JP2991499B2 - 抗ｇｐ３９抗体およびその用途 - Google Patents

抗ｇｐ３９抗体およびその用途

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 抗原特異的なＴ細胞の活性化およびクローン拡張（cl
onal expansion）を誘導するには、抗原提示細胞（APC
s）によって提供される２つのシグナルが休止リンパ球
の表面に送達される必要がある（シェンキンス（Jenkin
s,M.））およびシュバルツ（Schwartz,R.）（1987）J.E
xp.Med.165、302〜319;ミュラー（Mueller,D.L.）ら（1
990）J.Immunol.144、3701〜3709;ウイリアムズ（Willi
ams,I.R.）およびウナヌエ（Unanue,E.R.）（1990）J.I
mmunol,145、85〜93）。第一のシグナルは免疫応答に特
異性を付与するものであり、主要組織適合性複合体（MH
C）と関連して提示される外来抗原性ペプチドの認識後
のＴ細胞受容体（TCR）を介して媒介される。第二のシ
グナルはコスティミュレーション（costimulation）と
呼ばれるもので、Ｔ細胞を誘導して増殖させ、機能的に
する（シュバルツ（1990）Science248、1349〜1356）。
コスティミュレーションは抗原特異的でもないしMHCに
拘束されるものでもなく、APCsによって発現される１ま
たは２以上の異なる細胞表面分子によって提供されると
思われる（ジェンキンスら（1988）J.Immunol.140、332
4〜3330;リンスレイ（Linsley,P.S）ら（1991）J.Exp.M
ed.173、721〜730;ギミ（Gimmi,C.D.）ら（1991）Proc.
Natl.Acad.Sci.USA88、6575〜6579;ヤング（Young,J.
W.）ら（1992）J.Clin.Invest.90、229〜237;クーロバ
（Koulova,L.）ら（1991）J.Exp.Med.173、759〜762;ラ
イザー（Reiser,H.）ら（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.US
A89、271〜275;バン−セベンター（van−Seventer,G.
A.）ら（1990）J.Immunol.144、4579〜4586;ラサル（La
Salle,J.M.）ら（1991）J.Immunol.147、774〜80;ダス
ティン（Dustin,M.I.）ら（1989）J.Eep.Med.169、503;
アーミテージ（Armitage,R.J.）ら（1992）Nature357、
80〜82;リウ（Liu,Y.）ら（1992）J.Exp.Med.175、437
〜445）。Ｔ細胞活性化に関与する一つのコスティミュ
ラトリー経路にはＴ細胞表面上の分子CD28が関与する。
この分子は、Ｂ細胞または他のAPCs上のリガンドによっ
て送達されるコスティミュラトリーシグナルを受け取る
ことができる。CD28のリガンドとしては、B7−１および
／またはB7−２などのＢリンパ球活性化抗原のB7ファミ
リーの成員が挙げられる（フリードマン（Freedman,A.
S.）ら（1987）J.Immunol.137、3260〜3267;フリーマン
（Freeman,G.J.）ら（1989）J.Immunol.143、2714〜272
2;フリーマンら（1991）J.Exp.Med.174、625〜631;フリ
ーマンら（1993）Science262、909〜911;マズマ（Azum
a,M.）ら（1993）Nature366、76〜79;フリーマンら（19
93）J.Exp.Med.178、2185〜2192）。B7−１およびB7−
２はまた活性化Ｔ細胞表面上に存在する他の分子、CTLA
4のリガンドでもあるが、コスティミュレーションにお
けるCTLA4の役割はわかっていない。
コスティミュラトリーシグナルとともに抗原特異的シ
グナルがＴ細胞に送達されるとＴ細胞が活性化される。
Ｔ細胞の活性化にはＴ細胞の増殖およびサイトカイン分
泌の両方が含まれる。対照的に、コスティミュラトリー
シグナルの不在下で抗原特異的シグナルがＴ細胞に送達
されると非応答性の状態またはアネルギーがＴ細胞にお
いて誘導され、それによって抗原特異的な寛容がＴ細胞
において誘導されると考えられている。
Ｔ細胞とＢ細胞との相互作用は免疫応答において中心
的役割を果たしている。胸腺依存性抗原への液性免疫の
誘導にはＴヘルパー（以下、Thという）細胞によって提
供される「ヘルプ」が必要がある。Ｂリンパ球に提供さ
れるある種のヘルプはTh細胞によって放出される可溶性
分子（たとえば、IL−４やIL−５などのリンホカイン）
によって媒介されるが、Ｂ細胞の活性化にはまた接触依
存性のＢ細胞とTh細胞との相互作用が必要である（ヒロ
ハタ（Hirohata）ら、J.Immunol.、140:3736〜3744（19
88）；バートレット（Bartlett）ら、J.Immunol.、143:
1745〜1754（1989））。このことは、Ｂ細胞の活性化に
はＢ細胞およびTh細胞上の細胞表面分子間での必須の相
互作用が関与していることを示している。それゆえ、Ｔ
細胞上の該分子はＴ細胞の接触依存性のヘルパーエフェ
クター機能を媒介している。Ｂ細胞およびＴ細胞上の分
子間の接触依存性の相互作用はさらに、活性化Ｔ細胞か
ら単離した原形質膜がＢ細胞の活性化に必要なヘルパー
機能を提供しうるという観察によって支持されている。
ブライアン（Brian）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85:56
4〜568（1988）；ホジキン（Hodgkin）ら、J.Immunol.1
45:2025〜2034（1990）；ノエル（Noelle）ら、J.Immun
ol.、146:1118〜1124（1991）。
分子CD40は未成熟および成熟Ｂリンパ球の表面上で同
定されており、抗体と架橋したときにＢ細胞の増殖を誘
導する。バル（Valle）ら、Eur.J.Immunol.、19:1463〜
1467（1989）；ゴードン（Gordon）ら、J.Immunol.、14
0:1425〜1430（1988）；グルーバー（Gruber）ら、J.Im
munol.、142:4144〜4252（1989）。CD40は分子レベルで
クローニングされ、特徴付けられている。スタメンコビ
ッチ（Stamenkovic）ら、EMBO J.、8:1403〜1410（198
9）。CD40のリガンドであるgp39（CD40リガンドまたはC
D40Lとも称する）もまた分子レベルでクローニングさ
れ、特徴付けられている。アーミテージラ、Nature、35
7:80〜82（1992）；レーダーマン（Lederman）ら、J.Ex
ep.Med.、175:1091〜1101（1992）；ホレンバウ（Holle
nbaugh）ら、EMBO J.、11:4313〜4319（1992）。gp39タ
ンパク質は活性化されたCD4+Th細胞では発現されるが、
休止のCD4+Th細胞では発現されない。スプリッグス（Sp
riggs）ら、J.Exp.Med.、176:1543〜1550（1992）；レ
ーン（Lane）ら、Eur.J.Immunol.、22:2573〜2578（199
2）；ロイ（Roy）ら、J.Immunol.,151:1〜14（1993）。
gp39遺伝子でトランスフェクトされ細胞表面上にgp39タ
ンパク質を発現する細胞はＢ細胞の増殖を誘導すること
ができ、他の刺激性シグナルとともに抗体の産生を誘導
することができる。アーミテージら、Nature、357:80〜
82（1992）；ホレンバウら、EMBO J.、11:4313〜4319
（1992）。
発明の要約 Ｔ細胞の接触依存性のヘルパーエフェクター機能を媒
介する細胞表面分子は、Ｔ細胞ヘルプを必要とする免疫
応答を誘導するのに重要である。たとえば、Ｔ細胞上の
gp39とＢ細胞上のCD40との相互作用は、抗原へのＢ細胞
応答を活性化するうえで中心的な役割を果している。本
発明は、少なくともその一部は、接触依存性のヘルパー
エフェクター機能を媒介する細胞表面分子はまた抗原へ
のＴ細胞の応答においても重要な役割を果たしていると
いう知見に基づいている。とりわけ、適当な条件下、Ｔ
細胞上のgp39と該Ｔ細胞に抗原を提示する細胞上のリガ
ンドとの間の相互作用を妨害することによって抗原特異
的な寛容を誘導できることがわかった。従って、該Ｔ細
胞に抗原を提示する細胞は、該Ｔ細胞の活性化に必要な
シグナルを提供しうるためには該細胞上のgp39リガンド
（たとえば、CD40）と該Ｔ細胞上のgp39との間の相互作
用が必要である。gp39とgp39リガンドとの間の相互作用
を抑制するとＴ細胞活性化が妨害され、抗原特異的なＴ
細胞寛容が誘導される。
本発明の方法は、抗原特異的なＴ細胞寛容の誘導に関
する。該方法には、Ｔ細胞を、（１）該Ｔ細胞に抗原を
提示し、接触依存性のヘルパーエフェクター機能を媒介
する該Ｔ細胞の表面上の受容体と相互作用するリガンド
を表面に有する細胞、および（２）接触依存性のヘルパ
ーエフェクター機能を媒介するＴ細胞の表面上の該受容
体のアンタゴニストと接触させることが含まれる。該ア
ンタゴニストは該受容体とそのリガンドとの相互作用を
抑制する。Ｔ細胞を抗原を提示する細胞および該アンタ
ゴニストとインビトロで接触させることができるし、ま
たは該細胞と該アンタゴニストとを被験者に投与してＴ
細胞寛容をインビボで誘導することもできる。
好ましい態様において、接触依存性のヘルパーエフェ
クター機能を媒介するＴ細胞の表面上の受容体はgp39で
ある。この態様においては、アンタゴニストはgp39と該
Ｔ細胞に抗原を提示する細胞上のそのリガンドとの相互
作用を抑制する分子である。特に好ましいgp39アンタゴ
ニストは抗gp39抗体である。別の態様として、gp39アン
タゴニストは可溶性の形態のgp39リガンド、たとえば可
溶性のCD40である。Ｔ細胞に抗原を提示する細胞は好ま
しくはＢ細胞である。このＢ細胞は小さな休止Ｂ細胞で
あってよい。可溶性抗原に対してＴ細胞寛容を誘導する
には、該Ｂ細胞を該Ｔ細胞に接触させる前に（たとえ
ば、被験者に投与する前に）該抗原に接触させることが
できる。他の態様において、アロ抗原に対してＴ細胞寛
容を誘導する場合は、該Ｔ細胞に抗原を提示するのに用
いる細胞は同種細胞［アロジェニック（allogeneic cel
ls），同種異系細胞］である。同種細胞は、たとえば、
同種Ｂ細胞、同種骨髄、同種脾臓細胞または末梢血液中
の同種細胞であってよい。
本発明の方法は、たとえば、可溶性抗原に対するＴ細
胞寛容を誘導するため、骨髄移植片または他の臓器移植
に対するＴ細胞寛容を誘導するため、または骨髄移植に
おける移植片対宿主病を抑制するために用いることがで
きる。骨髄移植の場合には、移植した骨髄細胞自身が本
発明の方法においてＴ細胞に抗原を提示する細胞として
働く。従って、本発明の一つの態様において、同種骨髄
をgp39アンタゴニスト（たとえば、抗gp39抗体）ととも
に被験者に投与することによって骨髄の受け入れが促進
される。
本発明はさらに、Ｂ細胞増殖、Ｂ細胞分化およびＴ細
胞応答を抑制しうる抗ヒトgp39モノクローナル抗体、お
よび該抗体を含む医薬組成物に関する。本発明の抗ヒト
gp39モノクローナル抗体は一般に免疫応答を調節するた
め、および特に抗原特異的なＴ細胞寛容を誘導するため
に使用するのが好ましい。好ましい抗体としては、実施
例６に記載するモノクローナル抗体3E4、2H5、2H8、4D9
−８、4D9−９、24−31、24−43、89−76および89−79
が挙げられる。特に好ましい抗体はモノクローナル抗体
89−76および24−31である。89−76および24−31抗体を
それぞれ産生する89−76および24−31ハイブリドーマ
は、ブタペスト条約の規定に従ってアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション、パークローンドライブ、
ロックビル、メリーランドに1994年９月２日に寄託して
ある。89−76ハイブリドーマはATCC受託番号HB11713
を、24−31ハイブリドーマはATCC受託番号HB11712を付
与された。24−31抗体および89−76抗体はIgG1イソタイ
プである。
従って、一つの態様において、本発明はIgG1イソタイ
プの抗ヒトgp39モノクローナル抗体（mAb）を提供す
る。本発明の抗ヒトgp39mAbは標準インビトロアッセイ
におけるＢ細胞増殖、たとえばインターロイキン−４お
よび可溶性gp39でＢ細胞を処理することにより誘導され
るＢ細胞増殖を抑制することができる。抗ヒトgp39抗体
によるＢ細胞増殖の抑制は、約0.01〜５μg/ml、より好
ましくは約0.1〜2.5μg/ml、さらに一層好ましくは約0.
