JP2022033727A - 組換えrobo2タンパク質、組成物、方法およびそれらの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、2017年6月2日出願の米国仮出願第62/514,242号;および2018年4月26日出願の同第62/663,082号の利益を主張する。
ここで特許請求される発明は、以下に記載されている共同研究契約の当事者によって、または当事者に代わってなされた。共同研究契約は、特許請求された発明がなされた日以前に有効であり、特許請求された発明は、共同研究契約の範囲内で行われた活動の結果としてなされた。共同研究契約の当事者は、BOSTON MEDICAL CENTER CORP.およびPFIZER INC.である。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2018年5月3日に作成された前記ASCIIコピーはPCFC-0043-WO1_SL.txtという名称であり、サイズは54,754バイトである。
Roundabout受容体2(ROBO2、Roundaboutガイダンス受容体2またはRoundaboutホモログ2とも称される)は、スリットガイダンスリガンド(Slit Guidance Ligand)(SLIT)タンパク質リガンドの受容体である。ROBO2は、腎臓内の腎糸球体足細胞の基底面において発現され、スリットガイダンスリガンド2(SLIT2)は、腎糸球体内に存在する。SLIT2結合時、ROBO2は、腎糸球体の濾過障壁内でネフリンと複合体を形成し、負の制御因子として作用してネフリン誘導性アクチン重合を阻害する。ROBO2の減少は、足細胞におけるアクチン重合を増加させ、ネフリン欠損マウスにおいて認められる異常な足細胞の構造的な表現型を軽減する。ROBO2の減少はまた、マウスにおける足細胞の糸球体基底膜への接着を増加させる。これらのデータは、ROBO2染色体転座を有する患者ではタンパク尿が認められないという観察結果とともに、SLIT2-ROBO2シグナル伝達経路を遮断することにより、ネフリン誘導性アクチン重合が増加してタンパク尿が減少することを示唆する。ROBO2シグナル伝達を遮断することにより、ネフリン誘導性アクチン重合の上方制御によって、タンパク尿疾患における腎糸球体の濾過障壁もまた回復し得る。
a)グリシンリッチペプチド;
b)グリシンおよびセリンを含むペプチド;
c)配列(Gly-Gly-Ser)n(式中、nは1、2、3、4、5、または6である)(配列番号22)を有するペプチド;および
d)配列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(式中、nは1、2、3、4、5、または6である)(配列番号23)を有するペプチド
からなる群から選択される、E17に記載の組換えROBO2タンパク質。
本発明は、SLITリガンド(例えば、SLIT2リガンド)に結合し、それによりSLITのROBO2との相互作用を阻害し、その結果としてSLIT2-ROBO2シグナル伝達経路を阻害することができる、新規な組換えROBO2タンパク質を包含する。以前の研究により、ROBO2の免疫グロブリン様(Ig様)ドメイン1および2(Ig1およびIg2)の両方がSLITリガンドと相互作用し、一方、第1のIg様ドメイン(Ig1)がSLITに対する主要結合部位であることが示されている。加えて、以前の研究では、3つのフィブロネクチンIII型(FNIII)リピートの除去は、第3および第4の免疫グロブリン様ドメイン(Ig3およびIg4)の除去よりも、SLITリガンドへのROBO結合に対してより不利な影響を有することが示されている。すなわち、FNIIIの欠失は、Ig3およびIg4の欠失よりも、SLITリガンドへのROBO結合を大きく減少させる。
(i)ROBO2のIg1ドメイン(ROBO2-Fc1.1;配列番号4;図1B)、
(ii)ROBO2のIg1およびIg2ドメイン(ROBO2-Fc2.0;配列番号3;図1B)、または
(iii)ROBO2のIg1、Ig2およびIg3ドメイン(ROBO2-Fc3.0;配列番号6;図1B)
からなる組換えROBO2タンパク質は、SLIT2に結合しなかった(図3)。
いくつかの態様では、SLITに結合することができ、免疫グロブリンドメインを含む組換えROBO2タンパク質が本発明において提供される。
「結合親和性」は一般に、1つの結合パートナー(例えば、本明細書で開示されている組換えROBO2タンパク質)の接触残基と、その結合パートナー(例えば、SLITリガンド)の接触残基との間の非共有結合性相互作用の全体の強度を指す。別途示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対または結合パートナーのメンバー(例えば、組換えROBO2タンパク質およびSLIT2リガンド)間の1:1の相互作用を反映する結合親和性を指す。
いくつかの態様では、本開示は組換えROBO2タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている組換えROBO2タンパク質はSLITリガンド(特に、SLIT2リガンド)に結合し、それによりSLITが細胞のROBO2受容体に結合するのを阻止し、したがって、SLIT中和リガンドトラップと称される。驚くべきことに、実施例において示されているように、Ig2-3ドメイン間リンカー、VFER(配列番号12)とともに、初めの2つの免疫グロブリン様ドメイン(Ig1およびIg2)、Ig1-Ig2ドメイン間リンカーを含み、3つのフィブロネクチンIII型(FNIII)リピートは含まない構築物であるROBO2-Fc2.1(配列番号2;図1B)は、SLIT2に結合した(図3)。結晶構造研究によれば、ROBO2 Ig2-Ig3ドメイン間リンカー、VFER(V200-F201-E202-R203;配列番号12)を含めることにより、ROBO2の第2のIgドメインのC末端領域においてフォールディング構造が効果的に安定化し(図15)、組換えROBO2タンパク質の発現レベルが著しく増加することもまた示される。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されている組換えROBO2-Fcタンパク質は、ROBO2-SLITシグナル伝達の少なくとも1つの生物学的活性を低下させる。そのような活性は、当技術分野において公知の他のROBO2-SLIT活性のなかでも、ROBO2とSLITリガンドとの間の結合、ROBO2の細胞内ドメインに対する細胞内シグナル伝達分子(例えば、srGAP1またはNckなど)の結合、ならびに/またはROBO2-SLITシグナル伝達の下流の活性、例えば、アクチン重合、足細胞接着、および/もしくは神経細胞遊走のSLIT2-N媒介性阻害などを含むがこれらに限定されない。組換えROBO2-Fcタンパク質がROBO2の活性を低下させるかどうかは、当技術分野において周知のいくつかのアッセイによってアセスメントすることができる。例えば、当技術分野において公知のアッセイを使用して、組換えROBO2-Fcタンパク質が、(a)SLITのROBO2への結合を阻害する;(b)srGAP1とROBO2との結合を減少させる;(c)NckとROBO2との結合を減少させる;(d)ROBO2依存的SLIT2-N活性を阻害する;(e)アクチン重合を阻害する;(f)足細胞接着を阻害する;および/または(g)神経細胞遊走のSLIT2-N媒介性阻害を阻害するかどうかを判定することができる。
