TW201902920A

TW201902920A - 重組robo2蛋白、組合物、方法及其用途

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Publication number: TW201902920A
Application number: TW107119047A
Authority: TW
Inventors: 史蒂芬貝拉希; 珍娜伊莉莎白布爾曼; 奈森希金森-史考特; 麥可夏瑪席金; 馬修羅素; 史帝法諾Ｖ古拉; 宗顯卓; 史瑞庫瑪Ｒ柯丹卡提爾; 慰寧陸; 雪平范; 大衛 J 瑟蘭特
Original assignee: 美商輝瑞大藥廠; 美商波士頓醫療中心公司
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2018-06-01
Publication date: 2019-01-16
Also published as: US10906955B2; WO2018222850A8; JP7315637B2; CA3006926A1; PE20200495A1; AU2018278809A1; US20180346542A1; KR20200016292A; JP2020522248A; US20210214414A1; IL270917A; SG10201913194WA; RU2019143457A; BR112019024742A2; CO2019013315A2; AU2018278809B2; JP2022033727A; RU2019143457A3; MX2019014480A; WO2018222850A1

Abstract

本發明提供經設計以結合SLIT配位體且防止其結合於ROBO2細胞表面受體之重組環形交叉受體2 (ROBO2)蛋白。亦提供使用此等重組ROBO2蛋白之方法。

Description

重組ROBO2蛋白、組合物、方法及其用途

慢性腎病(CKD)為世界範圍內的公眾健康問題，其通常會導致末期腎衰竭。在美國有大約人口的13%或約2700萬人且全世界有超過5億人受到CKD之影響。由於糖尿病及肥胖症持續流行，因此預測CKD在總人口中之發病率會繼續增加。在美國有約50萬名(全世界有約7百萬名) CKD患者將發展為末期腎病(ESRD)且需要進行透析或腎臟移植才會存活。ESRD之罹病率及死亡率較高，且美國每年的開銷為至少400億美元。蛋白尿(亦即尿液中存在過量之血清蛋白——通常界定為尿液白蛋白量＞ 30毫克/天)為伴隨及未伴隨糖尿病之患者中的CKD之早期生物標記、風險因素及替代結果。在CKD早期期間進行降低蛋白尿量的治療可減緩ESRD之進展。然而，當前並不存在可用於患有蛋白尿之CKD患者的腎臟足細胞特異性抗蛋白尿治療。

足細胞為特定上皮細胞，其延長初級突起(primary process)及次級突起(secondary process)以覆蓋腎小球基底膜之外表面。來自鄰近足細胞的富含肌動蛋白之穿插次級突起(亦即足突(foot process)形成過濾狹縫，其係藉由形成對蛋白質滲透之最終屏障的半多孔狹縫隔膜來橋連。蛋白尿為糖尿病性及非糖尿病性腎病中的足細胞損傷之臨床特徵。愈來愈多的公佈研究證實，足細胞之分子組分中的遺傳性、先天性或後天性異常均會導致蛋白尿。儘管足細胞狹縫隔膜蛋白，諸如腎病蛋白(nephrin)及足突蛋白(podocin)之基因突變係與蛋白尿腎病之遺傳形式相關，但日益明確的是，組成狹縫隔膜且與其相關之蛋白質並不僅僅為簡單的結構性屏障。因此，有大量證據表明此等蛋白質會形成可影響足細胞足突結構之平衡信號傳遞網路且經由與肌動蛋白細胞骨架相互作用而起作用。環形交叉 (ROBO) 受體

環形交叉受體2 (Roundabout Receptor 2；ROBO2，亦稱作環形交叉指導受體2或環形交叉同源物2)為Slit指導配位體(SLIT)蛋白配位體之受體。ROBO2表現於腎臟中的腎小球足細胞之基底表面處，且Slit指導配位體2 (SLIT2)存在於腎臟腎小球中。SLIT2結合後，ROBO2與腎小球過濾屏障中之腎病蛋白形成複合物且充當抑制經腎病蛋白誘導之肌動蛋白聚合的負調控劑。ROBO2之缺失會增加足細胞中之肌動蛋白聚合且緩解腎病蛋白剔除小鼠中所見的異常足細胞結構表型。ROBO2之缺失亦會增加足細胞對小鼠中之腎小球基底膜的黏著。此等資料連同具有ROBO2染色體易位的患者不具有蛋白尿之觀測結果一起表明，阻斷SLIT2-ROBO2信號傳遞路徑可增加經腎病蛋白誘導之肌動蛋白聚合以減少蛋白尿。阻斷ROBO2信號傳遞亦可藉由上調經腎病蛋白誘導之肌動蛋白聚合來恢復蛋白尿疾病中之腎小球過濾屏障。

SLIT1、SLIT2及SLIT3. SLIT為與細胞外基質相關之分泌蛋白。所有SLIT之蛋白質序列均顯示高度保守性且具有相同結構：N端信號肽；四個串聯富白胺酸重複域(LRR)，其稱為D1-D4；六個表皮生長因子(EGF)樣域；層黏連蛋白G樣域；另外一個(無脊椎動物)或三個(脊椎動物)EGF樣域及C端半胱胺酸結域。SLIT配位體可經裂解而產生具有未知功能之短C端片段(SLIT-C產物)及呈活性且介導與ROBO之結合的長N端片段(SLIT-N產物)。本文所述之SLIT配位體以及裂解產物(例如SLIT-N、SLIT2-D2)可用於評定ROBO2活性。

脊椎動物中的四個ROBO受體之特徵為：ROBO1/Dutt1；ROBO2；ROBO3/Rig-1及ROBO4/Magic環形交叉(Magic Roundabout)。ROBO1、ROBO2及ROBO3共有一共用細胞外域(ECD)結構，其會生成細胞黏附分子。這一區域含有五個免疫球蛋白樣(Ig樣)域(Ig1、Ig2、Ig3、Ig4及Ig5)，之後為三個3型纖維結合蛋白(FN3)重複序列(圖1A)。此外，如圖1A中所示，ROBO2在其胞內域中具有四個細胞質保守(CC)序列。

全長人類ROBO2前驅體之序列顯示為SEQ ID NO: 24。21胺基酸ROBO2前導序列(SEQ ID NO: 17；根據SEQ ID NO: 24中所示之編號的殘基1至21)在蛋白質生產期間裂解以產生成熟ROBO2 (圖1A)。根據SEQ ID NO: 24中所示之編號的殘基22至859形成細胞外域，SEQ ID NO: 24中所示之殘基860至880形成跨膜域，且SEQ ID NO: 24中所示之殘基881至1378形成細胞質域(圖1A)。

ROBO2之五個Ig樣域(Ig1、Ig2、Ig3、Ig4及Ig5)的例示性序列顯示於表23中。ROBO2前Ig1序列(SEQ ID NO: 8)、Ig1-Ig2域間連接子(SEQ ID NO: 10)及Ig2-Ig3域間連接子(SEQ ID NO: 12)亦揭示於表23中。

SLIT之D2 LRR域以及ROBO之Ig1及Ig2域在進化上為保守的且參與結合。ROBO之Ig1及Ig2域在一起亦稱作SLIT結合域。研究顯示，儘管ROBO2之兩個免疫球蛋白樣(Ig樣)域1及2 (Ig1及Ig2)均與SLIT相互作用；但第一Ig樣域(Ig1)為SLIT之主要結合位點。此外，先前研究表明，與去除第三及第四免疫球蛋白樣域(Ig3及Ig4)相比，去除三個III型纖維結合蛋白(FNIII)重複序列對SLIT與ROBO之結合具有較顯著不利作用(參見例如Liu等人, 2004, Molecular Cellular Neuroanatomy 39:256-261)。

ROBO-SLIT結合後，Rho GTP酶及其調節因子(GAP及GEF)參與下游信號傳遞路徑。在SLIT存在下，SLIT-ROBO Rho GTP酶活化蛋白1 (srGAP1)結合於ROBO之CC3域且使RhoA及Cdc42不活化。此等效應蛋白能夠尤其介導排斥作用、細胞骨架動態變化之控制及細胞極性。在SLIT存在下，Vilse/CrossGAP亦可結合於ROBO之CC2域且抑制Rac1及Cdc42。Rac1亦藉由經由結合於ROBO之CC2-3域的接附蛋白Dreadlock (Dock)募集GEF蛋白無七之子(Son of sevenless；Sos)來活化。這會活化Rac1及p21活化激酶(Pak)之下游靶向物，其亦結合於ROBO CC2-3域。ROBO之此等下游信號傳遞搭配物控制排斥作用及細胞骨架動態變化。酪胺酸激酶阿貝爾森(Abelson；Abl)亦可結合ROBO CC3域且經由CC1域之磷酸化對抗ROBO信號傳遞且介導細胞黏附。Abl之底物Enabled (Ena)亦結合ROBO CC1及CC2域。所有此等下游ROBO-SLIT分子均可用於評定ROBO2活性，且可用於評定本文所揭示之新穎重組ROBO2蛋白之任何中和作用。

在腎臟中，ROBO2與腎病蛋白經由接附蛋白Nck形成複合物。與促進肌動蛋白聚合的腎病蛋白之作用相反，SLIT-ROBO2信號傳遞抑制經腎病蛋白誘導之肌動蛋白聚合。因此，ROBO2胞內域與Nck之結合可用於評定ROBO2活性。

當前並不無可用於保留腎功能或以其他方式治療該疾病之療法供用於患有多種腎小球疾病(包括局部區段性腎小球硬化(Focal Segmental Glomerular Sclerosis))之患者。此外，當前並不存在可用於患有蛋白尿之CKD患者的治療。因此，需要研發一種調節ROBO2-SLIT信號傳遞，由此保留或調節足細胞功能且減少蛋白尿或以其他方式治療或預防與ROBO2-SLIT結合及信號傳遞相關或藉由其介導之腎病的療法。

本發明提供結合於SLIT配位體之重組ROBO2蛋白以及其用途及相關聯方法。熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗確定本文所述的本發明之具體實施例之許多等效物。此類等效物意欲由以下實施例(E)涵蓋。

E1. 一種重組環形交叉受體2 (ROBO2)蛋白，其包含根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基1至203，且其進一步包含免疫球蛋白重鏈恆定域。

E2. 一種重組環形交叉受體2 (ROBO2)蛋白，其基本上由根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基1至203及免疫球蛋白重鏈恆定域組成。

E3. 一種重組環形交叉受體2 (ROBO2)蛋白，其包含(i) SLIT結合部分；及(ii)半衰期延長部分，其中該SLIT結合部分包含ROBO2細胞外域之一部分。

E4. 如E3之重組ROBO2蛋白，其中該ROBO2細胞外域之該部分包含ROBO2之前兩個免疫球蛋白樣(Ig1及Ig2)域及由序列SEQ ID NO: 12組成之C端序列。

E5. 如E3之重組ROBO2蛋白，其中該ROBO2細胞外域之該部分基本上由以下組成：ROBO2前免疫球蛋白樣1(Ig1)序列(SRLRQEDFP (SEQ ID NO: 8))、第一免疫球蛋白樣域(Ig1)、第一與第二免疫球蛋白樣域之間的域間連接子(Ig1-Ig2域間連接子；VALLR (SEQ ID NO: 10))、第二免疫球蛋白樣域(Ig2)及第二與第三免疫球蛋白樣域之間的域間連接子(Ig2-Ig3域間連接子；VFER (SEQ ID NO: 12))。

E6. 如E3至E5中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該ROBO2細胞外域之該部分基本上由根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基1至203組成。

E7. 如E3至E6中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該半衰期延長部分包含免疫球蛋白域。

E8. 如E1、E2或E7中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該免疫球蛋白域為IgA₁ 、IgA₂ 、IgD、IgE、IgM、IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 或IgG₄ 之Fc域。

E9. 如E8之重組ROBO2蛋白，其中該Fc域為人類IgG₁ 之Fc域。

E10. 如E9之重組ROBO2蛋白，其中該Fc域經修飾以消除效應功能。

E11. 如E10之重組ROBO2蛋白，其中該Fc域為人類IgG₁ 之Fc域，且其中該人類IgG1 Fc域包含選自由以下組成之群的至少一種突變：在胺基酸殘基編號234處由丙胺酸取代白胺酸(L234A)、在胺基酸殘基編號235處由丙胺酸取代白胺酸(L235A)及在胺基酸殘基編號237處由丙胺酸取代甘胺酸(G237A)，所有殘基編號均根據如Kabat中所示之Eu編號。

E12. 如E9至E11之重組ROBO2蛋白，其中該人類IgG1 Fc域不包含根據如Kabat中所示之Eu編號的殘基編號447處之離胺酸。

E13. 如E11至E12中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該Fc域包含根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基210至440。

E14. 如E11至E12中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該Fc域由根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基210至440組成。

E15. 如E1、E2或E7中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中根據SEQ ID NO: 1之編號的該等胺基酸殘基1至203與免疫球蛋白域鄰接。

E16. 如E1、E2或E7中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中根據SEQ ID NO: 1之編號的該等胺基酸殘基1至203經由連接子連接至該免疫球蛋白域。

E17. 如E16之重組ROBO2蛋白，其中該連接子為包含約1至30個胺基酸殘基之肽基連接子。

E18. 如E17之重組ROBO2蛋白，其中該肽基連接子係選自由以下組成之群： a)富甘胺酸肽； b)包含甘胺酸及絲胺酸之肽； c)具有序列(Gly-Gly-Ser)_n 之肽，其中n為1、2、3、4、5或6 (SEQ ID NO: 22)；及 d) 具有序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n 之肽，其中n為1、2、3、4、5或6 (SEQ ID NO: 23)。

E19. 如E18之重組ROBO2蛋白，其中該肽基連接子為(Gly-Gly-Ser)₂ (SEQ ID NO: 15)。

E20. 一種重組ROBO2-Fc蛋白，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 1。

E21. 一種重組ROBO2-Fc蛋白，其由胺基酸序列SEQ ID NO: 1組成。

E22. 一種重組ROBO2-Fc蛋白，其包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之胺基酸序列。

E23. 如E1至E22中之任一者之重組ROBO2蛋白，其包含由寄存在ATCC且ATCC寄存編號為PTA-124008的質體之插入物編碼的胺基酸序列。

E24. 如E4或E5中之任一者之重組ROBO2-Fc蛋白，其中ROBO2之該Ig1包含以下突變中之至少一者：S17T及R73Y，各根據SEQ ID NO: 1編號。

E25. 一種重組ROBO2-Fc蛋白，其包含胺基酸序列SEQ ID NO: 19。

E26. 如E25之重組ROBO2-Fc蛋白，其中該蛋白不包含位於根據SEQ ID NO: 19之編號的胺基酸殘基編號441處之C端離胺酸。

E27. 如E1至E26中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該ROBO2為人類ROBO2。

E28. 如E1至E27中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該蛋白以以下或小於以下之結合親和力(K_D )結合SLIT2：約10 nM、約5 nM、約2 nM、約1 nM、約900 pM、約800 pM、約700 pM、約600 pM、約500 pM、約400 pM、約300 pM、約250 pM、約200 pM、約150 pM、約100 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約25 pM、約20 pM、約15 pM、約10 pM、約5 pM或約1 pM。

E29. 如E1至E27中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該蛋白以比ROBO1結合於SLIT2之K_D 值小至少約2倍、約4倍、約6倍、約8倍、約10倍、約20倍、約40倍、約60倍、約80倍、約100倍、約120倍、約140倍、約160倍之K_D 結合SLIT2。

E30. 如E1至E29中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該蛋白以比ROBO1-Fc蛋白結合於SLIT2之K_D 值小至少約2倍、約4倍、約6倍、約8倍、約10倍、約20倍、約40倍、約60倍、約80倍、約100倍、約120倍、約140倍、約160倍之K_D 結合SLIT2。

E31. 如E28至E30中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中K_D 係藉由表面電漿子共振(SPR)量測。

E32. 如E31之重組ROBO2蛋白，其中該K_D 係使用Biacore T200儀器量測。

E33. 如E28至E30中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該K_D 係藉由生物層干涉術(BLI)量測。

E34. 如E33之重組ROBO2蛋白，其中該K_D 係使用ForteBio Octet儀器量測。

E35. 如E1至E34中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該蛋白抑制SLIT配位體與ROBO2之結合。

E36. 如E1至E34中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該蛋白抑制ROBO2依賴性SLITx-N活性。

E37. 如E1至E36中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該蛋白抑制SLIT配位體與ROBO2之結合且抑制ROBO2依賴性SLIT-N活性。

E38. 如E1至E37中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該ROBO2依賴性SLITx-N活性係選自由以下組成之群：肌動蛋白聚合、足細胞黏著及神經元細胞遷移之抑制。

E39. 如E1至E38中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該蛋白之半數最大抑制濃度(IC₅₀ )不超過約15nM、約13nM、約11nM、約9nM、約7nM、約6nM、約5nM、約4nM、約3nM、約2nM、約1nM。

E40. 如E39之重組ROBO2蛋白，其中該IC₅₀ 係藉由均相時間解析式螢光(HTRF)分析量測以供用於抑制ROBO2與SLIT2結合。

E41. 如E1至E40中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該蛋白之半數最大IC₅₀ 不超過約75nM、約65nM、約55nM、約45nM、約35nM、約25nM、約15nM、約5nM。

E42. 如E41之重組ROBO2蛋白，其中該IC₅₀ 係藉由量測經SLIT2-N介導的神經元細胞遷移之抑制來評定。

E43. 如E28至E42中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該SLIT2為人類SLIT2。

E44. 如E1至E43中之任一者之重組ROBO2蛋白，其中該等重組ROBO2蛋白中之兩者結合而形成均二聚體。

E45. 一種經分離之核酸分子，其編碼E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白。

E46. 如E45之經分離之核酸分子，其包含SEQ ID NO: 21之核酸序列。

E47. 如E45之經分離之核酸分子，其由SEQ ID NO: 21之核酸序列組成。

E48. 一種經分離之核酸，其包含寄存在ATCC且ATCC寄存編號為PTA-124008的質體之插入物的核酸序列。

E49. 一種重組ROBO2蛋白，其包含由序列SEQ ID NO: 21編碼之胺基酸序列。

E50. 一種重組ROBO2蛋白，其包含由與序列SEQ ID NO: 21具有至少85%、90%、95%或99%一致性之序列編碼的胺基酸序列。

E51. 一種重組ROBO2蛋白，其包含由能夠在極為嚴格之條件下雜交至序列SEQ ID NO: 21之序列編碼的胺基酸序列。

E52. 一種載體，其包含如E45至E48中之任一者之核酸分子。

E53. 一種宿主細胞，其包含如E45至E48中之任一者之核酸分子。

E54. 一種宿主細胞，其包含E52之載體。

E55. 如E53或E54之宿主細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。

E56. 如E53或E54之宿主細胞，其中該宿主細胞為CHO細胞、HEK-293細胞或Sp2.0細胞。

E57. 一種製造重組ROBO2蛋白之方法，其包含在表現重組ROBO2蛋白之條件下培養E53至E56中之任一者之宿主細胞。

E58. 如E57之方法，其進一步包含分離該重組ROBO2蛋白。

E59. 一種醫藥組合物，其包含E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。

E60. 一種降低ROBO2之生物活性之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物。

E61. 如E60之方法，其中該ROBO2之生物活性係選自由以下組成之群：結合於至少一個SLIT配位體、肌動蛋白聚合、足細胞黏著、抑制經SLIT2-N介導的神經元細胞遷移之抑制，ROBO2與srGAP1之結合及ROBO2與Nck之結合。

E62. 一種治療腎病之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物。

E63. 一種保留足細胞功能之方法，其包含使該足細胞與E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物接觸。

E64. 一種調節足細胞功能之方法，其包含使該足細胞與E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物接觸。

E65. 一種治療腎小球疾病之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物。

E66. 一種治療局部區段性腎小球硬化(FSGS)之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物。

E67. 一種治療腎病變之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物。

E68. 如E67之方法，其中該腎病變為IgA腎病變。

E69. 如E60至E68中之任一者之方法，其中該個體為人類。

E70. 如E60至E69中之任一者之方法，其中靜脈內投與該重組ROBO2蛋白或醫藥組合物。

E71. 如E60至E69中之任一者之方法，其中皮下投與該重組ROBO2蛋白或醫藥組合物。

E72. 如E60至E71中之任一者之方法，其中約一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次、每月兩次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次或每四個月一次投與重組ROBO2蛋白或醫藥組合物。

E73. 如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物，其用作藥劑。

E74. 如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物，其供用於降低細胞中的ROBO2之活性。

E75. 如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物，其供用於降低個體中的ROBO2之活性。

E76. 如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物，其供用於保留個體中之足細胞功能。

E77. 如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物，其供用於調節個體中之足細胞功能。

E78. 如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物，其供用於治療個體中之腎小球疾病。

E79. 如之重組ROBO2蛋白E78，其中該腎小球疾病為FSGS。

E80. 如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物，其供用於治療個體中之腎病變。 E81. 一種如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物之用途，其用於製造用於降低細胞中的ROBO2之活性的藥劑。 E82. 一種如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物之用途，其用於製造用於降低個體中的ROBO2之活性的藥劑。 E83. 一種如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物之用途，其用於製造用於保留個體中之足細胞功能的藥劑。 E84. 一種如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物之用途，其用於製造用於調節個體中之足細胞功能的藥劑。 E85. 一種如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療個體中之腎小球疾病的藥劑。 E86. 一種如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物之用途，其用於製造用於治療個體中之腎病變的藥劑。

E87. 如E80之重組ROBO2蛋白，其中該腎病變為IgA腎病變。

E88. 一種套組，其包含容器；容器中之組合物，其包含如E1至E44中之任一者之重組ROBO2蛋白或E59之醫藥組合物；及含有用於投與治療有效量之重組ROBO2蛋白或醫藥組合物以治療有需要之患者的說明的藥品說明書。

相關申請案之交叉參考

本申請案主張2017年6月2日申請的美國臨時申請案第62/514,242號及2018年4月26日申請的美國臨時申請案第62/663,082號之權益，所述申請案之全部內容以引用之方式併入本文中。達成聯合研究聲明之各方

當前所主張之發明係由達成聯合研究協議之下列各方完成或以其為名義完成。聯合研究協議在所主張發明完成之日或該日期之前生效，且所主張發明係作為在聯合研究協議之範疇內進行的活動之結果而完成。達成聯合研究協議之各方為BOSTON MEDICAL CENTER CORP.及PFIZER INC.。序列表

