KR101458623B1 - 종양 세포-살해 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 치료용 종양 세포-살해 펩타이드 및 약제학적 조성물을 제공 한다. 본 발명의 상기 종양 세포-살해 펩타이드는 종양 세포에 대해 선별적인 조직지향성이므로 정상 세포의 손상을 최소화하면서 종양 세포사를 효과적으로 유도할 수 있다.

Description

종양 세포-살해 펩타이드{TUMOR CELL-KILLING PEPTIDES}
본 출원은 미국특허청에 2009년 9월 2일에 출원된 미국 특허출원 제61/239,423호를 기초로 우선권을 주장하며, 거의 개시 내용은 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명은 한국 과학 재단(Korea Science and Engineering Foundation)(김 T-H에게)의 재원으로 승인(NO. R13-2003-009-01002-0), 한국 과학 및 기술의 기초 연구 프로그램 재단(Basic Research Program of the Korea Science & Engineering Foundation)(김 T-H에게)의 승인(R0l-2006-000-10451-0), 및 과학기술부(Ministry of Science & Technology)로부터 수상한 파생 질병 연구를 위한 공동-사용 기술의 확립(Establishment of Joint-Use Equipments for Degenerative Diseases Research; 한국기초과학지원연구원, Korea Basic Science Institute)의 승인(서 Y-W에게) 하에 한국 정부 지원을 받아 수행하였다.
본 발명은 종양 세포-살해 펩타이드 및 암 치료를 위한 종양 세포-살해 펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
세포자멸사(apoptosis)는 다세포 유기체에 있어서 유해하고 심각하게 손상됐거나 또는 불필요한 세포들을 제거하기 위한 미세-조정 메카니즘이다. 세포자멸사는 정상 세포의 성장, 세포내 항상성의 유지, 암 및 다른 질환들의 방지, 바이러스 또는 박테리아의 감염으로부터 보호하는 데 있어 중요한 역할을 한다. 많은 실험적 증거들은 미토콘드리아가 세포자멸사를 조절하고 미토콘드리아의 구조적 완전성은 Bcl-2 패밀리 단백질에 의해서 조절됨을 보여준다(1). Bcl-2 패밀리 멤버는 그들이 세포자멸사를 향상시키는지 또는 억제시키는 지에 따라 2 개의 주요 그룹으로 나눠진다. 항-세포자멸 유전자들이(anti-apoptotic members)(예컨대, Bcl-2 및 Bcl-XL) BH1-BH4의 4 개 BH 도메인을 갖는 반면, 프로-세포자멸 유전자들(pro-apoptotic members)(예컨대, Bax 및 Bak)은 BH1-BH3의 3 개 BH 도메인을 갖는다. BH3-단독 단백질들은(예컨대, Bid, Noxa 및 PUMA) Bax 및 Bak과 같은 프로-세포자멸 단백질을 활성화시키거나 또는 Bcl-2 및 Mcl-1과 같은 항-세포자멸 단백질을 억제함으로써 세포자멸사를 유도한다(2, 3)
본래 p53 목표 유전자로 확인된 마우스 Noxa는 p53-의존적 유전자 독성 자극(p53-dependent genotoxic stimuli)에 의해 유도되는 세포자멸사에 있어서 중요한 역할을 한다(4-7). Noxa의 두 개의 기능적인 도메인, BH3 도메인 및 미토콘드리아 표적화 도메인(MTD: mitochondria targeting domain)은 이미 밝혀진 바 있다(8). 최근의 연구들은 Mcl-1 및 A1/Bfl-1의 선택적인 억제에 의해 세포사를 유도하는 단백질의 능력에 있어서 Noxa BH3 도메인이 중요하다는 것을 나타낸다(1, 9-13). 한편, HeLa 세포에서의 Noxa MTD 결실은 완벽하게 세포사를 억제하였다(8). 따라서, Noxa의 MTD가 Noxa의 BH3 도메인을 미토콘드리아로 이동시키고, BH3 도메인이 Mcl-1 및 A1/Bfl-1에 결합하여 Mcl-1 및 A1/Bfl-1의 항-세포 자멸 활성을 불활성화시키는 것으로 여겨진다. 이러한 이론은 Noxa 활성 유도-세포사(cell death-inducing activity of Noxa)가 Mcl-1 및 A1/Bfl-1을 불활성 시키는 Noxa BH3 도메인의 영향에 전적으로 의존적임을 제시한다. 그러나, BH3 도메인을 변형시킨 Noxa 돌연변이는 완벽하게 Noxa 활성 유도-세포사를 억제하지 못했으며 이는 Noxa의 또 다른 잠재적인 살해 도메인(killing domain)이 있음을 나타낸다(6, 14).
본 발명자들은 안전하고 효과적으로 종양 세포의 사멸을 유도할 수 있는 펩타이드 약제(peptide drug)를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 Noxa 단백질의 MTD 및 특이적인 종양 조직지향성 모티브(tumor homing motif)의 조합으로 종양 부위를 선택적으로 표적할 수 있으며, 정상 세포가 아닌 종양 세포의 대량 세포사를 유도하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 종양 세포-살해 펩타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 종양 세포-살해 펩타이드를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 첨부된 청구범위 및 도면으로부터 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 또는 SEQ ID NO:1의 상기 아미노산 서열과 최소 70%의 상동성을 갖는 그의 상동 서열을 포함하는 미토콘드리아 표적화 도메인(MTD); 및 (b) SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산 서열을 포함하는 종양 조직지향성 모티브를 포함하는 종양 세포-살해 펩타이드를 제공한다.
본 발명자들은 안전하고 효과적으로 종양 세포사를 유도할 수 있는 펩타이드 약제(peptide drug)를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 Noxa 단백질의 MTD 및 특이적인 종양 조직지향성 모티브(tumor homing motif)의 조합으로 종양 부위를 선택적으로 표적할 수 있으며, 정상 세포가 아닌 종양 세포의 대량 세포사를 유도하였다.
본 발명은 Noxa 단백질의 미토콘드리아 표적화 도메인이며 증진-세포사 활성을 갖는 MTD를 포함한다.
Noxa 단백질은 Bcl 패밀리의 “BH3-단독” 유전자 중의 하나로써, 미토콘드리아 기능을 조절하여 세포자멸사를 자극할 수 있다. Noxa 단백질의 BH3 도메인은 세포자멸사에 있어 중요한 역할을 하며, BH3가 없는 Noxa의 MTD 도메인은 세포 살해 활성을 갖지 않는 것으로 알려져 있다. 그러나, 본 발명자들은 특이 종양 조직표적화 모티브와 결합한 경우, Noxa 단백질의 C-말단에 있는 MTD가 BH3 도메인이 없이도 세포사를 마찬가지로 유도할 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명에서 이용된 MTD는 SEQ ID NO:1(KLLNLISKLF)에 명시된 아미노산 서열을 포함하며 이는 human Noxa 단백질의 미토콘드리아 표적화 도메인이다.
택일적으로, 본 발명에서 이용된 MTD는 SEQ ID NO:1에 최소 70% 상동성을 갖는 SEQ ID NO:1의 상동 서열을 포함한다.
펩타이드의 서열 상동성은 종래의 컴퓨터 프로그램을 이용하여 본래 서열과 변형 서열을 비교함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, UWGCG(University of Wisconsin Genetics Computer Group)에서 상업적으로 사용가능한 GAP 컴퓨터 프로그램 버전 6.0(Devereux et al., Nucl. Acids Res., 12:387(1984))을 이용할 수 있다. 또한 NCBI의(National Center for Biotechnology Information, Washington, D.C.) BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램을 이용하여 용이하게 상동성 조사를 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 최소 70% 상동성을 갖는 SEQ ID NO:1의 상동 서열은 5 번째 및 9 번째에 류신을 포함한다. 상동 서열은 최소 70% 상동성을 갖도록 SEQ ID NO:1의 아미노산 1 개 내지 3 개를 치환하여 제작할 수 있으며; 그러나 세포사 유도에 있어서 두 개의 류신이 중요하기 때문에 SEQ ID NO:1의 5 번째 및 9 번째 류신은 보존하는 것이 바람직하다.
최소 70% 상동성을 갖는 SEQ ID NO:1의 상동 서열의 예로는, SEQ ID NO 4 (KALNLISKLF), SEQ ID NO 5 (KLAALISKLF), SEQ ID NO 6 (KLLNLIAALF), 및 SEQ ID NO 7 (KALNLIAALF)의 아미노산 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 MTD를 포함하는 종양 세포-살해 펩타이드는 mPT(mitochondrial permeability transition) 포어를 개통하여 미토콘드리아로부터 유출된 세포기질 칼슘의 급격한 증가를 통해 대량 세포괴사를 야기한다.
