WO2017217556A1 - ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ－３タンパク質を有効成分として含むＴＧＦβ阻害剤 - Google Patents

ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ－３タンパク質を有効成分として含むＴＧＦβ阻害剤 Download PDF

Info

Publication number
WO2017217556A1
WO2017217556A1 PCT/JP2017/022588 JP2017022588W WO2017217556A1 WO 2017217556 A1 WO2017217556 A1 WO 2017217556A1 JP 2017022588 W JP2017022588 W JP 2017022588W WO 2017217556 A1 WO2017217556 A1 WO 2017217556A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tgfβ
protein
reic
cells
dkk
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/022588
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
木下　理恵
二見　淳一郎
裕巳 公文
Original Assignee
桃太郎源株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 桃太郎源株式会社 filed Critical 桃太郎源株式会社
Priority to CN201780035935.5A priority Critical patent/CN109414473A/zh
Priority to US16/310,188 priority patent/US20190330291A1/en
Priority to EP17813449.0A priority patent/EP3485895A4/en
Publication of WO2017217556A1 publication Critical patent/WO2017217556A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a TGF ⁇ inhibitor that attenuates the activity of Transforming Growth Factor ⁇ (TGF ⁇ ) in tissues and organs.
  • TGF ⁇ Transforming Growth Factor ⁇
  • REIC Reduced Expression in Immortalized Cell
  • immune checkpoint inhibitors such as anti-PD-1 antibody, anti-CTLA-4 antibody, and anti-CCR4 antibody that have appeared since 2010 have released the local immune suppression state
  • melanoma and lung cancer it has achieved a life-prolonging effect far exceeding that of chemotherapy.
  • a TGF ⁇ inhibitor comprising, as an active ingredient, a REIC / Dkk-3 protein or a partial protein containing a Cys-rich domain thereof or a DNA encoding the same.
  • a TGF ⁇ inhibitor according to [1] comprising a REIC / Dkk-3 protein or a partial protein containing its Cys-rich domain as an active ingredient, wherein TGF ⁇ is dose-dependent in a concentration range where the working dose is 50 nM or more.
  • TGF ⁇ inhibitor which inhibits the reaction between selenium and its receptor.
  • TGF ⁇ inhibitor according to [3], which does not completely inhibit the reaction between TGF ⁇ and its receptor even when the dose is 375 nM or more.
  • An antitumor immune activator comprising the TGF ⁇ inhibitor according to any one of [1] to [4].
  • a preventive or therapeutic agent for a TGF ⁇ -related disease comprising the TGF ⁇ inhibitor according to any one of [1] to [4].
  • the agent for preventing or treating a TGF ⁇ -related disease according to [6] which acts on immune system cells and inhibits the reaction between TGF ⁇ and its receptor in immune system cells.
  • [8] The agent for preventing or treating a TGF ⁇ -related disease according to [6] or [7], which can reduce side effects due to inhibition of TGF ⁇ by not completely inhibiting the reaction between TGF ⁇ and its receptor. [9] It inhibits the reaction between TGF ⁇ and its receptor in a concentration-dependent manner at a dose of 50 nM or higher, and does not completely inhibit the reaction between TGF ⁇ and its receptor even at a high concentration of 375 nM or higher. [6] A preventive or therapeutic agent for a TGF ⁇ -related disease according to any one of [8]. [10] The preventive or therapeutic agent according to any of [6] to [9], wherein the TGF ⁇ -related disease is cancer and activates antitumor immunity. [11] Prevention of [10], which cancels the immunosuppressed state via regulatory T cells induced by TGF ⁇ secreted from cancer cells, recovers and activates the attack of cancer cells by immune cells Or a therapeutic agent.
  • REIC / Dkk-3 protein binds to the extracellular domains of TGF ⁇ receptors I and II with low affinity, and that a mechanism that competitively inhibits the physiological activity of TGF ⁇ can operate.
  • Ad-REIC gene therapy
  • FIG. 3A shows the binding mode
  • FIG. 3B shows the result of SDS-PAGE.
  • the present invention is a TGF ⁇ (transforming growth factor) inhibitor containing, as an active ingredient, a REIC / Dkk-3 protein or a partial protein thereof, or a DNA encoding them.
  • a TGF ⁇ inhibitor is also referred to as a TGF ⁇ signaling inhibitor.
  • the full-length base sequence of REIC / Dkk-3 DNA (REIC gene) and the amino acid sequence of the protein encoded by the gene are represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
  • SEQ ID NO: 2 a sequence consisting of amino acids 1 to 21 is predicted as a signal sequence.
  • the REIC / Dkk-3 protein has an N-terminal domain, a Cysteine-rich domain, and a C-terminal domain, as shown in FIG.
  • the REIC / Dkk-3 protein (REIC protein) of the present invention may be a full-length protein or a partial protein consisting of a partial region of the REIC / Dkk-3 protein, and at least a Cys-rich domain of the REIC / Dkk-3 protein. It may be a partial protein containing.
  • the Cys-rich domain is a domain having a molecular weight of 17 kD and is the minimum domain responsible for the immune activity of the REIC / Dkk-3 protein.
  • FIG. 8 shows a DNA sequence (SEQ ID NO: 8) and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) used when a Cys-rich domain protein is produced as a recombinant protein.
  • SEQ ID NO: 8 shows a DNA sequence (SEQ ID NO: 8) and an amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) used when a Cys-rich domain protein is produced as a recombinant protein.
  • the part shown in italics is a signal sequence, and APAPTATS underlined thereafter is the sequence to be added.
  • the REIC / Dkk-3 protein of the present invention or a partial protein thereof is the above amino acid sequence, that is, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, or an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence It is a protein having a TGF ⁇ inhibitory action.
  • the substantially identical amino acid sequence one or more or several (1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 or 2) amino acids are included in the amino acid sequence.
  • the purification may be performed by using a purification method used for ordinary proteins, for example, by appropriately selecting and combining ion exchange chromatography, affinity chromatography, gel filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, and the like. be able to.
  • the partial protein of the REIC / Dkk-3 protein of the present invention can be obtained according to the description in WO01 / 038528.
  • the present invention also includes a vector containing REIC / Dkk-3 DNA.
  • the REIC / Dkk-3 protein is expressed in the subject and acts as a TGF ⁇ inhibitor.
  • Introducing a target gene (DNA) into a subject in gene therapy can be performed by a known method.
  • a method for introducing a gene into a subject there are a method using a viral vector and a method using a non-viral vector, and various methods are known (separate volume experimental medicine, basic technology of gene therapy, Yodosha, 1996; separate volume). Experimental Medicine, Gene Transfer & Expression Analysis Experimental Method, Yodosha, 1997; edited by Japanese Society of Gene Therapy, Gene Therapy Research Handbook, NTS, 1999).
  • a method using a viral vector such as adenovirus, adeno-associated virus (AAV), or retrovirus is representative.
  • a viral vector such as adenovirus, adeno-associated virus (AAV), or retrovirus
  • introducing a gene of interest into a DNA virus or RNA virus such as a detoxified retrovirus, herpes virus, vaccinia virus, pox virus, poliovirus, shinbis virus, Sendai virus, SV40, immunodeficiency virus (HIV)
  • a gene into a cell by infecting the cell with a recombinant virus.
  • an adeno-AAV hybrid vector (Recchia, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 96, 2615, 1999) or a transposon gene that has been incorporated into the AAV chromosome is used. Therefore, if an adenovirus vector having the ability to be incorporated into a chromosome is used, it can be applied to long-term gene expression. It is also possible to confer tissue specificity to an adenovirus vector by inserting a peptide sequence showing tissue-specific migration into the H1 loop of adenovirus fiber (Mizuguchi, H. & Hayakawa, T., Nippon Rinsho, 7, 1544, 2000).
  • Ad-REIC an adenovirus vector containing REIC / Dkk-3 DNA
  • the target gene can be introduced into cells and tissues using a recombinant expression vector into which a gene expression vector such as a plasmid vector has been incorporated without using the above virus.
  • the gene can be introduced into cells by lipofection method, phosphate-calcium coprecipitation method, DEAE-dextran method, direct DNA injection method using a micro glass tube.
  • gene transfer method by internal liposome internal liposome
  • gene transfer method by electrostatic liposome electrostatic type liposome
  • HVJ-liposome method improved HVJ-liposome method
  • HVJ-E Envelope vector method
  • receptor-mediated gene introduction method method of transferring DNA molecule together with carrier (metal particle) with particle gun
  • naked-DNA direct introduction method introduction method with various polymers, etc.
  • any expression vector can be used as long as it can express the target gene in vivo.
  • pCAGGS Gene 108, 193-200 (1991)
  • pBK -Expression vectors such as CMV, pcDNA3, 1, pZeoSV (Invitrogen, Stratagene), and pVAX1.
  • a vector containing REIC / Dkk-3 DNA may contain a promoter or enhancer for appropriately transcribed genes, a poly A signal, a marker gene for labeling and / or selecting a cell into which the gene has been introduced, and the like.
  • a promoter in this case, a known promoter can be used.
  • the REIC / Dkk-3 protein or a partial protein thereof binds to the TGF ⁇ receptor and inhibits TGF ⁇ binding to the TGF ⁇ receptor. As a result, signal transduction from TGF ⁇ is suppressed.
  • the TGF ⁇ receptor to which REIC / Dkk-3 protein binds includes both type I receptor (TGF ⁇ RI) and type II receptor (TGF ⁇ RII).
  • TGF ⁇ inhibitor containing REIC / Dkk-3 protein or a partial protein thereof or DNA encoding them as an active ingredient can be used for the prevention or treatment of TGF ⁇ -related diseases.
  • TGF ⁇ -related diseases refer to diseases caused by abnormal TGF ⁇ signaling
  • TGF ⁇ inhibitors containing REIC / Dkk-3 protein or a partial protein thereof or DNA encoding them as an active ingredient are TGF ⁇ receptors for TGF ⁇ . Inhibiting binding to the body normalizes TGF ⁇ signaling and enables prevention or treatment of TGF ⁇ -related diseases.
  • Cancer may be mentioned as a TGF ⁇ related disease.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention includes REIC / Dkk-3 protein or a partial protein thereof or DNA encoding them, and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • the prophylactic or therapeutic agent for TGF ⁇ -related diseases can be administered in various forms, such as oral administration by tablet, capsule, granule, powder, syrup, etc., or injection (subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, Parenteral administration such as intraperitoneal injection), drops, suppositories, sprays, eye drops, nasal administration, transdermal administration, transmucosal administration, pulmonary administration, patches, and the like.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention includes a carrier, a diluent, and an excipient that are usually used in the pharmaceutical field.
  • lactose and magnesium stearate are used as carriers and excipients for tablets.
  • aqueous solution for injection isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants are used, and suitable solubilizers such as polyalcohols such as alcohol and propylene glycol, nonionic surfactants, etc. You may use together.
  • As the oily liquid, sesame oil, soybean oil and the like are used, and as a solubilizing agent, benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination.
  • the dose varies depending on symptoms, age, body weight, etc., but may be administered by subcutaneous injection, intramuscular injection, or intravenous injection at a dose of 0.001 mg to 100 mg once every several days, weeks or months.
  • a vector containing REIC / Dkk-3 DNA for example, a vector of 10 7 to 10 9 pfu (plaque forming unit) may be administered.
  • REIC / Dkk-3 protein inhibits the reaction between TGF ⁇ and its receptor in a concentration-dependent manner in a concentration range of 40 nM or more, preferably 50 nM or more. Therefore, an amount that results in a blood concentration of 40 nM or more, preferably 50 nM or more when administered is sufficient. Since REIC / Dkk-3 protein does not completely inhibit the reaction between TGF ⁇ and its receptor even at a high dose, for example, 375 nM or more, side effects due to strong inhibition of TGF ⁇ can be reduced.
  • the preventive or therapeutic agent of the present invention exerts preventive and therapeutic effects on TGF ⁇ -related diseases, particularly cancer, even when administered alone. Furthermore, when used for prevention or treatment of cancer, it can be used as a single agent as an immune checkpoint inhibitor, or can be used in combination with other immune checkpoint inhibitors.
  • the combined use of this drug and an immune checkpoint inhibitor is expected to have a strong preventive or therapeutic effect due to the double induction of anticancer action.
  • the combined use with an existing immune checkpoint inhibitor increases the possibility of releasing a strong immune checkpoint at the tumor site, and increases the possibility of a significant improvement in the success rate of cancer immunotherapy with high QOL.
  • the administration method may be any gene therapy for forcibly expressing the REIC protein, or any method of administering the REIC protein preparation.
  • immune checkpoint inhibitors include anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-CCR4 antibody and the like.
  • the culture supernatant was mixed with REIC-immobilized magnetic beads at room temperature to collect molecules that bind to the beads.
  • Molecules bound on the magnetic beads were eluted with Glycine / hydrochloric acid (pH 2.9), and fractions containing REIC binding protein were collected.
  • the collected sample was reacted with proteolytic enzyme: trypsin, the digested fragment was analyzed by HPLC / QTOF mass spectrometry, and the protein contained in the sample was identified in the MASCOT database. This list did not contain any components that showed significant binding, but the TGF ⁇ type I receptor extracellular domain (TGF ⁇ RI-ECD) was included in the list of candidate molecules in which partial fragments were detected. It was confirmed. 2.
  • REIC proteins include FL-REIC (SGE-REIC), which secretes and expresses full-length REIC, REIC C domain (SGE-REIC-C) lacking 120 amino acids at the N-terminus, and REIC-17kDa (SGE) containing only the Cys-rich domain. -REIC-17kDa) were used.
  • the italicized part is a secretion signal
  • the underlined part is a TGF ⁇ RI-ECD part.
  • HisTag HHHHHH
  • the REIC protein may be REIC 17 kDa, which is the minimum domain responsible for immune activity. 4.
  • TGF ⁇ RI-Fc and TFG ⁇ RII-Fc co-expression system In various experimental processes, TGF ⁇ RI-ECD has a problem of low stability, and human immunoglobulin G (IgG) A protein production system was constructed by fusing TGF ⁇ RI-ECD to the N-terminal side of the Fc region. At the same time, expression plasmid DNA vectors for Fc fusion proteins to which TGF ⁇ RII-ECD (Uniprot: P37173) and HAtag were respectively added were prepared.
  • the wells were washed 3 times with 100 ⁇ L of ⁇ 1 PBS-T, and 100 ⁇ L of Biotinylated REIC polyclonal antibody was diluted 1000 times and added to each well, and allowed to stand at room temperature for 1 hour.
  • the wells were washed 3 times with 100 ⁇ L of PBS-T1, Streptavidin-HRP was diluted 5000 times, 100 ⁇ L was added to each well, and allowed to stand at room temperature for 1 hour. Wash wells 3 times with 100 ⁇ L x 1 PBS-T, add 100 ⁇ L of coloring solution to each well, add 50 ⁇ L of stop solution to each well when the color is moderate, and stop the coloring reaction. Colorimetric measurements were performed at the wavelength (FIG. 5).
  • FIG. 6 shows the Western Blotting image and the intensity of the phosphorylated Smad2 band (lower graph). From this result, it was confirmed that the signal transduction in EL4 cells by TGF ⁇ stimulation was attenuated by the addition of REIC protein. 7.
  • TF-1 cells are cultured cells that proliferate in a proliferative cytokine-dependent manner, and it is known that growth inhibitory activity is confirmed when TGF ⁇ , an inhibitory cytokine, is added.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

