NO321098B1 - Anvendelse av en celle som presenterer antigen til en T-celle, anvendelse av en gp39 antagonist og anvendelse av en gp39 antagonist som inhiberer interaksjonen av gp39 med CD40 for fremstilling av et farmasoytisk preparat. - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåter for å indusere antigen-spesifikk T-celletoleranse er beskrevet. Fremgangsmåtene involverer å bringe en T-celle i kontakt med: 1) en celle som presenterer antigen for T-cellen, hvori en ligand på cellen interagerer med en reseptor på overflaten av T-cellen som formidler kontaktavhengig hjelpereffeltrorfunksjon; og 2) en antagonist for reseptoren på overflaten av T-cellen som inhiberer interaksjon av liganden på den antigen-presenterende celle med reseptoren på T-cellen. I en foretrukket utførelse skal den celle som presenterer antigen for T-cellen være en B-celle og reseptoren på overflaten av T-cellen som formidler kontakt-avhengig hjelpereffeltrorfunksjon skal være gp39. Fortrinnsvis vil antagonisten være et antigp39-antistoff eller en løselig gp39-ligand, feks. løselig CD40. Fremgangsmåtene ifølge denne oppfinnelse kan anvendes til å indusere T-celletoleranse til et løselig antigen eller til en allogen celle. Fremgangsmåtene ifølge denne oppfinnelse kan også anvendes til å indusere toleranse i tilfeller med benmargtransplantasjon og andre organtransplantater og til å inhibere transplantat mot vert (graft-versus-host)-sykdom.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en celle som presenterer antigen til en T-celle, anvendelse av en gp39 antagonist og anvendelse av en gp39 antagonist som inhiberer interaksjonen av gp39 med CD40 for fremstilling av et farmasøytisk preparat.

Bakgrunn for oppfinnelsen

For å indusere antigen-spesifikk T-celle-aktivering og klonal ekspansjon må det avgis to signaler frembragt av antigen-presenterende celler (APCer) til overflaten av hvilende T-lymfocytter (M. Jenkins og R. Schwartz (1987) J. Exp. Med. 165,302-319; D.L. Mueller et al.,

(1990) J. Immunol. 144,3701-3709; LR. Williams og E.R. Unanue (1990) J. Immunol. 145,85-93).

Det første signal som gir spesifisitet til immunresponsen, formidles via T-celle-reseptoren (TCR) etter gjenkjenning av fremmed antigent peptid presentert innenfor rammen av hoved-histokompatibilitet-komplekset (MHC). Det andre signal som betegnes ko-stimulering, induserer T-celler til å formere seg og bli funksjonelle (R.H. Schwartz (1990) Science 248,1349-1356). Kostimulering er hverken antigenspesifikk eller MHC-begrenset, og det antas at den frembringes av ett eller flere særskilte celle-overflatemolekyler som uttrykkes av APCer (M.K. Jenkins et al.,

(1988) J. Immunol. 140,3324-3330; P.S. Linsley et al., (1991)

J. Exp. Med. 173,721-730; CD. Gimmi et al., (1991) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88,6575-6579;

J.W. Young et al., (1992) J. Clin. Invest. 90,229-237; L. Koulova et al., (1991) J. Exp. Med. 173, 759-762; H. Reiser et al., (1992) Proe. Nati. Sei. USA 89,271-275; G.A. van-Seventer et al.,

(1990) J. Immunol. 144,4579-4586; J.M. LaSalle et al., (1991) J. Immunol. 147,774-80; M.I.

Dustin et al, (1989) J. Exp. Med, 169,503; R.J. Armitage et al., (1992) Nature 357, 80-82; Y. Liu et al., (1992) J. Exp. Med. 175,437-445). Én ko-stimulatorisk mekanisme involvert i T-celle-aktiveringen involverer molekylet CD28 på overflaten av T-celler. Dette molekyl kan ta imot et ko-stimulatorisk signal avgitt av en ligand på B-celler eller andre APCer. Ligander for CD28 inkluderer medlemmer av B7-familien av B-lymfocytt-aktiveringsantigener, såsom B7-1 og/eller B7-2 (A.S. Freedman et al., (1987) J. Immunol. 137,3260-3267; G.J. Freeman et al., (1989) J.

Immunol. 143,2714-2722; G.J. Freeman et al., (1991)

J. Exp. Med. 174,625-631; G.J. Freeman et al., (1993) Science 262,909-911; M. Azuma et al.,

(1993) Nature 366,76-79; G.J. Freeman et al., (1993) J. Exp. Med. 178,2185-2192).

B7-1 og B7-2 er også ligander for et annet molekyl, CTLA4, som er til stede på overflaten av aktiverte T-celler, selv om CTLA4 sin rolle i kostimuleringen er uklar.

Avgivelse av et antigen-spesifikt signal med et ko-stimulatorisk signal til en T-celle, vil føre til T-celle-aktivering som kan inkludere både T-celleformering og cytokinsekresjon. Motsatt blir avgivelse av et antigen-spesifikt signal til en T-celle i fravær av et ko-stimulatorisk signal antatt å indusere en tilstand av manglende responsevne eller anergi i T-cellen, og derved å indusere antigen-spesifikt toleranse i T-cellen.

Interaksjoner mellom T-celler og B-celler spiller en sentral rolle ved immunresponsen. Induksjon av humoral immunitet mot tbymus-avhengige antigener krever "hjelp" frembragt av T-hjelpe-celler (heretter Th)-celler. Selv om en viss hjelp som gis til

B-lymfocytter blir formidlet av løselige molekyler avgitt av Th-celler (f.eks. lymfokiner såsom IL-4 og IL-5), vil aktivering av B-celler også kreve en kontakt-avhengig interaksjon mellom B-celler og Th-celler. Hirohata et al., J. Immunol., 140:3736-3744 (1988); Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745-1754 (1989). Dette viser at B-celleaktivering involverer en obligatorisk interaksjon mellom celleoverflatemolekyler på B-celler og Th-celler. Molekylene på T-cellen formidler derfor T-cellenes kontakt-avhengige hjelpereffektor-funksjoner. En kontakt-avhengig inter-aksjon mellom molekyler på B-celler og T-celler understøttes ytterligere av den observasjon at isolerte plasmamembraner fra aktiverte T-celler kan tilveiebringe hjelpefunksjoner nødvendige for B-celle-aktiveringen. Brian, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85:564-568 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol., 145:2025-2034 (1990); Noelle et al., J. Immunol., 146:1118-1124 (1991).

Et molekyl, CD40, har blitt identifisert på overflaten av umodne og modne B-lymfocytter som, når de tverrbindes av antistoffer, induserer B-celleformering. Valle et al., Eur. J. Immunol., 19:1463-1467 (1989); Gordon et al., J. Immunol., 140:1425-1430 (1988); Gruber et al., J. Immunol., 142:4144-4152 (1989). CD40 er blitt klonet molekylært og karakterisert. Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989). En ligand for CD40, gp39 (også kalt CD40-ligand eller CD40L) er også blitt molekylært klonet og karakterisert. Armitage et al., Nature, 357:80-82

(1992); Lederman et al., J. Exp. Med. 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J.,

11:4313-4319 (1992). gp39-proteinet blir uttrykt på aktiverte, men ikke hvilende CD4<+>Th-celler. Spriggs et al., J. Exp. Med. 176:1543-1550 (1992);

Lane et al., Eur. J. Immunol., 22:2573-2578 (1992); Roy et al.,

J. Immunol., 151:1-14 (1993). Celler transfektert med gp39-genet og som uttrykker gp39-proteinet på overflaten, kan utløse B-celleformering og kan, sammen med andre stimulatoriske signaler, indusere antistofrproduksjon. Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992).

Sammendra<g> av oppfinnelsen

Celle-overflatemolekyler som formidler T-cellenes kontakt-avhengige hjelpe-effektorfunksjoner er viktige for indusering av immunresponser som krever T-celle hjelp. Interaksjonen av gp39 på T-celler med CD40 på B-celler spiller f.eks. en sentral rolle ved aktivering av B-celleresponser til antigener. Foreliggende opp-finnelse er basert i alle fall delvis på den oppdagelse at celle-overflatemolekyler som formidler kontakt-avhengige hjelpeeffektor-funksjoner også spiller en kritisk rolle i T-cellenes respons på antigener. Særlig er det blitt oppdaget at interferens av en interaksjon mellom gp39 på en T-celle og en Ugand på en celle som presenterer antigen for T-cellen, under egnede betingelser kan indusere antigen-spesifikk T-celletoleranse. Cellen som presenterer antigen for T-cellen, krever følgelig en interaksjon mellom en gp39-ligand, f.eks. CD40 på cellen og gp39 på T-cellen for å være i stand til å frembringe signaler som er nødvendige for aktivering av T-cellen. Inhibering av interaksjonen mellom gp39-liganden og gp39, vil forhindre T-celleaktivering og i stedet indusere antigen-spesifikk T-celletoleranse.

Dette omfatter å bringe en T-celle i kontakt med: 1) en celle som presenterer antigen for T-cellen og har en ligand på celleoverflaten som interagerer med en reseptor på overflaten av T-cellen som formidler kontakt-avhengige hjelpeeffektorrunksjoner; og 2) en antagonist for reseptoren på overflaten av en T-celle som formidler kontakt-avhengige hjelpe-effektorfunksjoner. Antagonisten inhiberer interaksjonen av reseptoren med sin ligand. En T-celle kan bringes i kontakt med den celle som presenterer antigen og antagonisten in vi tro, eller alternativt kan cellen og antagonisten administreres til et individ for å indusere T-celletoleranse in vivo.

Reseptoren på overflaten av T-cellen som formidler kontakt-avhengige hjelpeeffektorfunksjoner er gp39. Antagonisten er et molekyl som inhiberer interaksjonen av gp39 med sin ligand på en celle som presenterer antigen til T-cellen. En spesielt foretrukket gp39-antagonist er et anti-gp39-antistoff. Alternativt vil gp39-antagonisten være en løselig form av en gp39-ligand, f.eks. løselig CD40. Cellen som presenterer antigen for en T-celle er fortrinnsvis en B-celle. B-cellen kan være en Uten hvilende B-celle. For å indusere T-celletoleranse mot et løselig antigen, kan B-cellen bringes i kontakt med antigenet før kontakt med T-cellen (f.eks. før administrering til et individ). For å indusere T-celletoleranse for alloantigener, kan videre den celle som anvendes til å presentere antigen for T-cellen, være en allogen celle. Den allogene celle kan f.eks. være en allogen B-celle, allogen benmarg, allogene miltceller eller allogene celler i perifert blod.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig anvendelse av

a) en celle som presenterer antigen til en T-celle og har CD40 på dets overflate; og

b) en gp39 antagonist for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å indusere antigen-spesifikk T-celle toleranse.

Det er videre beskrevet anvendelse av

a) en celle som presenterer antigen til en T-celle og har CD40 på dets overflate;

b) et antigen assosiert med cellen som presenterer antigenet for en T celle; og

c) en gp39 antagonist for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å indusere antigen-spesifikk T-celle toleranse.