본 발명의 종양 세포-살해 펩타이드는 또한 종양 세포 부위를 선별적으로 표적하는 종양 조직지향성 모티브를 포함한다.
본 발명에 이용된 MTD 도메인은 R8과 같은 PTD(protein transduction domain)에만 결합된 경우, 정상 및 종양 세포(또는 조직) 모두에 작용한다. 이와 같이, 종양 치료에 있어서 도전 중의 하나는 정상 조직의 손상은 최소화하는 반면, 종양 세포의 사멸은 최대화 하는 것이다. 본 발명자들은 본 발명에 이용된 특이 종양 조직지향성 모티브가 증진-세포사 도메인인 MTD를 선별적으로 종양 부위로 이동시키며, 정상 세포에는 손상이 없다는 것을 발견하였다.
또한, 종양 세포-살해 효과를 위해서는 MTD 도메인이 종양 세포로 유입되는 것이 중요하다. 본 발명에 이용된 특이 종양 조직지향성 모티브는 또한, 증진-세포사 도메인으로서 MTD 도메인이 종양 세포로 도입되도록 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, MTD 도메인이 종양 세포를 표적화하여 전달되도록 하는 종양 조직지향성 모티브는 SEQ ID NO:2에 명시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 종양 조직지향성 모티브는 SEQ ID NO:3에 명시된 아미노산 서열을 포함한다.
용어“종양(tumor)”은 적어도 부분적으로 혈관형성 맥관구조를 포함하는 것으로 특징지어진 세포 덩어리를 의미한다. 종양은 양성, 전-악성 또는 악성이 될 수 있다. 악성 종양은 암을 의미한다.
용어 “암(cancer)”는 용어는 인간 및 동물의 암, 칼시노마, 사르코마, 아데노칼시노마, 림포마, 류케케미아, 고형암 및 림포이드 암 등을 의미한다. 다른 유형 암의 예로는 대장암, 자궁암, 전립선암, 신장암(즉, 신장 세포 칼시노마), 방광암, 폐암, 유방암, 갑상선암, 간암(즉, 헤파토칼시노마), 흉막암, 췌장암, 난소암, 자궁 경부암, 고환암, 항문암, 담관암, 위장간칼시노마 종양, 식도암, 쓸개암, 직장암, 충수암, 소장암, 위(위장)암, 중추 신경계 암, 피부암, 융모상피암; 두경부암, 혈액암, 골원성 육종, 섬유육종, 신경모세포종, 신경교종, 흑색종, B-세포 림프종, 비-호지킨 림프종, 버킷 림프종, 소세포 림프종, 대세포 림프종, 단구성 백혈병, 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 및 다발성 골수종을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 종양 세포-살해 펩타이드는 대장암 세포, 폐암 세포 또는 자궁암 세포에 살해 활성을 가지며, 보다 바람직하게는 대장암 세포이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 종양 조직지향성 모티브 및 MTD는 링커, 스페이서 또는 어댑터에 의하여 직접적으로 융합 또는 연결될 수 있다. 링커를 포함하는 아미노산의 수는 당업자에 의한 일반적인 실험으로 결정될 수 있다. MTP 및 종양 조직지향성 모티브가 서로 상대방의 기능을 방해 않도록 하는 충분한 수의 아미노산을 링커가 포함할 수 있다. 따라서, 링커를 포함하는 아미노산은 MTP 및 종양 조직지향성 모티브의 생물학적 활성을 많이 변경하지 않는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 펩타이드 링커는 본 발명의 종양 조직지향성 모티브 및 MTD을 연결시키는 데 이용된다. 예를 들어, 펩타이드 링커는 당업계에 공지된 글리신 폴리머 (G)n, 글리신-세린 폴리머(예컨대, (GS)n, (GSGGS)n 및 (GGGS)n을 포함하며, 상기 n은 적어도 한 개의 정수), 글리신-알라닌 폴리머, 알라닌-세리 폴리머, 및 쉐이커 포타슘 채널을 위한 테더(tether)와 같은 다른 플렉서블 링커, 및 많은 다양한 다른 플렉서블 링커를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 글리신이 알라닌 보다 더 phi-psi 공간을 유효하게 접근할 수 있고, 장쇄를 가진 다른 잔기들보다 덜 제한적이기 때문에, 글리신 폴리머가 가장 바람직하다(참고문헌에 포함된 참조 Scheraga, Rev. Computational Chem. III73-142 (1992)). 두 번째로, 세린이 친수성이므로 구형의 글리신 체인을 용해할 수 있다. 세 번째로, 단일 체인 항체와 같은 재조합 단백질의 서브유닛을 연결하는 데 있어 유사한 체인이 효과적인 것으로 밝혀진 바 있다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 종양 조직지향성 모티브 및 MTD를 연결하는데 이용된 펩타이드 링커는 글리신 올리고머이며, 가장 바람직하게는 (Gly)2-3이다.
본 발명의 바람직한 또 다른 구현에에 따르면, 본 발명의 종양 세포-살해 펩타이드는 그의 N-말단 구역에 종양 조직지향성 모티브 및 그의 C-말단 구역에 MTD를 포함하고, MTD 및 종양 조직지향성 모티브는 펩타이드 링커에 의해 연결된다.
본 발명의 종양 세포-살해 펩타이드는 다양한 방법에 따라 제작될 수 있다. 예를 들어, 유전자 클로닝 방법 또는 고체-상 합성 기술에 의해 생성될 수 있다. 보다 바람직하게는, 종양 세포-살해 펩타이드에 대한 뉴클레오타이드 서열 코딩은 적합한 호스트 셀로 형질전환시키고 종양 세포-살해 펩타이드를 생성하도록 하여 발현된다(참조 Sambrook, J. 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)). 일부 구현예에서, 필요에 따라 뉴클레오타이드 서열은 링커, 교차링커, 스페이서 또는 어댑터를 추가적으로 엔코딩한다. 선택적으로, 본 발명의 종양 세포-살해 펩타이드는 당업계에 공지된 고체-상 합성 기술에 따라 생성될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, 등, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명의 종양 세포-살해 펩타이드는 고안정성, 특히, 혈청 안정성을 위해 변형시킬 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 그의 N-말단 또는 C-말단에 아세틸기, 플루오레닐기 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택된 보호 기(protection group)를 갖는다.
실시예에 서술한 바와 같이, 본 발명의 종양 세포-살해 펩타이드는 암 치료용 약제성 펩타이드 분자로써 주목될 수 있다. 종양 세포-살해 펩타이드는 특이적으로 종양 세포를 조직지향하여 선별적으로 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 종양 세포-살해 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 종양 세포-살해 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 조성물을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료용 방법을 제공한다.
용어 “유효 성분”은 치료적으로 유효 화합물뿐만 아니라 그의 프로드럭과 그의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물 및 용매화물을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 암 치료에 있어 효과적이다. 상기 약제학적 조성물에 의해 치료되는 암으로는, 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인강암, 후두암, 췌장암, 방광암, 대장암, 자궁암, 뇌암, 전립선암, 골 암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암, 신우요관암을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 약제학적 조성물에 의해 치료되는 암은 대장암 및 자궁암이고 보다 바람직하게는 대장암이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체(carrier)를 추가적으로 포함할 수 있다.
표현 “약제학적으로 허용가능한”은 물질 또는 조성물이 포유류에게 처리되는 제제를 포함하는 다른 성분들과 화학적 및/또는 독성학적으로 양립되는 것을 가리킨다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 종래의 제제 중 하나가 될 수 있으며, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있다. 비-경구 투여, 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사, 복강 내 주사, 경피 투여, 또는 종양 내 주사를 이용할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성에 따라 다양해 질 수 있다. 상기 약제학적 유효량은 필요한 치료에 따라 당업계의 숙련된 자에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 일일 투여량은 0.001 ㎍/kg 내지 1000 ㎎/kg(체중)범위이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 제제의 형태는 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태, 추출제, 엘릭서제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
도 1a-1e. MTD에 의한 세포사의 도입.
(a) 본 발명의 실험에 이용된 펩타이드들을 도식적으로 나타낸 도표.
(b) HeLa 세포에 DMSO 또는 지정된 펩타이드를 점차 증가시킨 양으로 처리하였다(10 μM, 20 μM 및 30 μM). 세포사의 %는 처리 10 분 후에 광학 현미경으로 죽은 세포와 살아있는 세포를 카운팅하여 확인하였다.