本発明は、TGFβのシグナル伝達を阻害することによりTGFβ関連疾患を予防又は治療する医薬の提供を目的とする、REIC/Dkk-3タンパク質若しくはそのCys-richドメインを含む部分タンパク質又はそれらをコードするDNAを有効成分として含むTGFβ阻害剤、及び該TGFβ阻害剤を含むTGFβ関連疾患の予防又は治療剤である。

Description

ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ－３タンパク質を有効成分として含むＴＧＦβ阻害剤
　本発明は、組織・臓器でTransforming Growth Factor β（TGFβ）の活性を減弱させるTGFβ阻害剤に関し、TGFβを阻害することでTGFβ関連疾患の病態を改善することができる。
　ヒトの多くの正常組織で普遍的に発現している分泌タンパク質であるREICは、多くのがん細胞で発現が喪失しており、その発見経緯から2000年にReduced Expression in Immortalized Cell(REIC)と命名されている。さらに構造的な特徴からDickkopf（Dkk）ファミリーに属し一般名はREIC/Dkk-3と呼ばれる。このREIC/Dkk-3タンパク質を強制発現させるアデノウイルスベクター（Ad-REIC）をがん細胞に感染させると、がん細胞内で小胞体ストレスに伴うアポトーシスが誘導される。このアポトーシス誘導はがん細胞に特異的であり、正常細胞では確認されない現象であることから、がんに対する遺伝子治療の臨床研究が開始され、現在、有効性と安全性が確認されつつある状況である。一方で、細胞外に分泌されるREICタンパク質の機能はまだ未解明な点が多かった。2008年にこのREICタンパク質が血液中の単球から樹状細胞様の分化を誘導することが発見され、この活性が抗がん免疫活性を高めていることが判明した（特許文献１参照）。また、2010年にはこれらの抗がん免疫活性の誘導が、REICタンパク質中の分子量17kDaのCys-richドメインに集中していることを発見し（特許文献２参照）、REICタンパク質の薬効成分の最小ドメインが見出された。
　近年、腫瘍免疫学研究が進展し、2010年以降に登場した抗PD-1抗体、抗CTLA-4抗体、抗CCR4抗体等の「免疫チェックポイント阻害剤」が腫瘍局所の免疫抑制状態を解除し、メラノーマや肺がんに対する臨床治験で、化学療法を大幅に上回る延命効果を達成している。
　腫瘍局所の免疫抑制状態を解除し、腫瘍免疫応答を再活性化する治療が、QOLの高いがん治療の選択肢として今後の柱となることは確実である。一部の予測では、今後10年間で進行がん患者の60％に免疫チェックポイント阻害剤が投与されると見込まれている（非特許文献１参照）。しかし、先行する免疫チェックポイント阻害剤（抗PD-1抗体）の奏効率は20～30％とされ、複数の免疫抑制分子が関わる腫瘍局所では、複数の作用点を同時に遮断するバイオ医薬品の併用により、さらなる奏効率の改善が期待されている。
　分泌タンパク質であるTGFβは多彩な生理活性を発現するが、腫瘍局所ではがん細胞などから分泌されるTGFβにより制御性T細胞（Treg細胞）が誘導されて、免疫抑制状態を誘導していることが知られている。
WO2009/119874 WO2012/002582
Ledford H. Nature 508,7494, 24-26 (2014)
　本発明は、TGFβのシグナル伝達を阻害することによりTGFβ関連疾患を予防又は治療する医薬の提供を目的とする。特に、TGFβ受容体に結合し、TGFβによるTreg誘導活性を抑制していることで抗がん免疫活性を回復・活性化することができる医薬の提供を目的とする。
　本発明者らは、REIC/Dkk-3タンパク質が細胞外で相互作用する物質を探索した。その結果、REIC/Dkk-3タンパク質が相互作用する分子としてTGFβ受容体を特定した。細胞外に分泌するREIC/Dkk-3タンパク質の相互作用分子の同定、作用メカニズムの解明は長年の課題であった。本発明者らは組換えタンパク質を大量生産して、低親和性の相互作用でも検出しうる評価系を構築したことで、標的分子の同定と検証に成功した。本発明者らは、TGFβの機能からREIC/Dkk-3タンパク質が、TGFβがTGFβ受容体に結合するのを抑制し、TGFβのシグナル伝達を阻害することを見出した。この知見は、REIC/Dkk-3が、腫瘍局所の免疫抑制状態を解除して、腫瘍免疫応答を回復・活性化するがん免疫治療薬として利用できることを示している。すなわちREIC/Dkk-3タンパク質はTGFβ受容体に結合して、TGFβによる制御性Ｔ細胞（Treg）誘導活性を抑制することにより抗がん免疫活性を回復・活性化することができる。この様なREICタンパク質が示す抗がん免疫活性の活性化は、免疫チェックポイント阻害剤と同様の作用であり、REIC/Dkk-3が、がんの予防又は治療に用い得るタンパク質製剤としても極めて有望な分子であることを示している。
　また、本発明者らはREIC/Dkk-3はTGFβのシグナル伝達を阻害することにより、TGFβ関連疾患の予防又は治療に用い得ることを見出した。
　本発明に基づくREICタンパク質の用途としては次のようなものが挙げられる。
（１）　腫瘍局所の免疫抑制状態を解除する免疫調整剤。既存の免疫チェックポイント阻害剤との併用により、がん免疫治療を改善する。
（２）　アデノウイルスベクターを用いたREIC/Dkk-3遺伝子治療であるAd-REIC治療で成功している作用機序は、Ad-REICによるアポトーシス誘導に伴い、がん抗原が露出する「プライミング効果」と、分泌されたREICタンパク質により腫瘍局所で樹状細胞等が活性化され、腫瘍免疫応答が活性化する「ブースター効果」との相乗効果である。後者のブースター効果の発現において、TGFβのシグナル伝達の阻害による制御性Ｔ細胞（Treg）誘導抑制が関与するメカニズムが解明されたため、がん抗原を露出させるプライミング作用を既存の抗がん剤や放射線治療等に置き換えて、かつ、後者のブースター効果をREICタンパク質製剤で置き換えることが可能となり、がん治療の選択の幅が拡張する。
（３）　TGFβの多彩な機能は、がんのみならず、臓器又は組織の線維化など様々な疾患と相関している。TGFβの活性を穏やかに抑制するREICの効果は、様々な病態の改善につながる可能性があり、重要な創薬ターゲットである。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]　REIC/Dkk-3タンパク質若しくはそのCys-richドメインを含む部分タンパク質又はそれらをコードするDNAを有効成分として含むTGFβ阻害剤。
[２]　REIC/Dkk-3タンパク質又はそのCys-richドメインを含む部分タンパク質を有効成分として含む[１]のTGFβ阻害剤であって、作用用量が50nM以上の濃度領域において、濃度依存的にTGFβとその受容体との反応を阻害する、[１]のTGFβ阻害剤。
[３]　作用用量が高用量でも、TGFβとその受容体との反応を完全には阻害しない、[１]又は[２]のTGFβ阻害剤。
[４]　作用用量が375nM以上でも、TGFβとその受容体との反応を完全には阻害しない、[３]のTGFβ阻害剤。
[５]　[１]～[４]のいずれかのTGFβ阻害剤を含む、抗腫瘍免疫活性化剤。
[６]　[１]～[４]のいずれかのTGFβ阻害剤を含む、TGFβ関連疾患の予防又は治療剤。
[７]　免疫系細胞に作用し、免疫系細胞におけるTGFβとその受容体との反応を阻害する、[６]のTGFβ関連疾患の予防又は治療剤。
[８]　TGFβとその受容体との反応を完全には阻害しないことにより、TGFβの阻害による副作用を低減することができる、[６]又は[７]のTGFβ関連疾患の予防又は治療剤。
[９]　作用用量が50nM以上の濃度において濃度依存的にTGFβとその受容体との反応を阻害し、かつ375nM以上の高濃度においてもTGFβとその受容体との反応を完全には阻害しない、[６]～[８]のいずれかのTGFβ関連疾患の予防又は治療剤。
[１０]　TGFβ関連疾患ががんであり、抗腫瘍免疫を活性化する、[６]～[９]のいずれかの予防又は治療剤。
[１１]　がん細胞から分泌されたTGFβにより誘導された制御性Ｔ細胞を介した免疫抑制状態を解除し、免疫細胞によるがん細胞への攻撃を回復させ活性化させる、[１０]の予防又は治療剤。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2016-121187号の開示内容を包含する。
　REIC/Dkk-3タンパク質はTGFβ受容体IとIIの細胞外ドメインと低親和性で結合し、またTGFβの生理活性を競合阻害する機構が作動し得ることが結論付けられた。既に遺伝子治療法（Ad-REIC）で臨床開発が進んでいるREIC創薬の合理性が再確認されたほか、抗がん免疫作用の全容が明らかになり、タンパク質製剤として応用が可能である。既存の免疫チェックポイント阻害剤との併用や、既存の抗がん剤、放射線治療等と組み合せることで、腫瘍免疫応答を回復・活性化し、より効果的ながん免疫治療が実現できる。