本発明はまた、本発明の組換えROBO2タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明はまた、本明細書において記載されているポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法も提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の手順によって作製するおよび発現させることができる。
本発明の組換えROBO2タンパク質は、医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で、薬学的に許容できる担体、賦形剤、および/または安定剤(Remington:The Science And Practice of Pharmacy 第20版、2000、Lippincott WilliamsおよびWilkins編 K.E.Hoover)をさらに含んでもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」は、活性成分と組み合わせた場合、その成分が生物学的活性を保持することができ、かつ対象の免疫系と反応しない、任意の材料を含む。例として、標準的な医薬担体、例えば、リン酸緩衝塩類溶液、水、油/水型エマルジョン剤などのエマルジョン剤、および様々なタイプの湿潤剤などのいずれかが挙げられるがこれらに限定的されない。エアロゾルまたは非経口投与用に好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液(PBS)または生理(0.9%)食塩水である。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化される(例えば、Remington‘s Pharmaceutical Sciences、第18版、A.Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、PA、1990;およびRemington、The Science and Practice of Pharmacy、第20版、Mack Publishing、2000を参照されたい)。
本発明の組換えROBO2タンパク質は、様々な治療上または診断上の目的のために使用することができる。例えば、本発明の組換えROBO2タンパク質は、親和性精製剤(例えば、SLIT2などのSLITリガンドのインビトロ精製のために)として、診断薬(例えば、SLITリガンドの発現を検出するため(例えば、特定の細胞、組織、または血清中のSLIT2)として使用されてもよい。SLIT2などのSLITリガンドのための例示的な診断アッセイは、例えば、患者から得られたサンプルを、組換えROBO2タンパク質が検出可能な標識またはレポーター分子で標識されている、本発明の組換えROBO2タンパク質と接触させることを含み得る。
本発明の組換えROBO2タンパク質の例示的な治療的使用は、糸球体疾患、巣状分節性糸球体疾患(FSGS)などの腎疾患を処置することを含む。本発明の組換えROBO2タンパク質はまた、予防的処置(例えば、疾患症状を示していないが糸球体疾患、FSGSなどの腎疾患に罹患しやすい対象に投与すること)において使用されてもよい。
ある特定の実施形態では、本発明の組換えROBO2タンパク質は、皮下投与される。ある特定の実施形態では、本発明の組換えROBO2タンパク質は、静脈内投与される。
本発明はまた、本発明の組換えROBO2タンパク質、および使用説明書を含む、キットまたは製造物品を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、容器、組換えROBO2タンパク質を含む容器内の組成物、およびそれを必要とする患者を処置するために治療有効量の組換えROBO2タンパク質を投与するという指示を含有する添付文書を含む、キットまたは製造物品を提供する。
本発明の代表的な材料は、米国微生物系統保存機関(American Type Culture Collection)(10801 University Boulevard、Manassas、Va.20110-2209、米国)において、2017年2月23日に寄託された。ATCC受託番号PTA-124008を有するベクターROBO2-Fc2.2は、配列番号1をコードするDNAインサートを含む。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびそれに付属する規則(ブダペスト条約)の規定のもとで行われた。これは、寄託物の製造可能な培養物の維持を、寄託日から30年間保証する。寄託物は、ブダペスト条約の条項のもとで、かつ、関連する米国特許が発行されるときまたは任意の米国もしくは外国特許出願が一般公開されるときのいずれか先に来る時点で、寄託物の培養物の後代が、永続的かつ制限なく一般に利用可能となることを保証する、Pfizer Inc.とATCCとの間の合意を条件として、ATCCが利用可能となり、米国特許法第122条およびそれに従う施行規則(886 OG 638を特に参照して米国特許規則第1.14条を含む)により、米国特許商標庁長官からその権利を有すると決定された者が、後代を使用できることを保証する。
ROBO2-Fc2.2の作製
複数のROBO2-Fc融合タンパク質のデザインを通じたROBO2-Fc2.2の選択
最適なROBO2-Fcリガンドトラップを選択するために、様々な長さの、グリシン-セリン(GS)リンカーによってIgG1 Fcドメインに融合されているROBO2細胞外ドメインからなる複数のタンパク質を作製した。研究により、ROBO1およびROBO2受容体では、それらのIg1ドメインは、SLITリガンドのD2ロイシンリッチリピート(LRR)ドメインに結合するのに十分であることが示された。ROBO2は、5つのIgドメイン(Ig1~5)を含有する。選択基準としてまず、SLIT2に結合可能な最小のROBO2配列を有するROBO2-Fc融合タンパク質を作製することに注目し、次いで、その分子をHEK293細胞における組換えタンパク質発現用に最適化することに注目した。最初に、GSリンカーを介してヒトIgG1のFc部分に融合されている、Ig1ドメイン(ROBO2-Fc1.0;配列番号5)、Ig1およびIg2ドメイン(ROBO2-Fc2.0;配列番号3)、Ig1、Ig2、およびIg3ドメイン(ROBO2-Fc3.0;配列番号6)、ならびにIg1、Ig2、Ig3、およびIg4ドメイン(ROBO2-Fc4.0;配列番号7)からなるポリペプチド配列の発現のために、4つのDNA構築物を作製した(表23)。