FI105528B - Menetelmiä antigeenispesifisen T-solutoleranssin indusoimiseksi - Google Patents
Menetelmiä antigeenispesifisen T-solutoleranssin indusoimiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI105528B FI105528B FI960980A FI960980A FI105528B FI 105528 B FI105528 B FI 105528B FI 960980 A FI960980 A FI 960980A FI 960980 A FI960980 A FI 960980A FI 105528 B FI105528 B FI 105528B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cell
- cells
- antigen
- antibody
- att
- Prior art date
Links
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 175
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 98
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 98
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 97
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 75
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 199
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims abstract description 123
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 claims abstract description 123
- 101000759376 Escherichia phage Mu Tail sheath protein Proteins 0.000 claims abstract description 121
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 103
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims abstract description 54
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 42
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 38
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 28
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims abstract description 25
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 27
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 22
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 21
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 claims description 18
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 12
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 claims description 6
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 claims description 6
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 claims description 3
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims 3
- 230000001773 anti-convulsant effect Effects 0.000 claims 2
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 claims 2
- 229960003965 antiepileptics Drugs 0.000 claims 2
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 claims 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims 2
- RNPABQVCNAUEIY-GUQYYFCISA-N Germine Chemical compound O1[C@@]([C@H](CC[C@]23C)O)(O)[C@H]3C[C@@H](O)[C@@H]([C@]3(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]4[C@]5(C)O)[C@@]12C[C@H]3[C@@H]4CN1[C@H]5CC[C@H](C)C1 RNPABQVCNAUEIY-GUQYYFCISA-N 0.000 claims 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 claims 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 claims 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 claims 1
- 229910052787 antimony Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 claims 1
- 108010020084 germin Proteins 0.000 claims 1
- RNPABQVCNAUEIY-UHFFFAOYSA-N germine Natural products O1C(C(CCC23C)O)(O)C3CC(O)C(C3(O)C(O)C(O)C4C5(C)O)C12CC3C4CN1C5CCC(C)C1 RNPABQVCNAUEIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 abstract description 22
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 abstract description 15
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 5
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 82
- 230000004044 response Effects 0.000 description 53
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 47
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 46
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 28
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 28
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 26
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 22
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 22
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 21
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 10
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 10
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 10
- 101710131437 Gene 39 protein Proteins 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 9
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 108010066813 Chitinase-3-Like Protein 1 Proteins 0.000 description 8
- 102000018704 Chitinase-3-Like Protein 1 Human genes 0.000 description 8
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 8
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 230000003172 anti-dna Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 6
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 101001115846 Bos taurus Melanocyte-stimulating hormone receptor Proteins 0.000 description 2
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 2
- 208000017760 chronic graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 2
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000019838 Blood disease Diseases 0.000 description 1
- 206010048396 Bone marrow transplant rejection Diseases 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108700042658 GAP-43 Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 235000002296 Ilex sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002294 Ilex volkensiana Nutrition 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 101710146021 Kinin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 101100394237 Mus musculus Hand1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710126321 Pancreatic trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 101710198346 Snaclec 5 Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 201000001322 T cell deficiency Diseases 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000021375 Xenogenes Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 208000024340 acute graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011256 aggressive treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- -1 coatings Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003677 hemocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940000351 hemocyte Drugs 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001400 myeloablative effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108010043277 recombinant soluble CD4 Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
5 % 105528
Menetelmiä antigeenispesifisen T-solutoleranssin indusoimi-seksi - Metoder for inducering av antigenspecifik T-cellto-lerans
Keksinnön tausta
Lepäävien T-solulymfosyyttien pinnalle täytyy saapua kaksi signaalia, jotka antaa kaksi antigeenin tarjoavaa solua (APC-10 s), jotta antigeenispesifinen T-soluaktivaatio ja kloonin laajeneminen saadaan aikaan (Jenkins, M. Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165, 302 - 319; Mueller, D. L., et ai. (1990) J. Immunol. 144, 3701 - 3709; Williams, I.R. ja Unanue, E.R.
(1990) J. Immunol. 145, 85 - 93). T-solureseptorin (TCR) 15 kautta välitetään ensimmäinen signaali, joka antaa immuunivasteelle spesifisyyttä, minkä jälkeen suurimman histokompa-tibiliteettikompleksin (MHC) yhteydessä tarjottu, vieras an-tigeenipeptidi tunnistetaan. Yhteisstimulaatioksi nimitetty toinen signaali saa aikaan T-solujen jakaantumisen sekä sen, 20 että niistä tulee toiminnallisia (Schwartz, R. H. (1990) Science 248, 1349 - 1356). Yhteisstimulaatio ei ole antigeenispesif inen eikä se rajoitu MHC:n, ja arvellaan, että sen saa aikaan yksi tai useampi erilainen solun pintamolekyyli, i·. jota tai joita APC:t ilmentävät (Jenkins, M. K., et ai.
!! 25 (1988) J. Immunol. 140, 3324 - 3330; Linsley, P.S., et ai.
(1991) J. Exp. Med. 173, 721 - 730; Gimmi, C.D. et ai., ’···' (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 88, 6575 - 6579; Young, J.
V:.: W., et ai. (1992) J. Clin. Invest. 90, 229 - 237: Koulova, • · « · L., et ai. (1991) J. Exp. Med. 173, 759 - 762, Reiser, H., et 30 ai. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 89, 271 - 275; van- : Seventer, G. A., et ai. (1990) J. Immunol. 144, 4579 - 4586; • · 9 ' .·:·; LaSalle, J. M., et ai., (1991) J. Immunol. 147, 774 - 80; * *. Dustin, M. I., et ai., (1989) J. Exp. Med. 169, 503, Armita- M * ge, R. J., et ai. (1992) Nature 357, 80 - 82; Liu, Y., et ai.
' I·'35 (1992) J. Exp. Med. 175, 437 - 445). Yhteen yhteisstimulaa- tiotiehen, joka kuuluu T-soluaktivaatioon, sisältyy T-solujen pinnalla sijaitseva molekyyli CD28. Tämä molekyyli voi ottaa vastaan yhteistimulaatiosignaalin, jonka B-solujen tai muiden 2 105528 APC:iden pinnalla sijaitseva ligandi lähettää. Ligandit CD2-8: aa varten sisältävät B-lymfosyyttiaktivaatioantigeenien B7-perheen jäseniä, kuten B7-l:n ja (tai) B7-2:n (Freedman, A.
S., et ai. (1987) J. Immunol. 137, 3260 - 3267; Freeman, G.J.
5 et ai. (1989) J. Immunol. 143, 2714 - 2722; Freeman, G. J., et ai. (1991) J. Exp. Med. 174, 625 - 631; Freeman, G. J., et ai. (1993) Science 262, 909 - 911; Azuma, M., et ai., (1993) Nature 366, 76 - 79; Freeman, G. J. et ai. (1993) J. Exp.
Med. 178, 2185 - 2192). B7-1 ja B7-2 ovat myös ligandeja 10 toista molekyyliä CTLA4:ää varten, joka sijaitsee aktivoitujen T-solujen pinnalla, vaikka CTLA4:n rooli yhteisstimulaa-tiossa on epäselvä.
Kun T-solulle annetaan antigeenille spesifinen signaali yh-15 teisstimulaation signaalin kanssa, tämä tapahtuma johtaa T-solun aktivaatioon, johon voi sisältyä sekä T-solun uusien solujen tuotto, proliferäätio, että sytokiinin erittyminen. Sitävastoin jos T-solu saa antigeenille spesifisen signaalin ilman yhteisstimulaation signaalia, ajatellaan, että T-solus-20 sa indusoituu tällöin epäherkkyystila tai energian häviö, mikä saa aikaan mainitussa solussa antigeenille spesifisen toleranssin.
: T- ja B-solujen väliset vuorovaikutukset esittävät keskeistä 25 roolia immuunivasteissa. Humoraalisen immuniteetin induktio tyymuksesta riippuvaisia antigeenejä kohtaan tarvitsee .···. "apua", jota T-auttajasolut (tässä yhteydessä myöhemmin nimi- ,**·, tetty Th-soluiksi) antavat. Samalla kun Th-solujen vapautta- • · · IJI mat liukoiset molekyylit (esimerkiksi lymfokiinit, kuten IL-4
III
• 30 ja IL-5) välittävät apua, jota annetaan B-lymfosyyteille, viimeksi mainittujen solujen aktivaatioon tarvitaan myös B- • « · M.' ja Th-solujen välistä vuorovaikutusta, jolle kosketus on • · · V · välttämätöntä. Hirohata et ai., J. Immunol., 140, 3736 - 3744 .j. (1988); Bartlett et ai., J. Immunol., 143, 1745 - 1754 * f · · 35 (1989) . Tämä ilmaisee, että B-solun aktivaatioon sisältyy välttämätön vuorovaikutus B- ja Th-solujen pintamolekyylien välillä. T-solun pinnan molekyylit välittävät siis kosketusta M · • · • v 3 105528 edellyttäviä T-solujen auttajaefektoritoimintoja. B- ja T-solujen välistä vuorovaikutusta, jonka edellytyksenä on kosketus, tukee havainto, jonka mukaan aktivoitujen T-solujen eristetyt plasmamembraanit voivat saada aikaan auttajatoimin-5 toja,. jotka ovat välttämättömiä B-solun aktivaatiolle. Brian, Proc. Natl. Acad Sei. USA, 85, 564 - 568 (1988); Hodgkin et ai., J. Immunol., 145, 2025 - 2034 (1990); Noelle et ai., J. Immunol., 146, 1118 - 1124 (1991).
10 Kypsymättömien ja kypsien B-solujen pinnalla on identifioitu molekyyli CD40, joka saa aikaan B-solun proliferaation, kun vasta-aineet silloittavat sen. Valle et ai., Eur. J. Immunol., 19, 1463 - 1467 (1989), Gordon et ai., J. Immunol., 140, 1425 - 1430 (1988); Gruber et ai., J. Immunol., 142, 15 4144 - 4152 (1989). CD40-molekyyli on kloonattu ja luonneh
dittu. Stamenkovic et ai., EMBO J., 8, 1403 - 1410 (1989). CD40:n ligandin gp39:n (nimitetty myös CD40-ligandiksi tai CD40L:ksi) molekyyli on myös kloonattu ja luonnehdittu. Armi-tage et ai., Nature, 357, 80 - 82 (1992); Lederman et ai., J. 20 Exp. Med., 175, 1091 - 1101 (1992); Hollenbaugh et ai., EMBO
J., 11, 4313 - 4319 (1992). Proteiini gp39 ilmentyy aktivoiduilla, mutta ei lepäävillä CD4+-Th-soluilla. Spriggs et ai., J. Exp. Med., 176, 1543 - 1550 (1992); Lane et ai., Eur. J. Immunol., 22, 2573 - 2578 (1992), Roy et ai., J. Immunol., 25 151, 1-14 (1993). Sellaiset solut, jotka on transfektoitu geenillä gp39 ja jotka ilmentävät pinnallaan gp39-proteiinia, .···. voivat laukaista B-solun proliferaation ja yhdessä muiden « · stimuloivien signaalien kanssa saada aikaan vasta-aineen tuo- * * * ton. Armitage et ai., Nature, 357, 80 - 82 (1992); Hollen- ψ · v ’ 30 baugh et ai., EMBO J., 11, 4313 - 4319 (1992).
Keksinnön yhteenveto • · · * « · • · · »
Solun pinnan molekyylit, jotka välittävät T-solujen auttaja-,···, 35 efektorifunktioita, joiden edellytyksenä on kontakti, ovat '·' tärkeitä, jotta sellaiset immuunivasteet indusoituvat, jotka vaativat T-solun apua. T-solujen pinnalla sijaitsevien gp39- * » · 4 105528 :ien vuorovaikutus B-solujen pinnan CD40:ien kanssa esittää keskeistä roolia, kun B-soluvasteet aktivoituvat antigeenejä kohtaan. Esillä oleva keksintö perustuu ainakin osittain havaintoon, että myös sellaiset solun pinnan molekyylit, 5 jotka välittävät kontaktia edellyttäviä auttajaefektorifunk-tioita, esittävät kriittistä osaa T-solujen vasteessa antigeenejä kohtaan. On havaittu erityisesti, että sopivissa olosuhteissa sellaisen vuorovaikutuksen häirintä, joka vallitsee T-solun pinnalla sijaitsevan gp39:n ja sellaisen solun pin-10 nalla sijaitsevan ligandin välillä, joka tarjoaa antigeenin T-solulle, voi saada aikaan antigeenispesifisen T-solutole-ranssin. Niinpä sellainen solu, joka tarjoaa antigeenin T-solulle, vaatii vuorovaikutusta solun pinnalla sijoitsevan gp39-ligandin (esim. CD40:n) ja T-solun pinnalla sijaitsevaa 15 gp39:n välillä, jotta saadaan aikaan signaaleja, jotka ovat välttämättömiä T-solun aktivaatiolle. Gp39-ligandin ja gp39:n välisen vuorovaikutuksen inhibointi estää T-soluaktivoinnin ja saa aikaan pikemminkin antigeenispesifisen T-solutolerans-sin.
20
Esillä olevan keksinnön menetelmät ovat yhteydessä antigeeni-spesifisen T-solutoleranssin induktioon. Menetelmiin sisältyy T-solun kontakti 1) sellaisen solun kanssa, joka tarjoaa T-solulle antigeenin ja jonka solun pinnalla on ligandi, joka 25 on vuorovaikutuksessa T-solun pinnalla sijaitsevan sellaisen reseptorin kanssa, joka välittää auttajafektorifunktioita, sekä 2) sellaisen T-solun pinnan reseptorin antagonistin • · kanssa, joka välittää auttajafektorifunktioita, joiden edel- J J « lytyksenä on kontakti. Antagonisti inhiboi reseptorin vuoro- ♦ · · * 30 vaikutuksen tämän ligandin kanssa. T-solu voi olla kosketuk sissa solun kanssa, joka tarjoaa antigeenin, ja antagonistin kanssa ifl vitro, tai vaihtoehtoisesti solu ja antagonisti : voidaan antaa kohteelle T-solutoleranssin saamiseksi aikaan ’·. in vivo.
35 « · « ·
Edullisessa sovellusmuodossa gp39 on reseptori sellaisen T- • I ♦ solun pinnalla, joka välittää auttajaefektorifunktioita, • · « « · · • · • · 5 105528 joiden edellytyksenä on kontakti. Tässä sovellusmuodossa antagonisti on molekyyli, joka inhiboi gp39:n vuorovaikutuksen tämän ligandin kanssa sellaisen solun pinnalla, joka tarjoaa T-solulle antigeenin. Erityisen edullinen gp39-anta-5 gonisti on anti-gp39-vasta-aine. Gp39-antagonisti on vaihtoehtoisesti gp39-ligandin liukoinen muoto, esimerkiksi CD40. Sellainen solu, joka T-solulle tarjoaa antigeenin, on mieluummin B-solu. Viimeksi mainittu solu voi olla pieni, lepäävä B-solu. T-solutoleranssin indusoimiseksi liukoista anti-10 geeniä kohtaan B-solu voi olla kosketuksissa antigeenin kanssa, ennenkuin se on kosketuksissa T-solun kanssa (esimerkiksi ennen kohteelle antoa). Toisessa sovellusmuodossa T-solutoleranssin indusoimiseksi alloantigeenejä kohtaan, sellainen solu, joka tavallisesti tarjoaa T-solulle antigeenin, on 15 allogeeninen solu. Allogeeninen solu voi olla esimerkiksi allogeeninen B-solu, allogeeninen luuydinsolu, tai sellaisina soluina voi olla allogeenisiä pernasoluja tai ääreisverenkierron allogeenisiä soluja.
20 Esillä olevan keksinnön menetelmiä voidaan käyttää esimerkiksi T-solutoleranssin aikaansaamiseksi liukoista antigeeniä, luuydinsiirrännäistä tai muita elinsiirrännäisiä kohtaan tai inhiboitaessa luuydinsiirroksen käänteishyljintää. Luuydin-siirrosten tapauksessa siirretyt luuydinsolut itse toimivat 25 soluina, jotka keksinnön mukaisessa menetelmässä tarjoavat T-soluille antigeenin. Niinpä keksinnön eräässä sovellusmuodos-sa luuydinsiirrännäisen hyväksymistä edistää se, että koh- « · teelle annetaan allogeenistä luuydintä yhdessä gp39-anta- ♦ · t gonistin (esimerkiksi anti-gp39-vasta-aineen) kanssa.
i :: 30 Tämän keksinnön osana ovat myös anti-humaani-gp39-monoklonaa-liset vasta-aineet, jotka pystyvät inhiboimaan B-solun proli- i·* V · feraation, erilaistumisen sekä T-soluvasteet, sekä farmaseut- tisia koostumuksia, jotka sisältävät tällaisia vasta-aineita.
,·«, 35 Keksinnön mukaiset anti-humaani-gp39-monoklonaaliset vasta-« · '1' aineet ovat edullisia moduloitaessa immuunivasteita yleisesti I « » ja erityisesti indusoitaessa antigeenispesifistä T-solutole- • # * I 1 I • * « · 6 105528 ranssia. Edullisiin vasta-aineisiin kuuluvat monoklonaaliset vasta-aineet 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 ja 89-79, joita kuvataan esimerkissä 6. Monoklonaaliset vasta-aineet 89-76 ja 24-31 ovat erityisen edullisia. Hybri-5 doomat 89-76 sekä 24-31, jotka tuottavat vastaavasti vasta-aineita 89-76 ja 24-31, talletettiin sellaisten säädösten mukaisesti, jotka on esitetty Budapestin sopimuksessa, kokoelmaan the American Type Culture Collection, Parklaw Drive, Rockville, Md., syyskuun toisena päivänä vuonna 1994. Hybri-10 doomalle 89-76 annettiin ATCC-tulonumero HB11713 ja hybri- dooma 24-31 sai ATCC-tulonumeron HB11712. Vasta-aineet 24-31 ja 89-76 ovat IgGl-isotyyppiä.
Niinpä eräässä sovellusmuodossa keksintö saa aikaan mono-15 klonaalisen anti-humaani-gp39-vasta-aineen (mAb), joka on IgGl-isotyyppiä. Keksinnön mukainen anti-humaani-gp39-mAb voi inhiboida B-solun proliferäätion normaalissa in vitrn -määrityksessä, esimerkiksi sellaisen B-solun proliferation, joka on saatu aikaan käsittelemällä B-soluja interleu-' ;20 kiini-4:llä ja gp39:llä. Antihumaani-gp39-vasta-aine inhiboi
I I I
B-solun proliferaation, siten että IC50:n arvo (se on pitoi-suus, joka on välttämätön solun jakaantumisen inhiboimiseksi 50 %:lla), oli noin 0,01 - 5,0 μg/ml, mieluummin noin 0,1 -f"if 2,5 μg/ml ja vielä mieluummin noin 0,1 - 1,25 μg/ml. Keksin- 25 nön mukaiset anti-humaani-gp39-mAb:t voivat inhiboida myös ' ' IgG:n, IgM:n ja (tai) IgA:n tuoton normaalissa in vitro -määrityksessä, esimerkiksi sellaisen IgG-tuoton, joka on indusoitu viljelemällä B-soluja aktivoitujen T-solujen kans- • · · ’...· sa (esimerkiksi T-solujen kanssa, jotka on aktivoitu käsit- 30 telemällä niitä anti-CD3-vasta-aineella) . Ant i - humaani-gp3 9- .···. vasta-aine inhiboi mieluummin IgG:n, IgM:n ja (tai) IgA:n B- • · '·* solutuoton, siten että IC50:n on noin 0,01 - 1,0 μg/ml tai *.*.* mieluummin noin 0,01 - 0,1 μg/ml.
« I
35 Edullisessa sovellusmuodossa keksinnön mukainen anti-humaa-ni-gp39-mAb sitoo epitoopin, jonka tunnistaa monoklonaalinen vasta-aineen, joka valitaan 3E4:n, 2H5:n, 2H8:n, 4D9-8:n, 7 105528 4D9-9:n, 24-31:n, 24-43:n, 89-76:n ja 89-79:n muodostamasta ryhmästä. Anti-humaani-gp39-mAb sitoo mieluummin epitoopin, jonka monoklonaalinen vasta-aine 24-31 tai 89-76 tunnistaa. MAb:n kyky sitoa epitooppi, jonka jokin edellä mainituista 5 vasta-aineista tunnistaa, voidaan määrittää normaalein ris- tikilpailumäärityksin. Esimerkiksi sellainen vasta-aine, joka sitoo saman epitoopin, jonka mAb 24-31 tunnistaa, kilpailee leimatun 24-31:n sitoutumisesta aktivoituihin T-soluihin, kun taas sellainen vasta-aine, joka sitoo eri epitoopin kuin sen, 10 jonka mAb 24-31 tunnistaa, ei tule kilpailemaan leimatun 24-31:n sitoutumisesta aktivoituihin T-soluihin.
Keksintö antaa käyttöön keksinnön mukaisten anti-humaani-gp39-vasta-aineiden farmaseuttisia koostumuksia. Nämä koos-15 tumukset sisältävät tyypillisesti anti-humaani-gp39-mAb:tä (esimerkiksi mieluummin 24-31:htä tai 89-76:tta) sekä farmaseuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta.