REIC/Dkk-3タンパク質の構造模式図を示す図である。 TGFβRI-ECDの塩基配列及びアミノ酸配列を示す図である。図中、イタリック体で表す部分は分泌シグナル配列を示し、下線部はTGFβRI-ECDの配列を示す。C末端側にはHisTagが付加されている。 TGFβRIとFL-REIC、REIC-C domain若しくはCys-richドメインタンパク質（REIC-17KDa）との共発現系による結合実験の結果を示す図である。図３Ａは結合様式を示し、図３ＢはSDS-PAGEの結果を示す。 REIC/Dkk-3タンパク質とTGFβRI-Fc若しくはTGFβRII-Fcの共発現系による結合実験の結果を示す図である。 ELISAにより行ったREICタンパク質とTGFβRI-Fc若しくはTGFβRII-FCの結合実験の結果を示す図である。 REIC/Dkk-3タンパク質によるEL4細胞に対するTGFβシグナルの競合阻害実験の結果を示す図である。 REIC/Dkk-3タンパク質による免疫制御因子TGFβの競合阻害を確認するバイオアッセイの結果を示す図である。 Cys-richドメインタンパク質を組換えタンパク質として用いるときに用いるDNA配列及びそのアミノ酸配列を示す図である。 REIC/Dkk-3タンパク質によるEL-4細胞及びヒトfibroblastに対するTGFβシグナルの競合阻害実験の結果を示す図である。 REICタンパク質によりTGFβ経路の阻害効果（レポーター遺伝子による効果）を示す図である。 各添加濃度のREICタンパク質によりTGFβ経路の阻害効果（レポーター遺伝子による効果）を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、REIC/Dkk-3タンパク質若しくはその部分タンパク質、又はそれらをコードするDNAを有効成分として含むTGFβ（トランスフォーミング増殖因子）阻害剤である。TGFβ阻害剤をTGFβシグナル伝達阻害剤ともいう。
　REIC/Dkk-3 DNA（REIC遺伝子）の全長塩基配列及び該遺伝子のコードするタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２に表される。配列番号２に表すアミノ酸配列中、１番から21番のアミノ酸からなる配列がシグナル配列と予測される。
　REIC/Dkk-3タンパク質は、図１に示すように、N末端ドメイン、Cysteine-richドメイン及びC末端ドメインを有する。
　本発明のREIC/Dkk-3タンパク質（REICタンパク質）は全長タンパク質でもよいし、REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域からなる部分タンパク質であって、少なくともREIC/Dkk-3タンパク質のCys-richドメインを含む部分タンパク質であってもよい。Cys-richドメインは、分子量17kDのドメインであり、REIC/Dkk-3タンパク質の免疫活性を担う最少ドメインである。このような部分タンパク質として、Cys-richドメインタンパク質（REIC-17kDa(SGE-REIC-17kDa)）や全長REIC/Dkk-3タンパク質からN末端の120アミノ酸を欠損させた部分タンパク質（（REIC C domain(SGE-REIC-C)）が挙げられる。Cys-richドメインタンパク質は、配列番号２に表すREIC/Dkk-3タンパク質のアミノ酸配列の第135番目から第288番目のアミノ酸配列からなる領域である。Cys-richドメインタンパク質をコードするDNAの塩基配列を配列番号３に、アミノ酸配列を配列番号４に表す。また、全長REIC/Dkk-3タンパク質からN末端の120アミノ酸を欠損させた部分タンパク質は配列番号２に表すREIC/Dkk-3タンパク質のアミノ酸配列の第142番目から第350番目のアミノ酸配列からなる領域である。全長REIC/Dkk-3タンパク質からN末端の120アミノ酸を欠損させた部分タンパク質をコードするDNAの塩基配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に表す。
　実際に部分タンパク質を組換えタンパク質として作製するときは、REIC/Dkk-3のN末端のシグナル配列が連結した状態でタンパク質を合成し、宿主細胞から分泌させている。この際、プロセッシングによる分泌シグナルの切断部位の下流に数個のアミノ酸を残して設計するので、作製する部分タンパク質のN末端側には、配列番号２に表すREIC/Dkk-3全長タンパク質のシグナルペプチドのC末端側のアミノ酸が付加されている。付加されるタンパク質として例えばAPAPTATS（配列番号７）が挙げられる。例えば、図８にCys-richドメインタンパク質を組換えタンパク質として作製するときに用いるDNA配列（配列番号８）及びそのアミノ酸配列（配列番号９）を示す。図８中、イタリック体で表す部分はシグナル配列であり、その後の下線を引いたAPAPTATSが上記の付加される配列である。
　本発明のREIC/Dkk-3タンパク質又はその部分タンパク質は、上記のアミノ酸配列、すなわち配列番号２、配列番号４又は配列番号６に表されるアミノ酸配列あるいは該アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、TGFβ阻害作用を有するタンパク質である。ここで、実質的に同一のアミノ酸配列としては、当該アミノ酸配列に対して1又は複数若しくは数個(1～10個、好ましくは1～5個、さらに好ましくは1個若しくは2個)のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列、及びBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の同一性を有しているものが挙げられる。
　また、本発明のREIC/Dkk-3タンパク質若しくはその部分タンパク質をコードするDNAは、配列番号１、配列番号３又は配列番号５に表される塩基配列とBLAST（Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも85％以上、好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上の同一性を有しているDNA、又は前記DNAによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して1又は複数若しくは数個(1～10個、好ましくは1～5個、さらに好ましくは1個若しくは2個)のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAであって、TGFβ阻害作用を有するタンパク質をコードするものである。
　REIC/Dkk-3タンパク質又はその部分タンパク質は、上記の配列情報に基づいて、化学合成により得ることができる。また、遺伝子工学的手法により組換えタンパク質として得ることができる。すなわち、本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分タンパク質をコードするDNAを適当なベクターに導入し、該ベクターを宿主中に挿入し、該宿主を培養し、培養物からポリペプチドを得ればよい。本発明のDNAを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドDNA、ファージDNA等が挙げられ、公知のものを用いることができる。この際、宿主としては真核細胞又は原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立されたヒト、げっ歯類などの哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞及び酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。本発明のREIC/Dkk-3タンパク質又はその部分タンパク質をコードするDNAを含む宿主細胞をin vitro又はin vivoで培養して細該宿主を公知の方法で培養することにより、培養物からREIC/Dkk-3タンパク質又はその部分タンパク質を得ることができる。ここで、「培養物」とは、培養上清、あるいは培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味する。発現、産生されたタンパク質は、前記培養物から精製することができる。精製は、通常のタンパク質で使用されている精製方法を用いればよく、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより精製することができる。さらに、本発明のREIC/Dkk-3タンパク質の部分タンパク質はWO01/038528号公報の記載に従って得ることも可能である。
　REIC/Dkk-3 DNAは、配列番号１、３又は５の配列情報に基づいて、ヒト細胞、ヒト組織等から得ることができる。また、WO01/038528号公報の記載に従って得ることも可能である。
