KR20200093328A - 녹사 단백질 유래 세포사 유도 펩타이드 eMTD - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신속하게 작용하는 세포사 유도 펩타이드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 Noxa 단백질에서 유래한, MTD 부분을 포함한 16개의 아미노산으로 구성된 세포괴사를 일으키는 펩타이드에 관한 것이다. 이는 아미노산 10개로 구성된 MTD부분을 포함하였으므로 eMTD (extended MTD)라고 이름 붙였다. 본 발명에 따르면 eMTD는 여러 세포주에서 빠르고 강력하게 세포괴사를 일으켰으며, 이는 특정한 세포를 표적화하는 펩타이드나 물질들과 결합하여 암 등의 각종 질환의 치료에 응용될 수 있다.

Description

녹사 단백질 유래 세포사 유도 펩타이드 eMTD {Cell-killing peptide eMTD derived from Noxa}
본 발명은 신속하게 작용하는 세포사 유도 펩타이드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 Noxa 단백질에서 유래한, MTD 부분을 포함한 16개의 아미노산으로 구성된 세포사 유도 펩타이드에 관한 것으로, 본 발명의 펩타이드는 여러 세포주에서 빠르고 강력하게 세포괴사를 일으켰으며, 이는 특정한 세포를 표적화하는 펩타이드나 물질들과 결합하여 암 등의 각종 질환의 치료에 응용될 수 있다.
세포사의 형태는 매우 다양하다. 지금까지의 세포사에 대한 활발한 연구로 여러 가지 형태의 세포사가 보고되었는데, 가장 오래된, 수동적 세포사의 개념인 세포괴사(necrosis)를 비롯하여 계획된 비염증성의 세포사인 세포자멸사(apoptosis), 계획된 세포괴사라는 개념의 네크로토시스(necroptosis), 염증이 유발된 곳에서 일어나는 파이롭토시스(pyroptosis), 세포 내의 철 이온에 의존하는 페롭토시스(ferroptosis) 등의 세포사들이 여기에 속한다. 이들은 각기 다른 원인과 특성을 가지고 있지만 서로 완벽하게 분리되어 있지 않으며, 생리학적으로 상호작용하며 항상성을 지켜간다.
세포사의 조절은 매우 중요한 문제이며 조절능력에 이상이 생기는 경우 여러 가지 문제가 발생한다. 세포사 조절능력의 붕괴로 발생하는 가장 대표적인 질병은 암이다. 암은 비정상적으로 조직이 자라나서 다른 조직에 침윤하는 성질을 보이는데 정상적인 세포사 기능이 망가진 세포들로 주로 구성된다. 여러 가지 자가면역성 질환들도 세포사의 조절이 망가진 경우들이다. 염증성 세포들이 다른 곳으로 옮겨가지 못하거나 세포사의 조절실패로 많은 수가 남아있는 경우에 필요이상의 염증이 계속되는 상황이 발생하게 된다.
세포사를 일으키는 약물들은 이미 널리 사용되고 있다. 대표적인 약물들이 항암제인데, 수많은 항암제들이 암세포에서 세포괴사와 세포사멸을 일으켜 암을 치료하고 있다. 대표적인 예로는, DNA의 알킬화를 유도해서 세포사를 일으키는 약물들(예를 들어, cisplatin, etoposide), 대사길항제로 사용되는 약물들(예를 들어, methotrexate, fluorouracil)이 있다. 이러한 약물들은 자가면역 질환에서도 많이 사용되는데, 류마티스 관절염(methotrexate), 루푸스(cyclophosphamide), 다발성 경화증(cyclophosphamide)등에서 사용되고 있다.
Noxa 단백질은 세포자멸사를 일으키는 단백질이다. Noxa는 DNA의 손상이 있을 때나 유전자 독성이 있을 때는 p53 유전자를 발현시키는 방법으로 발현이 유도되고, 조직의 허혈 상황이나 프로테아좀(proteosom) 억제 등의 상황에서는 p53 유전자와 상관없는 방법으로 발현이 유도된다. 발현된 Noxa 단백질은 BH3 (Bcl-2 homology 3) 도메인을 이용하여 Mcl1과 Bcl2A1에 결합하여 억제시킨다. 결과적으로 BAX와 BAK 단백질이 활성화되고 Cytochrome-c가 세포질로 유출되어 Caspase system이 작동하여 세포자멸사를 일으킨다.
