番号１９：プライマーＴａｔ２の塩基配
列配列表配列番号２０：プライマーＴａｔ１の塩基配
列

【００７２】 SEQUENCE LISTING <110> Welfide Corporation <120> Agent for inducing apoptosis of mast cell <130> WF4110JP1 <160> 20 <210> 1 <211> 415 <212> PRT <213> mouse <220> <223> MITF mi mutant <400> 1 Met Leu Glu Tyr Ser His 6 Tyr Gln Val Gln Thr His Leu Glu Asn Pro Thr Lys Tyr His Ile 21 Gln Gln Ala Gln Arg His Gln Val Lys Gln Tyr Leu Ser Thr Thr 36 Leu Ala Asn Lys His Ala Ser Gln Val Leu Ser Ser Pro Cys Pro 51 Asn Gln Pro Gly Asp His Ala Met Pro Pro Val Pro Gly Ser Ser 66 Ala Pro Asn Ser Pro Met Ala Met Leu Thr Leu Asn Ser Asn Cys 81 Glu Lys Glu Ala Phe Tyr Lys Phe Glu Glu Gln Ser Arg Ala Glu 96 Ser Glu Cys Pro Gly Met Asn Thr His Ser Arg Ala Ser Cys Met 111 Gln Met Asp Asp Val Ile Asp Asp Ile Ile Ser Leu Glu Ser Ser 126 Tyr Asn Glu Glu Ile Leu Gly Leu Met Asp Pro Ala Leu Gln Met 141 Ala Asn Thr Leu Pro Val Ser Gly Asn Leu Ile Asp Leu Tyr Ser 156 Asn Gln Gly Leu Pro Pro Pro Gly Leu Thr Ile Ser Asn Ser Cys 171 Pro Ala Asn Leu Pro Asn Ile Lys Arg Glu Leu Thr Ala Cys Ile 186 Phe Pro Thr Glu Ser Glu Ala Arg Ala Leu Ala Lys Glu Arg Gln 201 Lys Lys Asp Asn His Asn Leu Ile Glu Arg Arg Arg Phe Asn Ile 216 Asn Asp Arg Ile Lys Glu Leu Gly Thr Leu Ile Pro Lys Ser Asn 231 Asp Pro Asp Met Arg Trp Asn Lys Gly Thr Ile Leu Lys Ala Ser 246 Val Asp Tyr Ile Arg Lys Leu Gln Arg Glu Gln Gln Arg Ala Lys 261 Asp Leu Glu Asn Arg Gln Lys Lys Leu Glu His Ala Asn Arg His 276 Leu Leu Leu Arg Val Gln Glu Leu Glu Met Gln Ala Arg Ala His 291 Gly Leu Ser Leu Ile Pro Ser Thr Gly Leu Cys Ser Pro Asp Leu 306 Val Asn Arg Ile Ile Lys Gln Glu Pro Val Leu Glu Asn Cys Ser 321 Gln Glu Leu Val Gln His Gln Ala Asp Leu Thr Cys Thr Thr Thr 336 Leu Asp Leu Thr Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Asn Leu Gly 351 Thr Met Pro Glu Ser Ser Pro Ala Tyr Ser Ile Pro Arg Lys Met 366 Gly Ser Asn Leu Glu Asp Ile Leu Met Asp Asp Ala Leu Ser Pro 381 Val Gly Val Thr Asp Pro Leu Leu Ser Ser Val Ser Pro Gly Ala 396 Ser Lys Thr Ser Ser Arg Arg Ser Ser Met Ser Ala Glu Glu Thr 411 Glu His Ala Cys * 415 <210> 2 <211> 1248 <212> DNA <213> mouse <220> <223> DNA coding MITF mi mutant <400> 2 ATGCTAGAAT ACAGTCACTA CCAGGTGCAG ACCCACCTGG AAAACCCCAC CAAGTACCAC 60 ATACAGCAAG CTCAGAGGCA CCAGGTAAAG CAGTACCTTT CTACCACTTT AGCAAATAAA 120 CATGCCAGCC AAGTCCTGAG CTCACCATGT CCAAACCAGC CTGGCGACCA TGCCATGCCA 180 