1〜1.25μg/mlのIC50（すなわち、増殖を50％抑制する
のに必要な濃度）で行うのが好ましい。本発明の抗ヒト
gp39mAbはまた、標準インビトロアッセイにおけるＢ細
胞によるIgG、IgMおよび／またはIgAの産生、たとえば
Ｂ細胞を活性化Ｔ細胞（たとえば、抗CD3抗体で処理す
ることによって活性化されたＴ細胞）とともに培養する
ことによって誘導されるIgの産生を抑制することができ
る。IgG、IgMおよび／またはIgAのＢ細胞産生の抗gp39
抗体による抑制は、約0.01〜1.0μg/ml、または一層好
ましくは約0.01〜0.1μg/mlのIC50で行うのが好まし
い。
好ましい態様において、本発明の抗ヒトgp39mAbは、3
E4、2H5、2H8、4D9−８、4D9−９、24−31、24−43、89
−76および89−79よりなる群から選ばれたモノクローナ
ル抗体によって認識されるエプトープに結合する。さら
に好ましくは、抗ヒトgp39mAbはモノクローナル抗体24
−31またはモノクローナル抗体89−76によって認識され
るエプトープに結合する。上記抗体のいずれかにより認
識されるエプトープに結合するmAbの能力は、標準交差
競合アッセイにより決定することができる。たとえば、
mAb24−31によって認識されるエプトープと同じエプト
ープに結合する抗体は標識24−31の活性化Ｔ細胞への結
合に競合するであろうし、一方、mAb24−31によって認
識されるエプトープとは異なるエプトープに結合する抗
体は標識24−31の活性化Ｔ細胞への結合に競合しないで
あろう。
本発明はまた、本発明の抗ヒトgp39抗体の医薬組成物
をも提供する。これら組成物は一般に、抗ヒトgp39mAb
（たとえば、好ましくは24−31または89−76）および薬
理学的に許容しうる担体を含む。
本発明のさらに他の側面は、抗ヒトgp39mAbをコード
する核酸（たとえば、抗ヒトgp39mAbの免疫グロブリン
Ｈ鎖またはＬ鎖またはその一部をコードするDNA）に関
する。かかる核酸は、抗ヒトgp39mAbを産生する細胞
（たとえば、ハイブリドーマ）から標準法により単離す
ることができる。たとえば、24−31または89−76mAbを
コードする核酸は、それぞれ24−31または89−76ハイブ
リドーマから、cDNAライブラリースクリーニング、PCR
増幅または他の標準法により単離することができる。抗
ヒトgp39mAb鎖をコードする核酸は、標準組換えDNA法に
より操作して組換え抗ヒトgp39mAb、たとえばキメラ化
またはヒト化した抗ヒトgp39mAbを製造することができ
る。
さらに、抗ヒトgp39mAbをコードする核酸は、発現ベ
クター中に組み込み、宿主中に導入して組換え形態の抗
ヒトgp39抗体の発現および産生を容易にすることができ
る。
図面の簡単な説明 図１は、インビボ抗gp39抗体処理により誘導されたタ
ンパク質抗原に対するＴ細胞寛容を示すグラフである。
Ｔ細胞応答の測定は、抗gp39抗体を用い、または用いる
ことなく、すでにインビボで投与した抗原を抗原パルス
標識した（antigen−pulsed）Ｂ細胞に攻撃することに
よりインビトロで行った。
図２は、インビボ抗gp39抗体処理により誘導された同
種Ｂ細胞に対するＴ細胞寛容を示すグラフである。Ｔ細
胞応答の測定は、抗部39抗体を用い、または用いること
なく、すでにインビボで投与した同種Ｂ細胞で攻撃する
ことによりインビトロで行った。
図3Aは、受容動物を抗gp39抗体で処理した場合の、同
種Ｂ細胞によって誘導される一次同種CTL応答の抑制を
示すグラフである。表示したグループは、未処理マウス
（■）、抗gp39抗体処理マウス（△）および未感作Balb
/cマウスからの脾臓細胞（●；負の対照エフェクター細
胞として使用）である。
図3Bおよび3Cは、受容動物を抗gp39抗体で処理した場
合の、LPS処理Ｂ幼若細胞によって誘導される一次同種C
TL応答の抑制を示すグラフである。パネルＢおよびＣは
２つの独立した実験を表す。表示したグループは、処理
しない場合のインビボLPS幼若細胞（▲）、抗gp39抗体
処理したインビボLPS幼若細胞（●）、処理しない場合
のインビボ休止Ｂ細胞（○）および抗gp39抗体処理した
インビボ休止Ｂ細胞（□）である。
図4Aは、受容動物を抗gp39抗体で処理した場合の、同
種Ｂ細胞によって誘導される二次同種CTL応答の抑制を
示すグラフである。表示したエフェクターグループは、
HIg処理した受容者（■）、未感作（naive）Balb/c
（▲）および抗gp39抗体処理した受容者（■）である。
対応する同系応答（Balb/c細胞で刺激したBalb/c細胞）
は白抜きの記号で示す。
図4Bは、抗gp39抗体処理による同種CTL応答の抑制の
特異性を示す。未感作Balb/c細胞による（○）またはＨ
−2bハプロタイプＢ細胞および抗gp39抗体を投与するこ
とによりＨ−2bに対して寛容となった細胞による（■）
Ｈ−2k標的に対するCTL応答を示す。
図５は、抗gp39抗体で処理した場合および処理しない
場合の、骨髄移植を宿主に移植後の種々の時間における
宿主の脾臓細胞の数を示す棒グラフである。
図6Aは、抗gp39抗体でインビボ処理した場合および処
理しない場合の、骨髄移植を受けたマウスから取り出し
た脾臓Ｂ細胞によりインビトロで産生されたIgAの濃度
を示すグラフである。骨髄移植から７日後または14日後
に脾臓Ｂ細胞を取り出し、抗体産生を測定した。
図6Bは、抗gp39抗体でインビボ処理した場合および処
理しない場合の、骨髄移植を受けたマウスから取り出し
た脾臓Ｂ細胞によりインビトロで産生されたIgG1の濃度
を示すグラフである。骨髄移植から７日後または14日後
に脾臓Ｂ細胞を取り出し、抗体産生を測定した。
図7Aは、抗gp39抗体でインビボ処理した場合および処
理しない場合の、骨髄移植を受けたマウスにおける骨髄
移植後の種々の時間の血清IgE濃度を示すグラフであ
る。
図7Bは、抗gp39抗体でインビボ処理した場合および処
理しない場合の、骨髄移植を受けたマウスにおける骨髄
移植後の種々の時間の血清抗DNA抗体濃度を示すグラフ
である。
図8Aおよび8Bは、抗gp39抗体でインビボ処理した場合
および処理しない場合の、骨髄移植を受けたマウスから
の細胞障害性Ｔ細胞のインビトロ細胞溶解活性を異なる
エフェクター／標的細胞比（E:T比）で示すグラフであ
る。パネルＡおよびＢは２つの独立した実験を示す。
図9A、9Bおよび9Cは、CD40Ig（パネルＡ）、mAb4D9−
８（パネルＢ）またはmAb4D9−９（パネルＣ）のいずれ
かによる６時間活性化ヒト末梢血リンパ球の染色を示す
フローサイトメトリープロフィールである。
図10A、10Bおよび10Cは、mAb4D9−８（パネルＡ）、m
Ab4D9−９（パネルＢ）またはCD40Ig（パネルＣ）のい
ずれかで染色し、シクロスポリンＡの存在下で培養した
６時間活性化ヒト末梢血リンパ球の染色を示すフローサ
イトメトリープロフィールである。
図11Aおよび11Bは、非標識mAb4D9−８（パネルＡ）ま
たは非標識mAb4D9−９（パネルＢ）の存在下、CD40Igに
よる６時間活性化ヒト末梢血リンパ球の染色を示すフロ
ーサイトメトリープロフィールである。
図12は、細胞を抗ヒトgp39mAb4D9−８、4D9−９、24
−31、24−43、89−76または89−79の存在下で培養した
場合の、可溶性gp39およびIL−４によって誘導されたヒ
トＢ細胞増殖の抑制を示すグラフである。
図13は、細胞を抗ヒトgp39mAb24−31または89−79の
存在下で培養した場合の、アロ特異的混合リンパ球応答
の抑制を示すグラフである。
発明の詳細な記載 本発明は、抗原特異的なＴ細胞寛容の誘導方法に関す
る。本発明の方法には、Ｔ細胞を、（１）該Ｔ細胞に抗
原を提示し、接触依存性のヘルパーエフェクター機能を
媒介する該Ｔ細胞の表面上の受容体と相互作用するリガ
ンドを表面に有する細胞、および（２）接触依存性のヘ
ルパーエフェクター機能を媒介するＴ細胞の表面上の該
受容体のアンタゴニストと接触させることが含まれる。
本明細書において接触依存性のヘルパーエフェクター機
能を媒介する分子または受容体とは、Th細胞上で発現さ
れ、エフェクター細胞（たとえば、Ｂ細胞）上のリガン
ドと相互作用するものであって、該受容体とそのリガン
ドとの相互作用がエフェクター細胞の応答（たとえば、
Ｂ細胞活性化）に必要であるものをいう。エフェクター
細胞の応答に関与することに加えて、かかる分子はまた
該Ｔ細胞の抗原への応答にも関与することが今やわかっ
た。
接触依存性のヘルパーエフェクター機能を媒介するＴ
細胞上の好ましい分子はgp39である。従って、好ましい
態様において、本発明の方法にはＴ細胞を抗原を提示す
る細胞およびgp39アンタゴニストと接触させることが含
まれる。従って、抗原を提示させるのに用いる細胞は、
Ｔ細胞の表面上のgp39と相互作用して該Ｔ細胞を活性化
させる（すなわち、該Ｔ細胞にＴ細胞活性化に必要なシ
グナルを送達する）ものである。たとえば、該細胞は、
CD40を発現し、抗原をＴ細胞に提示するＢ細胞であって
よい。抗原提示細胞上のgp39リガンドと該Ｔ細胞上のgp
39との相互作用を抑制することにより、該Ｔ細胞は提示
された該抗原によって活性化されず、該抗原に対して寛
容となる。
本発明の方法は、インビボで抗原に対するＴ細胞寛容
を誘導させるのに用いることができる。たとえば、Ｔ細
胞に抗原を提示する細胞を、接触依存性のヘルパーエフ
ェクター機能を媒介する該Ｔ細胞上に発現された受容体
のアンタゴニスト（たとえば、gp39アンタゴニスト）と
ともに被験者に投与することができる。本発明の方法は
さらに、Ｔ細胞を、接触依存性のヘルパーエフェクター
機能を媒介するＴ細胞上に発現される受容体のアンタゴ
ニスト（たとえば、gp39アンタゴニスト）とともに該Ｔ
細胞に抗原を提示する細胞とインビトロにて接触させる
ことにより、抗原に対してＴ細胞をインビトロにて寛容
にするのに用いることができる。ついで、インビトロで
寛容にされたＴ細胞を被験者に投与することができる。
本発明の方法は、特定の抗原に対して、または同種骨髄
（たとえば、骨髄移植において）などの移植された細胞
に対して被験者のＴ細胞を寛容にするのに用いることが
できる。本発明の方法はまた、骨髄移植における移植片
対宿主病を抑制するうえでも有用である。
本発明の種々の側面を以下の細項目においてさらに詳
細に記載する。
I.gp39アンタゴニスト： 本発明の方法によれば、gp39アンタゴニストをＴ細胞
と接触させて（たとえば被験者に投与して）、Ｔ細胞上
のgp39とＢ細胞などの抗原提示細胞上のgp39リガンドと
の相互作用を妨害する。gp39アンタゴニストとは、この
相互作用を妨害する分子として定義される。gp39アンタ
ゴニストは、gp39に対して向けられた抗体（たとえば、
gp39に対するモノクローナル抗体）、gp39に対して向け
られた抗体のフラグメントまたは誘導体（たとえば、Fa
bまたはＦ（ab′）２フラグメント、キメラ抗体または
ヒト化抗体）、可溶性形態のgp39リガンド（たとえば、
可溶性CD40）、可溶性形態のgp39リガンドの融合タンパ
ク質（たとえば、可溶性CD40Ig）、またはgp39−CD40相
互作用を破壊または妨害する薬剤であってよい。
A.抗体 哺乳動物（たとえば、マウス、ハムスター、またはウ
サギ）は、該哺乳動物において抗体応答を引き起こす免
疫原の形態のgp39タンパク質またはタンパク質断片（た
とえば、ペプチド断片）で免疫することができる。その
表面にgp39を発現する細胞もまた免疫原として用いるこ
とができる。他の免疫原としては、精製したgp39タンパ
ク質またはタンパク質断片が挙げられる。gp39の精製
は、標準精製法によりgp39発現細胞から行うことができ
る。gp39cDNA（アーミテージら、Nature、357:80〜82
（1992）；レーダーマンら、J.Exp.Med.、175:1091〜11
01（1992）；ホレンバウら、EMBO J.、11:4313〜4319
（1992））を宿主細胞、たとえば細菌または哺乳動物細
胞株中で発現させ、細胞培養液から標準法に従ってgp39
タンパク質を精製することができる。gp39ペプチドは、
gp39のアミノ酸配列（アーミテージら、Nature、357:80
〜82（1992）；レーダーマンら、J.Exp.Med.、175:1091
〜1101（1992）；ホレンバウら、EMBO J.、11:4313〜43
19（1992）に開示）に基づき、公知の方法（たとえば、
Ｆ−mocまたはＴ−boc化学合成）により合成することが
できる。タンパク質に免疫原性を付与する技術として
は、担体への結合、または当該技術分野でよく知られた
他の方法が挙げられる。たとえば、タンパク質をアジュ
バントの存在下で投与することができる。免疫の進行
は、血漿または血清中の抗体力価の検出によりモニター
することができる。抗体レベルを評価するため、抗原と
して免疫原を用いた標準ELISAまたは他のイムノアッセ
イを用いることができる。
免疫後、抗血清を得ることができ、所望ならポリクロ
ーナル抗体を該血清から単離することができる。モノク
ローナル抗体を産生するには、抗体産生細胞（リンパ
球）を免疫動物から回収し、標準体細胞融合法によりミ