本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式以電子方式提交且以全文引用之方式併入本文中。2018年5月3日創建的該ASCII複本的名稱為PCFC-0043-WO1_SL.txt且位元組大小為54,754。1. 概述

本發明涵蓋能夠結合SLIT配位體(例如SLIT2配位體)之新穎重組ROBO2蛋白，由此抑制SLIT與ROBO2之相互作用，且因此抑制SLIT2-ROBO2信號傳遞路徑。先前研究顯示，儘管ROBO2之兩個免疫球蛋白樣(Ig樣)域1及2 (Ig1及Ig2)均與SLIT配位體相互作用；但第一Ig樣域(Ig1)為SLIT之主要結合位點。此外，先前研究表明，與去除第三及第四免疫球蛋白樣域(Ig3及Ig4)相比，去除三個III型纖維結合蛋白(FNIII)重複序列對SLIT配位體與ROBO之結合具有較顯著不利作用。亦即與缺失Ig3及Ig4相比，FNIII缺失會引起ROBO與SLIT配位體之結合較顯著減少。

出人意料地，現首次顯示僅包含前兩個免疫球蛋白樣域(Ig1及Ig2)以及Ig2-Ig3域間連接子、VFER (SEQ ID NO: 12)且不含三個III型纖維結合蛋白(FNIII)重複序列之構築體，ROBO2-Fc 2.1 (SEQ ID NO: 2；圖1B)結合SLIT2(圖3)。但相比之下，缺少三個III型纖維結合蛋白(FNIII)重複序列但由以下組成之重組ROBO2蛋白： (i) ROBO2之Ig1域(ROBO2-Fc 1.1；SEQ ID NO: 4，圖1B)， (ii) ROBO2之Ig1及Ig2域(ROBO2-Fc 2.0；SEQ ID NO: 3，圖1B)，或 (iii) ROBO2之Ig1、Ig2及Ig3域(ROBO2-Fc 3.0；SEQ ID NO: 6，圖1B) 並未結合SLIT2 (圖3)。

因此，需要將VFER (SEQ ID NO: 12)添加至Ig1-Ig2域之C端以形成在不存在FNIII重複序列下具有與SLIT2之穩定結合分佈的ROBO2-Fc構築體(ROBO2-Fc 2.1; SEQ ID NO: 2)。此ROBO2-Fc 2.1構築體不僅缺少第三、第四及第五免疫球蛋白樣域(Ig3、Ig4及Ig5)亦不含三個III型纖維結合蛋白(FNIII)重複序列。出人意料地，發現結合或不結合SLIT2之差別在於存在四個胺基酸VFER序列(SEQ ID NO: 12)。

上文所述的重組ROBO2蛋白構築體中無一者含有ROBO2前Ig1序列(SEQ ID NO: 8)。出人意料地發現，本文所揭示及例示的此等重組ROBO2蛋白之產量可藉由包括ROBO2前Ig1序列(SEQ ID NO: 8)顯著提高。與缺乏這一序列之構築體相比，添加該序列會使蛋白質產量增加約25倍，同時保持結合於SLIT2之高親和力(圖3至圖4A至圖4C)。如圖14中所示，此ROBO2前Ig1序列將ROBO2之Ig1域之兩個β片橋連在一起且咸信使N端區之摺疊結構穩定。在不希望受任何特定理論束縛之情況下，前Ig1序列呈現促成經增加之新穎蛋白質之表現。2. 定義

在一些態樣中，本文提供能夠結合SLIT且包含免疫球蛋白域之重組ROBO2蛋白。

術語「重組蛋白」係指藉由重組DNA技術產生之多肽，其中一般而言，編碼多肽之DNA插入至適合表現載體中，繼而引入至宿主細胞中以產生重組蛋白。如本文所用，「蛋白質」係指包含胺基酸且由熟習此項技術者公認為蛋白質的任何組合物。術語「蛋白質」、「肽」及「多肽」在本文中互換地使用。胺基酸可藉由其全稱(例如丙胺酸)或藉由公認的一個字母(例如A)或三個字母(例如Ala)縮寫來提及。

如本文所用，「免疫球蛋白域」為源自免疫球蛋白之多肽。在一些實施例中，免疫球蛋白域包含免疫球蛋白重鏈或其部分。在一些實施例中，重鏈之部分為可結晶片段(Fc)或其部分。如本文所用，Fc片段包含重鏈鉸鏈區及免疫球蛋白之重鏈之C_H 2及C_H 3域。重鏈(或其部分)可源自已知重鏈同型中之任一者：IgG (γ)、IgM (μ)、IgD (δ)、IgE (ε)或IgA (α)。此外，重鏈(或其部分)可源自已知重鏈同型或次型中之任一者：IgG1 (γ1)、IgG2 (γ2)、IgG3 (γ3)、IgG4 (γ4)、IgA1 (α1)、IgA2 (α2)。在一些實施例中，免疫球蛋白域包含免疫球蛋白之不間斷天然(亦即野生型)序列。在一些實施例中，免疫球蛋白Fc域包含變異Fc區。

就本發明中所論述之所有重鏈恆定區胺基酸位置而言，編號係根據Eu索引而定，該Eu索引首次描述於Edelman等人，1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1):78-85中,其描述骨髓瘤蛋白質Eu (第一個經定序人類IgG1)之胺基酸序列。Edelman等人之EU索引亦闡述於Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda中。因此，「如Kabat中所示之EU索引」或「Kabat之EU索引」係指基於Edelman等人在Kabat 1991中所闡述之人類IgG1 Eu抗體的殘基編號系統。

「天然序列Fc區」包含與自然界中存在之Fc區之胺基酸序列一致的胺基酸序列。「變異Fc區」包含與天然序列Fc區之胺基酸序列相差至少一個胺基酸修飾的胺基酸序列。較佳地，與天然序列Fc區相比，變異Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如與天然序列Fc區相比，具有約一個至約十個胺基酸取代，且較佳約一個至約五個胺基酸取代。本文中之變異Fc區將較佳與天然序列Fc區具有至少約80%胺基酸序列一致性，且更佳與其具有至少約90%胺基酸序列一致性，更佳至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%且最佳與其具有至少約99%胺基酸序列一致性。

如本文所用，「連接子」為使兩個分離實體(例如重組ROBO2-Fc蛋白之細胞外域及免疫球蛋白域)彼此結合之分子或分子群，且可在兩個實體之間提供間隔及可撓性以使得其能夠達成其例如特異性結合其同源配位體(例如SLIT配位體)的構形。蛋白連接子為尤其較佳的，且可使用此項技術中熟知的標準重組DNA技術將其表示為重組蛋白之組分。

術語「IC₅₀ 」或「半數最大抑制濃度」係指抑制50%之ROBO2-SLIT信號傳遞途徑，例如ROBO2-SLIT2信號傳遞路徑所需的重組ROBO2蛋白之濃度。IC₅₀ 為抑制50%之ROBO2-SLIT生物過程，諸如ROBO2與SLIT配位體之間的結合、胞內信號傳遞分子(諸如srGAP1或Nck)與ROBO2之胞內域的結合及/或ROBO2-SLIT信號傳遞之下游活性(諸如肌動蛋白聚合、足細胞黏著及/或經SLITx-N介導的神經元細胞遷移之抑制)需要多少重組ROBO2蛋白之量度。較低IC₅₀ 指示較強效作用，因為較少量重組ROBO2蛋白介導較強效抑制作用。

如本文所用，術語「SLITx」一般指SLIT配位體。同樣，術語「SLITx-N」及「SLITx-C」一般分別指SLIT配位體之N端及C端片段。SLIT配位體可為哺乳動物SLIT配位體，較佳人類SLIT配位體。在一些實施例中，SLIT配位體係選自由以下組成之群：SLIT1配位體、SLIT2配位體及SLIT3配位體。SLIT配位體可為SLIT2配位體，較佳人類SLIT2配位體。

如本文所用，「個體」為動物、較佳哺乳動物、更佳非人類靈長類動物且最佳為人類。術語「個體(subject/individual)」及「患者」在本文中互換地使用。在所有實施例中，人類核酸及人類多肽為較佳的。咸信本文其他處所述之使用人類、大鼠及食蟹獼猴分子獲得之結果會預測出可使用其他同源序列獲得之結果。

如本文所用，「治療」為用於獲得有利或所期望之臨床結果的途徑。出於本發明之目的，有利或所期望之臨床結果包括(但不限於)以下中之一或多者：減少蛋白尿(亦即相較於沒有投藥下的尿液中之蛋白水準，降低尿液中之蛋白量)、減少水腫及/或恢復血液白蛋白水準。術語「治療」包括預防性及/或治療性治療。若在病狀之臨床表現之前投與，則治療視為預防性的。治療性治療包括例如改善或降低疾病之嚴重程度或縮短疾病時長。

術語「治療有效量」係指有效「治療」個體中之疾病或病症的本發明之治療劑之量。舉例而言，治療有效量可為緩解疾病之一或多種症狀的量或保持疾病緩解所需之量。在局部區段性腎小球硬化(FSGS)之情況下，治療有效量係指具有以下作用中之至少一者的量：減少蛋白尿(亦即相較於沒有投藥下的尿液中之蛋白水準，降低尿液中之蛋白量)、減少水腫及/或恢復血液白蛋白水準。

當關聯可量測數值變量使用時，「約」或「大約」係指變量之指定值及在指定值之實驗誤差內(例如平均在95%信賴區間內)或在指定值之±10%內(二者中更高的那個)之變量之所有值。數值範圍包括界定該範圍之數字。結合親和力

「結合親和力」一般係指一個結合搭配物(例如本文所揭示之重組ROBO2蛋白)之接觸殘基與其結合搭配物(例如SLIT配位體)之接觸殘基之間的非共價相互作用總和的強度。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對或結合搭配物(例如重組ROBO2蛋白及SLIT2配位體)之成員之間的1:1相互作用的結合親和力。

在最詳細之層面上，ROBO2與SLIT配位體之間的相互作用的結合親和力可由界定ROBO2/SLIT相互作用中所存在之原子接觸的空間座標以及關於其對結合熱動力學之相對作用的資訊來界定。在一個層面上，接觸殘基可藉由界定ROBO2與SLIT之間的原子接觸的空間座標來表徵。在一個態樣中，接觸殘基可由特定標準來界定，例如ROBO2蛋白胺基酸殘基中之原子與SLIT蛋白胺基酸殘基中之原子之間的距離(例如ROBO2胺基酸殘基之重原子至SLIT之胺基酸殘基的重原子的等於或小於約4 Å (諸如本文實例中所用之3.8 Å)之距離)。在另一態樣中，接觸殘基之特徵可為參與與同源結合搭配物或與亦氫鍵合於結合搭配物之水分子的氫鍵相互作用(亦即水介導之氫鍵合)。在另一態樣中，接觸殘基之特徵可為與結合搭配物之殘基形成鹽橋。在又一態樣中，接觸殘基可表徵為歸因於與結合搭配物之接觸殘基相互作用而內埋表面積(BSA)發生非零變化的殘基。在不太詳細之層面上，結合親和力可經由功能，例如藉由與其他蛋白質競爭結合來表徵。

低親和力重組蛋白一般緩慢結合其配位體且往往會容易解離，而高親和力重組蛋白一般較快結合其配位體且往往會保持結合較長時間。此項技術中已知多種量測結合親和力之方法，其中任一者可用於本發明之目的。用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例描述於下文中。

結合親和力可表示為K_D 值，其係指特定重組ROBO2蛋白-SLIT配位體相互作用之解離速率。K_D 為解離速率(rate of dissociation) (亦稱為「解離速率(off-rate) (k_離 )」)與締合速率(association rate) (或「締合速率(on-rate) (k_合 )」)之比率。因此，K_D 等於_k _離 /_k _合且表示為莫耳濃度(M)，且K_D 愈小，結合之親和力愈強。K_D 值可使用此項技術中公認方法測定。用於量測K_D 之一種例示性方法為表面電漿子共振(SPR)，其為此項技術中熟知的方法(例如Nguyen等人 Sensors (Basel). 2015 May 5;15(5):10481-510)。K_D 值可藉由SPR使用生物感測器系統，諸如BIACORE®系統來量測。BIAcore動力學分析包含分析抗原與在表面上具有固定分子(例如包含抗原決定基結合域之分子)之晶片的結合及解離。此項技術中用於測定蛋白質之K_D 的另一熟知方法係藉由使用生物層干涉術(例如Shah等人 J Vis Exp. 2014; (84): 51383)。K_D 值可使用OCTET®技術(Octet QKe系統，ForteBio)來量測。替代地或另外，亦可使用KinExA® (動力排除分析)分析，其購自Sapidyne Instruments (Boise, Id.)。用於評定兩個結合搭配物之間的結合親和力之此項技術中已知的任何方法均涵蓋在本文中。3. 重組 ROBO2 蛋白

在一些態樣中，本發明提供重組ROBO2蛋白。在一些實施例中，本文所揭示之重組ROBO2蛋白結合SLIT配位體(尤其SLIT2配位體)，由此防止SLIT與細胞ROBO2受體結合，且因此稱作SLIT中和配位體陷阱(SLIT neutralizing ligand trap)。出人意料地，如實例中所示，包含前兩個免疫球蛋白樣域(Ig1及Ig2)、lg1-lg2域間連接子以及Ig2-Ig3域間連接子、VFER (SEQ ID NO: 12)且不含三個III型纖維結合蛋白(FNIII)重複序列之構築體，ROBO2-Fc 2.1 (SEQ ID NO: 2；圖1B)結合SLIT2(圖3)。晶體結構研究亦顯示，包括ROBO2 Ig2-Ig3域間連接子、VFER(V200-F201-E202-R203；SEQ ID NO: 12)會有效地穩定ROBO2之第二Ig域的C端區中的摺疊結構(structural fold) (圖15)，且顯著增加重組ROBO2蛋白之表現量。

在一些態樣中，本發明提供包含SLIT結合部分及半衰期延長部分之重組多肽。「SLIT結合部分」賦予重組ROBO2蛋白SLIT結合能力。在一些實施例中，SLIT結合部分包含ROBO2細胞外域之一部分。在一些實施例中，ROBO2細胞外域之該部分包含至少兩個免疫球蛋白樣(Ig樣)域及由VFER (SEQ ID NO: 12)組成之C端序列。在一些實施例中，至少兩個Ig樣域係選自由Ig1、Ig2、Ig3、Ig4及Ig5組成之群。在一些實施例中，至少兩個Ig樣域係選自由以下組成之群：序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，ROBO2細胞外域之該部分包含ROBO2之前兩個Ig樣域(Ig1及Ig2)。在一些實施例中，ROBO2細胞外域之該部分包含SEQ ID NO: 9及/或SEQ ID NO: 11。

蛋白質生產研究亦測定出本文所揭示及例示的重組ROBO2蛋白之產量可藉由包括ROBO2前Ig1序列(SEQ ID NO: 8)顯著提高。添加此序列會使經短暫性及/或穩定轉染之哺乳動物細胞中的蛋白質產量增加約25倍，同時保留結合於SLIT之高親和力(圖3至圖5)。

因此，在一些實施例中，ROBO2細胞外域之該部分進一步包含ROBO2前Ig1序列。在一些實施例中，ROBO2前Ig1序列包含SEQ ID NO: 8。

在一些實施例中，ROBO2細胞外域之該部分包含ROBO2前Ig1序列、Ig1、Ig1-Ig2域間連接子、Ig2及Ig2-Ig3域間連接子。ROBO2前Ig1序列(SEQ ID NO: 8)、Ig1 (SEQ ID NO: 9)、Ig1-Ig2域間連接子(SEQ ID NO: 10)、Ig2(SEQ ID NO: 11)及Ig2-Ig3域間連接子(SEQ ID NO: 12)之例示性序列顯示於表23中且亦示於圖2中。本發明並不限於本文所揭示之序列。來自其他ROBO2同源物、同功異型物、變異體或片段之對應殘基可根據此項技術中已知的序列比對或結構比對來鑑別。舉例而言，比對可人工或藉由使用熟知的序列比對程式，諸如ClustalW2或「BLAST 2 Sequences」使用預設參數來進行。

在一些實施例中，ROBO2細胞外域之部分包含根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基1至203。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白包含與根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基1至203共有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的ROBO2細胞外域之部分。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白包含由根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基1至203組成的細胞外域。

在一些態樣中，ROBO2為人類ROBO2。在一些態樣中，ROBO2為大鼠ROBO2。在一些態樣中，ROBO2為小鼠ROBO2。在一些態樣中，ROBO2為靈長類動物ROBO2。在一些態樣中，ROBO2為猿ROBO2。在一些態樣中，ROBO2為猴ROBO2。在一些態樣中，所述ROBO2為食蟹獼猴ROBO2。

除了SLIT結合部分之外，新穎之重組ROBO2蛋白包含半衰期延長部分。與不具有半衰期延長部分之相同ROBO2蛋白相比，「半衰期延長部分」延長重組ROBO2蛋白之活體內血清半衰期。半衰期延伸部分之實例包括(但不限於)聚組胺酸、Glu-Glu、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧還蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白域、麥芽糖結合蛋白(MBP)、人類血清白蛋白(HSA)或聚乙二醇(PEG)。在一些實施例中，半衰期延長部分包含免疫球蛋白域。在一些實施例中，免疫球蛋白域包含Fc域。在一些實施例中，Fc域源自已知重鏈同型中之任一者：IgG (γ)、IgM (μ)、IgD (δ)、IgE (ε)或IgA (α)。在一些實施例中，Fc域源自已知重鏈同型或次型中之任一者：IgG₁ (γ1)、IgG₂ (γ2)、IgG₃ (γ3)、IgG₄ (γ4)、IgA₁ (α1)、IgA₂ (α2)。在一些實施例中，Fc域為人類IgG1之Fc域。

在一些實施例中，Fc域包含Fc域之不間斷天然序列(亦即野生型序列)。在一些實施例中，免疫球蛋白Fc域包含產生改變的生物活性之變異Fc域。舉例而言，可將至少一個點突變或缺失引入至Fc域中以降低或消除效應子活性(例如WO 2005/063815)及/或增加重組蛋白製造期間的均勻性。在一些實施例中，Fc域為人類IgG1之Fc域且包含以下效應子剔除取代中之一或多者：L234A、L235A及G237A(Eu編號)或相對於SEQ ID NO: 1之編號的L228A、L229A及G231A。在一些實施例中，Fc域不包含位於人類IgG1之C端位置處之離胺酸(亦即利用Eu編號之K447)。不存在離胺酸可增加重組蛋白製造期間的均勻性。在一些實施例中，Fc域包含位於C端位置處之離胺酸(K447，Eu編號)。

在一些實施例中，重組ROBO2多肽包含一個、兩個、三個或四個鏈內二硫鍵，其可位於ROBO2細胞外域處或Fc域處。在一些實施例中，重組ROBO2多肽包含四個鏈內二硫鍵，其中之兩者位於ROBO2細胞外域處且兩者位於Fc域處。在一些實施例中，位於ROBO2細胞外域處之鏈內二硫鍵在Cys31與Cys89之間，及在Cys133與Cys182之間，所有均根據SEQ ID NO: 1之編號。在一些實施例中，位於Fc域處之鏈內二硫鍵在Cys255與Cys315之間，及在Cys361與Cys419之間，所有均根據SEQ ID NO: 1之編號。

在一些實施例中，重組ROBO2多肽中之兩者共價，例如藉由二硫鍵、多肽鍵或交聯劑結合或非共價結合以製造均二聚蛋白。在一些實施例中，兩個重組ROBO2多肽藉助於至少一個，且更佳兩個鏈間二硫鍵經由較佳位於各多肽之免疫球蛋白Fc區中的半胱胺酸殘基共價結合以形成均二聚體。在一些實施例中，兩個鏈間二硫鍵在Cys220與Cys223之間。在一些實施例中，低於90%、低於80%、低於70%、低於60%、低於50%、低於40%、低於30%、低於20%、低於10%、低於8%、低於5%、低於4%、低於2%、低於1%之重組ROBO2多肽經結合而形成均二聚體。

在一些實施例中，重組ROBO2多肽與另一多肽共價，例如藉由二硫鍵、多肽鍵或交聯劑結合或非共價結合以製造異二聚蛋白。在一些實施例中，異二聚蛋白為雙特異性或多特異性的。在一些實施例中，其他多肽包含免疫球蛋白域。在一些實施例中，多肽藉助於至少一個，且更佳兩個鏈間二硫鍵經由較佳位於各多肽之免疫球蛋白Fc區中的半胱胺酸殘基共價結合以形成雜二聚體。在一些實施例中，兩個鏈間二硫鍵在重組ROBO2多肽之Cys220與Cys223之間。在一些實施例中，異二聚蛋白包含兩種不同重組ROBO2多肽。

在一些實施例中，重組ROBO2蛋白之Fc域包含根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基210至440。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白包含與根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基210至440共有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%胺基酸序列一致性的Fc域。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白包含由根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基210至440組成的Fc域。

在一些實施例中，重組ROBO2蛋白之細胞外域與免疫球蛋白域鄰接。亦即ROBO2蛋白之細胞外域的最末C端胺基酸殘基藉由肽基鍵與免疫球蛋白域之最先的N端胺基酸殘基共價連接。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白之細胞外域經由連接子與免疫球蛋白域連接。在一些實施例中，連接子為肽基連接子。在一些實施例中，肽基連接子包含約1至30個胺基酸殘基。在一些實施例中，肽基連接子係選自由以下組成之群：富甘胺酸肽；包含甘胺酸及絲胺酸之肽；具有序列[Gly-Gly-Ser]_n 之肽，其中n為1、2、3、4、5或6 (SEQ ID NO: 22)；及具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_n 之肽，其中n為1、2、3、4、5或6 (SEQ ID NO: 23)。在一些實施例中，肽基連接子為Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 15)。富甘胺酸肽連接子包含其中至少25%殘基為甘胺酸之肽連接子。富甘胺酸肽連接子在此項技術中為熟知的(例如Chichili等人 Protein Sci. 2013 Feb; 22(2): 153-167)。