CCAGTGCCGG GGAGCAGCGC ACCCAACAGC CCTATGGCTA TGCTCACTCT TAACTCCAAC 240 TGTGAAAAAG AGGCATTTTA TAAGTTTGAG GAGCAGAGCA GGGCAGAGAG TGAGTGCCCA 300 GGTATGAACA CGCACTCTCG AGCGTCGTGC ATGCAGATGG ATGATGTAAT TGATGACATC 360 ATCAGCCTGG AATCAAGTTA TAATGAAGAA ATTTTGGGCT TGATGGATCC GGCCTTGCAA 420 ATGGCAAATA CGTTACCCGT CTCTGGAAAC TTGATCGACC TCTACAGCAA CCAGGGCCTG 480 CCACCGCCAG GCCTTACCAT CAGCAACTCC TGTCCAGCCA ACCTTCCCAA CATAAAAAGG 540 GAGCTCACAG CGTGTATTTT CCCCACAGAG TCTGAAGCAA GAGCATTGGC TAAAGAGAGG 600 CAGAAAAAGG ACAATCACAA CTTGATTGAA CGAAGAAGAT TTAACATAAA CGACCGCATT 660 AAGGAGCTAG GTACTCTGAT CCCCAAGTCA AATGATCCAG ACATGCGGTG GAACAAGGGA 720 ACCATTCTCA AGGCCTCTGT GGACTACATC CGGAAGTTGC AACGGGAACA GCAACGAGCT 780 AAGGACCTTG AAAACCGACA GAAGAAGCTG GAGCATGCGA ACCGGCACCT GCTGCTCAGA 840 GTACAGGAGC TGGAGATGCA GGCTAGAGCG CATGGACTTT CCCTTATCCC ATCCACCGGT 900 CTCTGCTCGC CTGATCTGGT GAATCGGATC ATCAAGCAAG AACCAGTTCT TGAGAACTGC 960 AGCCAGGAAC TTGTACAGCA CCAGGCAGAC CTGACATGTA CGACAACTCT GGATCTCACG 1020 GACGGTACCA TCACCTTTAC CAACAACCTC GGCACCATGC CGGAGAGCAG CCCGGCCTAC 1080 AGCATCCCCA GGAAGATGGG CTCCAACTTG GAAGACATCC TGATGGACGA TGCCCTCTCA 1140 CCTGTTGGAG TCACCGACCC ACTGCTGTCA TCAGTGTCGC CAGGAGCTTC AAAAACAAGC 1200 AGCCGGAGGA GCAGTATGAG CGCAGAAGAA ACGGAGCATG CGTGTTAG 1248 <210> 3 <211> 410 <212> PRT <213> mouse <220> <223> MITF wh mutant <400> 3 Met Leu Glu Tyr Ser His 6 Tyr Gln Val Gln Thr His Leu Glu Asn Pro Thr Lys Tyr His Ile 21 Gln Gln Ala Gln Arg His Gln Val Lys Gln Tyr Leu Ser Thr Thr 36 Leu Ala Asn Lys His Ala Ser Gln Val Leu Ser Ser Pro Cys Pro 51 Asn Gln Pro Gly Asp His Ala Met Pro Pro Val Pro Gly Ser Ser 66 Ala Pro Asn Ser Pro Met Ala Met Leu Thr Leu Asn Ser Asn Cys 81 Glu Lys Glu Ala Phe Tyr Lys Phe Glu Glu Gln Ser Arg Ala Glu 96 Ser Glu Cys Pro Gly Met Asn Thr His Ser Arg Ala Ser Cys Met 111 Gln Met Asp Asp Val Ile Asp Asp Ile Ile Ser Leu Glu Ser Ser 126 Tyr Asn Glu Glu Ile Leu Gly Leu Met Asp Pro Ala Leu Gln Met 141 Ala Asn Thr Leu Pro Val Ser Gly Asn Leu Ile Asp Leu Tyr Ser 156 Asn Gln Gly Leu Pro Pro Pro Gly Leu Thr Ile Ser Asn Ser Cys 171 Pro Ala Asn Leu Pro Asn Ile Lys Arg Glu Leu Thr Glu Ser Glu 186 Ala Arg Ala Leu Ala Lys Glu Arg Gln Lys Lys Asp Asn His Asn 201 Leu Asn Glu Arg Arg Arg Arg Phe Asn Ile Asn Asp Arg Ile Lys 216 Glu Leu Gly Thr Leu Ile Pro Lys Ser Asn Asp Pro Asp Met Arg 231 Trp Asn Lys Gly Thr Ile Leu Lys