エローマ細胞と融合させてこれら細胞を不死化し、ハイ
ブリドーマ細胞を得る。かかる技術は当該技術分野にお
いてよく知られている。たとえば、コーラーおよびミル
シュテインにより最初に開発されたハイブリドーマ法
（Nature（1975）256:495〜497）、並びにヒトＢ細胞ハ
イブリドーマ法（コズバー（Kozbar）ら、Immunol.Toda
y（1983）4:72）、ヒトモノクローナル抗体を産生する
ためのEBV−ハイブリドーマ法（コール（Cole）ら、Mon
oclonal Antibodies in Cancer Therapy（1985）（アレ
ン・アール・ブリス、77〜96頁））、および結合（comb
inatorial）抗体ライブラリーのスクリーニング（ヒュ
ーズ（Huse）ら、Science（1989）246:1275）などの他
の方法。該タンパク質またはペプチドに特異的に反応す
る抗体の産生についてハイブリドーマ細胞を免疫化学的
にスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離するこ
とができる。
本明細書において用いる抗体なる語は、gp39タンパク
質またはそのペプチドまたはgp39融合タンパク質と特異
的に反応するフラグメントをも包含する。抗体は常法に
よりフラグメントとすることができ、全抗体について記
載したのと同様にしてフラグメントを有用性についてス
クリーニングすることができる。たとえば、Ｆ（ab′）
２フラグメントは抗体をペプシンで処理することにより
生成させることができる。得られたＦ（ab′）２フラグ
メントは、ジスルフィド架橋を還元すべく処理してFa
b′フラグメントとすることができる。本発明の抗体は
さらに、抗gp39部分を有する２特異的分子およびキメラ
分子を包含する。
非ヒト被験者において産生された抗体をヒトの治療に
用いる場合には、これら抗体は種々の程度で外来のもの
として認識され、該患者において免疫応答が生じるかも
しれない。この問題を最小限に抑えまたは排除する（一
般的な免疫抑制に好ましい）一つの方法は、キメラ抗体
誘導体、すなわち非ヒト動物の可変領域とヒトの定常領
域とを組み合わせた抗体分子を作製することである。キ
メラ抗体分子としては、たとえば、マウス、ラットまた
は他の種からの抗体の抗原結合ドメインをヒト定常領域
と組み合わせたものが挙げられる。種々のキメラ抗体の
作製法が記載されており、gp39を認識する免疫グロブリ
ン可変領域を含むキメラ抗体を作製するのに用いること
ができる。たとえば、モリソン（Morrison）ら、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA81:6851（1985）；タケダ（Takeda）
ら、Nature314:452（1985）、カビリー（Cabilly）ら、
米国特許第4,816,567号；ボス（Boss）ら、米国特許第
4,816,397号；タナグチ（Tanaguchi）ら、ヨーロッパ特
許出願公開EP171496号；ヨーロッパ特許出願公開第0173
494号、英国特許第GB2177096B号を参照。かかるキメラ
抗体は、対応する非キメラ抗体に比べてヒト被験者にけ
る免疫原性が小さいことが期待される。
ヒトの治療目的に用いる場合、可変領域の一部、とり
わけ抗原結合ドメインの保存らえたフレームワーク領域
をヒト由来のものとし、超可変領域のみを非ヒト由来の
ものとしたヒト可変領域キメラを作成することによっ
て、gp39タンパク質またはペプチドに特異的に反応する
モノクローナル抗体またはキメラ抗体をさらにヒト化す
ることができる。かかる改変免疫グロブリン分子は当該
技術分野で知られた幾つかの技術（たとえば、テング
（Teng）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、80:7308〜7312
（1983）；ゴスバーら、ImmunologyToday、4:7279（198
3）；オルソン（Olsson）ら、Meth.Enzymol.、92:3〜16
（1982））のいずれによっても作製することができ、PC
T公開WO92/06193号またはEP0239400号の教示に従って作
成するのが好ましい。ヒト化抗体は、たとえば、スコッ
トジェン・リミテッド（Scotgen Limited）、グレート
ブリテン、ミドルセックス、トゥイッケナム、ホリー・
ロード２番によって商業的に製造することができる。
gp30タンパク質またはペプチドに対して特異的に反応
する特異的抗体、または抗体フラグメントの他の作製方
法は、細菌中に発現された免疫グロブリン遺伝子または
その一部をコードする発現ライブラリーをgp39タンパク
質またはペプチドでスクリーニングすることである。た
とえば、ファージ発現ライブラリーを用い、完全なFab
フラグメント、VH領域およびFV領域を細菌中で発現させ
ることができる。たとえば、ウォード（Ward）ら、Natu
re、341:545〜546:（1989）；ヒューズら、Science、24
6:1275〜1281（1989）；およびマッカファーティ（McCa
fferty）ら、Nature、348:552〜554（1990）を参照。か
かるライブラリーを、たとえばgp39ペプチドを用いてス
クリーニングすることにより、gp39に反応性の免疫グロ
プリンフラグメントを同定することができる。別法とし
て、SCID−huマウス（ジェンファーム（Genpharm）より
入手可能）を用いて抗体またはそのフラグメントを作製
することができる。
ヒトgp39およびマウスgp39を含むgp39に対して向けら
れたモノクローナル抗体の作製方法および本発明の方法
に使用するのに適したモノクローナル抗体については実
施例６にさらに詳細に記載してある。本発明の特に好ま
しい抗ヒトgp39抗体は、ハイブリドーマ24−31および89
−76によってそれぞれ産生されたmAb24−31および89−7
6である。89−76抗体および24−31抗体をそれぞれ産生
する89−76ハイブリドーマおよび24−31ハイブリドーマ
は、ブダペスト条約の規定に従い、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション、パークローンドライブ、
ロックビル、メリーランドに1994年９月２日に寄託して
ある。89−76ハイブリドーマはATCC受託番号HB11713
を、24−31ハイブリドーマはATCC受託番号HB11712を付
与された。
キメラ抗体やヒト化抗体などの組換え抗gp39抗体は、
標準組換えDNA法に従い、抗gp39抗体をコードする核酸
（たとえば、DNA）を操作することにより作製すること
ができる。従って、本発明の他の側面は、gp39、とりわ
けヒトgp39に反応性の免疫グロブリンＨ鎖またはＬ鎖ま
たはその一部をコードする単離核酸分子に関する。該免
疫グロブリンをコードする核酸は、免疫グロブリンのＬ
鎖またはＨ鎖可変領域をコードしていてよく、Ｈ鎖また
はＬ鎖の定常領域（またはその一部）が結合していても
結合していなくてもよい。かかる核酸は、抗ヒトgp39mA
bを産生する細胞（たとえば、ハイブリドーマ）から標
準法により単離することができる。たとえば、24−31ま
たは89−76mAbをコードする核酸は、それぞれ24−31ハ
イブリドーマまたは89−76ハイブリドーマからcDNAライ
ブラリースクリーニング、PCR増幅その他の標準法によ
り単離することができる。抗ヒトgp39mAbをコードする
核酸を単離およびさらに操作した後、該核酸を発現ベク
ター中に組み込み、宿主細胞中に導入して組換え形態の
抗ヒトgp39抗体の発現および産生を容易にすることがで
きる。
B.gp39の可溶性リガンド Ｔ細胞寛容を誘導するのに用いることのできる他のgp
39アンタゴニストは、可溶性形態のgp39リガンドであ
る。可溶性CD40などのgp39の１価可溶性リガンドはgp39
に結合することができ、それによってgp39とＢ細胞上の
CD40との相互作用を抑制する。「可溶性」なる語は、リ
ガンドが細胞膜に永久的に結合していないことを示す。
可溶性gp39リガンドは、化学合成によって、または好ま
しくは組換えDNA法によって、たとえば、該リガンドの
細胞外ドメインのみ（経膜ドメインおよび細胞質ドメイ
ンを欠く）を発現させることによって作製することがで
きる。好ましい可溶性gp39リガンドは可溶性CD40であ
る。別の態様として、可溶性gp39リガンドはまた融合タ
ンパク質の形態であってもよい。かかる融合タンパク質
は、第二の分子に結合した少なくとも一部のgp39リガン
ドを含む。たとえば、CD40は免疫グロブリンとの融合タ
ンパク質（すなわち、CD40Ig融合タンパク質）として発
現させることができる。一つの態様において、免疫グロ
ブリンＨ鎖、たとえばCr1のヒンジ領域、CH2領域および
CH3領域に対応する配列のアミノ酸残基に結合したCD40
分子の細胞外ドメイン部分のアミノ酸残基からなる融合
タンパク質を作製してCD40Ig融合タンパク質を生成する
（たとえば、リンスレイら（1991）J.Exp.Med.1783:721
〜730;カポン（Capon）ら（1989）Nature337、525〜53
1;およびカポン米国特許第5,116,964号を参照）。融合
タンパク質は、化学合成によって、または好ましくはCD
40のcDNAに基づいて組換えDNA法によって作製すること
ができる。（スタメンコビッチら、EMBO J.、8:1403〜1
410（1989））。
II.抗原特異的な寛容を誘導する細胞： 本発明は、少なくとも一部、抗原を提示しgp39と相互
作用する細胞により該抗原がＴ細胞に提示されると、該
抗原の該Ｔ細胞への提示がgp39アンタゴニストの存在下
で行われた場合に抗原特異的なＴ細胞寛容が生じるとい
う知見に基づいている。このメカニズムによるＴ細胞寛
容を誘導しうる細胞としては、Ｔ細胞に抗原を提示し、
Ｔ細胞活性化に必要なシグナルを該Ｔ細胞に送達するた
めにその表面上のgp39リガンドと該Ｔ細胞上のgp39との
相互作用を必要とする細胞が挙げられる。この相互作用
を抑制することにより、提示された抗原によるＴ細胞の
活性化が妨害され、該Ｔ細胞において抗原特異的な寛容
が誘導される。gp39を介したＴ細胞の活性化を妨害する
ことにより、抗原提示細胞上のコスティミュラトリー分
子（たとえば、Ｂ細胞などの抗原提示細胞上のB7ファミ
リー分子）の誘導が妨害され、該抗原提示細胞はコステ
ィミュラトリーシグナルの不在下で抗原性シグナルのみ
を送達しそれゆえ寛容が誘導される。
従って、本発明の方法において、抗原を提示する細胞
を受容者に投与する。「抗原を提示する細胞」および
「抗原提示細胞」なる語は本明細書において同じ意味で
用いられ、受容者のＴ細胞に抗原を提示しうる細胞を包
含し、Ｂリンパ球、「プロフェッショナル（profession
al）」抗原提示細胞（たとえば、単球、樹状細胞、ラン
ゲルハンス細胞）および免疫細胞に抗原を提示する他の
細胞（たとえば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細
胞、線維芽細胞、寡突起神経膠細胞）が含まれている。
さらに、抗原提示細胞は受容Ｔ細胞においてコスティミ
ュラトリーシグナルを刺激する能力が減少しているのが
好ましい。たとえば、抗原提示細胞はB7ファミリーのタ
ンパク質（たとえば、B7−１およびB7−２）などのコス
ティミュラトリー分子を発現しないかまたは低レベルし
か発現しなくてよい。本発明の方法において使用すべき
可能な抗原提示細胞上のコスティミュラトリー分子の発
現は、標準法により、たとえば、コスティミュラトリー
分子に対して向けられた抗体を用いたフローサイトメト
リーにより評価することができる。
Ｔ細胞寛容を誘導するための好ましい抗原提示細胞
は、リンパ球細胞、たとえば末梢血リンパ球または脾臓
細胞である。Ｔ細胞寛容を誘導するのに好ましいリンパ
球細胞はＢ細胞である。Ｂ細胞は細胞の混合集団（たと
えば、末梢血または脾臓中の他の細胞型）から標準細胞
分離法により精製することができる。たとえば、接着細
胞は、脾臓細胞をプラスチック皿上で培養し、ついで非
接着細胞集団を回収することによって除去することがで
きる。Ｔ細胞は、抗Ｔ細胞抗体（たとえば、抗Thy1.1抗
体および／または抗Thy1.2抗体）および補体で処理する
ことにより細胞の混合集団から取り出すことができる。
一つの態様において、休止リンパ球細胞、好ましくは休
止Ｂ細胞を抗原提示細胞として用いる。休止Ｂ細胞など
の休止リンパ球細胞の単離は、当該技術分野で知られた
技術により、たとえばこれら細胞の小さなサイズおよび
密度に基づいて行うことができる。休止リンパ球細胞の
単離は、たとえば、トニー（Tony,H−P.）およびパーカ
ー（Parker,D.C.）（1985）J.Exp.Med.161:223〜241に
記載された向流遠心エルトリエーション（counterflow
centrifugal elutriation）により行うことができる。
向流遠心エルトリエーションを用い、14〜19ml/分、好
ましくは19ml/分（3,200rpm）にてフラクションを回収
することにより、Ｔ細胞応答を活性化しうる細胞を含ま
ない休止リンパ球細胞集団を得ることができる。別法と