이에, 본 발명의 목적은 암세포 특이적 세포괴사 유도 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암세포 특이적 세포괴사 유도 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암세포 특이적 세포괴사 유도 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암세포 특이적 세포괴사 유도 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암세포 특이적 세포괴사 유도 펩타이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암세포 특이적 세포괴사 유도 펩타이드의 암 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암세포 특이적 세포괴사 유도 펩타이드를 이용한 암 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 암세포 특이적 세포괴사 유도 펩타이드 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 세포에서 신속하고 강력한 괴사를 일으키는 펩타이드에 관한 것으로서, Noxa 단백질에서 유래한, MTD (mitochondria targeting domain) 부분을 포함하는 펩타이드 eMTD (extended MTD)가 암세포를 죽이는 것을 발견하고 이를 이용한 세포사유도 펩타이드, 이를 암호화하는 뉴클레오타이드, 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 형질전환세포 및 상기 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 MTD 도메인을 연장하여 세포투과 펩타이드나 다른 표적화 펩타이드와 융합하지 않고서도 세포사를 일으킬 수 있는 펩타이드를 만들었다. 이 펩타이드의 아미노산 서열은 Noxa 단백질의 아미노산 서열에서 유래하였으며, 최소 16개의 아미노산으로 구성되어있다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 세포괴사 유도 펩타이드에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 세포괴사 유도 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 세포괴사 유도 펩타이드는 N-말단부 및/또는 C-말단부에 종양 유도 펩타이드(THP)가 추가적으로 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 종양 유도 펩타이드는 서열번호 5 내지 31로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 종양 유도 펩타이드는 링커를 통해 세포괴사 유도 펩타이드에 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 링커는 세포괴사 유도에 방해가 되지 않을 정도의 길이를 가진 아미노산 서열 또는 세포 내 분해가 가능한 화학연결기를 연결자로 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 링커는 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있으며(Huston, et al., Methods in Enzymology, 203:46-88(1991) 및 Whitlow, et al., Protein Eng., 6:989(1993) 참조), 구체적인 일 예로, 글리신 또는 세린 아미노산과 기타 아미노산들로 구성 되며, 그 길이는 1 내지 5 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.
서열번호 명명 서열목록 비고
5 RGD RGD
6 NGR CNGRCVSGCAGRC
7 RGD-4C CDCRGDCFC
8 iRGD CRGDKGPDC
9 RGDGWK RGDGWK
10 Cilengitide -RGDfV-
11 iNGR CRNGRGPDC
12 Lyp-1(tLyp-1) CGNKRTR
13 F3 KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKK
14 TMTP1 KLAKLAK
15 IF7 IFLLWQR
16 Lyp-1 CGNKRTRGC
17 REA CREAGRKAC
18 AGR CAGRRSAYC
19 LSD CLSDGKRKC
20 SP5-52 SVSVGMKPSPRP
21 D-SP5 PRPSPKMGVSVS
22 PC5-2 TDSILRSYDWTY
23 4R22 CSNIDARAC
24 GX1 CGNSNPKSC
25 RGR CRGRRST
26 DUP-1 FRPNRAQDYNTN
27 SP94 SFSIIHTPILPL
28 RPMrel CPIEDRPMC
29 TCP-1 CTPSPFSHC
30 HN-1 TSPLNIHNGQKL
31 CREKA CREKA
상기 "펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.
본 발명의 펩타이드는 고체상합성법(solid phase peptide synthesis)을 이용하여 화학적으로 직접 합성하는 방법, 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 DNA를 벡터에 삽입하여 in vivo에서 전사(transcription), 번역(translation)을 거쳐 발현시킨 후 정제하여 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 예는 세포괴사 유도 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오타이드는 세포괴사 유도 펩타이드를 암호화하는 코돈을 기초로 자동 합성기에서 화학 합성하여 제조 또는 합성된 유전자의 PCR 증폭 또는 전사를 통해 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포괴사 유도 펩타이드를 코딩하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 세포괴사 유도 펩타이드는 N-말단부 및/또는 C-말단부에 종양 유도 펩타이드(THP)가 추가적으로 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 종양 유도 펩타이드는 서열번호 5 내지 31로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 종양 유도 펩타이드는 링커를 통해 세포괴사 유도 펩타이드에 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 링커는 세포괴사 유도에 방해가 되지 않을 정도의 길이를 가진 아미노산 서열 또는 세포 내 분해가 가능한 화학연결기를 연결자로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 세포괴사 유도 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포괴사 유도 펩타이드를 코딩하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 세포괴사 유도 펩타이드는 N-말단부 및/또는 C-말단부에 종양 유도 펩타이드(THP)가 추가적으로 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 종양 유도 펩타이드는 서열번호 5 내지 31로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 종양 유도 펩타이드는 링커를 통해 세포괴사 유도 펩타이드에 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 링커는 세포괴사 유도에 방해가 되지 않을 정도의 길이를 가진 아미노산 서열 또는 세포 내 분해가 가능한 화학연결기를 연결자로 포함할 수 있다.