在一些實施例中，重組ROBO2-Fc蛋白包含序列SEQ ID NO: 1。在一些實施例中，重組ROBO2-Fc蛋白由序列SEQ ID NO: 1組成。在一些實施例中，重組ROBO2-Fc蛋白包含與序列SEQ ID NO: 1具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，重組ROBO2-Fc蛋白包含與序列SEQ ID NO: 1具有至少95%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，重組ROBO2-Fc蛋白包含與序列SEQ ID NO: 1具有至少96%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，重組ROBO2-Fc蛋白包含與序列SEQ ID NO: 1具有至少97%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，重組ROBO2-Fc蛋白包含與序列SEQ ID NO: 1具有至少98%一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，重組ROBO2-Fc蛋白包含與序列SEQ ID NO: 1具有至少99%一致性之胺基酸序列。

在一些實施例中，相對於序列SEQ ID NO: 1進行不超過10、不超過9、不超過8、不超過7、不超過6、不超過5、不超過4、不超過3、不超過2或不超過1次取代。在一些實施例中，相對於序列SEQ ID NO: 1進行不超過5次取代。在一些實施例中，相對於序列SEQ ID NO: 1進行不超過4次取代。在一些實施例中，相對於序列SEQ ID NO: 1進行不超過3次取代。在一些實施例中，相對於序列SEQ ID NO: 1進行不超過2次取代。在一些實施例中，相對於序列SEQ ID NO: 1進行不超過1次取代。在一些實施例中，與包含序列SEQ ID NO: 1之蛋白的K_D 相比，取代不會改變K_D 超過1000倍、超過100倍或10倍。在某些實施例中，取代為根據表1之保守取代。表 1 ：胺基酸取代

在一些實施例中，表4至15中所列的ROBO2胺基酸殘基(E6、D7、F8、P9、V200、F201、E202、R203，各相對於SEQ ID NO: 1編號)中之一或多者未經取代。在一些實施例中，表4至15中所列之胺基酸殘基(E6、D7、F8、P9、V200、F201、E202、R203，其相對於SEQ ID NO: 1編號)中無一者經取代。根據晶體結構研究(參見實例5)，表4至15中所揭示之ROBO2胺基酸殘基為咸信對於支持SLIT結合域之結構完整性至關重要的胺基酸殘基。此等位置處之胺基酸取代可潛在影響SLIT結合。因此，在此等位置處不進行取代可為合乎需要的。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白包含與SEQ ID NO: 1中所示之胺基酸殘基1至203共有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致性的ROBO2細胞外域之一部分，且進一步包含一或多個殘基E6、D7、F8、P9、V200、F201、E202及R203(根據序列SEQ ID NO: 1編號)。

在一些態樣中，可引入相對於序列SEQ ID NO: 1之一或多個點突變以增加重組ROBO2蛋白對SLIT配位體，例如SLIT2之親和力。如實例中所示，對SLIT2之結合親和力可藉由引入相對於序列SEQ ID NO: 1之點突變S17T及R73Y增加約10倍(圖11至13)。因此，在一些態樣中，本發明提供一種具有相對於序列SEQ ID NO: 1之以下突變中之一或多者的重組ROBO2蛋白：S17T及R73Y。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白包含SEQ ID NO: 19中所示之序列。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白由SEQ ID NO: 19中所示之序列組成。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白不包含位於根據SEQ ID NO: 19之編號的胺基酸殘基441處的C端離胺酸。在某些實施例中，本發明之重組ROBO2蛋白之K_D 不超過約1× 10^-6 M，諸如不超過約1 × 10^-7 M、不超過約9 × 10^-8 M、不超過約8 × 10^-8 M、不超過約7 × 10^-8 M、不超過約6 × 10^-8 M、不超過約5 × 10^-8 M、不超過約4 × 10^-8 M、不超過約3 × 10^-8 M、不超過約2 × 10^-8 M、不超過約1 × 10^-8 M、不超過約9 × 10^-9 M、不超過約8 × 10^-9 M、不超過約7 × 10^-9 M、不超過約6 × 10^-9 M、不超過約5 × 10^-9 M、不超過約4 × 10^-9 M、不超過約3 × 10^-9 M、不超過約2 × 10^-9 M、不超過約1 × 10^-9 M、不超過約9 × 10^-10 M、不超過約8 × 10^-10 M、不超過約7 × 10^-10 M、不超過約6 × 10^-10 M、不超過約5 × 10^-10 M、不超過約4 × 10^-10 M、不超過約3 × 10^-10 M、不超過約2 × 10^-10 M、不超過約1 × 10^-10 M、不超過約9 × 10^-11 M、不超過約8 × 10^-11 M、不超過約7 × 10^-11 M、不超過約6 × 10^-11 M、不超過約5 × 10^-11 M、不超過約4 × 10^-11 M、不超過約3 × 10^-11 M、不超過約2 × 10^-11 M、不超過約1 × 10^-11 M、不超過約9 × 10^-12 M、不超過約8 × 10^-12 M、不超過約7 × 10^-12 M、不超過約6 × 10^-12 M、不超過約5 × 10^-12 M、不超過約4 × 10^-12 M、不超過約3 × 10^-12 M、不超過約2 × 10^-12 M、不超過約1 × 10^-12 M、不超過約9 × 10^-13 M、不超過約8 × 10^-13 M、不超過約7 × 10^-13 M、不超過約6 × 10^-13 M、不超過約5 × 10^-13 M、不超過約4 × 10^-13 M、不超過約3 × 10^-13 M、不超過約2 × 10^-13 M、不超過約1 × 10^-13 M。

在某些實施例中，本發明之重組ROBO2蛋白之K_D 在約1 × 10^-7 M至約1 × 10^-14 M、約9 × 10^-8 M至約1 × 10^-14 M、約8 × 10^-8 M至約1 × 10^-14 M、約7 × 10^-8 M至約1 × 10^-14 M、約6 × 10^-8 M至約1 × 10^-14 M、約5 × 10^-8 M至約1 × 10^-14 M、約4 × 10^-8 M至約1 × 10^-14 M、約3 × 10^-8 M至約1 × 10^-14 M、約2 × 10^-8 M至約1 × 10^-14 M、約1 × 10^-8 M至約1 × 10^-14 M、約9 × 10^-9 M至約1 × 10^-14 M、約8 × 10^-9 M至約1 × 10^-14 M、約7 × 10^-9 M至約1 × 10^-14 M、約6 × 10^-9 M至約1 × 10^-14 M、約5 × 10^-9 M至約1 × 10^-14 M、約4 × 10^-9 M至約1 × 10^-14 M、約3 × 10^-9 M至約1 × 10^-14 M、約2 × 10^-9 M至約1 × 10^-14 M、約1 × 10^-9 M至約1 × 10^-14 M、約1 × 10^-7 M至約1 × 10^-13 M、約9 × 10^-8 M至約1 × 10^-13 M、約8 × 10^-8 M至約1 × 10^-13 M、約7 × 10^-8 M至約1 × 10^-13 M、約6 × 10^-8 M至約1 × 10^-13 M、約5 × 10^-8 M至約1 × 10^-13 M、約4 × 10^-8 M至約1 × 10^-13 M、約3 × 10^-8 M至約1 × 10^-13 M、約2 × 10^-8 M至約1 × 10^-13 M、約1 × 10^-8 M至約1 × 10^-13 M、約9 × 10^-9 M至約1 × 10^-13 M、約8 × 10^-9 M至約1 × 10^-13 M、約7 × 10^-9 M至約1 × 10^-13 M、約6 × 10^-9 M至約1 × 10^-13 M、約5 × 10^-9 M至約1 × 10^-13 M、約4 × 10^-9 M至約1 × 10^-13 M、約3 × 10^-9 M至約1 × 10^-13 M、約2 × 10^-9 M至約1 × 10^-13 M或約1 × 10^-9 M至約1 × 10^-13 M範圍內。

在一些實施例中，重組ROBO2蛋白以以下或小於以下之K_D 結合SLIT2：約10 nM、約5 nM、約2 nM、約1 nM、約900 pM、約800 pM、約700 pM、約600 pM、約500 pM、約400 pM、約300 pM、約250 pM、約200 pM、約150 pM、約100 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約25 pM、約20 pM、約15 pM、約10 pM、約5 pM或約1 pM。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白以約600 pM之K_D 結合SLIT2。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白以約500 pM之K_D 結合SLIT2。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白以約400 pM之K_D 結合SLIT2。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白以約300 pM之K_D 結合SLIT2。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白以約250 pM之K_D 結合SLIT2。在一些實施例中，重組ROBO2蛋白以約200 pM之K_D 結合SLIT2。

一般而言，重組ROBO2-Fc蛋白應以高親和力結合於SLIT配位體(例如SLIT2)以便有效地阻斷ROBO2之活性。重組ROBO2-Fc蛋白之結合親和力(K_D )在低奈莫耳及皮莫耳範圍內，諸如約1 × 10^-8 M或小於1 × 10^-8 M為合乎需要的。

在一些實施例中，重組ROBO-Fc蛋白以比ROBO1結合於SLIT2之K_D 值小至少約2倍、約4倍、約6倍、約8倍、約10倍、約20倍、約40倍、約60倍、約80倍、約100倍、約120倍、約140倍、約160倍之K_D 結合SLIT2。在一些實施例中，重組ROBO2-Fc蛋白以比ROBO1-Fc蛋白結合於SLIT2之K_D 值小至少約2倍、約4倍、約6倍、約8倍、約10倍、約20倍、約40倍、約60倍、約80倍、約100倍、約120倍、約140倍、約160倍之K_D 結合SLIT2。 生物活性分析

在某些實施例中，本文所揭示之重組ROBO2-Fc蛋白會降低ROBO2-SLIT信號傳遞之至少一種生物活性。此類活性包括(但不限於)ROBO2與SLIT配位體之間的結合、胞內信號傳遞分子(諸如srGAP1或Nck)與ROBO2之胞內域的結合及/或ROBO2-SLIT信號傳遞之下游活性，諸如肌動蛋白聚合、足細胞黏著及/或經SLIT2-N介導的神經元細胞遷移之抑制以及此項技術中已知的其他ROBO2-SLIT活性。可藉由此項技術中熟知的多種分析來評定重組ROBO2-Fc蛋白是否降低ROBO2之活性。舉例而言，此項技術中已知的分析可用於確定重組ROBO2-Fc蛋白是否：(a)抑制SLIT與ROBO2結合；(b)減少srGAP1與ROBO2之結合；(c)減少Nck與ROBO2之結合；(d)抑制ROBO2依賴性SLIT2-N活性；(e)抑制肌動蛋白聚合；(f)抑制足細胞黏著；及/或(g)抑制經SLIT2-N介導的神經元細胞遷移之抑制。

在某些實施例中，重組ROBO2-Fc蛋白抑制SLIT配位體與ROBO2結合(例如可藉由評定重組ROBO2-Fc蛋白及ROBO2與SLIT2之間的競爭性結合來加以評定)。舉例而言，一種分析可對(i)重組ROBO2-Fc蛋白存在下的ROBO2與SLIT之結合與(ii)不存在重組ROBO2-Fc蛋白下的ROBO2與SLIT之結合進行比較。與不存在測試重組ROBO2-Fc蛋白下的ROBO2與SLIT之結合相比，在重組ROBO2-Fc蛋白存在下，ROBO2與SLIT之結合可減少至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%。不存在重組ROBO2-Fc蛋白下的SLIT與ROBO2之預期結合可設定為100%。

在某些實施例中，重組ROBO2-Fc蛋白抑制SLIT與ROBO2結合，半數最大抑制濃度(IC₅₀ )不超過約1 × 10⁻⁷ M、不超過約1 × 10⁻⁸ M、不超過約1 × 10⁻⁹ M、不超過約1 × 10⁻¹⁰ M、不超過約1 × 10⁻¹¹ M、不超過約1 × 10⁻¹² M、不超過約1 × 10⁻¹³ M、不超過約1 × 10⁻¹⁴ M、不超過約1 × 10⁻¹⁵ M、約1 × 10⁻⁷ M至約5 × 10⁻¹⁴ M、約1 × 10⁻⁷ M至約1 × 10⁻¹⁴ M、約1 × 10⁻⁷ M至約5 × 10⁻¹³ M、約1 × 10⁻⁷ M至約1 × 10⁻¹³ M、約1 × 10⁻⁷ M至約5 × 10⁻¹² M或約1 × 10⁻⁷ M至約1 × 10⁻¹² M。在一些實施例中，如藉由均相時間解析式螢光(HTRF)分析所量測，重組ROBO2-Fc蛋白之半數最大抑制濃度(IC₅₀ )不超過15 nM、約13 nM、約11 nM、約9 nM、約7 nM、約6 nM、約5 nM、約4 nM、約3 nM、約2 nM、約1 nM以抑制ROBO2與SLIT2結合。可使用SLIT或ROBO2之片段，諸如SLIT-N及ROBO2之Ig域1或ROBO2之Ig域1及Ig域2來評定IC₅₀ 。

亦可藉由量測ROBO2依賴性SLIT-N活性水準來評定重組ROBO2-Fc蛋白之抑制活性，諸如肌動蛋白聚合、足細胞黏著及/或經SLIT2-N介導的神經元細胞遷移之抑制。舉例而言，分析可對(i) ROBO2、SLIT及重組ROBO2-Fc蛋白存在下的神經元細胞遷移與(ii) ROBO2、SLIT存在下但不存在重組ROBO2-Fc蛋白下的神經元細胞遷移進行比較。與不存在重組ROBO2-Fc蛋白下的神經元細胞遷移相比，在重組ROBO2-Fc蛋白存在下，神經元細胞遷移可增加至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%。不存在重組ROBO2-Fc蛋白下的基線神經元細胞遷移可設定為0%。

在某些實施例中，重組ROBO2-Fc蛋白抑制ROBO2依賴性SLIT-N活性，諸如肌動蛋白聚合、足細胞黏著及/或經SLIT2-N介導的神經元細胞遷移之抑制，半數最大抑制濃度(IC₅₀ )不超過約1 × 10⁻ ⁷ M、不超過約1 × 10⁻ ⁸ M、不超過約1 × 10⁻ ⁹ M、不超過約1 × 10⁻ ¹⁰ M、不超過約1 × 10⁻ ¹¹ M、不超過約1 × 10⁻ ¹² M、不超過約1 × 10⁻ ¹³ M、不超過約1 × 10⁻ ¹⁴ M、不超過約1 × 10⁻ ¹⁵ M、約1 × 10⁻ ⁷ M至約5 × 10⁻ ¹⁴ M、約1 × 10⁻ ⁷ M至約1 × 10⁻ ¹⁴ M、約1 × 10⁻ ⁷ M至約5 × 10⁻ ¹³ M、約1 × 10⁻ ⁷ M至約1 × 10⁻ ¹³ M、約1 × 10⁻ ⁷ M至約5 × 10⁻ ¹² M或約1 × 10⁻ ⁷ M至約1 × 10⁻ ¹² M。在某些實施例中，約1 × 10⁻ ¹⁰ M至約1 × 10⁻ ¹³ M之IC₅₀ 為較佳的。在某些實施例中，約5 × 10⁻ ¹¹ M至約5 × 10⁻ ¹² M之IC₅₀ 為較佳的。在一些實施例中，如藉由量測經SLIT2-N介導的神經元細胞遷移之抑制所評定，重組ROBO-Fc蛋白之半數最大抑制濃度(IC₅₀ )不超過約75 nM、約65 nM、約55 nM、約45 nM、約35 nM、約25 nM、約15 nM、約5 nM。

在某些實施例中，使用其他生物活性分析進一步評定本發明之重組ROBO-Fc蛋白之特徵，例如以便評估其效能、藥理學活性及作為治療劑之潛在功效。此類分析為此項技術中已知的且視重組蛋白之預期用途而定。實例包括例如毒性分析、免疫原性分析、穩定性分析、抗藥物抗體分析及/或PK/PD剖析。 核酸及製造重組 ROBO2 蛋白之方法

本發明亦提供編碼本發明之重組ROBO2蛋白的聚核苷酸。本發明亦提供製造本文所述之聚核苷酸中之任一者的方法。聚核苷酸可藉由此項技術中已知之程序製造及表現。

在一個態樣中，本發明提供聚核苷酸或包含編碼重組ROBO2蛋白之聚核苷酸的組合物，該重組ROBO2蛋白包含ROBO2細胞外域(ECD)之一部分且進一步包含免疫球蛋白域，其中該細胞外域包含：至少兩個免疫球蛋白樣(Ig樣)域；及由序列SEQ ID NO: 12組成之C端序列。

在一個態樣中，本發明提供聚核苷酸或包含編碼重組ROBO2蛋白之聚核苷酸的組合物，該重組ROBO2蛋白包含根據SEQ ID NO: 1中所示之編號的胺基酸殘基1至203且進一步包含免疫球蛋白域。

在一些實施例中，本發明提供聚核苷酸或包含編碼以下重組ROBO2蛋白中之任一者之聚核苷酸的組合物：ROBO2-Fc 2.2 (SEQ ID NO: 1)、ROBO2-Fc 2.1 (SEQ ID NO: 2)、ROBO2-Fc 2.0 (SEQ ID NO: 3)、ROBO2-Fc 1.1 (SEQ ID NO: 4)、ROBO2-Fc 1.0 (SEQ ID NO: 5)、ROBO2-Fc 3.0 (SEQ ID NO: 6)、ROBO2-Fc 4.0 (SEQ ID NO: 7)及ROBO2-Fc S17T R73Y (SEQ ID NO: 19)。在一些實施例中，本發明提供聚核苷酸或包含編碼ROBO2-Fc 2.2 (SEQ ID NO: 1)之聚核苷酸的組合物。在一些實施例中，本發明提供聚核苷酸或包含編碼ROBO2-Fc 2.1 (SEQ ID NO: 2)之聚核苷酸的組合物。在一些實施例中，本發明提供聚核苷酸或包含編碼ROBO2-Fc 2.0 (SEQ ID NO: 3)之聚核苷酸的組合物。

本發明亦提供聚核苷酸或包含其之組合物，其中該聚核苷酸包含寄存在ATCC，ATCC寄存編號為PTA-124008的質體之DNA插入物的序列。

在另一態樣中，本發明提供編碼重組ROBO2-Fc蛋白之聚核苷酸及其變異體，其中此類變異聚核苷酸與本文所揭示之任何核酸共有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少87%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性，該核酸諸如(但不限於)包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 19之核酸及寄存在ATCC，ATCC寄存編號為PTA-124008的質體之插入物的核酸序列之核酸。在一些實施例中，此類變異聚核苷酸與本文所揭示之任何核酸共有至少95%序列一致性,該核酸諸如(但不限於)包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 19之核酸的核酸。在一些實施例中，此類變異聚核苷酸與本文所揭示之任何核酸共有至少96%序列一致性，該核酸諸如(但不限於)包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 19之核酸的核酸。在一些實施例中，此類變異聚核苷酸與本文所揭示之任何核酸共有至少97%序列一致性，該核酸諸如(但不限於)包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 19之核酸的核酸。在一些實施例中，此類變異聚核苷酸與本文所揭示之任何核酸共有至少98%序列一致性，該核酸諸如(但不限於)包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 19之核酸的核酸。在一些實施例中，此類變異聚核苷酸與本文所揭示之任何核酸共有至少99%序列一致性，該核酸諸如(但不限於)包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7及SEQ ID NO: 19之核酸的核酸。

在另一個態樣中，本發明包括包含SEQ ID NO: 21中所示之核酸序列的聚核苷酸及其變異體。在一些實施例中，本發明包括包含SEQ ID NO: 21中所示之核酸序列，且進一步包含編碼SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列的核酸序列的聚核苷酸及其變異體。在一些實施例中，編碼SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列的核酸序列為SEQ ID NO: 21中所示之核酸序列的N端。

在一個實施例中，ROBO2之細胞外域及免疫球蛋白Fc域由單獨聚核苷酸編碼。或者，ROBO2之細胞外域及免疫球蛋白Fc域兩者均由單一聚核苷酸編碼。

本發明亦涵蓋與任何此類序列互補之聚核苷酸。聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股的，且可為DNA (重組、cDNA或合成)或RNA分子。RNA分子包括hnRNA分子，其含有內含子且以一對一方式對應於DNA分子；及mRNA分子，其不含內含子。額外編碼或非編碼序列可(但未必)存在於本發明之聚核苷酸內，且聚核苷酸可(但未必)連接於其他分子及/或支撐材料。

聚核苷酸可包含天然序列(亦即野生型序列)或可包含此類序列之非天然序列(亦即變異體)。聚核苷酸變異體含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入以使得經編碼之多肽之SLIT結合能力相對於天然分子不會降低。對於經編碼之多肽之SLIT結合活性的影響可通常如本文所述評定。在一些實施例中，變異體展現出與編碼包含ROBO2之天然(野生型)序列及Fc域的重組ROBO2-Fc蛋白的聚核苷酸序列具有至少約70%一致性，在一些實施例中，至少約80%一致性，在一些實施例中，至少約90%一致性，且在一些實施例中，至少約95%一致性。

在一些實施例中，變異體編碼包含以下胺基酸殘基之重組ROBO2蛋白，該等胺基酸殘基具有根據SEQ ID NO: 1中所示之編號的胺基酸殘基1至203之至少20、至少19個、至少18個、至少17個、至少16個、至少15個、至少14個、至少13個、至少12個、至少11個、至少10個、至少9個、至少8個、至少7個、至少6個、至少5個、至少4個、至少3個、至少2個、或至少1個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體編碼包含以下胺基酸殘基之重組ROBO2蛋白，該等胺基酸殘基具有根據SEQ ID NO: 1中所示之編號的胺基酸殘基1至203之至少5個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體編碼包含以下胺基酸殘基之重組ROBO2蛋白，該等胺基酸殘基具有根據SEQ ID NO: 1中所示之編號的胺基酸殘基1至203之至少4個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體編碼包含以下胺基酸殘基之重組ROBO2蛋白，該等胺基酸殘基具有根據SEQ ID NO: 1中所示之編號的胺基酸殘基1至203之至少3個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體編碼包含以下胺基酸殘基之重組ROBO2蛋白，該等胺基酸殘基具有根據SEQ ID NO: 1中所示之編號的胺基酸殘基1至203之至少2個胺基酸取代。在一些實施例中，變異體編碼包含以下胺基酸殘基之重組ROBO2蛋白，該等胺基酸殘基具有根據SEQ ID NO: 1中所示之編號的胺基酸殘基1至203之至少1個胺基酸取代。此等量並不意謂為限制性的，且所述百分比之間的增量特定地設想為本發明之部分。