構築物の発現は、Igリーダー(配列番号18)によって駆動される。ROBO2-Fc1.0、2.0および3.0タンパク質はSLIT2に結合しなかった。ROBO2-Fc4.0は結合した。Fc融合体のROBO2部分を最小化するために、Ig1ドメインがC末端にIg1-Ig2ドメイン間リンカー(配列番号10)を含むバージョン(ROBO2-Fc1.1;配列番号4)を含めて、さらにタンパク質を作製した。別の構築物は、Ig1およびIg2ドメインならびにIg2-Ig3ドメイン間リンカー(VFER(配列番号12))(ROBO2-Fc2.1;配列番号2)を含んで関与した。Ig1-Ig2ドメインのC末端にVFER(配列番号12)を付加してROBO2-Fc2.1タンパク質を作出することにより、SLIT2に対する強固な結合が可能となった(図3)。ROBO2-Fc1.1はSLIT2に結合しなかった。Octet Redを利用して、ROBO2-Fcタンパク質を、抗ヒト-Fc(AHC)センサー上に10μg/mlでロードし、100nMのSLIT2とともに7分間インキュベートし、次いで、センサーをバッファー単独に640秒間移した。ROBO2-Fc4.0を、結合に関する陽性対照として含めた。
ROBO2-Fc2.2結合および中和活性の特徴付け
SLIT2-N結合、SLIT2-N結合の中和、およびSLITx-N機能的活性の阻害に関して、ROBO2-Fc2.2を多くのアッセイにおいてスクリーニングした。SLIT2に対するROBO2-Fc2.2の結合を、2つの方式で、第1に、表面プラズモン共鳴(SPR)によって、第2に、細胞ベースのフローサイトメトリーアッセイを使用して、アセスメントして、細胞で発現されるヒトSLIT2-Nに対するROBO2-Fc2.2の結合を検出した。
ヒトSLIT2は、カニクイザルSLIT2と高レベルの相同性を共有しており、全体の相同性は99%であり、ROBO2結合部位を含有するSLIT2のロイシンリッチリピートドメイン2(D2)内の相同性は、100%である。カニクイザルと同様に、ヒトおよびラットSLIT2も高度の相同性を共有しており、全体のおよびD2結合ドメイン内の配列同一性は97%である。D2領域を含有するヒトおよびラットSLIT2のN末端断片(SLIT2-N)、ならびにヒトおよびカニクイザルの特定のSLIT2 D2ドメイン(100%同一)に対するROBO2-Fc2.2の結合をSPRによってアセスメントした。速度論的漸増実験(図4A~4C)の各サイクルに関して、ROBO2-Fc2.2分子は、ROBO2-Fc2.2のヒトIgG1 Fc領域に結合する、C1チップに付着している抗ヒトFc(AHFc)によって、非共有結合的に捕捉された。次いで、捕捉されたROBO2-Fc2.2を、様々な濃度のSLIT2リガンドに曝露させて、会合および解離動態をモニタリングした。ROBO2-Fc2.2は、2nMに希釈した。HBS-EPを希釈剤として使用した。ヒト/カニクイザルSLIT2-D2、ヒトSLIT2-NおよびラットSLIT2-Nを、それらの原液濃度からHBS-EPB中で2nMに希釈した。SLIT2リガンドに対して、希釈液としてHBS-EPBを使用して、2nMから15.6pMの範囲で8段階の2倍希釈系列を実施した。ROBO2-Fc2.2を、10~15RU同等物の読取り値まで捕捉し、次いで、漸増する量の特定のSLIT2分析物(すなわちヒト/カニクイザルSLIT2-D2、ヒトSLIT2-N、またはラットSLIT2-N)に曝露させた。意図されるSLIT2リガンドの会合を120秒間追跡し、解離を180秒間モニタリングした。速度論的速度定数の単純な1:1相互作用モデルを使用して、見かけの結合親和性を決定した。ヒト/カニクイザルSLIT2-D2(ROBO2結合ドメイン、100%同一)に対するROBO2-Fc2.2結合のKDは、0.293nMであると決定された(図4A)。ヒトSLIT2-N(N末端断片)に対するROBO2-Fc2.2結合のKDは0.279nMであると決定され(図4B)、最後に、ラットSLIT2-Nに対するROBO2-Fc2.2結合のKDは0.543nMであると決定された(図4C)。
ROBO2-Fc2.2を、製造業者の使用説明書に従って、Alexa Fluor(AF)647にコンジュゲートした。染色のための調製において、ヒトSLIT2-Nを過剰発現するヒト胚性腎(HEK293)を、5%ウシ胎児血清を含有するバッファー中に再懸濁させた。ROBO2-Fc2.2-AF647で細胞を染色するために、2×ストックを調製し、蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファー中で11~12段階の2倍希釈系列を作製した。細胞およびROBO2-Fc2.2-AF647の相当する希釈物を96ウェルU底プレート中で合わせ、4℃で45分間インキュベートした。インキュベーション後、1ウェル当たり150mLのFACSバッファーを添加して細胞を洗浄した。洗浄後、Fortessa Flow Cytometerにおいてデータを取得するために、細胞をバッファー中に再懸濁した。FlowJoソフトウェアを使用してデータを分析し、SLIT2-Nを発現しているHEK293細胞の幾何平均蛍光強度(Geo MFI)から対照HEK293細胞のGeo MFIを引いたものとして表した。ROBO2-Fc2.2は、9nMのEC50を有する高い親和性で、HEK293細胞において過剰発現されるヒトSLIT2-Nに用量依存的に結合する(図5)。
ROBO2-Fcは、おそらくリガンドトラップとして作用することによって、細胞のROBO2受容体に対するSLIT2などのSLITリガンドの結合を阻害する。ROBO2-SLITx-N HTRF色素標識アッセイを使用して、ROBO2-Fc2.2がヒトROBO2へのSLITリガンドの結合を中和する能力をアセスメントした。このアッセイでは、テルビウム(Tb)標識された(ドナー)、SNAPタグ付き(SNAPタグ(登録商標)New England Biolabs;Kepplerら、2003、Nat.Biotechnol.21:86もまた参照されたい)ヒトROBO2発現HEK293細胞を、5nMのd2標識(アクセプター)した様々な種由来のSLITx-N(Cisbio d2色素標識キットを使用して製造業者の使用説明書に従って調製した)とともに、漸増する量のROBO2-Fc2.2の存在下で1時間インキュベートした。インキュベーション後、665nmおよび620nmでの蛍光を、Envisionマルチラベルプレートリーダーにおいて測定した。HTRF比は以下の通り算出した:665nmでの蛍光/620nmでの蛍光×10,000。最大シグナルは、ROBO2-Fc2.2の非存在下でのd2標識されたSLIT2-Nを有するTb標識されたROBO2細胞のHTRF比と定義し、最小シグナルは、Tb標識されたROBO2発現HEK293細胞だけのHTRF比と定義した。ヒト、カニクイザル、ウサギ、ラットおよびマウスを含むいくつかの種由来の3つの異なるSLITリガンド(SLIT1-N、SLIT2-NおよびSLIT3-N)の中和を、アッセイにおいて使用した。最高濃度が4000nMの、11段階の4倍希釈系列を使用して、各SLITx-NのIC50を決定した。3つの独立した実験間でのIC50の幾何平均を算出し、評価したすべてのリガンドについてまとめた(表2)。