　さらに、本発明はREIC/Dkk-3 DNAを含むベクターをも包含する。該ベクターを被験体に導入することにより、被験体体内でREIC/Dkk-3タンパク質が発現しTGFβ阻害剤として作用する。
　遺伝子治療における目的の遺伝子（DNA)の被験体への導入は公知の方法により行うことができる。遺伝子を被験体へ導入する方法として、ウイルスベクターを用いる方法及び非ウイルスベクターを用いる方法があり、種々の方法が公知である(別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、1996；別冊実験医学、遺伝子導入&発現解析実験法、羊土社、1997；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、1999)。
　遺伝子導入のためのウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。無毒化したレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、SV40、免疫不全症ウイルス(HIV)等のDNAウイルス又はRNAウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
　本発明に係る遺伝子をウイルスを用いた遺伝子治療に使用するとき、アデノウイルスベクターが好ましく用いられる。アデノウイルスベクターの特徴として、（１）多くの種類の細胞に遺伝子導入ができる、（２）増殖停止期の細胞に対しても効率よく遺伝子導入ができる、（３）遠心により濃縮が可能であり、高タイター（1010～1011PFU/ml以上）のウイルスが得られる、（４）in vivoの組織細胞への直接の遺伝子導入に適している、といった点が挙げられる。遺伝子治療用のアデノウイルスとしては、E1/E3領域を欠失させた第１世代のアデノウイルスベクター(Miyake,S.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,93,1320,1996)から、E1/E3領域に加え、E2若しくはE4領域を欠失させた第２世代のアデノウイルスベクター(Lieber,A.,et al.,J.Virol.,70,8944,1996;Mizuguchi,H.&Kay,M.A.,Hum.Gene Ther.,10,2013,1999)、アデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた(GUTLESS)第３世代のアデノウイルスベクター(Steinwaerder,D.S.,et al.,J.Virol.,73,9303,1999)が開発されているが、本発明に係る遺伝子を導入するには、特に限定されず、いずれのアデノウイルスベクターでも使用可能である。さらに、AAVの染色体に組み込み能を付与したアデノ-AAVハイブリッドベクター(Recchia,A.,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,96,2615,1999)や、トランスポゾンの遺伝子を用いることにより染色体に組み込む能力を有したアデノウイルスベクターなどを利用すれば、長期的な遺伝子発現にも応用が可能である。また、アデノウイルスファイバーのH1ループに組織特異的な移行性を示すペプチド配列を挿入することにより、アデノウイルスベクターに組織特異性を付与することも可能である(Mizuguchi,H.&Hayakawa,T.,Nippon Rinsho,7,1544,2000)。
　本発明において、REIC/Dkk-3 DNAを含むアデノウイルスベクターをAd-REICと呼ぶ。
　また、上記ウイルスを用いることなく、プラスミドベクター等の遺伝子発現ベクターが組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。例えば、リポフェクション法、リン酸-カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、微小ガラス管を用いたDNAの直接注入法などにより細胞内へ遺伝子を導入することができる。また、内包型リポソーム(internal liposome)による遺伝子導入法、静電気型リポソーム(electorostatic type liposome)による遺伝子導入法、HVJ-リポソーム法、改良型HVJ-リポソーム法(HVJ-AVEリポソーム法)、HVJ-E(エンベロープ)ベクターを用いた方法、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体(金属粒子)とともにDNA分子を細胞に移入する方法、naked-DNAの直接導入法、種々のポリマーによる導入法等によっても、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。この場合に用いる発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターも用いることができるが、例えばpCAGGS（Gene 108, 193-200(1991)）や、pBK-CMV、pcDNA3、1、pZeoSV(インビトロゲン社、ストラタジーン社)、pVAX1などの発現ベクターが挙げられる。
　REIC/Dkk-3 DNAを含むベクターは、適宜遺伝子を転写するためのプロモーターやエンハンサー、ポリAシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識及び／又は選別のためのマーカー遺伝子等を含んでいてもよい。この際のプロモーターとしては、公知のプロモーターを用いることができる。
　本発明のREIC/Dkk-3 DNAを含むベクターを被験体へ導入するには、遺伝子治療剤を直接体内に導入するin vivo法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すex vivo法等を用いればよい(日経サイエンス、1994年4月号、20-45頁;月刊薬事、36(1), 23-48 (1994); 実験医学増刊、12(15)、1994; 日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、1999)。
　上記のREIC/Dkk-3タンパク質又はその部分タンパク質は、TGFβ受容体に結合し、TGFβ受容体にTGFβが結合するのを阻害する。その結果、TGFβからのシグナル伝達を抑制する。
　TGFβは、細胞の増殖や分化、アポトーシス、造血、骨の発達、細胞外基質形成、免疫反応、炎症反応、臓器や組織の線維化等に関与している多機能性のサイトカインである。TGFβはその機能を介してがん、線維化、神経疾患、リウマチ、アレルギー疾患、動脈硬化等の種々の疾患の病態形成に関与している。また、腫瘍局所においては、がん細胞からTGFβが分泌され制御性Ｔ細胞（Treg細胞）が誘導され、免疫抑制状態が誘導される。その結果、がん細胞に対する免疫細胞による攻撃が抑制される。REIC/Dkk-3タンパク質はTGFβがTGFβ受容体に結合するのを阻害し、その結果、免疫抑制状態を誘導するTGFβからのシグナル伝達経路を抑制することで腫瘍局所の抑制性免疫細胞が減少して腫瘍免疫応答が回復し、免疫抑制状態を解除し、免疫細胞によるがん細胞への攻撃を回復、活性化させる。すなわち、REIC/Dkk-3タンパク質は、主に免疫系細胞に作用し、免疫系細胞におけるTGFβとその受容体との反応を阻害する。
　REIC/Dkk-3タンパク質は、Ｔリンパ球様細胞等の免疫系の細胞において作用し、線維芽細胞等のその他の細胞には作用しない。
　REIC/Dkk-3タンパク質は高濃度領域でもTGFβの活性を完全遮断できないが、免疫系に対して選択的な抑制効果を示す。すなわちREICタンパク質は免疫系に選択的にTGFβ活性を減弱することができ、腫瘍局所での抗腫瘍免疫活性を穏やかに活性化する免疫調整剤として用い得る。多彩な生理機能に関与するTGFβを強く阻害する薬剤では副作用が懸念されているが、REICは低親和性かつ免疫系特異的にTGFβ活性を減弱できるため、TGFβを阻害することによる副作用を低減しつつ、がん治療に理想的な腫瘍免疫応答の活性化状態を誘導できる。
　REIC/Dkk-3タンパク質が結合するTGFβ受容体は、I型受容体（TGFβ RI）及びII型受容体（TGFβ RII）どちらも含む。
　REIC/Dkk-3タンパク質若しくはその部分タンパク質又はそれらをコードするDNAを有効成分として含むTGFβ阻害剤は、TGFβ関連疾患の予防又は治療に用いることができる。ここで、TGFβ関連疾患とは、TGFβシグナル伝達の異常により引き起こされる疾患をいい、REIC/Dkk-3タンパク質若しくはその部分タンパク質又はそれらをコードするDNAを有効成分として含むTGFβ阻害剤はTGFβのTGFβ受容体への結合を阻害することによりTGFβシグナル伝達を正常にし、TGFβ関連疾患の予防又は治療を可能にする。