在如下文所述之最大對應比對時，若兩個序列中之核苷酸或胺基酸序列相同，則兩個聚核苷酸或多肽序列稱為「一致」。兩個序列之間的比較通常藉由在比較窗比較序列以鑑別且比較具有序列相似性之局部區域來進行。如本文所用之「比較窗」係指至少約20個連續位置，通常50至約450個，或100至約300個連續位置的區段，其中在兩個序列經最佳比對之後，序列可與相同數目之連續位置的參考序列相比較。

用於比較之最佳序列比對可使用生物資訊軟體之Lasergene^® 套件中之MegAlign^® 程式(DNASTAR公司, Madison, WI)使用預設參數來進行。此程式體現以下參考文獻中所述之數種比對方案：Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. 於Dayhoff, M.O. (編) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC 第5卷, 增刊3, 第345至358頁；Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes 第626至645頁 Methods in Enzymology 第183卷, Academic Press, Inc., San Diego, CA；Higgins, D.G.及Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153；Myers, E.W. 及Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17；Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105；Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425；Sneath, P.H.A.及Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA；Wilbur, W.J.及Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730。

在一些實施例中，「序列一致性之百分比」係藉由在至少20個位置之比較窗比較兩個最佳比對序列來測定，其中比較窗中的聚核苷酸或多肽序列之部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比，可包含20百分比或小於20百分比，通常5至15百分比或10至12百分比的添加或缺失(亦即缺口)，以實現兩個序列之最佳比對。百分比係藉由以下計算：測定兩個序列中出現相同核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數以得到匹配位置數，將匹配位置數除以參考序列之總位置數(亦即窗大小)且將結果乘以100以得到序列一致性之百分比。

變異體亦可或者實質上與天然基因或其部分或互補序列同源。此類聚核苷酸變異體能夠在適度嚴格條件下雜交至編碼包含ROBO2之天然(野生型)序列及Fc域的重組ROBO2-Fc蛋白的天然存在的DNA序列(或互補序列)。

適合的「適度嚴格條件」包括在5× SSC、0.5% SDS、1.0 mM EDTA (pH 8.0)之溶液中預洗滌；在50℃至65℃下，5× SSC，雜交隔夜；之後在65℃下用含有0.1%SDS之2×、0.5×及0.2× SSC中之每一者洗滌兩次，持續20分鐘。

如本文所用，「高度嚴格條件」或「高嚴格性條件」為以下條件：(1)採用低離子強度及高溫進行洗滌，例如在50℃下，0.015 M氯化鈉/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)在42℃下，在雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如50% (v/v)甲醯胺，及0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50 mM磷酸鈉緩衝劑(pH 6.5)以及750 mM氯化鈉、75 mM檸檬酸鈉；或(3)在42℃，下採用50%甲醯胺、5× SSC(0.75 M NaCl，0.075 M檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5×登哈特氏溶液(Denhardt's solution)、經音波處理之鮭魚精子DNA (50 µg/mL)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，且在42℃下在0.2× SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)且在55℃下在50%甲醯胺中洗滌，之後在55℃下進行由含有EDTA之0.1× SSC組成的高嚴格性洗滌。熟習此項技術者將認識到如何視需要調節溫度、離子強度等以適應諸如探針長度及其類似物之因素。

一般熟習此項技術者應瞭解，由於遺傳密碼之簡併性，存在編碼包含如本文所述之胺基酸序列的ROBO2-Fc多肽的多種核苷酸序列。一些此等聚核苷酸與任何天然基因之核苷酸序列攜帶最小同源性。儘管如此，本發明尤其預期因密碼子使用差異而改變之聚核苷酸。此外，包含本文所提供之聚核苷酸序列之基因的對偶基因在本發明範疇內。對偶基因為由於核苷酸之一或多個突變(諸如缺失、添加及/或取代)而變化的內源基因。所得mRNA及蛋白質可(但不必)具有變化的結構或功能。對偶基因可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)來識別。

本發明亦包括經密碼子最佳化之聚核苷酸，其中核酸序列已經最佳化而使在特定細胞中之表現最大化。一般而言，密碼子最佳化係指一種修飾核酸序列以增強在相關宿主細胞中之表現同時維持天然胺基酸序列的方法，其係藉由用宿主細胞之基因中的較常或最常用的密碼子替代天然序列之至少一個密碼子(例如約或超過約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或大於50個密碼子)。不同物種展現出對特定胺基酸之特定密碼子的特別偏倚。密碼子偏倚(生物體之間在密碼子使用方面之差異)通常與信使RNA (mRNA)之轉譯效率相關，其反過來咸信尤其與待轉譯之密碼子之特性及特定轉移RNA (tRNA)分子之可獲得性相關。所選tRNA在細胞中佔優勢一般為肽合成中最常使用的密碼子的反映。因此，可基於密碼子最佳化調整基因以在既定生物體中進行最佳基因表現。可易於得到密碼子使用表，且此等表可以多種方式適用(例如Nakamura, Y.等人「Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000」 Nucl. Acids Res. 28:292 (2000))。亦可用針對最佳化用於在特定宿主細胞中表現的特定序列的密碼子之計算機演算法，諸如亦可用Gene Forge (Aptagen；Jacobus, Pa.)。在一些實施例中，編碼重組ROBO2-Fc蛋白之序列中的一或多個密碼子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或大於50個或所有密碼子)對應於特定胺基酸之最常用密碼子。

因此，在一個態樣中，經修飾之核酸序列提供相較於來自另外相同細胞中的例如編碼ROBO2-Fc 2.2之核酸的野生型核酸序列(SEQ ID NO: 21)的重組ROBO2蛋白之表現，可偵測地較高的重組ROBO2蛋白在細胞中之表現量。此可被稱作「表現最佳化」或「增強表現」核酸，或簡稱為「經修飾核酸」。

如在本文中可互換地指代，「最佳化」或「經密碼子最佳化」係指編碼序列已相對於野生型編碼序列(例如人類ROBO2及/或人類Fc域之編碼序列)經最佳化以增加編碼序列之表現，例如藉由最小化罕見密碼子之使用、降低CpG二核苷酸之數目、移除隱含剪接供體或受體位點、移除Kozak序列、移除核糖體進入位點及類似者。

修飾的實例包括消除一或多個順式作用基元及引入一或多個Kozak序列。在一個實施例中，消除一或多個順式作用基元且引入一或多個Kozak序列。

可經消除之順式作用基元的實例包括：內部TATA盒；chi位點；核糖體進入位點；ARE、INS及/或CRS序列元件；重複序列及/或RNA二級結構；(隱含)剪接供體及/或受體位點、分支點；及Sall。

在一個實施例中，相對於野生型ROBO2及/或本發明之新穎ROBO2蛋白的人類IgG1 Fc域基因序列提高GC含量(例如存在於核酸序列中的G及C核苷酸之數目)。GC含量較佳比野生型基因(例如SEQ ID NO: 21)高至少5%、更佳至少6%、又更佳地至少7%、甚至更佳至少8%、更佳至少9%、甚至更佳至少10%、又更佳至少12%、甚至更佳至少14%、又更佳至少15%、更佳至少17%、甚至更佳至少20%、甚至更佳至少30%、又更佳至少40%、更佳至少50%、甚至更佳至少60%且最佳至少70%。

在另一實施例中，GC含量以G (鳥嘌呤)及C (胞嘧啶)核苷酸在序列中之百分比表示。亦即，編碼ROBO2-Fc 2.2之野生型核酸(SEQ ID NO: 21)的GC含量要低於編碼ROBO2-Fc 2.2的經密碼子最佳化之核酸序列的GC含量。

在一個實施例中，本發明之經修飾核酸之GC含量要大於包含SEQ ID NO: 21之核酸序列的編碼ROBO2-Fc 2.2之野生型核酸的GC含量。熟習此項技術者應理解，在知曉核酸碼之簡併性之情況下，與編碼蛋白之核酸序列無關，自其表現之ROBO2-Fc 2.2的胺基酸序列較佳地為胺基酸序列SEQ ID NO:1。

已知，CpG二核苷酸之甲基化在真核細胞之基因表現的調節中起重要作用。特定言之，真核細胞中之CpG二核苷酸的甲基化基本上用於經由干擾轉錄機制來沉默基因表現。因此，歸因於藉由CpG基元之甲基化誘發的基因沉默，具有減少數目之CpG二核苷酸的本發明之核酸及載體將提供較高且長效的轉基因表現量。

可使用見於例如http://www.bioinformatics.org/sms2/ cpg_islands.html.之可公開獲得之軟體來鑑別潛在CpG島。CpG島軟體可使用由Gardiner-Garden及Frommer, 1987, J. Mol. Biol. 196(2):261-282描述之方法以及此項技術中熟知的用於鑑別潛在CpG島的多種其他方法來報導潛在CpG島區域。可在1個鹼基對(bp)時間間隔處使用跨越序列之200個bp窗口進行計算。將CpG島定義為序列範圍，其中Obs/Exp值大於0.6且GC含量大於50%。如下計算窗口中之CpG二聚體的期望數目：窗口中之『C』的數目乘以窗口中之『G』的數目，除以窗口長度。因此，存在於核酸序列中之潛在CpG島可易於藉由將爭議中序列輸入至由軟體提供之窗口中來判定(藉由「將原始序列或一或多個FASTA序列黏貼至以下文字區域中。輸入限制為100000個字符」之指令指示)。CpG島往往發現於脊椎動物基因之5'區域中，因此，此程式可用於反白顯示基因組序列中之潛在基因。

本發明之聚核苷酸可使用化學合成、重組方法或PCR獲得。化學聚核苷酸合成方法在此項技術中熟知且無需詳細描述於本文中。熟習此項技術者可使用本文所提供之序列及商用DNA合成器以產生所需DNA序列。

為使用重組方法製備聚核苷酸，包含所需序列之聚核苷酸可插入適合載體中，且繼而載體可引入適合宿主細胞中進行複製及擴增，如本文中進一步論述。聚核苷酸可藉由此項技術中已知的任何方法插入宿主細胞中。細胞藉由利用直接吸收、內吞作用、轉染、F-配對或電穿孔將外源性聚核苷酸引入來轉型。一旦引入，外源性聚核苷酸可作為非一體化載體(諸如質體)維持在細胞內或一體化至宿主細胞基因組中。如此擴增之聚核苷酸可藉由此項技術中熟知的方法與宿主細胞分離。參見例如Sambrook等人,1989。

或者，PCR允許DNA序列複製。PCR技術在此項技術中為熟知的且描述於美國專利第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號及第4,683,202號以及PCR：The Polymerase Chain Reaction, Mullis等人編, Birkauswer Press, Boston, 1994中。

RNA可藉由使用適當載體中之經分離DNA且將其插入適合宿主細胞內獲得。當細胞複製且DNA轉錄至RNA時，可隨後使用熟習此項技術者熟知方法分離RNA，例如，如Sambrook等人,1989中所闡述。

適合選殖載體可根據標準技術構築，或可選自大量在此項技術中可供使用之選殖載體。雖然所選選殖載體可根據意欲使用之宿主細胞變化，但適用選殖載體將一般能夠自我複製，可具有特定限制核酸內切酶之單一標靶，及/或可載有可用於選擇含有載體之純系的標記物之基因。適合實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBSSK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA及穿梭載體，諸如pSA3及pAT28。此等及許多其他選殖載體可購自諸如BioRad、Strategene及Invitrogen之商業供應商。

進一步提供表現載體。表現載體通常為含有根據本發明之聚核苷酸的可複製聚核苷酸構築體。暗示表現載體作為游離基因體或作為染色體DNA之整體部分在宿主細胞中必須為可複製的。適合表現載體包括(但不限於)質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體及PCT公開案第WO 87/04462號中所揭示之表現載體。載體組分可一般包括(但不限於)以下一或多者：信號序列；複製起點；一或多種標記物基因；適合轉錄控制元件(諸如啟動子、強化子及終止子)。對於表現(亦即轉譯)，亦通常需要一或多種轉譯控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯啟動位點及中止密碼子。

在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO: 21中所示之核酸分子。在一些實施例中，載體包含SEQ ID NO: 21中所示之核酸分子及編碼SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列的核酸序列。在一些實施例中，編碼SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 18中所示之胺基酸序列的核酸序列為SEQ ID NO: 21中所示之核酸序列的N端。

含有相關聚核苷酸及/或聚核苷酸本身之載體可藉由多種合適方法中之任一者引入宿主細胞中，包括電穿孔、使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質轉染；微彈轟擊(microprojectile bombardment)；脂質體轉染；及感染(例如在載體為諸如痘苗病毒之感染物的情況下)。引入載體或聚核苷酸之選擇將常常視宿主細胞之特徵而定。

例示性宿主細胞包括大腸桿菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤細胞。較佳宿主細胞包括CHO細胞、人類胎腎(HEK) 293細胞或Sp2.0細胞以及此項技術中熟知的其他多種細胞。

宿主細胞可在允許表現經編碼之重組ROBO2蛋白的條件下培養。在一些實施例中，經編碼之重組ROBO2-Fc蛋白包含SEQ ID NO: 17中所示之ROBO2前導序列或SEQ ID NO: 18中所示之Ig前導序列。在一些實施例中，ROBO2前導序列(SEQ ID NO: 17)在蛋白質生產期間裂解以產生成熟ROBO2-Fc。在一些實施例中，Ig前導序列(SEQ ID NO: 18)在蛋白質生產期間裂解以產生成熟ROBO2-Fc，例如ROBO2-Fc 2.2。4. 調配物及用途

本發明之重組ROBO2蛋白可調配為醫藥組合物。醫藥組合物可進一步包含呈冷凍乾燥調配物或水溶液形式之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑及/或穩定劑(Remington: The Science and practice of Pharmacy 第20版, 2000, Lippincott Williams and Wilkins, 編者K. E. Hoover)。如本文所用，「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」包括當與活性成分合併時,提供保留生物活性且不與個體之免疫系統反應的成分的任何物質。實例包括(但不限於)標準醫藥載劑中之任一者，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)及各種類型之濕潤劑。對於霧劑或非經腸投與之較佳稀釋劑為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理鹽水(0.9%)。包含此類載劑之組合物係藉由熟知的習知方法調配(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, A. Gennaro,編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990；及Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 第20版, Mack Publishing, 2000)。

可接受之載劑、賦形劑或穩定劑各劑量及濃度下對接受者無毒性，且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，其包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨、氯化六羥季銨、氯化苯甲烴銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲苯酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬絡合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。本文中將進一步描述醫藥學上可接受之賦形劑。 診斷用途

本發明之重組ROBO2蛋白可用於各種治療或診斷目的。舉例而言，本發明之重組ROBO2蛋白可用作親和純化劑(例如用於SLIT配位體，諸如SLIT2之活體外純化)，用作診斷劑(例如用於偵測SLIT配位體(例如特定細胞、組織或血清中之SLIT2)之表現)。SLIT配位體，諸如SLIT2之例示性診斷分析可包含例如使由患者獲得之樣本與本發明之重組ROBO2蛋白接觸，其中用可偵測標記或報導分子標記重組ROBO2蛋白。

本發明涵蓋本文所揭示之重組ROBO2蛋白作為診斷成像方法之用途，該等方法用於觀測樣本、細胞、組織或患者中之SLIT配位體，諸如SLIT2。舉例而言，重組ROBO2蛋白可與顯影劑結合使得可檢測到重組ROBO2蛋白之存在，由此偵測SLIT配位體，諸如SLIT2之存在。 治療用途

本發明之重組ROBO2蛋白的例示性治療性用途包括治療腎病，諸如腎小球疾病、局部區段性腎小球病(FSGS)。本發明之重組ROBO2蛋白亦可用於預防性治療中(例如向尚未展現疾病症狀但易患腎病，諸如腎小球疾病、FSGS之個體投與)。

在另一態樣中，本發明包括由與不存在病症、疾病或病狀下的尿液中之蛋白水準相比，增加的尿液中之蛋白水準介導或與其相關之任何病症、疾病或病狀的治療。此類病症、疾病或病狀包括(但不限於)狼瘡性腎炎、IgA腎病變、膜性腎病變(MN)、微小病變腎病(minimal change disease；MCD)、纖維化(諸如肝纖維化)、非酒精性脂肪變性肝炎(NASH)、蛋白尿、白蛋白尿、絲球體腎炎、糖尿病性腎病變、腎病症候群、病灶性腎小球硬化、急性腎衰竭、急性小管間質性腎炎、腎盂腎炎、腎移植排斥及逆流性腎病變。

對於治療性應用，可藉由習知技術，諸如靜脈內(歷經一定時段以快速注射形式或藉由連續輸注)、肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、經口、局部或藉由吸入向哺乳動物，尤其人類投與本發明之重組ROBO2蛋白。本發明之重組ROBO2蛋白亦可以適合方式藉由腫瘤內、瘤周、病變內或病變周途徑投與。

因此，在一個態樣中，本發明提供一種降低ROBO2之活性之方法，其包含向有需要之個體(例如人類)投與治療有效量的本發明之重組ROBO2蛋白。

在另一態樣中，本發明提供一種保留或調節足細胞功能之方法，其包含向有需要之個體(例如人類)投與治療有效量的本發明之重組ROBO2蛋白。

在某些實施例中，個體罹患或易患腎病。在某些實施例中，腎病為腎小球疾病。在某些實施例中，腎病為FSGS。

在某些實施例中，個體罹患或易患腎病變。在另一態樣中，本發明提供一種供用於本文所揭示之治療方法中的本發明之重組ROBO2蛋白。舉例而言，本發明提供一種供用於降低細胞中的ROBO2之活性、降低個體中的ROBO2之活性、保留個體中之足細胞功能、調節個體中之足細胞功能、治療個體中之腎小球疾病及治療個體中之腎病變的本發明之重組ROBO2蛋白。在另一態樣中，本發明提供本發明之重組ROBO2蛋白之用途，其用於製造用於降低細胞中的ROBO2之活性、降低個體中的ROBO2之活性、保留個體中之足細胞功能、調節個體中之足細胞功能、治療個體中之腎小球疾病及治療個體中之腎病變的藥劑。 給藥及投與

在某些實施例中，皮下投與本發明之重組ROBO2蛋白。在某些實施例中，靜脈內投與本發明之重組ROBO2蛋白。

可以可隨腎病之嚴重程度而變化的頻率向有需要之個體投與醫藥組合物。在預防性療法之情況下，頻率可視個體對腎病之易感性或傾向性而變化。在一些實施例中，以單一劑量形式皮下或靜脈內投與醫藥組合物。在一些實施例中，以多劑量形式皮下或靜脈內投與醫藥組合物。

可以快速注射或藉由連續輸注形式向有需要之患者投與組合物。舉例而言，可以每公斤體重0.0025至200 mg、0.025至0.25 mg/kg、0.010至0.10 mg/kg或0.10至0.50 mg/kg的量快速投與重組ROBO2蛋白。對於連續輸注而言，可以每分鐘每公斤體重0.001至200 mg、0.0125至1.25 mg/kg/min、0.010至0.75 mg/kg/min、0.010至1.0 mg/kg/min或0.10至0.50 mg/kg/min投與重組ROBO2蛋白持續1至24小時、1至12小時、2至12小時、6至12小時、2至8小時或1至2小時之時段。

對於投與重組ROBO2蛋白，劑量可為約1 mg/kg至約10 mg/kg、約2 mg/kg至約10 mg/kg、約3 mg/kg至約10 mg/kg、約4 mg/kg至約10 mg/kg、約5 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約20 mg/kg、約2 mg/kg至約20 mg/kg、約3 mg/kg至約20 mg/kg、約4 mg/kg至約20 mg/kg、約5 mg/kg至約20 mg/kg、約1 mg/kg或大於1 mg/kg、約2 mg/kg或大於2 mg/kg、約3 mg/kg或大於3 mg/kg、約4 mg/kg或大於4 mg/kg、約5 mg/kg或大於5 mg/kg、約6 mg/kg或大於6 mg/kg、約7 mg/kg或大於7 mg/kg、約8 mg/kg或大於8 mg/kg、約9 mg/kg或大於9 mg/kg、約10 mg/kg或大於10 mg/kg、約11 mg/kg或大於11 mg/kg、約12 mg/kg或大於12 mg/kg、約13 mg/kg或大於13 mg/kg、約14 mg/kg或大於14 mg/kg、約15 mg/kg或大於15 mg/kg、約16 mg/kg或大於16 mg/kg、約17 mg/kg或大於17 mg/kg、約19 mg/kg或大於19 mg/kg或約20 mg/kg或大於20 mg/kg。投與頻率將視病狀之嚴重程度而定。頻率可在每週3次至每兩週或三週一次範圍內。

另外，可經由皮下注射向患者投與組合物。舉例而言，可一週兩次、一週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次、每八週一次、每九週一次、每十週一次、每月兩次、每月一次、每兩個月一次或每三個月一次經由皮下或靜脈內注射向患者投與1至200 mg之劑量的重組ROBO2蛋白。

在某些實施例中，人類中的重組ROBO2蛋白之半衰期為約24小時、約2天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天、約28天、約29天、約30天、約5天至約40天、約5天至約35天、約5天至約30天、約5天至約25天、約10天至約40天、約10天至約35天、約10天至約30天、約10天至約25天、約15天至約40天、約15天至約35天、約15天至約30天或約15天至約25天。

在某些實施例中，每2至6週以以下劑量皮下或靜脈內投與醫藥組合物：約0.1 mg/kg至約10 mg/kg、約0.5 mg/kg至約10 mg/kg、約1 mg/kg至約10 mg/kg、約1.5 mg/kg至約10 mg/kg、約2 mg/kg至約10 mg/kg、約0.1 mg/kg至約8 mg/kg、約0.5 mg/kg至約8 mg/kg、約1 mg/kg至約8 mg/kg、約1.5 mg/kg至約8 mg/kg、約2 mg/kg至約8 mg/kg、約0.1 mg/kg至約5 mg/kg、約0.5 mg/kg至約5 mg/kg、約1 mg/kg至約5 mg/kg、約1.5 mg/kg至約5 mg/kg、約2 mg/kg至約5 mg/kg、約0.5 mg/kg、約1.0 mg/kg、約1.5 mg/kg、約2.0 mg/kg、約2.5 mg/kg、約3.0 mg/kg、約3.5 mg/kg、約4.0 mg/kg、約4.5 mg/kg、約5.0 mg/kg、約5.5 mg/kg、約6.0 mg/kg、約6.5 mg/kg、約7.0 mg/kg、約7.5 mg/kg、約8.0 mg/kg、約8.5 mg/kg、約9.0 mg/kg、約9.5 mg/kg或約10.0 mg/kg。