Vielä eräs keksinnön näkökohta koskee nukleiinihappoa, joka 20 koodittaa anti-humaani-gp39-mAb:tä (esimerkiksi DNArta, joka koodittaa immunoglobuliinin anti-humaani-gp39-mAb:n raskasta tai kevyttä ketjua tai niiden osaa). Tällainen nukleiinihappo voidaan eristää normaalitekniikoin solusta (esimerkiksi hyb-ridoomasta), joka tuottaa anti-humaani-gp39:ää. Esimerkiksi 25 24-31 tai 89-76 -mAbtä koodittava nukleiinihappo voidaan eristää vastaavasti 24-31- tai 89-76-hybridoomasta cDNA-kir-1 jastoseulonnalla, PCR-amplifikaatiolla tai muulla standardi- • · · tekniikalla. Anti-humaani-gp39-mAb-ketjua koodittavaa nukle- ;.·.ί iinihappoa voidaan manipuloida normaalein yhdistelmä-DNA-tek- :T: 30 nilkoin, jotta tuotetaan yhdistelmä-anti-humaani-gp39-mAb:- itä, esimerkikksi kimeerisiä tai ihmiskäyttöön sopivaksi . tehtyjä anti-humaani-gp39-mAb: itä.
• · · • « · • · · • · «
Ennen kaikkea voidaan sellainen nukleiinihappo, joka koodit-35 taa anti-humaani-gp39-mAb:tä, sisällyttää ilmentymisvektoriin f 1 ja viedä se isäntäsoluun, jotta helpotetaan anti-humaani- e » # · · » ·
• t I
• · · · 8 105528 gp39-vasta-aineiden rekombinanttimuotojen ilmentymistä ja valmistusta.
Kuvioiden lyhyt kuvaus 5
Kuvio 1 esittää graafisesti sellaista T-solutoleranssia pro-teiiniantigeenia kohtaan, joka on saatu aikaan anti-gp39-käsittelyllä in vivo. T-soluvasteet mitattiin jjQ vitro, sen jälkeen kun "haaste" oli tehty sellaisella antigeenillä, jota 10 aiemmin annettiin in vivo, antigeenisykäyksen saaneilla B-soluilla joko anti-gp39-vasta-aineen kanssa tai ilman sitä.
Kuvio 2 esittää graafisesti sellaista T-solutoleranssia allo-geenisiä B-soluja kohtaan, joka on saatu aikaan in vivo anti-15 gp39-käsittelyllä. T-soluvasteet mitattiin in vitro, sen jälkeen kun "haaste" oli tehty allogeenisillä B-soluilla, joita aiemmin annettiin in vivo, joko anti-gp39-vasta-aineen kanssa tai ilman sitä.
20 Kuvio 3A esittää graafisesti sellaisten primaaristen allo- geenisten CTL-vasteiden inhibitiota, jotka indusoitiin allogeenisillä B-soluilla, kun vastaanottajaeläimiä käsitellään anti-gp39-vasta-aineella. Kyseessä olleet ryhmät ovat käsittelemättömät hiiret (·), anti-gp39:llä käsitellyt hiiret (Δ) 25 ja pernasolut, jotka ovat peräisin Balb/c-hiiriltä (·); käy-tettiin negatiivisina kontrolliefektorisoluina) .
• • · ·
Kuviot 3B ja 3C esittävät graafisesti sellaisten primaaristen *.·.: allogeenisten CTL-vasteiden inhibitiota, joita LPS:llä käsi- 30 tellyt B-solublastit indusoivat, kun vastaanottajaeläimiä käsitellään anti-gp39-vasta-aineella. Kuviot B ja C esittävät . kahta itsenäistä koetta. Edustetut ryhmät ovat LPS-blastit in * · « vivo ilman käsittelyä (w), anti-gp39: llä käsitellyt LPS- • · · blastit ill vivo anti gp-39-käsittelyn kanssa (·), lepäävät B-35 solut in vivo ilman käsittelyä (O) sekä lepäävät B-solut in f I » vivo anti-gp39-käsittelyn kanssa (Q) .
I * V « f • · « · 9 105528
Kuvio 4A esittää graafisesti sellaisten sekundaaristen, allo-geenisten CTL-vasteiden inhibitiota, jotka on indusoitu allo-geenisillä B-soluilla, kun vastaanottajaeläimiä käsitellään anti-gp39-vasta-aineella. Esitetyt efektoriryhmät ovat seu-5 raavat: HIg:llä käsitellyt vastaanottajat (¢), luonnolliset Balb/c:t (¾.) sekä anti-gp39: llä käsitellyt vastaanottajat (h)· Vastaava syngeeninen vaste (Balb/c-solut, joita on stimuloitu Balb/c-soluilla) esitetään avoimin symbolein.
10 Kuvio 4B esittää graafisesti allogeenisten CTL-vasteiden inhibition spesifisyyttä, kun käsitellään anti-gp39:llä. Kuviossa esitetään CTL-vasteet H-2k-kohteita vastaan luonnollisilla Balb/c-soluilla (O) tai sellaisilla soluilla, joille on saatu aikaan toleranssi H-2b:a kohtaan, siten että niille 15 on annettu H-2b-haplotyypin B-soluja sekä anti-gp39:ää (®) .
Kuvio 5 on on pylväsdiagrammi, joka esittää splenosyyttien lukumäärää isännässä, joka on saanut luuydinsiirrosta, eri ajankohtina isännälle toimitetun luuydinsiirroksen jälkeen, 20 joka on tehty anti-gp39-vasta-aineen kanssa tai ilman sitä.
Kuvio 6A esittää graafisesti sellaisen IgA:n pitoisuutta joka on tuotettu in vitro pernan B-soluilla, jotka on otettu hii-lt, restä, jolle on tehty luuydinsiirros joko anti-gp39-käsitte- 25 lyn kanssa tai ilman sitä. Pernan B-solut poistettiin ja vasta-aineen tuotto mitattiin joko seitsemän tai neljäntoista : päivän jälkeen luuydinsiirrosta.
t·1 • » • · «··
Kuvio 6B esittää graafisesti sellaisen IgGlrn pitoisuutta, 30 joka on tuotettu pernan B-soluilla in vitro, sen jälkeen kun ne on poistettu hiiristä, jotka saivat in vivo luuydinsiir-. .·. roksen joko yhdessä anti-gp39-käsittelyn kanssa tai ilmen sitä. Pernan B-solut poistettiin ja vasta-aineen tuotto mi- • · · tattiin joko seitsemän tai 14 päivän jälkeen luuydinsiirrok-35 sesta.
i ’ : • · • ♦ · • 1 1 • · 1 10 105528
Kuvio 7A esittää graafisesti seerumin IgE-pitoisuutta eri ajankohtina luuydinsiiroksen jälkeen hiirillä, jotka saivat luuydinsiirroksen joko anti-gp39-käsittelyn kanssa tai ilman sitä.
5
Kuvio 7B esittää graafisesti anti-DNA-vasta-aineen pitoisuuksia eri ajankohtina luuydinsiirroksen jälkeen hiirillä, jotka saivat luuydinsiirroksen joko anti-gp39:n kanssa in vivo tai ilman sitä.
10
Kuviot 8A ja 8B esittävät graafisesti sellaisten sytotoksis-ten T-solujen sytolyyttistä aktiivisuutta in vitro, jotka on saatu hiiriltä, joille on toimitettu luuydinsiirros joko anti-gp39-käsittelyn kanssa in vivo tai ilman sitä, siten 15 että on käytetty erilaisia efektorin ja kohdesolun välisiä suhteita (E:T-suhde). Osakuviot A ja B edustavat kahta itsenäistä koetta.
Kuviot 9A, 9B ja 9C ovat virtaussytometrituloksia siluettiku-20 vina, jotka kuvaavat ihmisen perifeerisen veren kuusia tuntia aktivoitujen lymfosyyttien värjäystä joko CD40Ig:llä (osaku-vio A), mAb-4D9-8:11a (osakuvio B) tai mAb-4D9-9:llä (osaku-vio C).
25 Kuviot 10A, 10B ja 10C ovat virtaussytometrituloksia siluet- 1 * vtikuvina, jotka kuvaavat ihmisen perifeerisen veren kuusi V : tuntia aktivoituja lymfosyyttejä, joita on viljelty syklospo- • · · riini A:n läsnäollessa ja jotka on värjätty joko mAb-4D9- t 8:11a (osakuvio A), mAb-4D9-9:llä (osakuvio B) tai CD40Ig:llä • * · .*·*: 30 (osakuvio C).
, .·. Kuviot 11A ja 11B ovat virtaussytometrituloksia silhuettiku-
t · I
y.l' vina, jotka kuvaavat ihmisen perifeerisen veren kuusi tuntia aktivoitujen lymfosyyttien värjäystä CD40Ig:llä leimaamatto-• · ..li' 35 man mAb-4D9-8:n (osakuvio A) tai leimaamattoman mAb-4D9-9:n J#>>: (osakuvio B) läsnäollessa.
• ♦ · # f ψ $ * « * » • · · • · 11 105528
Kuvio 12 esittää graafisesti humaani B-solun sellaisen proliferation inhibitiota, joka on indusoitu liukoisella gp39:llä ja IL-4:llä, kun soluja viljellään anti-humaani-gp39-mAb:iden 4D9-8:n, 4D9-9:n, 24-31:n, 24-43, 89-76:n tai 89-79:n läs-5 näollessa.
Kuvio 13 esittää graafisesti allospesifistä seoslymfosyytti-vastetta, kun soluja viljellään anti-humaani-gp39-mAb:iden 24-31:n tai 89-79:n läsnäollessa.
10
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö esittää erikoisuutena menetelmiä antigeenispe-sifisen T-solutoleranssin indusointia varten. Menetelmiin 15 sisältyy se, että T-solu saatetaan kosketuksiin 1) solun kanssa, joka tarjoaa T-solulle antigeenin ja jolla on pinnallaan ligandi, joka on vuorovaikutuksessa T-solun pinnan sellaisen reseptorin kanssa, joka välittää auttajaefektorifunk-tioita, joiden edellytyksenä on kosketus, ja 2) T-solun pin-20 nalla sijaitsevan sellaisen reseptorin antagonistin kanssa, joka inhiboi reseptorin ja ligandin välisen vuorovaikutuksen. Tässä dokumentissa määriteltynä molekyyli tai reseptori, joka välittää kontaktia edellyttävät auttajaefektorifunktiot, on sellainen molekyyli tai reseptori, joka ilmentyy Th-solun 25 pinnalla ja joka on vuorovaikutuksessa ligandin kanssa, joka sijaitsee efektorisolun pinnalla (esimerkiksi B-solun), jolloin reseptorin vuorovaikutus ligandinsa kanssa on välttämä- ··« Σ.,.ϊ tön efektorisoluvasteen (esimerkiksi B-solun aktivaation) i tuottamiseksi. Sen lisäksi, että tällainen molekyyli sisältyy j1:1; 30 efektorisoluvasteisiin, on osoitettu, että tällainen molekyy- li sisältyy T-solun vasteeseen antigeeniä kohtaan.
f « · • · · T-solun pinnalla edullinen molekyyli on gp39, joka välittää » I i kosketusta edellyttävän auttajaefektoritoiminnan. Niinpä ,35 edullisissa sovellusmuodoissa keksinnön mukaisiin menetelmiin sisältyy T-solun kosketus sellaisen solun kanssa, joka tarjo- .1’·. aa antigeenin ja gp39-antagonistin. Näin ollen sellainen • ♦ • a · f · 1 • · • · 12 105528 solu, jota käytetään tarjoamaan antigeeni, on solu, joka on vuorovaikutuksessa T-solun pinnalla sijaitsevan gp39:n kanssa, jotta T-solu aktivoituu (se on, luovuttaa välttämättömät signaalit T-solun aktivaatiota varten T-solulle). Solu voi 5 olla esimerkiksi B-solu, joka ilmentää CD40:ää ja luovuttaa antigeenin T-solulle. Kun inhiboidaan vuorovaikutus, joka vallitsee antigeenin tarjoavan solun pinnalla sijaitsevan gp39-ligandin ja T-solun pinnan gp39:n kanssa, T-solua ei aktivoida tarjotulla antigeenillä, vaan pikemminkin T-solu 10 saadaan sietämään antigeeniä.
Keksinnön menetelmiä voidaan käyttää indusoimaan T-solutole-ranssi antigeeniä kohtaan ΐβ vivo. Esimerkiksi sellainen solu, joka tarjoaa antigeenin T-solulle, voidaan antaa koh-15 teelle yhdessä sellaisen reseptorin antagonistin kanssa, joka ilmentyy sellaisen T-solun pinnalla, joka välittää kosketusta edellyttävän auttajaefektoritoiminnan (esimerkiksi gp39-anta-gonisti). Keksinnön menetelmiä voidaan käyttää edelleen, jotta saadaan aikaan T-solun sieto antigeeniä kohtaan ϊβ 20 vitro, siten että T-solu saatetaan kosketuksiin ίβ vitro solun kanssa, joka T-solulle tarjoaa antigeenin, yhdessä sellaisen T-solun pinnalla ilmentyvän reseptorin antagonistin kanssa, joka välittää kontaktia edellyttävän auttajaefeksto-ritoiminnan (esimerkiksi gp39-antagonistin kanssa). Sellaiset 25 T-solut, jotka on saatu sietämään antigeeniä in vitro, voidaan sitten antaa kohteelle. Keksinnön menetelmiä voidaan käyttää siihen, että kohteessa T-solu saadaan sietämään spe-:///· sifistä antigeeniä tai siirrettyjä soluja, kuten esimerkiksi » allogeenistä luuydintä (esimerkiksi luuydinsiirrossa) . Kek- • « · 30 s innon menetelmät ovat myös käyttökelpoisia, kun inhiboidaan käänteishyljintää luuydinsiirron yhteydessä.
« » » · • · » y.'.' Keksinnön erilaisia näkökohtia kuvataan yksityiskohtaisemmin » I · seuraavissa alaosastoissa 35 • i · i : • · « f···, I. gp39-antagonisti • · 1 • · · · • « · 13 105528
Keksinnön menetelmien mukaan gp39-antagonisti on kosketuksissa T-solun kanssa (esimerkiksi annettu kohteelle), jotta häiritään T-solun pinnalla sijaitsevan gp39:n vuorovaikutusta gp39-ligandin kanssa antigeenin tarjoavan solun, kuten B-so-5 lun, pinnalla. Gp39-antagonisti määritellään vasta-aineeksi, joka häiritsee tätä vuorovaikutusta. Gp39-antagonisti voi olla vasta-aine, joka kohdistuu gp39:ään (esimerkiksi mono-klonaalinen vasta-aine gp39:ää vastaan), gp39:ään kohdistuvan vasta-aineen fragmentti (esimerkiksi Fab tai F(ab)'2-fragmen-10 tit, kimeeriset tai ihmiskäyttöön sopiviksi tehdyt vasta- aineet) gp39:n liukoiset muodot (esimerkiksi liukoinen CD40), gp39-ligandin fuusioproteiinin liukoiset muodot (esimerkiksi liukoinen CD40Ig) tai farmaseuttiset aineet, jotka katkaisevat gp39-CD40-vuorovaikutuksen tai häiritsevät sitä.
15 A. Vasta-aineet
Nisäkäs (esimerkiksi hiiri, hamsteri tai kani) voidaan immunisoida gp39-proteiinin immunogeenisellä muodolla tai pro-20 teiinifragmentilla (esimerkiksi peptidifragmentilla), joka tuo esiin vasta-ainevasteen nisäkkäässä. Sellaista solua, joka ilmentää pinnallaan gp39:ää, voidaan myös käyttää im-munogeeninä. Vaihtoehtoisiin immunogeeneihin kuuluu puhdistettu gp39-proteiini tai sen fragmentteja. Gp39 voidaan puh-25 distaa gp39:ää ilmentävistä soluista normaalein puhdistus-tekniikoin; gp39:n cDNA (Armitage et ai., Nature, 357, 80 -82 (1992); Lederman et ai., J. Exp. Med., 175, 1091 - 1101 (1992); Hollenbaugh et ai., Embo J., 11, 4313 - 4319 (1992) voi ilmentyä isäntäsolussa, esimerkiksi bakteeri- tai nisä-M*: 30 kässolulinjassa, ja gp39-proteiini voidaan puhdistaa soluvil jelmästä standarditekniikoin. Gp39-peptidit voidaan synteti-. soida gp39:n aminohapposekvenssin perusteella (julkistettu julkaisussa Armitage et ai., Nature, 357, 80 - 82 (1992); • · »
Ledermman et ai., J. Exp. Med., 175, 1091 - 1101 (1992); 35 Hollenbaugh et ai., EMBO J., 11, 4313 - 4319 (1992)) tunnet- • » · tuja tekniikoita käyttämällä (esimerkiksi F-moc- tai T-boc-kemiallista synteesiä). Sellaisiin tekniikoihin, jotka anta- rf » * * * « » * « · • » 14 105528 vat immunogeenisyyttä proteiinille, sisältyy konjugaatio kantaja-aineisiin tai muut tekniikat, jotka tekniikan tason mukaan ovat hyvin tunnettuja. Esimerkiksi proteiinia voidaan antaa adjuvantin läsnäollessa. Immunisaatiotapahtumaa voidaan 5 valvoa siten, että ilmaistaan vasta-ainetiitterit plasmassa tai seerumissa. Vasta-ainemäärien mittaamiseen voidaan käyttää normaaleja ELISA- tai muita immunologisia pitoisuusmääri-tyksiä, joissa immunogeeni on antigeeninä.
10 Immunisaation jälkeen voidaan saada antiseerumeita, jos halutaan, ja polyklonaaliset vasta-aineet voidaan erottaa seerumeista. Immunisoidusta eläimestä voidaan koota vasta-ainetta tuottavia soluja (lymfosyyttejä) monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamista varten ja sulauttaa ne myeloomasolujen 15 kanssa normaalein somaattisen solun sulauttamismenetelmin, tappaa nämä solut tällä tavalla ja tuottaa hybridoomasoluja. Tällaiset tekniikat ovat tekniikan tason mukaan hyvin tunnettuja. Niitä ovat esimerkiksi hybridoomatekniikka, jonka Kohler ja Milstein ovat kehittäneet (Nature (1975) 256, 495 -20 497) samoin kuin muut tekniikat, kuten esimerkiksi humaani B- soluhybridoomatekniikka (Kozbar et ai., Immunol. Today (1983) 4, 72), EBV-hybridoomatekniikka monoklonaalisten humaanivas-ta-aineiden valmistamiseksi (Cole et ai., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) (Allen R. Bliss, Inc., sivut. 77 25 - 96) sekä kombinaatiovasta-ainekirjastojen seulonta (Huse. et al., Science (1988) 246, 1275). Hybridoomasolut voidaan seu- .· I < V : loa immunokemiallisesti sellaisten vasta-aineiden tuoton • jr#! suhteen, jotka reagoivat spesifisesti proteiinin tai peptidin • tai eristettyjen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa.
,:i:: 30
Termi vasta-aine tässä yhteydessä käytettynä on tarkoitettu ,·. sisältämään sellaiset vasta-aineiden fragmentit, jotka ovat f · · spesifisesti reaktiokykyisiä gp39-proteiinin tai sen peptidin 4 1» \ tai gp39-fuusioproteiinin kanssa. Vasta-aineet voidaan frag- * 35 mentoida tavallisia tekniikoita käyttämällä ja fragmentit Γ voidaan seuloa käyttökelpoisuuden suhteen samalla tavalla, ,>··, kuin edellä kuvataan kokonaisten vasta-aineiden kohdalla.
9 1 > ' » 1
» P
V » · » » • 1 15 105528
Esimerkiksi F (ab') 2-fragmentteja voidaan valmistaa siten, että vasta-ainetta käsitellään pepsiinillä. Saatua F(ab1)2-fragmenttia voidaan käsitellä siten, että pelkistetään disul-fidisillat, jotta saadaan aikaan Fab'-fragmentteja. Esillä 5 olevan keksinnön mukaiseen vasta-aineeseen on lisäksi tarkoitus sisällyttää bispesifiset ja kimeeriset molekyylit, joissa on anti-gp39-osa.
Kun sellaisia vasta-aineita, jotka on valmistettu eläimissä, 10 käytetään ihmisillä terapeuttisesti, ne tunnistetaan vaihte-levassa määrin vieraiksi, ja potilaassa voi muodostua immuunivaste. Eräs sellainen lähestymistapa tämän ongelman vähentämiseksi tai poistamiseksi, joka on parempi kuin yleinen immuunosupressio, on valmistaa kimeerisiä vasta-ainejoh-15 dannaisia, se on, vasta-ainemolekyylejä, joissa yhdistyy eläinperäinen muuttuva alue ja ihmisperäinen vakioalue. Kimeeriset vasta-ainemolekyylit voivat sisältää esimerkiksi antigeeniä sitovan domainin, joka on peräisin hiiren tai muiden lajien vasta-aineesta, sekä ihmisperäisen vakioalueen. 20 Kimeeristen vasta-aineiden valmistamiseksi on kuvattu suuri määrä lähestymistapoja ja niitä voidaan käyttää sellaisten kimeeristen vasta-aineiden valmistukseen, jotka sisältävät immunoglobuliinin vaihtelevan alueen, joka tunnistaa gp39:n. Katso esimerkiksi julkaisuja Morrison et ai., Proc. Natl.
25 Acad. Sei. U.S.A., 81, 6851 (1985); Takeda et ai., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et ai., US-patentti nro 4 816 567; ·.· Boss et ai., US-patentti nro 4 816 397; Tanaguchi et ai., ·/”: Eurooppalainen patenttijulkaisu EP171496; Eurooppalainen ·. patenttijulkaisu 0173494, Yhdistyneen kuningaskunnan patentti • · « 30 GB 2177096B. Otaksutaan, että tällaiset kimeeriset vasta- I t I 9 aineet olisivat ihmisellä vähemmän immunogeenisiä kuin vastaava ei-kimeerinen vasta-aine.