상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 또 다른 일 예는 세포괴사 유도 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 세포괴사 유도 펩타이드를 코딩하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 세포괴사 유도 펩타이드는 N-말단부 및/또는 C-말단부에 종양 유도 펩타이드(THP)가 추가적으로 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 종양 유도 펩타이드는 서열번호 5 내지 31로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 종양 유도 펩타이드는 링커를 통해 세포괴사 유도 펩타이드에 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 링커는 세포괴사 유도에 방해가 되지 않을 정도의 길이를 가진 아미노산 서열 또는 세포 내 분해가 가능한 화학연결기를 연결자로 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 숙주세포로는 대장균, 효모, 동물세포, 식물세포, 또는 곤충세포 등을 포함할 수 있으며, 원핵세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 예는 세포괴사 유도 펩타이드를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 상기 세포괴사 유도 펩타이드는 N-말단부 및/또는 C-말단부에 종양 유도 펩타이드(THP)가 추가적으로 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 종양 유도 펩타이드는 서열번호 5 내지 31로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 종양 유도 펩타이드는 링커를 통해 세포괴사 유도 펩타이드에 연결된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 상기 링커는 세포괴사 유도에 방해가 되지 않을 정도의 길이를 가진 아미노산 서열 또는 세포 내 분해가 가능한 화학연결기를 연결자로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 암은 폐암, 유방암, 간암, 피부 흑색종, 위암, 췌장암, 대장암, 난소암, 신장 세포암, 전립선암 또는 뇌종양인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 조성물 내의 유효성분으로서의 세포괴사 유도 펩타이드의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있으며, 고형분 중량 기준으로 0.001 내지 99.9 중량%, 또는 0.1 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%, 또는 0.1 내지 40 중량%일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 이 외에도 비강에 투여하는 국소 분무의 형태를 띌 수도 있다.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연고제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 또는 경피제, 스프레이제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태의 비경구 제형 등으로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 암세포 특이적 세포괴사 유도 융합 펩타이드 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 및 희석제 등의 보조제를 추가로 함유하는 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구를 위한 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 연고제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제, 경피제 등이 포함된다.
비수성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
좌제의 제제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 인간에게 적용하는 구체적 예에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여방식과 표준 약제학적 관행(standard phamaceutical practice)을 고려하여 선택된 약제학적 담체와 혼합되어 투여될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 전분 또는 락토오즈를 함유하는 정제 형태로, 또는 단독 또는 부형제를 함유하는 캡슐 형태로, 또는 맛을 내거나 색을 띄게 하는 화학 약품을 함유하는 엘릭시르 또는 현탁제 형태로 경구, 구강 내 또는 혀 밑 투여될 수 있다.
이러한 액체 제제는 현탁제(예를 들면, 메틸셀룰로오즈, 위텝솔(witepsol)과 같은 반합성 글리세라이드 또는 행인유(apricot kernel oil)와 PEG-6 에스테르의 혼합물 또는 PEG-8과 카프릴릭/카프릭 글리세라이드의 혼합물과 같은 글리세라이드 혼합물)와 같은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제와 함께 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.1 내지 500 ㎎/kg, 바람직하게는 0.5 내지 300 ㎎/kg일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서 개인적인 차이에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량이 상기 투여 용량 미만이면 유의성 있는 효과를 얻을 수 없으며, 그 이상을 초과하는 경우 비경제적일 뿐만 아니라 상용량의 범위를 벗어나므로 바람직하지 않은 부작용이 나타날 우려가 발생할 수 있으므로, 상기 범위로 하는 것이 좋다.