Ala Ser Val Asp Tyr Ile Arg 246 Lys Leu Gln Arg Glu Gln Gln Arg Ala Lys Asp Leu Glu Asn Arg 261 Gln Lys Lys Leu Glu His Ala Asn Arg His Leu Leu Leu Arg Val 276 Gln Glu Leu Glu Met Gln Ala Arg Ala His Gly Leu Ser Leu Ile 291 Pro Ser Thr Gly Leu Cys Ser Pro Asp Leu Val Asn Arg Ile Ile 306 Lys Gln Glu Pro Val Leu Glu Asn Cys Ser Gln Glu Leu Val Gln 321 His Gln Ala Asp Leu Thr Cys Thr Thr Thr Leu Asp Leu Thr Asp 336 Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Asn Leu Gly Thr Met Pro Glu Ser 351 Ser Pro Ala Tyr Ser Ile Pro Arg Lys Met Gly Ser Asn Leu Glu 366 Asp Ile Leu Met Asp Asp Ala Leu Ser Pro Val Gly Val Thr Asp 381 Pro Leu Leu Ser Ser Val Ser Pro Gly Ala Ser Lys Thr Ser Ser 396 Arg Arg Ser Ser Met Ser Ala Glu Glu Thr Glu His Ala Cys * 410 <210> 4 <211> 1233 <212> DNA <213> mouse <220> <223> DNA coding MITF wh mutant <400> 4 ATGCTAGAAT ACAGTCACTA CCAGGTGCAG ACCCACCTGG AAAACCCCAC CAAGTACCAC 60 ATACAGCAAG CTCAGAGGCA CCAGGTAAAG CAGTACCTTT CTACCACTTT AGCAAATAAA 120 CATGCCAGCC AAGTCCTGAG CTCACCATGT CCAAACCAGC CTGGCGACCA TGCCATGCCA 180 CCAGTGCCGG GGAGCAGCGC ACCCAACAGC CCTATGGCTA TGCTCACTCT TAACTCCAAC 240 TGTGAAAAAG AGGCATTTTA TAAGTTTGAG GAGCAGAGCA GGGCAGAGAG TGAGTGCCCA 300 GGTATGAACA CGCACTCTCG AGCGTCGTGC ATGCAGATGG ATGATGTAAT TGATGACATC 360 ATCAGCCTGG AATCAAGTTA TAATGAAGAA ATTTTGGGCT TGATGGATCC GGCCTTGCAA 420 ATGGCAAATA CGTTACCCGT CTCTGGAAAC TTGATCGACC TCTACAGCAA CCAGGGCCTG 480 CCACCGCCAG GCCTTACCAT CAGCAACTCC TGTCCAGCCA ACCTTCCCAA CATAAAAAGG 540 GAGCTCACAG AGTCTGAAGC AAGAGCATTG GCTAAAGAGA GGCAGAAAAA GGACAATCAC 600 AACTTGAATG AACGAAGAAG AAGATTTAAC ATAAACGACC GCATTAAGGA GCTAGGTACT 660 CTGATCCCCA AGTCAAATGA TCCAGACATG CGGTGGAACA AGGGAACCAT TCTCAAGGCC 720 TCTGTGGACT ACATCCGGAA GTTGCAACGG GAACAGCAAC GAGCTAAGGA CCTTGAAAAC 780 CGACAGAAGA AGCTGGAGCA TGCGAACCGG CACCTGCTGC TCAGAGTACA GGAGCTGGAG 840 ATGCAGGCTA GAGCGCATGG ACTTTCCCTT ATCCCATCCA CCGGTCTCTG CTCGCCTGAT 900 CTGGTGAATC GGATCATCAA GCAAGAACCA GTTCTTGAGA ACTGCAGCCA GGAACTTGTA 960 CAGCACCAGG CAGACCTGAC ATGTACGACA ACTCTGGATC TCACGGACGG TACCATCACC 1020 TTTACCAACA ACCTCGGCAC CATGCCGGAG AGCAGCCCGG CCTACAGCAT CCCCAGGAAG 1080 ATGGGCTCCA ACTTGGAAGA CATCCTGATG GACGATGCCC TCTCACCTGT TGGAGTCACC 1140 GACCCACTGC TGTCATCAGT GTCGCCAGGA GCTTCAAAAA CAAGCAGCCG GAGGAGCAGT 1200 ATGAGCGCAG AAGAAACGGA GCATGCGTGT TAG 1233 <210> 5 <211> 91 