Videre er det beskrevet anvendelse av en gp39 antagonist som inhiberer interaksjonen av gp39 med CD40 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for indusering av antigen-spesifikk T-celletoleranse in vivo i et individ eksponert for et slikt antigen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig anvendelse av en gp39 antagonist for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for indusering av antigen-spesifikk T-celletoleranse i et individ, hvori gp39 antagonisten inhiberer interaksjonen av gp39 på en T-celleoverflate med CD40 på overflaten av en celle som presenterer antigen for en T-celle og medierer kontakt-avhengig hjelpeeffektor funksjon.

Det er mulig å indusere T-celletoleranse for et benmargtransplantat eller andre organtransplantater eller til å inhibere transplantat mot vert ("graft-versus-host")-sykdom ved transplantering av benmarg. I tilfellet benmargtransplantasjon vil de transplanterte benmarg-celler selv tjene som celler som presenterer antigen for T-cellen i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Aksept av et benmargtransplantat vil kunne befordres ved å administrere til et individ allogen benmarg i forbindelse med en gp39-antagonist (f.eks. et anti-gp39-antistoff).

Anti-humane gp39 mono-klonale antistoffer foretrekkes for anvendelse til modulering av immunresponser generelt, og spesielt for anvendelse til å indusere antigen-spesifikk T-celletoleranse. Foretrukne antistoffer omfatter de monoklonale antistoffer 3E4,2HS, 2H8,4D9-8, 4D9-9,24-31,24-43,89-76 og 89-79, beskrevet i eksempel 6. Spesielt foretrukne antistoffer er de monoklonale antistoffer 89-76 og 24-31. 89-76 og 24-31-hybridomacellene som produserer henholdsvis 89-76 og 24-31-antistoffene, ble deponert under betingelsene i Budapest-avtalen hos the American Type Culture Collecuon, Parklawn Drive, Rockville, Md, 2. sept. 1994. 89-76-hybridomacellen fikk ATCC Accession Number HB 11713, og 24-31-hybridomacellen fikk ATCC Accession Number HB 11712. 24-31 og 89-76-antistoffene er av IgGl -isotypen.

Det anti-humane gp39 monoklonale antistoffet (mAb) er følgelig av en IgGl-isotype. Det anti-humane gp39 mAb kan inhibere B-celleformering i en standard in vitro assay, f.eks. B-celleformering indusert ved behandling av B-cellene med interleukin-4 og løselig gp39. Fortrinnsvis vil det antihumane gp39-antistoff inhibere B-celleformering med en IC^q (d.v.s. den konsentrasjon som er nødvendig for å inhibere formering med 50%) mellom ca. 0,01 og 5,0 jttg/ml, mer fordelaktig mellom ca. 0,1 og 2,5 /ig/ml, og mest fordelaktig mellom ca. 0,1 og 1,25 /ig/ml. De anti-humane gp39 mAb'er kan altså inhibere B-celle-produksjon av IgG, IgM og/eller IgA i en standard in vitro assay, f.eks. Ig- produksjon indusert ved dyrking av B-celler med aktiverte T-celler (f.eks. T-celler aktivert ved behandling med anti-CD3-antistoff. Fortrinnsvis vil det anti-humane gp39-antistoff inhibere B-celleproduksjon av IgG, IgM og/eller IgA med en IC50 mellom ca. 0,01 og 1,0 /ig/ml, eller mer fordelaktig mellom ca. 0,01 og 0,1 /ig/ml.

Det anti-humane gp39 mAb vil binde en epitop gjenkjent av et mono-klonalt antistoff valgt fra en gruppe bestående av 3E4,2H5,2H8,4D9-8,4D9-9,24-31,24-43, 89-76 og 89-79. Mer foretrukket vil det anti-humane gp39 mAb binde en epitop gjenkjent av det mono-klonale antistoff 24-31 eller det monoklonale antistoff 89-76. Et mAb sin evne til å binde en epitop gjenkjent av hvilken som helst av de forannevnte antistoffer, kan bestemmes ved standard kryss-konkurranseanalyser. F.eks. vil et antistoff som binder den samme epitop gjenkjent av mAb 24-31 konkurrere om bindingen av merket 24-31 til aktiverte T-celler, mens et antistoff som binder en annerledes epitop enn den som er gjenkjent av mAb 24-31, ikke vil konkurrere om bindingen av merket 24-31 til aktiverte T-celler.

Det er mulig å tilveiebringe farmasøytiske preparater av de anti-humane gp39-antistoffene. Disse preparater vil typisk omfatte et anti-humant gp39 mAb (f.eks. fortrinnsvis 24-31 eller 89-76) og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Nukleinsyrer som koder for et anti-humant gp39 mAb (f.eks. DNA som koder for et immunoglobulin tung kjede eller lett kjede, eller del derav, av et anti-humant gp39 mAb) kan isoleres fra en celle (f.eks. hybridoma) som produserer et anti-humant gp39 mAb ved standard teknikk. F.eks. kan nukleinsyre som koder for 24-31 eller 89-76 mAb isoleres fra henholdsvis 24-31 eller 89-76 hybridoma, ved screening av cDNA-bibliotek, PCR-amplifikasjon eller annet standard teknikk. Nukleinsyre som koder for en anti-human gp39 mAb-kjede kan manipuleres ved standard rekombinant DNA-teknikk til å fremstille rekombinante anti-humane gp39 mAb'er, f.eks. chimere eller humaniserte anti-humane gp39 mAb'er.

Dessuten vil en nukleinsyre som koder for et anti-humant gp39 mAb kunne inkorporeres i en ekspresjonsvektor og innføres i en vertscelle for å lette ekspresjon og fremstilling av rekombinante former av anti-humane gp39-antistoffer.

Kort beskrivelse av te<g>ningene

Fig. 1 er en grafisk fremstilling av T-celletoleranse for et protein-antigen indusert ved in vivo anti-gp39-behandling. T-celleresponsene ble målt in vitro etter utfordring med et antigen som tidligere var administrert in vivo på antigen-pulsede B-celler enten med eller uten et anti-gp39-antistoff. Fig. 2 er en grafisk fremstilling av T-celletoleranse for allogene B-celler indusert ved in vivo anti-gp39-behandling. T-celleresponsene ble målt in vitro etter utfordring med allogene B-celler som tidligere var administrert in vivo enten med eller uten et anti-gp39-antistoff. Fig. 3 A er en grafisk fremstilling av inhiberingen av primære allogene CTL-responser indusert av allogene B-celler når mottaker-dyr er behandlet med anti-gp39-antistoff. Representerte grupper er ubehandlede mus (■), anti-gp39-behandlede mus (A) og miltceller fra ikke-primede Balb/c-mus (•; anvendt som negativ kontroll effektorceller). Fig. 3B og 3C er grafiske fremstillinger av inhiberingen av primære allogene CTL-responser indusert av LPS-behandlede B-celle-blaster når mottakerdyrene er behandlet med anti-gp39-antistoff. Diagrammene B og C representerer to uavhengige eksperimenter. Representerte grupper er LPS-blaster in vivo uten behandling (>), LPS-blaster in vivo med anti-gp39-behandling (•), hvilende B-celler in vivo uten behandling (O) og hvilende B-celler in vivo med anti-gp39-behandling (□). Fig. 4A er en grafisk fremstilling av inhiberingen av sekun-dære allogene CTL-responser indusert av allogene B-celler når mot-takerdyrene er behandlet med anti-gp39-antistoff. Viste effektor-grupper er: HIg-behandlede mottakere (•), naturlige Balb/c (>) og anti-gp39-behandlede mottakere (■). Tilsvarende syngen-respons (Balb/c-celler stimulert med Balb/c-celler) er angitt ved åpne symboler. Fig. 4B er en grafisk fremstilling av spesifisiteten av inhibering av allogene CTL-responser ved anti-gp39-behandling. Det er vist CTL-responser mot H-2 -mål ved naturlige Balb/c-celler (O) eller ved celler tolerisert for H-2^ ved administrering av H-2^ haplotype B-celler og anti-gp39 (■). Fig. 5 er et søylediagram som viser antallet splenocytter hos en vert som har fått et benmargtransplantat på forskjellige tider etter overføring av benmargen til verten enten med eller uten behandling med et anti-gp39-antistoff. Fig. 6A er en grafisk fremstilling av konsentrasjonen av IgA frembragt av milt B-celler in vitro etter uttak fra mus som fikk et benmargtransplantat enten med eller uten in vivo anti-gp39-behandling. Milt B-celler ble fjernet og antistoff-fremstillingen målt enten 7 eller 14 dager etter benmargtransplantasjon. Fig. 6B er en grafisk fremstilling av konsentrasjonen av IgGl frembragt av milt B-celler in vitro etter uttak fra mus som fikk et benmargtransplantat enten med eller uten in vivo anti-gp39-behandling. Milt B-celler ble uttatt og antistoff-produksjonen målt enten 7 eller 14 dager etter benmargtransplantasjon. Fig. 7A er en grafisk fremstilling av serum IgE-konsentra-sjonene hos mus som fikk et benmargtransplantat enten med eller uten in vivo anti-gp39-behandling til forskjellige tider etter benmargoverføringen. Fig. 7B er en grafisk fremstilling av serum anti-DNA-antistoff-konsentrasjonene hos mus som fikk et benmargtransplantat enten med eller uten in vivo anti-gp39-behandling til forskjellige tider etter overføring av benmarg. Fig. 8A og 8B er grafiske fremstillinger som viser den cytolytiske aktivitet in vitro av cytotoksiske T-celler fra mus som fikk et benmargtransplantat enten med eller uten in vivo anti-gp39-behandling ved forskjellige effektor til målcelleforhold (E:T-forhold). Diagrammene A og B representerer to uavhengige eksperimenter. Fig. 9A, 9B og 9C er cytometriske strømningsprofiler som viser farvingen av 6 timer aktiverte humane perifert blod

lymfocytter med enten CD40Ig (diagram A) mAb 4D9-8 (diagram B) eller mAb 4D9-9 (diagram

C).

Fig. 10A, 10B og 10C er cytometriske strømningsprofiler som viser farvingen av 6 timer aktiverte humane perifert blod lymfo-cytter dyrket i nærvær av cyklosporin A farvet med enten mAb 4D9-8 (diagram A), mAb 4D9-9 (diagram B) eller CD40Ig (diagram C). Fig. 1 IA og 1 IB er cytometriske strømningsprofiler som viser farvingen av 6 timer aktiverte humane perifert blod lymfocytter med CD40Ig i nærvær av umerket mAb 4D9-8 (diagram A) eller umerket mAb 4D9-9 (diagram B). Fig. 12 er en grafisk fremstilling av inhiberingen av human B-celleformering indusert av løselig gp39 og IL-4 når cellene er dyrket i nærvær av anti-humane gp39 mAb'er 4D9-8,4D9-9, 24-31,24-43, 89-76 eller 89-79. Fig. 13 er en grafisk fremstilling av inhiberingen av en allo-spesifikk blandet lymfocyttrespons når cellene er dyrket i nærvær av anti-humane gp39 mAb'er, 24-31 eller 89-79.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Som angitt ovenfor er det mulig å indusere antigen-spesifikk T-celletoleranse. Dette involverer å bringe en T-celle i kontakt med 1) en celle som presenterer antigen til T-cellen og har en ligand på celleoverflaten som interagerer med en reseptor på overflaten av T-cellen som formidler kontaktavhengige hjelper-effektorfunksjoner, og 2) en antagonist for reseptoren på T-cellen som inhiberer interaksjon av reseptoren på liganden. Som definert her skal et molekyl eller en reseptor som formidler kontakt-avhengige hjelpereffektorfunksjoner være én som uttrykkes på en Th-celle og interagerer med en ligand på en effektorcelle, f.eks. en B-celle, hvor reseptorens inter-aksjon med sin ligand er nødvendig for dannelse av en effektor-cellerespons (f.eks. B-celleaktivering). I tillegg til å bli involvert i effektor-celleresponser, er det nå blitt funnet at et slikt molekyl er involvert i T-celleresponsen på antigen.