본 발명은 신속하게 작용하는 세포사 유도 펩타이드에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 Noxa 단백질에서 유래한, MTD 부분을 포함한 16개의 아미노산으로 구성된 세포괴사를 일으키는 펩타이드에 관한 것이다. 이는 아미노산 10개로 구성된 MTD부분을 포함하였으므로 eMTD (extended MTD)라고 이름 붙였다. 본 발명에 따르면 eMTD는 여러 세포주에서 빠르고 강력하게 세포괴사를 일으켰으며, 이는 특정한 세포를 표적화하는 펩타이드나 물질들과 결합하여 암 등의 각종 질환의 치료에 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드가 Noxa 단백질의 어느 부분에서 유래되었는지를 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 HeLa 세포주에 eMTD 펩타이드와 eMTDΔ4 펩타이드를 처리한 뒤 MTS 어세이를 통하여 세포의 상대적 생존율을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 HeLa 세포주에 eMTDΔ4 펩타이드를 20 uM 처리하고 3분 뒤 현미경을 통해 촬영하여 처리하기 전과 비교한 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 HeLa, CT26, B16F10 세포주에 eMTDΔ4 펩타이드를 처리한 뒤 MTS 어세이를 통하여 세포의 상대적 생존율을 측정한 결과 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따라 HeLa 세포를 칼슘농도지표인 Fluo-4로 염색한 뒤, eMTDΔ4 펩타이드를 20 uM 처리한 것과 처리하지 않은 것을 콘포칼 현미경을 통해 시간별로 촬영한 사진이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라 HeLa 세포를 칼슘농도지표인 Fluo-4로 염색한 뒤, eMTDΔ4 펩타이드를 처리하지 않고 콘포칼 현미경을 통해 시간별로 촬영한 사진의 ROI (Region of interest) 안의 Fluo-4 강도를 나타낸 그래프이다.
도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따라 HeLa 세포를 칼슘농도지표인 Fluo-4로 염색한 뒤, eMTDΔ4 펩타이드를 20 uM 처리하고 콘포칼 현미경을 통해 시간별로 촬영한 사진의 ROI (Region of interest) 안의 Fluo-4 강도를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 eMTDΔ4 펩타이드에 형광물질(Fluorescein; FAM)을 결합시킨 후 HeLa 세포에 처리하여 5분 후와 10분 후에 고정하여 콘포칼 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 BalB/C 생쥐의 간에서 분리해낸 미토콘드리아에 eMTDΔ4 펩타이드를 처리하여 미토콘드리아가 부풀어버리는 것을 540 nm 파장의 흡광도를 측정하여 관찰한 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 BalB/C 생쥐의 간에서 분리해낸 미토콘드리아에 eMTDΔ4 펩타이드를 처리하여 미토콘드리아가 부풀어버리는 것을 투과 전자현미경(transmission electron microscopy: TEM)을 이용하여 관찰한 사진이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 미토콘드리아의 PTP가 열리는 지를 확인하기 위해, HeLa 세포를 칼세인(Calcein) AM과 코발트 이온을 이용하여 미토콘드리아만 염색하고 eMTDΔ4 펩타이드를 처리하지 않고 시간별로 콘포칼 현미경을 통해 관찰한 사진이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 미토콘드리아의 PTP가 열리는 지를 확인하기 위해, HeLa 세포를 칼세인(Calcein) AM과 코발트 이온을 이용하여 미토콘드리아만 염색하고 eMTDΔ4 펩타이드를 처리한 후 시간별로 콘포칼 현미경을 통해 관찰한 사진이다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따라 HeLa 세포를 미토콘드리아 활성산소 지표인 MitoSox로 염색한 뒤 eMTDΔ4 펩타이드를 20 uM 처리한 것과 처리하지 않은 것을 콘포칼 현미경을 통해 시간별로 촬영한 사진이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 HeLa 세포를 미토콘드리아 활성산소 지표인 MitoSox로 염색한 뒤 eMTDΔ4 펩타이드를 처리하지 않은 것을 콘포칼 현미경을 통해 시간별로 촬영한 사진의 ROI (Region of interest) 안의 MitoSox 강도를 나타낸 그래프이다.
도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 HeLa 세포를 미토콘드리아 활성산소 지표인 MitoSox로 염색한 뒤 eMTDΔ4 펩타이드를 20 uM 처리한 것을 콘포칼 현미경을 통해 시간별로 촬영한 사진의 ROI (Region of interest) 안의 MitoSox 강도를 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 eMTDΔ4 펩타이드에 형광물질(Fluorescein; FAM)을 결합시킨 후 HeLa 세포에 처리하여 시간별로 콘포칼 현미경을 통해 촬영한 사진이다.
도 11a는 본 발명의 일 실시예에 따라 Two-step assay를 시행하여 리포좀의 지질막이 얼마나 손상되었는지 나타낸 그림이다.
도 11b는 본 발명의 일 실시예에 따라 원자력 현미경을 통해(Atomic force microscopy) 시간에 따른 eMTDΔ4 펩타이드에 의한 세포막의 손상을 보여주는 그림이다.
도 11c는 본 발명의 일 실시예에 따라 원자력 현미경을 통해(Atomic force microscopy) eMTDΔ4 펩타이드에 의한 세포막의 손상과 그 깊이를 나타낸 그림이다.