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> MITF bHLH-Zip fragment <400> 5 Met Leu Ala Lys Glu Arg 6 Gln Lys Lys Asp Asn His Asn Leu Ile Glu Arg Arg Arg Arg Phe 21 Asn Ile Asn Asp Arg Ile Lys Glu Leu Gly Thr Leu Ile Pro Lys 36 Ser Asn Asp Pro Asp Met Arg Trp Asn Lys Gly Thr Ile Leu Lys 51 Ala Ser Val Asp Tyr Ile Arg Lys Leu Gln Arg Glu Gln Gln Arg 66 Ala Lys Asp Leu Glu Asn Arg Gln Lys Lys Leu Glu His Ala Asn 81 Arg His Leu Leu Leu Arg Val Gln Glu Leu * 91 <210> 6 <211> 276 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA coding MITF bHLH-Zip fragment <400> 6 ATGTTGGCTA AAGAGAGGCA GAAAAAGGAC AATCACAACT TGATTGAACG AAGAAGAAGA 60 TTTAACATAA ACGACCGCAT TAAGGAGCTA GGTACTCTGA TCCCCAAGTC AAATGATCCA 120 GACATGCGGT GGAACAAGGG AACCATTCTC AAGGCCTCTG TGGACTACAT CCGGAAGTTG 180 CAACGGGAAC AGCAACGAGC TAAGGACCTT GAAAACCGAC AGAAGAAGCT GGAGCATGCG 240 AACCGGCACC TGCTGCTCAG AGTACAGGAG CTGTAG 276 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> TAT-derived peptide <400> 7 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 11 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA coding TAT-derived peptide <400> 8 TATGGCAGGA AGAAGCGGAG ACAGCGACGA AGA 33 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> HisTag <400> 9 Met Gly Gly Ser His His His His His His 10 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA coding HisTag <400> 10 ATGGGGGGTT CTCATCATCA TCATCATCAT 30 <210> 11 <211> 439 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> fused protein composing of HisTag-PTD-MITF mi mutant <400> 11 Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Gly Tyr Gly Arg 15 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Met Leu Glu Tyr Ser His 30 Tyr Gln Val Gln Thr His Leu Glu Asn Pro Thr Lys Tyr His Ile 45 Gln Gln Ala Gln Arg His Gln Val Lys Gln Tyr Leu Ser Thr Thr 60 Leu Ala Asn Lys His Ala Ser Gln Val Leu Ser Ser Pro Cys Pro 75 Asn Gln Pro Gly Asp His Ala Met Pro Pro Val Pro Gly Ser Ser 90 Ala Pro Asn Ser Pro Met Ala Met Leu Thr Leu Asn Ser Asn Cys 105 Glu Lys Glu Ala Phe Tyr Lys Phe Glu Glu Gln Ser Arg Ala Glu 120 Ser Glu Cys Pro Gly Met Asn Thr His Ser Arg Ala Ser Cys Met 135 Gln Met Asp Asp Val Ile Asp Asp Ile Ile Ser Leu Glu Ser Ser 150 Tyr Asn Glu Glu Ile Leu Gly Leu Met Asp Pro Ala Leu Gln Met 165 Ala Asn Thr Leu Pro Val Ser Gly Asn Leu Ile Asp Leu Tyr Ser 180 Asn Gln Gly Leu Pro Pro Pro Gly Leu Thr