• · · • · *
• · · i · I
Spesifisesti gp39-proteiinin tai peptidin kanssa reaktioky- « 35 kyiset monoklonaaliset tai kimeeriset vasta-aineet voidaan tehdä ihmiskäyttöön sopiviksi terapeuttisia humaanitarkoituk-.···. siä varten siten, että valmistetaan ihmisperäisiä muuttuvan 16 105528 alueen kimeerejä, joissa vaihtelevan alueen osia, erityisesti antigeeniä sitovan domainin säilytetyt runkoalueet ovat peräisin ihmiseltä ja hypervariaabelit alueet ovat ei-ihmispe-räisiä. Tällaisia muutettuja immunoglobuliinimolekyylejä 5 voidaan valmistaa useilla tekniikoilla, jotka tekniikan tason mukaan ovat tunnettuja (esimerkiksi Teng et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80, 7308 - 7312 (1983), Kozbor et ai., Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et ai., Meth. Enzy-mol., 92, 3-16 (1982), ja mieluummin niitä valmistetaan 10 sellaisten ohjeiden mukaan, jotka on esitetty PCT-julkaisussa WO92/06193 tai EP 0239400. Ihmiselle sopiviksi tehdyt vasta-aineet voivat olla kaupallisesti valmistettuja, esimerkiksi Scotgen Limited:in, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Iso-Britannia, valmistamia.
15
Toinen menetelmä tuottaa spesifisiä vasta-aineita tai vasta-ainefragmentteja, jotka ovat reaktiokykyisiä gp39-proteiinia tai peptidiä kohtaan, on seuloa ilmentymiskirjastoja, jotka koodittavat immunoglobuliinigeenejä tai niiden osia, jotka 20 imentyvät bakteereissa gp39-proteiinin tai -peptidin kanssa. Esimerkiksi täydellisiä Fab-fragmentteja, VH-alueita ja FV-alueita voidaan ilmentää bakteereissa faagi-ilmentymiskirjas-toja käyttämällä. Katso esimerkiksi seuraavista julkaisuista: Ward et ai.,Nature, 341, 544 - 546 (1989); Huse et ai., Scie-25 nce, 246, 1275 - 1281 (1989); ja McCafferty et ai., Nature, 348, 552 - 554 (1990). Tällaisten kirjastojen seulonta esimerkiksi gp39-peptidillä voi identifioida immunoglobuliini- mmm fragmentteja, jotka pystyvät reagoimaan gp39:n kanssa. Vaih- m toehtoisesti voidaan käyttää SCID-hu-hiirtä (saatavissa Gen-30 pharmilta) vasta-aineiden tai niiden fragmenttien valmistuk-seen.
• · · • · · .···. Gp39:n vastaisten, humaani gp39 ja hiiren gp39 mukaan luet- • · · tuina, sekä keksinnön menetelmissä käyttökelpoisten mono- 35 klonaalisten vasta-aineiden valmistusmenetelmiä kuvataan • I · yksityiskohtaisemmin esimerkissä 6. Erityisen edullisia kek- « .··. sinnön anti-humaani-gp39-vasta-aineita ovat mAb:t 24-31 ja • » • · · • « 17 105528 89-76, joita hybridoomat 24-31 ja 89-76 vastaavasti tuottavat. Hybridoomat 89-76 ja 24-31, jotka tuottavat vastaavasti 89-76 ja 24-31-vasta-aineita, talletettiin Budapestin sopimuksen säädöksen mukaan the American Type Culture Collecti-5 oniin, Parklawn Drive, Rocville, Md., syyskuun toisena päivänä 1994. Hybridoomalle 89-76 annettiin ATCC-tulonumero HB11713 sekä hybridoomalle 24-31 ATCC-tulonumero HB11712.
Yhdistelmä-anti-gp39-vasta-aineita, kuten kimeerisiä ja ih-10 miskäyttöön sopiviksi tehtyjä vasta-aineita voidaan valmistaa manipuloimalla normaalien yhdistelmä-DNA-tekniikoiden mukaisesti nukleiinihappoa (esim DNA:ta), joka koodittaa an-ti-gp39-vasta-ainetta. Esillä olevan keksinnön toinen näkökohta koskee näin ollen eristettyjä nukleiinihappomolekyyle-15 jä, jotka koodittavat immunoglobuliinin raskaita ja kevyitä ketjuja tai niiden osia, jota pystyvät reagoimaan gp39:n, erityisesti humaani gp39:n kanssa. Immunolgobuliinia koodit-tava nukleiinihappo voi koodittaa immunoglobuliinin kevyen tai raskaan ketjun variaabelia aluetta kytketyn raskaan tai ,'“20 kevyen ketjun vakioalueen (tai sen osan) kanssa tai ilman sitä. Tällainen nukeiinihappo voidaan eristää solusta (esi-, merkiksi hybridoomasta), joka valmistaa antihumaani-gp39- i t < mAb:tä normaalein tekniikoin. Esimerkiksi 24-31- tai 89-76-
I I
mAb:tä koodittava nukleiinihappo voidaan eristää vastaavasti
f I I
;;; 25 24-31- tai 89-76-hybridoomasta cDNA-kirjaston seulonnan r i i '·' avulla, PCR-amplifikaatiolla tai muulla standarditekniikal la. Ennen kaikkea antihumaani-gp-39-mAb:ta koodittavan ··· nukleiinihapon eristämisen ja sitä seuraavan mahdollisen ma- • · · nipulaation jälkeen voidaan mainittu nukleiinihappo sisäl-30 lyttää ilmentymisvektoriin ja viedä isäntäsoluun helpotta- • · · maan anti-humaani-gp-39-vasta-aineiden yhdistelmämuotojen • · ’t* ilmentymistä ja tuottoa.
• · • · · • · · • · « • « B. Liukoiset ligandit gp39:ää varten 35 18 105528
Muut gp39-antagonistit, joita voidaan käyttää T-solutolerans-sin indusointiin, ovat gp-39-ligandin liukoisia muotoja. Monovalenttinen liukoinen ligandi gp39, kuten liukoinen CD40 voi sitoa gp39:n ja siten inhiboida gp39:n vuorovaikutuksen 5 B-solujen pinnalla sijaitsevan CD40:n kanssa. Termi "liukoinen" ilmaisee, että ligandi ei ole liittynyt pysyvästi solu-membraanin kanssa. Liukoinen gp39-ligandi voidaan valmistaa kemiallisen synteesin avulla tai mieluummin yhdistelmä-DNA-tekniikoilla, esimerkiksi ilmentämällä ainoastaan ligandin 10 solunulkoista domainia (transmembraani- ja sytoplasmadomainit puuttuvat). Edullinen liukoinen gp39-ligandi on liukoinen CD4 0. Liuokoinen gp39-ligandi voi olla vaihtoehtoisesti . fuu-sioproteiinin muodossa. Tällainen fuusioproteiini käsittää ainakin osan gp39-ligandia, joka on kiinnittynyt toiseen 15 molekyyliin. CD40 voi ilmentyä esimerkiksi immunoglobuliinin (se on CD40Ig:n) kanssa. Eräässä sovellusmuodossa tuotetaan fuusioproteiini, joka sisältää CD40-molekyylin solunulkoisen domainiosan aminohappotähteitä liitettyinä sellaisen sekvenssin aminohappotähteisiin, jotka vastaavat immunoglobuliinin 20 raskaan ketjun sarana-, CH2- ja CH3-alueita, esimerkiksi
Crl:ää, jotta CD40Ig-fuusioproteiini muodostuu (katso esimerkiksi, Linsley et ai. (1991) J.Exp. Med. 1783, 721-730; Capon et ai. (1989) Nature 337, 525 - 531, ja Capon US-patentti 5 116 964). Fuusioproteiini voidaan valmistaa kemiallisen syn-25 teesin avulla tai mieluummin yhdistelmä-DNA-tekniikoilla, jotka perustuvat CD40:n cDNA'.han (Stamenkovic et ai., EMBO
:· J. , 8, 1403 - 1410 (1989)) .
• · · • m II Soluja antigeenispesifisen toleranssin indusointiin • · » i l : 30
Esillä oleva keksintö perustuu ainakin osittain havaintoon, • että kun T-solun antigeeninä on solu, joka sekä tarjoaa anti-« · geenin sekä on vuorovaikutuksessa gp39:n kanssa, tuloksena on • antigeenispesifinen T-solutoleranssi, kun antigeeni tarjotaan ·’· 35 T-solulle gp39:n antagonistin läsnäollessa. Sellaisiin solui- hin, jotka pystyvät indusoimaan T-solutoleranssin tällä me-kanismilla, sisältyy soluja, jotka tarjoavat T-solulle anti- « · * • · • » • · » 105528 geenin ja vaativat vuorovaikutusta ensiksi mainitun solun pinnalla sijaitsevan gp39-ligandin ja T-solun pinnalla sijaitsevan gp39:n välillä, jotta ne vapauttavat T-solun aktivaatiolle välttämättömiä signaaleja T-solulle. Tämän vuoro-5 vaikutuksen inhibitio estää T-solun aktivoitumasta tarjotulla antigeenillä, ja pikemminkin inhibito indusoi antigeenis-pesifisen toleranssin T-solussa. T-solun aktivaation häirintä gp39:n kautta voi estää yhteisesti stimuloivien molekyylien induktion antigeenin tarjoavan solun pinnalla (esimerkiksi 10 B7-perheen molekyylit antigeenin tarjoavan solun, kuten B-solun pinnalla) , niin että antigeenin tarjoava solu antaa vain antigeenisignaalin yhteisstimuloivan signaalin puuttuessa ja indusoi täten toleranssin.
15 Niinpä esillä olevan keksinnön menetelmissä antigeenin tarjoava solu annetaan vastaanottavalle kohteelle. Ilmaisua "sellainen solu, joka tarjoaa antigeenin" ja "antigeenin tarjoava solu" käytetään tässä dokumentissa samaa merkitsevinä, ja niiden tarkotuksena on käsittää solut, jotka tarjoavat 20 antigeenin vastaanottajan soluille, ja niihin kuuluu B-lym- fosyyttejä, "ammattimaisia" antigeenin tarjoavia soluja (esimerkiksi monosyyttejä, dendriittisoluja, Langerhansin soluja) ja muita soluja, jotka tarjoavat antigeenin immuunisoluille (esimerkiksi keratinosyyttejä, endoteelisoluja, astrosyytte-25 jä, fibroblasteja, oligodendrosyyttejä). On tämän lisäksi edullista, että antigeenin tarjoavalla solulla on vähennetty v ' kapasiteetti stimuloida yhteisstimulaatiosignaalia vastaanot- tajan T-soluissa. Antigeenin tarjoavissa soluissa yhteissti- • · · i muloivat molekyylit, kuten proteiinien B7-perhe (esimerkiksi .·;·. 30 B7-1 ja B7-2) eivät ilmenny tai ne ilmentyvät vain vähän. Yh- teisstimulaatiomolekyylien ilmentyminen mahdollisten antigeenin tarjoavien sellaisten solujen pinnalla, joita on määrä · · "I käyttää keksinnön mukaisessa menetelmässä, voidaan määrittää • 1 1 \ 1 normaalein tekniikoin, esimerkiksi virtaussytometrillä siten, 35 että käytetään vasta-aineita, jotka kohdistuvat yhteisstimu-i|": laatiomolekyylejä vastaan.
· · • · · 20 105528 T-solutoleranssin indusointiin edulliset antigeenin tarjoavat solut ovat lymfoidisoluja, esimerkiksi perifeerisen veren lymfosyyttejä tai pernasoluja. T-solutoleranssin indusointiin edullisia lymfoidisoluja ovat B-solut. Ne voidaan puhdistaa 5 solujen seospopulaatioista (esimerkiksi muista solutyypeistä, joita on perifeerisessä veressä tai pernassa) normaalein so-lunerottamistekniikoin. Kiinni tarttuvat solut voidaan poistaa esimerkiksi siten, että pernasoluja viljellään muovimal-joissa ja kootaan kiinnitarttumattomien solujen populaatio.
10 T-solut voidaan poistaa solujen seospopulaatiosta siten, että seospopulaatiota käsitellään anti-T-soluvasta-aineen (esimerkiksi anti-Thyl.l:n ja (tai) anti-Thyl.2:n) sekä komplementin seoksella. Eräässä sovellusmuodossa käytetään lepääviä lymfoidisoluja, mieluummin lepääviä B-soluja, antigeenin tar-15 joavina soluina. Lepäävät lymfoidisolut, kuten lepäävät B-solut, voidaan eristää tekniikan tason mukaisin menetelmin, esimerkiksi niiden pienen koon ja niiden tiheyden perusteella. Lepääviä lymfoidisoluja voidaan eristää esimerkiksi sent-rifugaalisella lietteen vastavirtauutolla, kuten kuvataan H-20 P.Tonyn ja D.C. Parkerin julkaisussa (1985) J. Exp. Med. 161. 223 - 241.
Sellaisia soluja, joista puuttuu pienten, lepäävien lym-foidisolujen populaatio, voidaan saada lietteen sentrifugaa-.25 tista vastavirtauuttamista käyttämällä ja kokoamalla jae tai jakeet 14 - 19 ml/minuutti, mieluummin 19 ml/minuutti (nopeudella (3200 kierrosta minuutissa). Pienet, lepäävät lym-fosyytit (esimerkiksi B-solut) voidaan eristää vaihtoehtoi- * '···1 sesti jatkuvalla tiheysgadienttisentrifugoinnilla, esimerkik- V:.· 30 si Ficoll- tai Percoll-gradienttia käyttämällä, ja pienten, • · · V : lepäävien lymfosyyttien kerros voidaan saada sentrifugoinnin jälkeen. Pienet lepäävät B-solut voidaan erottaa aktivoiduis- : ta B-soluista myös siten, että normaalein tekniikoin (esimer- • · · .**·’: kiksi immunofluoresenssilla) määritetään yhteisstimulaatiomo- ·. 35 lekyylien, esimerkiksi B7-l:n ja (tai) B7-2:n, ilmentyminen *;;; aktivoitujen B-solujen pinnalla.
Γ : · 21 105528
Antigeenin tarjoava solu, kuten B-solu, voidaan saattaa kosketuksiin antigeenin kanssa (esimerkiksi liukoisen proteiinin kanssa) ennen kuin se saatetaan kosketuksiin T-solun kanssa (esimerkiksi ennen antoa kohteelle) ja sellaisen solun kans-5 sa, jota käytettiin antamaan antigeeni T-solulle gp39-anta-gonistin läsnäollessa, jotta saatiin aikaan spesifinen T-solutoleranssi antigeenille (katso esimerkki 1). Toleranssi alloantigeenejä kohtaan voidaan saada aikaan vaihtoehtoisesti siten, että käytetään allogeenistä solua antigeenin antavana 10 soluna (katso esimerkit 2 ja 3) . Allogeenisolu antaa allo-geeniproteiinin antigeenifargmentteja T-soluille. Eräässä sovellusmuodossa allogeeninen solu on allogeeninen lym-foidisolu, kuten allogeeninen B-solu. Kohteen sietokykyä voidaan vaihtoehtoisesti lisätä perifeerisen veren soluilla 15 (esimerkiksi perifeerisen veren lymfosyyteillä), perna- tai luuydinsoluilla. Luuydinsiirroksen tapauksessa luovuttajan luuytimen solut itse toimivat antigeenin tarjoavina soluina, jotka saatetaan kosketuksiin T-solujen kanssa (esimerkiksi annetaan kohteelle). Allogeenistä luuydintä voidaan näin 20 ollen antaa yhdessä gp39-antagonistin kanssa, jotta vastaaot-tajassa saadaan aikaan toleranssi luuydintä kohtaan ja estetään käänteishyljintä (katso esimerkkejä 4 ja 5).
III Solujen ja gp-antagonistien anto .v 25
Antigeenispesifinen T-solutoleranssi voidaan saada aikaan keksinnön mukaan siten, että kohteelle annetaan gp39-anta-gonistia yhdessä solun kanssa, joka tarjoaa T-solulle anti-geenin ja ilmentää ligandia, jolla on vuorovaikutuksia gp39:n • · · : 30 kanssa T-solun pinnalla. Edullisessa sovellusmuodossa anti geenin tarjoava solu ja gp39-antagonisti annetaan samanai- :kaisesti. Gp39-antagonistia voidaan antaa vaihtoehtoisesti • · · ennen solujen antoa, esimerkiksi kun antagonisti on vasta-aine, jolla on pitkä puoliintumisaika. Siinä tapauksessa, 35 että annettavat solut ovat luuydinsoluja, jolloin toivotaan käänteishyljinnän inhibitiota, luuytimessä sijaitsevat luo-vuttajasolut voidaan tehdä vastustuskykyisiksi, ennenkuin ne I f · 22 105528 siirretään vastaanottajaisännälle, inkuboimalla luovuttajan luuydintä B-solujen kanssa, jotka ovat peräisin isännästä, sekä gp39-antagonistin kanssa in vitro. Gp39-käsittely voi jatkua in vivo luuydinsiirron aikana tai sen jälkeen, jos on 5 välttämätöntä. Sellaisissa kohteissa, joiden on määrä ottaa vastaan luuydintä tai muuta elinsiirrännäistä, allogeeninen toleranssi siirrännäistä kohtaan voidaan saada aikaan kohteessa käsittelemällä kohdetta sellaisen hoito-ohjeen mukaan, joka saa aikaan allogeenisentoleranssin ennen elimen tai luulo ydinsolujen siirtoa. Tämän esikäsittelyohjeen mukaan kohteelle voidaan antaa yhdessä gp39-antagonistin kanssa soluja, jotka ovat peräisin luovuttajasta. Luovuttajasta peräisin olevat solut voivat olla esimerkiksi B-soluja, koko perifeeristä verta tai sen jotain fraktiota (esimerkiksi perifeeri-15 sen veren lymfosyyttejä tai pieniä lepääviä lymfosyyttejä tai B-soluja).
Antigeenin tarjoavien solujen (antagonistiin yhdistettynä) yhden annoksen annon on havaittu olevan riittävä indusoimaan 20 T-solutoleranssi (katso esimerkkejä). Annettujen, antigeenin tarjoavien solujen lukumäärä voi vaihdella käytetyn solutyypin, kudos- tai elinsiirrännäistyypin, vastaanottajan painon, yleisen tilan sekä muiden sellaisten muuttujien mukaan, jotka ammattimies tuntee. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytet-25 tävä solujen sopiva määrä voidaan määrittää jollain tavanomaisilla menetelmillä, jotka ammattimies tuntee (esimerkiksi ' käyttämällä menetelmiä, joita esimerkeissä kuvataan). Soluja • · · annetaan sellaisessa muodossa tai sellaista tietä, joka so- \ veltuu toleranssin indusointiin vastaanottajassa. Soluja • · · 30 voidaan antaa fysiologisesti hyväksyttävässä liuoksessa, * kuten esimerkiksi puskuroidussa keittosuolaliuoksessa tai sen kaltaisessa vehikkelissä. Solu annetaan mieluummin suonen- • · m • · · '.V. sisäisesti.
• * · « · * » 35 Keksinnön mukaista antagonistia annetaan kohteille farmaseutit : tiseen antoon in vivo biologisesti yhteensopivassa muodossa .···. T-solutoleranssin aikaan saamiseksi. "Biologisesti yhteen • · · • · · • · * 23 1 0 5 5 2 8 sopiva muoto in vivo -antoa varten" tarkoittaa annettavan antagonistin sellaista muotoa, jossa proteiinin terapeuttiset vaikutukset ovat toksisia vaikutuksia tärkemmät. Termiin kohde tarkoitetaan sisällytettävän elävät organismit, joissa 5 immuunivaste voidaan saada esiin, esimerkiksi nisäkkäät. Kohteiden esimerkkeihin kuuluvat ihmiset, koirat, kissat, hiiret ja niiden transgeeniset lajit. Gp39-antagonistia voidaan antaa missä tahansa farmakologisessa muodossa, valinnaisesti farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantaja-aineessa.
10 Antagonistin terapeuttisesti aktiivisen määrän anto määritellään sellaisena määränä, joka on tehokas sellaisina annoksina sellaisten ajanjaksojen ajan, jotka ovat tarpeen halutun tuloksen saavuttamiseksi. Esimerkiksi gp39:n terapeuttisesti aktiivinen määrä voi vaihdella sellaisten tekijöiden mukaan, 15 joita ovat sairauden vaihe, ikä, sukupuoli ja yksilön paino sekä antagonistin kyky tuoda haluttu vaste esiin yksilössä. Annosohje voidaan säätää siten, että saadaan aikaan optimi terapeuttinen vaste. Voidaan antaa esimerkiksi useita jaettuja annoksia päivittäin tai annosta voidaan vähentää suhteessa 20 siihen, kuinka terapeuttisen tilanteen pakottava tarve vaatii .
Aktiivista yhdistettä (esimerkiksi antagonistia) voidaan antaa sopivalla tavalla, kuten injektiona (ihonalaisesti, 25 suonensisäisesti, jne.), suun kautta, sisäänhengityksen kautta, ihon läpi tai peräaukon kautta tapahtuvana antona. Aktii-. j ; vinen yhdiste voidaan päällystää antotien mukaisesti jollain .···. materiaalilla, jotta yhdiste suojataan entsyymien, happojen 1 **· tai muiden luonnonmukaisten, sellaisten olosuhteiden vaiku- i : : 30 tuksilta, jotka voivat inaktivoida yhdisteen. Suonensisäinen
I » I
* injektio on edullinen antotie.