(c) Noxa 결실 돌연변이체를 도식적으로 나타낸 도표.
(d) HeLa 세포에 Noxa의 결실 돌연변이체를 형질도입시켰다. 형질도입 후 11 시간, 24 시간 및 36 시간에 형광 현미경을 이용하여 형태학적으로 변화가 있는 EGFP-양성의 죽은 세포를 카운팅하여 세포사를 확인하였다.
(e) HeLa 세포에 MTD 펩타이드의 치환 돌연변이체를 형질도입시켰다. 이러한 MTD의 변종들 또한 세포-살해 활성을 나타냈다.
도 2a-2c. MTD 펩타이드-유도 세포사의 특징.
(a) HeLa 세포에 MTD 펩타이드(10 μM), 또는 TRAIL(100 ng/ml)을 처리하였다. 지정된 시간에 이미지를 획득하였다(상위 패널). Jurkat 세포에 MTD 펩타이드(10 μM)를 10 분 동안 처리하고 TEM을 위한 처리를 진행하였다. 4,000 x 배율로 이미지를 획득하였다(하위 패널). N: 핵, M: 미토콘드리아
(b) 플라스미드(대조군 벡터 또는 GFP와 융합된 Noxa 야생형)는 HeLa 세포로 형질도입되었다. zVAD-fmk을 처리하고 2 일 후, 시토크롬 c가 항-시토크롬 c 항체로 염색되었다. 화살표는 확산된 시토크롬 c 염색을 가리킨다. 시토크롬 c의 유출은 HeLa 세포에 MTD 펩타이드(5 μM)를 처리한 후 면역형광법으로 분석되었다(하위 패널).
(c) MTD-펩타이드 처리전 HeLa 세포에 zVAD-fmk(25 μM) 또는 IDN-6556(25 μM)을 전-처리하였다. R8, ΔR8-MTD 및 R8:MTD 5 을 5 시간 동안 처리한 후, 세포사를 셀 카운팅 키트-8(Dojindo Molecular Technologies, Rockville, USA)을 이용하여 분석하였다.
도 3a-3d. Noxa-유도 세포사에 있어서 Noxa MTD의 중요 아미노산 잔기.
(a) MTDmt1 내지 MTDmt5의 아미노산 서열은 도 1에 정리되었다. HeLa 세포에 DMSO 또는 지정된 펩타이드를 점차 증가시킨 양으로 처리하였다(10 μM, 20 μM 및 30 μM). 세포사의 %는 처리 10 분 후에 광학 현미경으로 죽은 세포와 살아있는 세포를(시료당 300 세포) 카운팅하여 확인하였다.
(b) HeLa 세포에 야생형 또는 지정된 Noxa 돌연변이체를 형질도입시켰다. 형질도입 후 20 시간에 형광 현미경을 이용하여 EGFP-양성의 죽은 세포 및 살아있는 세포를 카운팅하여 세포사를 확인하였다.
(c) NCI-H460 세포에 지정된 펩타이드를 2 시간 또는 5 시간 동안 처리하였다. 세포사의 %는 상기 서술된 바와 같이 확인하였다.
(d) A459 세포에 지정된 펩타이드를 1, 2 시간 또는 5 시간 동안 처리하였다. 세포사의 %는 상기 서술된 바와 같이 확인하였다.
도 4a-4g. MTD 펩타이드는 세포기질에서 칼슘 스파이크를 유도한다.
(a-c) HeLa 세포에 3 μM Fluo-4-AM를 첨가하여 30 분 동안 두고, 그 후 3 μM의 지정된 펩타이드들을(a: MTD, b: MTDmt3, c: MTDmt5) 처리하였다. 형광 이미지 및 현미경 검경물 구획의 이미지는 5 분 동안 5-초 간격으로 레이져 스캐닝 공초점 현미경을 이용하여 획득되었다. 관심 있는 두 구역(RO1 및 RO2)의 상대적 형광 강도(F/F0)는 5 분 동안 5-초 간격으로 측정되었다.
(d) HeLa 세포에 10 μM BAPTA-AM 전처리를 2 시간 동안 한 MTD 펩타이드(5 μM)를 또는 전처리를 하지 않은 MTD 펩타이드(5 μM)를 처리하였다. 살아있는 세포의 이미지를 10 분 동안 10-초 간격으로 연속적으로 획득하여 지정된 시간에 따라 나타내었다. 화살표는 세포막 수포의 모습을 가리킨다.
(e-g) HeLa 세포에 칼슘 무첨가 KRB 배지 단독(e), 10 μM 2-APB 및 20 μM 리아노딘을 함유한 KRB 배지 (f), 또는 30 μM CsA를 함유한 KRB 배지(g)로 2 시간 동안 전처리하였다. 그 후 HeLa 세포에 3 μM Fluo-4-AM를 첨가하여 30 분 동안 두고, MTD 펩타이드 3 μM을 처리하였다. 이미지는 5 분 동안 5-초 간격으로 레이져 스캐닝 공초점 현미경을 이용하여 획득하였다. 관심 있는 두 구역(RO1 및 RO2)의 상대적 형광 강도(F/F0)는 5 분 동안 5-초 간격으로 측정되었다.
도 5a-5c. MTD 펩타이드에 의한 MTD 포어의 개통.
(a) HeLa 세포에 1 μM 칼세인-AM 및 2 mM 코발트를 첨가하여 15 분 동안 두고, 2 분 동안 25 μM MitoTracker를 첨가하여 미토콘드리아를 염색하였다. MitoTracker(적색)과 중복되는 칼세인 시그널(녹색)의 대표적인 이미지를 나타내었다.
(b) MTD 펩타이드를 처리하지 않거나(상위 패널) 또는 처리한(하위 패널) HeLa 세포로부터 나오는 칼세인 및 MitoTracker 시그널의 시간차 이미지를 5 분 동안 10-초 간격으로 획득하였다. 지정된 시간 지점의 대표적인 이미지를 나타내었다.
도 6a-6d. TU:MTD 펩타이드는 in vitiro 및 in vivo에서 세포사를 유도한다.
(a) CT26 세포를 Balb/c 마우스에게 피하 주사하였다. 종양 세포는 7 일 동안 성장하였고, 7일 내지 19일 동안 매 2 일 마다 TU2:MTD 펩타이드(385 ㎍/마우스) 또는 PBS를 꼬리 정맥을 통하여 정맥 주사하였다(n= 10 마우스/군). 종양 크기는 가장 긴 지름 x 너비2 x 0.5로 계산되었다.
(b) 8일 내지 20일 동안 매 2 일 마다 TU3:MTD 펩타이드(230 ㎍/마우스) 또는 PBS를 꼬리 정맥을 통하여 종양이 생긴 Balb/c 마우스에게 정맥 주사하였다(n= 5 마우스/군). 종양 크기는 상기 서술한 바와 같이 측정되었다.
(c) 마우스를 희생하여 PBS, TU2:MTD 또는 TU3:MTD 펩타이드를 처리한 마우스로부터 종양을 수득하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다. 종양 부위의 이미지(400x 배율)를 획득하였고(좌), 네모 부분을 확대하였다(우).
(d) 정상 마우스 또는 PBS, TU2:MTD 또는 TU3:MTD 펩타이드를 매 2 일 마다7 번씩 처리한 마우스로부터 나온 간 및 신장의 이미지(400x 배율)는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 후에 획득되었다.
도 7. MTD 펩타이드-유도 세포사의 특징
(a) HeLa 세포에 DMSO 또는 MTD 처리 후 10 분에 FITC-콘쥬게이티드 아넥신 V 항체로 염색하였다. 이미지는 공초점 현미경으로 획득하였다.
(b) HeLa 세포에 DMSO 또는 MTD 처리 후 10 분에 SYTOX 그린으로 염색하였다. 이미지는 공초점 현미경으로 획득하였다.
(c) HeLa 세포에 10 분 또는 30 분 동안 무혈청 배양 배지로 DMSO 또는 MTD 펩타이드(10 )를 처리하였다. 처리 후에, 배양 배지를 수득하였다. 조건화된 배지의 단백질을 2.5 배 메탄올 및 0.1 배 5M NaCl로 침강시킨다. 침전물 및 세포 용해물로 SDS-PASE 및 항-HMGB1 항체(R&D systems, Minneapolis, Minnesota)로 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다
(d) 마우스 간의 분리된 미토콘드리아는 버퍼(NT), MTD 펩타이드(10 μM) 또는 MTDmt5 펩타이드(10 μM)로 처리되고 그 후 1 시간 동안 30 ℃에서 인큐베이션시켰다. 미토콘드리아는 원심분리기(10,000x rpm)를 이용하여 수득하고 투과 전자 현미경(TEM)을 위한 과정을 진행하였다. 이미지(상위 패널)은 7,000x 배율로 획득되었고, 상대적인 미토콘드리아 크기(하위 패널)은 40 개 미토콘드리아 각각의 지름을 측정하여 계산되었다.