して、たとえばフィコールまたはパーコール勾配を用い
た不連続密度勾配遠心分離により小さな休止リンパ球
（たとえば、Ｂ細胞）を単離することができ、遠心分離
後に小さな休止リンパ球を含む層を得ることができる。
小さな休止Ｂ細胞はまた、標準法（たとえば、蛍光抗体
法）により、活性化されたＢ細胞の表面のB7−１および
／またはB7−２などのコスティミュラトリー分子の発現
をアッセイすることにより、活性化されたＢ細胞から分
離することができる。
Ｂ細胞などの抗原提示細胞は、該Ｔ細胞に接触させる
前に（たとえば、被験者に投与する前に）抗原（たとえ
ば、可溶性タンパク質）と接触させることができ、該細
胞を用いてgp39アンタゴニストの存在下で該Ｔ細胞に該
抗原を提示させることにより該抗原に特異的なＴ細胞寛
容を誘導させることができる（実施例１参照）。別法と
して、抗原提示細胞として同種細胞を用いることによ
り、アロ抗原に対する寛容を誘導することができる（実
施例２および３参照）。同種細胞はＴ細胞に同種タンパ
ク質の抗原性断片を提示する。一つの態様において、同
種細胞は同種Ｂ細胞などの同種リンパ種細胞である。別
法として、被験者はまた末梢血中の細胞（たとえば、末
梢血リンパ球）、脾臓細胞または骨髄細胞で寛容にする
ことができる。骨髄移植の場合、ドナーの骨髄細胞自身
がＴ細胞に接触する抗原提示細胞として働く（たとえ
ば、被験者に投与）。従って、同種骨髄をgp39アンタゴ
ニストとともに投与することにより、受容者において骨
髄に対する寛容を誘導し、移植片対宿主病を防ぐことが
できる（実施例４および５参照）。
III.細胞およびgp39アンタゴニストの投与： 抗原特異的なＴ細胞寛容は、本発明に従い、Ｔ細胞に
抗原を提示し、該Ｔ細胞上のgp39と相互作用するリガン
ドを発現する細胞とともにgp39アンタゴニストを被験者
に投与することによって誘導することができる。好まし
い態様において、抗原提示細胞およびgp39アンタゴニス
トは同時に投与する。別法として、たとえばgp39アンタ
ゴニストが長い半減期を有する抗体である場合に、該細
胞を投与する前に該アンタゴニストを投与することがで
きる。投与しようとする細胞が骨髄細胞であり、移植片
対宿主病の抑制が望まれる場合には、ドナー骨髄を受容
者のＢ細胞およびgp39アンタゴニストとともにインビト
ロでインキュベートすることにより、受容者宿主に移す
前に該骨髄中のドナーＴ細胞を寛容にすることができ
る。gp39処置は、必要なら骨髄を移す間または移した後
にインビボで継続することができる。骨髄または他の臓
器移植を受ける被験者において、該臓器または骨髄細胞
を移す前に同種寛容を誘導させる治療計画で処置するこ
とにより、該被験者において該移植に対する同種寛容を
誘導することができる。この前処置治療計画には、gp39
アンタゴニストとともにドナーの細胞を被験者に投与す
ることが含まれる。ドナーの細胞としては、たとえば、
Ｂ細胞、全末梢血またはそのフラクション（たとえば、
末梢血リンパ球または小さな休止リンパ球またはＢ細
胞）が挙げられる。
抗原提示細胞の（アンタゴニストと組み合わせた）単
回投与量の投与が、Ｔ細胞寛容を誘導するに充分である
ことがわかった（実施例参照）。投与する抗原提示細胞
の数は、使用した細胞のタイプ、組織または臓器移植の
タイプ、受容者の体重、受容者の一般的状態または当業
者に知られた他の変数に依存して変わってよい。本発明
の方法に使用する細胞の適当な数は、常法（たとえば、
実施例に記載するアッセイを用いて）により当業者が決
定することができる。細胞の投与は、受容者において寛
容を誘導するのに適した形態および経路で行う。細胞の
投与は、緩衝食塩水や同様のビヒクルなどの生理学的に
許容しうる溶液中にて行うことができる。細胞は静脈内
に投与するのが好ましい。
本発明のアンタゴニストは、Ｔ細胞寛容を誘導するた
め、インビボの医薬投与に適した生物学的に両立しうる
形態に被験者に投与する。「インビボの医薬投与に適し
た生物学的に両立しうる形態」とは、該タンパク質の治
療効果が毒性作用より重視されるように投与されるアン
タゴニストの形態をいう。被験者なる語は、免疫応答を
引き起こしうる生物、たとえば哺乳動物を包含する。被
験者の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラッ
ト、およびこれらのトランスジェニック種が挙げられ
る。gp39アンタゴニストの投与は、任意に薬理学的に許
容しうる担体中にて医薬形態で行うことができる。治療
学的に活性な量のアンタゴニストの投与とは、所望の結
果を達成するのに必要な投与量および時間にて有効な量
と定義される。たとえば、gp39のアンタゴニストの治療
学的に活性な量は、個体の疾患状態、年齢、性および体
重、および該アンタゴニストが該個体において所望の応
答を引き起こす能力に従って変わってよい。投与計画は
最適の治療応答をもたらすように調節する。たとえば、
幾つかの分割投与量を毎日投与することができるし、ま
たは治療状況の緊急性によって示されるように比例して
投与量を減らしていくこともできる。
活性化合物（たとえば、アンタゴニスト）の投与は、
注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮投
与、または直腸投与などの常法により行うことができ
る。投与経路に応じて、活性化合物を不活性する酵素、
酸または他の天然の条件から該化合物を保護するために
該化合物を物質中にコーティングすることができる。好
ましい投与経路は静注である。
非経口以外の投与によりgp39のアンタゴニストを投与
するには、不活性を防ぐ物質で該アンタゴニストをコー
ティングするかまたは該物質と該アンタゴニストとを同
時に投与する必要がある。たとえば、アンタゴニスト
は、適当な担体または希釈剤中にて、または酵素阻害剤
とともにまたはリポソームなどの適当な担体中にて一緒
に投与することができる。薬理学的に許容しうる希釈剤
としては、食塩および水性緩衝液が挙げられる。酵素阻
害剤としては、膵臓トリプシンインヒビター、ジイソプ
ロピルフルオロホスフェート（DEP）およびトラシロー
ル（trasylol）が挙げられる。リポソームとしては、水
中油中水懸濁液並びに通常のリポソーム（ストレジャン
（Strejan）ら（1984）J.Neuroimmunol7:27）が挙げら
れる。
活性化合物はまた、非経口または腹腔内投与すること
もできる。グリセロール、液体ポリエチレングリコー
ル、およびそれら混合物中、および油中で分散液を調製
することもできる。通常の貯蔵および使用条件では、こ
れら調製物には微生物の増殖を防ぐための保存剤が含ま
れる。
注射用途に適した医薬組成物としては、滅菌水溶液
（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射用溶液ま
たは分散液を即座に調製するための滅菌粉末が挙げられ
る。いずれの場合においても組成物は滅菌されていなけ
ればならず、容易な注射器操作が可能な程度に流体でな
ければならない。該組成物は製造および貯蔵条件下で安
定でなければならず、細菌や真菌などの混入微生物の作
用から保護されていなければならない。担体は、たとえ
ば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロ
ール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレン
グリコールなど）、およびこれらの適当な混合物を含む
溶媒であるかまたは分散媒体であってよい。適当な流動
性は、たとえば、レシチンなどのコーティングを使用す
ることによって、分散液の場合は必要な粒径を維持する
ことによって、および界面活性剤を使用することによっ
て維持することができる。微生物の作用からの保護は、
種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロ
ロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサ
ールなどにより行うことができる。多くの場合、等張
剤、たとえば糖、ポリアルコール、たとえばマンニトー
ル、ソルビトール、塩化ナトリウムなどが組成物中に含
まれているのが好ましいであろう。注射用組成物の持続
吸収は、吸収を遅らせる薬剤、たとえばモノステアリン
酸アルミニウムやゼラチンなどを組成物中に配合するこ
とにより行うことができる。
滅菌注射用溶液の調製は、必要なら上記成分の１また
はその組み合わせとともに所要量の活性化合物（たとえ
ば、gp39のアンタゴニスト）を適当な溶媒中に配合し、
ついで滅菌濾過することにより行うことができる。一般
に分散液の調製は、基本的な分散媒体と上記から選ばれ
た必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を
配合することにより行う。滅菌注射溶液の調製のための
滅菌粉末の場合は、好ましい調製法は真空乾燥および凍
結乾燥であり、これにより活性成分（たとえば、アンタ
ゴニスト）と前以て滅菌濾過した溶液からの所望の追加
成分との粉末が得られる。
上記のように活性化合物を適切に保護してある場合
は、該タンパク質は、たとえば不活性な希釈剤または同
化しうる食用担体とともに経口投与することができる。
本明細書において「薬理学的に許容しうる担体」とは、
溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌
剤、等張剤および吸収遅延剤などのすべてを包含する。
薬理学的に活性な物質のためのかかる媒体および剤の使
用は、当該技術分野でよく知られている。通常の媒体ま
たは剤が活性化合物と両立しない場合以外は、治療学的
組成物中に使用することができる。補助的な活性化合物
を該組成物中に配合することもできる。
投与の容易および投与量の均一さのため、単位投与剤
型で非経口組成物に調合するのが特に有利である。本明
細書において単位投与剤型とは、治療すべき哺乳動物被
験者に対する単位投与量として適した物理的に区別され
る単位をいう。各単位には、所要の薬理学的担体と組み
合わせて所要の治療効果を奏するように計算された前以
て決定された量の活性化合物が含まれる。本発明の単位
投与剤型は、（ａ）活性化合物の独特の特性および達成
しようとする特定の治療効果、および（ｂ）個体におけ
る治療感受性（treatment of sensitivity）のためにか
かる活性化合物を調整する際の内在する技術的制約に直
接依存して個々に特性される。
インビボでのＴ細胞の寛容に加え、本発明はまた、た
とえばgp39アンタゴニストの存在下で抗原提示細胞と接
触させることによる、インビトロでのＴ細胞の寛容をも
包含する。たとえば、Ｔ細胞を被験者から採取し、抗原
提示細胞およびアンタゴニストとともに培養することに
よってインビトロで寛容にし、ついで該Ｔ細胞を被験者
に再投与することができる。
IV.本発明の方法の用途： 本発明の方法は、種々の抗原に対してＴ細胞寛容を誘
導するために応用することができる。たとえば、実施例
１に記載するように、可溶性抗原（たとえば、可溶性タ
ンパク質）に対してＴ細胞寛容を誘導することができ
る。Ｔ細胞の寛容はまた、自己免疫疾患または異常な免
疫応答を伴う疾患に関与する抗原に対して行うことがで
きる。たとえば、一つの態様において、抗原は自己抗原
である。他の態様において、抗原はアレルゲンである。
別の態様において、Ｔ細胞の寛容はまた外来細胞上に発
現される抗原に対して行うことができる（実施例２〜５
に記載するように）。従って、さらに他の態様におい
て、抗原はアロ抗原または異種抗原［ジェノアンチゲン
（xenoantigen）］である。アロ抗原および異種抗原に
対するＴ細胞寛容の誘導は、ドナーの移植片、たとえば
組織または臓器移植片または骨髄移植の移植受容者によ
る拒絶を抑制するために移植において特別の用途を有す
る。加えて、骨髄移植中のドナーＴ細胞の寛容は、移植
片対宿主病を抑制するのに有用である（実施例５参
照）。
本発明を下記実施例によりさらに詳しく説明するが、
本発明はこれらに限られるものではない。本明細書中に
引用した全ての参考文献、特許および公開された特許出
願の内容は参照のため本明細書中に引用される。
実施例1:抗原特異的な寛容の誘導 方法 マウスをKLH−パルス標識した脾臓Ｂリンパ球で５日
間免疫した。一次免疫の間、動物を抗gp39抗体MR1で処
理するかまたは処理しなかった。最初の免疫から５日
後、マウスをフロイントの完全アジュバント（CFA）中
のKLHで局所（食趾（food pad））攻撃した。マウスを
５日後に屠殺し、取り出したリンパ節の水を切り、その
後、KLHに対するＴ細胞増幅応答をインビトロでアッセ
イした。
結果 抗原でパルス標識した活性化Ｂリンパ球で免疫し、そ
の後、同抗原で攻撃した動物は、免疫を行った該抗原に
対して有意の免疫応答を生じる。抗原特異的Ｔリンパ球
の増殖により測定した応答を図１に示す。一次免疫の間
に抗gp39抗体で動物を処理すると、インビトロで抗原攻
撃したときに抗原特異的なＴリンパ球の非応答性という
結果となった。抗gp39抗体で処理した動物のリンパ節か
ら得られたＴリンパ球は未処理の動物のリンパ節から得
られたＴリンパ球に比べて低下した増殖能を示す。