Ile Ser Asn Ser Cys 195 Pro Ala Asn Leu Pro Asn Ile Lys Arg Glu Leu Thr Ala Cys Ile 210 Phe Pro Thr Glu Ser Glu Ala Arg Ala Leu Ala Lys Glu Arg Gln 225 Lys Lys Asp Asn His Asn Leu Ile Glu Arg Arg Arg Phe Asn Ile 240 Asn Asp Arg Ile Lys Glu Leu Gly Thr Leu Ile Pro Lys Ser Asn 255 Asp Pro Asp Met Arg Trp Asn Lys Gly Thr Ile Leu Lys Ala Ser 270 Val Asp Tyr Ile Arg Lys Leu Gln Arg Glu Gln Gln Arg Ala Lys 285 Asp Leu Glu Asn Arg Gln Lys Lys Leu Glu His Ala Asn Arg His 300 Leu Leu Leu Arg Val Gln Glu Leu Glu Met Gln Ala Arg Ala His 315 Gly Leu Ser Leu Ile Pro Ser Thr Gly Leu Cys Ser Pro Asp Leu 330 Val Asn Arg Ile Ile Lys Gln Glu Pro Val Leu Glu Asn Cys Ser 345 Gln Glu Leu Val Gln His Gln Ala Asp Leu Thr Cys Thr Thr Thr 360 Leu Asp Leu Thr Asp Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Asn Leu Gly 375 Thr Met Pro Glu Ser Ser Pro Ala Tyr Ser Ile Pro Arg Lys Met 390 Gly Ser Asn Leu Glu Asp Ile Leu Met Asp Asp Ala Leu Ser Pro 405 Val Gly Val Thr Asp Pro Leu Leu Ser Ser Val Ser Pro Gly Ala 420 Ser Lys Thr Ser Ser Arg Arg Ser Ser Met Ser Ala Glu Glu Thr 435 Glu His Ala Cys * 439 <210> 12 <211> 1320 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA coding the fused protein composing of HisTag-PTD-MITF mi m utant <400> 12 ATGGGGGGTT CTCATCATCA TCATCATCAT GGTGGTTATG GCAGGAAGAA GCGGAGACAG 60 CGACGAAGAG GTATGCTAGA ATACAGTCAC TACCAGGTGC AGACCCACCT GGAAAACCCC 120 ACCAAGTACC ACATACAGCA AGCTCAGAGG CACCAGGTAA AGCAGTACCT TTCTACCACT 180 TTAGCAAATA AACATGCCAG CCAAGTCCTG AGCTCACCAT GTCCAAACCA GCCTGGCGAC 240 CATGCCATGC CACCAGTGCC GGGGAGCAGC GCACCCAACA GCCCTATGGC TATGCTCACT 300 CTTAACTCCA ACTGTGAAAA AGAGGCATTT TATAAGTTTG AGGAGCAGAG CAGGGCAGAG 360 AGTGAGTGCC CAGGTATGAA CACGCACTCT CGAGCGTCGT GCATGCAGAT GGATGATGTA 420 ATTGATGACA TCATCAGCCT GGAATCAAGT TATAATGAAG AAATTTTGGG CTTGATGGAT 480 CCGGCCTTGC AAATGGCAAA TACGTTACCC GTCTCTGGAA ACTTGATCGA CCTCTACAGC 540 AACCAGGGCC TGCCACCGCC AGGCCTTACC ATCAGCAACT CCTGTCCAGC CAACCTTCCC 600 AACATAAAAA GGGAGCTCAC AGCGTGTATT TTCCCCACAG AGTCTGAAGC AAGAGCATTG 660 GCTAAAGAGA GGCAGAAAAA GGACAATCAC AACTTGATTG AACGAAGAAG ATTTAACATA 720 AACGACCGCA TTAAGGAGCT AGGTACTCTG ATCCCCAAGT CAAATGATCC AGACATGCGG 780 TGGAACAAGG GAACCATTCT CAAGGCCTCT GTGGACTACA TCCGGAAGTT GCAACGGGAA 840 CAGCAACGAG CTAAGGACCT TGAAAACCGA CAGAAGAAGC TGGAGCATGC GAACCGGCAC 900 CTGCTGCTCA GAGTACAGGA GCTGGAGATG CAGGCTAGAG