Gp39:n sellaista antoa varten, joka tapahtuu muuta tietä kuin • · · V ; parenteraalisesti, voi olla tarpeellista päällystää antago- 35 nisti materiaalilla, joka estää inaktivaation, tai antaa se • · « 1 ···. tällaisen materiaalin kanssa. Antagonisti voidaan antaa yksi- lölle sopivassa kantaja-aineessa tai ohenteessa, se voidaan • · • · · · · 9 « 24 1 0 5 5 2 8 antaa entsyymi-inhibiittoreiden kanssa tai sopivassa kantaja-aineessa kuten liposomeissa. Farmaseuttisesti hyväksyttäviin kantaja-aineisiin sisältyvät keittosuolaliuos ja puskureiden vesiliuokset. Entsyymi-inhibiittoreihin sisältyvät haiman 5 trypsiini-inhibiittori, di-isopropyylifluorofosfaatti (DEP) ja trasyloli. Liposomeihin sisältyvät vesi-öljyssä-vedessä-emulsiot samoin kuin tavanomaiset liposomit (Strejan et ai., (1984) J. Neuroimmunol., 7, 27).
10 Aktiivinen yhdiste voidaan antaa myös parenteraalisesti tai intraperitoneaalisesti. Dispersiot voidaan valmistaa glyseroliin, nestemäisiin polyetyleeniglykoleihin ja niiden seoksiin ja öljyihin. Nämä valmisteet voivat sisältää säilöntäainetta mikro-organismien kasvun estämiseksi tavanomaisissa varas-15 tointiolosuhteissa ja normaalissa käytössä.
Injektoitavat farmaseuttiset koostumukset sisältävät steriilejä vesiliuoksia (silloin kun ne ovat vesiliukoisia) tai dispersioita sekä steriileitä jauheita steriilien, injektoi-20 tavien liuosten valmistamiseksi hetkessä. Kaikissa tapauksissa koostumuksen täytyy olla steriili, ja sen täytyy olla juokseva siinä määrin, että se on helposti ruiskutettavissa.
Sen täytyy kestää valmistusolosuhteissa sekä varastoinnin aikana, ja se täytyy varjella mikro-organismien, kuten esi-25 merkiksi bakteereiden ja sienien, aiheuttamalta saastumisel ta. Kantaja-aine voi olla liuotin tai dispersion väliaine, . ; ; joka sisältää esimerkiksi vettä, etanolia, polyolia (esimer- ,··*. kiksi glyserolia, propyleeniglykolia ja nestemäistä polyety- , ,·, leeniglykolia yms.) sekä niiden sopivia seoksia. Sopiva juok- 30 sevuus voidaan pitää yllä esimerkiksi siten, että käytetään I · · ' päällystettä, kuten lesitiiniä, dispersion tapauksessa pide tään yllä sopivaa partikkelikokoa ja siten, että käytetään Φ 9 9 pinta-aktiiivisia aineita. Mikro-organismien toiminta voidaan ’ estää erilaisin bakteerien- ja sientenvastaisin ainein, esi- » ··· 35 merkiksi parabeenin, klooributanolin, fenolin, askorbiiniha-• * · · pon yms. avulla. Monissa tapauksissa on edullista sisällyttää • · « koostumukseen isotoonisia aineita, esimerkiksi sokereita, ♦ » • · · 9 · * 9 · • * 25 105528 polyalkoholeja, kuten mannitolia, sorbitolia, natriumklori-dia. Injektoitavien koostumusten pidennetty absortio saadaan aikaan sisällyttämällä koostumukseen ainetta, joka viivyttää absorptiota, esimerkiksi alumiinimonosteraattia ja gelatii-5 nia.
Steriilejä injektoitavia liuoksia voidaan valmistaa siten, että tarvittava määrä aktiivista yhdistettä (esimerkiksi gp39:n antagonistia) sisällytetään sopivaan liuottimeen yhden 10 edellä mainitun ainesosan tai tarpeen mukaan niiden yhdistelmän kanssa, minkä jälkeen liuos (liuokset) steriloidaan suodattamalla. Dispersiot valmistetaan tavallisesti siten, että aktiivinen yhdiste sisällytetään steriiliin vehikkeliin, joka sisältää dispersion perusväliaineen ja tarvittavia muita 15 ainesosia, jotka valitaan edellämainittujen joukosta. Kun on kyse steriileistä jauheista, joita käytetään steriilien injektoitavien liuosten valmistukseen, edullisia valmistustapoja ovat tyhjö- sekä jäädytyskuivaus, joilla saadaan jauhe, jossa on aktiivista ainesosaa (esimerkiksi antagonistia) sekä 20 jotakin haluttua, lisäksi tulevaa ainesosaa, joka on peräisin sen aiemmin steriiliksi suodatetusta liuoksesta.
Kun aktiivinen yhdiste suojataan sopivasti, kuten edellä kuvataan, proteiinia voidaan antaa suun kautta, esimerkiksi 25 inertin liuottimen tai assimiloituvan, syötäväksi kelpaavan kantaja-aineen kanssa. "Farmaseuttisesti hyväksyttävä kanta- ja-aine" tässä yhteydessä käytettynä sisältää minkä tahansa j‘“: liuottimen ja kaikki liuottimet, dispersion väliaineet, pääl- i ·': lysteet, bakteerien- ja sienienvastaiset agenssit, isotoniset • · » 30 ja absorptiota viivyttävät aineet yms.. Tällaisten väliainei-den ja agenssien käyttö farmaseuttisesti aktiivisia aineita varten on tekniikan tason mukaan hyvin tunnettua. Paitsi t 0 · l” sikäli kuin jokin tavanomainen väliaine tai agenssi ei sovi t · · *, * yhteen aktiivisen yhdisteen kanssa, sen käyttöä terapeutti- V; 35 sissa koostumuksissa on harkittava. Koostumuksiin voidaan sisällyttää täydentäviä, aktiivisia yhdisteitä.
1 * ' < « i · I 4 » I » * * 4 · » · • · 26 1 0 5 5 2 8
On erityisen edullista formuloida parenteraaliset koostumukset annosyksikön muotoon, jotta anto helpottuu ja annostus yhdenmukaistuu. Tässä yhteydessä käytettynä annosyksikkömuoto viittaa fysikaalisesti erillisiin yksiköihin, jotka on sovi-5 tettu yksikköannostuksiksi hoidettavia nisäkäskohteita var ten; kukin yksikkö sisältää aktiivisen yhdisteen ennalta määrätyn määrän, jonka on laskettu saavan aikaan haluttu terapeuttinen vaikutus haluttuun farmaseuttiseen kantaja-aineeseen yhdistettynä. Keksinnön mukaisten annosyksikkömuo-10 tojen spesifikaation määräävät (a) aktiivisen yhdisteen ainutlaatuiset ominaisuudet sekä tietty, saavutettava terapeuttinen efekti sekä (b) rajoitukset, jotka ovat yhdistelmäval-mistuksen tekniikan tasolle luonteenomaisia, kun kysymyksessä on aktiivinen yhdiste yksilöiden herkkyyden hoitoon, ja spe-15 sifikaatio on niiden mukainen.
Sen lisäksi, että T-solujen toleranssimuodostus tapahtuu in vitro, keksintö käsittää T-solujen toleranssinmuodostuksen in vitro. esimerkiksi siten, että mainitut solut saatetaan kos-20 ketuksiin antigeenin tarjoavan solun kanssa gp39-antagonistin länäollessa. T-solut voidaan saada esimerkiksi hoidettavalta kohteelta, niitä käsitellään toleranssin muodostusta varten in vitro siten, että niitä viljellään antigeenin tarjoavien solujen sekä antagonistin kanssa ja sitten ne annetaan koh-25 teelle uudestaan.
v · IV. Keksinnön mukaisen mentelmän käyttö »<· • · » · ·« » * :[: Keksinnön mukaisia menetelmiä voidaan käyttää indusoitaessa 30 T-solutoleranssi erilaisia antigeenejä kohtaan. T-solutole- « ranssi voidaan indusoida esimerkiksi liukoista antigeeniä , .·. (liukoista proteiinia) kohtaan, kuten esimerkissä l kuvataan.
» i · T-soluja voidaan käsitellä toleranssin aikaan saamiseksi « · « sellaisia antigeenejä kohtaan, jotka sisältyvät autoim-,.V 35 muunisairauksiin, tai sellaisiin häiriöihin, jotka liittyvät epänormaaleihin immuunivasteisiin. Eräässä sovellusmuodossa ,··, antigeeni on esimerkiksi autoantigeeni. Toisessa sovellusmuo-
« I
f ( f I « »
I I
* 1 27 1 0 5 5 2 8 dossa antigeeni on allergeeni. T-soluja voidaan käsitellä toleranssin saavuttamiseksi vaihtoehtoisesti antigeenejä kohtaan, jotka ilmentyvät vieraiden solujen pinnalla (kuten kuvataan esimerkeissä 2-59. Niinpä vielä muissa sovellus-5 muodoissa antigeeni on alloantigeeni tai ksenoantigeeni. T-solutoleranssin induktiolla alloantigeenejä ja ksenoanti-geenejä kohtaan on erityistä käyttöä elinsiirrossa, esimerkiksi inhiboitaessa luovuttajan siirrännäisen, esimerkiksi kudos-, elin- tai luuydinsiirrännäisen, hyljintää, transplan-10 taatin vastaanottajassa. Edellä esitettyjen menettelytapojen lisäksi luovuttajan T-solujen käsittely luuydinsiirrännäises-sä toleranssin saavuttamiseksi on käyttökelpoinen tapa, kun inhiboidaan käänteishyljintää (katso esimerkiksi esimerkkiä 5) .
15
Keksintöä valaisevat vielä seuraavat esimerkit, joiden ei tulisi olla konstruoidut siten, että ne rajoittavat keksintöä. Tässä patenttihakemuksessa mainituttujen kaikkien viitteiden, patenttien ja julkaistujen patenttihakemusten sisäl-20 löt sisällytetään tähän dokumenttiin viitteinä.
Esimerkki 1: Antigeenispesifisen toleranssin indusointi
Menetelmät 25 Hiiriä immunisoitiin KHLrllä käsitellyillä pernan B-lymfosyy-'· teillä viiden päivän ajan. Primaarisen immunisaation aikana eläimiä käsiteltiin anti-gp-39-vasta-aineella MR1 tai ne ·«· ·...· jätettiin käsittelemättä. Viiden päivän kuluttua immunisaati- on alusta hiirille annettiin paikallisesti (käpälään) "haas- :T: 30 te" eli testiannos KHL:ää, joka oli täydellisessä Freundin adjuvantissa (CFA). Hiiret tapettiin viisi päivää myöhemmin, . tyhjentyvät lymfasolmukkeet poistettiin ja määritettiin jji • · · .·:·. vitro T-solujen jakaantumisvaste KHL:ää kohtaan.
« « « < ·.·'· 35 Tulokset < i r ·'...· Eläimiä immunisoitiin aktivoiduilla B-lymfosyyteillä, joita oli käsitelty antigeenillä, ja sen jälkeen niille annettiin «Il 1 · 28 105528 testiannos samaa antigeeniä, joka sai aikaan immuunivasteet immunisoivaa antigeeniä kohtaan. Vaste mitattiin antigeenis-pesifisten T-lymfosyyttien proliferaationa, joka esitetään kuviossa 1. Eläinten käsittely anti-gp39-vasta-aineella pri-5 maari-immunisaation aikana antaa tulokseksi sen, että anti-geenispesifisiltä T-lymfosyyteiltä puuttuu vaste, kun niitä käsitellään antigeenillä in vitro. Sellaisilla T-lymfosyy-teillä, jotka saatiin anti-gp39-vasta-aineella käsitellyistä eläimistä, ilmeni vähentynyttä proliferaatiokykyä, kun niitä 10 verrattiin T-lymfosyytteihin, jotka saatiin käsittelemättömien eläinten lymfasoImukkeista.
Esimerkki 2: T-solutoleranssin induktio allogeenisiä soluja kohtaan 15
Menetelmät
Balb/c(H-2d)-hiiriä immunisoitiin allogeenisillä pernasoluilla, jotka saatiin DBA/2(H-2b)-hiiriltä. Eläimiä käsiteltiin anti-gp30-vasta-aineella MRlillä viiden päivän ajan im-20 munisoinnin jälkeen tai ne jätettiin käsittelemättä. Eläimet tapettiin kuudentena päivänä ja niistä poistettiin pernat. Anti-gp39-vasta-aineella käsitellyistä tai käsittelemättömistä eläimistä saadut pernasolut viljeltiin tämän jälkeen in vitro ilman mitään kiihoketta tai säteilytettyjen DBA/2-per-25 nasolujen kanssa. Proliferaatiovaste tälle sekundaariselle allergeeniselle ärsykkeelle mitattiin kolmantena päivänä viljelyn alettua.
• « « t * · §
Tulokset · · '·’ ‘ 30 Allogeenisillä pernan B-soluilla immunisoiduista eläimistä saaduissa T-lymfosyyteissä ilmeni voimakkaita proliferaa-tiovasteita, kun mainitut T-lymfosyytit viisi päivää myöhem- • · · : min saivat in vitro "haasteen", joka käsitti samoja B-soluja (kuvio 2). Allogeenisillä pernan B-soluilla immunisoiduista '!!! 35 ja anti-gp39-vasta-aineella käsitellyistä hiiristä saatujen T-lymfosyyttien proliferaatiokyky kuitenkin on vähentynyt, kun viimeksi mainitut lymfosyytit myöhemmin saivat "haasteen" « 4 « 29 105528 in vitro. Anti-gp39-vasta-aineella käsitellyillä hiirillä vaste "haastetta" kohtaan vähenee arviolta 50 prosenttia verrattuna hiiriin, jotka olivat kontrolleina.
5 Esimerkki 3: Anti-gp39-käsittely häiritsee CTL-vasteiden kehittymistä allogeenisiä B-soluja kohtaan Tässä esimerkissä tutkittiin gp39:n roolia sytotoksisten T-solujen (CTL) tuotossa. Sen seikan määrittämiseksi, millainen 10 gp39:n funktio on CTL:n kehityksessä, tutkittiin anti-gp39-käsittelyn vaikutuksia allospesifisten CTL:ien tuottoon siten, että immunisoitiin allogeenisillä B-soluilla. Tutkittiin anti-gp-käsittelyn vaikutuksia sekä primaarisiin että sekundaarisiin CTL-vasteisiin.
15
Primaariset CTL-vasteet
Sen seikan tutkimiseksi, voiko anti-gp-39 estää allogeenisiä B-soluja tuomasta esiin allospesifisiä CTL-vasteita in vivo, vastaanottajahiirille annettiin allogeenisiä B-soluja (per-20 nasoluja, joista T-solut oli poistettu), anti-gp39:n kanssa tai ilman sitä. Balb/c-hiiriä (naaraspuolisia, kuuden - kahdeksan viikon ikäisiä, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) immunisoitiin C57BL/6:n (naaraspuolinen, kuuden - kahdeksan viikon ikäinen, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) per-25 nasoluilla (30 - 50 x 106), joista T-solut oli poistettu anti-Thyl.2:11a (askites, valmistettu ATCC-kloonista H013.4) ja käsittelemällä kaniinin komplementilla. Sitten näitä vas-taanottajahiiriä käsiteltiin anti-gp39: llä viiden päivän ajan (250mg vastaanottajaa kohti päivinä 0, 2 ja 4) tai ne jätet- I»» : 30 tiin käsittelemättä. Viidentenä päivänä pernat poistettiin ja CTL-vasteet mitattiin siten, että käytettiin 4 tunnin mit-: täistä kromin vapautumismääritystä. Negatiivisina efektori- solukontrolleina käytettiin pernasoluja, jotka saatiin esikä-sittelemättömistä Balb/c-hiiristä. Käytetyt kohdesolut olivat ·;;; 35 naaraspuolisia E-Kl (H-2b, T-solulymfooma, joka on peräisin ' C57BL/6-kannasta) sekä P815 (H-2d, mastosytooma, joka on pe- räisin DBA/2J-kannasta). 51Cr:llä leimatut kohdesolut pestiin
( · I
30 105528 ja niitä siirrostettiin 1 x 104 -solua kammiota kohti 96-kam-mioisille levyille efektorisolujen kanssa siten, että efekto-ri:kohde-suhteet (E:T) olivat 100:1, 20:1 ja 4:1. Levyjä sentrifugoitiin lyhytaikaisesti ja sitten niitä inkuboitiin 5 37 °C:ssa, viisiprosenttisessa C02:ssa, neljän tunnin ajan.
Levyjä sentrifugoitiin vielä kerran ja kustakin kammiosta koottiin 100 ml solutonta supernatanttia gamma-säteilyn mittausta varten (LKB Clinigamma, Wallac Inc., Gaithesburg, MD). Spesifisen hajoamisen prosenttimäärä mitattiin kaavan (a-b)/c 10 mukaan, jossa kaavassa a = efektorisolujen kanssa inkuboidui-sta kohdesoluista vapautunut iskujen lukumäärä minuutissa, b = yksinomaan viljelyalustan kanssa inkuboiduista kohdesoluis-ta vapautunut iskujen lukumäärä minuutissa (spontaani vapautuminen) ja c = kohdesoluista jäädytys-sulatuksella vapautu-15 nut iskujen lukumäärä minuutissa (arviolta 80 prosenttia sisällytettyjen iskujen kokonaismäärästä minuutissa). Mikään tutkituista solunäytteistä ei hajottanut P815-kohteita. E-naaraspuolsia Kl-kohteita koskevia tuloksia kuvataan kuviossa 3A, jossa esitetyt ryhmät ovat seuraavat: käsittelemättömät 20 hiiret (·), anti-gp39:llä käsitellyt hiiret (a) sekä pernasolut, jotka on saatu esikäsittelemättömistä Balb/c-hiiris-tä (·); käytetty negatiivisina kontrolliefektorisoluina) . Tulokset havainnollistavat, että sellaiset hiiret, jotka saivat anti-gp39:ää ja allogeenisiä soluja, eivät tuottaneet primaa-25 ri-CTL-vastetta in vivo vasteena allogeenisille B-soluille.
Sitä vastoin anti-gp39:n puuttuessa allogeeniset B-solut herkistivät vastaanottajan alloantigeeniä kohtaan ja indusoi-vat melkoisen CTL-vasteen.
i : : • * ·
III
f · · ·' ' 30 Sen määrittämiseksi, voisiko anti-gp39 lisätä vain sellaisten B-solujen tolerogeenistä vaikutusta, joita ei oltu aktivoitu, käytettiin LPS:llä aktivoituja B-soluja CTL:n esikäsittelyyn anti-gp39:n läsnäollessa sekä puuttuessa. Sellaiset B-solut, jotka olivat peräisin C57BL/6-hiiriltä, valmistettiin edellä '!!! 35 kuvatulla tavalla ja niitä viljeltiin kahden päivän ajan ' 1' siten, että lipopolysakkaridia (LPS; 50 mg/ml; Sigma Diagnos-
• I I
ties, St. Louis, MO) oli läsnä tai se puuttui. Solut koottiin
I · I
3i 105528 ja niitä pestiin perusteellisesti ja ne injektoitiin Balb/c-vastaanottajahiirten vatsaonteloon. Vastaaottajahiiriä joko käsiteltiin anti-gp39:llä päivinä 0, 2 ja 4, kuten edellä kuvataan, tai niitä ei käsitelty. Viidentenä päivänä pernat 5 poistettiin ja CTL-vasteet määritettiin edellä kuvatulla tavalla. Kahden itsenäisen kokeen tulokset esitetään kuviossa 3B (ylimmässä ja alimmassa osakuviossa). Edustetut ryhmät olivat seuraavat: LPS-blastit in vivo ilman käsittelyä (>), LPS-blastit, joita oli käsitelty in vivo anti-gp39:llä ( ), 10 lepäävät B-solut in vivo ilman käsittelyä (O) ja lepäävät B-solut, joita oli käsitelty in vivo anti-gp39:llä ( ). Tulokset ilmaisevat, että anti-gp39-käsittely myös vähensi, vaikka ei kokonaan, primaari-CTL-vastetta allogeenisille LPS-blas-teille.
15
Sekundaariset CTL-vasteet
Anti-gp39:n ja allogeenisen B-solunannon CTL:n muodostumiseen kohdistuvan sysäyksen tutkimiseksi sellaisia pernasoluja, jotka saatiin käsitellyistä ja käsittelemättömistä hiiristä, 20 stimuloitiin in vitro ja CTL-vasteiden piiri tutkittiin. Balb/c-hiiriä esikäsiteltiin in vivo C57BL/6:sta peräisin olevilla B-soluilla, kuten edellä kuvattiin. Sellaiset pernasolut, jotka ovat peräisin eläimistä, joita oli käsitelty anti-gp39:llä sekä kontrollina käytetyllä hamsterin Ig:llä 25 (HIg:llä), poistettiin ja 5 x 106-solua viljeltiin viiden päivän ajan ("reagoijat") pernan monien B-solukantojen kanssa (valmistettu anti-Thyl.2 + komplementtikäsittelyllä), joita • · · oli käsitelty mitomysiinillä (2,5 mg/ral 37 °C:ssa, Sigma M.· Diagnostics, St. Louis, MO) siten, että stimulaattoreiden t *' : 30 määrä oli tällöin 5 x 106/ml. Stimulaattoriryhmiä olivat C57BL/6 (H-2b) sekä Balb/c (H-2d), joilla vastaavasti ilmeni : sekundaarinen, allogeeninen vaste sekä primaarinen, syngeeni- . · · · nen vaste, stiloija- ja reagoijasoluja viljeltiin juuri val- mistetussa herkistäroisvällaineessa RPMI-1640 (Bio Whittaker, 35 Walkersville, MD), jossa oli l x 105 M 2-merkaptoetanolia (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), 2 mM L-glutamiinia (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO), 500 U/ml penisilliiniä ja 32 105528 5000 U/ml streptomysiiniä (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO). Viiden piäivän kuluttua reagoijasolut koottiin ja kuolleet solut poistettiin, siten että ne sentrifugoitiin tiheysgra-dientissa. Saatuja eläviä soluja käytettiin efektoreina CTL-5 määrityksessä edellä kuvatulla tavalla. Kohteisiin kuului E-naaraspuolinen K1 (H-2b, T-solulymfooma, joka on peräisin C57BL/6-kannasta) sekä P815 (H-2d, mastosytooma, joka on peräisin DBA/2J-kannasta). Tulokset esitetään kuviossa 4A. Allogeenisesti stimuloidut efektoriryhmät olivat seuraavat: 10 Hlgrllä käsitellyt vastaanottajat (#) , luonnonmukaiset Balb/c (>) ja anti-gp39:llä käsitellyt vastaanottajat (0) . Vastaava syngeeninen vaste (Balb/c-solut, jotka on stimuloitu Balb/c-soluilla) ilmaistaan avoimin merkein. Kuten osattiin odottaa, hiirien immunisaatio in vivo allogeenisillä pernasoluilla, 15 joista T-solut oli poistettu (H-2b) , ilman anti-gp39-käsit.te-lyä johti selvään sekundaariseen CTL-vasteeseen in vitro. Lisääntynyttä sekundaarista anti-H-2b-CTL-vastetta ei havaittu, jos hiirille annettiin anti-gp39:ää in vivo.