実施例2:同種細胞に対するＴ細胞寛容の誘導 方法 Balb/c（Ｈ−2d）マウスをDBA/2（Ｈ−2b）マウスか
らの同種脾臓Ｂ細胞で免疫した。免疫後の５日間、動物
を抗gp39抗体、MR1で処理するかまたは処理しなかっ
た。第６日目に動物を屠殺し、脾臓を取り出した。その
後、抗gp39抗体で処理した動物または未処理動物からの
脾臓を刺激なしでまたは照射DBA/2脾臓細胞とともにイ
ンビトロで培養した。この二次同種刺激に対する増殖応
答を培養の開始後３日目に測定した。
結果 同種脾臓Ｂ細胞で免疫した動物からのＴリンパ球は、
同細胞でインビトロにて５日後に攻撃したときに強い増
殖応答を生じる（図２）。しかしながら、同種Ｂ細胞で
免疫し抗gp39抗体で処理したマウスからＴリンパ球は、
その後インビトロで攻撃したときに低下した増殖能を有
する。抗gp39抗体処理したマウスは、対照の未処理動物
に比べて攻撃に対する応答性において約50％の低下を示
す。
実施例3:抗gp39抗体処理は同種Ｂ細胞に対するCTL応答
の生成を妨害する 本実施例においては、細胞障害性Ｔ細胞（CTL）の生
成におけるgp39の役割を調べた。CTLの発生におけるgp3
9のインビボ機能を評価するため、同種Ｂ細胞で免疫す
ることによるアロ特異的なCTLの生成に対する抗gp39抗
体処理の効果を調べた。一次CTL応答および二次CTL当応
答の両方に対する抗gp39抗体処理の効果を決定した。
一次CTL応答 同種Ｂ細胞がインビボでアロ特異的なCTL応答を引き
起こすのを抗gp39抗体が妨害しうるか否かを試験するた
め、同種Ｂ細胞（Ｔ細胞を欠く脾臓細胞）を抗gp39抗体
とともに、または抗gp39抗体なしで受容者のマウスに投
与した。Balb/cマウス（雌、６〜８週齢、ジャクソン・
ラボラトリーズ（Jackson Laboratories）、バーハーバ
ー、メイン州）を、抗Thy1.2抗体（ATCCクローンHO13.4
から調製した腹水）およびウサギ補体処理によりＴ細胞
を欠くC57BL/6（雌、６〜８週齢、ジャクソン・ラボラ
トリーズ、バーハーバー、メイン州）脾臓細胞（30〜50
×106）で免疫した。ついで、これら受容者のマウスを
抗gp39抗体で５日間処理するか（第０日目、第２日目お
よび第４日目に250mg/受容者）または処理しなかった。
第５日目に脾臓を取り出し、４時間クロム放出アッセイ
を用いてCTL応答を測定した。未感作Balb/cマウスから
の脾臓細胞を負の対照エフェクター細胞として用いた。
使用した標的細胞は、Ｅ雌K1（Ｈ−2b,C57BL/6株由来の
Ｔ細胞リンパ腫）およびP815（Ｈ−2d、肥満細胞腫、DB
A/2J株由来）であった。51Cr−標識した標的細胞を洗浄
し、エフェクター細胞とともにエフェクター：標的（E:
T）比が100:1、20:1および4:1で96ウエルプレート中に
ウエル当たり１×104細胞にてプレーティングした。プ
レートを簡単に遠心分離にかけ、ついで５％CO2中、37
℃にて４時間インキュベートした。プレートをもう一度
遠心分離にかけ、各ウエルから100mlの細胞不含上澄み
液を回収し、ガンマカウンティングにかけた（LKBクリ
ニガンマ（LKBClinigamma）、ウオレス（Wallace In
c.）、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）。特異的溶
解％を（ａ−ｂ）/cと定義する（式中、ａ＝エフェクタ
ー細胞とともにインキュベートした標的細胞により放出
されるcpm、ｂ＝培地のみでインキュベートした標的細
胞により放出される（自然放出）cpm、およびｃ＝標的
細胞から凍結−解糖により放出可能なcpm（導入された
全cpmの約80％））。P815標的は、試験した細胞試料の
いずれによっても溶解しなかった。Ｅ雌K1標的の結果を
図3Aに示す。図3Aにおいて、図示したグループは、未処
理マウス（■）、抗gp39抗体処理マウス（△）および未
感作Balb/cマウスからの脾臓細胞（●；負の対照エフェ
クター細胞として使用）である。これら結果は、抗gp39
抗体および同種細胞を与えられたマウスは同種Ｂ細胞に
応答してインビボで一次CTL応答を生成しないことを示
す。対照的に、抗gp39抗体が存在しないと、同種Ｂ細胞
はアロ抗原に対して受容者を感作し、実質的なCTL応答
を誘導する。
抗gp39抗体が活性化されていない脾臓Ｂ細胞の寛容原
作用のみを増幅しうるか否かを決定するため、LPS−活
性化Ｂ細胞を用いて抗gp39抗体の存在下または不在下で
CTLを感作させた。C57BL/6マウスからのＢ細胞を上記と
同様にして調製し、リポ多糖（LPS;50mg/ml;シグマ・ダ
イアグノスティックス（Sigma Diagnositics）、セント
ルイス、ミズーリ州）の存在下または不在下で２日間培
養した。ついで、細胞を回収し、充分に洗浄し、Balb/c
受容マウスに腹腔内注射した（30〜50×106）。受容マ
ウスを上記のように第０日目、第２日目および第４日目
に抗gp39抗体で処理するかまたは処理しなかった。第５
日目に脾臓細胞を取り出し、CTL応答を上記と同様にし
て決定した。２つの独立した実験の結果を図3Bに示す
（上段および下段のパネル）。図示したグループは、処
理なしのインビボLPS幼若細胞（blasts）（＞）、抗gp3
9抗体処理したインビボLPS幼若細胞（●）、処理なしの
インビボ休止Ｂ細胞（○）、および抗gp39抗体処理した
インビボ休止Ｂ細胞（□）である。これら結果は、完全
ではないが、抗gp39抗体はまた同種LPS幼若細胞に対す
る一次CTL応答をも減少させることを示している。
二次CTL応答 CTL生成に対する抗gp39抗体および同種Ｂ細胞の投与
の影響を調べるため、処理および未処理マウスからの脾
臓細胞をインビトロで刺激し、CTL応答の範囲を調べ
た。Balb/cマウスを上記と同様にしてC57BL/6由来のＢ
細胞でインビボにて感作させた。抗gp39抗体および対照
のハムスターIg（HIg）処理した動物から脾臓細胞を取
り出し、種々のマイトマイシンＣ処理した（37℃にて2.
5mg/ml、シグマ・ダイアグノスティックス、セントルイ
ス、ミズーリ州）脾臓Ｂ細胞の株（抗Thy1.2抗体＋補体
処理により調製）とともに５×106スティミュレーター/
mlにて５日間培養した（「レスポンダー（responder
s）」）。スティミュレーターグループはC57BL/6（Ｈ−
2bおよびBalb/c（Ｈ−2d）であり、それぞれ二次同種応
答および一次同系応答を示す。スティミュレーター細胞
およびレスポンダー細胞を、新たに調製した感作RPMI−
1640培地（バイオ・ホワイテーカー（Bio Whittake
r）、ウオーカースビル、メリーランド州）、１×105M2
−メルカプトエタノール（バイオ−ラド・ラボラトリー
ズ（Bio−Rad Laboratories）、ハーキュールズ、カリ
フォルニア州）、2mM L−グルタミン（シグマ・ダイア
グノスティックス、セントルイス、ミズーリ州）、500U
/mlペニシリンおよび5000U/mlストレプトマイシン（シ
グマ・ダイアグノスティックス、セントルイス、ミズー
リ州）中で培養した。５日後、レスポンダー細胞を回収
し、死細胞を密度勾配遠心分離により除去した。得られ
た生細胞を上記CTLアッセイにおいてエフェクターとし
て用いた。標的にはＥ雌K1（Ｈ−2b,C57BL/6株由来のＴ
細胞リンパ腫）およびP815（Ｈ−2d,肥満細胞腫、DBA/2
J株由来）が含まれていた。その結果を図4Aに示す。図
示した同種刺激エフェクターグループは、HIg処理受容
者（●）、未感作Balb/c（＞）および抗gp39抗体処理し
た受容者（■）である。対応する同系応答（Balb/c細胞
で刺激したBalb/c細胞）は白抜きの記号で示す。予想さ
れたように、抗gp39抗体の不在下で同種Ｔ欠損脾臓細胞
（Ｈ−2b）でマウスをインビボ免疫すると、インビトロ
で強い二次CTL応答となった。マウスに抗gp39抗体を与
えた場合には、強められた二次抗Ｈ−2bCTL応答は観察
されなかった。
抗gp39抗体によるCTL応答の抑制の特異性を決定する
ため、上記脾臓細胞培養を、CTLアッセイにおいてステ
ィミュレーターとしてB10BR（Ｈ−2k）脾臓Ｂ細胞を、
標的としてSL8（Ｈ−2k、AKR株由来の特発性Ｔ細胞リン
パ腫）を用いて抗Ｈ−2k同種応答（第三者同種応答）に
ついて分析した。その結果を図4Bに示す。図示したグル
ープは、未感作Balb/c（○）および抗gp39抗体処理した
受容者（■）である。これら結果は、抗gp39抗体処理に
よる抗H2b特異的CTL応答の抑制がアロ特異的であること
を示している。なぜなら、H2b脾臓細胞および抗gp39抗
体の投与が傍観者であるアロ抗原（Ｈ−2k）に対するイ
ンビトロCTL応答に変化をもたらさなかったからであ
る。
以上を総合すると、これらデータは、抗gp39抗体がア
ロ特異的なCTL応答（一次および二次の両者）の生成を
妨害することを示している。抗gp39抗体の存在下では、
関連するアロ抗原に特異的なCTL前駆体はなお存在して
いる。なぜなら、インビトロの二次培養において若干の
抗Ｈ−2bCTL活性を示すことができるからである。抗gp3
9抗体処理は、CTL感作（priming）を阻止することによ
り、または感作アロ特異的CTLの頻度を減少させること
により、二次インビトロ応答を減少させたと結論するこ
とができる。休止Ｂ細胞の使用は、この非応答性を示す
ために強制的なものではない。なぜなら、LPS幼若細胞
によって誘導された同種CTL応答もまた抗gp39抗体によ
って損なわれたからである。
実施例4:同種マウス骨髄の移植は、受容者をgp39に対す
る抗体で処理した場合には安定なキメラを誘導する 従来の化学療法では治癒され得なかった多くの血液疾
患の治療には、同種骨髄の移植が含まれる。この攻撃的
な療法には、クロノジェニックな（clonogenic）腫瘍細
胞を撲滅させるべく、同種骨髄の潅流と組み合わせた骨
髄腫を撲滅しうる（myeloablative）高投与量の化学療
法剤の投与が含まれる。
胸腺を照射して胸腺Ｔ細胞を欠失させたと、抗CD4モ
ノクローナル抗体（mAb）を含むＴ細胞に対するmAbを使
用した場合に安定なキメラの頻度が増大することがすで
に示されている。この抗体療法により、Ｔ細胞欠失、そ
れゆえドナー特異的が寛容が得られ、このことはドナー
皮膚移植に対する寛容によって示される。300ラドのWB
I、インビボ抗Ｔ細胞mAb処理、および同種骨髄の投与後
に永久的な同種移植を達成できないのは、胸腺内の影響
を受けないＴ細胞によるものである。抗CD4mAbおよび抗
CD8mAbの使用により末梢血および脾臓のＴ細胞の有効な
欠失をもたらし得るが、胸腺のＴ細胞はmAbでコーティ
ングされるのみで欠失されるわけではない。それゆえ、
胸腺照射をマウスに行う。
方法 移植片対宿主病が誘導されるのを回避するため、親へ
のF1の同種骨髄移植（BMT）のマウスモデルを用いた。
本発明者らは、（C57BL/6×Balb/c）F1であるF1株CB6を
用い、その結果、Ｈ−２d/bの全MHCハプロタイプとなっ
た。骨髄を取り出し、抗gp39抗体MR1とともに、または
抗gp39抗体なしで、照射したBALB/c親に静脈内注射し
た。キメラ化（chimerism）の最良のレベルを決定する
ため、および各照射レベルで抗gp39抗体処理した動物と
処理しない動物とを比較するため、全身照射（whole bo
dy irradiation）（WBI）レベルを変化させた。キメラ
化の決定は、Ｈ−2d（BALB/c）マウス内に存在するＨ−
2bMHCハプロタイプの末梢血リンパ球のフローサイトメ
トリーにより行った。このマウスの組み合わせが適して
おり、500および600ラドWBIのレベルでキメラ現象が得
られることが以前に示されている。
結果 フローサイトメトリーによりC57BL/6由来細胞（Ｈ−2
b）の同定を行うことによってキメラ化を検出した。こ
の研究の開始のときから抗gp39抗体で処理した場合にの
み、400、500および600全身照射にて照射したマウスに
おいて14日以内にキメラ化が出現することがわかった。
600全身照射を受けた場合に400ラドの抗体処理群と同じ
程度に骨髄を受け入れたのを例外として、抗体処理を受
けなかったマウスはすべての照射レベルにおいて細胞を
拒絶した（表１）。抗gp39抗体療法とともに400、500お
よび600ラドで治療後６週間のキメラ化のレベルは、そ
れぞれ70.7＋5.74、94.1および84.4＋8.56であったのに
対し、抗体処理なしでの600ラドでは85.7＋5.9キメラで
あることがわかった（表２）。この時点で細胞を表現型
で分類すると、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびマクロファージは
すべてキメラ化され、処理した場合の400ラドでの程度
は未処理群の600ラドでの程度と同じであった（表
２）。また、抗gp39抗体処理は、末梢内でのリンパ球細
胞のいずれの全パーセント集団をも有意に変化させない
とも思われた。抗gp39抗体により動物の処理が終了した
とき、これら動物は移植後８週間まで安定にキメラ化さ
れることがわかった。
実施例5:抗gp39抗体による受容者の処理と組み合わせた