Et foretrukket molekyl på en T-celle som formidler kontakt-avhengig hjelpereffektorfunksjon er gp39. En T-celle bringes i kontakt med en celle som presenterer antigen og en gp39-antagonist. Følgelig skal den celle som anvendes til å presentere antigen være én som interagerer med gp39 på overflaten av en T-celle for å aktivere T-cellen (d.v.s. avgi de nødvendige signaler for T-celle-aktivering til T-cellen). F.eks. kan cellen være en B-celle som uttrykker CD40 og presenterer antigen for T-cellen. Ved å inhibere en interaksjon mellom en gp39-ligand på det celle-presenterende antigen med gp39 på T-cellen, blir T-cellen ikke aktivert av det presenterte antigen, men blir i stedet gjort tålbar mot antigenet.

Det er følgelig mulig å indusere T-celletoleranse til et antigen in vivo. F.eks. kan en celle som presenterer antigen for en T-celle administreres til et individ i forbindelse med en antagonist for en reseptor uttrykt på T-cellen som formidler kontakt-avhengige hjelpereffektorfunksjoner (f.eks. en gp39-antagonist). Det er også mulig å tolerisere en T-celle mot et antigen in vitro ved å bringe T-cellen i kontakt in vitro med en celle som presenterer antigen til T-cellen sammen med en antago-nist for en reseptor uttrykt på T-cellen som formidler kontakt-avhengig hjelpereffektorfunksjon (f.eks. en gp39-antagonist). T-celler tolerisert in vitro kan deretter administreres til et individ. Det er følgelig mulig å tolerisere T-celler i et individ mot et spesifikt antigen, eller mot transplanterte celler, såsom allogen benmarg (f.eks. ved benmargtransplantasjon). Videre er det mulig å inhibere "graft versus host" sykdom ved benmargtransplantasjon.

Forskjellige trekk av denne oppfinnelse er beskrevet i ytterligere detalj i de følgende underavsnitt.

I. gp39-antagonister

En gp39-antagonist bringes i kontakt med en T-celle (f.eks. administreres til et individ) for å interferere med interaksjonen av gp39 på en T-celle med en gp39-ligand på en antigen-presenterende celle, såsom en B-celle. En gp39-antagonist defineres som et molekyl som interfererer med denne interaksjon. gp39-antagonisten kan være et antistoff rettet mot gp39 (f.eks. et monoklonalt antistoff mot gp39), et fragment eller et derivat av et antistoff rettet mot gp39 (f.eks. Fab eller F(ab)'2-rfagmenter, chimere antistoffer eller humaniserte antistoffer), løselige former av en gp39-ligand (f.eks. løselig CD40), løselige former av et fusjonsprotein av en gp39-ligand (f.eks. løselig CD40Ig), eller farmasøytiske agenser som sprenger eller interfererer med gp39-CD40-interaksjonen.

A. Antistoffer

Et pattedyr (f.eks. en mus, hamster eller kanin) kan immuniseres med en immunogen form av gp39-protein eller proteinfragment (f.eks. peptidfragment) som fremkaller en antistoff-respons i pattedyret. En celle som uttrykker gp39 på sin overflate kan også anvendes som immunogen. Alternative immuno-gener omfatter renset gp39-protein eller proteinfragmenter. Gp39 kan renses fra en gp39-trykkende celle ved standard rense-teknikker; gp39 cDNA (Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)) kan uttrykkes i en verts-celle, f.eks. bakterier eller en pattdyr-cellelinje, og gp39-protein kan renses fra cellekulturen ved standard teknikker. gp39-peptider kan syntetiseres basert på aminosyresekvensen av gp39 (beskrevet i Armitage et al., Nature, 357:80-82

(1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)) ved anvendelse av kjente teknikker (f.eks. kjemisk syntese av F-moc eller T-boc). Teknikker for å gi immunogenisitet til et protein omfatter konjugasjon til bærere eller andre teknikker velkjent i teknologien. F.eks. kan proteinet administreres i nærvær av adjuvans. Utviklingen av immuniseringen kan overvåkes ved påvisning av antistoff-titer i plasma eller serum. Standard ELISA eller annen immunoassay kan anvendes med immunogenet som antigen for å bestemme nivået av antistoffer.

Etter tmmunisering kan det fremstilles antisera og om ønskelig polyklonale antistoffer isolert fra disse sera. For å fremstille monoklonale antistoffer kan det høstes antistoff-produserende celler (lymfocytter) fra et immunisert dyr og sammensmeltes med myelomaceller ved standard somatiske cellefusjonsfremgangsmåter som således udødetiggjør disse celler og gir hybridomaceller. Slike teknikker er velkjent i teknologien. F.eks. hybridomateknikken opprinnelig utviklet av Kohler og Milstein (Nature (1975) 256:495-497) såvel som andre teknikker såsom human B-celle hybridomateknikk (Kozbar et al., Immunol. Today (1983) 4:72), EBV-hybridomateknikken for fremstilling av humane monoklonale antistoffer (Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) (Allen R. Bliss, Inc., s. 77-96), og screening av kombinatoriske antistoff-bibliotek (Huse et al., Science (1989) 246:1275). Hybridomaceller kan screenes immuno-kjemisk for fremstilling av antistoffer som er spesifikt reaktive med proteinet eller peptidet, og monoklonale antistoffer kan isoleres.

Betegnelsen antistoff som anvendt heri er ment å omfatte fragmenter derav som er spesifikt reaktive med et gp39-protein eller peptid derav eller gp39-fusjonsprotein. Antistoffer kan fragmenteres ved anvendelse av konvensjonelle teknikker, og fragmentene screenes for anvendelighet på samme måte som beskrevet ovenfor for hele antistoffer. F.eks. kan det dannes F(ab')2-fragmenter ved behandling av antistoff med pepsin. Det resulte-rende Ffab^-fragment kan behandles for å redusere disulfidbroer for å frembringe Fab-fragmenter. Antistoffet er videre ment å omfatte bispesifikke og chimere molekyler som har en anti-gp39-del.

Når antistoffer fremstilt i ikke-humane individer blir anvendt terapeutisk på mennesker, blir de gjenkjent i varierende grad som fremmede, og det kan dannes en immunrespons i pasienten. Én metode for minimalisering eller eliminering av dette problem, som er å foretrekke fremfor generell immunsuppresjon, er å frem-stille chimere antistoff-derivater, d.v.s. antistoffmolekyler som kombinerer en ikke-human dyr variabel region og en human konstant region. Chimere antistoffmolekyler kan omfatte f.eks. det antigen-bindende domene fra et antistoff fra en mus, rotte eller andre arter, med humane konstante regioner. Flere forskjellige metoder for å lage chimere antistoffer er beskrevet, og kan anvendes til fremstilling av chimere antistoffer som inneholder den immunglobulin-variable regionen som gjenkjenner gp39. Se f.eks. Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:6851 (1985); Takeda et al., Nature 314:452 (1985), Cabilly et al., US-patent nr. 4.816.567; Boss et al., US-patent nr. 4.816.397; Tanaguchi et al., europeisk patentpublikasjon EP171496; europeisk patentpublikasjon 0173494, UK-patent GB 2177096B. Det forventes at slike chimere antistoffer ville være mindre immunogene i et humant individ enn det tilsvarende ikke-chimere antistoff.

For human-terapeutiske formål kan de monoklonale eller chimere antistoffer spesifikt reaktive med et gp39-protein eller peptid, humaniseres ytterligere ved fremstilling av human variable regionchimerer, hvori deler av de variable regioner, spesielt de konserverte rammeverkregioner av det antigen-bindende domene, er av human opprinnelse og bare de hypervariable regioner er av ikke-human opprinnelse. Slike forandrede immunglobulinmolekyler kan lages ved hvilken som helst av flere teknikker kjent i teknologien, (f.eks. Teng et al., Proe. Nati. Acad. Sei, USA, 80:7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4:7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol., 92:3-16 (1982)), og blir laget fortrinnsvis ifølge beskrivelsene t PCT-publikasjon WO92/06193 eller EP-0239400. Humaniserte antistoffer kan frem-stilles kommersielt av f.eks. Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Storbritannia.

En annen fremgangsmåte til å danne spesifikke antistoffer, eller antistoff-fragmenter, som er reaktive mot et gp39-protein eller peptid, er å screene ekspresjonsbiblioteker som koder for immunglobulingener eller deler derav, uttrykt i bakterier med et gp39-protein eller peptid. F.eks. kan det uttrykkes komplette Fab-fragmenter, VH-regioner og FV-regioner i bakterier ved anvendelse av fagekspresjonsbiblioteker. Se fleks. Ward et al., Nature, 341:544-546, (1989); Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989); og McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Screening av slike biblioteker med f.eks. et gp39-peptid kan identifisere immunglobulinfragmenter reaktive med gp39. Alternativt kan SCID-hu-musen (tilgjengelig fra Genpharm) anvendes til fremstilling av antistoffer eller fragmenter derav.

Metodologi for fremstilling av monoklonale antistoffer rettet mot gp39, innbefattet humant gp39 og mus gp39, og egnede mono-klonale antistoffer for anvendelse her er beskrevet i ytterligere detalj i eks. 6. Spesielt foretrukne anti-humane gp39-antistoffer er mAb'er 24-31 og 89-76, fremstilt henholdsvis ved hybridomene 24-31 og 89-76. 89-76 og 24-31-hybirdomene, som fremstiller henholdsvis 89-76 og 24-31-antistoffene, ble deponert under bestemmelsene i Budapest-avtalen hos the American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md., 2. sept. 1994. 89-76-hybridomet ble gitt ATCC-adgangsnummeret HB 11713 og 24-31 - hybridomet ble gitt ATCC-adgangsnummer HB 11712.

Rekombinante anti-gp39-antistoffer, såsom chimere og humaniserte antistoffer, kan fremstilles ved manipulering av nukleinsyre (f.eks. DNA) som koder for et anti-gp39-antistoff ifølge standard rekombinant-DNA-teknikk.