20 CTL-vasteiden anti-gp39:llä tapahtuvan inhibition spesifisyyden määrittämiseksi edellä kuvattuista pernaviljelmistä analysoitiin anti-H-2k:n allogeeniset vasteet (allogeenisten vasteiden kolmas ryhmä) siten, että CTL-määrityksessä stimu-laattoreina käytettiin pernan B10BR-(H-2k)-B-soluja ja koh-25 teinä käytettiin SL8:aa (H-2k:ta, spontaania T-solulymfoomaa, .· joka oli peräisin AKR-kannasta). Tulokset esitetään kuviossa .···. 4B. Esitetyt ryhmät ovat luonnonmukainen Balb/c (O) sekä anti-gp39:llä käsitellyt vastaanottajat (g). Tulokset havain-nollistavat, että anti-H2b:lle spesifisten CTL-vasteiden 30 inhibitio anti-gp39-käsittelyllä oli allospesifistä, koska H-2b:n sekä anti-gp39:n anto aivät muuttaneet CTL-vastetta in :.i.: vitro sivullista alloantigeeniä (H-2k) kohtaan.
• · « I I f • * •
Kun näistä tuloksista tehdään yhteenveto, ne osoittavat, että ·>', 35 anti-gp39 häiritsee allospesifisten CTL-vasteiden (sekä pri- maaristen että sekundaaristen) kehittämistä. Asiaankuuluvalle alloantigeenille spesifisiä CTL-prekur sore itä on vielä läsnä f « 1 33 1 0 5 5 2 8 anti-gp39:n läsnäollessa, koska sekundaarisessa viljelmässä in vitro voidaan havainnollistaa jonkin verran anti-H-2b-CTL-aktiivisuutta. Voidaan tehdä sellainen johtopäätös, että anti-gp39-käsittely vähensi sekundaarista vastetta in vitro 5 siten, että se esti CTL:n vaikuttamalla CTL:n määrään tai vähentämällä sitä. Lepäävien B-solujen käyttö ei ole välttämätön tämän vasteen puuttumisen hvainnollistamiselle, koska anti-gp39 huononsi myös allogeenista CTL-vastetta, jonka LPS-blastit indusoivat.
10
Esimerkki 4: Hiiren allogeenisen luuytimen siirto indusoi stabiileja kimaireja gp39:n vasta-aineella käsitellyissä vas-taanottaj issa 15 Monien sellaisten hematologisten häiriöiden hoitoon, joita ei voida parantaa kemoterapeuttisilla menetelmillä, sisältyy allogeenisen luuytimen siirto. Tähän agressiiviseen hoitoon sisältyy kemoterapia, jossa käytetään suuria myeloablatiivi-sia annoksia kytkettyinä allogeenisen luuytimen perfuusioon, 20 mikä tekee mahdolliseksi hävittää täydellisesti klonogeeniset kasvainsolut.
On jo osoitettu, että kateenkorvan säteilyttäminen, kateen-korvan T-solujen poistaminen lisää stabiilien kimairain 25 esiintymistiheyttä, kun käytetään T-solujen vastaisia mono-klonaalisia vasta-aineita (MAB:itä), anti-CD-mAb:t mukaan luettuina. Tämä vasta-aineen anto-ohjelma johti T-solupuutok- * ···’ seen ja täten luovuttajaa kohtaan spesifiseen sietoon, joka .!.* voitiin osoittaa luovuttajan ihosiirrännäisten sietona. Pysy- • · · : 30 vän allogeenisen yhdistämisen epäonnistuminen 300 radin WBI- käsittelyn, anti-T-solu-mAb-käsittelyn in vivo ja allogeeni- : sen luuytimen annon jälkeen voi olla tuloksena siitä, että T- • · » solut tymuksen sisällä ovat muuttumattomina. Anti-CD4-mAb:n ja anti-CD8-mAb:n käyttö voi johtaa perifeerisen veren sekä ;;; 35 pernan T-solujen tehokkaaseen poistoon, kun taas tymuksen T- ;·' solut ovat yksinkertaisesti mAbriden päällystämiä eikä niitä • 4 « 4 » 4 34 105528 ole poistettu. Täten hiirien kateenkorvan säteilytys pannaan toimeen.
Menetelmät 5 Käytettiin hiirimallia siirrettäessä Fl:n allogeenista luuydintä (BMT) vanhempaan, jotta vältettiin indusoimasta kään-teishyljintäreaktiota. Käytettiin Fl-kantaa CB6, jotka ovat (C57BL/6xBalb/c)Fl:ää, jotka ovat peräisin H-2d/b:n kokonais MHC-haplotyypistä. Luuydin poistettiin ja se injektoitiin 10 laskimonsisäisesti BALB/c-vanhempaan, MRl:een, jota oli sä-teilytetty, anti-gp39-vasta-aineen kanssa tai ilman sitä.
Koko ruumiiseen kohdistuvan säteilytyksen tasot (WBI) vaihte-livat kimerismin parhaan tason määrittämiseksi ja jotta voitiin verrata anti-gp39-vasta-aineella käsiteltyjä ja käsitte-15 lemättömiä eläimiä kullakin säteilytystasolla. Kimerismi määritettiin virtaussytometrianalyysillä, joka pantiin toimeen perifeerisen veren H-2b-MHC-haplotyypin lymfosyyteillä, joita on H-2d(BALB/c)-hiirissä. Aiemmin on osoitettu, että tämä hiirien yhdistelmä soveltuu ja että kimairat voidaan 20 saada 500 ja 600 radin suuruisella koko kehon säteilytyksel-lä.
Tulokset
Kimerismi havaittiin identifioimalla virtaussytometrillä 25 solut (H-2b) , jotka olivat peräisin C57BL/6:sta. Kimeerismin havaittiin kehittyvän hiirissä, joita oli säteilytetty 400, 500 ja 600 radin suuruisella koko kehon säilytyksellä 14 m päivän aikana vain, jos hiiriä käsiteltiin anti-gp39-vasta- • · :·' aineella tutkimuksen alusta lähtien. Sellaiset hiiret, jotka 30 eivät saaneet mitää vasta-ainetta, hylkivät soluja kaikilla säteilytystasoilla, joilla niitä oli käsitelty, paitsi kun annettiin 600 radia koko keholle, jolloin ne hyväksyivät luu-Γ; ytimen samassa määrin kuin ryhmä, jota käteltiin vasta-ai- neella ja säteilytettiin 400 radilla (taulukko 1). Havait-35 tiin, että kimerismin taso kuuden viikon mittaisen käsittelun jälkeen, kun käytettiin 400, 500 ja 600 radia sekä anti-gp39-t<>·' vasta-aineterapiaa, oli vastaavasti 70,7 + 5,74, 94,1 ja 84,4 35 1 0 5 5 2 8 + 8,56, kun taas säteilytettäessä 600 radilla ilman mitään muuta käsittelyä niiden havaittiin olevan 85,7 + 5,9 kimeeri-siä (taulukko 2). Solujen fenotyypitys tässä kohden ilmaisi, että T-soluista, B-soluista ja makrofaageista oli tullut 5 kimeerisiä ja samassa määrin, kun käytettiin 400 radin suuruista säteilytystä verrattuna ryhmään, joka sai 600 radia säteilyä eikä muuta käsittelyä (taulukko 2). Kävi myös ilmi, että anti-gp-39-vasta-ainekäsittely ei muuttanut merkittävästi minkään lymfoidisolujen populaation kokonaisprosenttia 10 periferiassa. Kun lopetettiin eläinten käsittely anti-gp39- vasta-aineella, havaittiin, että eläimet olivat transplantaation jälkeen stabiilisti kimeerisiä aina kahdeksaan viikkoon saakka.
15 Taulukko I
Koko kehon sätei- Anti-gp39: llä kä- Kimeeristen eläin-lytystaso (radeja) siteltyjen, kimee- ten lukumäärä, risten eläinten eläimiä ei käsi- lukumäärä telty anti-gp39:- llä 0 0(5) 0(5) 20 200 0(5) 0(5) 400 9(9) 0(9) ···. 450 3(5) 0(5) •»· -- .-- --- — ,0 500 4(5) 2(5)
·«· - - 1 — ..... I
1 600 7(9) 7(9) 25 ·!·' Koko kehon säteilytyksen tasot tuottivat kimeerismin. Suluis-
• M
.! * sa esitetyt luvut ilmaisevat kullakin tasolla tutkittujen eläinten kokonaislukumäärän.
I « ! 30
Taulukko 2 36 1 0 5 5 2 8
Radeja Käsit- II-2Kb+ B-solut T-solut Mac. II- tely II-2Kb+ II-2Kb+ 2Kb+ 400 + 70,7+5,74 89±2,6 45,6+13,3 82,3+3,3 500 + 94,1 100 89 100 5 600 + 8 4,4±8,5 6 99,3±0,94 72,3±15,9 91,1+8,3 600 - 85,7+5,9 97,3±1,77 67,1±10,3 91+9
Prosenttimäärä B- ja T-soluja sekä makrofaageja (Mac.), jotka ovat positiivisia H-2Kb:n suhteen, +standardivirhe.
10
Esimerkki 5: Allogeeninen luuydintransplantaatio yhdistettynä vastaanottajan käsittelyyn anti-gp39:llä, joka inhiboi akuutin ja kroonisen käänteishyljinnän 15 Tässä esimerkissä käytettiin seuraavaa metodiikkaa:
Hiiret: DBA/2 (H-2d)-, C57BL/6 (H-2b)- sekä B6D2F1 ((C57BL/6 (H-2d)x DBA/2)Fx-hybridi)-hiiret saatiin NCI-laboratorioista (Bethesda, Maryland) ja niitä pidettiin Animal facilityssä 20 Dartmouth Medical Schoolissa. Kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt hiiret olivat naaraspuolisia ja iältään kuuden -kahdeksan viikon ikäisiä.
···. Kroonisen GVHD:n induktio: Krooninen GVHD saatiin aikaan * "·. 25 siten, että laskimonsisäisesti ruiskutettiin parentaalisia 4 (DBA/2) pernasoluja vastaanottajiin, jotka olivat sellaisia (C57BL/6xDBA/2)Fx-hybridejä, joita ei oltu säteilytetty (Fast, L.D. (1990) J. Immunol. 144, 4177). Parentaaliset hii-ret nukutettiin ja ne tapettiin vääntämällä kaula sijoiltaan • 4 s.! · 30 ja niiltä poistettiin perna. Erotetut pernasolut pestiin ja lietettiin uudelleen RPMI 1640 -väliaineeseen (Whittaker, Waldersville, Maryland) laskimonsisäistä ruisketta varten Fj_-vastaanottajiin.
> I
i I
4 4« 4 4 · 4 I · 4 * I · 105528
Akuutin GVHD:n induktio: Akuutti GVHD saatiin aikaan ruiskuttamalla laskimonsisäisesti parentaalisia C57BL/6-pernasoluja vastaanottajiin, jotka olivat säteilyttämättömiä (C57BL/6xDB-A/2)F^-hybridejä. Solut valmistettiin samalla tavalla kuin 5 siirtoa varten samalla tavalla kuin kroonista GVHDttä indusoitaessa.
Vasta-aineet: Anti-gp39:MR1 tuotettiin askiteksessa ja puhdistettiin ioninvaihto-HPLC:llä, kuten aiemmin kuvataan (Foy, 10 T.M. et ai. (1993) J. Exp. Med. 178, 1567 - 1575; Noelle, R.J. et ai. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 6550). Polyklonaaliset anti-isotyyppivasta-aineet: kaikki anti-IgG^ ja IgA-vasta-aineet sekä normaalit kontrollit saatiin Southern Biotecnology Associatesilta, Inc., (Birmingham AL).
15 Anti-IgE-vasta-aineet: kaikki anti-IgE-vasta-aineet (BIE3 ja biotiini AM95) sekä standardit (A3B1), joita käytettiin IgE:-lle erikoisesti suunnitellussa ELISAssa, olivat tohtori T. Waldschmidtin, IA, ystävällinen lahja. Anti-MCH-haplotyyppi-set vasta-aineet: H-2Kb-FITC:hen konjugoitu vasta-aine sekä 20 H-2Dd-biotiiniin konjugoitu vasta-aine saatiin PharMingeniltä (San Diego, CA).
Solulinjat: Käytettiin solulinjoja, joihin kuuluivat P815 (H-2d) sekä LB27,4 (H-2bxd), jotka saatiin the American Type 25 Culture Collectionista. Solulinja cl.18.5 (H-2B) saatiin ystävällisenä lahjana tohtori William R. Greeniltä.
• · ” Polyklonaalisen Ig:n tuotto ia vitro: Kontrolli- ja cGVHD- • · hiiristä poistettiin pernat ja valmistettiin yksinkertaiset * « 30 solusupensiot. Soluja käsiteltiin Trisillä puskuroidulla ammoniumkloridilla erytrosyyttien poistamiseksi ja valkosolu-jen kokonaismäärä laskettiin visuaalisesti hemosy tome tri llä.
'· ! Soluja inkuboitiin (5 x 106) yhdessä millitrassa täydellistä (c)RPMI 1640 -alustaa (täydennetty 10 prosentilla vasikan 35 sikiön seerumia (Hyclone, Logan UT, 25 mmoolia/1 HEPESiä, 2 mmoolia/1 L-glutamiinia, 5000 U/ml penisilliiniä ja 5000 mg/ml streptomysiiniä) kolmen päivän ajan 37 °C:ssa, viisi- 38 105528 prosenttisessa C02:ssa. Viljelmäsupernatantit koottiin ja ja solut koottiin niistä ja Ig määritettiin isotyypille spesifisellä ELISA-määrityksellä.
5 Isotyypille spesifiset ja antigeenille spesifiset ELISA-mää-ritykset: ELISA IgG^n ja IgA:n ilmaisua varten: Vuohen anti-hiiri-IgG^a tai -IgA:ta (10 μg/ml; Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham AL), joka oli PBS:ssa, absorboitiin 96-kammioisen polyvinyylimikrotiitterilevyn kammioiden 10 pinnalle yhden tunnin ajan 37 °C:ssa, sitten yön ajan 4 °C:ssa. Levyt pestiin ja niitä käsiteltiin PBS:llä, joka sisälsi yhden prosentin FCS:ää, yhden tunnin ajan 37 °C:ssa. Levyt pestiin jälleen ja niihin lisättiin sopivat superna-tanttien ja standardikontrollien (IGG! ja IgA, Southern Bio-15 technology Associates, Inc., Birmingham AL) laimennuksia kahden tunnin ajaksi 37 °C:ssa. Mainitun ajan kuluttua levyjä pestiin kolme kertaa ja niihin lisättiin alkaliseen fosfa-taasiin konjugoitua anti-hiiri IgG^ia tai IgA:ta (laimennukset 1/500) (Southern Biotechnology Associates, Inc., Bir-20 mingham Alabama) kahden tunnin ajaksi 37 °C:ssa. Levyjä pestiin perusteellisesti ja niihin lisättiin fosfaattisubstraat-tia (1 mg/ml; Sigma Diagnostics, St. Louis, MO), jolloin tuloksena oli sopiva värin muuttuminen. Lukemat määritettiin ELISA-lukijalla (Dynatech Laboratoriesm Inc) 410 nm:n absor-25 banssilla. Ig:n pitoisuudet määritettiin vertaamalla sopivalla isotyypillä laadittuun standardikäyrään ja ne ilmaistiin .* * keskiarvona + standardivirhe (n=3) .
·· · >»»
IgE:n ilmaisu ELISAlla: 96-kammioisen mikrotiitterilevyn T: 30 kammiot päällystettiin anti-hiiri-IgE:tä sitovalla vasta- aineella (B1E3 (2mg/ml)) yön ajan 4 °C:ssa ja sitten levyjä , .·. käsiteltiin PBS:llä, joka sisälsi yhden pprosentin FCS:ää, yhden tunnin ajan 37 °C:ssa. Levyjä pestiin jälleen ja niihin lisättiin supernatanttien ja standardikontrollien (A3Bl(IgE)) i 35 sopivia laimennuksia kahden tunnin ajaksi 37 °C:ssa. Levyt pestiin perusteellisesti ja kuhunkin kammioon lisättiin EM95- i
Biotiinia (5 mg/ml) ja niitä inkuboitiin kahden tunnin ajan I I 1 / ( ( i I i 9 < f 39 1 0 5 5 2 8 37 °C:ssa. Tämän ajan jälkeen lisättiin alkaliseen fosfataa-siin konjugoitua streptavidiinia (laimennus 1/500) kahden tunnin ajaksi ja sitten kammioita pestiin perusteellisesti, ennenkuin niihin lisättiin fosfataasisubstraattia (1 mg/ml); 5 Sigma Diagnostics, St. Louis, MO), minkä tuloksena väri muuttui sopivasti. Lukemat määritettiin ELISA-lukijalla (Dynatech Laboratories, Inc.) 410 nm:n absorbanssilla. Ig:n pitoisuudet määritettiin vertaamalla standardikäyrään ja ne ilmaistiin keskiarvona + standardivirhe (n=3).
10
Anti-DNA-Ab:n ilmaisu ELISAlla: Vasikan kateenkorvan DNArta (Sigma, St. Louis, MO.) (5 Mg/ml) liuotettiin kytkentäpusku-riin, joka sisälsi 0,1 moolia/1 natriumkarbonaatti/natriumbi-karbonaattia (pH 9,8). Tätä keitettiin 10 minuutin ajan ja 15 sitten sitä inkuboitiin jäiden päällä 3 minuutin ajan. Sitten määritettiin DNA:n OD. 260 ja pitoisuus säädettiin siten, että saatiin DNA:n pitoisuudeksi vaadittu 5 Mg/ml. Liuosta lisättiin sitten 100 μ1:Ά& 96-kammioisen polyvinyylimikro-tiitterilevyn kammioihin ja levyjä inkuboitiin yön ajan 4 20 °C:ssa. Sitten levyjä pestiin kolme kertaa ja niitä käsiteltiin yhden tunnin ajan 37 °C:ssa PBS:llä, joka sisälsi l prosenttia FCS:ää ja 0,02 prosenttia natriumatsidia. Levyt pestiin jälleen ja niihin lisättiin seeruminäytteiden sarja-laimennukset (100 ml) ja niitä inkuboitiin kahden tunnin ajan 25 37 °C:ssa. Kuhunkin kammioon lisättiin sitten ilmaisuun käy tettävää vasta-ainetta, alkaliseen fosfataasiin kytkettyä vuohen anti-hiiri-IgG^a, ja inkuboitiin jälleen kerran kah-v : den tunnin ajan 37 °C:ssa. Levyt pestiin perusteellisesti ja :#φ>: niihin lisättiin fosfataasin substraattia (1 mg/ml, Sigma : 30 Diagnostics, St. Luis, MO), mikä johti sopivaan värin muutok-
• · V
.’I'; seen. Lukemat määritettiin ELISA-lukijalla (Dynatech Labora- m tories, Inc.) 410 nm:n absorbanssilla. Vasta-ainetiittereitä verrattiin positiivisiin seeruminäytteisiin ja tulokset il- · · ”! maistiin mielivaltaisina yksiköinä.
35
Donoriperäisten solujen ilmaisu virtaussytometrillä: Pernat poistettiin normaaleilta BDF^cGVHD-hiiriltä, joita oli käsi- « · • · · · • · • · in 105528 40 telty anti-gp39:llä tai jotka olivat käsittelemättömiä, ja valmistettiin yksinkertainen solususpensio. Solut kerrostettiin Ficoll-Hypaquelle (4:1) ja sitten niitä sentrifugoitiin nopeudella 2000 kierrosta minuutissa 20 minuutin ajan huo-5 neenlämpötilassa. Muodostunut lymfosyyttikerros poistettiin ja se pestiin kerran BSS:llä, joka sisälsi 5 prosenttia FCS:-ää ja värjäykseen käytettiin 1 x 106 solua putkea kohti lopullisessa 50 μ1:η tilavuudessa. Kuhunkin putkeen lisättiin 50 μ1:ΆΆ rotan seerumia, jotta estettiin epäspesifinen vasta-10 aineiden sitoutuminen. Solut värjättiin (a) kontrollivasta- aineilla: rotan Ig-FITC:llä (lopullinen laimennus 1:100) sekä PE-streptavidiinilla (lopullinen laimennus 1:500) ja (b) FITC H-2Kb:llä sekä biotiiniin kytketyllä H-2Dd:llä (molemmat lopullisena laimennuksena 1:100). Soluja inkuboitiin 20 mi-15 nuutin ajan jäiden päällä ja sitten ne pestiin kahdesti jotta sitoutumattomat vasta-aineet saatiin poistettua. PE-strep-tavidiina (lopullinen laimennus 1:500) lisättiin lopuksi sopivaan putkeen, 20 minuutin ajaksi jäiden päällä, biotiiniin konjugoidun vasta-aineen ilmaisemiseksi. Soluja pestiin 20 jälleen kaksi kertaa analyysiä varten, joka toimitettiin laitteella Becton Dickinsonin FACScan-laitteella. Positiivisen pulssin avainnuksen jälkeen etummaisen ja sivusironnan kautta koottiin näytettä kohti 10 000 tapahtumaa asiaankuuluvan MHC-haplotyypin suhteen positiivisten solujen prosentti-25 määrän määrittämiseksi.