在某些實施例中，每2至6週以約3.0 mg/kg之劑量皮下或靜脈內投與醫藥組合物。在某些實施例中，每2至6週以約2.0 mg/kg至約10.0 mg/kg之劑量皮下或靜脈內投與醫藥組合物。

在一些實施例中，每週或每2週以以下劑量皮下或靜脈內投與醫藥組合物：約25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg、200 mg、225 mg、250 mg、275 mg或300 mg。

在一個例示性實施例中，每週或每2週皮下投與醫藥組合物。在某些實施例中，每週以約2 mg/kg之劑量皮下投與醫藥組合物。在某些實施例中，每週以約約150 mg之劑量皮下投與醫藥組合物。

在某些實施例中，每2至6週以約10.0 mg/kg之劑量靜脈內或皮下投與醫藥組合物。在某些實施例中，每2至6週以約1.0 mg/kg至約10.0 mg/kg之劑量皮下或靜脈內投與醫藥組合物。

在一個例示性實施例中，每月靜脈內投與醫藥組合物。

本發明之重組ROBO2蛋白可用作單一療法或與其他療法組合以治療例如腎病。用於治療腎病之其他療法在此項技術中為熟知的且並未在本文中列出。5. 套組

本發明亦提供包含本發明之重組ROBO2蛋白及使用說明書之套組或製品。因此，在一些實施例中，本發明提供一種套組或製品，其包含容器；容器；容器中之組合物，其包含重組ROBO2蛋白；及含有用於投與治療有效量之重組ROBO2蛋白以治療有需要之患者的說明的藥品說明書。

在某些實施例中，套組可含有具有乾燥蛋白質之第一容器及具有水性調配物之第二容器。在某些實施例中，包括含有單室及多室預填注射器(例如液體注射器及冷凍乾燥物注射器)之套組。

與使用本發明之重組ROBO2蛋白有關的說明書一般包括關於預期治療之給藥、給藥時程及投藥途徑的資訊。容器可為單位劑量、散裝(例如多劑量封裝)或次單位劑量。本發明套組中供應之說明書典型地為標籤或藥品說明書(例如套組中包括之紙片)上之書面說明書，但亦提供機器可讀說明書(例如磁性或光學儲存盤上載有的說明書)。

本發明套組呈適合封裝形式。適合封裝包括(但不限於)小瓶、瓶子、罐、可撓性封裝(例如密封聚酯薄膜或塑膠袋)及其類似物。亦涵蓋用於與特定裝置，諸如吸入器、經鼻投與裝置(例如霧化器)或輸注裝置(諸如小型泵)組合之封裝。套組可具有無菌進入孔(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。容器亦可具有無菌進入孔(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。容器可進一步包含第二醫藥活性劑。

套組可視情況提供諸如緩衝劑之額外組分及說明性資訊。通常，套組包含容器及在容器上或與容器相聯之標籤或藥品說明書。6. 生物寄存

本發明之代表性物質於2017年2月23日寄存於美國弗吉尼亞州20110-2209馬納薩斯10801大學大街之美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)。ATCC寄存編號為PTA-124008之載體ROBO2-Fc 2.2包含編碼SEQ ID NO: 1之DNA插入物。按照國際承認用於專利程序的微生物寄存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure) (布達佩斯條約(Budapest Treaty))及其下條例之規定進行存放。此保證自寄存之日起維持30年之寄存物之活力培養。寄存將由ATCC在布達佩斯條約之條款下提供，且受制於Pfizer公司與ATCC之間的協議，其保證在相關美國專利發佈後或在任何美國或外國專利申請案對公眾公佈後(不分先後)，公眾可永久且無限制地利用寄存培養物之子代，且保證由美國專利及商標局委員根據35 U.S.C.第122節及依據其之專員規則(包括特定參考886 OG 638之37 C.F.R.第1.14節)經授權所確定者可利用子代。

本申請案之受讓人，Pfizer公司已同意，若在適合條件下培養時，處於寄存之物質的培養物死亡或丟失或破壞，則將通知以即時用另一相同物質置換該等物質。寄存物質之可供使用性不解釋為許可在違反由任何政府部門根據其專利法律授予權利之情況下實踐本發明。實例

本文描述例示性方法及物質，但類似或等效於本文所述之方法及物質之方法及物質亦可用於實施或測試本發明。該等材料、方法及實例僅具說明性且不希望具限制性。實例 1. ROBO2-Fc 2.2 之產生 經由多種 ROBO2-Fc 融合蛋白之設計選擇 ROBO2-Fc 2.2

為了選擇最佳ROBO2-Fc配位體陷阱，產生由經由甘胺酸-絲胺酸(GS)連接子與IgG1 Fc域融合的不同長度之ROBO2細胞外域組成的多種蛋白質。研究顯示，對於ROBO1及ROBO2受體，其Ig1域足以結合於SLIT配位體之D2富白胺酸重複(LRR)域。ROBO2含有5個Ig域(Ig1至Ig5)。選擇標準首先聚焦於產生具有可結合SLIT2的極小ROBO2序列之ROBO2-Fc融合蛋白，且隨後聚焦於最佳化針對HEK 293細胞中之重組蛋白表現的分子。一開始，產生針對多肽序列之表現的4個DNA構築體，該等構築體由Ig1域(ROBO2-Fc 1.0；SEQ ID NO: 5)；Ig1及Ig2域(ROBO2-Fc 2.0；SEQ ID NO: 3)；Ig1、Ig2及Ig3域(ROBO2-Fc 3.0；SEQ ID NO: 6)以及Ig1、Ig2、Ig3及Ig4域(ROBO2-Fc 4.0；SEQ ID NO: 7)組成，其經由GS連接子(表23)與人類IgG1之Fc部分融合。構築體之表現由Ig前導序列(SEQ ID NO: 18)驅動。ROBO2-Fc 1.0、ROBO2-Fc 2.0及ROBO2-Fc 3.0蛋白並未結合SLIT2。ROBO2-Fc 4.0結合SLIT2。為了將Fc融合之ROBO2部分減至最少，生成更多蛋白質，其包括具有包含在C端處之Ig1域、Ig1-Ig2域間連接子(SEQ ID NO: 10)之形式(ROBO2-Fc 1.1；SEQ ID NO: 4)。另一構築體涉及包括Ig1及Ig2域以及Ig2-Ig3域間連接子(VFER (SEQ ID NO: 12)) (ROBO2-Fc 2.1；SEQ ID NO: 2)。在Ig1-Ig2域之C端處添加VFER(SEQ ID NO: 12)以形成ROBO2-Fc 2.1蛋白使得能夠穩定結合於SLIT2 (圖3)。ROBO2-Fc 1.1並未結合SLIT2。利用Octet Red，以10 μg/ml將ROBO2-Fc蛋白載至抗人類Fc (AHFc)感測器上且與100 nM SLIT2一起培育7分鐘，且隨後將感測器單獨移動至緩衝液持續640秒。ROBO2-Fc 4.0作為結合之陽性對照包括在內。

ROBO2-Fc 2.1在HEK 293細胞中之重組蛋白表現極差(3 µg/ml)。為了增加表現，添加ROBO2前Ig1序列(SEQ ID NO: 8)且將ROBO2前導序列(SEQ ID NO: 17)亦包括至ROBO2-Fc 2.1表現構築體以形成ROBO2-Fc 2.2表現構築體。ROBO2前導序列(SEQ ID NO: 17)在蛋白質生產期間裂解以產生成熟ROBO2-Fc 2.2。與另外相同宿主細胞中的未編碼前Ig1序列SRLRQEDFP (SEQ ID NO: 8)之另外其他表現構築體的表現相比，添加ROBO2前Ig1序列(SEQ ID NO: 8)使蛋白表現增加超過25倍。經增加之表現並未影響ROBO2-Fc 2.2之生物活性，其仍以高親和力結合SLIT2(圖3-圖4A-圖4C)。實例 2. ROBO2-Fc 2.2 結合及中和活性之特徵

在多種分析中針對SLIT2-N結合、SLIT2-N結合之中和及抑制SLITx-N功能活性篩選ROBO2-Fc 2.2。以兩種方式評定結合於SLIT2之ROBO2-Fc 2.2：第一，藉由表面電漿子共振(SPR)；及第二，使用基於細胞之流式細胞測量術分析，以偵測結合於經細胞表現之人類SLIT2-N的ROBO2-Fc 2.2。SPR 分析

人類SLIT2與食蟹獼猴SLIT2共有高水準同源性；總同源性為99%且在含有ROBO2結合位點的SLIT2之富白胺酸重複域2 (D2)處同源性為100%。與食蟹獼猴相似，人類及大鼠SLIT2共有高度的總體序列一致性之同源性且在D2結合域中呈97%。ROBO2-Fc 2.2與含有D2區之人類及大鼠SLIT2的N端片段(SLIT2-N)及人類及食蟹獼猴之特定SLIT2 D2域(100%一致性)的結合係藉由SPR評定。對於動力學調定實驗之各循環(圖4A至圖4C)，藉由附接至C1晶片之抗人類Fc (AHFc)非共價捕獲ROBO2-Fc 2.2分子，該AHFc結合於ROBO2-Fc 2.2之人類IgG1 Fc區。隨後將所捕獲之ROBO2-Fc 2.2暴露於不同濃度之SLIT2配位體以監測結合及解離動力學。將ROBO2-Fc 2.2稀釋至2 nM。使用HBS-EP作為稀釋劑。將人類/食蟹獼猴SLIT2-D2、人類SLIT2-N及大鼠SLIT2-N在HBS-EPB中自其儲備液濃度稀釋至2 nM。使用HBS-EPB作為稀釋劑製備SLIT2配位體之8點、2倍稀釋液系列，範圍在2 nM至15.6 pM範圍內。捕獲ROBO2-Fc 2.2直至讀取到10至15 RU等值，且隨後暴露於調定量之特異性SLIT2分析物(亦即人類/食蟹獼猴SLIT2-D2、人類SLIT2-N或大鼠SLIT2-N)。追蹤所指定之SLIT2配位體的結合120s且監測解離180s。使用動力學速率常數之簡單的1:1相互作用模型測定明顯的結合親和力。結合於人類/食蟹獼猴SLIT2-D2 (ROBO2結合域，100%一致性)的ROBO2-Fc 2.2之K_D 測定為0.293 nM (圖4A)。結合於人類SLIT2-N (N端片段)的ROBO2-Fc 2.2之K_D 測定為0.279 nM (圖4B)，且最後，結合於大鼠SLIT2-N的ROBO2-Fc 2.2之K_D 測定為0.543 nM (圖4C)。流式細胞測量術分析

根據製造商說明書使ROBO2-Fc 2.2與Alexa Fluor (AF) 647結合。在準備染色中，將過度表現人類SLIT2-N之人胎腎(HEK293)再懸浮於含有5%胎牛血清之緩衝液中。為了染色具有ROBO2-Fc 2.2-AF647之細胞，製備2×儲備液且在螢光活化細胞分選(FACS)緩衝液中製得11至12點、2倍稀釋液系列。將細胞及相關ROBO2-Fc 2.2-AF647稀釋液合併於96孔u形底盤中且在4℃下培育45分鐘。培育之後，每孔添加150 μL FACS緩衝液以洗滌細胞。洗滌之後，將細胞再懸浮於緩衝液中以用於在Fortessa流式細胞儀獲取資料。資料使用FlowJo軟體分析且表示為表現SLIT2-N之HEK293細胞的幾何平均螢光強度(Geo MFI)減去對照HEK293細胞之Geo MFI。ROBO2-Fc 2.2以劑量依賴型方式以具有9 nM之EC₅₀ 的高親和力結合於過度表現於HEK293細胞上之人類SLIT2-N(圖5)。均相時間解析式螢光 (HTRF) 分析

ROBO2-Fc可能藉由充當配位體陷阱來抑制SLIT配位體，諸如SLIT2與細胞ROBO2受體結合。使用ROBO2-SLITx-N HTRF染料標記分析來評定ROBO2-Fc 2.2中和結合於人類ROBO2之SLIT配位體的能力。在此分析中，在調定量之ROBO2-Fc 2.2存在下，將表現經鋱(Tb)標記(供體)、經SNAP標記(SNAP-tag® New England Biolabs；亦參見Keppler等人, 2003, Nat. Biotechnol. 21:86)之人類ROBO2的HEK293細胞與5 nM來自不同物種的經d2標記(受體)之SLITx-N(根據製造商說明書使用Cisbio d2染料標記套組製備)一起培育1小時。培育之後，在Envision多標記盤讀取器上量測665 nm及620 nm處之螢光。HTRF比率計算如下：665 nm處之螢光/620 nm處之螢光× 10,000。最大信號界定為在不存在ROBO2-Fc 2.2下，經Tb標記之ROBO2細胞與經d2標記之SLIT2-N之HTRF比率，最小信號界定為僅表現經Tb標記之ROBO2的HEK293細胞之HTRF比率。在分析中使用來自若干物種，包括人類、食蟹獼猴、兔、大鼠及小鼠的3種不同SLIT配位體(SLIT1-N、SLIT2-N及SLIT3-N)的中和。使用最高濃度為4000 nM之11點、4倍稀釋液系列來測定各SLITx-N之IC₅₀ 。計算3個獨立實驗中的IC₅₀ 之幾何平均值且對所評估的所有配位體進行彙總(表2)。表 2. ROBO-Fc 2.2 抑制 SLITx-N: 人類 ROBO2 HTRF 分析之結果的彙總表 ROBO2-Fc 2.2劑量依賴性抑制結合於人類ROBO2之來自不同物種之SLIT配位體係。在HTRF分析中針對一組人類、食蟹獼猴、兔、大鼠或小鼠SLIT配位體使用ROBO-Fc 2.2之11點、4倍劑量調定測定IC₅₀ 。ROBO2-Fc 2.2為結合於人類ROBO2之人類、食蟹獼猴、兔及大鼠SLIT1-N的強效中和劑，IC₅₀ 在5.9 nM (人類)之低至9.8 nM (兔)之高範圍內，ROBO2-Fc 2.2亦展現出劑量依賴性抑制結合於人類ROBO2之SLIT2-N，IC₅₀ 在3.9 nM (人類)至5.7 nM (兔)範圍內。ROBO2-Fc 2.2為結合於人類ROBO2之SLIT3-N的強效中和劑，IC₅₀ 在3.6 nM (食蟹獼猴)至10.2 nM (兔)範圍內。最後，ROBO2-Fc 2.2為人類SLIT2-N:人類ROBO2(圖6A)及大鼠SLIT2-N:人類ROBO2(圖6B)結合之強效中和劑，IC₅₀ 分別為7 nM或4 nM。神經元細胞遷移分析

最後一項選擇篩選為ROBO2依賴性SLIT2-N活性的功能中和。SLIT2-ROBO2相互作用為發育過程中軸突遷移之主要調控因子。已知SLIT2對室下區神經元化學排斥且這一活性為ROBO2依賴性的。分離來自大鼠室下區(SVZ)之神經元組織外植體且包埋於膠原蛋白基質中。在SLIT2-N存在下，抑制神經元細胞遷移(SVZ分析)；在1 nM SLIT2-N存在下在存在或不存在調定量之ROBO2-Fc 2.2下培育組織外植體。培育之後，用4%多聚甲醛固定細胞且用Hoechst 33342染色。在具有10×高NA物鏡之Operetta高內涵成像儀(Operetta High Content Imager) (Perkin Elmer)上獲得寬場螢光影像。每孔取用九個場，重疊率為5%，以捕獲孔之整個中心區域。獲得各場之Z形堆疊，其由各層之間的距離為1 μm的6個層組成，以捕獲組織外植體之全部深度。在Volocity軟體(Perkin Elmer)中進行分析。各孔中之所有場均拼接在一起。藉由Hoechst 33342染色偵測中心處組織外植體之區域及組織外植體外部之各核。對獨立核進行計數且以μm為單位對各核之中心與最近的組織外植體之邊緣的距離進行量測。將孔中的核之平均遷移距離乘以核計數以獲得各孔之總遷移距離。ROBO2-Fc 2.2能夠以劑量依賴性方式以51 nM之IC₅₀ 恢復神經元細胞遷移(圖7)。此等結果表明，ROBO2-Fc 2.2不僅可抑制SLIT2與ROBO2結合，且亦對SVZ神經元的ROBO2依賴性SLIT2化學排斥活性具有強效劑量依賴性中和作用。實例 3. 新穎 ROBO2 蛋白之活體內作用

被動型海曼腎炎為影響腎小球足細胞的腎毒性損傷之大鼠模型，其導致蛋白尿增加。這一模型用於評定ROBO2-Fc 2.2減少蛋白尿之功效。用ROBO2-Fc 2.2處理大鼠不僅會減少蛋白尿且亦保護足細胞足突架構。如圖8及圖9中所示，經ROBO2-Fc 2.2之預防性或治療性給藥方案處理大鼠會減少蛋白尿之量。用對抗大鼠腎臟刷狀緣而產生之綿羊抗血清(抗Fx1a (Probetex公司)，基底膜及足細胞)注射路易斯大鼠。大鼠對綿羊血清產生免疫反應。補體活化引起足細胞消失且在平穩階段之後的第3天及第12天之間蛋白尿會增加。這一機理與膜性腎病變中所見之機理極為相似，在該膜性腎病變中，抗足細胞蛋白PLA2R(在70%之情況下)之自體抗體在補體參與之後引起足細胞消失及腎病水準蛋白尿。在投與一定劑量範圍之綿羊抗血清之前24小時對大鼠進行預處理以覆蓋大約50%、90%及99% (1 mg/kg、5 mg/kg及25 mg/kg)腎小球ROBO2且其後每72小時進行預處理(預防性給藥方案)。對於治療性給藥方案，在第6天或第9天(投與綿羊抗血清之後5或8天)投與ROBO2-Fc 2.2，投與綿羊抗血清之前24小時給定之劑量亦包括於研究中。當以預防性方式開始治療(圖8)時，蛋白尿之最大減少率為45%，且重複量測ANOVA統計學分析確認劑量反應，伴隨低於.001之p值。藉由針對各ROBO2-Fc 2.2處理組之重複量測ANOVA統計學分析，與對照抗體治療相比，在第0天、第6天及第9天投與的ROBO2-Fc 2.2處理將蛋白尿減少至類似範圍(圖9)，最大限度地減少至(40%)，且伴隨低於.001之p值。如藉由互補IHC評分所測定，腎臟中之免疫複合體沈積並未減少，其表明反應係歸因於足細胞保護作用。

為了進一步提供調節足細胞功能及結構之可信度，如下文所述進行足細胞次結構之電子顯微圖的定量分析。收集、取樣及剖切

獲得、修整藉由浸沒(4%甲醛/1%戊二醛)固定的全斷面樣本腎(每隻動物一個腎臟)以僅包括皮質，且將各腎臟之五種樣本包埋於環氧樹脂中。分割各腎臟之第一包埋樣本。若其含有三個腎小球，則將樣本切成薄片且使其成像。若此第一樣本不含腎小球，則對來自腎臟之其他包埋樣本進行依序分割且以類似方式評估以找到具有三個腎小球之樣本。觀測及成像

使用透射電子顯微鏡(Hitachi H-7100)及數位CCD相機系統(Advanced Microscopy Techniques, Danvers, MA)使所選腎臟樣本數位成像。在不重複之情況下，以5,000×及10,000×放大倍數對200×放大倍數下所見的前三個腎小球之三個毛細血管環進行成像。此產生每個腎臟的18個數位影像(亦即每個腎臟樣本三個腎小球×每個腎小球三個區域×2個放大倍數)。為了允許以盲法方式進行評估，僅用研究編號、動物編號、樣本編號及放大倍數標識各影像。足細胞足突寬度及 狹縫 隔膜密度量測

ImageJ軟體(1.47v版；National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)用於手動追蹤及量測高放大倍數的穿透式電子顯微鏡術影像上的鄰近於每單位長度之腎小球基底膜(GBM)的足突之寬度。簡言之，在每組六隻大鼠及來自各大鼠的九張5000× TEM影像中進行量測。藉由繪製平行於GBM之線而自狹縫隔膜之一端至另一端量測足細胞足突寬度。針對影像之所有足突重複進行此量測。隨後根據比例尺調整此等結果且計算各影像之調和平均值。

狹縫隔膜密度：藉由對狹縫隔膜數進行計數且除以跨越此等狹縫隔膜之區域的總GBM長度來計算狹縫隔膜密度。簡言之，在每組六隻大鼠及來自各大鼠的九張5000× TEM影像中進行量測。藉由使狹縫隔膜數除以GBM長度來計算密度。若多於一個GBM區域可見或歸因於足突之非可視性，GBM為斷開的，則重複以上程序且使用此等量測結果之平均值來計算狹縫隔膜密度。經由多個毛細血管環計算穿插足突之狹縫隔膜之間的距離，測定足突寬度平均值。消失的足細胞的足突寬度將大於正常的未消失之足細胞的足突寬度。

如圖10A中所示，經25 mg/kg劑量下的ROBO2-Fc 2.2處理之動物的足突寬度要明顯比經對照抗體處理之動物短。此等資料表明蛋白尿減少係歸因於足細胞次結構之變化。另外，如圖10B中所示，ROBO2-Fc 2.2處理增加狹縫隔膜之密度(藉由雙尾T測試，p值低於0.01)，表明其消失較少且保護不受腎小球損傷影響。

此等結果表明，ROBO2-Fc 2.2在抑制腎小球疾病之兩種標誌方面為有效的：蛋白尿及彌漫性足細胞消失。因此，此等結果支持使用ROBO2-Fc 2.2作為治療腎小球疾病，諸如(但不限於)局部區段性腎小球硬化(FSGS)之潛在療法。