同種骨髄移植は急性および慢性の移植片対宿主病を抑制
する 本実施例においては以下の方法を用いた。
マウス:DBA/2（Ｈ−2d）、C57BL/6（Ｈ−2b）およびB
6D2F1（（C57BL/6（Ｈ−2d）×DBA/2）F1ハイブリッ
ド）マウスをNCIラボラトリーズ（ベセスダ、メリーラ
ンド州）から入手し、ダートーマス・メディカル・スク
ールの動物施設中のウイルス不含環境中で維持した。こ
の研究に使用したマウスはすべて雌であり、６〜８週齢
であった。
慢性GVHDの誘導：慢性GVHDの誘導を、親（DBA/2）の
脾臓細胞を非照射（C57BL/6×DBA/2）F1ハイブリッド受
容者に静脈内注射することにより行った（ファスト（Fa
st,L.D.）（1990）、J.Immunol.144:4177）。脾臓を取
り出すため、親マウスを麻酔し、頚部脱臼により屠殺し
た。分離した脾臓細胞を洗浄し、F1受容者に静脈内注射
するためPRMI1640培地中に再懸濁した（ハワイテーカ
ー、ウオルダースビル、メリーランド州）。
急性GVHDの誘導：急性GVHDの誘導は、親C57BL/6脾臓
細胞を非照射（C57BL/6×DBA/2）F1ハイブリッド受容者
に静脈内注射することにより行った。慢性GVHDの誘導の
場合と同様にして、移植のための細胞を調製した。
抗体：抗gp39抗体：以前に記載されているようにして
（フォイら（1993）J.Exp.Med.178:1567〜1575;ノエル
（Noelle,R.J.）ら（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:
6550）、MR1を腹水中に産生させ、イオン交換HPLCによ
り精製した。ポリクローナル抗イソタイプ抗体：抗IgG1
抗体および抗IgA抗体および標準対照はすべてサザーン
・バイオテクノロジー・アソシエーツ（Southern Biote
chnology Associates,Inc.）（バーミンガム、アラバマ
州）から入手した。抗IgE抗体:IgE特異的ELIZAに用いる
抗IgE抗体（BIE3およびビオチンAM95）および標準（A3B
1）はすべて、ワルドシュミット（T.Waldschmidt）博士
（アイオワ州）から親切に贈呈されたものであった。抗
MHCハプロタイプ抗体:H−2KbFITC結合抗体およびＨ−2D
dビチオン結合抗体をファーミンジェン（PharMingen）
（サンジエゴ、カルフォルニア州）から入手した。
細胞株：使用した細胞株にはP815（Ｈ−2d）およびLB
27.4（Ｈ−2bxd）が含まれ、これらはアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクションから入手した。細胞株c
1.18.5（Ｈ−2b）はウイリアム・アール・グリーン（Wi
lliam R.Green）博士から親切に贈呈されたものであっ
た。
インビトロでのポリクローナルIg産生：対照およびcG
VHDマウスから脾臓を取り出し、単一細胞懸濁液を調製
した。細胞をトリス緩衝塩化アンモニウムで処理して赤
血球を除去し、血球計で目視でカウントすることにより
全白血球数を決定した。細胞（５×106）を1mlの完全
（ｃ）RPMI−1640培地（10％ウシ胎仔血清（ハイクロー
ン（Hyclone）、ローガン（Logan）、ユタ州）、25mM H
EPES、2mM L−グルタミン、5000U/mlペニシリンおよび5
000mg/mlストレプトマイシンを添加）中、37℃、５％CO
2にて３日間インキュベートした。細胞をペレット化す
ることにより培養上澄み液を回収し、イソタイプ−特異
的ELISAアッセイによりIgを定量した。
イソタイプ特異的および抗原特異的ELISA:IgG1および
IgAの検出のためのELISA:PBS中のヤギ抗マウスIgG1およ
びIgA（10μg/ml;サザーン・バイオテクノロジー・アソ
シエーツ、バーミンガム、アラバマ州）を96−ウエルポ
リビニルマイクロタイタープレートのウエル上に、37℃
にて１時間、ついで４℃にて一夜吸着させた。プレート
を洗浄し、１％FCSを含有するPBSで37℃にて１時間ブロ
ックした。プレートを再び洗浄し、上澄み液の適当な希
釈液および標準対照（IgG1およびIgA、サザーン・バイ
オテクノロジー・アソシエーツ・バーミンガム、アラバ
マ州）を37℃にて２時間かけて加えた。この時間後、プ
レートを３回洗浄し、アルカリホスファターゼを結合し
たヤギ抗マウスIgG1またはIgA（1/500希釈）（サザーン
・バイオテクノロジー・アソシエーツ、バーミンガム、
アラバマ州）を37℃にて２時間かけて加えた。プレート
を充分に洗浄し、ホスファターゼ基質（1mg/ml;シグマ
・ダイアグノスティックス（Sima Diagnostics）、セン
トルイス、ミズーリ州）を加え、適当な発色変化を起こ
させた。410nmの吸光度をELISAリーダー（ダイナテック
・ラボラトリーズ（Dynatech Laboratories,Inc.））で
読み取ることにより読み取りを行った。適当なイソタイ
プ標準曲線と比較することによってIgの濃度を決定し、
平均＋標準誤差（ｎ＝３）として表した。
IgEの検出のためのELISA:96−ウエルポリビニルマイ
クロタイタープレートのウエルを抗マウスIgE捕捉抗体
（B1E3（2mg/ml））で４℃にて一夜コーティングし、つ
いで１％FCSを含有するPBSで37℃にて１時間ブロックし
た。プレートを再び洗浄し、上澄み液の適当な希釈液お
よび標準対照（A3B1（IgE））を37℃にて２時間かけて
加えた。プレートを充分に洗浄し、各ウエルにEM95−ビ
チオン（5mg/ml）を加え、37℃にて２時間インキュベー
トした。この時間の後、ストレプトアビジンに結合した
アルカリ−ホスファターゼをさらに２時間かけて加え
（1/500希釈）、ついでホスファターゼ基質（1mg/ml;シ
グマ・ダイアグノスティックス、セントルイス、ミズー
リ州）を加える前に充分に洗浄し、適当な変色変化を起
こさせた。410nmの吸光度をELISAリーダー（ダイナテッ
ク・ラボラトリーズ）で読み取ることにより読み取りを
行った。標準曲線と比較することによってIgの濃度を決
定し、平均＋標準誤差（ｎ＝３）として表した。
抗DNA抗体の検出のためのELISA:0.1M炭酸ナトリウム
／重炭酸ナトリウムを含有するカップリング緩衝液（pH
9.8）中でウシ胸腺DNA（シグマ、セントルイス、ミズー
リ州）を溶解した。これを10分間沸騰させ、ついで氷上
で３分間インキュベートした。ついで、このDNAのOD260
を決定し、所望の５μg/mlのDNAが得られるよう濃度を
調節した。ついで、100μｌを96ウエルポリビニルマイ
クロタイタープレートのウエルに加え、４℃にて一夜イ
ンキュベートした。ついで、プレートを３回洗浄し、１
％CFCSおよび0.02％アジ化ナトリウムを含むPBSで37℃
にて１時間ブロックした。プレートを再び洗浄し、つい
で系列希釈の血清試料を加え（100ml）、37℃にて２時
間インキュベートした。ついで、検出抗体、ヤギ抗マウ
スIgG1アルカリホスファターゼを各ウエルに加え、37℃
にて再び２時間インキュベートした。プレートを充分に
洗浄し、ホスファターゼ基質（1mg/ml;シグマ・ダイア
グノスティックス、セントルイス、ミズーリ州）を加
え、適当な発色変化を起こさせた。410nmの吸光度をELI
SAリーダー（ダイナテック・ラボラトリーズ）で読み取
ることにより読み取りを行った。抗体力価を陽性血清試
料と比較し、結果を任意の単位で表した。
ドナー由来の細胞の検出のためのフローサイトメトリ
ー分析：正常BDF1、抗gp39抗体で処理したcGVHDマウス
および処理していないcGVHDマウスから脾臓細胞を取り
出し、単一細胞懸濁液を調製した。細胞をフィコール−
ハイパック（4;1）上に重層し、ついで室温で2000rpmに
て20分間遠心分離にかけた。得られたリンパ球層を取
り、５％FCSを含有するBSSで１回洗浄した。チューブ当
たり１×106細胞を50μｌの最終容量中で染色のため用
いた。各チューブに50μｌのラット血清を加えて抗体の
非特異的結合を防いだ。細胞を（ａ）対照抗体：ラット
IgFITC（1:100最終希釈）およびPE−ストレプトアビジ
ン（1:500最終希釈）および（ｂ）FITC H−2Kbおよびビ
オチンＨ−2Dd（ともに1:100最終希釈）で染色た。細胞
を氷上で20分間インキュベートし、ついで２回洗浄して
未結合抗体を除去した。最後にPE−ストレプトアビジン
（1:500最終希釈）を適当なチューブに加えてビチオン
結合抗体を氷上でさらに20分間検出した。細胞をさらに
２回洗浄してベクトンディッキンソンFACスキャン（FAC
San）上で分析するための準備をした。前および側部ス
キャッターによる陽性ゲーティングの後、関連するMHC
ハプロタイプについて陽性の細胞のパーセントを決定す
るために試料当たり10,000の事象を集めた。
CTLアッセイの評価のためのクロム放出アッセイ:51Cr
−標識標的細胞を洗浄し、エフェクター細胞とともにE:
T比100:1、20:1および4:1にて96ウエルプレート中にウ
エル当たり１×104でプレーティングした。使用した標
的細胞には、P815（Ｈ−2d）、LB27.4（Ｈ−2bxd）およ
びc118.5（Ｈ−2b）が含まれていた。プレートを簡単に
遠心分離にかけ、ついで５％CO2中、37℃にて４時間イ
ンキュベートした。プレートをもう一度遠心分離にか
け、細胞不含上澄み液のアリコートを各ウエルから回収
してガンマカウンターでカウントした。特異的溶解パー
セントは、（ａ−ｂ）/c（式中、ａ＝エフェクター細胞
とともにインキュベートした標的細胞から放出されるcp
m、ｂ＝培地とのみインキュベートした標的細胞から放
出される（自然放出）cpm、およびｃ＝標的細胞につい
て凍結−融解放出可能なcpm（導入した全cpmの約80％）
として定義される。
急性GVHD脾臓細胞のインビトロでの二次刺激：急性GV
HD脾臓を、抗gp39抗体処理した動物、HIg処理した動
物、または未処理動物から取り出した。脾臓の赤血球を
欠失させ、ついで細胞ウエル当たり１×104のアリコー
トとした。照射したスティミュレーター細胞（P815）を
上記のように適当な標的細胞に加えた。
結果 マウスにおけるGVHDは脾腫となる マウスにおいてcGVHDの結果の一つは脾臓の肥大であ
る。これはドナー細胞の存在に応答して生じるものであ
るが、脾臓中に浸潤し肥大させるのは主として宿主自身
の細胞である（ロリンク（Rolink,A.G.）ら（1983）J.E
xp.Med.158:546）。図５は、cGVHDの開始から７〜14日
後には、脾臓がcGVHDのないマウスに比べてほとんど２
倍の数の白血球を含むことを示している。cGVHDの開始
のときにマウスを抗gp39抗体で処理すると（250μg/マ
ウス、第０日目、２日目、４日目、および６日目）、cG
VHDマウス中の白血球／脾臓の数が疾患のないマウスと
同等の値まで減少する。
GVHDによって誘導されたポリクローナル免疫グロブリン
の過剰産生 cGVHDを有するマウスではドナーＴ細胞とＢ細胞との
間の同族相互作用のためにIgの過剰産生が起こることが
報告されている（モリス（Morris,S.E.）ら（1990）J.E
xp.Med.171:503）。抗gp39抗体がIgの過剰産生を抑制す
るかどうかを決定するため、cGVHDを有するマウスに抗g
p39抗体を投与した。第７日目または14日目に対照およ
びcGVHDマウスから脾臓を取り出し、インビトロでのIgG
1およびIgAの自然産生についてＢ細胞をアッセイした。
cGVHDを有するマウスの脾臓細胞はインビトロで高レベ
ルのIgAおよびIgG1を産生した（図6Aおよび6B）。しか
しながら、cGVHDを有し抗gp39抗体で処理した（第０日
目、２日目、４日目および６日目）マウスでは、疾患を
有しないマウスと同等のレベルでIgG1およびIgAを産生
した。cGVHDを有するマウスの脾臓細胞の培養液に抗gp3
9抗体を加えてもインビトロでのIg産生レベルは減少せ
ず、抗gp39抗体がインビボでその作用を発揮することが
示唆された。
これら実験においてハムスターIg（HIg）を対照とし
て用いると、GVHDの誘導において何ら抑制的役割を示さ
ず、実際にはポリクローナルIgの産生のみならず結果と
しての脾腫においても該疾患が強調されることがわかっ
た。未処理の１週間GVHD誘導マウスに比べ、１週間HIg
処理したGVHD誘導マウスにより産生されるIgのレベルは
８倍増加することが検出された。HIgはそれ自体免疫原
であることは明白であった。従って、未処理のF1受容マ
スクを関連対照群と表示することに決定した。
GVHDにより誘導された血清の過剰なIgEおよび抗DNA自己
抗体に対する抗gp39抗体の作用 cGVHDの経過は、血清IgEおよび二本鎖DNAに対する抗
体の上昇によりモニターできる（モリスら（1990）J.Ex
p.Med.171:503）。血清IgEレベルはIgE特異的なELISAを
用いて測定した。慢性GVHDが誘導されたマウスを抗gp39
抗体で第０日目、２日目、４日目および６日目に処理
し、その後、何ら抗体を投与しなかった。マウスを１週
間毎に採血し、血清IgEレベルを確かめた（図7A）。cGV