·.*.· Kromin vapautumisen määritys CTL-määrityksen arviointia var- V : ten. 51Cr:lla leimatut kohdesolut pestiin ja siveltiin 96- : kammioisille levyille 1x10* solua kammiota kohti efekto- : 30 risolujen kanssa siten, että suhde E:T oli 100:1, 20:1 ja
«M
4:1. Käytetyt kohdesolut, olivat P815 (H-2d) , LB27.4 (H-2bxd) sekä cll8,5(H-2 ). Levyjä sentrifugoitiin lyhyesti ja sitten . .·. niitä inkuboitiin 37 °C:ssa, viisiprosenttisessa C02:ssa nel-
« t I
jän tunnin ajan. Levyt sentrifugoitiin vielä kerran ja erä • · * 35 solutonta supernatanttia koottiin kustakin kammiosta gamma-.laskijalla suoritettavaa laskua varten. Spesifisen hajoamisen I f « i|<f: prosenttimäärä määritetään kaavan (a-b)/c avulla, jolloin a =
I < I
· · < · » « ·
I
41 105528 iskuja minuutissa, joita vapautuu kohdesoluista, joita on inkuboitu efektorisolujen kanssa, b = iskuja minuutissa, joita vapautuu kohdesoluista, joita inkuboitiin alustan kanssa yksinään (spontaanivapautuminen) ja c = kohdesoluille 5 saadut, jäädytys-sulatuksella vapautuvat iskut minuutissa (arviolta 80 prosenttia liittyneistä iskujen kokonaismäärästä minuutissa).
Akuuttien GVHD-pernasolujen sekundaarinen stimulaatio in 10 vitro. Akuutit GVHD-pernasolut poistettiin anti-gp39:llä käsitellyistä, Hlgillä käsitellyistä ja käsittelemättömistä eläimistä. Pernoista poistettiin punasolut ja sitten ne annosteltiin 1 x 104 solua kammiota kohti. Sopiviin kammioihin lisättiin säteilytettyjä stimulaattorisoluja (P815). Seitse-15 män päivän jälkeen toimitettiin CTL-määritykset sopivia kohteita kohtaa, kuten aiemmin mainittiin.
Tulokset GVHD tuottaa hiiressä tulokseksi pernan suurentuneisuuden.
20 Eräs cGVHD:n seurauksista hiiressä on pernan suurentuminen. Ensi sijaisesti isännän omat solut suodattuvat pernaan ja laajentavat sitä, vaikka tämä on vaste luovuttejasolujen läsnäololle (Rolink, A.G. et ai. (1983) J. Exp. Med. 158, 546). Kuvio 5 ilmaisee, että 7-14 päivän kuluttua cGVHD:n 25 alkamisesta, pernat sisältävät melkein kaksi kertaa niin paljon leukosyyttejä kuin hiiri ilman cGCHD:tä. CGVHD:n tau-din puhjetessa hiirien hoito anti-gp39:llä (250 μg/hiiri,
III
' päivinä 0, 2, 4 ja 6) vähentää leukosyyttien (perna) lukumää- • Il ·...· rää cGVHD-hiirillä, sellaisiin arvoihin, jotka olivat ident- :.i.: 30 tisiä niiden arvojen kanssa, jotka saatiin hiiriltä, jotka eivät poteneet mainittua tautia.
; GVHD:n indusoima polyklonaalisen immunoglobuliinin ylituotan- • · · to.
t i · 35 On raportoitu, että sellaisilla hiirillä, jotka potevat cGVH- ·· D:ta, on Ig:n ylituotantoa, joka johtuu samaa alkuperää ole- vista vuorovaikutuksista luovuttajan T-solujen ja B-solujen · 42 105528 välillä (Morris et ai. (1990) J. Exp. Med. 171, 503). Sen seikan määrittämiseksi, inhiboiko anti-gp39 Ig:n ylituotantoa, annettiin cGVHDrtä poteville hiirille anti-gp39:ää. Päivinä 7 ja 14 poistettiin pernat kontrollilta sekä cGVHD-5 hiiriltä ja B-soluista määritettiin in vitro igG^n ja igArn spontaani tuotto in vitro. cGVHDrtä potevilta hiiriltä saadut splenosyytit tuottivat in vitro suuria määriä IgArta ja IgG^ :a (kuviot 6A ja 6B). Sellaiset splenosyytit, jotka saatiin hiiriltä, jotka potivat cGVHDrtä ja joita käsiteltiin anti-10 gp39:llä (päivinä 0, 2, 4 ja 6) tuottivat kuitenkin IgG-^htä ja IgArta sellaisia määriä, jotka olivat identtiset niillä hiirillä tuotettujen määrien kanssa, joilla ei ollut mainittua sairautta. Anti-gp39rn lisäys sellaisten hiirten pernasolujen viljelmiin, jotka potivat cGVHDrtä, ei vähentänyt 15 Ig:n tuoton tasoa in vitro, mikä viittaa siihen, että anti-gp39 vaikuttaa in vivo.
Kun näissä kokeissa käytettiin kontrollina hamsterin Igrtä (HIg), havaittiin, ettei GVHDrn induktiossa ilmennyt mitään 20 inhibitiota, vaan sairaus suorastaan korostui, ei ainoastaan polyklonaalisen Igrn tuottona, vaan myös sairaudesta aiheutuvana pernan suurentumisena. Igrn tuottotaso lisääntyi kahdek-sankertaiseksi, kun GVHD indusoitiin yhden viikon ajan Hlgr-llä hoidettuihin hiiriin, verrattuina hoitamattomiin hiiriin, 25 joihin GDHD indusoitiin yhden viikon ajan. Oli ilmeistä, että itse HIg on immunogeeninen. F^vastaanottajahiiret, joita ei ‘..1 hoidettu, päätettiin sen tähden nimittää asiaankuuluvaksi • · · I I · kontrolliryhmäksi.
* · • « '···’ 3 0 Anti-gp39rn vaikutus GVHDrn indusoimaan seerumin hyper-IgEr- • · v * hen ja anti-DNA-autovasta-aineisiin.
cGVHDrn kulkua voidaan tarkkailla seerumin IgErn sekä kak-: sisäikeisen DNArn vasta-aineiden nousun perusteella (Morris, S.E. et ai. (1990) J. Exp. Med. 171, 503). Seerumin IgErn 35 määrä mitattiin IgErlle spesifisellä ELISAlla. Hiiriin aikaan saatua kroonista GVHDrtä hoidettiin anti-gp39rllä päivinä 0, 2, 4 ja 6 ja sitten ei enää annettu mitään vasta-ainetta.
t» * • · * « 9 9 · 43 105528
Hiiristä otettiin verta viikoittain ja selvitettiin seerumien IgE:n määrät (kuvio 7A). cGVHD sai aikaan seerumin IgE-taso-jen 10 - 15 -kertaisen lisääntymisen. Anti-gp39:n anto inhiboi cGVHD:n indusoimat seerumin IgE:n lisäykset aina kahdek-5 saan viikkoon saakka sairauden puhkeamisesta. Seerumin lisääntyneen IgE:n inhibition lisäksi anti-gp39 saa aikaan myös seerumin anti-DNA:n autovasta-aineiden tuoton eston. Krooninen GVHD aiheuttaa 5-10 -kertaisen lisäyksen anti-DNA-vas-ta-aineiden havaitussa tasossa, jota anti-gp39-hoito vähensi 10 (kuvio 7B).
Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että anti-gp39:n (MR1- klooni) puoliintumisaika on 12 päivää (Foy, T.M. et ai.
(1993) J.Exp. Med. 178, 1567 - 1575). Anti-gp39:lie spesifi- 15 set ELISA-määritykset ilmaisevat, että käsiteltyjen hiirien seerumissa ei ollut ilamistavissa anti-gp39:ää kahdeksan viikon kuluttua hoidosta. Pysyvä anti-gp39 ei sen tähden voi selittää cGVDH:n pitkällistä tukahduttamista. Tehtiin siirto- tutkimuksia sen tutkimiseksi, voivatko sellaiset splenosyytit 20 siirtää cGVHD:tä, jotka olivat peräisin hiiriltä, joilla oli cGVHD, sekä sellaisilta hiiriltä, joille oli annettu anti- gp39:ää. Sellaisilta hiiriltä saadut splenosyytit, jotka oli saatu hiiriltä, joille oli annettu cGVHD:tä sekä anti-gp39:- ää, eivät kyenneet saamaan aikaan lgE:n lisääntymistä seeru- 25 missä eikä anti-DNA-autovasta-aineita adoptiosiirrossa; sitä vastoin splenosyytit, jotka olivat peräisin sellaisilta hii- '1·' riitä, joissa oli cGHVD, lisäsivät slgErtä ja anti-DNA-vasta- • · · : aineita. Nämä tulokset viittaavat siihen, että alloreaktiivi- • · · set T-solut on saatu anti-gp39-käsittelyllä passiivisiksi.
: 30 ·»«
Alloreaktiivisten luvuttajasolujen ilmaisu.
Kun analysoitiin sellaisten hiirien pernoja luovuttajaperäis- . .·. ten solujen suhteen, joissa cGVHD oli saatu aikaan, havait- • 1 1 "·, ti in, että verrattuna normaaliin BDFj^een, joka värjäytyy • I 1 t 35 kaksinkertaisesti positiiviseksi H-2Kb:n ja H-2Dd:n suhteen, cGVHD:llä oli arviolta 5-7 prosenttia luovuttajan soluja.
I I f ',,.1 Nämä solut olivat peräisin DBA/2: s ta ja sen tähden ne värjäy- « · 1 < t •« · 44 105528 tyvät yksikertaisesti positiivisiksi H-2Dd:n suhteen. Nämä solut olivat ilmaistavissa anti-gp39-käsittelystä huolimatta. Tämä valaisee sitä seikkaa, että anti-gp39-käsittely sallii donorisolujen siirtämisen sallimatta mitää auttajatoimintoa 5 vastaanottajan B-solujen suhteen, mikä antaa tulokseksi Ig:n tuoton käsittelemättömässä cGVHD-ryhmässä.
Anti-gp39-käsittelyn vaikutus akuutin GVHD:n induktioon.
10 Akuutti GVHD liittyy lisääntyneen anti-allogeenisen CTL-vas-teen induktioon. Vaikka on selvää, että gp39-CD40-vuorovaiku-tukset ovat kriittisiä Th-B-soluvuorovaikutuksille, ei ole selvää, voiko anti-gp39-terapia muuttaa muiden imrouuniefekto-rimekanismien induktiota. AGVHD indusoitiin siten, että Fj_-15 vastaanottajalle annettiin C57BL/6-pernasoluja. Kuten kuviossa 8 esitetään, 12 päivän kuluttua allogeenisten solujen siirrosta mitattiin selvä H-2b-anti-H-2d-CTL-vaste. Hiirien käsittely anti-gp39:llä mutta ei HIgillä esti H-2b-anti-H-2d-CTL:n tuoton (kuvio 8). Anti-gp39:llä tapahtunut hoito vähen-20 si CTL-vasteita yhdessä kahdesta kokeesta pienemmiksi kuin havaittiin luonnonmukaisilla pernasoluilla. Tämä viittaa GVHD-hiiristä saatuihin pernasoluihin, joilla annetaan "heräte" . Jos näitä pernasoluja sitten viljellään seitsemän päivän ajan säteilytettyjen P815-solujen kanssa ja sitten toimite-25 taan CTL-määritys, nämä solut eivät onnistu saamaan aikaan sekundaarista stimulaatiota P815-soluja kohtaan, kuitenkin v.' normaali BDFj^-perna saa aikaan primaari vasteen. Sellaisilla
Ml V · hiirillä, joihin oli indusoitu aGVHD mutta joita ei oltu käsitelty, sekundaarinen immuunivaste ilmeni odotetusti. Nämä : 30 tulokset ilmaisevat, että akuuttien GVHD-hiirien käsittely ··· anti-gp39: llä tekee CD8+-populaation passiiviseksi sekundaa-riselle stimulaatiolle.
• · · • · ·
Tulosten tarkastelu a · · 35 Pernan suurentuneisuuden suunnan muutos (kuvio 5), Ig:n yli-tuotannon inhibitio (kuviot 6A ja 6B) , seerumin IgE:n tasojen j inhibitio sekä anti-DNA-autovasta-ainetuotannon (kuviot 7A ja f < · • · 45 105528 7B) inhibitio hiirissä, joissa on indusoitu GVH sekä joille on annettu anti-gp39:ää, viittaavat siihen, että anti-gp39 estää siirrettyjen T-solujen kyvyn saada aikaan isännän B-solun aktivaatio. Tämä splenomegalian inhibitio ja polyklo-5 naalisen IgG^n ja IgA:n tuotto jää alhaiseksi seitsemän päivän ajaksi vasta-aineen annon päättymisestä. IgE:n ja anti-DNA-vasta-aineiden väheneminen kestää kahdeksan viikkoa, vaikka käsittely on päättynyt. Nämä tulokset ilmaisevat, että reaktiokykyisten T-solujen klonaalinen puuttuminen on vaikut-10 tanut T-solutoimintaan tai että on ilmennyt T-solujen energian puuttumista. Aiemmin on osoitettu (Van den Eertwegh et ai. (1993) J. Exp. Med. 178, 1555 - 1565), että sytokiiniä tuottavat solut säilyvät normaaleina vasta-aineella käsitellyissä hiirissä immunisoitujen hiirien in situ -tutkimuksissa. Tämä 15 ilmaisee, että T-solut eivät häviä käsittelyn seurauksena.
Kun cGVHD-hiiristä analysoitiin donoriperäisten solujen läsnäolo, niitä löydettiin, olipa eläin sitten käsitelty anti-gp39:llä tai käsittelemätön. Anti-gp39:llä on täten kyky indusoida passiivinen tila näihin donorin T-soluihin, mikä 20 sallii vasta-ainevasteiden inhibition. Jos pernoja siirrettään näistä eläimistä luonnonmukaisiin vastaanottajiin, vasta-aineiden määrä itse asiassa lisääntyy, kun luovuttajien pernat ovat käsittelemättömiä cGVHD:ita, mutta anti-gp39:llä käsitellyt cGVHD-hiiret eivät pysty saamaan aikaan sekundaa-25 rista cGVHD-tilaa siirron jälkeen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että anti-gp39 häiritsee T-solujen kykyä tuoda esiin voimakasta kliinistä GVHD-immunopatologiaa sekä splenomegali- • · · aa, niin että vasta-aineen anto tuo esiin reagoimattomuuden '···* CD4+-alapopulaatiossa.
30 • · · *.· · On raportoitu, että tarvitaan B-soluja auttamaan CTL:ien induktiota, mikä on nähtävissä, kun sellaisilla hiirillä, : joilta puuttuu B-soluja, tutkitaan suojaavan T-soluimmunitee- tin induktiota Friendin leukemiaviruksen hiirellä aikaan-35 saamaa leukemiaa kohtaan (Schultz, K.R. et ai. (1990) Science
i I I
249). Täten on ajateltavissa, että sellaisilla hiirillä, j · ·;' joissa on indusoitu aGVHD, anti-gp39 inhiboi B-solujen akti- • · |4« « 46 105528 vaatiota ja estää täten antigeenin läsnäolon ja täten tärkeimmät CD8+T-solut. On myös ehdotettu, että CD8+CTL:n synnyttäminen edellyttää vuorovaikutusta luokkaan II rajoittuneiden Th-solujen kanssa (von Boehmer, H. et ai. (1979) J.
5 Exp. Med. 150, 1134; Keene, J. et ai. (1982) J. Exp. Med.
155, 768) ja että kun TCR-affiniteetti on vähäinen, tarvitaan CD4+:n välittämää T-soluapua in vivo (Gao, X. et ai. (1991) J. Immunol. 147, 3268).
10 On tehty tutkimuksia, joissa on tarkasteltu CD28-B7/BBl-vuo-rovaikutusten roolia CD8+CTL-vasteiden induktiossa. Havaittiin, että CD28-B7/BBl-vuorovaikutukset olivat tarpeellisia ja riittäviä luokan I MCH-spesifisen CTL:n tuottamiselle (Harding, F.A. ja Allison, J.P. (1993) J. Exp. Med. 177, 15 1791). On viitattu siihen, että CD40:n ligandi voi olla tär keä B7:n induktori (Ranheim, E.A. ja Kipps, T.J. (1993) J.
Exp. Med. 177, 925), kuten sellaiset tutkimukset esittävät, joihin sisältyy B7:n ilmentymisen inhibitio CD40:n vasta-aineiden aiheuttama normaaleilla ja leukemiasoluilla pinnal-20 la. Nämä tutkimukset yhdessä ilmaisevat, että anti-gp39 voi estää CD4+T-solujen vuorovaikutuksen B-solujen kanssa jättäen täten indusoimatta B7:n ilmentymisen, mikä sallii sen, että B-solu tehokkaasti aktivoi T-solun proliferaatita ja saa sen tuottamaan sytokiinejä. Yhteenvetona nämä tulokset viittaavat 25 siihen, että CD4+T-soluja tarvitaan CTL-muodostumisen induktioon ensin T-B-solujen samaa alkuperää olevalla vuorovaiku- '·'· tuksella gp39:n ja sen ligandin CD40:n välillä. CD40:n mer- • · · V · kinanto B-solujen pinnalla sallii sitten B7/BBl:htä lisäävän • · · säätelyn. B7/BBl:n keskinäinen vuorovaikutus sen ligandin ://*. 30 CD28:n kanssa T-solujen pinnalla voimistaa sitten T-solun i‘i*; proliferaatiota ja sytokiinin tuottoa. Jos T-solulle kuiten kin annetaan vain yksi signaali, se on gp39:n-vuorovaikutus . .·. CD40:n kanssa, eikä se saa toista signaalia, silloin T-soluun » t i indusoidaan reagoimattomuus ja siitä tulee siedätetty tai « « · 35 siltä on poistettu energia.
V
* « · « • « i : 1 · » · • · * # · t · • * 47 1 0 5 5 2 8 Nämä tutkimukset ilmaisevat, että kun aGVHD indusoidaan hiirissä, saadaan anti-H-2d-vaste. Kuitenkin jos eläimiä käsitellään anti-gp39:llä, silloin ei havaita mitään CTL-vastet-ta. Voi olla selvää, että anti-gp39 inhiboi CTL:n muodostu-5 mistä aiemmin kuvatulla menetelmällä (Schultz, K.R. et ai. (1990) Science 249). B-solujen aktivaatio CD40-ligaation kautta epäonnistuu, ja B-solut eivät kykene täten edistämään CTL:ien induktiota. Tutkimuksemme osoittivat lisäksi, että kun pernasoluja stimuloidaan In vitro P815-soluilla, sellai-10 set solut, jotka olivat alttiina anti-gp39:lie in vivo, havaittiin kykenemättömiksi saamaan aikaan sekundaarista anti-H-2dCTL:a. Voidaan täten osoittaa, että anti-gp39 on indusoinut toleranssitilan T-soluosaston pinnalle, koska gp39 ei kykyne kytkemään CD40:ntä, täten ei ole olemassa mitään B7/B-15 Bl:ää lisäävää säätelyä ja näin ollen T-soluja ei saada enää aktivoitua ja ne jäävät passiivisiksi. On myös tunnettua, että lepäävät B-solut tavallisesti ovat allogeenisten T-solu-jen tehottomia stimulaattoreita seoslymfosyyttien reaktiossa lukuunottamatta esiaktivaatiota anti-IgM-vasta-aineilla, 20 PMA:lla tai LPS:llä (Inaba, K. ja Steinman, R.M. (1989) J.
Exp. Med. 160, 1717; Metley, J. P. et ai. (1989) J. Exp. Med. 169, 239; Frohman, M. ja Cowing, C. (1985) J. Immunol. 134, 2269). Tämän lisäksi B-soluihin kohdistuva liukoinen monomee-riantigeeni, joka on tarkoitettu annettavaksi in vivo, voi 25 antaa tulokseksi spesifisen T-solun energian häviön (Eynon, E.E. ja Parker, D. (1992) J. Exp. Med. 175, 131). Täten näyt-tää todistettavalta, että antigeenin ja kytkeytyvien APC:iden v : antomenetelmän mukaan voidaan indusoida energian puutos tai if · • toleranssi. Annettaessa P815-solujen testiannos eli "haaste"
t30 pernan CD8+T-soluosastoa vastaan, ei tarvita antigeenin tar-j*:': jontaan, alloantigeeni voidaan antaa täten suoraan ja CTL
voidaan indusoida. Pernojen passiivisuus sekundääristä stimu-, ,·. laatiota kohtaan ilmaisee, että tässä järjestelmässä voidaan f i i V·.'' indusoida allospesif inen toleranssi.