　TGFβ関連疾患としては、がんが挙げられる。
　本発明のTGFβ阻害剤の予防又は治療対象となるがんとしては、脳・神経腫瘍、皮膚がん、胃がん、肺がん、肝がん、リンパ腫・白血病、結腸がん、膵がん、肛門・直腸がん、食道がん、子宮がん、乳がん、副腎がん、腎がん、腎盂尿管がん、膀胱がん、前立腺がん、尿道がん、陰茎がん、精巣がん、骨・骨肉腫、多発性骨髄腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等の固形がん、血液がんが挙げられる。
　本発明の予防又は治療剤は、REIC/Dkk-3タンパク質若しくはその部分タンパク質又はそれらをコードするDNA、並びに薬理学的に許容され得る担体、希釈剤若しくは賦形剤を含む。TGFβ関連疾患の予防又は治療剤は、種々の形態で投与することができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、点滴剤、座薬、スプレー剤、点眼剤、経鼻投与剤、経皮投与剤、経粘膜投与剤、経肺投与剤、貼付剤などによる非経口投与を挙げることができる。
　本発明の予防又は治療剤は、注射等により全身投与してもよく、また、局所投与することも可能である。例えば、がん部位に注射により投与することによりその効果を発揮し得る。
　本発明の予防又は治療剤は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
　その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、数日又は数週間又は数ヶ月おきに１回あたり、0.001mg～100mgを皮下注射、筋肉注射、又は静脈注射によって投与すればよい。また、REIC/Dkk-3 DNAを含むベクターを用いる場合、例えば107～109pfu(plaque forming unit)のベクターを投与すればよい。
　in vitroの検討により、REIC/Dkk-3タンパク質が40nM以上、好ましくは50nM以上の濃度領域において、濃度依存的にTGFβとその受容体との反応を阻害する。従って、投与した時の血中濃度が40nM以上、好ましくは50nM以上になる量を投与すればよい。なお、REIC/Dkk-3タンパク質は高用量、例えば、375nM以上でもTGFβとその受容体の反応を完全に阻害することはないので、TGFβを強く阻害することによる副作用を低減することができる。
　REIC/Dkk-3タンパク質は毒性等の副作用は観察されておらず、REIC/Dkk-3タンパク質の大量投与は安全性が高く期待されている。
　本発明の予防又は治療剤は、単剤投与でもTGFβ関連疾患、特にがんの予防及び治療効果を発揮する。さらに、がんの予防又は治療に用いるときは、免疫チェックポイント阻害剤としての単剤での利用、又は他の免疫チェックポイント阻害剤との併用が可能である。本剤と免疫チェックポイント阻害剤との併用により抗がん作用が２重に誘導され強い予防又は治療効果が期待される。特に、既存の免疫チェックポイント阻害剤との併用は、腫瘍局所の強固な免疫チェックポイントを解除できる可能性が高まり、QOLの高いがん免疫治療の奏功率の大幅改善の可能性が高まる。投与方法はREICタンパク質を強制発現させる遺伝子治療、又はREICタンパク質製剤を投与する何れの方法でも良い。免疫チェックポイント阻害剤としては、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体、抗CCR4抗体等が挙げられる。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
1.　REICタンパク質へ結合するタンパク質の探索
　全長のREICタンパク質をFreeStyle293細胞を宿主とした分泌発現系で生産し、イオン交換クロマトグラフィーを用いて高純度に分離精製した。このサンプルをNHS Mag Sepharose(GEヘルスケア)と混合しREIC固定化磁気ビーズを調製した。次に、市販のCD14陽性ヒト末梢血単球(Lonza)に、GM-CSF(10ng/mL)とIL-4(10ng/mL)を同時に添加し、樹状細胞様細胞に分化誘導して6日間培養した。この培養上清を、REIC固定化磁気ビーズと常温で混合してビーズ上に結合する分子を収集した。磁気ビーズ上に結合した分子はGlycine/塩酸(pH2.9)で溶出し、REIC結合タンパク質を含む画分を回収した。この回収サンプルをタンパク質分解酵素：トリプシンと反応させて、その消化断片をHPLC/QTOF質量分析により解析、MASCOTデータベースでサンプルに含まれているタンパク質を同定した。このリスト内には顕著な結合を示す成分は含まれていなかったが、部分断片が検出された候補分子リストの中にTGFβのI型受容体の細胞外ドメイン（TGFβRI-ECD）が含まれることを確認した。
2.　REICタンパク質へ結合するタンパク質の探索
　REICタンパク質とTGFβRI-ECDが結合することを実験的に証明するために、両者の分泌タンパク質の発現プラスミドDNAを準備した。REICタンパク質としては全長REICを分泌発現させるFL-REIC(SGE-REIC)、N末を120アミノ酸欠損させたREIC C domain(SGE-REIC-C)、及びCys-richドメインのみのREIC-17kDa(SGE-REIC-17kDa)の３種類を用いた。一方、TGFβRI-ECDタンパク質はTGFβRI-ECD(SGE-TGFβRI-ECD)、発現量の向上を期待してREICの分泌シグナルを付加したsigREIC-TGFβRI-ECD(SGE-sigREIC-TGFβRI-ECD)の２種類を用いた。図２にTGFβRI-ECDタンパク質の合成に用いたヒトTGFβRI-ECD(Uniprot:P36897)の人工遺伝子のDNA配列（配列番号１０）及びそれをコードするアミノ酸配列（シグナル配列以降、配列番号１１）を表す。アミノ酸配列中、イタリック体で表す部分は分泌シグナルであり、下線を引いた部分はTGFβRI-ECD部分である。C末端側にはHisTag（HHHHHH)が付加されている。
3.　REICタンパク質とTGFβ-RIの共発現系による結合実験
　各種のREIC及びTGFβ-RI発現プラスミドDNAを用いて、FreeStyle293F細胞に対して遺伝子導入試薬：293Fectinを用いたリポフェクション法で一過的な遺伝子導入を行い、37℃で3日間の振とう培養を行い、その培養上清を回収した。各培養上清1mLに×1 PBSで洗浄したHis Mag Sepharose Ni(GEヘルスケア：磁気ビーズ)を50μLずつ加え、室温で穏やかに1時間混合した。その後、磁石を用いてビーズを回収し、×1 PBSでそれぞれ3回洗浄し、40μLの×1 SDSサンプルバッファー(還元剤入り)をそれぞれ加えることで磁気ビーズに特異的に結合したタンパク質を抽出し、SDS-PAGEによりTGFβRI-ECDと相互作用するタンパク質を解析した（図３）。その結果、TGFβRI-ECDと各種REICを共発現させると、バンド強度でおよそ1：1の強度になるような複合体がNi2+-Affinity磁気ビーズ上に濃縮されることが確認され、両者が複合体形成をすることが確認された。また、この際にREICタンパク質は免疫活性を担う最小ドメインとなるREIC 17kDaでも良いことが確認された。
4.　REICタンパク質とTGFβRI-Fc、TFGβRII-Fcの共発現系による結合実験
　種々の実験過程で、TGFβRI-ECDは安定性が低い問題点があり、この改善を目的としてヒトイムノグロブリンG（IgG）のFc領域のN末端側にTGFβRI-ECDを融合したタンパク質生産系を構築した。同時に、TGFβRII-ECD（Uniprot:P37173）及びHAtagをそれぞれ付加したFc融合タンパク質の発現プラスミドDNAベクターを作成した。これらの各遺伝子とFL-REICの発現ベクターを組み合わせてFree Style293細胞にco-transfectionし、培養上清中でREICタンパク質と複合体を形成していることを、Fc領域に結合するProteinGを固定化した磁気ビーズ（ProteinG-Mag Sepharose，GEヘルスケア）を用いてFc融合タンパク質を回収して、抗REIC抗体を用いたWestern Blotting法で確認した（図４）。この結果、REICタンパク質はTGFβRI-ECDに結合していることが確認されたほか、TGFβRII-ECDにも結合することが確認された。一方でHA-tagを付加したFcタンパク質はREICと結合しないことから、REICタンパク質とTGFβRI-ECD及びTGFβRII-ECDがそれぞれREICタンパク質と特異的に結合することが確認された。
5.　REICタンパク質とTGFβRI-Fc、TFGβRII-Fcの結合実験(ELISA法)