ROBO2-Fc 2.2之主要藥理學特性概述於表3中。表 3. ROBO2-Fc 2.2 之主要藥理學特性之彙總

活體外藥理學研究表明ROBO2-Fc 2.2以相同高親和力結合於人類SLIT2-N及相同人類及食蟹獼猴SLIT2-D2域。ROBO2-Fc 2.2亦以高親和力結合於大鼠SLIT2-N。ROBO2-Fc 2.2以劑量依賴型方式結合表現人類SLIT2-N之細胞。另外，在基於細胞之結合HTRF分析中，ROBO2-Fc 2.2有力地抑制大鼠及人類SLIT2-N結合於人類ROBO2。亦使用蛋白尿腎小球疾病之大鼠模型進行活體內機理、藥理學及功效研究。以預防性或治療性給藥方案形式投與ROBO2-Fc 2.2會引起PHN模型中之蛋白尿在統計學上顯著減少。此等結果支持使用ROBO2-Fc 2.2治療腎小球疾病，諸如局部區段性腎小球硬化(FSGS)。實例 4. ROBO2-Fc S17T/R73Y 結合及中和活性之特徵 流式細胞測量術分析

根據製造商說明書使ROBO2-Fc S17T/R73Y與Alexa Fluor (AF) 647結合。在準備染色中，將過度表現人類SLIT2-N之細胞再懸浮於含有5%胎牛血清之緩衝液中。為了染色具有ROBO2-Fc S17T/R73Y-AF647之細胞，製備2×儲備液且在FACS緩衝液中製得11至12點、2倍稀釋液系列。將細胞及相關ROBO2-Fc S17T/R73Y-AF647稀釋液合併於96孔u形底盤中且置放於在4℃下持續45分鐘。培育之後，每孔添加150 μL FACS緩衝液以洗滌細胞。洗滌之後，將細胞再懸浮於緩衝液中以用於在Fortessa流式細胞儀獲取資料。資料使用FlowJo軟體分析且表示為表現SLIT2-N之HEK293細胞的幾何平均螢光強度(Geo MFI)-對照HEK293細胞之Geo MFI。ROBO2-Fc S17T/R73Y以具有2.5 nM之EC₅₀ 的高親和力結合於過度表現於人胎腎(HEK293)細胞上之人類SLIT2-N (圖11)。均相時間解析式螢光 (HTRF) 分析

使用ROBO2-SLIT2-N均相時間解析式螢光(HTRF)分析來評定ROBO2-Fc S17T/R73Y阻斷SLIT2-N與經細胞表現之ROBO2的相互作用的能力。在此分析中，在調定量之ROBO2-Fc S17T/R73Y存在下，根據製造商說明書(Cisbio HTRF d2標記套組62D2DPEA及鋱穴狀合物標記套組62TBSPEA)將表現經鋱(Tb)標記(供體)、經SNAP標記之ROBO2的HEK293細胞與5 nM經d2標記(受體)之人類SLIT2-N一起培育持續1小時。培育之後，在Envision多標記盤讀取器上量測665 nm及620 nm處之螢光。HTRF比率計算如下：665 nm處之螢光/620 nm處之螢光× 10,000。最大信號界定為在不存在ROBO2-Fc S17T R73Y下，經Tb標記之ROBO2細胞與經d2標記之SLIT2-N之HTRF比率，最小信號界定為僅表現經Tb標記之ROBO2的HEK293細胞之HTRF比率。ROBO2-Fc S17T R73Y為以1.4 nM之IC₅₀ 結合的人類SLIT2-N:人類ROBO2的強效中和劑(圖12)。神經元細胞遷移分析

與ROBO2-Fc 2.2之做法一樣，評估ROBO2-Fc S17T/R73Y以劑量依賴型方式逆轉經SLIT2-N介導的神經元細胞遷移之抑制的能力。分離來自大鼠室下區(SVZ)之神經元組織外植體且包埋於膠原蛋白基質中。在SLIT2-N存在下，抑制神經元細胞遷移(SVZ分析)；在1 nM SLIT2-N存在下在存在或不存在調定量之ROBO2-Fc S17T R73Y下培育組織外植體。培育之後，用4%多聚甲醛固定細胞且用Hoechst 33342染色。在具有10×高NA物鏡之Operetta高內涵成像儀(Perkin Elmer)上獲得寬場螢光影像。每孔取用九個場，重疊率為5%，以捕獲孔之整個中心區域。獲得各場之Z形堆疊，其由各層之間的距離為1 μm的6個層組成，以捕獲組織外植體之全部深度。使用Volocity軟體(Perkin Elmer)進行分析。各孔中之所有場均拼接在一起。藉由Hoechst 33342染色偵測中心處組織外植體之區域及組織外植體外部之各核。對獨立核進行計數且以μm為單位對各核之中心與最近的組織外植體之邊緣的距離進行量測。將孔中的核之平均遷移距離乘以核計數以獲得各孔之總遷移距離。ROBO2-Fc S17T/R73Y能夠以劑量依賴性方式以11.5 nM之IC₅₀ 恢復神經元細胞遷移(圖13)。

此等結果表明，與ROBO2-Fc 2.2一樣，ROBO2-Fc S17T/R73Y不僅可抑制SLIT2與ROBO2結合，且亦對SVZ神經元的ROBO2依賴性SLIT2化學排斥活性具有強效劑量依賴性中和功能作用。因此，此等資料表明與ROBO2-Fc 2.2一樣，ROBO2-Fc S17T/R73Y可為可適用於治療涉及ROBO2-SLIT相互作用之腎小球疾病，諸如局部區段性腎小球硬化(FSGS)的潛在療法。實例 5. ROBO2-FC 2.2 之結構分析 材料製備、結晶、資料收集及結構測定 ： ROBO2-His 構築體之表現及純化

將由ROBO2前Ig1序列(SEQ ID NO: 8)、Ig1域、Ig2域及ROBO2 Ig2-Ig3域間連接子(SEQ ID NO: 12)以及C端處之6x組胺酸標記(SEQ ID NO: 25)組成的ROBO2構築體(ROBO2-His6 (「如SEQ ID NO: 25揭示之「His6」))表現於HEK293細胞中。用咪唑梯度溶離經由Ni Excel管柱純化構築體。經由尺寸排阻層析使用 HiLoad 26/200 Superdex 200 (GE Healthcare)將構築體進一步純化至均勻。結晶化

在以下條件下獲得ROBO2-His之晶體：100 mM檸檬酸鈉pH 4.5、12% PEG8000，其產生繞射至2.19 Å之晶體。資料收集

對晶體進行短暫低溫保護，且在先進光子來源(Advanced Photon Source；APS)下遠端進行同步加速器資料收集。使用軟體AutoPROC (Global Phasing有限公司)處理影像圖框。資料屬於空間群P2₁ ，其中單位晶格如下：a = 79.307 Å，b = 50.887 Å，c = 93.854 Å, α = γ = 90°, β = 114.92，每個不對稱單元具有兩個人類ROBO2複本(Ig1+Ig2)。結構測定及精化

分子置換使用ROBO1之同源性模型(Ig1+Ig2，PDB碼：2V9Q)搜尋所產生的各組分之有說服力之解決方案。使用軟體autoBUSTER(Global Phasing有限公司)進行精化，且2.19 Å下的最終R/R自由因子分別為0.2119及0.2425，且鍵之RMSD為0.010 Å，角度之RMSD為1.19°。結構結果及分析： 經由 ROBO2 前 Ig1 序列增強表現

在實例1中，已展現出包括野生型ROBO2前Ig1序列SRLRQEDFP (SEQ ID NO: 8)會顯著改良ROBO2-Fc 2.2之表現量。自ROBO2-His6 (如SEQ ID NO: 25所揭示之「His6」)顯而易見，Asp7 (D7)、Phe8 (F8)及Pro9 (P9)實質上參與對於ROBO2第一Ig域之結構完整性至關重要的相互作用(圖14)。Asp7與Tyr94形成氫鍵，而Phe8與Arg36及Asn93形成雙鍵(表4至表5；鄰近殘基之間的距離在3.8 Å或小於3.8 Å之距離內)。此外，Asp7 (D7)、Phe8 (F8)及Pro9 (P9)亦涉及與鄰近殘基之大面積凡得瓦(van der Waals)接觸，使得超過50%之其表面積內埋(表6至表9)。在不希望受任何特定理論束縛之情況下，此等資料表明，ROBO2前Ig1序列將ROBO2之第一Ig域之兩個β片橋連在一起且由此使N端區之摺疊結構明顯穩定。出人意料地，此等資料表明，相較於缺乏前Ig1序列的ROBO2-Fc構築體之表現，摺疊結構之穩定會介導經適當摺疊之ROBO2-Fc 2.2的經增加之表現。表 4 ：涉及 ROBO2 之 N 端 殘基的氫鍵 ( 複本 1) 表 5 ：涉及 ROBO2 之 N 端 殘基的氫鍵 ( 複本 2) 表 6 ：針對 ROBO2 之 N 端 殘基的最小距離相互作用表 ( 複本 1) 表 7 ：針對 ROBO2 之 N 端 殘基的最小距離相互作用表 ( 複本 2) 經由 ROBO2 Ig2-Ig3 域間連接子增強表現：

包括ROBO2 Ig2-Ig3域間連接子V200-F201-E202-R203 (VFER; SEQ ID NO: 12)顯著增加ROBO2-Fc 2.2之表現量。Val200為ROBO2之Ig2域中的最後一個β股之一部分。V200經由大面積的凡得瓦接觸經鄰近殘基深入包圍(表10至表11)；因此，85%之其表面積內埋(表12至表13)。除了Val200之外，Phe201-Glu202-Arg203亦實質上參與區域內之氫鍵合及凡得瓦相互作用(表10至表11、表14至表15)。總體而言，此等資料表明，此等四個胺基酸殘基有效地使ROBO2 Ig2域之C端區中的摺疊結構穩定(圖15)。在不希望受任何特定理論束縛之情況下，此等資料表明，相較於缺乏Ig2-Ig3域間連接子的ROBO2-Fc構築體之經降低之表現，摺疊結構之穩定會增加經適當摺疊之ROBO2-Fc 2.2的表現。表 10 ：針對 ROBO2 之 C 端 殘基的最小距離相互作用表 ( 複本 1) 表 11 ：針對 ROBO2 之 C 端 殘基的最小距離相互作用表 ( 複本 2) 表 14 ：涉及 ROBO2 之 C 端 殘基的氫鍵 ( 複本 1) 表 15 ：涉及 ROBO2 之 C 端 殘基的氫鍵 ( 複本 2) 實例 6. ROBO2-Fc S17T/R73Y 之結構分析 材料製備、結晶、資料收集及結構測定 ：表現

人類ROBO2 S17T/R73Y-His6構築體(如SEQ ID NO: 25所揭示之「His6」)由以下組成：具有2個點突變(S17T及R73Y)之人類ROBO2 Ig1域，之後為C端 His x 6標記(SEQ ID NO: 25)。人類SLIT2構築體由以下組成：SLIT2之D2域(271-479)，之後為C端His6標記(SEQ ID NO: 25)。此等構築體分開表現於HEK293細胞中且轉染後120小時收集條件培養基。ROBO2 S17T/R73Y-His6 ( 如 SEQ ID NO: 25 所揭示之「 His6 」 ) 及 SLIT2 D2 域之純化

使用鎳瓊脂糖凝膠HP (Nickel Sepharose HP) (GE Healthcare)及一定梯度之咪唑自條件培養基純化人類ROBO2 S17T/R73Y-His6 (如SEQ ID NO: 25所揭示之「His6」)。合併峰溶離份且稀釋至20 mM NaCl，調整至pH 6.0且載至具有HiTrap強磺丙基(SP)的串聯置放之HiTrap Q瓊脂糖凝膠速流(Q Sepharose Fast Flow；Q FF)管柱上。高效能(HP)管柱。大面積洗滌之後，移除Q FF管柱且將一定梯度之NaCl施加至SP HP管柱。基於糖基化程度收集溶離份且用TBS透析。

使用鎳瓊脂糖凝膠HP (GE Healthcare)自條件培養基捕獲人類SLIT2 D2域且用一定梯度之咪唑純化。收集峰溶離份且在含有50 mM Tris HCl pH 7.5、1000 mM NaCl之緩衝液下經由Superdex 200尺寸排阻層析進一步純化。收集含SLIT2 D2之溶離份且調整至500mM NaCl。ROBO2 S17T/R73Y-His 及 SLIT2 D2 域之複合物形成

歸因於SLIT2與凝膠過濾管柱之樹脂之間的出人意料之相互作用，ROBO2 S17T/R73Y-His6 (如SEQ ID NO: 25所揭示之「His6」)與SLIT2之複合物無法經由尺寸排阻層析獲得。替代地，以1:1莫耳比將經純化之ROBO2 S17T/R73Y-His6 (如SEQ ID NO: 25所揭示之「His6」)與SLIT2 D2域混合且加以濃縮以進行結晶嘗試。結晶化

在以下條件下獲得與SLIT2 D2域複合之ROBO2 S17T/R73Y-His6 (如SEQ ID NO: 25所揭示之「His6」)之晶體：100mM檸檬酸鈉pH 5.5、15% PEG6000。其產生繞射至1.78 Å之晶體。資料收集

對晶體進行短暫低溫保護，且在先進光子來源(APS)下遠端進行同步加速器資料收集。使用軟體AutoPROC (Global Phasing有限公司)處理影像圖框。資料屬於空間群P2₁ 2₁ 2₁ ，其中單位晶格如下：a = 163.251 Å，b = 41.896 Å，c = 50.938 Å，α = β= γ= 90°，每個不對稱單元具有一個複合物複本。結構測定及精化

分子置換搜尋使用ROBO1 Ig1域及SLIT2 D2域之同源性模型(PDB碼：2V9T)產生各組分之有說服力之解決方案。使用軟體autoBUSTER(Global Phasing有限公司)進行精化，且1.78 Å下的最終R/R自由因子分別為0.1848及0.2354，且鍵之RMSD為0.010 Å，角度之RMSD為1.10°。結構結果及分析

ROBO2 S17T/R73Y-His6-SLIT2 (如SEQ ID NO: 25所揭示之「His6」)之晶體結構與ROBO1-SLIT2之晶體結構充分對齊，且ROBO-SLIT界面在ROBO2與ROBO1之間高度保守。因此，可公開獲得之ROBO1-SLIT2結構可用作ROBO2-SLIT2之取代物以供結構性對比來探測S17T及R73Y之影響。

ROBO2之Ser17 (S17)經由氫鍵與SLIT2之Arg287相互作用(圖16)。與突變無關，與精胺酸之氫鍵為保守的；然而，Thr17提供與Arg287之額外凡得瓦接觸，且因此產生優於野生型Ser17之稍有力之優勢。

ROBO2之R73Y與SLIT2之Tyr404相互作用(圖16)。由兩個酪胺酸殘基之π-π堆疊所引起的凡得瓦相互作用明顯要優於酪胺酸與可撓性精胺酸側鏈之間的相互作用。此經由內埋表面積之百分比(對於Tyr73為42%，與對於Arg73為22%；表16至表19)為顯而易見的。ROBO2 S17T/R73Y中Arg至Tyr之突變有可能為親和力相較於包含S17及R73之野生型ROBO2增加的主要促成者。

此外，S17T及R73Y位於ROBO2-SLIT2界面之相對端處(圖16)。在不希望受任何特定理論束縛之情況下，穩定化此等位置處之相互作用有可能幫助ROBO2較好地與SLIT2『黏附』，且因此增加兩種蛋白的總體結合親和力。表 16 ： ROBO2 中之 主要突變的相互作用表 表 17 ： ROBO1 中之 對應野生型殘基的相互作用表 實例 7 ： ROBO2-Fc 2.2 之轉譯後修飾 LC/MS- 肽定位

藉由肽定位實現ROBO2-Fc 2.2之轉譯後修飾之分析。簡言之，減少、烷基化且用離胺酸特異性蛋白酶、離胺醯基內肽酶(Lys-C)消化ROBO2-Fc 2.2。藉由具有在214 nm處之UV偵測的逆相高效液相層析(RP-HPLC)分析Lys-C蛋白水解肽。

藉由聯機電噴霧電離質譜(RP-HPLC/ESI MS或LC/MS)鑑別針對ROBO2-Fc 2.2的肽圖中之所有主峰及次峰。所觀測到的各峰之質量與來自ROBO2-Fc 2.2之期望Lys-C蛋白水解肽相一致。此等LC/MS-肽定位結果表明，ROBO2-Fc 2.2含有適當胺基酸序列，如由cDNA序列所預測。LC/MS分析表明，肽K6 (檢測呈K4K5K6形式)中存在N連接寡醣，該肽含有用於N連接糖基化之N¹⁰² AS共同序列。K4K5K6醣肽中所鑑別的主要寡醣結構包括含有兩個半乳糖殘基，及一個末端N-乙醯基神經胺糖酸殘基(G2F+1NeuAc)；或兩個末端N-乙醯基神經胺糖酸殘基(G2F+2NeuAc)的雙觸角複合型結構。觀測到含有兩個末端半乳糖殘基(G2F)之少量K4K5K6醣肽。觀測到其他少量物種，其呈現三觸角及四觸角複合型結構，其中經核心取代之海藻糖含有至多四個末端N-乙醯基神經胺糖酸殘基。

LC/MS分析亦表明，肽K19(觀測到呈K18K19形式)中存在N連接寡醣，該肽含有用於N連接糖基化之N²⁹¹ ST共同序列。K18K19上所鑑別的主要寡醣結構包括含有零(G0F)或1 (G1F)個末端半乳糖殘基之脫唾液酸雙觸角複合型結構。觀測到少量K18K19，其具有含有兩個半乳糖殘基(G2F)之脫唾液酸雙觸角複合型結構。偵測到少量及微量含有截短N-聚醣及含有至多兩個末端N-乙醯基神經胺糖酸殘基之複合N-聚醣的醣肽K18K19。表 20 ： LC/MS - N 連接 糖基化 實例 8 ： 安全性藥理學研究

每週以50毫克/公斤/劑之劑量藉由靜脈內(IV)注射投與ROBO2-Fc 2.2一次持續6週(共計6個劑量)以遙測雄性猴以評估心血管(CV)終點。觀測到心跳速率(HR)與活動的統計學上顯著之差異。然而，此等差異程度較小，本質上具有偶發性且不會隨時間推移持續；因此，不認為其與ROBO2-Fc 2.2相關。在整個研究中在任何時間，每週以50毫克/公斤/劑IV投與ROBO2-Fc 2.2持續6週並未產生與ROBO2-Fc 2.2相關的血壓(BP)、HR或活動變化。在第1天、第22天及第36天C_最大分別為1060 µg/mL、1030 µg/mL及1070 µg/mL。

在經遙測之雄性及雌性食蟹獼猴中之重複劑量探究性毒性研究(ETS)中，評定每週一次IV投與50毫克/公斤/劑量之ROBO2-Fc 2.2持續29天(總計5個劑量)對心電圖(ECG)及血壓(BP)參數及活動之作用。不存在對經由第9天收集的CV量測結果之ROBO2-Fc 2.2相關作用。在第29天，組合的性別的C_最大為497 μg/mL。

將ECG及HR量測併入至處於20、100或300毫克/公斤/劑(IV)或300毫克/公斤/劑(皮下；SC)之劑量下的雄性及雌性食蟹獼猴中的符合良好實驗室操作(Good Laboratory Practice；GLP)之3個月重複劑量毒性研究中。在此研究中，在至多9210 µg/mL之平均組合性別C_最大下，不存在對ECG或HR之ROBO2-Fc 2.2相關作用。此外，不存在將暗示任何呼吸道或中樞神經系統作用之ROBO2-Fc 2.2相關臨床觀測結果。

此外，在3個月毒性研究中在大鼠中評定神經功能終點。在至多425毫克/公斤/劑(IV)下或在425毫克/公斤/劑(SC)下，不存在對運動活性或功能觀測組合(functional observational battery)之ROBO2-Fc 2.2相關作用(平均組合性別C_最大為至多7610 µg/mL)。實例 9 ： 動物中之藥物動力學及產物代謝 分析方法 I. 大鼠及猴血清中 ROBO2-Fc 2.2 之定量

在Meso Scale Discovery (MSD®)分析平台(15-1611，15-1609)上在威斯塔韓(Wistar Han)大鼠及食蟹獼猴血清中針對ROBO2-Fc 2.2之定量驗證電化學發光(ECL)分析。在此等分析中，在塗佈有經生物素標記之抗ROBO2-Fc抗體捕捉試劑的經抗生蛋白鏈菌素塗佈之MSD盤上培育含有ROBO2-Fc 2.2之樣本。用釕化小鼠抗人類IgG Fc抗體偵測經結合之ROBO2-Fc 2.2。藉由添加MSD讀取緩衝液以產生使用MSD盤讀取器讀取的ECL信號來達成最終偵測。所得ECL信號與ROBO2-Fc 2.2之濃度成正比。根據使用加權因子為1/y之4PL邏輯(自動估算)模型擬合標準曲線藉由內插法測定樣本濃度。100%血清中之定量範圍為50至1280 ng/mL，最小所需稀釋因數(MRD)為20x。II. 大鼠及猴血清中之抗 ROBO2-Fc 2.2 抗體之偵測

使用MSD®分析平台在威斯塔韓大鼠及食蟹獼猴血清中驗證ECL分析以偵測存在抗藥品抗體(ADA)。在此等分析中，將經生物素及釕標記之ROBO2-Fc 2.2與研究樣本、陽性對照(威斯塔韓或食蟹獼猴血清中之抗ROBO2-Fc 2.2抗體)或陰性對照(所收集之威斯塔韓或食蟹獼猴血清)共培育。樣本中存在的對ROBO2-Fc 2.2之抗體必須結合ROBO2-Fc 2.2之經生物素及釕標記之形式以在此等分析中進行偵測。使用經抗生蛋白鏈菌素塗佈之MSD盤捕獲經結合之ADA。使用三丙胺以產生ECL信號來達成最終偵測，該信號係使用MSD盤讀取器來量測且以相對光單位(RLU)報導。

使用分層策略針對ADA測試研究樣本。首先在篩選分析中以1:50之最小所需稀釋度測試樣本。產生小於分析截點之RLU的樣本報導為陰性(＜1.70，最小所需稀釋因數，50之log10)。在全稀釋液系列中再分析產生等於或高於分析截點之RLU的樣本以證實陽性結果且測定抗體力價。抗體力價定義為將產生等於分析截點RLU之RLU的樣本之稀釋度倒數，且報導效價之對數(以10為底)。