(e) HeLa 세포에서 MTD 펩타이드, MTDmt4 또는 MTDmt5(5 μM)처리 후, 세포 용해물은 지정된 시간에 따라 제작되었다. 정량된 단백질로 SDS-PAGE를 수행하여 PVDF 멤브레인으로 블럿팅하였다. TBST(10 mM TrisHCl, pH 7.5, 100 mM NaCl 및 0.1% Tween-20)에 5% 탈지 우유로 블록킹한 후, 멤브레인은 항-카스파제-3(SantaCruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), 항-카스파제-8(Cell signaling technology, Beverly, MA, USA), 항-카스파제-9(SantaCruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), 항-XIAP(Upstate Biotechnology, Dundee, United Kingdom), 또는 항-Bid(자체 제작) 항체로 탐지되었다. 항-액틴 항체(Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA)는 동량을 첨가하여 사용되었다.
도 8a-8d. Noxa-유도 세포사의 중요 아미노산 잔기.
(a) HeLa 세포에 WT Noxa, 5Lmt(L42A, L43A, L45A, L49A) 또는 4Lmt(L29A, L42A, L43A, L45A, L49A) 컨스트럭트 중의 하나를 형질도입하였다. 형질도입 후 지정된 시간에 형광 현미경을 이용하여 형태학적으로 변화가 있는 EGFP-양성의 죽은 세포를 카운팅하여 세포사를 확인하였다.
(b) HeLa 세포에 pDsRed2-Mito 및 Noxa 4Lmt 또는 pDsRed2-MitoNoxa 및 5Lmt로 형질도입한지 18 시간 후에 미토콘드리아 형태를 레이져 공초점 현미경으로 관찰하였다.
(c) pEGFP-Noxa WT, L42A, L43A, L45A, L49A(1 ㎍)는 pcDNA3-Mcl-1(1 ㎍)로 293T 세포 안에 혼합형질도입(cotransfection)되었고, 세포는 추가적으로 26 시간 동안 배양되었다. 상기 세포를 단백질 분해효소 저해제 혼합물 및 버퍼(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1mM EGTA, 1% 트리톤-X-100, 및 1% 소디윰 데옥시콜레이트를 함유)로 용해시켜 세포 용해액을 얻었다. EGFP에 대한 일차 항체를 세포 용해물에 2 시간동안 인큐베이션하였다. 아가로즈 비드가 콘쥬게이팅된 단백질(A+G)를 첨가하여 추가적으로 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 침전물 또는 투입된 용해물로 SDS-PAGE를 실시하고 항-EGFP(Noxa용) 및 항-Mcl-1 항체를 이용하여 웨스턴 블럿팅을 실시하였다.
(d) HeLa 세포에 지정된 양의 MTD 펩타이드를 1 시간, 2 시간 또는 5 시간동안 처리하였다. 세포사의 %는 광학 현미경으로 죽은 세포와 살아있는 세포를(시료당 200 내지 500 세포) 카운팅하여 확인하였다. 데이터는 3 번의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다.
도 9a-9d. TU:MTD 펩타이드는 CT26 세포에서 세포사를 유도하고 종양 무게를 감소시킨다.
(a) CT26 세포에 10 MTD, TU1:MTD, TU2:MTD, 또는 TU3:MTD 펩타이드를 처리하였고 지정된 펩타이드를 위한 현미경 검경물 구획의 이미지는 지정된 시간 지점에서 획득되었다. 최소 3 개의 각각의 실험의 대표적인 이미지를 나타내었다.
(b) CT26 세포를 Balb/c 마우스에게 피하 주사하였다. 종양 세포는 7 일 동안 성장하였고, 7일 내지 19일 동안 매 2 일 마다 TU2:MTD 펩타이드(385 ㎍/마우스) 또는 PBS를 꼬리 정맥을 통하여 정맥 주사하였다(n= 10 마우스/군). 마우스를 희생한 후 종양 무게를 측정하였다.
(c) 8일 내지 20일 동안 매 2 일 마다 TU3:MTD 펩타이드(230 ㎍/마우스) 또는 PBS를 꼬리 정맥을 통하여 종양이 생긴 Balb/c 마우스에게 정맥 주사하였다(n= 5 마우스/군). 종양 무게는 상기 서술한 바와 같이 측정되었다.
(d) 정상 피부의 표피층과 진피층 부위 또는 PBS, TU2:MTD 또는 TU3:MTD를 처리한 종양에 가까운 표피층과 진피층 부위의 이미지(100x 배율)는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 후에 획득되었다.
도 10. MTD 펩타이드에 의한 HMGB1의 배지로의 유출 및 카스파제 저해제에 의한 MTD-유도 세포사의 비저해.
HeLa 세포에 EGFP-Noxa WT 및 41-54를 Bcl-2 발현 플라스미드 또는 zVAD-fmk(25 μM)이 존재하는 경우로 조합하여 형질도입하였다. 형질 도입을 한지 18시간 후에, 형광 현미경을 이용하여 형태학적으로 변화가 있는 EGFP-양성의 죽은 세포를 카운팅하여 세포사를 확인하였다. 데이터는 총 200 개 세포로 집계된 각각 3 번 실험의 평균 ± SD를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 방법
세포 배양
HeLa 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 페니실린 100 units/ml 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)으로 37 ℃, 5 % CO2 항습 인큐베이터에서 배양되었다.
클로닝 및 돌연변이 유발
Noxa(Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1)의 결실 컨스트럭트(Deletion construct)는 이전에 기재된 바 있다(8). 위치-지정 돌연변이(Site-directed mutagenesis)는 다음과 같이 NoXa의 29, 42, 43, 45 및 49 위치(position)에 있는 류신(leucine) 잔기를 알라닌으로 전환시키는 PCR 프라이머를 이용하여 실시되었다.
L29A 전환을 위해, 제1차 PCR은 다음과 같은 프라이머들[Noxa 5’-(1)-프라이머 (GAAGATCTATGCCTGGGAAGAAGGCGCGC) + L29A 3’-프라이머 (CTCCAAATCTCCTGGCTTGAGTAGCACACTC) 및 L29A 5’-프라이머 (GAGTGTGCTACTCAAGCCAGGAGATTTGGAG) + Noxa 3’-(54)-프라이머(CGAATTCTCAGGTTCCTGAGCAGAAGAG)] 및 주형으로서 pEGFP-Noxa를 이용하여 실시되었고, 이후 제2차 PCR은 Noxa 5’(1) 프라이머, Noxa 3’(54) 프라이머 및 주형으로서 제1차 PCR 산물을 이용하여 실시되었다. 제2차 PCR 산물은 BglII 및 EcoR1으로 절단되어 pEGFP-c1으로 클로닝되었다.
L42A, L43A, 및 L45A 전환을 위해, PCR은 각각 Noxa 5’ (1) 프라이머 + L42A 3’-프라이머 (TTTGGATATCAGATTCAGAGCTTTCTGCCGGAA), Noxa 5’-(1)-프라이머 + L43A 3’-프라이머 (TTTGGATATCAGATTCGCAAGTTTCTGCCGG), 및 Noxa 5’-(1)-프라이머 + L45A 3’-프라이머 (TTTGGATATCGCATTCAGAAGTTTCTGCCGG)을 이용하여 실시되었고, 그 후 BglII 및 EcoRV로 절단되어 BglII 및 EcoRV로 절단된pEGFP-Noxa(1-54)으로 클로닝되었다.
L49A 전환을 위해, PCR은 Noxa 5’-(1)-프라이머 및 L49A 3’-프라이머 (CGAATTCTCAGGTTCCTGAGCAGAAGGCTTTGGATATCAGATTCAG)를 이용하여 실시되었고 그 후 BglII 및 EcoR1으로 절단하여 BglII 및 EcoR1 위치의 pEGFP-c1으로 클로닝되었다. 4Lmt 및 5Lmt를 위해, 각각 주형으로서 야생형 Noxa(WT Noxa) 및 L29A 컨스트럭트를 이용하여 Noxa 5’ 프라이머 및 4mt 3’-프라이머 (GTTTGGATATCGCATTCGCAGCTTTCTGCCGGAAG)로 PCR을 실시하였다. BglII 및 EcoRV로 절단된 PCR 산물은 pEGFP-Noxa L49A로부터 제작된 벡터로 클로닝되었다.