　TGFβRI-ECD-Fc及びTGFβRII-ECD-Fcタンパク質をそれぞれ組換えタンパク質として分泌発現・精製し、96wellのELISAプレート上に2.5μg/mLの濃度で100μLずつ添加し4℃で一晩静置して固定化した。×1 PBS100μLでウェルを3回洗浄し、ブロッキングワン（ナカライ）を各ウェルに200μLずつ添加し、室温で1時間静置した。100μLの×1 PBS-Tでウェルを3回洗浄した後、×1 PBS-T+0.1％BSAで希釈した全長REICを100μLずつ5μMから×1/5に系列希釈を0.32nMまで行ったものを添加し4℃で一晩静置した。
　×1 PBS-T100μLでウェルを3回洗浄し、Biotin化REICポリクローナル抗体を1000倍希釈して各ウェルに100μLずつ添加し、室温で1時間静置した。100μLのPBS-T1でウェルを3回洗浄し、Streptavidin-HRPを5000倍に希釈して各ウェルに100μLずつ添加し、室温で1時間静置した。100μLの×1 PBS-Tでウェルを3回洗浄し、発色液を各ウェルに100μLずつ添加し、程よく色がついたところで停止液を各ウェルに50μLずつ加えて着色反応を停止させ、450nmの波長で比色測定を行った(図５)。この結果、TGFβRI－ECDとREICの結合親和性が、TGFβRII－ECDよりも高めであり、Co-transfection実験（図４）と同じ傾向の結果が得られた。しかし、この結合実験では1μM以上で結合が確認されることから、結合親和性はそれほど高くないことが確認された。
6.　REICタンパク質によるTGFβの阻害能の確認
　マウスTリンパ球由来EL4細胞は、TGFβの刺激により細胞内のSmad2のリン酸化が誘導される。EL4細胞は制御性T細胞(Treg)様の分化が誘導できるモデル系としても知られており（Nat.Immunol.9,194,2007）、TGFβのEL4細胞への細胞内シグナル伝達におけるREICタンパク質の影響を調査した。TGFβタンパク質（和光純薬）は20μg/mLの濃度となる様に4mM HCl + 0.1％ HSAで溶解したものを使用した。6wellプレートを用いてEL4細胞をIMDM培地（Gibco）+10％ FBS中で培養した。培養EL4細胞に添加するREICタンパク質にはFree Style 293細胞で分泌生産させたヒト及びマウスのFL-REICと、より高分子の糖鎖修飾がされるヒト正常線維芽細胞を宿主とした生産系を用いて調製したヒトFL-REICの3種類を使用し、EL4細胞の培養上清に添加して37℃で一晩インキュベートした。REIC処理後の各wellにTGFβを添加し、37℃に10分間静置した。その後上清をそっと取り除き、各ウェルに100μLのLysis Buffer(20mM Hepes pH7.5, 500mM NaCl, 1％ NP-40，プロテアーゼインヒビター(ナカライ)、フォスファターゼインヒビター(ナカライ))を添加し、細胞を回収した。Cell Lysateを超音波破砕処理（Bioruptorを使用）した後、13,000rpm、4℃で10分間遠心分離を行い、上清を回収した。これをSDS-PAGEにより分離した後に、ニトロセルロース膜に転写した。このメンブレンを5％ nonfat dry milkをブロッキング剤として処理した後、Anti-Smad2 phospho抗体(Cell Signaling,1000倍希釈)を用いてWestern Blottingを行った。さらに同じメンブレンを用いてリプロービング処理を行い、Anti-Smad2/3抗体(Cell Signaling, 2000倍希釈)を用いて、各Smad2/3タンパク質を確認した（図６）。図６には、Western Blotting像及びリン酸化Smad2バンドの強度（下のグラフ）を示す。本結果より、REICタンパク質の添加によりTGFβ刺激によるEL4細胞内のシグナル伝達が減弱されることが確認された。
7.　REICタンパク質によるTGFβが誘導する細胞増殖阻害活性の競合阻害
　REICタンパク質がTGFβの活性を減弱させていることをバイオアッセイ系で検証するため、ヒト赤白血病細胞株：TF-1細胞に対する効果で評価した。TF-1細胞は増殖性のサイトカイン依存的に増殖する培養細胞であり、抑制性サイトカインであるTGFβを添加すると増殖阻害活性が確認されることが知られている。本評価実験では、TF-1細胞をRPMI培地+10% FBS + GM-CSF(2ng/mL)で培養し、TF-1細胞をRPMI培地+ 10% FBSで2回洗浄した後、TF-1細胞を96wellプレートの各ウェルに1.0×105cells/mLの濃度で100μL入れ、これに4ng/mLになるようにIL-5を添加した。さらに各WellにヒトFL-REICタンパク質とTGFβを添加し、37℃で2日間培養した。各wellの細胞増殖はCell Counting Kit-8(同仁化学)を用いて比色測定を行い、細胞増殖活性を算定した(図７)。この結果、免疫抑制因子のTGFβ活性がREICタンパク質の共存により減弱することが確認できた。本アッセイでは穏やかな競合効果として確認されているが、３回実施した実験で、いずれも再現性良く同様の結果を取得することに成功した。
８．　REICタンパク質によるTGFβの阻害能の確認
　6-wellプレートに各細胞（EL-4,ヒトfibroblast)細胞を播種し、リコンビナントREICタンパク質を培地中に添加して37℃で18時間静置した。
　TGFβを添加するwellに終濃度1ng/mLとなるようにTGFβを添加し、37℃で10分間静置した。6wellプレートの培地をアスピレーターで吸引除去した後、各wellにProtease inhibitor cocktail(ナカライ)とPhosphatase inhibitor cocktail(ナカライ)を含む100μLのCell lysis buffer(20mM Hepes,pH7.5,500mM NaCl,1％ NP-40)で細胞を溶解した。セルリフターで細胞を回収し1.5mLチューブに移し、Bioruptorにより超音波破砕処理を行い、cell lysateを作製した。Cell lysateを4℃で10分間13,000rpmで遠心分離し、上清を新しいチューブに入れた。そのうち各20μLを、一次抗体にAnti-Smad2/3及びAnti-Smad2/3 phospho-specific抗体（Cell Signaling)を用いてWestern Blotting法により解析を行った。
　結果を図９に示す。図９AがEL4細胞、図９Bがヒトfibroblastの結果を示す。図９には、Western Blotting像及びリン酸化Smad2バンドの強度（右のグラフ）を示す。
　図９の結果より、REICタンパク質は免疫系に対して選択的なTGFβ活性の抑制効果を示すことがわかった。
９．　REICタンパク質によるTGFβ経路の阻害効果（レポーター遺伝子による効果）
（１）EL-4細胞を用いた検討
　各種細胞にTGFβによる刺激に応じて、ルシフェラーゼレポーターを発現するプラスミドである、pGL4.48(Promega)をTransfectionしてルシフェラーゼアッセイを行った。まず、96wellプレートにEL4細胞を～70％confluentとなるように培養しておいた。アスピレーターで血清入りの培地を除き、培地をOpti-MEMに置換した。遺伝子導入試薬Lipofectamine3000（Invitrogen)に添付の手順書に従って、各wellに100ngのpGL4.48DNAをトランスフェクションした。37℃で5％CO2存在下で3時間インキュベートした後、Recombinant REICタンパク質を終濃度50μg/mLまたは100μg/mLとなるように添加し、37℃で5％CO2存在下で18時間インキュベートした。その後、TGFβを終濃度10μg/mLとなるように添加し、37℃で5％CO2存在下で3時間インキュベートした。細胞内のレポーター遺伝子の発現レベルはSteady-Glo Luciferase Assay System(Promega)とルミノメーターを用いて定量評価した。
　図１０に方法の概要（図１０B)、及びEL-4細胞の結果（図１０A）を示す。図１０Aの縦軸は、ルシフェラーゼ活性を示す。
（２）REICタンパク質濃度の検討
　（１）と同条件で、REICタンパク質の添加濃度を０～3000nMとし、TGFβ経路の阻害効果を確認した。
　図１１に方法の概要、及び結果を示す。縦軸はREICタンパク質を添加しない場合を１とした相対発光ユニット（RLU)で示す。
　図１０及び図１１の結果より、REICタンパク質は高濃度領域でもTGFβの活性を完全遮断できないが、免疫系に対して選択的な抑制効果を示すことがわかった。すなわちREICタンパク質は免疫系に選択的にTGFβ活性を減弱することができ、腫瘍局所での抗腫瘍免疫活性を穏やかに活性化する免疫調整剤として用い得ることがわかった。
　REIC/Dkk-3タンパク質若しくはその部分タンパク質又はそれらをコードするDNAはTGFβ関連疾患の予防又は治療に用い得る。
配列番号７～１１　合成
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (11)