도 11d는 본 발명의 일 실시예에 따라 원자력 현미경을 통해(Atomic force microscopy) eMTDΔ4 펩타이드에 의한 세포막의 손상을 통계처리하여 나타낸 그림이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 펩타이드 합성
펩타이드 합성은 애니젠(주)에 의뢰하여 고체상 펩타이드 합성법(Solid Phase Peptide Synthesis)으로 이루어졌으며 대용량 HPLC 정제법에 의해 정제되었고 DMSO (Dimethyl sulfoxide)의 50% 수용액에 1 mM의 농도로 녹여서 -20℃에서 보관하였다. 펩타이드의 아미노산 서열은 도 1 및 표 2에 나타내었다.
서열번호 명명 서열목록 비고
1 eMTD KLNFRQKLLNLISKLFCSGT
2 eMTDΔ4 KLNFRQKLLNLISKLF
3 MTD KLLNLISKLF
4 Noxa MPGKKARKNAQPSPARAPAELEVECATQLRRFGD KLNFRQKLLNLISKLFCSGT
실시예 2. 암세포주의 배양
각각의 암세포주(HeLa, CT26, B16F10)는 한국세포주은행에서 구입하였다. Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, Fetal Bovine Serum (FBS), Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 등은 Gibco (Thermo Fisher)사의 제품을 구입하여 사용하였다.
각 세포주는 10%의 FBS를 포함한 DMEM 배양액을 이용하여 배양되었으며, 인큐베이터는 CO2 5%, 37℃의 조건으로 유지되었다.
실시예 3. eMTD 펩타이드의 세포사 유도 실험
3-1. 자궁경부암 세포주에서의 세포사 유도 활성 측정
실시예 1에서 제조된 eMTD, eMTD
Figure pat00001
4 펩타이드의 세포사 유도 활성을 알아보기 위하여 암세포주인 HeLa를 96 well plate에 약 90%의 confluency로 배양하였다. 세포를 HBSS 버퍼로 한번 헹군 뒤, 본 발명의 eMTD, eMTD
Figure pat00002
4 펩타이드를 각각 0, 20, 40 uM의 농도로 처리하였다. 한 시간 후 MTS assay agent (Promega)를 처리하고, 다시 한 시간 뒤에 흡광도를 측정하여 세포의 상대적 생존율을 측정한 결과를 도 2 및 표 3에 나타내었다.
0 uM 20 uM 40 uM
fl-Noxa 생존율 (%) 100 101 106
표준편차 0.079 0.037 0.050
eMTD 생존율 (%) 100 61 63
표준편차 0.079 0.007 0.023
eMTDΔ4 생존율 (%) 100 53 40
표준편차 0.079 0.082 0.044
도 2 및 표 3에서 확인할 수 있듯이, eMTD, eMTDΔ4 펩타이드는 강한 세포사 활성을 보여주고 있다.
3-2. 현미경을 통한 세포모양 변화 관찰
세포모양의 변화를 더 구체적으로 관찰하기 위하여 eMTDΔ4 펩타이드 20 uM을 처리하고 현미경(Leika)을 이용하여 관찰하여, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 펩타이드를 처리하고 3분후에 대부분의 세포는 괴사가 진행되어 세포막이 터져있는 것을 볼 수가 있었다.
3-3. 다른 암세포주에서의 세포사 유도 활성 측정
펩타이드가 다른 암세포주에서도 세포사 유도 활성을 보이는지 알아보기 위하여, eMTDΔ4를 암세포주인 HeLa, CT26, B16F10에 각각 0, 20, 40 uM의 농도로 처리하고 MTS assay를 통하여 세포의 생존 정도를 측정하여 도 4 및 표 4에 나타내었다.
eMTDΔ4 HeLa CT26 B16F10
0 uM 생존율 (%) 100 100 100
표준편차 5.72 11.81 7.73
10 uM 생존율 (%) 47 69 68
표준편차 5.07 13.08 5.71
20 uM 생존율 (%) 11 21 33
표준편차 0.98 0.69 3.99
도 4 및 표 4에서 확인할 수 있듯이, eMTD
Figure pat00003
4 펩타이드는 사람의 자궁경부암에서 유래한 HeLa 뿐 아니라 쥐의 대장암에서 유래한 CT26와 쥐의 흑색종 세포에서 유래한 B16F10에서도 세포사를 유도하였다.
실시예 4. eMTDΔ4 펩타이드에 의한 세포사와 세포 내 칼슘 농도의 변화
eMTD 펩타이드가 어떻게 암세포주에서 세포사를 일으키는지 그 기전을 확인하기 위해, 세포사를 일으키는 과정 중 중요한 요소로 알려져있는 세포 내 칼슘농도의 변화를 칼슘인지자인 Fluo-4와 콘포칼 현미경(Leika)을 통하여 관찰하였다.