B. Løselige ligander for gp39

Andre gp39-antagonister som kan anvendes til å indusere T-celletoleranse, er løselige former av en gp39-ligand. En enverdig løselig ligand av gp39, såsom løselig CD40 kan binde gp39 og derved inhibere interaksjonen av gp39 med CD40 på B-celler. Betegnelsen "løselig" viser at liganden ikke er permanent assosiert med en cellemembran. En løselig gp39-ligand kan frem-stilles ved kjemisk syntese, eller fortrinnsvis ved rekombinant-DNA-teknikk, f.eks. ved å uttrykke bare det ekstracellulære domene (fraværende i det transmembrane og cytoplasmiske domene) av liganden. En foretrukket løselig gp39-ligand er løselig CD40. Alternativt kan en løselig gp39-ligand være i form av et fusjons-protein. Et slikt fusjonsprotein omfatter minst en del av gp39-liganden bundet til et andre molekyl. F.eks. kan CD40 uttrykkes som et fusjonsprotein med immunglobulin (d.v.s. et CD40Ig fusjons-protein). I én utførelse fremstilles det et fusjonsprotein omfattende aminsyrerester av en ekstracellulær domenedel av CD40-molekylet bundet til aminosyrerester av en sekvens tilsvarende CH2 og CH3-hengselregionene av en immunglobulin tung kjede, f.eks. C7I, under dannelse av et CD40Ig-fusjonsprotein (se f.eks. Linsley et al., (1991) J. Exp. Med. 1783:721-730; Capon et al., (1989) Nature 337, 525-531; og Capon US. 5.116.964). Fusjonsproteinet kan fremstilles ved kjemisk syntese, eller fortrinnsvis ved rekombinant-DNA-teknikk basert på cDNA fra CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989)).

II. Celler for induksjon av antigen-spesifikk toleranse

Foreliggende oppfinnelse er basert, i alle fall delvis, på den oppdagelse at presentasjon av et antigen for en T-celle med en celle som både presenterer antigen og interagerer med gp39, vil resultere i antigen-spesifikk T-celletoleranse når antigenet presenteres for T-cellen i nærvær av en gp39-antagonist. Celler som er i stand til å indusere T-celletoleranse ved denne mekanisme, omfatter de som presenterer antigen for en T-celle og krever en interaksjon mellom en gp39-ligand på cellen og gp39 på T-cellen for å avgi de nødvendige signaler for T-celleaktivering til T-cellen. Inhibering av denne interaksjon vil forhindre T-celleaktivering ved det presenterte antigen, og i stedet indusere antigen-spesifikk toleranse i T-cellen. Interferens med aktivering av T-cellen via gp39 kan forhindre induksjon av ko-stimulatoriske molekyler på den antigen-presenterende celle (f.eks. B7-familiemolekyler på en antigen-presenterende celle såsom en B-celle) slik at den antigen-presenterende celle avgir bare et antigent signal i fravær av et ko-stimulatorisk signal, og således induserer toleranse.

Det administreres således en celle som presenterer antigen til et mottaker-individ. Uttrykket "celle som presenterer antigen" og "antigen-presenterende celle" anvendes om hverandre her og er ment å omfatte celler som kan presentere antigen for T-celler hos mottakeren, og omfatter B-lymfocytter, "profesjonelle" antigen-presenterende celler (f.eks. monocytter, dendritiske celler, Langerhanske celler) og andre celler som presenterer antigen for immunceller (f.eks. keratinocytter, endothel-celler, astrocytter, fibroblaster, oligodendrocytter). Videre blir det foretrukket at den antigen-presenterende celle har redusert evne til å stimulere et ko-stimulatorisk signal i mottakerens T-celler. F.eks. kan den antigen-presenterende celle mangle ekspresjon av eller uttrykke bare lave nivåer av ko-stimulatoriske molekyler såsom B7-familien av proteiner (f.e-ks. B7-1 og B7-2). Ekspresjon av kostimulato-riske molekyler på potensielle antigen-presenterende celler som skal anvendes ifølge denne oppfinnelse, kan bestemmes ved standard teknikker, f.eks.ved strømningscytometri ved anvendelse av antistoffer rettet mot ko-stimulatoriske molekyler.

Foretrukne antigen-presenterende celler for indusering av T-celletoleranse er lymfoide celler, f.eks. perifert blod lymfo-cytter eller miltceller. Foretrukne lymfoide celler for indusering av T-celletoleranse er B-celler. B-celler kan renses fra en blandet populasjon av celler (f.eks. andre celletyper i perifert blod eller milt) ved standard celle-separasjonsteknikk. F.eks. kan klebende celler fjernes ved dyrking av miltceller på plastskåler og gjenvinning av den ikke-klebende cellepopulasjon. T-celler kan fjernes fra en blandet populasjon av celler ved behandling med et anti-T-celle-antistoff (f.eks. anti-Thyl.l og/eller anti-Thyl.2) og komplement. I én utførelse anvendes hvilende lymfoide celler, fortrinnsvis hvilende B-celler, som de antigen-presenterende celler. Hvilende lymfoide celler, såsom hvilende B-celler, kan isoleres ved teknikker kjent i teknologien, f.eks. basert på deres lille størrelse og lave tetthet. Hvilende lymfoide celler kan isoleres f.eks. ved sentrifugal elutriering i motstrøm som beskrevet hos H.P. Tony og D.C. Parker (1985) J. Exp. Med. 161:223-241. Ved anvendelse av sentrifugal utvasking i motstrøm kan det fremstilles en liten hvilende lymfoid celle-populasjon utarmet på celler som kan aktivere T-celle-responser, ved oppsamling av fraksjon(er) ved 14-19 ml/min., fortrinnsvis 19 ml/min. (ved 3200 opm). Alternativt kan det isoleres små hvilende lymfocytter (f.eks. B-celler) ved sentrifugering med diskontinuer-lig tetthetsgradient, f.eks. ved anvendelse av en Ficoll- eller Percoll-gradient, og et sjikt som inneholder små hvilende lymfo-cytter kan fremstilles etter sentrifugering. Små hvilende B-celler kan også adskilles fra aktiverte B-celler ved å analysere for ekspresjon av ko-stimulatoriske molekyler såsom B7-1 og/eller B7-2, på overflaten av aktiverte B-celler ved standard teknikk (f.eks. immunfluorescens).

Den antigen-presenterende celle, såsom en B-celle, kan bringes i kontakt med et antigen (f.eks. et løselig protein) før kontakt med T-cellen, f.eks. før administrering til et individ og cellen anvendes til å presentere antigenet for T-cellen i nærvær av en gp39-antagonist for å indusere spesifikk T-celletoleranse til antigenet (se eks. 1). Alternativt kan det induseres toleranse til alloantigener ved anvendelse av en allogen celle som den antigen-presenterende celle (se eks. 2 og 3). Den allogene celle presenterer antigenfragmenter av allogene proteiner for T-celler. I én utførelse vil den allogene celle være en allogen lymfoid celle, såsom en allogen B-celle. Alternativt kan et individ bibringes toleranse med celler i perifert blod (f.eks. perifert blod lymfo-cytter), miltceller eller benmargceller. I tilfellet benmargtransplantasjon vil donorens benmargceller selv tjene som de antigen-presenterende celler som bringes i kontakt med T-cellene (felts, administreres til et individ). Allogen benmarg kan følgelig administreres i forbindelse med en gp39-antagonist for å indusere toleranse til benmargen hos mottakeren og for å forhindre "graft versus host"-sykdom (se eks. 4 og 5).

ni. Administrering av celler og gp39-antagonister

Antigen-spesifikk T-celletoleranse kan induseres ved administrering av en gp39-antagonist til et individ i forbindelse med en celle som presenterer antigen for en T-celle og uttrykker en ligand som virker sammen med gp39 på T-cellen. I en foretrukket utførelse blir den antigen-presenterende celle og gp39-antagonisten administrert simultant eller samtidig. Alternativt kan gp39-antagonisten administreres før administrering av cellene, f.eks. når antagonisten er et antistoff med lang halveringstid. I et tilfelle hvor cellene som skal administreres er benmargceller, hvor det er ønskelig å inhibere graft-versus-host-sykdom, kan donorens T-celler i benmargen bibringes toleranse før overføringen til mottakerverten ved inkubering av donorens benmarg med B-celler fra verten og en gp39-antagonist in vitro. gp39-behandlingen kan fortsettes in vivo under og etter benmargoverføringen om nødvendig. Hos individer som skal få et benmarg- eller annet organtransplantat, kan allogen toleranse for transplantatet induseres i individet ved behandling med et regime som induserer allogen toleranse før overføringen av organ- eller benmargcellen. Dette forbehandlingsregime kan involvere administrering til individet av celler fra donoren sammen med en gp39-antagonist. Cellene fra donoren kan være f.eks. B-celler, helt perifert blod eller en viss fraksjon derav (f.eks. perifert blodlymfocytter eller små hvilende lymfocytter eller B-celler).

Administrering av en enkeltdose av antigenpresenterende celler i kombinasjon med antagonisten er blitt funnet å være tilstrekkelig for induksjon av T-celletoleranse (se eksemplene). Antallet antigenpresenterende celler som administreres, kan variere avhengig av den type celle som anvendes, typen av vev eller organtransplantat, mottakerens vekt, mottakerens generelle tilstand og andre variabler kjent for den dyktige fagmann. Et hensiktsmessig antall celler for anvendelse kan bestemmes av en vanlig fagmann på dette område ved konvensjonelle metoder, f.eks. ved anvendelse av analyser beskrevet i eksemplene. Cellene administreres i en form og på en måte som er egnet for induksjon av toleranse hos mottakeren. Cellene kan administreres i en fysiologisk akseptabel løsning, f.eks. en bufret saltløsning eller lignende bærer. Cellene administreres fortrinnsvis intravenøst.

En antagonist administreres til individer i en biologisk forlikelig form som egner seg for farmasøytisk administrering in vivo for å indusere T-celletoleranse. Ved "biologisk forlikelig form som egner seg for admimstrering in vivo" menes en form av antagonisten som skal administreres hvori eventuelle toksiske effekter blir oppveiet av de terapeutiske effekter av proteinet. Uttrykket "individ" er ment å inkludere levende organismer som det kan fremkalles en immunrespons i, f.eks. pattedyr. Eksempler på individer omfatter mennesker, hunder, katter, mus, rotter og transgene arter derav. En gp39-antagonist kan administreres i hvilken som helst farmakologisk form, eventuelt i en farmasøytisk akseptabel bærer. Administrering av en terapeutisk aktiv mengde av antagonisten defineres som en mengde som er effektiv ved doseringer og for tidsrom som er nødvendig for å oppnå det ønskede resultat. En terapeutisk aktiv mengde av en antagonist for gp39 kan variere ifølge faktorer såsom sykdommens tilstand, individets alder, kjønn og vekt, og antagonistens evne til å fremkalle en ønsket respons hos individet. Doser-ingsregimer kan justeres for å tilveiebringe den optimale terapeutiske respons. F.eks. kan det administreres flere oppdelte doser daglig, eller dosen kan reduseres proporsjonalt ettersom hvor kritisk den terapeutiske situasjonen er.