\ ' 35 Tämä tulos on vastakohta aiemmille tuloksille (Foy, T.M. et ι,,,ί ai. (1993) J. Exp. Med. 178, 1567 - 1575), jotka ilmaisevat, i « * I f r « « c i * 111 , I · I · „ 105528 että vasta-aine ei indusoi tuota toleranssia antigeeni-spesifisessä järjestelmässä. Kaksi järjestelmää eroaa toisistaan, koska aGVHD-malli tarjoaa alloantigeenin, joka jo on sidottu antigeenin tarjoamiin soluihin, kun taas antigeenis-5 pesifisten järjestelmien kanssa antigeeni annetaan ja otetaan kiinni in vivo, sitä prosessoi ja sen luovuttaa menetelmän mukainen APC. Näyttää siltä, että anti-gp39:llä on erilaisia vaikutuksia käytetyn antigeenin ja tarjontamenetelmän mukaan.
10 Voidaan päätellä, että anti-gp39 voi indusoida allospesifisen toleranssin immuunisysteemin sekä CD4+- että CD8+-osastoissa, ja tämä voi olla selvä hyvää tekevä terapeuttinen toimenpide, kun ajatellaan siirrännäisen immunologiaa ja immunoterapiaa.
On mahdollista, että sellaisilla potilailla, joille tapahtuu 15 luuydinsiirroksia, anti-gp39-hoito on riittävä toleranssin indusoimiseksi siirrännäistä kohtaan ja estämään siirrännäis-käsittelyjen sellaiset seuraukset kuten GVHD.
Esimerkki 6: Anti-gp39-vasta-aineiden tuotto ja luonnehtimi-2 0 nen
Koe 1 - Humaani gp39:ää vastaan suunnatut vasta-aineet Antigeenispesifisen T-solutoleranssin indusoimiseksi ihmisellä on edullista antaa vasta-ainetta, joka on suunnattu ihmisen gp39:ää kohtaan. Käytettiin seuraavaa metodiikkaa mono-25 klonaalisten hiiren anti-humaani-gp39-vasta-aineiden tuot toon. Balb/c-hiiriä immunisoitiin liukoisella gp39-fuusiopro-teiinilla, gp39-CD8:11a, täydellisessä Freundin adjuvantissa , · · (CFA). Tämän jälkeen, kuusi viikkoa myöhemmin, hiirille an-nettiin haaste liukoisella gp39-CD8:11a, joka oli epätäydel-M,· 30 lisessä Freundin adjuvantissa (IFA). Liukoista gp39-CD8:aa : annettiin liukoisessa muodossa neljän viikon kuluttua toises ta immunisaatiosta. Sitten hiirien immunisointia tehostettiin • aktivoiduilla ihmisen perifeerisen veren lymfosyyteillä kaksi • · 9 ,'.'1 viikkoa myöhemmin, minkä jälkeen vielä kahden viikon kahden 35 viikon kuluttua annettiin lopullinen tehoste, joka käsitti « i « liukoista gp39-CD8:aa. Splenosyytit sulautettiin normaalien I » r i c < · f i r « i < • « i < ( I f I t « · ( · 49 105528 ohjeiden mukaan NS-l-sulautuspartnerin kanssa neljäntenä päivänä lopullisesta immunisaatiosta.
Anti-humaani-gp39-vasta-aineita tuottavat kloonit valittiin 5 moninkertaisen seulontamenetelmän perusteella. Kloonit seulottiin aluksi levyllä toimitetulla sidontamäärityksellä (by a plate binding assay), jossa käytettiin gp39-CD8:aa. Positiiviset kloonit seulottiin sitten kontrollina toimivaa CD8-fuusioproteiinia, CD72-CD8:aa vastaan. Poistettiin sellaiset 10 kloonit, jotka arvosteltiin positiivisiksi levyllä suoritetulla CD8-CD72-sidontamäärityksellä. Tämän jälkeen jäljelle jäävät kloonit seulottiin lepäävillä ja kuusi tuntia aktivoiduilla ihmisen perifeerisen veren lymfosyyteillä (PBL) virtaussytometrianalyysiä käyttäen. Sellaisia hybridoomia 15 pidettiin positiivisina, jotka värjäsivät aktivoituja muttei lepääviä PBLriä. Jäljelle jäävät kloonit tutkittiin lopuksi niiden kyvyn suhteen estää CD40Ig:n sitoutuminen levyyn sidottuun gp39:ään.
20 Arviolta 300 kloonia seulottiin levysitoutumismäärityksissä aluksi gp39-CD8:aa ja CD72-CD8:aa vastaan. Näistä klooneista 30:n havaittiin ilmaisevan levyyn sidottua gp39:ää mutta ei CD:tä. Nämä kloonit seulottiin myöhemmin gp39:n ilmaisun suhteen aktivoidulla humaani-PBL:llä. Arviolta 15 kloonia 25 ilmaisi molekyylin aktivoidulla PBL:llä mutta ei lepäävillä soluilla. Lisäksi varmistettiin spesifisyys siten, että mää-’•V ritettiin kloonien kyky estää levyyn sidotun gp39:n ilmaisu t·» V : CD40Ig:n avulla. Kolme kymmenestä tutkitusta kloonista esti • i t CD40Ig:n sitomisen tässä määrityksessä. Nämä kloonit olivat l i''. 30 3E4, 2H5 ja 2H8. Tällaisia klooneja pidetään edullisina käy- jT; tettäviksi tässä dokumentissa kuvatuissa menetelmissä. Sei- laiset kloonit, jotka tutkimuksen perusteella olivat positii- , visia aktivoiduilla mutta ei lepäävillä PBL:illä, seulottiin # · · "ΐ, myös reaktiokyvyn suhteen rotan aktivoidun T-solukloonin, < * f 35 POMC8:n kanssa. Klooni 2H8 ilmensi ristireaktiokykyä rotan f tämän T-solulinjan kanssa.
» « ' i : 14» w
- I V
< « % f * I V ( I f
• I I
• % « · 50 105528
Koe 2 - Humaani-gp39:ää kohti suunnatut vasta-aineet
Esimerkissä 1 kuvatun menettelytavan kaltaista menetelmää käytettiin lisävasta-aineiden tuottamiseen humaani-gp39:ää 5 vastaan. Yksi Balb/c-hiiri immunisoitiin liukoisella gp39-CD8:lla, joka oli CFArssa, mitä seurasi stimulointi kuusi tuntia aktivoiduilla ihmisen perifeerisen veren lymfosyyteillä, mikä tapahtui neljä viikkoa myöhemmin. Tämän jälkeen hiiret saivat tehosteen liukoisella gp39-CD8:lla neljä päivää 10 ennen splenosyyttien sulauttamista NS-l-sulauttamispartnerin kanssa normaalien ohjeiden mukaisesti. Hybridoomakloonit seulottiin ihmisen kuusi tuntia aktivoitujen PBLrien virtaus-sytometrivärjäyksellä. Valittiin kloonit, jotka värjäsivät aktivoituja mutta ei lepääviä ihmisen PBL:iä. Lisäanalyysiä 15 varten valittiin kuusi kloonia, jotka olivat 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 ja 89-79.
Valittujen vasta-aineiden spesifisyys varmistettiin useilla määrityksillä. Virtaussytometrianalyysi havainnollisti ensin, 20 että kaikki kuusi mAb:tä värjäsivät aktivoituja mutta ei perifeerisen veren lepääviä T-soluja (katso tyypillisten esimerkkien suhteen kuvioita 9B sekä 9C, jotka kuvaavat aktivoitujen T-solujen värjäytymistä vastaavasti 4D9-8:lla ja 4D9-9:llä). Kunkin kuuden vasta-aineen tunnistaman molekyylin 25 ilmentyminen on ilmaistavissa neljän tunnin kuluttua aktivaatiosta, se on suurimmillaan kuuden - kahdeksan tunnin kulut- .·· tua aktivaatiosta, ja eikä se ole havaittavissa 24 tunnin • · · kuluttua aktivaation jälkeen. Kaikki kuusi mAb:tä tunnistivat molekyylin, joka ilmentyi aktivoiduilla CD3+PBL: illä, jotka 30 olivat pääasiassa CD4+-fenotyyppiä, mutta osa CD8+T-soluja ilmensi myös molekyyliä. Kuuden mAb:n tunnistaman molekyylin .·. ilmentyminen inhiboitui viljelyalustassa, jossa oli syklospo- ·!*. riini A:ta, kuten gp39:n ilmentyminen (katso kuvioita 10A ja • 9 10B, jotka kuvaavat tyypillisinä esimerkkeinä syklosporiinil-35 la käsiteltyjen T-solujen värjäytymistä vastaavasti 4D9-8:lla ja 4D9-9:llä). Näiden mAb:eiden tunnistaman molekyylin ilmentymisen kinetiikat ja leviäminen ovat identtisiä gp39:n il- 51 105528 mentymisen vastaavien ominaisuuksien kanssa, kuten humaani-CD40Ig:n fuusioproteiini ilmaisi. Tämän lisäksi kaikki kuusi mAb:ta estävät gp39:n värjäytymisen CD40Ig:llä (katso kuvioita 11A ja llb, jotka edustavat tyypillisiä esimerkkejä, 5 jotka kuvaavat CD40Ig:llä tapahtuvan gp39:n värjäytymisen inhibitiota vastaavasti 4D9-8:n ja 4D9-9:n läsnäollessa). ELISA-määrityksessä kaikki kuusi mAb:tä tunnistavat gp39-CD8:n, joka on gp39-molekyylin liukoinen fuusiomuoto. Ennen kaikkea kaikki kuusi mAb:tä immunosaostavat noin 36 kd:n 10 suuruisen molekyylin, joka on peräisin 35S-metioniinilla leimatuista, aktivoiduista humaani PBL:stä. Immunosaostettu molekyyli on yhtäläinen humaani CD40Ig-fuusioproteiinilla saostetun fuusioproteiinin kanssa.
15 Kuuden valitun mAb:n (4D9-8, 4D9-9, 24-32, 24-43, 89-76 ja 89-79) funktionaalinen aktiivisuus määritettiin seuraavasti. Ensin mitattiin mAb:iden kyky inhiboida sellaisten puhdistettujen humaani B-solujen proliferaatio, joita oli viljelty IL-4:n ja liukoisen gp39:n kanssa. Puhdistettuja ihmisen B-solu-20 ja viljeltiin gp39:n ja IL-4:n kanssa puhdistettujen mono-klonaalisten vasta-aineiden tai CD40Ig:n kanssa sekä ilman niitä, annosten ollessa 0 - 12,5 /ig/ml. B-soluproliferaatio määritettiin viljelmästä kolmen päivän kuluttua tymidiinin liittymisen avulla. Tulokset (esitetty kuviossa 12) havain-25 nollistavat, että kaikki kuusi mAb:tä estävät B-solun proliferation, jonka gp39 ja IL-4 indusoivat. mAb:t 89-76 ja 24-; ; 31 olivat tehokkaimmat inhiboitaessa indusoitua B-soluproli- ,···. feraatiota. IC50 (sellaisen vasta-aineen pitoisuus, joka in- , .·. hiboi B-solujen proliferaation 50-prosenttisesti) oli arvioi- > · · '.Y.' 30 ta 1 μg/ml vasta-aineella 89-76 ja noin 1,25 μg/ml vasta- ' aineella 24-31.
* · ·
Seuraavaksi tutkittiin mAb:iden kyky inhiboida B-solun eri- *«· v ’ laistuminen, joka mitattiin Ig:n tuottona, jonka anti-CD3:n .;· 35 aktivoimat T-solut ja IL-2 saivat aikaan. Valmistettiin puh- distettuja IgD+-humaani-B-soluja positiivisen valinnan avul-t;t la, johon käytettiin FACS:ää, ja sitten viljeltiin anti-CD3:- f 4 4 4· 1 · 52 105528 11a aktivoitujen humaani T-solujen (mitomysiini C;llä käsiteltyjä) sekä IL-2:n kanssa kuuden päivän ajan puhdistettujen monoklonaalisten anti-gp-39-vasta-aineiden kanssa annosten ollessa 0-10 Mg/ml. IgM:n, IgG:n ja IgA:n tuotto määritet-5 tiin ELISAlla kuudentena päivänä. Tulokset (esitetty myöhemmin taulukossa 3) havainnollistavat, että kaikki kuusi vasta-ainetta voivat inhiboida B-solun erilaistumista, johon T-solu vaikuttaa, IgM:n, IgGtn ja IgA:n tuoton avulla mitattuna.
ICjjo (sellaisen vasta-aineen pitoisuus, joka tarvitaan inhi-10 boimaan Ig:n tuotto 50-prosenttisesti) oli alueella, joka oli kuudella mAb:lla 1,0 - < 0,1 Mg/ml, vasta-aineet 24-31 ja 89-76 mukaanluettuina.
Taulukko 3 15 Immunoglobiinin tuotto
mAb IgM IgG IgA
ei mitään - 17 500 6710 4471 4D9-8 0,1 4813 2130 2819 1.0 4394 2558 1519 10.0 1081 389 396 4D9-9 0,1 3594 919 1731 1.0 2659 1233 1606 10.0 374 448 266 20 24-31 0,1 3863 981 344 1.0 1287 314 165 **;’ 10,0 1120 594 23 • · · :·. 24-43 0,1 6227 4132 432 1.0 3193 2130 192 10.0 7021 1232 1081 •T: 89-76 0,1 3783 1069 344 1.0 2180 352 171 10.0 818 551 19 i : ______ - »
I I
« I 1 « · • · 105528 53 89-79 0,1 9763 1924 3021 1.0 2314 460 156 10.0 183 135 434
Anti-gp39-mAb:eiden vaikutuksen tutkimiseksi T-soluvasteiden 5 suhteen, mAb:t sisällytettiin normaaleihin seoslymfosyytti-reaktioihin (MLR). Viljeltiin 300 000 ihmisen perifeerisen veren lymfosyyttiä (stimulukseen reagoivat = R) 100 000 sä-teilytetyn allogeenisen perifeerisen veren lymfosyytin kanssa (stimulaattorit = S) anti-gp39-mAB:iden läsnäollessa ja puut- 10 tuessa (10 μg/ml). Viljelmille annettiin 3H-tymidiinilsykäyk-set päivinä 4, 5 tai 6 ja viljelmät koottiin 18 tuntia myöhemmin. Kaikki kuusi anti-humaani-gp39-mAb:tä inhiboivat allospesifisiä vasteita, jotka mitattiin MRL:llä (katso tyypillistä esimerkkiä kuviosta 13, joka kuvaa allospesifisten 15 vasteiden inhibitiota, kun R:ää ja S:ää inkuboidaan 24-31:n tai 89-76:n läsnäollessa, CTLA4-immunoglobuliinifuusioprote-iinia ja anti-CD28-mAb:tä käytettiin positiivisina kontrolleina) .
20 Sen seikan määrittämiseksi, tunnistivatko kuusi mAb:tä erillisiä epitooppeja humaani-gp39-molekyylin pinnalla, tehtiin ristiinestokokeita. Aktivoidut humaani-PBL:t estettiin ensin kullakin kuudesta mAb:stä (25 μg/ml konjugoimatonta vasta- . . ainetta). Solut pestiin ja sitten ne värjättiin biotiinin » ···, 25 kojugoidulla vasta-aineella, jonka pitoisuus oli 10 μg/ml, mitä seurasi reaktio fytoerytriiniin konjugoidun avidiinin kanssa (PE-Αν) . Solujen värjäys PE-Av:llä analysoitiin FACS:- * · ·' ‘ llä. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa 4.
30 • · « • · > · · « . i.
35 54 105528
Taulukko 4
Esto Värjäävä vasta-aine_
IAb 4D9-8 4D9-9 24-31 24-43 89-76 89-79I
ei mi- +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ tään 4D9-8 ND - ++++ ++++ +++ +++ 4D9-9 +++ ND +++ ++++ +++ +++ 24-31 + + ND +++ ++ ++
24-43 + + +++ ND ++ + I
89-76 + + + + + +++ ND + + +_|
89-79 + ++ +++ +++ +++ ND _I
Värjäyksen intensiteetti ja positiivisten solujen prosentti-5 määrä esitetään symbolilla + (++++ - MI>200; +++ = MI>125; ++ MI>50; + a MI>25; - = ei mitään värjäytymistä, joka on enemmän kuin tausta). ND = ei määritetty.
i < I f
Kaikki vasta-aineet estivät CD40Ig:n sitoutumisen aktivoi- * f i ' 10 tuihin humaani-PBL: iin. Taulukossa 4 esitetyt tulokset ha-vainnoll is tavat kuitenkin selvästi, että muutamat vasta-*,:. aineet eivät onnistuneet estämään muiden vasta-aineiden si-
III
· toutumista aktivoituihin humaani-PBL:iin, mikä viittaa sii hen, että ne tunnistavat erilaisia epitooppeja humaani -gp39-15 molekyylien pinnalla.
• · · « · · • ·
Ml
Hybridoomat 89-76 ja 24-31, jotka vastaavasti tuottavat vas- • · : " ta-aineita 89-76 ja 24-31, talletettiin Budapestin säädösten mukaan The American Type Culture Collect ioniin, Parklaw Dri- » 20 ve, Rocville, Md., syyskuun toisena päivänä vuonna 1994. Hy- • « bridoomalle 89-76 annettiin ATCC-tulonumero HB11713 ja hyb-ridoomalle 24-31 annettiin ATCC-tulonumero HB11712. Vasta-aineet 24-31 ja 89-76 ovat IgGl-isotyyppiä.
55 105528
Koe 3 - Hiiren gp39:ään kohdistuvat vasta-aineet
Keksinnön erässä sovellusmuodossa gp39-antagonisti on mono-klonaalinen hiiren anti-gp39-vasta-aine MR1. Käytettiin seu-5 raavaa menetelmää monoklonaalisen MR1-vasta-aineen tuottamiseksi ja sitä voidaan käyttää muiden sellaisten vasta-aineiden tuottamiseen, jotka kohdistuvat gp39:ään.
Hamstereita immunisoitiin vatsakalvonontelon sisälle 5-106:-10 11a aktivoidulla Thl-solulla (dl,6) kerran viikossa kuuden viikon ajan. Kun seerumin tiitteri hiiren Thl:htä kohtaan oli suurempi kuin noin 1:10 000, solujen yhteensulauttaminen toimitettiin polyetyleeniglykolilla siten, että käytettiin immuunin hamsterin splenosyyttejä sekä NS-l:htä. Kammioista 15 saadut supernatantit, jotka sisälsivät kasvavia hybridoomia, seulottiin virtaussytometrian avulla, lepäävillä ja aktivoiduilla Thl:llä. Yksi erityinen hybridooma, joka tuotti Mab:tä, joka selektiivisesti tunnisti aktivoidun Thl:n, tutkittiin edelleen ja alakloonattiin MRl:n saamiseksi. MR1 20 tuotettiin askitessa ja puhdistettiin ioninvaihto-HPLC:llä.
Hybridooma MR1 on tallennettu the American Type Culture Col-lectioniin ja sille on annettu tulonumero HB11048.
Samanarvoisuudet 25
Alan ammattimies tajuaa tai pystyy vain normaaleja rutiini-menetelmiä käyttämällä ottamaan selville samanarvoisuuksia tässä dokumentissa kuvatun keksinnön monille spesifisille »#· , .·. sovellusmuodoille. Seuraavien vaatimusten on tarkoitus sisäl- • ♦ · ’*·· 30 tää tällaiset samanarvoisuudet. Kaikkien sellaisten viitteiden ja patenttihakemusten sisällöt, jotka on mainittu tässä hakemuksessa, sisällytetään esillä olevaan hakemukseen viit-teinä.
«*· ·;· 35 i I I < « « · I « · ( « r
Claims (22)
1. Menetelmä antigeenispesifisen T-solutoleranssin in-dusoimiseksi in vitm, tunnettu siitä, että T-solu saatetaan kosketuksiin 5 a) sellaisen solun kanssa, joka tarjoaa antigeenin T-so- lulle ja jolla on pinnallaan ligandi, joka on vuorovaikutuksessa T-solun pinnan reseptorin kanssa, joka välittää autta-jaefektorifunktion, jonka edellytyksenä on kontakti; ja b) T-solun pinnalla sijaitsevan reseptorin antagonistin 10 kanssa, joka inhiboi ligandin vuorovaikutuksen reseptorin kanssa.
2. Förfarande enligt patentkrav l, kännetecknat av att 20 receptorn pä T-cellens yta som förmedlar den kontaktberoende assistenteffektorfunktionen är gp39.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että T-solun pinnan reseptori, joka välittää kontaktia 15 edellyttävän auttajaefektoritoiminnan, on gp39.
3. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat av att an- I I I tagonisten är en anti-gp39-antikropp. « * «
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antagonisti on anti-gp39-vasta-aine.
4. Förfarande enligt patentkrav 3, kännetecknat av att an- • · 25 ti-gp39-antikroppen är en monoklon antikropp. • * • · m
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että anti-gp39-vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine.
5. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att an- :T: ti-gp39-antikroppen är en anti-human-gp39-antikropp.
... 6. Förfarande enligt patentkrav 5, kännetecknat av att an- • · ’\\\ ti-gp39-antikroppen är en monoklon antikropp 24-31 (ATCC de- • m ·;·* 30 positionsnummer HB 11712) .
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu sii- « 4 'ta, että anti-gp39-vasta-aine on anti-humaani-gp39-vasta-v.: 25 aine. I I I • · « : : 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu sii- • · m • tä, että anti-gp39-vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine • « * 24-31 (ATCC-talletusnumero HB 11712) . 30 ,···. 7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu sii- • · tä, että anti-gp39-vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine 89-76 (ATCC-talletusnumero HB 11713).