구체적으로, 실험 전날 HeLa 세포를 Lab-Tek chamber glass에 약 70%의 confluency로 배양하였으며, 실험직전에 칼슘인지자인 Fluo-4를 HBSS에 5 uM의 농도로 희석하여 HeLa 세포에 처리한 후 10분간 인큐베이터에서 배양하고 eMTDΔ4 펩타이드를 처리한 뒤, 그 결과를 도 5a 내지 도 5c에 나타내었다.
도 5a 내지 도 5c에서 확인할 수 있듯이, 펩타이드를 처리하지 않은 HeLa 체포들은 세포내의 칼슘 농도의 변화를 거의 찾아보기 힘들다. 하지만, eMTDΔ4 펩타이드를 처리한 HeLa 세포들에서는 펩타이드를 처리하고 1분도 되지 않아서 세포질 안으로의 칼슘유입이 관찰되며, 이를 그래프로 그려보았을 때 여러개의 톱니모양으로 그려지게 된다. 이러한 칼슘의 유입은 세포막에 수포가 생기고 세포막의 손상이 보이고 나면 감소되어 원래 있었던 칼슘의 양보다 더 적은 양이 되도록 천천히 감소한다.
실시예 5. eMTDΔ4 펩타이드의 세포 내 이동목표 관찰
실시예 4에서 세포 내 칼슘농도의 상승이 관찰되었고, 그 유래를 알기 위해 eMTDΔ4 펩타이드가 어느 곳에서 작용하는지 확인하였다. 이를 위해 eMTDΔ4 펩타이드의 C-말단에 형광물질인 Fluorescein을 부착하였다(eMTDΔ4-FAM). 그 다음, Lab-Tek chamber glass 위에 배양한 HeLa 세포에 eMTDΔ4-FAM를 처리한 후 5, 10분에 각각 1% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 이용하여 고정하였다.
원래 MTD는 미토콘드리아로 이동한다고 알려져 있으므로 미토콘드리아의 외막에 분포하는 TOMM20 항체를 이용하여 미토콘드리아를 시각화하였고, DAPI를 이용하여 세포핵을 시각화하였다. 이를 콘포칼 현미경을 통하여 관찰하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에서 확인할 수 있듯이, eMTDΔ4-FAM의 분포가 시각화한 미토콘드리아의 분포와 일치하는 것을 관찰할 수 있었다. 또한, eMTDΔ4-FAM의 처리 후 미토콘드리아의 모양이 분열되는 모습을 관찰할 수 있었다.
실시예 6. 미토콘드리아에서의 eMTDΔ4의 작용 관찰
6-1. 미토콘드리아의 부풀어 오름을 관찰
실시예 5에서 eMTDΔ4-FAM가 미토콘드리아로 이동하고 미토콘드리아의 분열을 유도하는 것을 관찰하였기 때문에, 실제로 eMTDΔ4가 미토콘드리아에서 어떻게 작용하는지 더 구체적으로 알아보기로 하였다.
먼저 6주령의 BalB/C 마우스에서 간을 꺼내서 완충용액(250 mM mannitol, 70 mM EGTA, 5mM HEPES, pH 7.4, 0.1 mM PMSF and 4 uM rotenone)에 담근 후 Teflon Potter-Elvehjem grider(Sigma)를 이용하여 잘 갈아주었다. 그 다음, 이를 4℃에서 1000 x g로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 얻은 후, 이를 4℃에서 10,000 x g로 10분 동안 원심분리하고 펠렛을 부유용액(250 mM sucrose, 10 mM HEPES, pH 7.4, 5 mM sodium succinate, 2 mM potassium phosphate, 0.1 mM PMSF, 25 uM EGTA, and 4 uM rotenone)으로 부유시켰다.
이렇게 분리한 미토콘드리아에 eMTD와 eMTDΔ4를 각각 25 uM 처리한 후 500 nm 파장의 흡광도를 측정하여 미토콘드리아의 부풀어 오름을 관찰하여, 그 결과를 도 7a 및 표 5에 나타내었다. 양성대조군으로 Ca2+를 200 uM 처리하였으며, 음성대조군으로 Ca2+ 200 uM과 CsA 20 uM을 처리하였다.
또한, 더 직접적인 확인을 위하여 미토콘드리아에 eMTDΔ4(25uM), Ca2+(200 uM), Ca2++CsA(20 uM)를 처리한 후 투과성 전자현미경을 통해 관찰하였고 그 결과들을 도 7b에 나타내었다.