  1. 　REIC/Dkk-3タンパク質若しくはそのCys-richドメインを含む部分タンパク質又はそれらをコードするDNAを有効成分として含むTGFβ阻害剤。
  2. 　REIC/Dkk-3タンパク質又はそのCys-richドメインを含む部分タンパク質を有効成分として含む請求項１記載のTGFβ阻害剤であって、作用用量が50nM以上の濃度領域において、濃度依存的にTGFβとその受容体との反応を阻害する、請求項１記載のTGFβ阻害剤。
  3. 　作用用量が高用量でも、TGFβとその受容体との反応を完全には阻害しない、請求項１又は２に記載のTGFβ阻害剤。
  4. 　作用用量が375nM以上でも、TGFβとその受容体との反応を完全には阻害しない、請求項３記載のTGFβ阻害剤。
  5. 　請求項１～４のいずれか１項に記載のTGFβ阻害剤を含む、抗腫瘍免疫活性化剤。
  6. 　請求項１～４のいずれか１項に記載のTGFβ阻害剤を含む、TGFβ関連疾患の予防又は治療剤。
  7. 　免疫系細胞に作用し、免疫系細胞におけるTGFβとその受容体との反応を阻害する、請求項６記載のTGFβ関連疾患の予防又は治療剤。
  8. 　TGFβとその受容体との反応を完全には阻害しないことにより、TGFβの阻害による副作用を低減することができる、請求項６又は７に記載のTGFβ関連疾患の予防又は治療剤。
  9. 　作用用量が50nM以上の濃度において濃度依存的にTGFβとその受容体との反応を阻害し、かつ375nM以上の高濃度においてもTGFβとその受容体との反応を完全には阻害しない、請求項６～８のいずれか１項に記載のTGFβ関連疾患の予防又は治療剤。
  10. 　TGFβ関連疾患ががんであり、抗腫瘍免疫を活性化する、請求項６～９のいずれか１項に記載のTGFβ関連疾患の予防又は治療剤。
  11. 　がん細胞から分泌されたTGFβにより誘導された制御性Ｔ細胞を介した免疫抑制状態を解除し、免疫細胞によるがん細胞への攻撃を回復させ活性化させる、請求項１０記載の予防又は治療剤。
PCT/JP2017/022588 2016-06-17 2017-06-19 ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ－３タンパク質を有効成分として含むＴＧＦβ阻害剤 WO2017217556A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201780035935.5A CN109414473A (zh) 2016-06-17 2017-06-19 含有REIC/Dkk-3蛋白作为有效成分的TGFβ抑制剂
US16/310,188 US20190330291A1 (en) 2016-06-17 2017-06-19 TGFß INHIBITOR CONTAINING REIC/Dkk-3 PROTEIN AS ACTIVE INGREDIENT
EP17813449.0A EP3485895A4 (en) 2016-06-17 2017-06-19 TGF INHIBITOR WITH REIC / DKK-3 PROTEIN AS AN ACTIVE SUBSTANCE