基於第1天給藥之前收集之樣本及給藥後樣本結果之比較得出關於ADA誘導之結論。若給藥前樣本針對ADA測試為陰性的，且對應給藥後樣本測試為陽性的，則將動物視為對於對ROBO2-Fc 2.2之ADA反應的誘導為陽性的。若給藥前及給藥後樣本兩者針對ADA測試為陽性的，則僅當給藥後樣本效價相加為至少0.48(log 3，連續稀釋因數)或高於給藥前樣本之效價時，才將動物視為對於ADA反應的誘導為陽性的。結果 I. 藥物動力學 A. 單劑量藥物動力學

在10 mg/kg之單一IV劑量之後在路易斯大鼠(n = 3)及食蟹獼猴(n = 2)中測定ROBO2-Fc 2.2之血清PK。ROBO2-Fc 2.2在大鼠中展現出1.5 mL/h/kg之清除率(CL)，在猴中展現出0.89 mL/h/kg之CL，且在大鼠中展現出0.19 L/kg之穩態分佈體積(Vss)，在猴中展現出0.09 L/kg之Vss，使得大鼠與猴中之終半衰期(t½)分別為大約5天與8天。向大鼠SC投與10 mg/kg ROBO2-Fc 2.2之後，所估算之生物利用率為56%。B. 重複劑量藥物動力學 ( 毒物動態學； TK) 大鼠毒物動態學

在每3天一次向雄性及雌性威斯塔韓大鼠(n=6/性別/劑量組)IV投與25、125或425毫克/公斤/劑且SC投與425毫克/公斤/劑之後，進行TK及ADA評估作為具有6週恢復期的3個月GLP先導毒性研究之一部分。

在第1天給藥之前收集及分析之樣本或自媒劑對照組收集及分析之樣本中不存在可定量濃度之ROBO2-Fc 2.2。直至第88天(所收集之最後樣本)且直至恢復期之最後一天(第135天)在投加ROBO2-Fc 2.2之組中觀測到可定量濃度之ROBO2-Fc 2.2。

在任何劑量組中在全身暴露量(如藉由最大濃度[C_最大 ]及時間0至72小時[AUC₇₂ ]的濃度曲線下面積(AUC)所評定)方面沒有明顯性別相關差異。自第1天至第88天，平均全身暴露量以適當劑量比例方式隨劑量增加而增加。在第1天及第88天SC給藥之後的ROBO2-Fc 2.2全身生物利用率分別為24.4%及25.4%。對於IV及SC組，累積比(AUC，第88天/第1天)為＜ 2.0 (表21)。

25、125及425 mg/kg IV組中的對ROBO2-Fc 2.2之ADA誘導的發生率分別為0.0% (0/12隻動物)、0.0% (0/12隻動物)及0.0% (0/12隻動物)，且在425 mg/kg SC組(5/12隻動物)中為41.7%。相較於ADA陰性動物，血清ROBO2-Fc 2.2濃度在ADA陽性動物中為相似的。然而，應注意，樣本中所存在的ROBO2-Fc 2.2之循環量可能會干擾ADA之偵測。食蟹獼猴毒物動態學

在每週一次向雄性及雌性食蟹獼猴(n=3或5/性別/劑量組)IV投與20、100或300毫克/公斤/劑且SC投與300毫克/公斤/劑之後，進行TK及ADA評估作為具有6週恢復期的3個月GLP先導毒性研究之一部分。

在第1天給藥之前收集及分析之樣本或自媒劑對照組收集及分析之樣本中不存在可定量濃度之ROBO2-Fc 2.2。直至第78天(所收集之最後樣本)且直至恢復期之最後一天(第127天或第128天)在投加ROBO2-Fc 2.2之組中觀測到可定量濃度之ROBO2-Fc 2.2。

在任何劑量組中在全身暴露量(如藉由C_最大及AUC₁₆₈ 所評定)方面沒有明顯性別相關差異。自第1天至第78天，平均全身暴露量以適當劑量比例方式隨劑量增加而增加。在第1天及第78天SC給藥之後的ROBO2-Fc 2.2全身生物利用率(300 mg/kg IV及SC劑量)分別為53.7%及77.0%。對於IV組，累積比(AUC，第78天/第1天)為＜ 2.0，且對於SC組，比率為2.1 (表21)。

20、100及300 mg/kg IV組中的對ROBO2-Fc 2.2之ADA誘導的發生率分別為0% (0/6隻動物)、0% (0/6隻動物)及20% (2/10隻動物)，且在300 mg/kg SC組(2/6隻動物)中為33%。相較於ADA陰性動物，血清ROBO2-Fc 2.2濃度在ADA陽性動物中為相似的。然而，應注意，樣本中所存在的ROBO2-Fc 2.2之循環量可能會干擾ADA之偵測。II. 分佈

單一IV劑量之後，大鼠(0.19 L/kg)及猴(0.09 L/kg)中的ROBO2-Fc 2.2之Vss較低，其與含有Fc之蛋白質在細胞外流體中之有限分佈相一致。III. 藥物動力學 - 藥效學及人類 PK 預測

基於PK/PD建模(併入經預測之人類PK、經量測之ROBO2及SLIT2血清及腎臟濃度資料)，預測2 mg/kg (150 mg)之經估算的每週一次的人類SC劑量會在腎臟中保持C_最小靶向物覆蓋率＞90%。預計人類有效濃度(C_有效 )為約11 µg/ml之血清在腎臟中提供＞90%之靶向物覆蓋率。與每週一次的2 mg/kg (150 mg)之人類SC劑量相關的預計人類穩態C_最大及AUCtau分別為18.2 μg/mL及2610 μg•h/mL。

藉由基於異速生長指數(allometric exponent)按比例調整食蟹獼猴靜脈內PK資料來得出ROBO2-Fc 2.2之人類PK的預測結果。在人類中，預測ROBO2-Fc 2.2會展現0.5 mL/h/kg之清除率及90 mL/kg之穩態分佈體積，提供大約14天之終半衰期。人類SC生物利用率經預測呈60%。

在初始臨床研究中，暴露限值將設定成2930 µg/mL之C_最大及74500 µg•h/mL之AUC，其測定為與在預計人類有效劑量(150 mg SC每週一次)下的分別為161×及29×預計人類有效暴露之暴露邊限相關。這一暴露邊限係基於大鼠中的由3個月GLP毒性研究鑑別的未觀測到之不良作用水準(NOAEL)。

儘管在每週分別以10毫克/公斤/劑SC或50或200毫克/公斤/劑IV投與ROBO2-Fc 2.2一次後，在大鼠或食蟹獼猴ETS中在3個月GLP毒性研究中未出現對血清細胞介素水準之ROBO2-Fc 2.2相關作用，但在8名人類供者中之1名及12隻猴中之1隻中活體外觀測到TNF-α及/或IL-6增加。儘管活體外發現之可譯性不會很好理解，但將在單次遞增劑量期中實施經由IV輸注緩慢投與ROBO2-Fc 2.2 (在第一小時內，給予所給定的總劑量之一小部分，之後經由第二小時投與剩餘劑量)之措施以允許暫停/結束給藥、密切監測生命徵象、臨床症狀及評定細胞介素水準。表 21： 大鼠及猴中的平均總 (雄性 +雌性 )毒理動力學參數 ±標準差 ^a 實例 10 ：毒理學

在持續時間為至多3個月(13週)的探索性(非符合良好實驗室操作[GLP])及先導(符合GLP)毒性研究中藉由IV及SC注射向大鼠及食蟹獼猴投與ROBO2-Fc 2.2。給藥3個月之後未觀測到之不良作用水準(NOAEL)為： (i) 大鼠中之125毫克/公斤/劑IV (2930 µg/mL之C_最大及74,500 µg•h/mL之AUC₇₂ )及425毫克/公斤/劑SC (842 µg/mL之C_最大及50,500 µg•h/mL之AUC₇₂ )，及 (ii) 猴中之300毫克/公斤/劑IV (9210 µg/mL之C_最大及427,000 µg•h/mL之AUC₁₆₈ )及SC (2340 µg/mL之C_最大及328,000 µg•h/mL之AUC₁₆₈ )。I. 重複劑量毒性

在大鼠及食蟹獼猴中用ROBO2-Fc 2.2進行探索性及先導重複劑量毒性研究。A. 大鼠研究 (i) 探索性 毒性研究 (ETS)

在雄性大鼠中之探索性毒性研究(ETS)中，以200毫克/公斤/劑IV或10、50或200毫克/公斤/劑SC每3天投與ROBO2-Fc 2.2一次持續14天(總計5個劑量)且在所有劑量下均耐受。不存在ROBO2-Fc 2.2相關臨床症狀且體重或食物消耗量參數沒有變化。

ROBO2-Fc 2.2相關作用包括在≥10毫克/公斤/劑SC下，在SC注射部位處出現輕微至中度SC血管周發炎；在≥10毫克/公斤/劑SC及IV下，不與微觀關聯相關的較高絕對胸腺重量(1.21×至1.44×對照)及相對胸腺重量(針對器官與體重比，1.17×至1.39×對照，且針對器官與大腦重量比，1.22×至1.46×對照)；在200毫克/公斤/劑SC及IV下，較高尿液肌酐(1.70×至1.83×對照)及較低尿量(分別為0.52×及0.55×對照)；在200毫克/公斤/劑SC及200毫克/公斤/劑IV下，較高平均尿液比重(1.011×及1.012×對照)；及在200毫克/公斤/劑IV下，較高平均血清膽固醇(1.38×對照)。臨床化學及器官重量結果不與任何微觀結果相關。(ii) 重複劑量毒性研究

在先導重複劑量大鼠毒性研究中，每3天以25、125或425毫克/公斤/劑IV或425毫克/公斤/劑SC向大鼠投與ROBO2-Fc 2.2一次持續3個月(總計31個劑量)，之後為6週恢復期(對照及425毫克/公斤/劑IV)。亦評估ROBO2-Fc 2.2之神經功能作用。ROBO2-Fc 2.2相關臨床症狀包括給藥期期間在425毫克/公斤/劑SC下4/10隻雄性大鼠中出現的皮膚病變(背側、胸部、顱骨或注射部位)。此等變化不視為不利的，因為發生率僅略高於對照組(2/15雄性)，且變化在給藥期中僅偶爾出現且不存在於以至多425毫克/公斤/劑IV投與ROBO2-Fc 2.2的動物中。不存在ROBO2-Fc 2.2相關體重、食物消耗量、眼科學、神經功能或宏觀結果。

在雄性中，≥ 125毫克/公斤/劑IV下的腎臟結果由微小腎絲球病變組成。在雌性中，亦觀測到微小腎絲球病變，但僅在425毫克/公斤/劑IV下，且其伴有輕微至輕度管狀的嗜鹼性球增多症及透明管狀管型以及較高尿蛋白(100 mg/dL)。雌性中的腎絲球病變、管狀嗜鹼性球增多症及透明管狀管型之形態學結果為不利的，因為組合連同並非不利的較高尿蛋白一起指示腎功能受損。在雄性中，腎絲球病變並非不利的，因為結果在分佈上要少得多，在不存在管狀嗜鹼性球增多症及透明管型下出現且不與較高尿蛋白相關。腎絲球病變之特徵在於藉由光顯微術觀測到腎臟皮質中的腎小球中之顆粒嗜酸性物質聚集且藉由穿透式電子顯微鏡術觀測到腎小球毛細血管環周圍足細胞足突融合。在恢復期結束時，腎絲球病變在雄性中完全恢復且在雌性中部分恢復且為不利的。在雌性中亦完全恢復管狀嗜鹼性球增多症、透明管狀管型及尿蛋白。在425毫克/公斤/劑IV下之雄性組中，且在≥25毫克/公斤/劑IV及425毫克/公斤/劑SC之雌性組中看到較高血清總蛋白(1.09×至1.18×)及血清白蛋白(1.10×至1.20×)。儘管尿蛋白較高，但在425毫克/公斤/劑IV之雌性組中會觀測到此。

另外的ROBO2-Fc 2.2相關微觀結果出現在投與425毫克/公斤/劑SC之動物中，且由以下組成：相較於對照(輕微至輕度)注射部位之出血及發炎之發生率及/或嚴重程度(中度)增加，及引流淋巴結中的微小淋巴增生之發生率增加。SC注射部位處增加的出血及發炎並非不利的，因為其僅比共存的對照略微嚴重且並不與超出期望的由於注射程序之明顯組織損傷相關。引流淋巴結中增加的微小淋巴增生之發生率為不利的，因為其在形態上與對照相似且有可能展現對ROBO2-Fc 2.2及/或給藥程序之微小免疫反應。在不再投與注射後，預期此等結果將恢復。

在≥125毫克/公斤/劑IV及425毫克/公斤/劑SC下的雌性組中，給藥期結尾處出現的ROBO2-Fc 2.2相關之較高肝臟重量並非不利的，且由較高平均絕對及相對身體及大腦重量(相較於對照，1.11×至1.17×)組成。此等較高肝臟重量並非不利的，此係因為不存在相關宏觀及微觀結果且不存在指示組織損傷的肝酶變化。較高肝臟重量完全恢復。

另外的臨床病理學凝血及臨床化學參數變化並非不利的且由以下組成：≥ 125毫克/公斤/劑IV下的雄性及雌性組中之較高血纖維蛋白原(1.21×至1.48×)；≥ 125毫克/公斤/劑IV下的雄性組及≥ 25毫克/公斤/劑IV及425毫克/公斤/劑SC下的雌性組中之較高膽固醇(1.37×至2.52×)及三酸甘油酯(1.58×至3.11×)及425毫克/公斤/劑IV下的雌性組中之較高球蛋白(1.16×)及較高鈣(1.09×)。雄性及雌性組中之血纖維蛋白原、膽固醇、三酸甘油酯、總蛋白、血清白蛋白及球蛋白完全恢復，但425毫克/公斤/劑IV下的雌性組中之鈣(恢復時，1.04×對照組)僅部分恢復。基於投與ROBO2-Fc 2.2之組與對照組之間的差異程度較小且不存在相關宏觀及微觀結果，此等臨床病理學變化並非不利的。

投與ROBO2-Fc 2.2 3個月之後，大鼠中的毒物動態學之彙總結果可見於表22中。每三天以25、125或425毫克/公斤/劑IV或以425毫克/公斤/劑SC向大鼠投與ROBO2-Fc 2.2一次持續3個月(總計31個劑量)之後，125毫克/公斤/劑IV及425毫克/公斤/劑SC鑑別為NOAEL。B. 猴研究 (i) 探索性毒性研究 (ETS)

在雄性及雌性食蟹獼猴中之ETS中，每週以50或200毫克/公斤/劑IV或10毫克/公斤/劑SC投與ROBO2-Fc 2.2一次持續29天(總計5個劑量)。在50毫克/公斤/劑IV組中的經遙測術植入之動物中評估心血管作用。在第30天(最後一次投藥之後的那一天)對所選動物進行屍體解剖。將來自50毫克/公斤/劑IV組之兩隻猴保留至第71天以評定耐受性及毒物動態學。投與ROBO2-Fc 2.2在所有劑量下均耐受。不存在對存活期、臨床症狀、體重、食物消耗量、心血管量測、活體內細胞介素評定、血液學及凝血參數之ROBO2-Fc 2.2相關作用及宏觀及微觀結果。ROBO2-Fc 2.2相關作用包括50毫克/公斤/劑IV下的兩隻雌性(1.26×至1.51×基線)中及200毫克/公斤/劑IV雄性及雌性動物(分別為1.59×與1.55×基線)中天冬胺酸轉胺酶少量增加；及50毫克/公斤/劑IV下的相同雌性(1.29×至2.05×基線)及200毫克/公斤/劑IV (1.29×基線)中丙胺酸轉胺酶少量增加。此等酶增加不與此等動物之肝臟中的ROBO2-Fc 2.2相關微觀變化相關。(ii) 重複劑量毒性研究

在先導重複劑量食蟹獼猴毒性研究中，每週以20、100或300毫克/公斤/劑IV或300毫克/公斤/劑SC投與ROBO2-Fc 2.2一次持續3個月(總計13個劑量)，之後為6週恢復期(對照及300毫克/公斤/劑IV)。此研究中所評估的任何終點中均不存在不利ROBO2-Fc 2.2相關結果。不存在ROBO2-Fc 2.2相關臨床症狀、體重、食物消耗量、心電圖/心跳速率、血液學、凝血、尿分析、眼科學、器官重量或宏觀結果。ROBO2-Fc 2.2相關臨床化學變化包括300毫克/公斤/劑IV或SC下的膽固醇增加(1.25×至1.61×基線)；≥20毫克/公斤/劑IV或300毫克/公斤/劑SC下的三酸甘油酯增加(1.58×至4.59×基線)；及≥100毫克/公斤/劑IV或300毫克/公斤/劑SC下的球蛋白降低(0.83×至0.87×基線)。所有臨床化學變化並非不利的，其歸因於其變化程度較小且缺少相關組織變化。恢復期之後，除300毫克/公斤/劑IV雄性中保持的增加之三酸甘油酯外，臨床化學變化均完全恢復(2.78×至6.79×基線)；可定量濃度之ROBO2-Fc 2.2存在至恢復期之第128天/第127天。

在投與300毫克/公斤/劑SC之動物的引流(左腋)及腋(右腋)淋巴結中觀測到淋巴濾泡之細胞含量增加。此結果之特徵在於最低限度地至適度地增加具有顯著生發中心形成的淋巴濾泡之大小及數目且與針對抗原刺激之反應相一致。歸因於其嚴重程度極小至輕度，此結果並非為不利的。在不再投與注射後，預期此結果將恢復。相比之下，以至多300毫克/公斤/劑IV之劑量投與ROBO2-Fc 2.2的動物中不存在ROBO2-Fc 2.2相關微觀結果。

投與ROBO2-Fc 2.2 3個月之後，食蟹獼猴中的毒物動態學之彙總結果可見於表22中。每週以20、100或300毫克/公斤/劑IV或以300毫克/公斤/劑SC向猴投與ROBO2-Fc 2.2一次持續3個月(總計13個劑量)之後，300毫克/公斤/劑IV及300毫克/公斤/劑SC鑑別為NOAEL。II. 局部耐受性

在探索性及先導大鼠及食蟹獼猴重複劑量毒性研究中用顯微鏡評估IV及SC注射部位。大鼠之IV注射部位處不存在ROBO2-Fc 2.2相關結果。ROBO2-Fc 2.2相關結果僅出現大鼠之SC注入部位處。在大鼠ETS中，≥10毫克/公斤/劑SC下的輕微至中度皮下血管周發炎係歸因於注射之物理外傷且不視為不利的。在先導大鼠研究中，增加的出血之嚴重程度(中度)被視為不利的，因為其僅比共存的對照略微嚴重且並不與超出期望的由於注射程序之明顯組織損傷相關。亦在先導大鼠研究中，在給藥期期間ROBO2-Fc 2.2相關表皮病變(背側、胸部、顱骨或注射部位)出現在425毫克/公斤/劑SC下的雄性中。此等變化不視為不利的，因為發生率僅略微高於對照組且在給藥期中偶然出現。

食蟹獼猴之IV注射部位處不存在ROBO2-Fc 2.2相關結果。至多200毫克/公斤/劑IV之劑量下的ETS中的大多數動物、包括對照中之IV注射部位處所存在的不同嚴重性之出血及/或嗜中性發炎並不視為與ROBO2-Fc 2.2相關，且在至多300毫克/公斤/劑IV劑量下的先導食蟹獼猴研究中不存在ROBO2-Fc 2.2相關IV注射部位結果。猴之SC注射部位處不存在ROBO2-Fc 2.2相關結果。III. 細胞介素釋放分析

在使用人類全血樣本之活體外細胞介素釋放分析(CRA)中，ROBO2-Fc 2.2在來自所測試的8名人類供者中之1名的全血樣本中引起產生腫瘤壞死因子-α (TNF-α)及介白素-6 (IL-6)。與ROBO2-Fc 2.2一起培育之人類全血樣本中未觀測到ROBO2-Fc 2.2相關干擾素-γ(IFN-γ)釋放。

在使用開始給藥之前收集的食蟹獼猴全血樣本的活體外CRA中，ROBO2-Fc 2.2來自所測試的12隻食蟹獼猴中之1隻的全血樣本中引起產生IL-6，同時並未觀測到ROBO2-Fc 2.2相關TNF-α或IFN-γ釋放。

另外，自每週以10毫克/公斤/劑SC或50或200毫克/公斤/劑IV投與ROBO2-Fc 2.2一次後的ETS中的食蟹獼猴收集血液樣本以便表徵細胞介素濃度之變化。TNF-α、IL-6或IFN-γ之血清濃度中不存在ROBO2-Fc 2.2相關變化。IV. C1q 及 Fc γR 結合分析

在補體蛋白1q (C1q)結合ELISA中活體外評估ROBO2-Fc 2.2以測試其引起補體依賴性細胞毒性(CDC)之潛力，且在可結晶片段γ受體(FcγR)結合分析中活體外評估ROBO2-Fc 2.2以測試其針對抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性之潛力。ROBO2-Fc 2.2並未結合於達至測試濃度之C1q且因此視為具有低誘導CDC潛力。ROBO2-Fc 2.2與所測試之所有FcγR的結合與伴隨分析對照抗體看到之結合相似或比其要少，且比根據陽性對照抗體之資料要少。此等資料表明，ROBO2-Fc 2.2具有較低的引起ADCC活性之潛力。V. 結果與藥物動力學之關係

在所測試之劑量範圍內，在向大鼠及食蟹獼猴重複IV及SC給藥之後，ROBO2-Fc 2.2暴露量(如藉由C_最大及AUC評定)以適當劑量比例方式隨劑量增加而增加。在暴露量方面未觀測到明顯性別相關差異。利用此等關鍵反應計算的與關鍵反應及暴露邊限相關的ROBO2-Fc 2.2之臨限濃度可見於表22中。表 22 ：與關鍵反應相關的 ROBO2-Fc 2.2 之濃度 表 22 ： 與關鍵反應相關的 ROBO2-Fc 2.2 之濃度 ( 續 )

總體而言，此等資料表明ROBO2-Fc 2.2為針對各種疾病、病症及病狀之潛在人類療法。

因此本發明已得到廣泛揭示且參考上述代表性實施例說明。熟習此項技術者將認識到在不背離本發明之精神及範疇下可進行各種修改。所有公開案、專利申請案及頒予專利以引用之方式併入本文中，其引用的程度如每個個別的公開案、專利申請案或頒予專利經特定及個別地指示以全文引用之方式併入本文中。在以引用之方式併入之正文中所含之定義若與在本發明中之定義矛盾，則將其排除在外。