분 0 10 20 30 40 50 60
None 100% 98% 97% 95% 95% 95% 95%
cNoxa del4 100% 79% 74% 70% 68% 66% 65%
cNoxa 100% 86% 78% 71% 68% 68% 67%
Ca 100% 77% 75% 73% 72% 70% 70%
CsA 100% 98% 98% 97% 97% 96% 96%
Ca+CsA 100% 98% 97% 96% 95% 94% 93%
분 0 10 20 30 40 50 60
None 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
cNoxa del4 0% 0% 0% 0% 0.22% 0% 0%
cNoxa 0% 4% 4% 6% 5% 5% 5%
ca 0% 0% 1% 1% 1% 1% 0%
CsA 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
Ca+CsA 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%
도 7a, 도 7b 및 표 5에서 확인할 수 있듯이, eMTDΔ4는 미토콘드리아의 부풀어 오름을 유발하는 것으로 보인다.
6-2. 미토콘드리아의 PTP 관찰
미토콘드리아는 세포사의 과정 중에 PTP(permeability transition pore)를 열어서 칼슘을 세포질로 내보낸다고 알려져 있다. eMTDΔ4가 미토콘드리아로 이동하고 세포질 내의 칼슘이 증가하였으므로, eMTDΔ4의 작용에 PTP가 연관되어 있는지 알아보기 위하여 칼세린 AM과 코발트 이온을 이용해서 PTP가 열리는지 여부를 확인하였다.
구체적으로, 실험 전날 HeLa 세포를 Lab-Tek chamber glass 위에 배양한 뒤에 실험 직전 1 uM의 칼세린 AM과 2 mM의 코발트 이온을 이용하여 20분간 염색하였고, 0.1 uM의 MitoTracker Red를 이용하여 2분간 염색하고, 시간별로 콘포칼 현미경을 통해 관찰하여, 그 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다. PTP가 열리는 경우에는 미토콘드리아 안의 칼세린 AM이 코발트 이온과 만나게 되면서 형광을 잃어버리게 된다.
도 8a 및 도 8b에서 확인할 수 있듯이, eMTDΔ4를 처리한 경우에 미토콘드리아 내의 Calcein AM이 형광을 일어버리는 모습을 보였으며, 이는 eMTDΔ4를 통한 세포질내의 칼슘의 유입이 미토콘드리아의 PTP의 개방을 통하여 생길 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
실시예 7. eMTDΔ4 펩타이드에 의한 세포사와 ROS의 생성
세포사를 일으키는 과정 중 중요한 요소로 세포 내 칼슘농도의 증가 외에 ROS(Reactive oxygen species)가 있다. eMTDΔ4가 세포사를 유도하는 과정 중에 ROS가 어떠한 역할을 하는지 확인하였다.
구체적으로, 실험 전날 HeLa 세포를 Lab-Tek chamber glass 위에 70%의 confluency로 배양하였고, ROS의 발생을 시각화하기 위하여 미토콘드리아에서 발생하는 ROS의 표지자인 MitoSox (Invitrogen)를 이용하여 5 uM의 농도로 10분간 염색하였다. 그 다음. eMTDΔ4를 처리하고 10분 동안 콘포칼 현미경을 이용하여 관찰한 세포의 모양과 ROS의 변화를 도 9a 내지 도 9c에 나타내었다.
도 9a 내지 도 9c에서 확인할 수 있듯이, 아무것도 처리하지 않은 HeLa 세포는 세포의 모양과 ROS의 양이 거의 변화하지 않은데 비해, eMTDΔ4를 처리한 HeLa 세포에서는 세포막에 수포가 생긴 직후부터 ROS의 양이 급격하게 증가하는 모습을 보였다. 이 결과만으로 미토콘드리아에 발생하는 ROS가 세포사의 직접적인 원인이라고 말할 수는 없지만 수포형성 직후(세포막이 손상이 된 시점) ROS가 발생하는 것으로 보아 본 발명의 eMTDΔ4가 미토콘드리아에서 ROS를 발생시킨다는 사실을 확인하였다.