Den aktive forbindelse (f.eks. antagonisten) kan administreres på beleilig måte såsom ved injeksjon (subkutan, intravenøs o.s.v.), oral administrering, inhalasjon, transdermal påføring eller rektal adrninistrering. Avhengig av administrerings-veien kan den aktive forbindelse være belagt med et materiale for å beskytte forbindelsen fra virkningen av enzymer, syrer og andre naturlige tilstander som kan inaktivere forbindelsen. En foretrukket administrasjonsvei er ved intravenøs injeksjon.

For å administrere en antagonist for gp39 på annen måte enn ved parenteral administrering, kan det være nødvendig å belegge antagonisten med, eller koadministrere antagonisten med, et materiale for å forhindre dens inaktivering. F.eks. kan en antagonist administreres til et individ i en hensiktsmessig bærer eller fortynningsmiddel, koadministreres med enzym-inhibitorer eller i en egnet bærer såsom liposomer. Farmasøytisk akseptable fortynningsmidler omfatter saltløsning og vandige bufferløsninger. Enzym-inibitorer omfatter pancreas trypsin inhibitorer, diiso-propylfluorfosfat (DEP) og trasylol. Liposomer omfatter vann-i-olje-i vann-emulsjoner samt konvensjonelle liposomer (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).

Den aktive forbindelse kan også administreres parenteralt eller intraperitonealt. Dispersjoner kan også fremstilles i glycerol, flytende polyetylenglykoler, og blandinger derav og i oljer. Under ordinære betingelser for lagring og anvendelse kan disse preparater inneholde et konserveringsmiddel for å forhindre vekst av mikroorganismer.

Farmasøytiske preparater egnet for injiserbar anvendelse omfatter sterile vandige løsninger hvor de er vannløselige eller dispersjoner og sterile pulvere for samtidig fremstilling av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner. I alle tilfeller må preparatet være sterilt og flytende i en slik grad at det lett lar seg sprøyte inn. Det må være stabilt under fremstillings- og lagringsbetingelser, og må være beskyttet mot den forurensende virkning av mikroorganismer såsom bakterier og sopp. Bæreren kan være et løsningsmiddel eller et dispergerings-medium inneholdene f.eks. vann, etanol, polyol (f.eks. glycerol, propylenglykol og flytende polyetylenglykol og lignende) og egnede blandinger derav. Passende fluiditet kan opprettholdes f.eks. ved anvendelse av et belegg såsom lecitin, ved å opprettholde den nødvendige partikkelstørrelse i tilfellet dispersjon og ved anvendelse av tensider. Forebyggelse av virkningen av mikroorganismer kan oppnås ved forskjellige antibakterielle og anti-soppmidler, f.eks. parabener, klorbutanol, fenol, askorbinsyre, thimerosal og lignende. I mange tilfeller vil det være å foretrekke å inkludere isotoniske midler, f.eks. sukkere, polyalkoholer såsom mannitol, sorbitol og natriumklorid i preparatet. Forlenget absorpsjon av de injiserbare preparater kan bringes istand ved å inkludere i blandingen et middel som forsinker absorpsjonen, f.eks. aluminium-monostearat og gelatin. Sterile injiserbare løsninger kan fremstilles ved inkorporering av den aktive forbindelse (f.eks. en antagonist av gp39) i den nødvendige mengde i et hensiktsmessig løsnings-middel med én av eller en kombinasjon av bestanddelene nevnt ovenfor, etter behov, etterfulgt av filtersterilisering. Generelt fremstilles dispersjoner ved inkorporering av den aktive forbindelse i en steril bærer som inneholder et basisk dispersjonsmedium og de nødvendige andre bestanddeler av dem som er nevnt ovenfor. I tilfellet sterile pulvere for fremstilling av sterile injiserbare løsninger vil de foretrukne fremstillingsfremgangsmåter være vakuum tørking og frysetørking som gir et pulver av den aktive bestanddel, f.eks. antagonist pluss eventuelle ytterligere ønskede bestanddeler fra en tidligere steril filtrert løsning derav.

Når den aktive forbindelse er hensiktsmessig beskyttet, som beskrevet ovenfor, kan proteinet administreres oralt, f.eks. med et inert fortynningsmiddel eller en assimilerbar spiselig bærer. Som anvendt her skal "farmasøytisk akseptabel bærer" inkludere hvilket som helst og alle løsningsmidler, dispersjonsmedier, belegg, antibakterielle og anti-soppmidler, isotoniske og absorpsjons-forsinkende midler, og lignende. Anvendelse av slike medier og midler for farmasøytisk aktive substanser er velkjent i teknologien. Unntatt så langt et eventuelt konvensjonelt medium eller middel er uforlikelig med den aktive forbindelse, vil anvendelse derav i de terapeutiske preparater bli overveiet. Supplementerende aktive forbindelser kan også inkorporeres i preparatene.

Det er spesielt fordelaktig å formulere parenterale preparater i doseringenhetsform for grei administrering og jevn dosering. Doseringsenhetsform som anvendt her skal referere til fysisk adskilte enheter egnet som enhetsdoseringer for pattedyr-individene som skal behandles; idet hver enhet inneholder en forutbestemt mengde av aktiv forbindelse beregnet å frembringe den ønskede terapeutiske effekt i forbindelse med den nødvendige farmasøytiske bærer. Spesifikasjonen for doseringsenhetsformen ifølge denne oppfinnelse dikteres av og er direkte avhengig av (a) de unike egenskaper av den aktive forbindelse og den spesielle terapeutiske effekt som skal oppnås, og (b) de iboende begrensninger i teknologien for kompoundering av en slik aktiv forbindelse for behandling av sensitivitet hos individer.

I tillegg til tolerisering av T-celler in vivo er det mulig med tolerisering av T-celler in vitro, fleks, ved kontakt med en antigen-presenterende celle i nærvær av en gp39-antagonist. F.eks. kan det fremstilles T-celler fra et individ, bibragt toleranse in vitro ved dyrking med de antigen-presenterende celler og antagonisten og deretter administrering på nytt til individet.

IV. Anvendelser

Det er følgelig mulig å indusere T-celletoleranse for flere forskjellige antigener. F.eks. kan det induseres T-celletoleranse for et løselig antigen f.eks. et løselig protein som beskrevet i eks. 1. T-celler kan bibringes toleranse for antigener involvert i autoimmune sykdommer eller forstyrrelser i forbindelse med unormale immunresponser. I én utførelse vil antigenet f.eks. være et autoantigen. I en annen utførelse vil antigenet være et allergan. Alternativt kan T-celler bibringes toleranse for antigener uttrykt på fremmede celler som beskrevet i eks. 2-5. I ytterligere andre utførelser vil antigenet følgelig være et alloantigen eller xenoantigen. Induksjon av T-celletoleranse for alloantigener og xenoantigener er av spesiell anvendelse i transplantasjon, f.eks. til å inhibere avstøpning fra en transplantat-mottaker av et donortransplantat, f.eks. et vevs-eller organtransplantat eller benmargtransplantat. Dessuten vil det å bibringe toleranse til donor T-celler i et benmargtransplantat være anvendelig til å inhibere "graft versus host"-sykdom (se eks. 5).

Oppfinnelsen illustreres ytterligere ved de følgende eksempler.

Eksempel 1: Induksjon av antigen-spesifikk toleranse

Metoder

Mus ble immunisert med KLH-pulsede B-lymfocytter fra milten i 5 dager. Under den primære immunisering var dyrene enten ubehandlet eller behandlet med et anti-gp39-antistoff MR1. 5 dager etter den første immunisering ble musene gitt en lokal utfordring (fér-blokk) med KLH i komplett Freunds'adjuvans (CFA). Musene ble avlivet 5 dager senere, de drenerende lymfeknuter fjernet og den proliferative T-cellerespons på KLH ble deretter bestemt in vitro.

Resultater

Dyrene immunisert med aktiverte B-lymfocytter pulset med antigen og deretter utfordret med det samme antigen, gir signifikante immunresponser mot det immuniserende antigen. Responsen målt ved formering av antigen-spesifikke T-lymfocytter er vist i fig. 1. Behandling av dyr med et anti-gp39-antistoff under den primære immunisering resulterer i manglende evne til respons hos antigen-spesifikke T-lymfocytter på in vitro antigenutfordring. T-lymfocytter fremstilt fra lymfeknuter fra dyr behandlet med et anti-gp39-antistoff viser nedsatt formeringsevne sammenlignet med T-lymfocytter fremstilt fra lymfeknuter fra ubehandlede dyr.

Eksempel 2: Induksjon av T-celletoleranse for allogene celler

Metoder

Balb/c (H-2d) -mus ble immunisert med allogene milt B-celler fra DBA/2(H2^)-mus. Dyrene var behandlet med et anti-gp39-antistoff, MR1, eller ubehandlet i 5 dager etter immunisering. På dag 6 ble dyrene avlivet og milten fjernet. Miltceller fra anti-gp39-antistoff eller ubehandlede dyr ble deretter dyrket in vitro enten uten stimulus eller med bestrålte DBA/2 miltceller. Den proliferative respons på denne sekundære allogene stimulering ble målt på dag 3 etter dyrkingsstart.

Resultater

T-lymfocytter fra dyr immunisert med allogene milt B-celler gir sterke proliferative

responser når de utfordres 5 dager senere med de samme celler in vitro (fig. 2). T-lymfocytter fra mus immunisert med allogene milt B-celler og behandlet med et anti-gp39-antistoff har imidlertid nedsatt formeringsevne når de deretter utfordres in vitro. Mus behandlet med anti-gp39-antistoff viser ca. 50% nedsettelse av evne til respons på utfordring sammenlignet med ubehandlede kontrollmus.

Eksempel 3 : Anti-gp39-behandling interfererer med dannelse av CTL-responser til allogene B-celler

I dette eksempel undersøkte man rollen til gp39 ved dannelsen av cytotoksiske T-celler (CTL). For å bestemme in vivo-funksjonen til gp39 ved utviklingen av CTL undersøkte man effektene av anti-gp39-behandling på dannelsen av allospesifikke CTL ved immunisering med allogene B-celler. Effektene av anti-gp39-behandling av både primære og sekundære CTL-responser ble bestemt.