모든 Noxa 돌연변이 컨스트럭트는 DNA 서열 분석에 의해 확인되었다.
펩타이드 합성
실시예의 펩타이드들을 합성하기 위해서, 0.25 mmol unit을 이용한 Fmoc 합성 방법이 기본적으로 적용되었다. 상세하게는, 4X DMF를 이용하여 레진을 세척하고 20 % 피페리딘/DMF 용액 10 ml에 1 분간 블렌딩한 후 상등액을 제거하여 분리하였다. 상기 레진을 다시 20 % 피페리딘/DMF 용액 10 ml과 혼합하고, 30 분 동안 흔들어 준 후 4X DMF으로 세척하였다. 피페리딘이 남아있는 지 아닌지를 확인하기 위하여 닌히드린 테스트를 실시하였다. 레진은 피페리딘이 없을 경우 청색으로 나타난다. 커플링 단계를 위하여, Fmoc-아미노산 1 mmol, 0.45 M HBTU/HOBT(1 mmol) 2.1 ml 및 DIEA(2 mmol) 348 ㎕가 포함된 용액을 준비하였다. 상기 레진을 용액에 혼합하고 30 분 동안 교반시킨다. 그 후 레진을 용액으로부터 분리시키고 4X DMF으로 세척하였다.
커플링 단계를 몇 차례 반복하여 다음의 아미노산들과 연결시킨다. 상기 결과의 펩타이드를 HPLC(High-performance liquid chromatography, Peptron, Daejeon Korea)로 정제하고 0.5 mM 50 % DMSO(dimethyl sulfoxide)에 현탁하여 -20℃에서 보관하였다.
본 발명의 실시예에 이용된 펩타이드의 명명 및 서열은 표 1에 정리하였다. △R8은 8 번 째 아르기닌 아미노산 잔기의 결실을 의미한다.
펩타이드 명명과 서열
펩타이드 서열 SEQ ID NOs
NoxaBH3 RRRRRRRRGECATQLRRFGDKLNF 8
NoxaBH3MTD RRRRRRRRGECATQLRRFGDKLNFRQKLLNLISKLF 9
MTD RRRRRRRRGRQKLLNLISKLF 10
MTD2 RRRRRRRRGRGKALNLISKLF 11
MTD3 RRRRRRRRGRGKLAALISKLF 12
MTD4 RRRRRRRRGRGKLLNLIAALF 13
MTD5 RRRRRRRRGRGKALNLIAALF 14
8:MTD KLLNLISKLF 1
MTDmt1 (KL41,42AA) RRRRRRRRGRQAALNLISKLF 15
MTDmt2 (LN43,44AA) RRRRRRRRGRQKLAALISKLF 16
MTDmt3 (LI45,46AA) RRRRRRRRGRQKLLNAASKLF 17
MTDmt4 (SK47,48AA) RRRRRRRRGRQKLLNLIAALF 18
MTDmt5 (LF49,50AA) RRRRRRRRGRQKLLNLISKAA 19
TU1:MTD CNGRCGGKLLNLISKLF 20
TU2:MTD CNGRCVSGCAGRCGGKLLNLISKLF 21
TU3:MTD CGNKRTRGCGGKLLNLISKLF 22
세포내 칼슘 측정
세포기질의 Ca2+ 측정을 위해, HeLa 세포주를 Lab-TekTM 챔버 유리 슬라이드에서 배양하였고 최종 농도 3 μM의 Fluo-4-AM(Fluo-4-acetoxymethyl ester)를 첨가하여 30 분 동안 둔 후 pH 7.4 PBS(Phosphate buffered saline)로 세척하고, 상기 서술된 펩타이드들이 포함된 새로운 Ca2+-무첨가 Krebs-ringer 변형 버퍼(KRB: 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM Na3PO4, 1 mM MgSO4, 5.5 mM 글루코오스, 및 20 mM HEPES, pH 7.4, 37°C)를 첨가한다. 시간차(Time-lapse) 이미지는 10 초 간격으로 5 분 동안 Fluo-4-AM를 시각화 하여 아르곤 레이져 스캐닝 공초점 현미경(Leica TCS SP5 Microsystems, Mannheim, Germany)으로 488 nm 여기(excitation)에서 획득하였다.
코발트- 퀀칭 칼세인 어세이( Cobalt - quenched Calcein Assay )
HeLa 세포주는 1 μM 칼세인-AM 및 2 mM 코발트를 첨가한 혈청-무첨가 DMEM에 15 분 동안 둔 다음, 25 μM MitoTracker에 2 분 동안 두어 미토콘드리아를 염색시킨다. 그 후, HeLa 세포주를 잠시 HBSS(Hank's Buffered Salt Solution)으로 세척하고 10% FBS(Fetal bovine serum)를 함유한 칼슘-무첨가 배지에 넣은 MTD 펩타이드를 처리하였다. 10 초 간격으로 10 분 동안 시간차 이미지를 획득하였다.
세포사 어세이
세포사의 비율은 형광 현미경으로 EGFP-양성인 죽은 세포를 계산하여 확인하였다. 최소한, 3 개의 분획 구역에서 300 개의 세포를 각 측정시마다 산출하였다.
동일 종양 동물 모델
본 발명자들은 동물 실험을 위한 조선대학교 기관의 지침 및 조정을 준수하였다. (14)에서 서술된 바와 같이 Balb/c 마우스내에 CT-26 세포들을(1.5 x 105 세포) 피하 주사하여 종양이 생기도록 한다. 종양의 크기는 길이 x 너비2 x 0.5로 계산되었다. 종양 세포는 7-8일 동안 배양되었고 마우스를 희생시킬 때까지 2 일 마다 TD2:MTD 펩타이드(385 ㎍/마우스) TU3:MTD 펩타이드 (230 ㎍/마우스) 또는 PBS를 꼬리의 정맥에 주사하였다.
면역침강 어세이
pEGFP-Noxa WT, pEGFP-Noxa L42A, pEGFP-Noxa L43A, pEGFP-Noxa L45A, 및 pEGFP-Noxa L49A(1 ㎍)는 pcDNA3-Mcl-1(1 ㎍)로 293T 세포 안에 혼합형질도입(cotransfection)되었고, 세포는 추가적으로 26 시간 동안 배양되었다. 상기 세포를 단백질 분해효소 저해제 혼합물 및 버퍼(20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1mM EGTA, 1% 트리톤-X-100, 및 1% 소디윰 데옥시콜레이트를 함유)로 용해시켜 세포 용해물을 얻었다. EGFP에 대한 일차 항체를 세포 용해물에 2 시간동안 인큐베이션하였다. 아가로즈 비드가 콘쥬게이팅된 단백질(A+G)를 첨가하여 추가적으로 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 원심 분리를 하고, 세포 의 펠렛을 수차례 버퍼로 세척하였다.
투과전자현미경
Jurkat 세포 또는 MTD 펩타이드 처리되어 분리된 미토콘드리아를 원심분리로 수득하고 2.5% 글루타르알데히드로 2 시간 동안 고정시킨 다음 0.2 M 소디윰 카코딜레이트 버퍼(pH 7.2)로 10-20 분씩 3 번 세척하였다. 시료는 순차적으로 60% 에탄올, 70% 에탄올, 80% 에탄올, 90% 에탄올, 95% 에탄올, 및 100% 에탄올 용액에 2 번 씩 4℃에서 20 분 동안 탈수시킨 후, 프로필렌 옥사이드를 20 분씩 3 번 침투시켰다. 시료는 프로필렌 옥사이드 및 에폰(epon)의 혼합물에 6 시간 동안 포매시켰다. Hitachi H-7600 전자 현미경(80 kV, Hitachi, Tokyo, Japan)으로 전자현미경 이미지를 획득하였다. (1)에서 서술된 바와 같이 미토콘드리아는 마우스의 간에서 분리되었다.
결과
Noxa 의 미토콘드리아 표적화 도메인은 세포사 -유도 활성을 갖는다.