실시예 8. eMTDΔ4 펩타이드에 의한 세포막의 손상
8-1. 콘포칼 현미경 관찰
eMTDΔ4가 유입되는 것과 미토콘드리아와 세포막의 손상의 시간적 순서와 원인관계를 확인하기 위해, 미토콘드리아를 시각화하기 위하여 실험 하루전날 HeLa세포에 Mito-DsRed2를 미리 트랜스펙션 하였다. 그 다음, eMTDΔ4-FAM을 HeLa 세포에 처리한 후 5초에 한번씩 10분간 콘포칼 현미경으로 촬영하여 이를 관찰하여, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 확인할 수 있듯이, 세포의 표면에 수포가 나타나는 순간부터 그 수포 부분을 통해 eMTDΔ4-FAM이 확산되는 것이 보이고, eMTDΔ4이 도달한 후에 미토콘드리아의 분열이 시작되는 것을 관찰하였다.
이는 eMTDΔ4이 채널이나 다른 리셉터를 통해 세포막 안으로 전달되는 것 보다 세포막이 손상이 되고난 후에 그 안으로 확산될 가능성이 더 높음을 말해준다. 확산을 통해 유입된 eMTDΔ4는 미토콘드리아로 이동하여 세포사를 일으키는 것으로 추측된다.
8-2. Two-step assay
eMTDΔ4에 의한 세포막의 직접적인 손상기전을 알아보기 위하여 Two-step assay를 시행하였다.
구체적으로, DOPS, DOPE, DOPC (Avanti polar lipid)를 클로로포름에 2:4:3의 비율로 녹인 후 휘발시키고, 이를 다시 2 mg/mL의 농도로 TbCl3 버퍼(15mM TbCl3, 50 mM sodium citrate, 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4)에 녹였다. 이를 400 nm의 필터를 이용한 Mini extruder (Avanti polar lipid)를 이용하여 리포솜으로 만들었고 세척 버퍼(150 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH7.4)로 세척한 뒤에, 어세이 버퍼(50 uM DPA, 150 M NaCl, 20 mM HEPES, pH 7.4)로 재부유시켰다. 이를 96웰 플레이트에 분주하여 eMTD와 eMTDΔ4를 각각 0, 10, 25 uM씩 처리하였고, 276 nm 레이저를 이용하여 자극시키고 490 nm에서 검출하여, 그 결과를 도 11a 내지 도 11c 및 표 6에 나타내었다.
eMTD eMTDΔ4
0 uM 상대적 형광강도 0% 0%
표준편차 0% 0%
10 uM 상대적 형광강도 27% 25%
표준편차 1% 1%
25 uM 상대적 형광강도 55% 51%
표준편차 3% 1%
도 11a 내지 도 11c 및 표 6에서 확인할 수 있듯이, eMTD와 eMTDΔ4를 처리하였을 때 형광이 더 많이 검출되었으며, 이는 리포좀의 지질막이 손상되어 TbCl3이 누출된 정도를 의미한다. 따라서, eMTD와 eMTDΔ4가 세포막의 지질구조에 직접적으로 작용하여 손상을 가한다는 결론을 내릴 수 있다.
이를 직접적으로 관찰하기 위해 본 발명의 eMTDΔ4를 MDA-MB-231 세포에 처리한 후 세포막에 생기는 구멍을 원자간력현미경(Atomic force microscope)을 이용하여 관찰하였고, 시간 별로 통계 처리하여 도 11d 및 표 7에 나타내었다.
counts counts counts counts
length t=30sec t=2min t=5min t=40min
> 0.625 1.408451 0 0 0
0.675~0.975 38.02817 20.63492 14.81481 2.5
1.025~1.325 43.66197 38.09524 39.50617 22.5
1.375~1.675 9.859155 20.63492 20.98765 22.5
1.725~2.025 4.225352 14.28571 13.58025 22.5
2.075~2.725 2.816901 6.349206 9.876543 22.5
2.775 < 0 0 1.234568 7.5
S.D 18.47933 13.65448 13.38917 10.47957
도 11d 및 표 7에서 확인할 수 있듯이, eMTD
Figure pat00004
4를 MDA-MB-231 세포에 처리한 후에 시간이 지날 수록 세포막에 더 커다란 구멍들이 생기고 있으며. 이는 eMTD
Figure pat00005
4가 MDA-MB-231 세포막의 표면에 손상을 가하고 있다는 것을 직접적으로 보여주고 있다.
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Claims (8)

  1. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 N-말단부 또는 C-말단부에 종양 유도 펩타이드(THP)가 추가적으로 결합되어 있는 것인, 펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 종양 유도 펩타이드(THP)는 서열번호 5 내지 31로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 것인, 펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드.
  5. 제4항의 뉴클레오타이드를 포함하는 재조합벡터.
  6. 제5항의 재조합벡터로 형질전환된 형질전환세포.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 간암, 피부 흑색종, 위암, 췌장암, 대장암, 난소암, 신장 세포암, 전립선암 또는 뇌종양인 것인, 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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