最終選択スクリーニングは、ROBO2依存的SLIT2-N活性の機能中和であった。SLIT2-ROBO2相互作用は、発生の間の軸索の移動の重要な制御因子である。SLIT2は、脳室下帯ニューロンに対して化学反発性であること、およびこの活性はROBO2依存的であることが知られている。ラットの脳室下帯(SVZ)からの神経組織外植片を単離し、コラーゲンマトリックス中に包埋した。SLIT2-Nの存在下で、神経細胞遊走は阻害される(SVZアッセイ)ので、組織外植片を、漸増する量のROBO2-Fc2.2あり、またはなしで、1nMのSLIT2-Nの存在下でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、Hoechst33342で染色した。10×高NA対物を用いたOperetta High Content Imager(Perkin Elmer)で、広視野の蛍光画像を取得した。5%オーバーラップで1ウェル当たり9つの視野を取得してウェルの中心エリア全体を捕捉した。各面間の距離が1μmの6面からなるZスタックを各視野について取得して、組織外植片の厚さ全体を捕捉した。Volocityソフトウェア(Perkin Elmer)において解析を行った。各ウェルにおけるすべての視野を継ぎ合わせた。中心にある組織外植片のエリアおよび組織外植片の外側のそれぞれの核を、Hoechst33342染色によって検出した。個々の核を計数し、それぞれの核の中心から組織外植片の最も近い縁部までの距離をμm単位で測定した。各ウェルに関して、ウェル中での核の平均移動距離に核数を掛けて総移動距離を得た。ROBO2-Fc2.2は、51nMのIC50で神経細胞遊走を用量依存的に回復させることができた(図7)。これらの結果により、SVZニューロンに関して、ROBO2-Fc2.2は、ROBO2に対するSLIT2の結合を阻害することができるだけでなく、ROBO2依存性SLIT2化学反発活性に対して強力な用量依存的な中和作用も有することが実証される。
新規なROBO2タンパク質のインビボでの作用
受身ヘイマン腎炎は、糸球体足細胞に影響を及ぼし、タンパク尿の増加をもたらす腎毒性損傷のラットモデルである。このモデルを使用して、ROBO2-Fc2.2がタンパク尿を減少させる有効性をアセスメントした。ROBO2-Fc2.2によるラットの処置はタンパク尿を減少させただけでなく、足細胞足突起構造も保護した。図8および図9で示されているように、ROBO2-Fc2.2の予防的または治療的投与レジメンのいずれかを用いたラットの処置は、タンパク尿の量を減少させた。Lewisラットに、ラット腎刷子縁に対して作製されたヒツジ抗血清(抗Fx1a(Probetex Inc)、基底膜および足細胞)を注射した。ラットは、ヒツジ血清に応答して免疫反応を起こした。補体活性化により、足細胞は足突起消失し、タンパク尿は3日目から12日目の間に増加しその後プラトーに達した。この機序は、足細胞タンパク質PLA2Rに対する自己抗体(症例の70%において)が足細胞消失およびネフローゼ域のタンパク尿を引き起こしその後補体が関与する膜性腎症において見られるものとよく似ている。ラットを、ヒツジ抗血清投与の24時間前に、およそ50、90および99%(1、5、および25mg/kg)の糸球体ROBO2をカバーする用量範囲で、およびその後は72時間ごとに前処理した(予防的用量レジメン)。治療的投与レジメンでは、ROBO2-Fc2.2を6日目または9日目(ヒツジ抗血清投与の5日後または8日後)に投与した、ヒツジ抗血清投与の24時間前に投与される用量もまたこの試験に含めた。タンパク尿の最大減少は処置を予防的に開始した場合に45%(図8)であり、反復測定分散分析統計分析は、0.001未満のp値で用量応答を裏付けた。0、6および9日目に投与されたROBO2-Fc2.2による処置は、各ROBO2-Fc2.2処置群に関して、対照抗体処置と比較して、タンパク尿を同程度(図9)まで、最大で40%および反復測定分散分析統計学的解析による0.001未満のp値で減少させた。補体IHCスコアリングによって決定した腎臓中の免疫複合体沈着は減少せず、この応答は足細胞保護的作用によるものであることを示した。
浸漬(4%ホルムアルデヒド/1%グルタルアルデヒド)により固定化した正面向きのサンプル腎臓(1動物当たり1個の腎臓)を受け取り、ちょうど皮質を含むように切り取り、各腎臓の5つのサンプルをエポキシ樹脂中に包埋した。各腎臓の最初に包埋されたサンプルを切片化した。このサンプルが3つの糸球体を含有した場合は、サンプルを薄切片化し、画像化した。この第1のサンプルが糸球体を含有しなかった場合は、その腎臓由来の他の包埋サンプルを順次切片化し、同様に評価して3つの糸球体を含むサンプルを見出した。
選択された腎臓サンプルを、透過型電子顕微鏡(Hitachi H-7100)およびデジタルCCDカメラシステム(Advanced Microscopy Techniques、Danvers、MA)を使用してデジタル画像化した。反復は行わずに、200×の倍率で見出された最初の3つの糸球体の3つの毛細管ループを、5,000×および10,000×倍率で画像化した。これにより1個の腎臓につき18のデジタル画像を得た(すなわち、1つの腎臓サンプルにつき3つの糸球体×1つの糸球体につき3領域×2つの倍率)。盲検法での評価を可能にするために、各画像は試験番号、動物番号、サンプル番号、および倍率だけで特定した。
ImageJソフトウェア(version 1.47v;National Institutes of Health、Bethesda、MD、米国)を使用して、高倍率の透過型電子顕微鏡画像における糸球体基底膜(GBM)の単位長さ当たりの、隣接する足突起の幅を手作業でトレースおよび測定した。手短に述べると、1群当たり6匹のラットにおいて、各ラットから9枚の5000×TEM画像で、測定を行った。GBMに平行な線を引くことによって、スリット膜の一端から他端まで足細胞足突起幅を測定した。画像の足突起すべてに関してこれを反復した。次いでこれらの結果をスケールバーに関して調整し、各画像に関して調和平均を算出した。
ROBO2-Fc S17T/R73Y結合および中和活性の特徴付け
フローサイトメトリーアッセイ