Primære CTL-responser

For å teste hvorvidt anti-gp39 kan forhindre allogene B-celler fra å fremkalle allospesifikke CTL-responser in vivo, ble det administrert allogene B-celler (T-utarmede miltceller) til mottakermus med eller uten anti-gp39. Balb/c-mus (hunnmus, 6-8 uker gamle, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) ble immunisert med C57BL/6 (hunnmus, 6-8 uker gamle, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) miltceller (30-50 x 10^) utarmet på T-celler anti-Thyl.2 (ascites frembragt fra ATCC klon HO 13.4) og kanin-komplementbehandling. Disse mottakermus ble deretter ubehandlet eller behandlet med anti-gp39 i 5 dager (250 mg/mottaker på dagene 0,2 og 4). På dag 5 ble milten fjernet og CTL-responsene ble målt ved anvendelse av en 4 timers kromavgivelsesanalyse. Milt-celler fra ikke-primede Balb/c-mus ble anvendt som negative kontroll-effektorceller. Anvendte målceller var E-hunnmus Kl(H-2 , T-cellelymfoma avledet fra C57BL/6-stammen) og P815 (H-2d, mastocytoma, avledet fra DBA/2J-stammen). <51>Cr-merkede målceller ble vasket og platet ut i 1 x 10^ celler pr. brønn i 96 brønners plater med effektorceller i effektonmål (E:T)-forhold på 100:1,20:1 og 4:1. Platene ble kort sentrifugert og deretter inkubert ved 37°C i 5% CO2 i 4 timer. Platene ble sentrifugert ytterligere én gang, og 100 ml av cellefri supematant ble oppsamlet fra hver brønn for gamma-telling (LKB Clinigamma, Wallace Inc., Gaithersburg, MD). Prosent spesifikk lysis defineres som (a-b)/c, hvor a = cpm avgitt av målceller inkubert med effektorceller, b = cpm avgitt av målceller inkubert med bare mediet (spontan avgivelse) og c = fryse-tine cpm som kan avgis fra målceller (ca. 80% av total cpm inkorporert). P815 mål ble ikke lyset av noen av de testede celleprøver. Resultater for E-hunnmus Kl mål er illustert i fig. 3A, hvori de viste grupper er ubehandlede mus (■), anti-gp39-behandlede mus (A) og miltceller fra ikke-primede Balb/c-mus (•: anvendt som negative kontroll-effektorceller. Resultatene viser at mus som fikk anti-gp39 og allogene celler ikke dannet en primær CTL-respons in vivo i respons på allogene B-celler. Motsatt, i fravær av anti-gp39, sensibiliserte de allogene B-celler mottakeren mot alloantigen og induserte en betydelig CTL-respons.

For å bestemme hvorvidt anti-gp39 bare kunne forsterke den tolerogene effekt av ikke-aktiverte milt B-celler, ble LPS-aktiverte B-celler anvendt til å prime CTL i nærvær eller fravær av anti-gp39. B-celler fra C57BL/6-mus ble fremstilt som beskrevet ovenfor og dyrket i 2 dager i nærvær eller fravær av lipopolysakkarid (LPS; 50 mg/ml; Sigma Diagnostics, St. Louis, MO).

Cellene ble deretter høstet og vasket inngående og injisert i.p. (30-50 x 10 ) i Balb/c-mottakermus. Mottakermusene var enten ubehandlede eller behandlet med anti-gp39 på dagene 0,2 og 4 som beskrevet ovenfor. På dag 5 ble milten fjernet og CTL-responsene bestemt som beskrevet ovenfor. Resultatene av to uavhengige eksperimenter er vist i fig. 3B (øvre og nedre diagram). De representerte grupper er LPS-blaster in vivo uten behandling >, LPS-blaster in vivo med anti-gp39-behandling (•), hvilende B-celler in vivo uten behandling (O) og hvilende B-celler in vivo med anti-gp39-behandling (□). Resultatene viser at, selv om den ikke er fullstendig, vil anti-gp39-behandling også redusere den primære CTL-respons på allogene LPS-blaster.

Sekundære CTL-responser

For å undersøke virkningen av anti-gp39 og administrering av allogene B-celler på CTL-dannelsen, ble miltceller fra behandlede og ubehandlede mus stimulert in vitro, og rammen for CTL-responsene undersøkt. Balb/c-mus ble primet in vivo med C57BL/6-avledede B-celler som beskrevet ovenfor. Miltceller fra dyrene behandlet med anti-gp39 og kontroll-hamster lg (Hig) ble fjernet, og 5 x 10** celler/ml ble dyrket i 5 dager ("respondere") med forskjellige stammer av milt B-celler (fremstilt ved anti-Thyl.2 + komplementbehandling) behandlet med mitomycin C (2,5 mg/ml ved 37°C, Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) ved 5 x 10^ stimulatorer/ ml. Stimulat-orgruppene var C57BL/6 (H-2<b>) og Balb/c (H-2<d>) som viser henholdsvis den sekundære allogene respons og den primære syngene respons. Stimulator og responderceller ble dyrket i friskt fremstilt sensibiliseirngsmedium RPMI-1640 (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 1 x 10<5> M 2-merkaptoetanol (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), 2 mM L-glutamin (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO), 500 U/ml penicillin og 5000 U/ml streptomycin (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO). Etter 5 dager ble responder-cellene høstet, og døde celler fjernet ved sentrifugering på en tetthetsgradient. De resulterende levende celler ble anvendt som effektorer i en CTL-assay som beskrevet ovenfor. Målene omfattet E-hunnmus Kl (H-2 , T-celle-lymfoma avledet fra C57BL/6-stammen) og P815 (H-2d, mastocytoma, avledet fra DBA/2J-stammen). Resultatene er illustrert i fig. 4A. Allogene stimulerte effektor-grupper som er vist er: HIg-behandlede mottakere (•), naturlige Balb/c (>), og anti-gp39-behandlede mottakere (■). Tilsvarende syngen respons (Balb/c-celler stimulert med Balb/c-celler) er angitt ved åpne symboler. Som antatt resulterte in vivo-immunisering av mus med allogene T-utarmede miltceller (H-2 ■u) i fravær av anti-gp39-behandling i en robust sekundær CTL-respons in vitro. Den forhøyede sekundære anti-H-2 CTL-respons ble ikke observert dersom musene ble gitt anti-gp39 in vivo.

For å bestemme spesifisiteten av inhiberingen av CTL-responser ved anti-gp39-behandling,

ble miltcellekulturer som beskrevet ovenfor analysert for anti-H-2^ allogene responser (tredje part allogene responser) ved anvendelse av B10BR (H-2^) milt B-celler som stimulatorene og SL8 (H-2 , spontane T-celle-lymfoma avledet fra AKR-stammen) som målene i CTL-analysen. Resultatene er vist i fig. 4B. De viste grupper er naturlige Balb/c (O) og anti-gp39-behandlede mottakere (■). Resultatene viser at inhiberingen av anti-H2 -spesifikke CTL-responser ved anti-gp39-behandling var allospesifikk siden administrering av H-2'5 miltceller og anti-gp39 ikke forandret in vitro CTL-responsen på et tilskuer alloantigen (H-2^).

Tilsammen viser disse data at anti-gp39 interfererer med dannelsen av allospesifikke CTL-responser (både primære og sekundære). I nærvær av anti-gp39 vil CTL-forløpere spesifikke for det relevante alloantigen fremdeles være til stede, siden man kan demonstrere en viss anti-H-2 CTL-aktivitet i den sekundære kultur in vitro. Det kan konkluderes at anti-gp39-behandling reduserte den sekundære in vitro respons ved å blokkere CTL-priming eller redusere frekvensen av primet allospesifikk CTL. Anvendelsen av hvilende B-celler er ikke påkrevet for å demonstrere denne manglende responsevne siden den allogene CTL-respons indusert av LPS-blaster også ble svekket av anti-gp39.

Eksempel 4: Overføring av allogen murin benmarg induserer

stabile kimæra når mottakere blir behandlet med et antistoff mot gp39

Behandling for mange hematologiske forstyrrelser som ikke kan helbredes med konvensjonelle kjemoterapeutiske metoder, involverer overføring av allogen benmarg. Denne aggressive terapi involverer administrering av høye myeloablative doser av kjemoterapi sammenkoblet med perfusjon av allogen benmarg som tillater utrydding av klonogene tumorceller.

Det er allerede blitt vist at bestråling av thymus som fjerner thymus T-celler, øker forekomsten av stabile kimæra når det ble anvendt monoklonale antistoffer (mAb'er) mot T-cellen, innbefattet anti-CD4 mAb'er. Dette antistoff-regime førte til fjerning av T-celler og således til donor spesifikk toleranse, som kunne indikeres ved toleranse for donor hudplantater. At man ikke lyktes i å oppnå permanent allogen implantering etter 300 rad WBI, in vivo anti-T-celle mAb-behandling, og administrering av allogen benmarg, kan ha skrevet seg fra de upåvirkede T-celler i thymus. Anvendelse av anti-CD4 og anti-CD8 mAb'er kan føre til effektiv utarming av perifert blod og milt T-celler, men thymus T-cellene er ganske enkelt belagt med mAb'er men ikke fjernet. Således utføres bestråling av thymus på musen.

Metoder

Det ble anvendt en murin modell for allogen benmargoverføring (BMT) av Fl til forelder slik at det kunne unngås indusering av "graft versus host"-sykdom. Vi anvendte Fl-stammen CB6

som er (C57BL/6 x Balb/c)Fl som resulterte i den generelle MHC haplotype av H-2^. Benmarg ble tatt ut og injisert i vev i den bestrålte Balb/c-forelder med eller uten et anti-gp39-antistoff, MR1. Nivået for bestråling av hele kroppen (WBI) ble variert slik at man kunne bestemme det beste nivå av kimærisme og sammenligne anti-gp39-antistoff-behandlede og ubehandlede dyr med hvert bestrålingsnivå. Kimærisme ble bestemt ved flow-cytometrisk analyse av perifert blod lymfocytter av H-2b MHC-haplotypen til stede i H-2d (BALB/c)-musen. Det var tidligere blitt vist at denne kombinasjon av mus er egnet, og at det kan fremstilles kimærer på nivået 500 og 600 rad WBI.

Resultater

Kimærisme ble påvist ved identifikasjon av C57BL/6-avledede celler (H-2 ) ved flowcytometri. Det ble funnet at det utviklet seg kimærisme i mus bestrålt med 400,500 og 600 rad WBI i løpet av 14 dager bare dersom de ble behandlet med anti-gp39-antistoff fra starten av studiet. Mus som ikke fikk noen antistoffbehandling, forkastet cellene på alle bestrålingsnivå unntatt når de ble gitt 600 rad WBI, hvorved de aksepterte benmargen i den samme utstrekning som den antistoffbehandlede gruppe ved 400 rad (tabell 1). Det ble funnet at kimærismenivået etter 6 ukers terapi ved 400, 500 og 600 rad med anti-gp39-antistoff-terapi var henholdsvis 70,7 + 5,74, 94,1 og 84,4 + 8,56, mens det ved 600 rad uten noen behandling ble funnet å være 85,7 + 5,9 kimært (tabell 2). Fenotyping av cellene på dette punkt viste at T-celler, B-celler og makrofager alle var kimærisert og i den samme utstrekning for 400 rad når behandlet ble sammenlignet med den 600 rad ubehandlede gruppe (tabell 2). Det syntes også som om anti-gp39-antistoffbehandling ikke signifikant forandret den totale tilstedeværende populasjon av noen av de lymfoide celler innenfor omkretsen. Når behandling av dyrene med anti-gp39-antistoff ble avsluttet, ble dyrene funnet å være stabilt kimære i opp til 8 uker post transplantering.

Nivåer av bestråling av hele kroppen som resulterte i

kimærisme. Tallene i parentes viser det totale antall

dyr som ble testet på hvert nivå.

Prosent av B-celler, T-celler og makrofager (Mak.) positive

for H-2kb ± standardfeil.