應瞭解，本發明的為清楚起見在單獨實施例之上下文中描述的某些特徵亦可以組合形式提供於單一實施例中。相反，為簡潔起見而在單一實施例之上下文中所描述的本發明之各種特徵亦可分開地或以任何適合子組合形式提供。

尤其預期關於本發明之一個實施例所述的任何限制可應用於本發明之任何其他實施例。此外，本發明之任何組合物可用於本發明之任何方法，且本發明之任何方法可用於產生或利用本發明之任何組合物。詳言之，應瞭解單獨或與一或多個其他申請專利範圍及/或實施方式之態樣組合的申請專利範圍中所述之本發明之任何態樣可與申請專利範圍及/或實施方式及/或序列表及/或圖式中別處陳述之本發明之其他態樣組合。

在本文中發現之特定實例不在本發明之範疇的程度上，該特定實例可明確不主張。

儘管本發明支持涉及僅替代及「及/或」之定義，但除非明確指示為僅替代或替代相互排斥，否則「或」一詞在申請專利範圍中之使用用於意謂「及/或」。除非另外清楚指示，否則如本說明書中所用，「一(a/an)」可意謂一或多個。如申請專利範圍中所用，當與字組「包含」結合使用時，字組「一(a/an)」可意謂一個或多於一個。如本文中所用，「另一」可意謂至少第二個或多於兩個。除非本文中另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語應具有由一般技術者通常理解之含義。此外，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。當參照本發明在本文中使用時，字組「包含(comprises/comprising)及字組「具有/包括」用於指明存在所陳述特徵、整數、步驟或組分但並不排除存在或附加一或多種其他特徵、整數、步驟、組分或其群。

雖然已參考不同申請案、方法及組合物描述所揭示之教示內容，但應瞭解，在不背離本文中之教示及下文所主張之本發明下可進行不同變化及修改。提供該等實例以更好地說明本發明之教示內容，且並不意欲限制本文中所呈現之教示內容之範疇。雖然已根據此等示例性實施例描述本發明之教示內容，但在不進行過度實驗下可對此等示例性實施例進行大量變化及修改。所有該等變化及修改皆在本教示內容之範疇內。

當本發明之態樣或實施例根據馬庫西群組(Markush group)或其他替代群組進行描述時，本發明不僅涵蓋整體列出之全部群組，而且涵蓋獨立群組之各成員及主群組之所有可能子組，且亦涵蓋缺乏一或多個群組成員之主群組。本發明亦設想明確排除所主張之發明中之任何群組成員中之一或多者。

本文中所引用之全部參考文獻(包括專利案、專利申請案、論文、課本及類似者)及其中引用的參考文獻至其尚未引用之程度，在此以全文引用之方式併入本文中。在所併入文獻及類似材料中之一或多者(包括(但不限於)定義之術語、術語用法、所描述之技術等)與本申請案不同或抵觸的情況下，以本申請案為準。

描述及實例詳述本發明之某些特定實施例，且描述本發明人預期之最佳模式。然而應瞭解，無論文中呈現之前述內容如何詳細，本發明仍可以許多方式實踐，且本發明應根據隨附申請專利範圍及其任何等效物來解釋。表 23 ：序列 表 24 序列 ID 指配 X = 並非構築體之部分的組分

圖1A為顯示人類ROBO2之域的圖示。21-胺基酸ROBO2前導序列(SEQ ID NO: 17；根據SEQ ID NO: 24中所示之編號的殘基1至21)在蛋白質生產期間裂解以產生成熟ROBO2。根據SEQ ID NO: 24中所示之編號的殘基22至859形成細胞外域，根據SEQ ID NO: 24之編號的殘基860至880形成跨膜域，且根據SEQ ID NO: 24之編號的殘基881至1378形成細胞質域。亦顯示ROBO2前Ig1序列(SEQ ID NO: 8)、Ig1-Ig2域間連接子(SEQ ID NO: 10)及Ig2-Ig3域間連接子(SEQ ID NO: 12)。

圖1B為顯示本文所述之例示性重組ROBO2-Fc融合蛋白的圖示：本文所述之ROBO2-Fc. 1.0 (僅含有Ig1域，亦即根據SEQ ID NO: 24之編號的胺基酸殘基31至127)；ROBO2-Fc. 1.1 (含有Ig1域及Ig1-Ig2域間連接子，亦即根據SEQ ID NO: 24之編號的胺基酸殘基31至132)；ROBO2-Fc. 2.0 (含有Ig1域、Ig1-Ig2域間連接子及Ig2域，亦即根據SEQ ID NO: 24之編號的胺基酸殘基31至220)；ROBO2-Fc. 2.1 (含有Ig1域、Ig1-Ig2域間連接子、Ig2域及Ig2-Ig3域間連接子，亦即根據SEQ ID NO: 24之編號的胺基酸殘基31至224)；ROBO2-Fc. 2.2 (含有前Ig1序列、Ig1域、Ig1-Ig2域間連接子、Ig2域及Ig2-Ig3域間連接子，亦即根據SEQ ID NO: 24之編號的胺基酸殘基22至224)；ROBO2-Fc. 3.0 (含有Ig1域、Ig1-Ig2域間連接子、Ig2域、Ig2-Ig3域間連接子、Ig3域，亦即根據SEQ ID NO: 24之編號的胺基酸殘基31至309)；及ROBO2-Fc. 4.0 (含有Ig1域、Ig1-Ig2域間連接子、Ig2域、Ig2-Ig3域間連接子、Ig3域、Ig3-Ig4域間連接子及Ig4，亦即根據SEQ ID NO: 24之編號的胺基酸殘基31至409)。

圖2顯示ROBO2-Fc 2.2胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)。殘基係以N端開始依序編號。Ig1及Ig2域以大寫顯示，而Fc域則以小寫字母顯示。前Ig1序列(SEQ ID NO: 8)及Ig2及Ig3域間連接子(SEQ ID NO: 12)以粗體及斜體顯示，而Ig1-Ig2域間連接子(SEQ ID NO: 10)則以斜體顯示。經預測之鏈內及鏈間二硫鍵以連接線示出。單一多肽鏈顯示為在Fc鉸鏈區中具有二硫鍵，其可與包含多肽鏈之又一Fc二聚。典型N連接糖基化共同序列位點用圓圈標記(亦即NXS/T，其中聚糖附接至天冬醯胺殘基且其中X可為除脯胺酸外之任何胺基酸，且第三胺基酸為絲胺酸或蘇胺酸任一者)，且位於A228、A229及A231處的剔除Fc效應功能之點突變以粗體示出。6個胺基酸之Gly-Ser連接子序列在方形區域中示出。

圖3展示ROBO2-Fc 2.1(SEQ ID NO: 2)結合於SLIT2而ROBO2-Fc 1.1 (SEQ ID NO: 4)及ROBO2-Fc 2.0 (SEQ ID NO: 3)並未結合。利用Octet Red，以10 μg/ml將ROBO2-Fc蛋白載至抗人類結晶片段(AHFc)感測器上且與100 nM SLIT2一起培育7分鐘，且隨後將感測器單獨移動至緩衝液持續640秒。ROBO2-Fc 4.0 (SEQ ID NO: 7)作為結合之陽性對照包括在內。在ROBO2之Ig2域之後添加序列VFER (SEQ ID NO: 12)以形成ROBO2-Fc 2.1 (SEQ ID NO: 2)對於製造結合SLIT2之ROBO2-Fc融合蛋白為必不可少的。

圖4A至圖4C展示ROBO2-Fc 2.2 (SEQ ID NO: 1)以高親和力結合於SLIT2。使用表面電漿子共振(SPR)來量測K_D 值。ROBO2-Fc 2.2與人類/食蟹獼猴SLIT2-D2 (ROBO2結合域，100%一致性)之K_D 為0.293 nM (圖4A)。ROBO2-Fc 2.2與人類SLIT2-N (N端片段)之K_D 為0.279 nM (圖4B)，且ROBO2-Fc 2.2與大鼠SLIT2-N之K_D 為0.543 nM (圖4C)。

圖5展示ROBO2-Fc 2.2 (SEQ ID NO: 1)以具有9 nM之EC₅₀ 的高親和力結合於過度表現於人胎腎(HEK293)細胞上之人類SLIT2-N。將用Alexa Fluor 647 (AF647)標記之ROBO2-Fc 2.2的12點、2倍稀釋液系列與表現SLIT2-N之HEK293細胞或對照HEK293細胞一起培育。資料表示為SLIT2-N HEK293細胞上之ROBO2-Fc 2.2 AF647的幾何平均螢光強度(Geo MFI)減去對照HEK293細胞上之ROBO2-Fc 2.2 AF647的幾何平均螢光強度。

圖6A至圖6B展示如藉由均相時間解析式螢光(HTRF)所評定的ROBO2-Fc 2.2 (SEQ ID NO: 1)劑量依賴性抑制結合於細胞表面ROBO2之SLIT2-N。將ROBO-Fc 2.2 (黑色正方形)或同型對照抗體(黑色圓形)之11點、4倍劑量調定添加至人類SLIT2-N (圖6A)或大鼠SLIT2-N (圖6B)人類ROBO2 HTRF分析。ROBO2-Fc 2.2為人類SLIT2-N:人類ROBO2(7 nM之IC₅₀ )及大鼠SLIT2-N:人類ROBO2 (4 nM之IC₅₀ )結合之強效中和劑。

圖7描繪利用ROBO2-Fc 2.2劑量依賴性抑制經SLIT2-N介導的神經元細胞遷移之抑制。在1 nM SLIT2-N及一定劑量範圍之ROBO2-Fc 2.2存在下隔夜培養室下區(SVZ)神經元組織細胞外植體。ROBO2-Fc 2.2能夠以劑量依賴性方式以51 nM之IC₅₀ 恢復神經元細胞遷移。

圖8展示伴隨例示性預防性給藥方案用ROBO2-Fc 2.2在大鼠被動型海曼腎炎(Passive Heymann Nephritis)模型中進行處理來抑制蛋白尿。自第0天誘導模型之前一天開始，每三天用指定劑量之ROBO2-Fc 2.2或不相關的同型對照單株抗體(對照)皮下處理指定群組中之每一者中的十二隻動物。Y軸作為蛋白質漏泄至尿液中之量度指示尿液白蛋白與肌酐之比率(mg/mg)，其指示足細胞受損。用對抗大鼠腎臟刷狀緣而產生之綿羊抗血清(抗Fx1a，基底膜及足細胞)注射路易斯大鼠(Lewis rat)。大鼠對結合大鼠足細胞之綿羊血清產生免疫反應。當足細胞受損及消失時，蛋白尿增加。藉由重複量測ANOVA統計學分析，與對照抗體治療相比，呈25 mg/kg的最高劑量之ROBO2-Fc 2.2進行的處理最大限度地減少蛋白尿(45%)，伴隨低於0.001之p值。伴隨低於0.001之p值，劑量作用在統計學上亦為顯著的。

圖9展示伴隨例示性治療性給藥方案用ROBO2-Fc 2.2在大鼠被動型海曼腎炎模型中進行處理來抑制蛋白尿。伴隨以下給藥方案每三天用指定劑量之ROBO2-Fc 2.2或不相關的對照單株抗體(對照)皮下處理指定群組中之每一者中的十二隻動物：在第0天投與對照抗體(圓形)且在第0天(正方形)、第6天(三角形)或第9天(倒三角形)投與ROBO2-Fc 2.2 。Y軸作為蛋白質漏泄至尿液中之量度指示尿液白蛋白與肌酐之比率(mg/mg)，其指示足細胞受損。用對抗大鼠腎臟刷狀緣而產生之綿羊抗血清(抗Fx1a，基底膜及足細胞)注射路易斯大鼠。大鼠對結合大鼠足細胞之綿羊血清產生免疫反應。當足細胞受損及消失時，蛋白尿增加。藉由針對各ROBO2-Fc 2.2處理組之重複量測ANOVA統計學分析，與對照抗體治療相比，在第0天、第6天及第9天投與的ROBO2-Fc 2.2處理將蛋白尿減少至類似範圍，最大限度地減少至(40%)，且伴隨低於0.001之p值。

圖10A至圖10B展示用ROBO2-Fc 2.2進行之處理會在被動型海曼腎炎模型中減少對足細胞次結構之損傷。自第0天誘導模型之前一天開始，每三天用呈25 mg/kg的指定劑量之ROBO2-Fc 2.2或不相關的對照單株抗體皮下處理指定群組中之每一者中的十二隻動物以達成100%目標覆蓋率。之後在第16天處死動物，使用穿透式電子顯微鏡對選定之腎臟樣本進行數位成像。在不重複之情況下，以5000×及10,000×放大倍數對200×放大倍數下所見的前三個腎小球之三個毛細血管環進行成像。ImageJ軟體(1.47v版；National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)用於手動追蹤及量測高放大倍數的穿透式電子顯微鏡術影像上的相鄰足突之寬度以及每單位長度之腎小球基底膜(GBM)的狹縫隔膜之密度。經由3個獨立實驗分析樣本。經ROBO2-Fc 2.2處理之動物的足細胞足突明顯短於經對照抗體處理之動物(圖10A)，且經ROBO2-Fc 2.2處理之動物中的狹縫隔膜之密度明顯較高(圖10B；藉由雙尾T測試，p值低於0.01)，表明其消失較少且保護不受腎小球損傷影響。

圖11展示ROBO2-Fc S17T/R73Y以具有2.5 nM之EC₅₀ 的高親和力結合於過度表現於人胎腎(HEK293)細胞上之人類SLIT2-N。將用alexa fluor 647 (AF647)標記之ROBO2-Fc S17T/R73Y的12點、2倍稀釋液系列與表現SLIT2-N之HEK293細胞或對照HEK293細胞一起培育。資料呈現為SLIT2-N HEK293細胞上之ROBO2-Fc S17T/R73Y AF647的幾何平均螢光強度(Geo MFI)減去對照HEK293細胞上之ROBO2-Fc S17T/R73Y AF647的幾何平均螢光強度。

圖12展示如藉由均相時間解析式螢光(HTRF)所評定的ROBO2-Fc S17T/R73Y劑量依賴性抑制結合於細胞表面ROBO2之SLIT2-N。將ROBO2-Fc S17T/R73Y(黑色正方形)或同型對照抗體(黑色圓形)之11點、4倍劑量調定添加至人類SLIT2-N人類ROBO2 HTRF分析。ROBO2-Fc S17T/R73Y為以1.4 nM之IC₅₀ 結合的人類SLIT2-N:人類ROBO2的強效中和劑。

圖13描繪利用ROBO2-Fc S17T/R73Y劑量依賴性抑制經SLIT2-N介導的神經元細胞遷移之抑制。在1 nM SLIT2-N及調定量之ROBO2-Fc S17T/R73Y存在下隔夜培養室下區(SVZ)神經元組織細胞外植體。ROBO2-Fc S17T/R73Y能夠以劑量依賴性方式以11.5 nM之IC₅₀ 恢復神經元細胞遷移。

圖14顯示描繪ROBO2-His構築體之晶體結構的圖式，該構築體由ROBO2前Ig1序列(SRLRQEDFP；SEQ ID NO: 8)、Ig1域、Ig2域及ROBO2 Ig2-Ig3域間連接子(VFER；SEQ ID NO: 12)以及C端處的6x組胺酸標記(His6) (SEQ ID NO: 25)組成。ROBO2-His之晶體結構顯示Asp7、Phe8及Pro9實質上參與對於ROBO2 Ig1域之結構完整性至關重要的相互作用。

圖15顯示描繪ROBO2-His構築體之晶體結構的圖式。ROBO2-His6 (如SEQ ID NO: 25所揭示之「His6」)之晶體結構顯示ROBO2 Ig2-Ig3域間連接子、纈胺酸200-苯丙胺酸201-麩胺酸202-精胺酸203 (SEQ ID NO: 12)會有效地穩定ROBO2之Ig2域的C端區中的摺疊結構。

圖16顯示與SLIT2複合的ROBO2 S17T/R73Y之第一免疫球蛋白樣域(Ig1)的晶體結構。

Claims

一種重組環形交叉受體2 (recombinant Roundabout Receptor 2；ROBO2)蛋白，其包含(i)ROBO2細胞外域之一部分；及(ii)免疫球蛋白域，其中ROBO2細胞外域之該部分基本上由以下組成：ROBO2前免疫球蛋白樣1(Ig1)序列、第一免疫球蛋白樣域(Ig1)、第一與第二免疫球蛋白樣域之間的域間連接子(Ig1-Ig2域間連接子)、第二免疫球蛋白樣域(Ig2)及第二與第三免疫球蛋白樣域之間的域間連接子(Ig2-Ig3域間連接子)。
如請求項1之重組ROBO2，其中ROBO2細胞外域之該部分基本上由根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基1至203組成。
如請求項1或2之重組ROBO2蛋白，其中該免疫球蛋白域為IgA₁ 、IgA₂ 、IgD、IgE、IgM、IgG₁ 、IgG₂ 、IgG₃ 或IgG₄ 之Fc域。
如請求項3之重組ROBO2蛋白，其中該Fc域為人類IgG₁ 之Fc域。
如請求項4之重組ROBO2蛋白，其中該人類IgG₁ Fc域包含L234A、L235A及G237A取代(Eu編號)且不包含K447 (Eu編號)。
如請求項5之重組ROBO2蛋白，其中該Fc域包含根據SEQ ID NO: 1之編號的胺基酸殘基210至440。
如請求項2或當依附於請求項2時，請求項3至6中任一項之重組ROBO2蛋白，其中根據SEQ ID NO: 1之編號的該等胺基酸殘基1至203與該免疫球蛋白域鄰接。
如請求項2或當依附於請求項2時，請求項3至6中任一項之重組ROBO2蛋白，其中根據SEQ ID NO: 1之編號的該等胺基酸殘基1至203經由連接子連接至該免疫球蛋白域。
如請求項8之重組ROBO2蛋白，其中該連接子為包含約1至30個胺基酸殘基之肽基連接子。
如請求項9之重組ROBO2蛋白，其中該肽基連接子係選自由以下組成之群： a)富甘胺酸肽； b)包含甘胺酸及絲胺酸之肽； c)具有序列[Gly-Gly-Ser]_n 之肽，其中n為1、2、3、4、5或6 (SEQ ID NO: 22)；及具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_n 之肽，其中n為1、2、3、4、5或6 (SEQ ID NO: 23)。
如請求項10之重組ROBO2蛋白，其中該肽基連接子為[Gly-Gly-Ser]₂ (SEQ ID NO: 15)。
一種重組環形交叉受體2 (ROBO2)-Fc蛋白，其包含該胺基酸序列SEQ ID NO: 1。
一種重組環形交叉受體2 (ROBO2)-Fc蛋白，其包含與該胺基酸序列SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性之胺基酸序列。
如請求項12之重組ROBO2-Fc蛋白，其包含由寄存在ATCC且ATCC寄存編號為PTA-124008的質體之插入物編碼的胺基酸序列。
如前述請求項中任一項之重組ROBO2蛋白，其中該蛋白以以下或小於以下之K_D 結合SLIT2：約10 nM、約5 nM、約2 nM、約1 nM、約900 pM、約800 pM、約700 pM、約600 pM、約500 pM、約400 pM、約300 pM、約250 pM、約200 pM、約150 pM、約100 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約25 pM、約20 pM、約15 pM、約10 pM、約5 pM或約1 pM。
如前述請求項中任一項之重組ROBO2蛋白，其中該蛋白以比ROBO1結合於SLIT2之K_D 值小至少約2倍、約4倍、約6倍、約8倍、約10倍、約20倍、約40倍、約60倍、約80倍、約100倍、約120倍、約140倍、約160倍之K_D 結合SLIT2。
如前述請求項中任一項之重組ROBO2蛋白，其中該蛋白以比ROBO1-Fc蛋白結合於SLIT2之K_D 值小至少約2倍、約4倍、約6倍、約8倍、約10倍、約20倍、約40倍、約60倍、約80倍、約100倍、約120倍、約140倍、約160倍之K_D 結合SLIT2。
如請求項15至17中任一項之重組ROBO2蛋白，其中該K_D 係藉由表面電漿子共振(SPR)，任選地使用Biacore T200儀器量測。
如請求項15至17中任一項之重組ROBO2蛋白，其中該K_D 係藉由生物層干涉術(BLI)，任選地使用ForteBio Octet儀器量測。
如前述請求項中任一項之重組ROBO2蛋白，其中該蛋白抑制SLIT與ROBO2結合及/或抑制ROBO2依賴性SLIT-N活性。
如前述請求項中任一項之重組ROBO2蛋白，其中如藉由均相時間解析式螢光(HTRF)分析所量測，該蛋白之半數最大抑制濃度(IC₅₀ )不超過約15 nM、約13 nM、約11 nM、約9 nM、約7 nM、約6 nM、約5 nM、約4 nM、約3 nM、約2 nM、約1 nM以抑制ROBO2與SLIT2結合。
如請求項1至20中任一項之重組ROBO2蛋白，其中如藉由量測經SLIT2-N介導的神經元細胞遷移之抑制所評定，該蛋白之半數最大抑制濃度(IC₅₀ )不超過約75 nM、約65 nM、約55 nM、約45 nM、約35 nM、約25 nM、約15 nM、約5 nM。
一種經分離之核酸分子，其包含編碼如請求項1至22中任一項之重組ROBO2蛋白的核苷酸序列。
如請求項23之經分離之核酸分子，其中該分子包含SEQ ID NO: 21之核酸序列。
一種載體，其包含如請求項23或24之核酸分子。
一種宿主細胞，其包含如請求項23之核酸分子。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至22中任一項之重組ROBO2蛋白及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
一種治療腎病之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之如請求項1至22中任一項之重組ROBO2蛋白。
如請求項28之方法，其中該腎病為腎小球疾病、局部區段性腎小球硬化(FSGS)或腎病變。
如請求項1至22中任一項之重組ROBO2蛋白，其供用於治療腎病之方法中。
如請求項30之重組ROBO2蛋白，其中該腎病為腎小球疾病、局部區段性腎小球硬化(FSGS)或腎病變。
一種如請求項1至22中任一項之重組ROBO2蛋白之用途，其用於製造用於治療腎病之藥劑。
如請求項32之用途，其中該腎病為腎小球疾病、局部區段性腎小球硬化(FSGS)或腎病變。