이미 본 발명자들은 Noxa의 C-말단 구역(C-terminal region, 41-50)에서 MTD(mitochondria targeting domain)를 확인하였다(8). BH3-단독 단백질의 BH3 도메인이 미토콘드리아에 영향을 미치기 때문에, 본 발명자들은 BH3 도메인이 MTD와 융합된 경우 BH3 도메인이 미토콘드리아 내로 효율적으로 이동되어 보다 강력한 살상 활성을 가질 것이라 가정하였다. NoxaBH3 도메인 단독 펩타이드, NoxaMTD 단독 펩타이드 및 NoxaMTD와 융합된 BH3 도메인 펩타이드를 합성하여(표 1 및 도 1a) 이들의 세포사 유도능을 테스트하였고, MTD 단독은 NoxaBH3MTD 펩타이드와 비교할 만한 세포사-유도 활성을 갖는 것으로 나타났다(도 1b). Noxa의 MTD 살해 활성을 갖는다는 것을 가리킨다. 따라서 본 발명자들은 HeLa 세포에서 Noxa 결실 돌연변이의 세포 살해 활성을 확인하였다(도 1c). 야생형 Noxa의 과발현 및 BH3 도메인 및 MTD를 모두 포함하는 21-54의 과발현은 HeLa 세포에서 11 시간 안에 세포사를 유도하였다. MTD만을 포함하는 41-54 및 BH3 도메인만을 포함하는 21-40은 11 시간안에 세포사를 거의 유도하지 못하였다; 또한, 어느 도메인도 포함하지 않는 1-30은 HeLa 세포의 세포사에 아무 효과도 나타내지 않았다(도 1d). 이러한 결과들은 이전 결과들과 일치하며 이는 BH3 도메인 및 MTD 모두가 Noxa-유도 세포사에 필요하다는 것을 보여준다(8). 그러나, 시간이 지날수록, 41-54에서 강한 세포사-유도 활성이 관찰되었고 이는 MTD 단독이 세포사-유도 활성을 갖는다는 것을 가리킨다. 21-40 과발현은 24 시간 및 36 시간에서 강한 세포사-유도 활성을 나타냈다(도 1d). 이러한 결과들은 Noxa의 BH3 도메인 및 MTD 모두가 세포 살해 활성을 보유한다는 것을 의미한다.
MTD 펩타이드로 유도된 세포사의 특징은 일반적인 세포자멸적 특징과는 많이 상이하다. TRAIL에 의해 유도된 세포자멸적 세포의 세포막의 수축과는 달리, MTD 펩타이드를 처리한 세포에서는 죽어가는 세포의 기포-유사 구조가 관찰되지 않았다(도 2a). MTD 펩타이드-처리 세포는 아넥신 V 및 SYTOX 그린(도 7a 및 도 7b)로 염색되었고, 세포 괴사의 전형적인 형태인 세포질 막의 부종이 나타났다. 또한, 투과 전자 현미경에 의해 분석된 미세구조적 변화로는 MTD 펩타이드에 의한 미토콘드리아의 부종, 핵의 확장 및 세포막 부종이 관찰되었고, 이는 MTD 펩타이드가 세포자멸사가 아닌 세포 괴사를 유도한다는 것을 나타낸다(도 2a). 세포 괴사가 일어나면 고이동성그룹 B1(high mobility group B1, HMGB1)이 세포의 외부로 유출될 수 있기 때문에(15,16), HeLa 세포에 MTD 펩타이드를 처리한 경우, HMGB1이 배지로 유출될 수 있다. 게다가, MTD 펩타이드 처리 후 10 분 내지 30 분 안에 HMGB1이 현저하게 유출되는 반면, MTD 펩타이드를 처리하지 않은 세포에서는 HMGB1이 유지되었다(도 7c).
본 발명자들은 MTD 펩타이드가 미토콘드리아에 직접적인 손상을 주는 지에 대해 추가적으로 실험하였다. MTD 펩타이드를 처리한 세포에서 시토크롬 c는 미토콘드리아로부터 세포기질로 유출되지 않으나, 반면 Noxa 야생형은 미토콘드리아로부터 시토크롬 c가 유출되었다(도 2b). 또한, MTD 펩타이드-유도 세포사는 pan-카스파제(pan-caspase) 저해제 zVAD-fmk 또는 IDN-6556에 의해 차단될 수 있었으며(도 2c), 이는 MTD 펩타이드-유도 세포사가 비-카스파제 과정에 의해 매개된다는 것을 뒷받침한다. MTD 펩타이드 및 돌연변이 MTDmt5 펩타이드(살해 활성이 없는 돌연변이 펩타이드(도 3a))를 처리하여 분리된 미토콘드리아는 어떠한 형태학적 변화 또는 미토콘드리아 크기의 변화도 나타나지 않았다(도 7d). 그러나, R8 또는 △R8:MTD가 세포사를 야기하지 못하였고(도 2c), 이는 세포질막을 통과하고, 세포사를 야기하는 일부 세포기질 요인들을 활성화시키기 위해서 MTD 펩타이드가 필요하다는 것을 뒷받침한다. 카스파제는 MTD, 돌연변이 MTDmt4(살해 활성을 보유한 돌연변이 펩타이드(도 3a)) 또는 MTDmt5 펩타이드 에 의해 활성화되지 않았다(도 7e). HeLa 세포에 Noxa 41-54를 형질도입시켜 유도된 세포사는 zVAD-fmk에 의하여 저해되지 않은 반면, Noxa 야생형 형질도입에 의해 유도된 세포사는 zVAD-fmk에 의하여 크게 저해되었다(도 10)는 사실에 의해 추가적으로 확인되었다. 이와 함께, 이러한 결과들은 Noxa MTD가 카스파제-독립적인 방식으로 세포괴사-유사 세포사를 유도한다는 것을 뒷받침한다.
MTD 펩타이드의 치환 변이체(Substitution Variants)는 세포사 -유도 활성을 유지한다
본 발명자들은 MTD 펩타이드 변이체들이 세포-살해 활성을 유지하는 지에 대해 추가적으로 실험하였고, 표 1에 있는 몇 개의 펩타이드 변이체는 이전에 서술된 방법에 의해 제작되었다. 본 발명자들은 이러한 MTD 치환 변이체들의 HeLa 세포에서의 세포 살해 활성을 확인하여 도 1e과 같은 실험 데이터를 삽화하였다. 그 결과, 세포-살해 활성이 MTD 펩타이드에 비해 약간 감소하였으나 MTD 2(1 개의 잔기를 치환), MTD 3(2 개의 잔기를 치환) 및 MTD 5(3 개의 잔기를 치환)는 탁월하게 세포사를 유도하였다. MTD 4(2 개의 잔기를 치환)는 MTD 펩타이드 보다 더 탁월한 세포-살해 활성을 나타냈다.
MTD 의 류신( leucine ) 잔기는 세포사 -유도 활성에 있어 중요하다.
세포사를 야기하는 MTD에 있어 중요한 아미노산을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 MTD 펩타이드에 스캐닝 돌연변이를 도입하였다(표 1). HeLa 세포에서 MTDmt1 및 MTDmt2 펩타이드는 유사한 세포사-유도 활성을 나타냈다. MTDmt3 및 MTDmt5 펩타이드는 완벽하게 세포사-유도 활성이 소실되었다(도 3a). MTDmt3 및 MTDmt5 펩타이드는 일반적으로 류신 잔기를 포함하고, 이는 MTD의 류신 잔기가 세포사-유도 활성에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 뒷받침한다.
MTD의 류신 잔기들 중 어느 것이 그 기능에 있어 중요한 지를 확인하기 위하여, MTD에 있는 4 개의 류신 잔기를 치환시킨 치환 돌연변이체인 4Lmt Noxa 돌연변이체 4 개를(L42A, L43A, L45A, 및 L49A) 제작하였다. 또한, Noxa BH3 도메인의 류신 잔기가 그의 살해 활성에 있어 중요한 것으로 나타났기 때문에, BH3 도메인의 4Lmt 및 추가적인 돌연변이(L29A)와 동일한 돌연변이를 MTD에 포함하는 5Lmt Noxa 돌연변이체를 제작하였다(6). 야생형 WT Noxa가 60% 이상의 세포사를 유도한 반면, 4Lmt 및 5Lmt는 세포사-유도 활성을 거의 완벽하게 소실하였다. 4Lmt 및 5Lmt에 있어 세포사-유도 활성의 소실은 주로 Noxa 미토콘드리아 로컬리제이션(localization)의 소실에 의한 것이다(도 8a 및 도 8b). MTD에 있어 중요한 잔기를 추가적으로 확인하기 위하여, 본 발명자들은 MTD(L42A, L43A, L45A, 및 L49A) 또는 BH3 도메인(L29A) 중 하나에 단일 아미노산 치환(류신 잔기를 알라닌 잔기로), 또는 MTD(L45A 및 L49A) 및 BH3 도메인(L29A) 모두에 트리플 치환(3Lmt)을 제작하여 세포사-유도 활성에 대한 효과를 평가하였다. 첫째, 본 발명자들은 이러한 돌연변이체들의 Noxa 미토콘드리아 로컬리제이션을 확인하였다. 공초점 현미경 이미지에 기초한 분석에 따르면, Noxa 점돌연변이체((L42A, L43A, L45A, 및 L49A)는 전형적인 Noxa의 미토콘드리아 로컬리제이션을 유지하였다. Noxa L29A, L45A, L49A, 및 3Lmt 돌연변이체는 눈에 띄게 세포-유도 활성이 감소하였으며, 이는 MTD에 있는 45 및 49 류신 잔기 모두와 BH3 도메인에 있는 29 류신이 Noxa-유도 세포사에 있어 중요한 역할을 한다는 것을 가리킨다.