HDは血清IgEレベルを10〜15倍増加させる。抗gp39抗体
の投与は、cGVHDによって誘導された血清IgEの増加を疾
患の開始から８週間後まで抑制した。上昇血清IgEの抑
制に加え、抗gp39抗体の投与はまた血清の抗DNA自己抗
体の生成を阻止した。慢性GVHDは抗DNA抗体のレベルを
５〜10倍上昇させるが、これが抗gp39抗体処理によって
減少した（図7B）。
以前の研究によると抗gp39抗体（MR1クローン）の半
減期は12日ある（フォイら（1993）J.Exp.Med.178:1567
〜1575）。抗gp39抗体の検出に特異的なELISAアッセイ
は、治療後８週間の処理マウスの血清で抗gp39抗体が検
出されないことを示している。それゆえ、持続する抗gp
39抗体ではcGVHDの長引いた抑制を説明できない。cGVHD
を有するマウスおよび抗gp39抗体を投与したマウスから
の脾臓細胞がcGVHDを転移しうるか否かを調べるため、
転移研究を行った。cGVHDおよび抗gp39抗体を受けた脾
臓細胞は養子転移（adoptive transfer）によりIgEおよ
び抗DNA自己抗体の上昇血清レベルを誘導できなかった
が、一方、cGVHDを有するマウスの脾臓細胞は高められ
たsIgEおよび抗DNA抗体を誘導した。これらデータは、
アロ反応性のＴ細胞が誘導されて抗gp39抗体処理の結
果、非応答性になったことを示唆している。
アロ反応性のドナー細胞の検出 ドナー由来の細胞の脾臓内での存在についてcGVHD誘
導したマウスを分析したところ、Ｈ−2KbおよびＨ−2Dd
に対して二重に陽性に染色される正常なBDF1と比べ、cG
VHDは約５〜７％のドナー細胞を有していた。これら細
胞はDBA/2由来であり、それゆえＨ−2Ddに対してのみ陽
性に染色される。これら細胞は抗gp39抗体処理とは無関
係に検出された。このことは、未処理のcGVHD群におい
てポリクローナルIgの産生をもたらす受容Ｂ細胞に対す
るヘルパー機能を生じさせることなく抗gp39抗体処理が
ドナー細胞の移植を可能とする時点を示している。
急性GVHDの誘導に対する抗gp39抗体処理の効果 急性GVHDは、増大した抗同種CTL応答の誘導を伴う。g
p39−CD40相互作用がTh−Ｂ細胞相互作用に重要である
ことは明らかであるが、他の免疫エフェクター機構の誘
導もまた抗gp39抗体療法によって変化を受けるのかどう
かについては明らかではない。AGVHDをF1受容者にC57BL
/6脾臓を投与することにより誘導した。図８に示すよう
に、同種細胞の移植から12日後に強いＨ−2b抗Ｈ−2dCT
L応答が測定される。マウスをHIgではなく抗gp39抗体で
処理すると、Ｈ−2b抗Ｈ−2dCTLの生産が妨害された
（図８）。２つの実験のうち一つにおいて、抗gp39抗体
で処理するとCTL応答が未感作脾臓細胞で観察されるも
のよりも低い程度まで減少した。このことは、攻撃した
ときにGVHDマウスからの脾臓細胞を示唆した。ついで、
これら脾臓細胞を照射P815細胞の存在下で７日間培養
し、ついでCTLアッセイを行うと、これら細胞は該P815
細胞に対して二次刺激を起こさなかったが、正常なBDF1
脾臓は一次応答を起こした。未処理のaGVHD誘導マウス
は、予想通り二次免疫応答を起こした。これら結果は、
急性GVHDマウスを抗gp39抗体で処理するとCD8＋集団が
二次攻撃に対して非応答性になることを示している。
考案 抗gp39抗体投与によるGVH誘導マウスにおける脾腫の
逆転（図５）、過剰Ig産生の抑制（第6Aおよび6B）、Ig
Eおよび抗DNA自己抗体産生の血清レベルの抑制（図7Aお
よび7B）は、抗gp39抗体が移植したＴ細胞が宿主Ｂ細胞
活性化を誘導する能力を阻止することを示唆している。
この脾腫およびポリクローナルIgG1およびIgA産生の抑
制は抗体投与終了の７日後に低いままである。IgEおよ
び抗DNA抗体の減少は、該処理の終了後８週間持続す
る。これら結果は、反応性Ｔ細胞のクローン性欠失かま
たはＴ細胞アネルギーが起こったかのいずれかによりＴ
細胞機能が影響を受けたことを示している。サイトカイ
ン産生細胞レベルは抗体処理マウスにおいて正常のまま
であることが免疫マウスのインシトゥ研究において以前
に示されている（ファン・デン・アートウエ（Van den
Eertwegh）ら（1993）J.Exp.Med.178:1555〜1565）。こ
のことは該処理の結果としてＴ細胞が欠失しないことを
示している。cGVHDマウスをドナー由来細胞の存在につ
いて分析すると、未処理であるか抗gp39抗体で処理した
かに関係なく存在することがわかった。それゆえ、抗gp
39抗体は、これらドナーＴ細胞に非応答性の状態を誘導
する能力を有し、抗体応答の抑制を引き起こす。実際、
これら動物の脾臓を未感作の受容者に移植すると、ドナ
ーの脾臓が未処理のcGVHDである場合に抗体レベルが上
昇するが、抗gp39抗体処理したcGVHDマウスは移植後に
二次cGVHD状態を生じさせることができない。このデー
タは、抗gp39抗体がＴ細胞が強いGVHD臨床免疫病理学お
よび脾腫を引き起こす能力を妨害すること、抗体投与が
CD4+サブ集団に非応答性を引き起こすことを示唆してい
る。
フリーンド（Friend）マウス白血病ウイルス誘発白血
病に対する防御Ｔ細胞免疫を誘導させるためのＢ細胞欠
失マウスの研究によって認められるように、CTLの誘導
のためにヘルプを提供するにはＢ細胞が必要である（シ
ュルツ（Schultz,K.R.）ら（1990）Science249）。それ
ゆえ、aGVHD誘導マウスにおいて抗gp39抗体はＢ細胞の
活性化を抑制し、それゆえ抗原の提示を妨害し、かくし
てCD8+T細胞を感作するものと思われる。CD8+CTLの生成
にはクラスII制限（class II−restricted）Th細胞が必
要であること（フォン・ベーマー（von Boehmer,H.）ら
（1979）J.Exp.Med.150:1134;キーン（Keene,J.）ら（1
982）J.Exp.Med.155:768）およびTCR親和性が低い場合
にはCD4＋媒介Ｔ細胞ヘルプがインビボで必要であるこ
ともまた示唆されている（ガオ（Gao,X.）ら（1991）J.
Immunol.147:3268）。
CD8＋CTL応答の誘導におけるCD28−B7/BB1相互作用の
役割を考案する研究が行われている。CD28−B7/BB1相互
作用はクラスＩ MHC特異的CTLの生成に必要であり充分
であることがわかった（ハーディング（Harding,F.A.）
およびアリソン（Allison,J.P.）（1993）J.Exp.Med.17
7:1791）。CD40に対する抗体による正常および白血病Ｂ
細胞でのB7発現の抑制を含む研究によって示されるよう
に、CD40のリガンドがB7の重要なインデューサーである
かもしれないことが示唆されている（ランハイム（Ranh
eim,E.A.）およびキップス（Kipps,T.J.）（1993）J.Ex
p.Med.177:925）。以上を総合すると、これら研究は、
抗gp39抗体は、CD4＋Ｔ細胞とＢ細胞との相互作用を阻
止することによって、増殖およびサイトカインの産生を
可能とするほど充分にＢ細胞がＴ細胞を活性化させるよ
うにするB7の発現を誘導できないようにすることを示し
ている。以上を要するに、このデータは、まずgp39とそ
のリガンドCD40との間のＴ−Ｂ細胞同族相互作用による
CTL生成の誘導にCD4＋Ｔ細胞が必要であることを示唆し
ている。ついで、Ｂ細胞上のCD40のシグナル生成（sign
aling）はB7/BB1を上方制御（upregulation）する。つ
いで、B7/BB1とＴ細胞上のリガンドCD28との相互作用が
Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を促進させる。しか
しながら、Ｔ細胞に一つのシグナルのみが提供される、
すなわちgp39とCD40との相互作用のみの場合には、第二
のシグナルは得られない。ついで、Ｔ細胞において非応
答性が誘導され、寛容となり、またはアネルギーとな
る。
これら研究は、aGVHDがマウスに誘導される場合には
抗Ｈ−2d応答が得られることを示している。しかしなが
ら、動物を抗gp39抗体で処理するとCTL応答は得られな
い。抗gp39抗体は、以前に記載された方法によって（シ
ュルツら（1990）Science249）CTL生成を抑制すること
が明らかである。Ｂ細胞はCD40結合によって活性化され
えず、それゆえCTLの誘導を促進することができない。
さらに、本発明者らの研究は、脾臓細胞をインビトロで
P815細胞で攻撃した場合に、抗gp39抗体にイビボで暴露
された細胞は二次抗Ｈ−2dCTLを起こさせることができ
ないことを示している。それゆえ、このことは、抗gp39
抗体がＴ細胞区画に寛容の状態を誘導したことを示して
いる。なぜなら、gp39はCD40に結合することができない
からであり、かくしてB7/BB1上方制御は存在せず、それ
ゆえＴ細胞はさらに活性化されることなく非応答性のま
まである。また、休止Ｂ細胞は、抗IgM抗体、PMAまたは
LPSで前以て活性化されない限り、混合リンパ球反応に
おいて同種Ｔ細胞の効果のないスティミュレーターであ
ることも知られている（イナバ（Inaba,K.）およびステ
インマン（Steinman,R.M.）（1989）J.Exp.Med.160:171
7;メットレイ（Metley,J.P.）ら（1989）J.Exp.Med.16
9:239;フローマン（Frohman,M.）およびカウイング（Co
wing,C.）（1985）J.Immunol.134:2269）。加えて、イ
ンビボでの提示のためのＢ細胞に向けられた可溶性のモ
ノマー抗原は特異的Ｔ細胞アネルギーとなる（エイノン
（Eynon,E.E.）およびパーカー（Parker,D.）（1992）
J.Exp.Med.175:131）。それゆえ、関与する抗原およびA
PCの投与法に依存してアネルギーまたは寛容が誘導され
ることが明らかであると思われる。脾臓のCD8＋Ｔ細胞
区画にP815細胞を攻撃させると、抗原提示のためにＢ細
胞は必要ではなく、かくしてアロ抗原を直接提示するこ
とができ、CTLを誘導することができる。該脾臓の二次
刺激への非応答性は、この系においてアロ特異的な寛容
が誘導されたことを示している。
このことは、抗原特異的な系において抗体によって寛
容が誘導されないことを示す以前の研究（フォイら（19
93）J.Exp.Med.178:1567〜1575）と反対である。これら
２つの系は異なる。というのは、aGVHDモデルは抗原提
示細胞にすでに結合したアロ抗原を提示するのに対し
て、抗原特異的な系では抗原を投与し、インビボで取り
込み、プロセスを受け、プロフェッショナルAPCによっ
て提示されるからである。それゆえ、抗gp39抗体は使用
した抗原および提示方法に依存して異なる効果を有す
る。
抗gp39抗体は免疫系のCD4＋およびCD8＋区画の両方に
おいてアロ特異的な寛容を誘導すること、およびこのこ
とは移植免疫学および免疫療法を考慮する場合に明らか
に有利な治療学的介入であることが結論付けられる。骨
髄移植を受けている患者の治療において、抗gp39抗体療
法は該移植に対する寛容を誘導するに充分であり、GVHD
などのような移植処置による結果の誘導を防ぐであろう
ことが考えられる。
実施例6:抗gp39抗体の産生および特徴付け 実験１−ヒトgp39に対する抗体 ヒト被験者において抗原特異的なＴ細胞寛容を誘導す
るには、ヒトgp39に対する抗体を投与するのが好まし
い。マウス抗ヒトgp39モノクローナル抗体を作製するた
め、以下の方法を用いた。Balb/cマウスを完全フロイン
トアジュバント（CFA）中の可溶性gp39融合タンパク
質、gp39−CD8で免疫した。引き続き、マウスを不完全
フロイントアジュバント（IFA）中の可溶性gp39−CD8で
６週間後に攻撃した。二次免疫の４週間後に可溶性gp39
−CD8を可溶性の形態で与えた。ついで、２週間後にマ
ウスを活性化ヒト末梢血リンパ球でブースター処理し、
ついでさらに２週間後に活性化gp39−CD8で最後のブー
スター処理を行った。最後の免疫から４日目に標準プロ
トコールに従って脾臓細胞をNS−１融合相手と融合させ
た。
抗gp39抗体を産生する細胞を、複数スクリーニング法
に基づいて選択した。クローンをまず、gp39−CD8を用
いたプレート結合アッセイによりスクリーニングした。
ついで、陽性のクローンを対照のCD8融合タンパク質で
あるCD72−CD8に対してスクリーニングした。CD8−CD72
プレート結合アッセイで陽性とされたクローンを排除し
た。残ったクローンを、引き続き休止および６時間活性
化ヒト末梢血リンパ球（PBL）上でスクリーニングし、
ついでフローサイトメトリー分析を行った。活性化され
たPBLは染色するが休止PBLは染色しないハイブリドーマ
を陽性とした。最後に、残りのクローンをgp39の結合し
たプレートへのCD40Igの結合を阻止する能力について試
験した。
プレート結合アッセイにおいて、約300クローンがgp3
9−CD8およびCD72−CD8に対して最初にスクリーニング
された。これらクローンのうち、30のクローンはプレー
トに結合したgp39を検出するがCD8は検出しないことが