ROBO2-Fc S17T/R73Yを、製造業者の使用説明書に従って、Alexa Fluor(AF)647にコンジュゲートした。染色のための調製において、5%ウシ胎児血清を含有するバッファー中にヒトSLIT2-N過剰発現細胞を再懸濁した。細胞をROBO2-Fc S17T/R73Y-AF647で染色するために、2×ストックを調製し、11~12段階の2倍希釈系列をFACSバッファー中で作製した。細胞およびROBO2-Fc S17T/R73Y-AF647の相当する希釈物を96ウェルU底プレート中で合わせ、4℃で45分間置いた。インキュベーション後、1ウェル当たり150mLのFACSバッファーを添加して細胞を洗浄した。洗浄後、Fortessa Flow Cytometerにおいてデータを取得するために、細胞をバッファー中に再懸濁した。FlowJoソフトウェアを使用してデータを分析し、SLIT2-Nを発現しているHEK293細胞の幾何平均蛍光強度(Geo MFI)-対照HEK293細胞のGeo MFIとして表した。ROBO2-Fc S17T/R73Yは、ヒト胚性腎(HEK293)細胞において過剰発現されるヒトSLIT2-Nと、2.5nMのEC50を有する高い親和性で結合した(図11)。
ROBO2-SLIT2-N均一時間分解蛍光(HTRF)アッセイを使用して、ROBO2-Fc S17T/R73YがSLIT2-Nと細胞に発現されるROBO2との相互作用を遮断する能力をアセスメントした。このアッセイでは、テルビウム(Tb)標識された(供与体)、SNAPタグ付きROBO2発現HEK293細胞を、5nMのd2標識(アクセプター)ヒトSLIT2-Nとともに、漸増する量のROBO2-Fc S17T/R73Yの存在下で1時間、製造業者の使用説明書に従ってインキュベートした(Cisbio HTRF d2 Labelingキット62D2DPEAおよびTerbium Cryptate Labelingキット62TBSPEA)。インキュベーション後、665nmおよび620nmでの蛍光を、Envisionマルチラベルプレートリーダーにおいて測定した。HTRF比は以下の通り算出した:665nmでの蛍光/620nmでの蛍光×10,000。最大シグナルは、ROBO2-Fc S17T R73Yの非存在下でのd2標識されたSLIT2-Nを有するTb標識されたROBO2細胞のHTRF比と定義し、最小シグナルは、Tb標識されたROBO2発現HEK293細胞だけのHTRF比と定義した。ROBO2-Fc S17T R73Yは、1.4nMのIC50を有する、ヒトSLIT2-N:ヒトROBO2結合の強力な中和剤であった(図12)。
ROBO2-Fc2.2で行ったように、ROBO2-Fc S17T/R73Yを、神経細胞遊走のSLIT2-N媒介性阻害を用量依存的に回復させる能力に関して評価した。ラットの脳室下帯(SVZ)からの神経組織外植片を単離し、コラーゲンマトリックス中に包埋した。SLIT2-Nの存在下で神経細胞遊走は阻害される(SVZアッセイ)ので、組織外植片を、1nMのSLIT2-Nの存在下で、漸増する量のROBO2-Fc S17T R73Yあり、またはなしでインキュベートした。インキュベーション後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、Hoechst33342で染色した。10×高NA対物を用いたOperetta High Content Imager(Perkin Elmer)で、広視野の蛍光画像を取得した。5%オーバーラップで1ウェル当たり9つの視野を取得してウェルの中心エリア全体を捕捉した。各面間の距離が1μmの6面からなるZスタックを各視野について取得して、組織外植片の厚さ全体を捕捉した。Volocityソフトウェア(Perkin Elmer)を使用して解析を行った。各ウェルにおけるすべての視野を継ぎ合わせた。中心にある組織外植片の領域および組織外植片の外側のそれぞれの核を、Hoechst33342染色によって検出した。個々の核を計数し、それぞれの核の中心から組織外植片の最も近い縁部までの距離をμm単位で測定した。各ウェルに関して、ウェル中での核の平均移動距離に核数を掛けて総移動距離を得た。ROBO2-Fc S17T/R73Yは、11.5nMのIC50で、神経細胞遊走を用量依存的に回復させることができた(図13)。
ROBO2-Fc2.2の構造解析
材料調製、結晶化、データ収集、および構造決定:
ROBO2-His構築物の発現および精製
C末端に6×ヒスチジンタグ(配列番号25)を有する、ROBO2プレIg1配列(配列番号8)、Ig1ドメイン、Ig2ドメインおよびROBO2Ig2-3ドメイン間リンカー(配列番号12)からなるROBO2構築物(ROBO2-His6(「His6」は配列番号25として開示されている))を、HEK293細胞において発現させた。イミダゾール勾配溶出を用いるNi Excelカラムによって、構築物を精製した。構築物は、HiLoad 26/200 Superdex 200(GE Healthcare)を使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって、均一になるまでさらに精製した。
ROBO2-Hisの結晶を以下の条件下:100mMのクエン酸ナトリウムpH4.5、12%PEG8000で得、これにより2.19Åまで回折する結晶を得た。
結晶は一過性に低温保護し(cryo-protected)、シンクロトロンデータ収集は、高度光子源(Advanced Photon Source)(APS)において遠隔で実施した。画像フレームは、ソフトウェアAutoPROC(Global Phasing Ltd)を使用して処理した。データは空間群P21に属し、単位格子は以下の通りである:a=79.307Å、b=50.887Å、c=93.854Å、α=γ=90°、β=114.92、非対称単位当たり2コピーのヒトROBO2(Ig1+Ig2)である。
ROBO1(Ig1+Ig2、PDBコード:2V9Q)の相同性モデルを使用したMolecular Replacement検索により、各構成成分の確かな解答が得られた。精密化は、ソフトウェアautoBUSTER(Global Phasing Ltd)を使用して実施し、2.19Åでの最終的なR/Rfree因子は、それぞれ0.2119および0.2425であり、結合のRMSDは0.010Å、角度のRMSDは1.19°である。
ROBO2プレIg1配列による発現の増強
実施例1において、野生型ROBO2プレIg1配列SRLRQEDFP(配列番号8)を含めることによりROBO2-Fc2.2の発現レベルが大きく増大することが実証された。ROBO2-His6の結晶構造(「His6」は配列番号25として開示されている)から、Asp7(D7)、Phe8(F8)、およびPro9(P9)が、ROBO2の第1のIgドメインの構造完全性に不可欠な相互作用に実質的に関与していることが明らかである(図14)。Asp7はTyr94と水素結合を形成し、一方、Phe8はArg36およびAsn93と二重結合を形成する(表4~5;隣接残基間の距離は、3.8Å以下の距離の範囲内である)。加えて、Asp7(D7)、Phe8(F8)、およびPro9(P9)はまた、隣接残基との広範なファンデルワールス接触も伴い、それらの表面積の50%超を埋没させている(表6~9)。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、これらのデータは、ROBO2プレIg1配列がROBO2の第1のIgドメインの2つのβ-シートを互いに橋架けし、それによりN末端領域のフォールディング構造を顕著に安定化させることを実証する。驚くべきことに、これらのデータは、フォールディング構造の安定化が、プレIg1配列を欠くROBO2-Fc構築物の発現と比較した、適切にフォールディングされたROBO2-Fc2.2の発現の増加を媒介することを示唆する。