Eksempel 5: Allogen benmargtransplantasjon kombinert med

behandling av mottakeren med anti-gp39

inhiberer akutt og kronisk "graft versus host"-

sykdom

Følgende metodologi ble anvendt i dette eksempel:

Mus: DBA/2 (H-2<d>), C57BL/6 (H-2<b>) og B6D2F|

((C57BL/6 (H-2<d>) x DBA/2) Fj-hybride) mus ble levert fra NCI-laboratoriene (Bethesda,

Maryland) og oppbevart i et virusfritt miljø i dyrestallen ved Dartmouth Medical School. Alle musene som ble anvendt i dette studiet var hunnmus, og med alder 6-8 uker.

Indusering av kronisk GVHD: Kronisk GVHD ble indusert ved i.v. injeksjon av parentale (DBA/2) miltceller i ikke-bestrålte (C57BL/6 x DBA/2)Fj hybride mottakere (Fast, L.D. (1990) J.

Immunol. 144:4177). Parentale mus ble anestetisert og avlivet ved halshugging som forberedelse til fjerning av milten. Adskilte miltceller ble vasket og slemmet opp igjen i RPMI 1640-medium (Whittaker, Waldersville, Maryland) for i.v. injeksjon i F j-mottakerne.

Induksjon av akutt GVHD: Akutt GVHD ble indusert ved i.v. injeksjon av parentale C57BL/6 miltceller i ikke-bestrålte (C57BL/6 x DBA/2)Fj hybride mottakere. Cellene ble forberedt for overføring som for indusering av kronisk GVHD.

Antistoffer: Anti-gp39:MRl ble fremstilt i ascites og renset ved ionebytter-HPLC, som tidligere beskrevet (T.M. Foy et al., (1993) J. Exp. Med. 178:1567-1575; R.J. Noelle et al., (1992) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:6550. Polyklonale anti-isotype-antistoffer: Alle anti-IgGj og IgA-antistoffer og standard-kontroller ble levert fra Southern Biotechnology Associates, Inc., (Birmingham AL). Anti-IgE-antistoffer: Alle anti-IgE-antistoffer (BIE3 og Biotin AM95) og standarder (A3B1) anvendt i den IgE-spesifikke ELISA var en hjertelig gave fra Dr. T. Waldschmidt, LA. Anti-MHC haplotype-antistoffer: H-2Kb FITC-konjugert antistoff og H-2Dd Biotin-konjugert antistoff ble levert fra PharMingen (San Diego, CA).

Cellelinjer: Anvendte cellelinjer inkluderte P815 (H-2<d>) og LB27.4 (H-2<bxd>), som ble levert fra the American Type Culture Collection. Cellelinjen cl. 18.5 (H-2b) ble levert som en hjertelig gave fra Dr. William R. Green.

Polyklonal Ig-produksjon in vitro: Milter fra kontroll og cGVHD-mus ble fjernet og enkeltcellesuspensjoner fremstilt. Cellene ble behandlet med Tris-bufret ammoniumklorid for å fjerne erytrocytter, og totale hvite blodlegemer bestemt ved visuell hemocytometertelling. Cellene ble inkubert (5xl0<6>) i 1 ml komplett (c)RPMI-1640-medium (supplementert med 10% føtalt serum (Hyclone Logan UT), 25 mM HEPES, 2 mM L-glutamin, 5000 U/ml penicillin og 5000 mg/ml streptomycin) i 3 dager ved 37°C, 5% CC^. Kultursupernatantene ble oppsamlet ved pelletering av cellene, og lg ble kvantifisert ved en isotype-spesifikk ELISA assay.

Isotype-spesifikk og antigen-spesifikk ELISA: ELISA for påvisning av IgGj og IgA: Geit anti-mus IgGj eller IgA (10 jig/ml; Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham AL) i PBS ble absorbert på brønner i en 96-brønners polyvinyl mikrotiterplate i 1 time ved 37°C og deretter over natten ved 4°C. Platene ble vasket og blokkert med PBS inneholdende 1% FCS i 1 time ved 37°C. Platene ble vasket igjen og de hensiktsmessige fortynninger av supernatanter og standardkontroller (IgGj og IgA, Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham AL) ble tilsatt i 2 timer ved 37°C. Etter denne tid ble platene vasket 3 ganger, og alkalisk fosfatase-konjugert geit anti-mus IgGj eller IgA, (1/500 fortynninger) (Southern Technology Associates, Inc., Birmingham Alabama) ble tilsatt i 2 timer ved 37°C. Platene ble inngående vasket og fosfatasesubstrat (1 mg/ml; Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) tilsatt, hvilket resulterte i den hensiktsmessige farveforandring. Avlesningene ble bestemt med en ELIS A-leser (Dynatech Laboratories, Inc.) ved en absorbans på 410 nm. Konsentrasjoner av lg ble bestemt ved sammenligning med den hensiktsmessige isotype standardkurve og uttrykt som gjennomsnittet + standardfeil (n=3).

ELISA for deteksjon av IgE: Brønnene i en 96-brønners polyvinyl mikrotiterplate ble belagt med et antimus IgE "capture"-antistoff (B1E3 (2 mg/ml)) over natten ved 4°C og deretter blokkert med PBS inneholdende 1% FCS i 1 time ved 37°C. Platene ble vasket igjen og de egnede fortynninger av supematanter og standardkontroller (A3B1 (IgE)) ble tilsatt i 2 timer ved 37°C. Platene ble inngående vasket og EM95-Biotin (5 mg/ml) ble satt til hver brønn og inkubert i 2 timer ved 37°C. Etter denne tid ble det tilsatt alkalisk fosfatase konjugert til streptavidin (1/500 fortynning) i ytterligere 2 timer, og deretter vasket inngående før tilsetning av fosfatasesubstrat (1 mg/ml); Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) som resulterte i den hensiktsmessige farve-forandring. Avlesningene ble bestemt med en ELISA-leser (Dynatech Laboratories Inc.) ved en absorbans på 410 nm. Konsentrasjonene av lg ble bestemt ved sammenligning med standardkurve og uttrykt som gjennomsnittet + standardfeil (n=3).

ELISA for påvisning av anti-DNA Ab: Kalvethymus-DNA (Sigma, St. Louis, MO) (5 jig/ml) ble løst i koblingsbuffer inneholdende 0,1M narriurnkarbonat/nalirurrihydrogenkarbonat (pH 9,8). Denne ble kokt i 10 min. og deretter inkubert på is i 3 min. OD 260 av dette DNA ble deretter bestemt, og konsentrasjonen justert for å oppnå de nødvendige 5 fig/ml DNA. 100 fil ble deretter satt til brønnene i en 96-brønners polyvinyl mikrotiterplate og inkubert over natten ved 4°C. Platen ble deretter vasket 3 ganger og blokkert i 1 time ved 37°C med PBS inneholdende 1% FCS og 0,02% natriumazid. Platen ble vasket igjen, og seriefortynninger av serumprøver ble deretter tilsatt (100 ml) og inkubert i 2 timer ved 37°C. Deteksjons-antistoffet, geit anti mus IgGj alkalisk fosfatase ble deretter satt til hver brønn og inkubert atter en gang i 2 timer ved 37°C. Platene ble inngående vasket, og tilsatt fosfatasesubstrat (1 mg/ml; Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) hvilket resulterte i den hensiktsmessige farveforandring. Avlesningene ble bestemt med en ELISA-leser (Dynatech Laboratories, Inc.) ved en absorbans på 410 nm. Antistoff-titere ble sammenlignet med positive seraprøver og resultatene uttrykt i vilkårlige enheter.

Flowcytometri-analyse for påvisning av donor-avledede celler. Milten ble fjernet fra normale BDFj, cGVHD-mus behandlet med og uten anti-gp39 og en enkeltcellesuspensjon ble fremstilt. Cellene ble sjiktet ut på Ficoll-Hypaque (4:1) og deretter sentrifugert ved 2000 opm i 20 min. ved romtemperatur. Det resulterende lymfocyttsjikt ble fjernet og vasket én gang med BSS inneholdende 5% FCS. 1 x 10** celler pr. rør ble anvendt for farvrng i et 50 fil sluttvolum. 50 fil rotteserum ble tilsatt til hvert rør for å forhindre ikke-spesifikk binding av antistoffer. Cellene ble farvet med (a) kontroll-antistoffene: Rotte lg FITC (1:100 slutt-fortynning) og PE-streptavidin (1:500 sluttfortynning) og (b) FITC H-2Kb og Biotin H-2Dd (begge 1:100 sluttfortynning). Cellene ble inkubert i 20 min. på is og deretter vasket to ganger for å fjerne eventuelle ubundne antistoffer. Til slutt ble tilsatt PE-streptavidin (1:500 sluttfortynning) til det egnede rør for å detektere det biotin-konjugerte antistoff i ytterligere 20 min. på is. Cellene ble igjen vasket to ganger klare for analyse på en Becton Dickinson FACScan. Etter positiv "gating" via forover og sidescatter, ble 10.000 hendelser oppsamlet pr. prøve for bestemmelse av prosent celler positive for den relavante MHC-haplotype.

Kromavgivelses-assay for bestemmelse av CTL-assay.

^ * Cr-merkede målceller blir vasket og platet ut i 1 x 10^ pr. brønn i 96-brønners plater med effektorceller i E:T-forhold på 100:1,20:1 og 4:1. Anvendte målceller inkluderte P815 (H-2<d>),

LB27.4 (H-2<bxd>) og cl 18.5 (H-2<b>). Platene sentrifugeres kort og inkuberes deretter ved 37°C i 5% CC<2 i 4 timer. Platene ble sentrifugert én gang tit, og en alikvot av cellefri supernatant ble oppsamlet fra hver brønn for telling med en gammateller. Prosent spesifikk lyse defineres som (a-b)/c hvor a = cpm avgitt av målceller inkubert med effektorceller, b = cpm avgitt av målceller inkubert med bare media (spontan frigjøring), og c = fryse/tine-cpm som kan frigjøres for

målceller (ca. 80% av total cpm inkorporert).

Sekundær stimulering av akutte GVHD miltceller in vitro.

Akutte GVHD-milter ble fjernet fra anti-gp39-behandlede, HIg-behandlede eller ubehandlede dyr.

Miltene ble utarmet på røde blodlegemer og deretter alikvotert i 1 x 10^ pr. cellebrønn. Bestrålte stimulatorceller (P815) ble satt til de hensiktsmessige brønner. Etter 7 dager ble det gjennomført CTL-analyser mot de hensiktsmessige mål som tidligere nevnt.

Resultater

GVHD i mus resulterer i splenomegali. Hos musene vil én av konsekvensene av cGVHD være forstørrelse av milten. Det er primært vertens egne celler som infiltrerer og forstørrer milten, selv om dette er i respons på tilstedeværelsen av donorceller (A.G. Rolink et al., (1983) J. Exp. Med. 158:546). Fig. 5 viser at på 7-14 dager etter initieringen av cGVHD, inneholder miltene nesten det dobbelte antall leukocytter sammenlignet med mus uten cGVHD. Behandling av mus ved utbredde av cGVHD med anti-gp39 (250 /xg/mus, dagene 0,2,4 og 6), reduserer antallet av leukocytter/ milt i cGVHD-mus til verdier som var identiske med mus uten sykdom.