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-121187 2016-06-17
JP2016121187 2016-06-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017217556A1 true WO2017217556A1 (ja) 2017-12-21

Family

ID=60664156

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/022588 WO2017217556A1 (ja) 2016-06-17 2017-06-19 ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ－３タンパク質を有効成分として含むＴＧＦβ阻害剤

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20190330291A1 (ja)
EP (1) EP3485895A4 (ja)
JP (1) JP2017226657A (ja)
CN (1) CN109414473A (ja)
WO (1) WO2017217556A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001038528A1 (fr) * 1999-11-19 2001-05-31 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Proteine inhibitrice de la proliferation cellulaire, polynucleotide, polynucleotide antisens de ce polynucleotide, inhibiteurs de proliferation cellulaire, diagnostics de cancers, remedes anticancereux et composition pour therapie genique les utilisant
WO2009119874A1 (ja) * 2008-03-28 2009-10-01 国立大学法人岡山大学 単球から樹状細胞様分化を誘導し、抗癌免疫活性を高める癌の治療又は予防のための医薬組成物
WO2012002582A1 (ja) * 2010-07-01 2012-01-05 国立大学法人岡山大学 REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2508606B1 (en) * 2006-10-24 2017-09-13 Momotaro-Gene Inc. Partial fragment of REIC/Dkk-3 gene and therapeutic agent for cancer containing the same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001038528A1 (fr) * 1999-11-19 2001-05-31 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Proteine inhibitrice de la proliferation cellulaire, polynucleotide, polynucleotide antisens de ce polynucleotide, inhibiteurs de proliferation cellulaire, diagnostics de cancers, remedes anticancereux et composition pour therapie genique les utilisant
WO2009119874A1 (ja) * 2008-03-28 2009-10-01 国立大学法人岡山大学 単球から樹状細胞様分化を誘導し、抗癌免疫活性を高める癌の治療又は予防のための医薬組成物
WO2012002582A1 (ja) * 2010-07-01 2012-01-05 国立大学法人岡山大学 REIC/Dkk-3タンパク質の部分領域ポリペプチド

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN ML. ET AL.: "Regulatory T cells suppress tumor-specific CD 8 T cell cytotoxicity through TGF-beta signals in vivo", PROC NATL ACAD SCI USA, vol. 102, no. 2, 2005, pages 419 - 424, XP055563061, ISSN: 0027-8424 *
FUJITA T. ET AL.: "DNA encoding soluble TGF-beta receptor can suppress regulatory T cell function and elicit anti-tumor immune responses", PROCEEDINGS OF THE JAPANESE CANCER ASSOCIATION, vol. 66, 2007, pages 338, XP009515790, ISSN: 0546-0476 *
PINHO S. ET AL.: "Dkk3 is required for TGF-beta signaling during Xenopus mesoderm induction", DIFFERENTIATION, vol. 75, no. 10, 2007, pages 957 - 967, XP055563057, ISSN: 0301-4681 *
RAMOS RN. ET AL.: "What are the molecules involved in regulatory T-cells induction by dendritic cells in cancer?", CLIN DEV IMMUNOL., vol. 2013, no. 2, pages 1 - 10, XP055448679, ISSN: 1740-2522 *
ROMERO D. ET AL.: "Dickkopf-3 regulates proetate epithelial cell acinar morphogenesis and prostate cancer cell invasion by limiting TGF- beta-dependent activation of matrix metalloproteases", CARCINOGENESIS, vol. 37, no. 1, 26 October 2015 (2015-10-26), pages 18 - 29, XP055447946, ISSN: 0143-3334 *
ROMERO D. ET AL.: "Downregulation of Dickkopf-3 disrupts prostate acinar morphogenesis through TGF-beta/Smad signaling", J CELL SCI., vol. 126, no. 8, 2013, pages 1858 - 1867, XP055448678, ISSN: 0021-9533 *
See also references of EP3485895A4 *
SNELLING SJB. ET AL.: "Dickkopf-3 is upregulated in osteoarthritis and has a chondroprotective role", OSTEOARTH CARTIL., vol. 24, no. 5, 2016, pages 883 - 891, XP029512442, ISSN: 1063-4584 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017226657A (ja) 2017-12-28
CN109414473A (zh) 2019-03-01
EP3485895A4 (en) 2019-08-28
EP3485895A1 (en) 2019-05-22
US20190330291A1 (en) 2019-10-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4790624B2 (ja) 生体分子パーティションモチーフ及びそれらの使用
US9644013B2 (en) Partial region polypeptide of REIC/Dkk-3 protein
CA2385444C (en) Humanin, a polypeptide suppressing neuronal death
KR101458623B1 (ko) 종양 세포-살해 펩타이드
JP2013535954A (ja) ペプチド、構造体およびその使用
US20090104177A1 (en) Peptides for inhibiting the interaction of protein kinase a and protein kinase a anchor proteins
US8658612B2 (en) Therapeutic agent for malignant mesothelioma and immunostimulant
US7217539B2 (en) Cell death inducers for mast cells
Lu et al. Transduction of recombinant M3-p53-R12 protein enhances human leukemia cell apoptosis
WO2017217556A1 (ja) ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ－３タンパク質を有効成分として含むＴＧＦβ阻害剤
JP2006166879A (ja) Ａｂ−ｄｉｐ、並びにアルツハイマー病の予防及び治療剤
JP4638354B2 (ja) Ｇ蛋白質共役型受容体をコードする遺伝子およびその遺伝子産物
WO2004069869A1 (ja) アポトーシス誘導遺伝子およびその利用
JP4283531B2 (ja) マスト細胞の細胞死誘発剤
EP1651670A2 (en) Novel therapeutic fusion proteins
US20110288004A1 (en) Viral Sequences and Uses Thereof
KR100917705B1 (ko) 카스파제-7 절단에서 유래하는 세포사멸과 관련된폴리뉴클레오티드 서열, 세포사멸의 억제, 유도 인자 및이의 스크리닝 방법
US20090062189A1 (en) Tumor suppressor protein and nucleotide encoding same
US20080096833A1 (en) Polytpeptide Specific To Liver Cancer, Polynucleotide Coding For The Polypeptide, And Rna Molecule Inhibiting Expression Of The Polypeptide
US20040115667A1 (en) Dna-sequences, which code for an apoptosis signal transduction protein
WO2010024118A1 (ja) カスパーゼリクルートメントドメインを応用した新規リコンビナントタンパク及びその用途
US20130065819A1 (en) Target of egr1 (toe1) polypeptides for inhibition of hiv
KR20010071848A (ko) Ｓａｒｔ-1 유래의 종양 항원 펩티드
JP2011068568A (ja) がん作用性パラスポリン−２受容体及びその利用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17813449

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017813449

Country of ref document: EP

Effective date: 20190117