わかった。引き続き、これらクローンを活性化ヒトPBL
上のgp39の検出についてスクリーニングした。約15のク
ローンが活性化PBL上の分子検出したが、休止細胞上の
分子は検出しなかった。これらクローンがプレートに結
合したgp39のCD40Ig検出を阻止する能力を決定すること
により特異性をさらに確認した。10のクローンのうち３
つのクローンが、このアッセイにおいてCD40Ig結合を阻
止することが試験された。これらクローンは、3E4、2H5
および2H8であった。かかるクローンは本発明の方法に
使用するのに好ましい。活性化PBLでは陽性だが休止PBL
では陽性ではないと試験されたクローンを、活性化され
たラットＴ細胞クローンであるPOMC8との反応性につい
てもスクリーニングした。クローン2H8はこのラットＴ
細胞株との交差反応性を示した。
実験２−ヒトgp39に対する抗体 実験１と同様の免疫手順を用い、ヒトgp39に対する別
の抗体を産生させた。１匹のBalb/cマウスをCFA中の可
溶性gp39−CD8で免疫し、ついで４週間後に６時間活性
化ヒト末梢血リンパ球で攻撃した。脾臓細胞をNS−１融
合相手と標準プロトコールに従って融合させる４日前
に、マウスを可溶性gp39−CD8でブースター処理した。
ハイブリドーマクローンのスクリーニングを６時間活性
化ヒトPBLのフローサイトメトリー染色により行った。
活性化ヒトPBLは染色するが休止ヒトPBLは染色しないク
ローンを選択した。６つのクローン、4D9−８、4D9−
９、24−31、24−43、89−76および89−79を選択し、さ
らに分析した。
これら選択した抗体の特異性を幾つかのアッセイによ
り確認した。まず、フローサイトメトリー分析は、６つ
のすべてのmAbが活性化末梢血Ｔ細胞を染色するが休止
末梢血Ｔ細胞は染色しないことを示した（代表的な例に
ついて図9Bおよび9Cを参照、それぞれ、活性化Ｔ細胞の
4D9−８および4D9−９による染色を示す）。これら６つ
の抗体のそれぞれによって認識される分子の発現は、活
性化の４時間以内には検出可能であり、活性化の６〜８
時間で最大であり、活性化の24時間後には検出できな
い。６つのすべてのmAbは活性化CD3+PBL上に発現される
分子（主としてCD4＋表現型の）を認識するが、CD8+T細
胞の一部もまた該分子を発現する。これら６つのmAbに
よって認識される分子の発現は、gp39の発現と同様に培
地中のシクロスポリンＡの存在によって抑制される（代
表的な例について図10Aおよび10Bを参照、それぞれ、シ
クロスポリン処理Ｔ細胞の4D9−８および4D9−９による
染色を示す）。これら６つのmAbによって認識される分
子の発現の動力学および分布をヒトCD40Igの融合タンパ
ク質によって検出されるようにgp39のものと同一であ
る。加えて、これら６つのすべてのmAbはCD40Igによるg
p39の染色を阻止する（代表的な例について図11Aおよび
11Bを参照、それぞれ、4D9−８および4D9−９の存在下
でのCD40Igによるgp39染色の抑制を示す）。ELISAアッ
セイにおいて、これら６つのすべてのmAbは可溶性融合
形態のgp39分子であるgp39−CD8を認識する。さらに、
これら６つのすべてのmAbは、35S−メチオニン標識した
活性化ヒトPBLから約36kdの分子を免疫沈降させる。こ
の免疫沈降した分子は、ヒトCD40Ig融合タンパク質によ
って沈降したものと同一である。
上記６つのの選択したmAb（4D9−８、4D9−９、24−3
1、24−43、89−76および89−79）の機能的活性を以下
のようにしてアッセイした。まず、IL−４および可溶性
gp39とともに培養した精製ヒトＢ細胞の増殖をmAbが抑
制する能力を測定した。精製ヒトＢ細胞を、精製モノク
ローナル抗体またはCD40Ig（０〜12.5μg/mlの範囲の投
与量）の存在下または不在下でgp39およびIL−４ととも
に培養した。培養３日後にチミジン導入によりＢ細胞増
殖を決定した。得られた結果（図12に示す）は、６つの
すべてのmAbがgp39およびIL−４によって誘導されるＢ
細胞増殖を抑制しうることを示している。mAb89−76お
よび24−31は誘導Ｂ細胞増殖の抑制において最も効果的
であった。IC50（Ｂ細胞増殖を50％抑制するのに必要な
抗体の濃度）は、89−76については約１μg/ml、24−31
については約1.25μg/mlであった。
つぎに、抗CD3抗体活性化Ｔ細胞およびIL−２によっ
て誘導されるIg産生により測定されるように、Ｂ細胞分
化をmAbが抑制する能力を調べた。精製IgD+ヒトＢ細胞
をFACSによる陽性選択により調製し、ついで精製抗gp39
モノクローナル抗体（０〜10μg/mlの範囲の投与量）の
存在下または不在下、抗CD3抗体活性化ヒトＴ細胞（マ
イトマイシンＣ処理）およびIL−２とともに６日間培養
した。IgM、IgGおよびIgA産生を第６日目にELISAにより
評価した。得られた結果（下記表３に示す）は、IgM、I
gGおよびIgA産生によって測定されるように、これら６
つのすべての抗体はＴ細胞依存性Ｂ細胞分化を抑制しう
ることを示している。IC50（Ig産生を50％抑制するのに
必要な抗体の濃度）は、24−31抗体および89−76抗体を
含む上記６つのmAbについて1.0μg/mlから0.1μg/ml未
満の範囲であった。
Ｔ細胞応答に対する抗gp39mAbの作用を調べるため、
これらmAbを標準混合リンパ球反応（MLR）中に含めた。
300,000個のヒト末梢血リンパ球（レスポンダー＝Ｒ）
を抗gp39mAb（10μg/ml）の存在下または不在下、100,0
00個の照射同種末梢血リンパ球（スチィミュレーター＝
Ｓ）とともに培養した。培養液を第４日目、５日目また
は６日目に3H−チミジンでパルス標識し、18時間後に回
収した。６つのすべての抗ヒトgp39mAbは、MLRによって
測定されるようにアロ特異的応答を抑制した（代表的な
例について図13を参照、ＲおよびＳを24−31および89−
76の存在下でインキュベートした場合のアロ特異的応答
の抑制を示す;CTLA4−免疫グロブリン融合タンパク質お
よび抗CD28mAbを正の対照として用いた）。
上記６つのmAbがヒトgp39分子上の異なるエピトープ
を認識するのかどうかを決定するため、交差実験を行っ
た。まず、活性ヒトPBLを上記６つのmAbのそれぞれで阻
止した（25μg/mlの未結合抗体）。細胞を洗浄し、つい
で10μg/mlのビオチン結合抗体で染色し、ついでフィト
エリトリン（phytoerythrin）結合アビジン（PE−Av）
と反応させた。PE−Avでの細胞の染色をFACSにより分析
した。その結果を下記表４に示す。
染色の強度および陽性細胞のパーセントを＋の記号で
示す（＋＋＋＋＝MI＞200;＋＋＋＝MI＞125;＋＋＝MI＞
50;＋＝MI＞25;−＝バックグラウンドを越える染色な
し）。ND＝決定せず。
すべての抗体が活性化ヒトPBLへのCD40Igの結合を阻
止した。しかしながら、表４に示すデータは、幾つかの
抗体は他の抗体が活性化ヒトPBLに結合するのを阻止で
きないことを明らかに示しており、これらがヒトgp39分
子上の異なるエピトープを認識することを示唆してい
る。
89−76抗体および24−31抗体をそれぞれ産生する89−
76および24−31ハイブリドーマは、ブダペスト条約の規
定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン、パークローンドライブ、ロックビル、メリーラン
ド州に1994年９月２日に寄託してある。89−76ハイブリ
ドーマはATCC受託番号HB11713、24−31ハイブリドーマ
はATCC受託番号HB11712を与えられた。24−31抗体およ
び89−76抗体はIgG1イソタイプである。
実験３−マウスgp39に対する抗体 本発明の一つの態様にいて、gp39アンタゴニストは抗
マウスgp39モノクローナル抗体、MR1である。以下の方
法を用いてMR1モノクローナル抗体を作製し、gp39に対
する他の抗体を作製するのにも用いることができる。
ハムスターを５〜106個の活性化Th1細胞（d1.6）で１
週間間隔で６週間腹腔内免疫した。マウスTh1に対する
血清力価が約1:10,000よりも大きいときに、免疫ハムス
ターの脾臓細胞およびNS−１を用いてポリエチレングリ
コールで細胞融合を行った。増殖するハイブリドーマを
含むウエルからの上澄み液を休止Th1および活性化Th1に
対するフローサイトメトリーによりスクリーニングし
た。活性化Thを選択的に認識するMabを産生した一つの
特定のハイブリドーマをさらに試験し、サブクローニン
グしてMR1を得た。MR1は腹水中で産生され、イオン交換
HPLCにより精製した。ハイブリドーマMR1はアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託してあり、
受託番号HB11048を与えられた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ＨＢ１１７１３ 早期審査対象出願 (72)発明者 フォイ，テレサ・エム アメリカ合衆国98104ワシントン、シア トル、コロンビア・ストリート1124番ス イート464 (72)発明者 アルフォ，アレジャンドロ アメリカ合衆国98030ワシントン、エド モンズ、スプルース・ストリート1812番 (72)発明者 レドベター，ジェフリー・エイ アメリカ合衆国98177ワシントン、シア トル、ノース・ウエスト・ワンハンドレ ッドアンドサーティーンス・プレイス 306番 (56)参考文献 国際公開93／8207（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 16/00 C12N 15/00 C12P 21/08 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ)

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】IgG1イソタイプの抗ヒトgp39モノクローナ
    ル抗体。
  2. 【請求項２】標準インビトロアッセイにおいてＢ細胞増
    殖を約0.01〜5.0μg/mlのIC50にて抑制する、請求項１
    に記載の抗ヒトgp39モノクローナル抗体。
  3. 【請求項３】標準インビトロアッセイにおいてＢ細胞増
    殖を約0.1〜2.5μg/mlのIC50にて抑制する、請求項２に
    記載の抗ヒトgp39モノクローナル抗体。
  4. 【請求項４】標準インビトロアッセイにおいてＢ細胞増
    殖を約0.1〜1.25μg/mlのIC50にて抑制する、請求項３
    に記載の抗ヒトgp39モノクローナル抗体。
  5. 【請求項５】Ｂ細胞増殖が、Ｂ細胞をインターロイキン
    −４および可溶性gp39で処理することによってインビト
    ロで誘導される、請求項２に記載の抗ヒトgp39モノクロ
    ーナル抗体。
  6. 【請求項６】標準インビトロアッセイにおいてIgM、IgG
    またはIgAのＢ細胞産生を約0.01〜1.0μg/mlのIC50にて
    抑制する、請求項１に記載の抗ヒトgp39モノクローナル
    抗体。
  7. 【請求項７】標準インビトロアッセイにおいてIgM、IgG
    またはIgAのＢ細胞産生を約0.01〜0.1μg/mlのIC50にて
    抑制する、請求項６に記載の抗ヒトgp39モノクローナル
    抗体。
  8. 【請求項８】IgM、IgGまたはIgAのＢ細胞産生がＢ細胞
    を抗CD3活性化Ｔ細胞とともに培養することにより誘導
    される、請求項６に記載の抗ヒトgp39モノクローナル抗
    体。
  9. 【請求項９】モノクローナル抗体24−31またはモノクロ
    ーナル抗体89−76によって認識されるエピトープに結合
    する抗ヒトgp39モノクローナル抗体。
  10. 【請求項１０】モノクローナル抗体24−31によって認識
    されるエピトープに結合する請求項９に記載の抗ヒトgp
    39モノクローナル抗体。
  11. 【請求項１１】モノクローナル抗体24−31である請求項
    10に記載の抗ヒトgp39モノクローナル抗体。
  12. 【請求項１２】ATCC受託番号HB11712で表示されるハイ
    ブリドーマ24−31。
  13. 【請求項１３】請求項12に記載のハイブリドーマによっ
    て産生されたモノクローナル抗体24−31。
  14. 【請求項１４】モノクローナル抗体89−76によって認識
    されるエピトープに結合する請求項９に記載の抗ヒトgp
    39モノクローナル抗体。
  15. 【請求項１５】モノクローナル抗体89−76である請求項
    14に記載の抗ヒトgp3モノクローナル抗体。
  16. 【請求項１６】ATCC受託番号HB11713で表示されるハイ
    ブリドーマ89−76。
  17. 【請求項１７】請求項16に記載のハイブリドーマによっ
    て産生されたモノクローナル抗体89−76。
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