ROBO2 Ig2-3ドメイン間リンカーV200-F201-E202-R203(VFER;配列番号12)を含めることにより、ROBO2-Fc2.2の発現レベルは著しく増加した。Val200は、ROBO2のIg2ドメイン中の最後のβ-鎖の一部である。V200は、広範なファンデルワールス接触によって隣接残基ですっかり取り囲まれており(表10~11)、その結果、その表面積の85%が埋没している(表12~13)。Val200に加えて、Phe201-Glu202-Arg203もまた、その領域内の水素結合およびファンデルワールス相互作用に実質的に関与している(表10~11、14~15)。まとめると、これらのデータは、これらの4つのアミノ酸残基が、ROBO2のIg2ドメインのC末端領域におけるフォールディング構造を効果的に安定化させることを示唆する(図15)。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、これらのデータは、フォールディング構造の安定化が、Ig2-3ドメイン間リンカーを欠くROBO2-Fc構築物の減少した発現と比較して、適切にフォールディングされたROBO2-Fc2.2の発現を増加させることを示唆する。
ROBO2-Fc S17T/R73Yの構造解析
材料調製、結晶化、データ収集、および構造決定:
発現
ヒトROBO2 S17T/R73Y-His6構築物(「His6」は配列番号25として開示されている)は、2つの点変異(S17TおよびR73Y)を有するヒトROBO2 Ig1ドメイン、その後に続くC末端His×6タグ(配列番号25)からなる。ヒトSLIT2構築物は、SLIT2のD2ドメイン(271~479)、その後に続くC末端His6タグ(配列番号25)からなる。これらの構築物を、別個にHEK293細胞において発現させ、トランスフェクションの120時間後に馴化培地を回収した。
Nickel Sepharose HP(GE Healthcare)およびイミダゾールの勾配を使用して、ヒトROBO2 S17T/R73Y-His6(「His6」は配列番号25として開示されている)を馴化培地から精製した。ピーク画分を合わせて20mMのNaClまで希釈し、pH6.0に調整し、HiTrap強陽イオンスルホプロピル(SP)高性能(HP)カラムと直列に配置したHiTrap、Q Sepharose Fast Flow(Q FF)カラムにロードした。十分に洗浄した後、Q FFカラムを取り外し、NaClの勾配をSP HPカラムにかけた。グリコシル化の程度に基づいて画分をプールし、TBSに対して透析した。
SLIT2とゲル濾過カラムの樹脂との間の予期しない相互作用のために、ROBO2 S17T/R73Y-His6(「His6」は配列番号25として開示されている)とSLIT2との複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーによって得ることができなかった。その代わり、精製したROBO2 S17T/R73Y-His6(「His6」は配列番号25として開示されている)を、SLIT2 D2ドメインと1:1のモル比で混合し、結晶化を試みるために濃縮した。
SLIT2 D2ドメインと複合体形成しているROBO2 S17T/R73Y-His6(「His6」は配列番号25として開示されている)の結晶を以下の条件:100mMクエン酸ナトリウム pH5.5、15%PEG6000で得た。これにより1.78Åまで回折する結晶を得た。
結晶は一過性に低温保護し、シンクロトロンデータ収集は、高度光子源(APS)において遠隔で実施した。画像フレームは、ソフトウェアAutoPROC(Global Phasing Ltd)を使用して処理した。データは空間群P212121に属し、単位格子は以下の通り:a=163.251Å、b=41.896Å、c=50.938Å、α=β=γ=90°であり、非対称単位当たり1コピーの複合体である。
ROBO1 Ig1ドメインおよびSLIT2 D2ドメイン(PDBコード:2V9T)の相同性モデルを使用したMolecular Replacement検索により、各構成成分の確かな解答が得られた。精密化は、ソフトウェアautoBUSTER(Global Phasing Ltd)を使用して実施し、1.78Åでの最終的なR/Rfree因子はそれぞれ0.1848および0.2354であり、結合のRMSDは0.010Å、角度のRMSDは1.10°であった。
ROBO2 S17T/R73Y-His6-SLIT2(「His6」は配列番号25として開示されている)の結晶構造は、ROBO1-SLIT2の結晶構造と広範囲にわたってアライメントされ、ROBO-SLIT境界は、ROBO2とROBO1との間で高度に保存されている。そのため、一般に公開されているROBO1-SLIT2構造は、S17TおよびR73Yの影響を調べるための構造比較のために、ROBO2-SLIT2の代替物として使用することができる。
ROBO2-Fc2.2の翻訳後修飾
LC/MS-ペプチドマッピング
ROBO2-Fc2.2の翻訳後修飾の分析は、ペプチドマッピングによって達成した。手短に述べると、ROBO2-Fc2.2を還元し、アルキル化し、リシン特異的プロテアーゼであるLysyl Endopeptidase(Lys-C)で消化した。Lys-Cタンパク質分解ペプチドを、214nmでのUV検出を用いる逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)で分析した。
安全性薬理学試験
ROBO2-Fc2.2を週1回、静脈内(IV)注射によって6週間にわたって(合計6用量)50mg/kg/用量の用量で、遠隔測定された雄のサルに投与して、心血管(CV)エンドポイントを評価した。心拍数(HR)および活動量において統計学的に有意な差異が観察された。しかしながら、これらの差異は、その大きさが小さく、散発的な性質であり、長期間は持続しなかったため、これらの差異はROBO2-Fc2.2に関連しないとみなされた。50mg/kg/用量で週1回、6週間にわたるROBO2-Fc2.2のIV投与は、血圧(BP)、HR、または活動量(activity)において、試験を通してどの時点でもROBO2-Fc2.2に関連する変化を生じさせなかった。Cmax値は、1、22、および36日目においてそれぞれ1060、1030、および1070μg/mlであった。
動物における薬物動態および生成物代謝
分析方法
I.ラットおよびサル血清におけるROBO2-Fc2.2の定量化