7. Förfarande enligt patentkrav 5, kännetecknat av att an- I « ti-gp39-antikroppen är en monoklon antikropp 89-76 (ATCC de- • « :.V positionsnummer HB 11713) . • · · · • » « · « 59 105528
8. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att anti -gp3 9- antikroppen är en kimerisk monoklon antikropp.
8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että anti-gp39-vasta-aine on kimeerinen monoklonaalinen vasta-aine. 57 105528
9. Förfarande enligt patentkrav 4, kännetecknat av att anti -gp39-antikroppen är en monoklon antikropp som anpassats 5 för användning hos människan.
9. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anti-gp39-vasta-aine on ihmiskäyttöön sopivaksi tehty monoklonaalinen vasta-aine.
10. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat av att an-tagonisten är en löslig form av CD40.
10. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että antagonisti on CD40:n liukoinen muoto.
11. Förfarande enligt patentkrav 10, kännetecknat av att den lösliga formen av CD40 är ett fusionsprotein. 10 12. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat av att cel- len är en lymfoidcell.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että CD40:n liukoinen muoto on fuusioproteiini. 10
12. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solu on lymfoidisolu.
13. Förfarande enligt patentkrav 12, kännetecknat av att lymfoidcellen är en B-cell.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että lymfoidisolu on B-solu.
14. Förfarande enligt patentkrav 13, kännetecknat av att B- 15 cellen är en vilande B-cell.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että B-solu on lepäävä B-solu.
15. Förfarande enligt patentkrav 13, kännetecknat av att B-cellen sätts i beröring med antigenen innan den är i berö-ring med T-cellen. < < %
15 T-cellens yta, vilken förmedlar en assistenteffektorfunktion som förutsätter kontakt; och b) med en receptorantagonist pä T-cellens yta, vilken inhi-berar ligandens växelverkan med receptorn.
15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että B-solu saatetaan kosketuksiin antigeenin kanssa ennen kuin se on kosketuksissa T-solun kanssa.
16. Förfarande enligt patentkrav 13, kännetecknat av att B-;,v 20 cellen är en allogen B-cell. • · · .···, 17. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat av att cel- · Ien är i det perifera blodet. * · · • · · • · · « « · "·.· ’· 18. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat av att cel len är i den allogena benmärgen. • · « • · i” 25 19. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat av att an- • · tigenen är ett protein. « /'•j 20. Förfarande enligt patentkrav 19, kännetecknat av att < f proteinet är en autoantigen. » f · * · « • ·
16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu 25 siitä, että B-solu on allogeeninen B-solu. • · ·
17. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii- • · '·”* tä, että solu on perifeerisessä veressä. • · · • · · · · « · · :30
18. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että solu on allogeenisessä luuytimessä. • « · • · • · « · V
19. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii- • r « tä, että antigeeni on proteiini. 35 < I
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiini on autoantigeeni. 58 105528
21. Förfarande enligt patentkrav 2, kännetecknat av att an-30 tigenen är en allergen. 60 105528
21. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antigeeni on allergeeni.
22. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu sii-5 tä, että siinä vielä T-solu ja sellainen solu, joka tarjoaa antigeenin T-solulle, saatetaan kosketuksiin antigeenin kanssa, joka on yhdistynyt soluun, joka tarjoaa antigeenin. 10 l. Förfarande för att inducera antigenspecifik T-celltole-rans in vitro, kännetecknat av att T-cellen sätts i beröring med a) en cell som erbjuder T-cellen en antigen och som pä sin yta har en ligand som stär i växelverkan med en receptor pä
22. Förfarande enligt patentkrav 2, kannetecknat av att vi-dare sätts en T-cell och en cell som erbjuder T-cellen en antigen i beröring med en antigen som är associerad med cel-len som erbjuder en antigen. « V I • · · • · · • · • · • · · • • t · • · t • · · • · · • · · « · t • · · « · • · • · · ··· • · « I · I I · I 1 f < f i « • I « I · I · · • • · • · « f < · • · t I • · • · ·
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11625593A | 1993-09-02 | 1993-09-02 | |
| US11625593 | 1993-09-02 | ||
| US23292994 | 1994-04-25 | ||
| US08/232,929 US5869049A (en) | 1993-09-02 | 1994-04-25 | Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists |
| US9409953 | 1994-09-02 | ||
| PCT/US1994/009953 WO1995006481A1 (en) | 1993-09-02 | 1994-09-02 | Methods for inducing antigen-specific t cell tolerance |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI960980A0 FI960980A0 (fi) | 1996-03-01 |
| FI960980A FI960980A (fi) | 1996-04-30 |
| FI105528B true FI105528B (fi) | 2000-09-15 |
Family
ID=26814047
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI960980A FI105528B (fi) | 1993-09-02 | 1996-03-01 | Menetelmiä antigeenispesifisen T-solutoleranssin indusoimiseksi |
| FI960978A FI106306B (fi) | 1993-09-02 | 1996-03-01 | Menetelmä anti-GP39-vasta-aineiden valmistamiseksi |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI960978A FI106306B (fi) | 1993-09-02 | 1996-03-01 | Menetelmä anti-GP39-vasta-aineiden valmistamiseksi |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US5747037A (fi) |
| EP (2) | EP0721469B1 (fi) |
| JP (3) | JP2991499B2 (fi) |
| CN (2) | CN100341896C (fi) |
| AT (2) | ATE188487T1 (fi) |
| AU (2) | AU696235B2 (fi) |
| DE (2) | DE69422523T2 (fi) |
| DK (2) | DK0721346T3 (fi) |
| ES (2) | ES2120067T3 (fi) |
| FI (2) | FI105528B (fi) |
| GR (2) | GR3027658T3 (fi) |
| HU (2) | HU220296B (fi) |
| IL (1) | IL110855A (fi) |
| NO (2) | NO321098B1 (fi) |
| NZ (3) | NZ273207A (fi) |
| PT (1) | PT721469E (fi) |
| WO (2) | WO1995006666A1 (fi) |
Families Citing this family (81)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5962406A (en) * | 1991-10-25 | 1999-10-05 | Immunex Corporation | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same |
| US5474771A (en) | 1991-11-15 | 1995-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same |
| US7070777B1 (en) | 1991-11-15 | 2006-07-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for inhibiting inflammation with an antibody that binds the 5C8 protein |
| JP2991499B2 (ja) * | 1993-09-02 | 1999-12-20 | トラスティーズ・オブ・ダートマス・カレッジ | 抗ｇｐ３９抗体およびその用途 |
| US5683693A (en) * | 1994-04-25 | 1997-11-04 | Trustees Of Dartmouth College | Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40 |
| US5876950A (en) * | 1995-01-26 | 1999-03-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy |
| JPH08239324A (ja) * | 1995-03-03 | 1996-09-17 | Fusanori Hamashima | 免疫抑制剤 |
| US6113898A (en) | 1995-06-07 | 2000-09-05 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies |
| US5833987A (en) * | 1995-06-07 | 1998-11-10 | Trustees Of Dartmouth College | Treatment of T cell mediated autoimmune disorders |
| US7153508B2 (en) | 1995-06-07 | 2006-12-26 | Biogen Idec Inc. | Treatment of B cell lymphoma using anti-CD80 antibodies that do not inhibit the binding of CD80 to CTLA-4 |
| US7175847B1 (en) | 1995-06-07 | 2007-02-13 | Biogen Idec Inc. | Treating intestinal inflammation with anti-CD80 antibodies that do not inhibit CD80 binding to CTLA-4 |
| US6440418B1 (en) * | 1995-11-07 | 2002-08-27 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies |
| US6001358A (en) * | 1995-11-07 | 1999-12-14 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof |
| US6340459B1 (en) | 1995-12-01 | 2002-01-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients |
| WO1997034633A1 (en) * | 1996-03-20 | 1997-09-25 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for inhibiting an immune response by blocking the gp39/cd40 and ctla4/cd28/b7 pathways and compositions for use therewith |
| DE19634159C1 (de) * | 1996-08-23 | 1997-09-25 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Induktion einer Tumorimmunität durch Injektion von Hybridzellen |
| AU4352997A (en) * | 1996-08-30 | 1998-03-19 | Genzyme Corporation | Inhibition of primary and/or secondary immune response to repeat adenoviral vector administration using cd40l specific antibodies |
| CZ244399A3 (cs) * | 1997-01-10 | 1999-10-13 | Biogen, Inc. | Použití sloučeniny anti-CD40L pro výrobu léku pro léčení imunologických onemocnění |
| US6428782B1 (en) * | 1997-05-23 | 2002-08-06 | Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. | Non-myeloablative tolerogenic treatment |
| ES2277460T3 (es) | 1998-12-14 | 2007-07-01 | Genetics Institute, Llc | Cadena del receptor de la citoquina. |
| US7553487B2 (en) * | 1998-12-14 | 2009-06-30 | Genetics Institute, Llc | Method and compositions for treating asthma |
| WO2000038708A1 (en) * | 1998-12-24 | 2000-07-06 | Phairson Medical Inc. | Treatment and prevention of immune rejection reactions |
| EP1101495A4 (en) * | 1999-06-01 | 2003-05-07 | Eisai Co Ltd | PREVENTIVE AGENTS AGAINST IDIOPATHIC THROMOBOCYTOPENIC PURPURA |
| AU5641100A (en) * | 1999-06-29 | 2001-01-31 | University Of Massachusetts | Methods for inducing t cell non-responsiveness to a tissue or organ graft |
| US20020028178A1 (en) * | 2000-07-12 | 2002-03-07 | Nabil Hanna | Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications |
| US20030170231A1 (en) * | 2000-03-06 | 2003-09-11 | Toshihiko Yamauchi | Remedies and preventives for antiphospholipid antibody syndrome |
| WO2001079555A2 (en) | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Roles of jak/stat family members in tolerance induction |
| CA2405632A1 (en) * | 2000-04-25 | 2001-11-01 | Idec Pharmaceutical Corporation | Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas |
| RU2270691C2 (ru) | 2000-05-12 | 2006-02-27 | Бет Израел Диконесс Медикал Сентер, Инк. | Композиции и способы достижения иммунной супрессии |
| CA2410188A1 (en) * | 2000-06-06 | 2001-12-13 | Idec Pharmaceutical Corporation | Non-agonistic antibodies to human gp39, compositions containing, and therapeutic use thereof |
| TWI311564B (en) | 2000-07-03 | 2009-07-01 | Bristol Myers Squibb Compan | Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule |
| US20040022787A1 (en) | 2000-07-03 | 2004-02-05 | Robert Cohen | Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID |
| AU2002220165A1 (en) * | 2000-11-14 | 2002-05-27 | The University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Non-lethal methods for conditioning a recipient for bone marrow transplantation |
| US7754208B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US20030133939A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US7829084B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| US20020159996A1 (en) * | 2001-01-31 | 2002-10-31 | Kandasamy Hariharan | Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders |
| US20030211107A1 (en) * | 2002-01-31 | 2003-11-13 | Kandasamy Hariharan | Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders |
| US20030103971A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-06-05 | Kandasamy Hariharan | Immunoregulatory antibodies and uses thereof |
| US20070065436A1 (en) * | 2001-01-31 | 2007-03-22 | Biogen Idec Inc. | Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies |
| US20040058445A1 (en) * | 2001-04-26 | 2004-03-25 | Ledbetter Jeffrey Alan | Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB |
| DK1397153T3 (da) | 2001-05-23 | 2008-05-26 | Bristol Myers Squibb Co | Fremgangsmåde til beskyttelse af allogent ö-celle-transplantat ved anvendelse af oplöselige CTLA4-mutantmolekyler |
| US20050069549A1 (en) | 2002-01-14 | 2005-03-31 | William Herman | Targeted ligands |
| US20030180292A1 (en) * | 2002-03-14 | 2003-09-25 | Idec Pharmaceuticals | Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy |
| US20030219436A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-11-27 | Ledbetter Jeffrey A. | Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein |
| AU2003220820A1 (en) * | 2002-04-03 | 2003-10-27 | Eisai Co., Ltd. | Remedies for pemphigus containing cd40l antagonist as the active ingredient |
| JP2006512895A (ja) * | 2002-06-28 | 2006-04-20 | ドマンティス リミテッド | リガンド |
| CN1326878C (zh) * | 2003-04-29 | 2007-07-18 | 中国抗体制药有限公司 | 抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗体及其衍生物与应用 |
| CA2528551A1 (en) * | 2003-06-13 | 2005-01-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Aglycosyl anti-cd154 (cd40 ligand) antibodies and uses thereof |
| AU2011224032B2 (en) * | 2003-06-13 | 2013-01-31 | Biogen Ma Inc. | Aglycosyl Anti-CD154 (CD40 Ligand) Antibodies and Uses Thereof |
| US7754209B2 (en) | 2003-07-26 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals | Binding constructs and methods for use thereof |
| DK1711528T3 (da) * | 2003-12-23 | 2012-08-20 | Genentech Inc | Behandling af cancer med hidtil ukendte anti-il 13 monoklonale antistoffer |
| US7501121B2 (en) * | 2004-06-17 | 2009-03-10 | Wyeth | IL-13 binding agents |
| US20090098142A1 (en) * | 2004-06-09 | 2009-04-16 | Kasaian Marion T | Methods and compositions for treating and monitoring treatment of IL-13-associated disorders |
| AR049390A1 (es) * | 2004-06-09 | 2006-07-26 | Wyeth Corp | Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos |
| AU2005287406B2 (en) | 2004-07-26 | 2011-08-18 | Biogen Ma Inc. | Anti-CD154 antibodies |
| US7563443B2 (en) * | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
| US8785140B2 (en) * | 2005-02-02 | 2014-07-22 | New South Innovations Pty Limited | Cd4+ Cd25+ T-cells activated to a specific antigen |
| CN100423775C (zh) * | 2005-04-15 | 2008-10-08 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 牛衣原体病灭活疫苗及其制备与检验方法 |
| PL1889065T3 (pl) | 2005-05-18 | 2013-12-31 | Novartis Ag | Metody diagnostyki i leczenia chorób posiadających składnik autoimmunologiczny i/lub zapalny |
| NI200800032A (es) * | 2005-07-25 | 2009-03-23 | Reducción de célula b utilizando moléculas de unión específicas cd37 y cd20 | |
| ES2363891T3 (es) * | 2006-03-20 | 2011-08-18 | The Regents Of The University Of California | Anticuerpos contra el antígeno de células troncales de la próstata (psca) modificados genéticamente para el direccionamiento al cáncer. |
| MX2008015524A (es) * | 2006-06-12 | 2009-01-13 | Trubion Pharmaceuticals Inc | Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora. |
| US8569059B2 (en) | 2006-08-02 | 2013-10-29 | Newsouth Innovations Pty Limited | Method of identifying CD4+ CD25+ T-cells activated to an antigen which express CD8 |
| JP2010527916A (ja) * | 2007-04-23 | 2010-08-19 | ワイス・エルエルシー | Ｉｌ−１３関連障害を治療する方法および組成物ならびにその治療をモニターする方法 |
| WO2009032949A2 (en) | 2007-09-04 | 2009-03-12 | The Regents Of The University Of California | High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection |
| EP2052848A1 (de) | 2007-10-27 | 2009-04-29 | Joint Solar Silicon GmbH & Co. KG | Aufbereitung von Formlingen aus Reinstsilizium |
| SI2132228T1 (sl) * | 2008-04-11 | 2011-10-28 | Emergent Product Dev Seatle | CD37 imunoterapevtik in kombinacija z njegovim bifunkcionalnim kemoterapevtikom |
| US8961991B2 (en) * | 2009-03-10 | 2015-02-24 | Baylor Research Institute | Anti-CD40 targeted fusion proteins |
| US20100069616A1 (en) * | 2008-08-06 | 2010-03-18 | The Regents Of The University Of California | Engineered antibody-nanoparticle conjugates |
| WO2010093467A1 (en) * | 2009-02-10 | 2010-08-19 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for inducing transplantation tolerance |
| WO2013013708A1 (en) | 2011-07-26 | 2013-01-31 | Fundació Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge | Treatment of acute rejection in renal transplant |
| PL3044323T3 (pl) | 2013-09-13 | 2022-06-27 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Sposoby wykrywania i ilościowego oznaczania białka komórki gospodarza w liniach komórkowych |
| NZ756750A (en) | 2013-09-13 | 2022-05-27 | Genentech Inc | Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides |
| MA41459A (fr) | 2015-02-03 | 2017-12-12 | Als Therapy Development Inst | Anticorps anti-cd40l et méthodes pour traiter des maladies ou des troubles liés aux cd40l |
| KR20180037984A (ko) | 2015-07-14 | 2018-04-13 | 이뮤넥스트, 인크. | 개선된 결합 특징, 기능적 특징 및 안전성 특징을 구비한 항-cd154 항체 및 인간 면역요법에서의 용도 |
| CN107921128B (zh) | 2015-08-05 | 2022-04-26 | 詹森生物科技公司 | 抗cd154抗体及其使用方法 |
| WO2017053469A2 (en) | 2015-09-21 | 2017-03-30 | Aptevo Research And Development Llc | Cd3 binding polypeptides |
| CA2946465C (en) | 2015-11-12 | 2022-03-29 | Delta Faucet Company | Ozone generator for a faucet |
| KR20200010294A (ko) | 2017-05-24 | 2020-01-30 | 에이엘에스 테라피 디벨럽먼트 인스티튜트 | 치료용 항-cd40 리간드 항체 |
| KR102142499B1 (ko) * | 2019-09-11 | 2020-08-10 | 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단 | Ykl-40 표적 인간 단일클론항체 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5645820A (en) * | 1987-06-24 | 1997-07-08 | Autoimmune, Inc. | Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens |
| US5690933A (en) * | 1989-05-31 | 1997-11-25 | Glaxo Wellcome Inc. | Monoclonal antibodies for inducing tolerance |
| US5962406A (en) * | 1991-10-25 | 1999-10-05 | Immunex Corporation | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same |
| DE69233402T3 (de) * | 1991-10-25 | 2009-06-25 | Immunex Corp., Seattle | Neue cytokine |
| US5474771A (en) * | 1991-11-15 | 1995-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same |
| CA2089229C (en) * | 1992-02-14 | 2010-04-13 | Alejandro A. Aruffo | Cd40cr receptor and ligands therefor |
| AU5098493A (en) * | 1992-08-21 | 1994-03-15 | Schering Corporation | Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40 |
| US5597563A (en) * | 1992-09-04 | 1997-01-28 | Beschorner; William E. | Method induction of antigen-specific immune tolerance |
| US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
| JP2991499B2 (ja) * | 1993-09-02 | 1999-12-20 | トラスティーズ・オブ・ダートマス・カレッジ | 抗ｇｐ３９抗体およびその用途 |
| ZA946765B (en) * | 1993-09-02 | 1996-02-15 | Dartmouth College | Methods of prolonged suppression of humoral immunity |
| US5683693A (en) * | 1994-04-25 | 1997-11-04 | Trustees Of Dartmouth College | Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40 |
-
1994
- 1994-09-02 JP JP7508265A patent/JP2991499B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 NZ NZ273207A patent/NZ273207A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 JP JP7508291A patent/JP3007977B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 AT AT94926659T patent/ATE188487T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 EP EP94926659A patent/EP0721469B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-02 WO PCT/US1994/009871 patent/WO1995006666A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-02 CN CNB941939189A patent/CN100341896C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 DK DK94926677T patent/DK0721346T3/da active
- 1994-09-02 HU HU9600521A patent/HU220296B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 PT PT94926659T patent/PT721469E/pt unknown
- 1994-09-02 HU HU9700522A patent/HU218610B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 AU AU76429/94A patent/AU696235B2/en not_active Ceased
- 1994-09-02 EP EP94926677A patent/EP0721346B1/en not_active Revoked
- 1994-09-02 DK DK94926659T patent/DK0721469T3/da active
- 1994-09-02 DE DE69422523T patent/DE69422523T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 WO PCT/US1994/009953 patent/WO1995006481A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-02 NZ NZ549136A patent/NZ549136A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 CN CN94194007A patent/CN1127351C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 NZ NZ273221A patent/NZ273221A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 AT AT94926677T patent/ATE167062T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 ES ES94926677T patent/ES2120067T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-02 DE DE69411025T patent/DE69411025T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 IL IL11085594A patent/IL110855A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 ES ES94926659T patent/ES2143553T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/475,847 patent/US5747037A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-01 NO NO19960861A patent/NO321098B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-03-01 FI FI960980A patent/FI105528B/fi active
- 1996-03-01 NO NO19960862A patent/NO321036B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-03-01 FI FI960978A patent/FI106306B/fi active
-
1997
- 1997-08-21 AU AU35183/97A patent/AU707110B2/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-03-27 US US09/049,043 patent/US5876718A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-30 US US09/069,871 patent/US6312692B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-14 GR GR980401834T patent/GR3027658T3/el unknown
- 1998-10-01 US US09/164,568 patent/US7722874B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-12 JP JP10289353A patent/JP3098739B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-29 GR GR20000400784T patent/GR3033095T3/el not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-04-17 US US11/405,876 patent/US20060222649A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI105528B (fi) | Menetelmiä antigeenispesifisen T-solutoleranssin indusoimiseksi | |
| KR100337078B1 (ko) | 항-gp39항체및이것의사용방법 | |
| AU710925B2 (en) | Methods for inducing T cell tolerance to a tissue or organ graft | |
| AU678532C (en) | Methods for inducing antigen-specific T cell tolerance | |
| MXPA96005051A (en) | Methods to induce tolerance to t cells for a tissue grafting uórg |