CGCATGGACT TTCCCTTATC 960 CCATCCACCG GTCTCTGCTC GCCTGATCTG GTGAATCGGA TCATCAAGCA AGAACCAGTT 1020 CTTGAGAACT GCAGCCAGGA ACTTGTACAG CACCAGGCAG ACCTGACATG TACGACAACT 1080 CTGGATCTCA CGGACGGTAC CATCACCTTT ACCAACAACC TCGGCACCAT GCCGGAGAGC 1140 AGCCCGGCCT ACAGCATCCC CAGGAAGATG GGCTCCAACT TGGAAGACAT CCTGATGGAC 1200 GATGCCCTCT CACCTGTTGG AGTCACCGAC CCACTGCTGT CATCAGTGTC GCCAGGAGCT 1260 TCAAAAACAA GCAGCCGGAG GAGCAGTATG AGCGCAGAAG AAACGGAGCA TGCGTGTTAG 1320 <210> 13 <211> 434 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> fused protein composing of HisTag-PTD-MITF wh mutant <400> 13 Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Gly Tyr Gly Arg 15 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Met Leu Glu Tyr Ser His 30 Tyr Gln Val Gln Thr His Leu Glu Asn Pro Thr Lys Tyr His Ile 45 Gln Gln Ala Gln Arg His Gln Val Lys Gln Tyr Leu Ser Thr Thr 60 Leu Ala Asn Lys His Ala Ser Gln Val Leu Ser Ser Pro Cys Pro 75 Asn Gln Pro Gly Asp His Ala Met Pro Pro Val Pro Gly Ser Ser 90 Ala Pro Asn Ser Pro Met Ala Met Leu Thr Leu Asn Ser Asn Cys 105 Glu Lys Glu Ala Phe Tyr Lys Phe Glu Glu Gln Ser Arg Ala Glu 120 Ser Glu Cys Pro Gly Met Asn Thr His Ser Arg Ala Ser Cys Met 135 Gln Met Asp Asp Val Ile Asp Asp Ile Ile Ser Leu Glu Ser Ser 150 Tyr Asn Glu Glu Ile Leu Gly Leu Met Asp Pro Ala Leu Gln Met 165 Ala Asn Thr Leu Pro Val Ser Gly Asn Leu Ile Asp Leu Tyr Ser 180 Asn Gln Gly Leu Pro Pro Pro Gly Leu Thr Ile Ser Asn Ser Cys 195 Pro Ala Asn Leu Pro Asn Ile Lys Arg Glu Leu Thr Glu Ser Glu 210 Ala Arg Ala Leu Ala Lys Glu Arg Gln Lys Lys Asp Asn His Asn 225 Leu Asn Glu Arg Arg Arg Arg Phe Asn Ile Asn Asp Arg Ile Lys 240 Glu Leu Gly Thr Leu Ile Pro Lys Ser Asn Asp Pro Asp Met Arg 255 Trp Asn Lys Gly Thr Ile Leu Lys Ala Ser Val Asp Tyr Ile Arg 270 Lys Leu Gln Arg Glu Gln Gln Arg Ala Lys Asp Leu Glu Asn Arg 258 Gln Lys Lys Leu Glu His Ala Asn Arg His Leu Leu Leu Arg Val 300 Gln Glu Leu Glu Met Gln Ala Arg Ala His Gly Leu Ser Leu Ile 315 Pro Ser Thr Gly Leu Cys Ser Pro Asp Leu Val Asn Arg Ile Ile 330 Lys Gln Glu Pro Val Leu Glu Asn Cys Ser Gln Glu Leu Val Gln 345 His Gln Ala Asp Leu Thr Cys Thr Thr Thr Leu Asp Leu Thr Asp 360 Gly Thr Ile Thr Phe Thr Asn Asn Leu Gly Thr Met Pro Glu Ser 375 Ser Pro Ala Tyr Ser Ile Pro Arg Lys Met Gly Ser Asn Leu Glu 390 Asp Ile Leu Met Asp Asp Ala Leu Ser Pro Val Gly Val Thr Asp 405 