電気化学発光(ECL)アッセイを、Wistar Hanラットおよびカニクイザル血清におけるROBO2-Fc2.2の定量化に関して、Meso Scale Discovery(MSD(登録商標))アッセイプラットホーム(15-1611、15-1609)において検証した。これらのアッセイにおいて、ROBO2-Fc2.2を含有するサンプルを、ビオチン化抗ROBO2-Fc抗体捕捉試薬をコーテイングしたストレプトアビジンコートMSDプレート上でインキュベートした。結合したROBO2-Fc2.2を、ルテニウム標識した(ruthenylated)マウス抗ヒトIgG Fc抗体で検出した。最終的な検出は、MSD Read Bufferを添加して、MSDプレートリーダーを使用して読み取るECLシグナルを生成させることによって達成した。結果として得られるECLシグナルは、ROBO2-Fc2.2の濃度と正比例していた。サンプル濃度は、1/yの重み係数を用いた4PLロジスティック(自動推定)モデルを使用して適合させた標準曲線から、内挿法によって決定した。100%血清における定量化の範囲は、20×の最小必要希釈倍率係数(MRD)で、50~1280ng/mLであった。
MSD(登録商標)アッセイプラットホームを使用して、Wistar Hanラットおよびカニクイザル血清において抗薬物抗体(ADA)の存在を検出するために、ECLアッセイを検証した。これらのアッセイにおいて、ビオチンおよびルテニウム標識されたROBO2-Fc2.2を、試験サンプル、陽性対照(Wistar Hanまたはカニクイザル血清における抗ROBO2-Fc2.2抗体)、または陰性対照(プールされた正常なWistar Hanまたはカニクイザル血清)とともに共インキュベートした。サンプル中に存在するROBO2-Fc2.2に対する抗体は、ROBO2-Fc2.2のビオチンおよびルテニウム標識されたバージョンの両方に結合し、これらのアッセイにおいて検出されるはずである。結合したADAを、ストレプトアビジンコートMSDプレートを使用して捕捉した。最終的な検出は、トリプロピルアミンを使用して、MSDプレートリーダーを使用して測定され、また相対的発光単位(RLU)で報告されるECLシグナルを生成させて達成した。
I.薬物動態
A.単回投与薬物動態
10mg/kgでの単回IV投与後にLewisラット(n=3)およびカニクイザル(n=2)において、ROBO2-Fc2.2の血清PKを決定した。ROBO2-Fc2.2は、ラットにおいて1.5mL/時間/kg、サルにおいて0.89mL/時間/kgのクリアランス(CL)、およびラットにおいて0.19L/kg、サルにおいて0.09L/kgの定常状態の分布容積(Vss)を示し、消失半減期(terminal half-life)(t1/2)はラットおよびサルにおいてそれぞれおよそ5日間および8日間となった。ラットに対してROBO2-Fc2.2を10mg/kgSC投与した後、推定されるバイオアベイラビリティは56%であった。
ラット毒物動態
6週間の回復期間を設けた3カ月GLPピボタル毒性試験の一部として、雄および雌のWistar Hanラット(n=6/性別/投与群)に3日ごとに1回投与される、25、125、または425mg/kg/用量のIV投与後、および425mg/kg/用量のSC投与後に、TKおよびADA評価を行った。
6週間の回復期間を設けた3カ月GLPピボタル毒性試験の一部として、雄および雌のカニクイザル(n=3または5/性別/投与群)に週に1回投与される、20、100、または300mg/kg/用量のIV投与後、および300mg/kg/用量のSC投与後、TKおよびADA評価を行った。
単回IV投与後のラット(0.19L/kg)およびサル(0.09L/kg)におけるROBO2-Fc2.2のVssは、Fc含有タンパク質の細胞外液中への限局的な分布と一致して低かった。
PK/PDモデリング(予測されるヒトPK、測定されるROBO2およびSLIT2の血清および腎臓濃度データを組み込んだ)に基づいて、腎臓中でCmin標的カバー率>90%を維持するために、2mg/kg(150mg)の推定による1週当たりのヒトSC用量が予測される。予想されるヒトに効果的な濃度(Ceff)約11μg/ml血清は、腎臓中の標的カバー率>90%をもたらす。2mg/kg(150mg)の週ヒトSC用量に関連して予想されるヒト定常状態CmaxおよびAUCtauはそれぞれ、18.2μg/mLおよび2610μg・時間/mLである。
毒性学
最大で3カ月(13週間)の期間の、予備的(医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施の基準[GLP]非準拠)およびピボタル(GLP準拠)毒性試験において、ROBO2-Fc2.2をラットおよびカニクイザルにIVおよびSC注射によって投与した。3カ月の投与後の無毒性量(NOAEL)は以下であった:
(i)ラットにおいて125mg/kg/用量のIV(Cmax 2930μg/mLおよびAUC72 74,500μg・時間/mL)および425mg/kg/用量のSC(Cmax 842μg/mLおよびAUC72 50,500μg・時間/mL)、ならびに
(ii)サルにおいて300mg/kg/用量のIV(Cmax 9210μg/mLおよびAUC168 427,000μg・時間/mL)およびSC(Cmax2340μg/mLおよびAUC168 328,000μg・時間/mL)。
ラットおよびカニクイザルにおいてROBO2-Fc2.2を用いて予備的およびピボタル反復投与毒性試験を行った。
(i)予備的毒性試験(ETS)
雄のラットにおける予備的毒性試験(ETS)において、ROBO2-Fc2.2を、3日ごとに1回、14日間にわたって(合計5用量)、200mg/kg/用量のIVまたは10、50、または200mg/kg/用量のSCで投与し、すべての用量で許容された。ROBO2-Fc2.2に関連する臨床徴候はなく、体重または摂餌量パラメーターに変化はなかった。
ピボタル反復投与ラット毒性試験において、ROBO2-Fc2.2を3日ごとに1回、3カ月にわたって(合計31用量)、25、125、または425mg/kg/用量のIVでまたは425mg/kg/用量のSCでラットに投与し、その後6週間の回復期間を続けた(対照および425mg/kg/用量のIV)。ROBO2-Fc2.2の神経機能作用もまた評価した。ROBO2-Fc2.2に関連する臨床徴候は、投与期間中の425mg/kg/用量のSCでの4/10の雄ラットにおいて認められる皮膚病変(背部、胸部、頭部、または注射部位)を含んでいた。発生率が対照群(2/15雄)と比較してわずかに高いだけであったため、また変化は投与期間中に散発的に認められただけであり、ROBO2-Fc2.2を最大で425mg/kg/用量のIVの用量で投与された動物においては存在しなかったことから、これらの変化は有害とはみなされなかった。ROBO2-Fc2.2に関連する体重の、摂餌量の、眼科の、神経機能の、または肉眼的な所見はなかった。
(i)予備的毒性試験(ETS)