Mcl-1은 Noxa의 BH3 도메인에 결합하여 Noxa-유도 세포사를 저해하는 것으로 알려져 있다(12, 17, 18). Noxa의 MTD 구역의 점돌연변이가 Noxa와 Mcl-1의 결합에 영향을 미치는 지에 대해 확인하기 위하여, Mcl-1 및 Noxa 돌연변이체 간의 상호작용을 면역침강방법으로 확인하였다. MTD 구역의 Noxa 돌연변이체는 Mcl-1에 결합하는 결합능을 유지하였으며, 이는 L45A 및 L49A의 감소된 살해 활성이 Mcl-1 결합 활성의 소실로 인한 것이 아니라는 것을 나타낸다(도 8c).
세포의 다른 유형에 있어 MTD 펩타이드에 대한 민감성을 확인하기 위하여, HeLa 세포, NCI-H460 또는 A549에 0.5 내지 5 μM MTD 펩타이드를 처리하였다. HeLa 세포는 5 μM MTD 펩타이드에서 최소 민감성을 나타냈고(도 8d); 그러나, NCI-H460 세포는 5 μM MTD 펩타이드에서 매우 민감했으나 5 μM MTDmt3 또는 MTDmt5 펩타이드에서는 그렇지 않았다(도 3d). 이러한 결과들은 세포의 다른 유형에 따라 5 μM MTD 펩타이드에 대한 민감성이 상이하다는 것을 보여준다.
MTD 펩타이드에 의해 증가된 세포기질 칼슘은 mPT 포어의 개통( opening )에 연관이 있다.
칼슘은 다양한 세포내 신호에 의존적인 세포 생존과 세포사 모두를 조절하는 조절인자로써 알려져 있다(19, 20). 따라서, 본 발명자들은 세포기질에서 MTD 펩타이드가 칼슘 농도를 변화시키는 지에 대한 실험을 하였다. HeLa 세포에서 세포기질 칼슘의 변화는 형광 칼슘 지표인 Fluo-4-AM를 이용하여 모니터링하였다. 세포기질 칼슘은 MTD 펩타이드를 처리한 후 1-3 분 안에 크게 증가되었고, 이어서 곧 분해가 관찰되었으며; 그러나, MTDmt3 및 MTDmt5 펩타이드를 처리한 HeLa 세포에서는 세포기질 칼슘 수준의 변화가 유도되지 않았다(도 4a). 이것은 세포기질 칼슘 스파이크가 MTD 펩타이드-유도 세포사에 있어 중요한 사건이라는 것을 뒷받침한다. 만약 이러한 세포기질 칼슘의 증가가 MTD 펩타이드-유도 세포사의 주요 원인이라면, 칼슘 선택적 킬레이터인 BAPTA-AM로 MTD 펩타이드-유도 세포사를 저해할 수 있다. 예측한 바와 같이, BAPTA-AM을 전처리한 HeLa 세포에서는 MTD 펩타이드-유도 세포사가 저해되었고(도 4b), 이는 세포기질 칼슘 스파이크가 MTD 펩타이드-유도 세포사에 있어 중요한 사건이라는 것을 뒷받침한다.
Noxa의 MTD가 미토콘드리아를 표적하고, MTD 펩타이드는 세포기질 칼슘 스파이크를 유도하기 때문에, MTD 펩타이드-유도 세포사 동안 관찰된 세포기질 칼슘 스파이크가 mPT 포어의 개통에 의해 야기된다는 것을 본 발명자들은 예측 할 수 있었다. 그러나, MTD 펩타이드에 의해 증가된 세포기질 칼슘이 IP3 수용체(IP3R) 및 리아노딘 수용체(RyR)를 통해 ER로부터 유출된 칼슘에 의한 것이거나 또는 세포 외부로부터 유입된 칼슘에 의한 것일 가능성도 있다(21). 이러한 가능성을 조사하기 위하여, 칼슘 무첨가 KRB 배지, IP3 및 RyR를 각각 차단하는 2-APB(2-Aminoethoxy-diphenylborate)이 있는 경우 또는 mPT 포어를 차단하는 CsA(cyclosporine A)가 있는 경우 HeLa 세포의 MTD 펩타이드에 의한 세포기질 칼슘 변화를 시간차 비디오 공초점 현미경으로 확인하였다(도 4c). 칼슘 무첨가 KRB 배지 및 KRB 배지에 2-APB(2-Aminoethoxy-diphenylborate) 및 리아노딘이 있는 경우 세포기질 칼슘 스파이크가 관찰되었고, 이는 MTD 펩타이드에 의한 세포기질 칼슘 스파이크는 ER로부터 유출된 칼슘 또는 세포의 외부로부터 유입된 칼슘에 의한 것이 아니라는 것을 가리킨다. 그러나, 세포기질 칼슘 스파이크는 CsA가 있는 경우에는 관찰되지 않았으며, 이는 세포질 MTD 펩타이드에 의한 칼슘 스파이크가 미토콘드리아로부터 유출된 칼슘에 의해 발생되었다는 것을 뒷받침한다.
CsA는 mPT 포어에 대해 안정된 차단제이기 때문에, mPT 포어의 투과성은 코발트-퀀칭 칼세인 어세이를 이용하여 직접적으로 모니터링되었다. 비-형광 세포막 투과성 칼세인-AM 및 코발트를 HeLa 세포에 첨가하였고, 세포막 비-투과성 칼세인은 세포질 및 미토콘드리아에 있는 비-특이 에스테라제에 의해 자발적으로 생성될 수 있다. 세포질 칼세인 시그널은 코발트에 의해 퀀칭될 수 있고; 그러나, 코발트가 미토콘드리아 세포막을 침투하지 못하기 때문에 미토콘드리아 칼세인 시그널이 퀀칭될 수 있다. 미토콘드리아 칼세인 시그널(녹색)은 미토콘드리아 특이 염료인 MitoTracker(적색)와 중복되어, 코발트가 미토콘드리아 칼세인 시그널이 아닌 세포질 칼세인 시그널을 퀀칭한다는 것을 확인해 준다(도 5a). mPT 포어가 열리는 경우, mPT 포어를 통하여 미토콘드리아로 코발트가 유입되고, 그 후 미토콘드리아 칼세인 시그널이 퀀칭된다. MTD 펩타이드를 처리하지 않은 HeLa 세포에서는, 미토콘드리아 칼세인 시그널이 5 분 동안 유지되었고, 또한 MitoTracker 염색과 중복되어, 이는 mPT 포어가 닫혔다는 것을 나타낸다(도 5b, 상위 패널). 그러나, MTD 펩타이드를 처리한 HeLa 세포에서는, MTD 펩타이드 처리 후 미토콘드리아 칼세인 시그널이 5 분 내에 급격하게 감소되었고, 이는 mPT 포어가 MTD 펩타이드에 의해 열렸다는 것을 나타낸다(도 5b, 하위 패널). 종합해보면, 이러한 결과들은 MTD 펩타이드가 mPT 포어를 열어 미토콘드리아 칼슘이 세포기질 안으로 유출되도록 한다.
종양-조직지향성 MTD ( TU : MTD ) 펩타이드가 종양의 성장을 억제한다.