Pro Leu Leu Ser Ser Val Ser Pro Gly Ala Ser Lys Thr Ser Ser 420 Arg Arg Ser Ser Met Ser Ala Glu Glu Thr Glu His Ala Cys * 434 <210> 14 <211> 1305 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA coding the fused protein composing of HisTag-PTD-MITF wh m utant <400> 14 ATGGGGGGTT CTCATCATCA TCATCATCAT GGTGGTTATG GCAGGAAGAA GCGGAGACAG 60 CGACGAAGAG GTATGCTAGA ATACAGTCAC TACCAGGTGC AGACCCACCT GGAAAACCCC 120 ACCAAGTACC ACATACAGCA AGCTCAGAGG CACCAGGTAA AGCAGTACCT TTCTACCACT 180 TTAGCAAATA AACATGCCAG CCAAGTCCTG AGCTCACCAT GTCCAAACCA GCCTGGCGAC 240 CATGCCATGC CACCAGTGCC GGGGAGCAGC GCACCCAACA GCCCTATGGC TATGCTCACT 300 CTTAACTCCA ACTGTGAAAA AGAGGCATTT TATAAGTTTG AGGAGCAGAG CAGGGCAGAG 360 AGTGAGTGCC CAGGTATGAA CACGCACTCT CGAGCGTCGT GCATGCAGAT GGATGATGTA 420 ATTGATGACA TCATCAGCCT GGAATCAAGT TATAATGAAG AAATTTTGGG CTTGATGGAT 480 CCGGCCTTGC AAATGGCAAA TACGTTACCC GTCTCTGGAA ACTTGATCGA CCTCTACAGC 540 AACCAGGGCC TGCCACCGCC AGGCCTTACC ATCAGCAACT CCTGTCCAGC CAACCTTCCC 600 AACATAAAAA GGGAGCTCAC AGAGTCTGAA GCAAGAGCAT TGGCTAAAGA GAGGCAGAAA 660 AAGGACAATC ACAACTTGAA TGAACGAAGA AGAAGATTTA ACATAAACGA CCGCATTAAG 720 GAGCTAGGTA CTCTGATCCC CAAGTCAAAT GATCCAGACA TGCGGTGGAA CAAGGGAACC 780 ATTCTCAAGG CCTCTGTGGA CTACATCCGG AAGTTGCAAC GGGAACAGCA ACGAGCTAAG 840 GACCTTGAAA ACCGACAGAA GAAGCTGGAG CATGCGAACC GGCACCTGCT GCTCAGAGTA 900 CAGGAGCTGG AGATGCAGGC TAGAGCGCAT GGACTTTCCC TTATCCCATC CACCGGTCTC 960 TGCTCGCCTG ATCTGGTGAA TCGGATCATC AAGCAAGAAC CAGTTCTTGA GAACTGCAGC 1020 CAGGAACTTG TACAGCACCA GGCAGACCTG ACATGTACGA CAACTCTGGA TCTCACGGAC 1080 GGTACCATCA CCTTTACCAA CAACCTCGGC ACCATGCCGG AGAGCAGCCC GGCCTACAGC 1140 ATCCCCAGGA AGATGGGCTC CAACTTGGAA GACATCCTGA TGGACGATGC CCTCTCACCT 1200 GTTGGAGTCA CCGACCCACT GCTGTCATCA GTGTCGCCAG GAGCTTCAAA AACAAGCAGC 1266 CGGAGGAGCA GTATGAGCGC AGAAGAAACG GAGCATGCGT GTTAG 1305 <210> 15 <211> 115 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> fused protein composing of HisTag-PTD-MITF bHLH-Zip fragment <400> 15 Met Gly Gly Ser His His His His His His Gly Gly Tyr Gly Arg 15 Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Met Leu Ala Lys Glu Arg 30 Gln Lys Lys Asp Asn His Asn Leu Ile Glu Arg Arg Arg Arg Phe 45 Asn Ile Asn Asp Arg Ile Lys Glu Leu Gly Thr Leu Ile Pro Lys 60 Ser Asn Asp Pro Asp Met Arg Trp Asn Lys Gly Thr Ile Leu Lys 75 Ala Ser Val Asp Tyr Ile Arg Lys Leu Gln Arg Glu Gln Gln