雄および雌のカニクイザルにおけるETSにおいて、ROBO2-Fc2.2を週1回、29日間にわたって(合計5用量)、50または200mg/kg/用量のIVでまたは10mg/kg/用量のSCで投与した。テレメトリー埋込み動物において、50mg/kg/用量のIV群において心血管作用を評価した。30日目、最後の投与の翌日に、選択した動物を剖検した。忍容性および毒物動態をアセスメントするために、50mg/kg/用量のIV群の2匹のサルを71日目まで保持した。ROBO2-Fc2.2の投与は、すべての用量で許容された。生存、臨床徴候、体重、摂餌量、心血管測定値、インビボでのサイトカインアセスメント、血液学的および凝固パラメーター、ならびに肉眼的および顕微鏡所見に関して、ROBO2-Fc2.2に関連する作用はなかった。ROBO2-Fc2.2に関連する作用は、50mg/kg/用量のIVの雌(1.26×-1.51×ベースライン)および200mg/kg/用量のIVの雄および雌動物(それぞれ1.59×および1.55×ベースライン)の両方におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのわずかな増加および50mg/kg/用量のIV(1.29×-2.05×ベースライン)および200mg/kg/用量のIV(1.29×ベースライン)の同じ雌におけるアラニンアミノトランスフェラーゼのわずかな増加を含んでいた。これらの動物の肝臓において、これらの酵素増加は、ROBO2-Fc2.2に関連する顕微鏡的変化に関連していなかった。
ピボタル反復投与カニクイザル毒性試験において、ROBO2-Fc2.2を週1回、3カ月にわたって(合計13用量)、20、100、または300mg/kg/用量のIVでまたは300mg/kg/用量のSCで投与し、その後に6週間の回復期間(対照および300mg/kg/用量のIV)を続けた。この試験において評価したいかなるエンドポイントにおいても、有害なROBO2-Fc2.2に関連する所見はなかった。ROBO2-Fc2.2に関連する臨床徴候、体重、摂餌量、心電図/心拍数、血液学、凝固、検尿、眼科、臓器重量、または肉眼的な所見はなかった。ROBO2-Fc2.2に関連する臨床化学変化は、300mg/kg/用量のIVまたはSCでのコレステロールの増加(1.25×-1.61×ベースライン)、≧20mg/kg/用量のIVまたは300mg/kg/用量のSCでのトリグリセリドの増加(1.58×-4.59×ベースライン)、ならびに≧100mg/kg/用量のIVまたは300mg/kg/用量のSCでのグロブリンの減少(0.83×-0.87×ベースライン)を含んでいた。すべての臨床化学変化は、それらの変化の大きさが小さいこと、および関連する組織変化が存在しないことから、有害ではなかった。臨床化学変化は、定量可能な濃度のROBO2-Fc2.2が回復期間の128/127日目まで存在していた回復期間後、300mg/kg/用量のIV雄において存続した(2.78×-6.79×ベースライン)トリグリセリドの増加を除いて完全に回復した。
IVおよびSC注射部位を、予備的およびピボタルラットおよびカニクイザル反復投与毒性試験において顕微鏡により評価した。ラットのIV注射部位においてROBO2-Fc2.2に関連する所見はなかった。ROBO2-Fc2.2に関連する所見は、ラットのSC注射部位においてのみ認められた。ラットETSにおいて、≧10mg/kg/用量のSCでの極軽度から中等度の皮下血管周囲炎は、注射の身体的外傷に起因すると考えられ、有害ではないとみなされた。ピボタルラット試験において、出血の重症度の増加(中等度)は、これらは同時の対照よりわずかに重度であるだけであり、注射手技の結果として予期されるであろうものを超える顕著な組織損傷とは関連していなかったため、有害ではないとみなされた。ピボタルラット試験においてまた、ROBO2-Fc2.2に関連する皮膚病変(背部、胸部、頭部、または注射部位)は、投与期間中に雄において425mg/kg/用量のSCで認められた。これらの変化は、発生率が対照群と比較してわずかに高いだけであるため、また投与期間中に散発的に認められたため、有害とはみなされなかった。
ヒト全血サンプルを使用したインビトロでのサイトカイン放出アッセイ(CRA)において、ROBO2-Fc2.2は、試験したヒトドナー8人のうちの1人由来の全血サンプルにおいて、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)およびインターロイキン-6(IL-6)の産生を誘発した。ROBO2-Fc2.2ともにインキュベートしたヒト全血サンプルにおいて、ROBO2-Fc2.2に関連するインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)放出は観察されなかった。
補体依存性細胞障害(CDC)を誘発するその潜在能を試験するために補体タンパク質1q(C1q)結合ELISAにおいて、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)活性についてのその潜在能を試験するために断片結晶化可能なガンマ受容体(FcγR)結合アッセイにおいて、ROBO2-Fc2.2をインビトロで評価した。ROBO2-Fc2.2は、試験した濃度までC1qに結合しなかったため、CDCの誘導に関して低い潜在能を有すると考えられる。試験したすべてのFcγRに対するROBO2-Fc2.2の結合は、アッセイ対照抗体で見られる結合と比較して同等またはそれより少なく、陽性対照抗体のデータと比較してより少なかった。これらのデータは、ROBO2-Fc2.2が有するADCC活性を誘発する潜在能は低いことを示唆する。
試験した用量範囲にわたって、ラットおよびカニクイザルに対する反復IVおよびSC投与後、ROBO2-Fc2.2曝露(CmaxおよびAUCによってアセスメント)は、用量が増加するにつれて用量にほぼ比例して増加した。明らかな性別に関連する曝露の差異は観察されなかった。重要な応答に関連するROBO2-Fc2.2の閾値濃度およびこれらの重要な応答に対して算出された曝露マージンは、表22において見られる。
Claims (1)
- 組換えRoundabout受容体2(ROBO2)タンパク質であって、(i)ROBO2細胞外ドメインの一部、および(ii)免疫グロブリンドメインを含み、前記ROBO2細胞外ドメインの一部が、第1の免疫グロブリン様ドメイン(Ig1)、第1の免疫グロブリン様ドメインと第2の免疫グロブリン様ドメインとの間のドメイン間リンカー(Ig1-Ig2ドメイン間リンカー)、第2の免疫グロブリン様ドメイン(Ig2)、および第2の免疫グロブリン様ドメインと第3の免疫グロブリン様ドメインとの間のドメイン間リンカー(Ig2-Ig3ドメイン間リンカー)を含み、3つのフィブロネクチンIII型(FNIII)リピートを含まない組換えROBO2タンパク質であって、SLITとROBO2との結合を阻害し、かつ/またはROBO2依存的SLIT-N活性を阻害する、組換えROBO2タンパク質。
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