PTD(protein transduction domain) 펩타이드가 어느 유형의 세포의 세포질막도 침투할 수 있는 기본 아미노산 잔기(예컨대, 8 개의 아르기닌)를 포함하고 있기 때문에, 동물에게 조직 주사된다면 매우 유독하다. 따라서 종양 살해제로 MTD 펩타이드를 개발하기 위해서는, 종양 세포 또는 종양 혈액 혈관에 선택적으로 전달되도록 재설계되어야 한다. 3 개의 종양-조직지향성 MTD(TU:MTD) 펩타이드는 종양 맥관 구조-표적화 모티브를 포함하도록 합성되었고(표 7)(22,23), 마우스 대장암종 세포주인 CT26을 이용하여 종양 세포 살해 활성을 확인하였다. TU2:MTD 및 TU3:MTD 펩타이드는 CT26 세포에서 MTD 펩타이드에 비교할 만한 살해 활성을 나타냈다; 그러나, TU1:MTD 펩타이드는 살해 활성이 없거나 약간 있는 것으로 나타났으며 이는 TU2:MTD 및 TU3:MTD 펩타이드가 CT26 세포의 세포질막을 침투할 수 있다는 것을 가리킨다(도 9a). 이러한 펩타이드들이 동물에게 있어 종양 살해 활성 또는 종양의 성장에 영향을 미치는 지를 확인하기 위하여, CT26 세포를 피하 주사하여 종양을 발생시킨 Balb/c 마우스에게 TU2:MTD 또는 TU3:MTD 펩타이드를 정맥 주사하였다. TU2:MTD 또는 TU3:MTD 펩타이드를 처리한 마우스는 PBS(도 6a 및 도 6b)를 처리한 마우스보다 눈에 띄게 종양의 크기가 축소되었다. 종양의 병리학적 관찰에서는 TU2:MTD 또는 TU3:MTD 펩타이드를 정맥 주사한 마우스에서 종양 세포의 대량 세포사가 관찰되는 것으로 나타났다; 그러나, PBS를 주사한 마우스에서는 종양 세포의 어떠한 세포사도 나타나지 않았다(도 6c). PBS-주사 마우스, TU2:MTD 펩타이드-주사 마우스, 또는 TU3:MTD 펩타이드-주사 마우스의 진피층 및 표피층 부위는 세포사가 없거나 또는 약간 있는 유사 구조를 갖는 것으로 나타났다; 또한, 현미경 분석에서는 TU2:MTD 또는 TU3:MTD 펩타이드를 주사한 마우스로부터 수득한 간 및 신장 조직에서 어떠한 손상도 나타나지 않았으며, 이러한 펩타이드-주사 마우스들에게는 어떠한 몸무게 감소도 나타나지 않았다(도 9b-9d 및 도 6d), 이는 TU2:MTD 또는 TU3:MTD 펩타이드가 마우스에게 유독한 효과를 나타내지 않는다는 것을 보여준다. 이와 함께, 이러한 결과들은 TU2:MTD 또는 TU3:MTD 펩타이드가 선택적으로 종양 부위를 표적화하여 정상 세포가 아닌 종양 세포의 대량 세포사를 유도한다는 것을 나타낸다.
고찰
요약하자면, 본 발명자들은 mPT 포어의 활성에 의한 칼슘 모빌리제이션을 통하여 BH3 도메인에 상관없이 Noxa 자체의 BH3-단독 단백질에 있는 MTD가 세포사를 증진시키는 도메인이라는 것을 확인하였다. 또한 본 발명자들은 세포사 유도를 위한 Noxa MTD의 중요한 아미노산 잔기(L45 및 L49)를 확인하였고 추가적으로 MTD 펩타이드가 종양 전달 도메인과 융합된 암-치료 약물로써 개발될 수 있다는 것을 보여주었다.
세포 괴사가 세포내 부종, 세포기관 용해 및 세포질막 붕괴으로 특징되는 반면, 세포자멸사는 세포 수축, 염색질 응축 및 세포자멸적 소체(apoptotic body)의 생성이 나타난다. 이러한 세포사의 두 가지 방식은 명백하게 독특하고 연관성이 없는 것처럼 보이지만, 최근의 연구들은 이러한 두 가지 방식의 세포사가 환경적 조건 및 세포사 자극에 의해서 서로 전환될 수 있다고 제기하고 있다(24-29). 이러한 관점에서, BH3 도메인은 세포자멸사에 있어서 중요한 역할을 하고 MTD는 세포괴사에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 보고 Noxa의 도메인에 주목하였다. 이러한 관점은 Noxa BH3 도메인에 돌연변이의 도입이 에토포시드, 아드리아미신 또는 이중-가닥 RNA 및 악티노미신에 의해 유도된 세포자멸사를 감소한다는 사실로써 증명되었다(6, 30). 한편, 본 연구에서 본 발명자들은 Noxa의 MTD를 포함한 펩타이드가 세포괴사를 유도한다는 것을 확인하였으며(도 2), 이는 Noxa의 MTD가 세포괴사에 기여한다는 것을 뒷받침한다. 이 관점은, Noxa 21-40을 형질도입시킨 HeLa 세포에서 세포자멸사의 특징인 세포막 기포형성이 관찰된 반면, Noxa 41-54를 형질도입시킨 HeLa 세포에서는 세포괴사의 전형적인 세포질막 구조인 기포-유사 구조가 관찰되었다는 사실에 의해 추가적으로 증명되었다(데이터 미수록) . 또한, Noxa 41-54 형질도입시킨 HeLa 세포(8) 및 MTD(도 2b)에서 시토크롬 c 유출 또는 카스파제-3 활성이 나타나지 않았다는 사실은 MTD 펩타이드-유도 세포사의 메카니즘이 Noxa MTD-유도 세포사와 유사할 것이라는 것을 가리킨다.
MTD의 소수성(hydrophobicity) 때문에 MTD 펩타이드-유도 세포사의 특이성에 대한 의문이 제기될 수 있으며, 이는 지질이중층의 붕괴로 인해 세포막 구조에 직접적인 손상을 입힐 수도 있음을 상정한다. 그러나, 본 발명자들은 다음과 같은 이유로서, MTD 펩타이드가 특이적 세포사를 유도한다는 것을 확신하였다. 비-특이 세포막 손상을 야기하는 펩타이드는 자체적으로 세포막 구조를 직접 붕괴한다. 그러나, △R8:MTD(도 3d)는 어떠한 세포사-유도 활성도 나타내지 않았고, 이는 PTD가 없는 MTD 펩타이드는 세포막에 손상을 입히지 못한다는 것을 나타낸다. 또한, 분리된 미토콘드리아에서는 MTD 펩타이드에 의한 어떠한 형태학적 변화도 나타나지 않았고, MTD 펩타이드를 처리한 Jurket 세포의 미토콘드리아에서는 미토콘드리아의 부종이 나타났다는 사실은(도 2a), MTD 펩타이드가 세포막 구조를 자체적으로 간단하게 붕괴시키지 못하며, 세포사-유도 활성을 위한 세포기질 요소가 필요하다는 것을 나타낸다. 이러한 예상은 MTDmt3 및 MTDmt5를 포함하는 돌연변이체 MTD 펩타이드가 HeLa 세포에서 어떠한 세포사도 유도하지 못했다는 사실에 의해 추가적으로 뒷받침 될 수 있다(도 3a). MTD 펩타이드에 대한 다른 세포주들의 상이한 민감성은 MTD 펩타이드-유도 세포사의 특이성에 대한 또 다른 증거이다(도 3). 이와 함께, 이러한 데이터들은 MTD 펩타이드가 비특이 세포막 손상 또는 붕괴를 야기하지 못하며, MTD 펩타이드가 세포를 살해하기 위해서는 일부 세포기질 요소를 필요로 한다는 것을 나타낸다.
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Claims (12)

  1. 다음을 포함하는 종양 세포-살해 펩타이드:
    (a) C-말단 부위에 SEQ ID NO:1의 아미노산 및 SEQ ID NO:4 내지 7의 아미노산으로 구성된 군으로부터 선택된 미토콘드리아 표적화 도메인(MTD);
    (b) N-말단 부위에 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:3의 아미노산으로 구성된 종양 조직지향성 모티브; 및
    (c) 상기 MTD와 상기 종양 조직지향성 모티브를 연결시키는 펩타이드 링커.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 글리신 올리고머인 것을 특징으로 하는 종양 세포-살해 펩타이드.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 (Gly)2-3인 것을 특징으로 하는 종양 세포-살해 펩타이드.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 종양 세포-살해 펩타이드는 mPT(mitochondrial permeability transition) 포어를 개통하여 세포기질로 미토콘드리아 칼슘 이온이 유출되도록 하는 것을 특징으로 하는 종양 세포-살해 펩타이드.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 종양 세포-살해 펩타이드는 대장 종양 세포, 폐 종양 세포 또는 자궁 경부 종양 세포에 살해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 종양 세포-살해 펩타이드.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 종양 세포-살해 펩타이드는 대장 종양 세포에 살해 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 종양 세포-살해 펩타이드.
  11. 유효 성분으로서 제 1 항, 제 5 항, 제 6 항 및 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 상기 종양 세포-살해 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약제학적 조성물.
  12. 삭제
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