Arg 90 Ala Lys Asp Leu Glu Asn Arg Gln Lys Lys Leu Glu His Ala Asn 105 Arg His Leu Leu Leu Arg Val Gln Glu Leu * 115 <210> 16 <211> 348 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA coding the fused protein composing of HisTag-PTD-MITF bHLH -Zip fragment <400> 16 ATGGGGGGTT CTCATCATCA TCATCATCAT GGTGGTTATG GCAGGAAGAA GCGGAGACAG 60 CGACGAAGAG GTATGTTGGC TAAAGAGAGG CAGAAAAAGG ACAATCACAA CTTGATTGAA 120 CGAAGAAGAA GATTTAACAT AAACGACCGC ATTAAGGAGC TAGGTACTCT GATCCCCAAG 180 TCAAATGATC CAGACATGCG GTGGAACAAG GGAACCATTC TCAAGGCCTC TGTGGACTAC 240 ATCCGGAAGT TGCAACGGGA ACAGCAACGA GCTAAGGACC TTGAAAACCG ACAGAAGAAG 300 CTGGAGCATG CGAACCGGCA CCTGCTGCTC AGAGTACAGG AGCTGTAG 348 <210> 17 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer M-tat <400> 17 GCGACGAAGA GGTATGCTAG AATACAGTCA CTACC 35 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer tat 3 <400> 18 GGCAGGAAGA AGCGGAGACA GCGACGAAGA GGTATG 36 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer tat 2 <400> 19 ATCATCATCA TGGTGGTTAT GGCAGGAAGA AGCGG 35 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer tat 1 <400> 20 TAAACCATGG GGGGTTCTCA TCATCATCAT CATCATGGTG 40

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の融合蛋白質および当該融合蛋白質を発
現するプラスミドの構造を概略的に示したものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 37/08 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０５ 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 19/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者朝倉栄二大阪府枚方市招提大谷二丁目25番１号ウェルファイド株式会社創薬研究所内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 CA07 DA06 EA04 GA11 HA01 HA03 4C084 AA02 AA07 BA01 BA22 BA23 ZA59 ZB07 ZB13 ZB21 ZB26 4H045 AA10 AA30 BA10 BA41 CA40 DA00 EA20 FA72 FA74 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＰＴＤ（ＰｒｏｔｅｉｎＴｒａｎｓ
ｄｕｃｔｉｏｎＤｏｍａｉｎ）およびＭＩＴＦ（ｍｉ
ｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ）変異体から
構成される融合蛋白質を有効成分とするマスト細胞の細
胞死誘発剤。
【請求項２】融合蛋白質がＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤお
よびＭＩＴＦ変異体から構成される請求項１の細胞死誘
発剤。
【請求項３】有効成分が融合蛋白質を尿素処理後に
尿素を除去して得られたものである請求項１の細胞死誘
発剤。
【請求項４】ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤおよびＭＩＴＦ
変異体から構成される融合蛋白質において、ＭＩＴＦ変
異体がＭＩＴＦのｍｉ変異体、ｗｈ変異体またはｂＨＬ
Ｈ−Ｚｉｐ（ｂａｓｉｃ−ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅ
ｌｉｘ／ｌｅｕｃｉｎｅｚｉｐｐｅｒ）断片であり、
ＰＴＤがＴＡＴ由来ペプチドである、当該融合蛋白質。
【請求項５】融合蛋白質が、配列表配列番号１１、
１３または１５で示されるアミノ酸配列を有する請求項
４の融合蛋白質。