GVHD-indusert hyperproduksjon av polyklonalt immunglobulin. Det er blitt rapportert at hyperproduksjon av lg foregår hos mus med cGVHD på grunn av kognate interaksjoner mellom donor T-celler og B-celler (S.E. Morris et al., (1990) J. Exp. Med. 171:503). For åbestemme hvorvidt anti-gp39 vil inhibere hyper Ig-produksjon, ble mus med cGVHD administrert anti-gp39. På dag 7 eller 14 ble miltene fjernet fra kontroll, og cGVHD-mus og B-cellene analysert for spontan produksjon av IgGj og IgA in vitro. Splenocytter fra mus med cGVHD ga høyt nivå av IgA og IgGj (fig. 6A og 6B) in vitro. Splenocytter fra mus med cGVHD og behandlet med anti-gp39 (dagene 0,2,4 og 6) ga imidlertid nivåer av IgG] og IgA identiske med mus uten sykdom. Tilsetningen av anti-gp39 til kulturer av miltceller fra mus med cGVHD ville ikke redusere nivåer av in vitro Ig-produksjon, hvilket antyder at anti-gp39 utøvet sin virkning in vivo.

Når hamster lg (Hig) ble anvendt som kontroll for disse eksperimenter, ble det funnet at det spilte ingen inhibitorisk rolle ved induseringen av GVHD, men i virkeligheten aksentuerte sykdommen ikke bare i form av polyklonal Ig-produksjon, men også i den resulterende splenomegali. En 8-gangers økning ble påvist i Ig-nivået frembragt av 1 uke Hlg-behandlede GVHD-induserte mus sammenlignet med ubehandlede 1 uke GVHD-induserte mus. Det var åpenbart at Hig i seg selv var et immunogen. Følgelig ble det bestemt å betegne de ubehandlede F

1-mottakermus som den relevante kontrollgruppe.

Effekt av anti-gp39 på GVHD-indusert serum Hyper-IgE og anti-DNA autoantistoffer.

Forløpet av cGVHD kan overvåkes ved hevning i serum IgE og antistoffer mot dobbelttrådet DNA (S.E. Morris et al., (1990) J. Exp. Med. 171:503). Nivået av serum IgE ble målt ved anvendelse av en IgE-spesifikk ELISA. Kronisk GVHD-induserte mus ble behandlet med anti-gp39 på dagene 0, 2,4 og 6 og deretter ble intet ytterligere antistoff administrert. Musene ble avblødet med ukentlige mellomrom, og nivået av serum IgE bestemt (fig. 7A). cGVHD induserer en 10-15 gangers økning i serum IgE-nivå. Administrering av anti-gp39 inhiberte cGVHD-indusert økning i serum IgE i opp til 8 uker etter initieringen av sykdommen. I tillegg til inhiberingen av forhøyet serum IgE ville administrering av anti-gp39 også blokkere dannelsen av serum anti-DNA autoantistoffer. Kronisk GVHD induserer en 5-10 gangers økning i nivået av anti-DNA antistoffer funnet, som var redusert ved anti-gp39-behandling (fig. 7B)

Tidligere studier hadde vist at halveringstiden for anti-gp39 (MRl-klon) er 12 dager (T.M. Foy et al., (1993) J. Exp. Med. 178:1567-1575). ELISA-analyser spesifikke for påvisning av anti-gp39 viser at anti-gp39 ikke lot seg påvise i serum fra behandlede mus 8 uker etter terapi. Hardnakket anti-gp39 kan derfor ikke svare for den langvarige undertrykkelse av cGVHD. Det ble gjennomført overføringsstudier for å undersøke hvorvidt splenocytter fra mus med cGVHD og fra dem som hadde fått administrert anti-gp39 kunne overføre cGVHD. Splenocytter fra mus som hadde fått cGVHD og anti-gp39 var ute av stand til å indusere forhøyet serumnivå av IgE og anti-DNA autoantistoffer etter adoptiv overføring; mens splenocytter fra mus med cGVHD induserte øket slgE og anti-DNA antistoffer. Disse data antyder at de allo-reaktive T-celler er blitt indusert til å bli ikke-responsive som resultat av anti-gp39-behandling.

Påvisning av alloreaktive donorceller. Når cGVHD-induserte mus ble analysert for tilstedeværelse av donor-avledede celler i milten, ble det funnet at sammenlignet med normal BDF

j, som farver dobbelt positiv for H-2Kb og H-2Dd, hadde cGVHD ca. 5-7% donor-celler. Disse celler er DBA/2-avledet og farver derfor enkelt positivt for H-2Dd. Disse celler ble detektert uansett anti-gp39-behandling. Dette illustrerer det poeng at anti-gp39-behandling tillater innpoding av donorcellene uten å fremkalle noen av hjelpefunksjonene for mottakerens B-celler som resulterer i polyklonal Ig-produksjon i den ubehandlede cGVHD-gruppe.

Effekt av anti-gp39-behandling på induksjon av akutt GVHD. Akutt GVHD har sammenheng med induksjon av øket anti-allogen CTL-respons. Selv om det er klart at gp39-CD40-interaksjoner er kritiske for Tn-B-celle-interaksjoner, er det ikke klart om induksjon av andre immune effektormekanismer også kan forandres ved anti-gp39-terapi. AGVHD ble indusert ved administrering av C57BL/6-milter til F j -mottakerne. Som vist i fig. 8 måles det 12 dager etter overføringen av allogene celler, en robust H-2 anti-H2 CTL-respons. Behandling av mus med anti-gp39, men ikke Hig, forhindret dannelsen av H-2b anti-H2<d> CTL (fig. 8). I ett av to eksperimenter ville behandling med anti-gp39 redusere CTL-responsene under den som ble observert med naturlige miltceller. Dette antydet at miltceller fra aGVHD-mus når de ble utfordret med. Dersom disse miltceller deretter blir dyrket i 7 dager i nærvær av bestrålte P815-celler og det deretter utføres et CTL-assay, unnlater disse celler å innlede en sekundær stimulering av P815-cellene, mens den normale BDF j-milt imidlertid setter opp en primær respons. De ubehandlede aGVHD-induserte mus innleder en sekundær immunrespons som ventet. Disse resultater viser at behandlingen av akutt GVHD-mus med anti-gp39 gjør CD8+-populasjonen ikke responsiv på en sekundær utfordring.

Diskusjon

Reversering av splenomegali (fig. 5), inhibering av hyper Ig-produksjon (fig. 6A og 6B), inhibering av serumnivå av IgE og anti-DNA autoantistoff-produksjon (fig. 7A og 7B) i GVH-induserte mus ved anti-gp39-administrering, antyder at anti-gp39 blokkerte de innpodede T-cellers evne til å indusere B-celleaktivering i verten. Denne inhibering av splenomegali og polyklonal IgGj og IgA-produksjon holder seg lav 7 dager etter avslutning av antistoffadministreringen.

Reduksjon i IgE og anti-DNA anti-stoffer holder seg i 8 uker selv når behandlingen er avsluttet. Disse resultater viser at T-cellefunksjonen er blitt påvirket enten ved klonal delesjon av de reaktive T-celler eller at det har forekommet T-celle-anergi. Det er tidligere blitt vist (Van den Eertwegh et al., (1993) J. Exp. Med. 178:1555-1565) at nivået av cytokin-produserende celler holder seg normalt i antistoff-behandlede mus i in situ-studier av immuniserte mus. Dette viser at T-celler ikke deleteres som en konsekvens av behandlingen. Når cGVHD-mus ble analysert for tilstedeværelse av donor-avledede celler, blir de funnet å være til stede enten dyret er ubehandlet eller behandlet med anti-gp39. Anti-gp39 har således evnen til å indusere en ikke-responsiv tilstand på disse donor T-celler, og fremkaller således inhibering av antistoffresponser. I virkeligheten, dersom milter fra disse dyr blir overført til naturlige mottakere, blir antistoffnivået hevet når donor-miltene er ubehandlede cGVHD, men anti-gp39-behandlede cGVHD-mus er ute av stand til å innlede en sekundær cGVHD-tilstand etter overføring. Disse data antyder at anti-gp39 interfererer med T-cellenes evne til å fremkalle en sterk GVHD klinisk immunopatologi og spleno-megali, og at antistoffadministreringen fremkaller manglende evne til respons på CD4<+->subpopulasjonen.

Det er blitt rapportert at B-celler er nødvendige for å skaffe hjelp for induksjon av CTL'er slik man kan se det ved å studere B-celle-manglende mus for induksjon av beskyttende T-celle-immunitet til en Friend murin leukemi virus-indusert leukemi (K.R. Schultz et al., (1990) Science 249). Det synes således mulig å forstå at anti-gp39 i en aGVHD-indusert mus vil inhibere aktiveringen av B-celler og således forhindre antigen-presentasjon og således prime CD8<+>T-cellene. Det er også blitt antydet at dannelse av CD8<+>CTL krevet interaksjon med klasse II-begrensede Th-celler (H. von Boehmer et al., (1979) J. Exp. Med. 150:1134;

J. Keene et al., (1982) J. Exp. Med. 155:768) og at når TCR-affiniteten er lav, er det nødvendig med CD4+-formidlet T-celle-hjelp in vivo (X. Gao et al., (1991) J. Immunol. 147:3268).

Det er blitt gjennomført studier som ser på rollen til CD28-B7/BB1-interaksjoner ved induksjon av CD8+CTL-responser. Det ble funnet at CD28-B7/BB1-interaksjoner var nødvendige og til-strekkelig for dannelsen av klasse 1 MHC-spesifikk CTL (F.A. Harding og J.P. Allison

(1993) J. Exp. Med. 177:1791). Det er blitt antydet at liganden for CD40 kan være en viktig induser for B7 (E.A. Ranheim og TJ. Kipps (1993) J. Exp. Med. 177:925) som vist ved studier som involverer inhibering av B7-ekspresjon på normale og leukemiske B-celler av antistoffer for CD40. Til sammen viser disse studier at anti-gp39 kan blokkere interaksjonen av CD4+ T-celler med B-celler, og således unngå å indusere ekspresjonen av B7 som tillater en B-celle effektivt å aktivere en T-celle til å formere seg og fremstille cytokiner. Til sammen antyder disse data at CD4+T-celler er nødvendige for induksjon av CTL-dannelse først ved T- B-cellenes kognate interaksjon mellom gp39 og liganden CD40. Signalisering av CD40 på B-cellene tillater deretter oppregulering av B7/BB1. Resiprok interaksjon av B7/BB1 med liganden CD28 på T-cellene vil deretter tillate øket T-celleformering og cytokinproduksjon. Dersom det imidlertid fremskaffes bare ett signal til T-cellene, d.v.s. gp39-interaksjon med CD40, og det andre signal ikke blir oppnådd, da induseres det en manglende responsevne i T-cellene og de blir toleriserte eller anergiserte.

Disse studier indikerer at når aGVHD induseres i mus, blir det oppnådd en anti-H-2d<->respons. Dersom dyrene imidlertid behandles med anti-gp39, da observeres ingen CTL-respons. Det kan være åpenbart at anti-gp39 vil inhibere CTL-dannelsen ved en tidligere beskrevet fremgangsmåte (K.R. Schultz et al., (1990) Science 249). B-cellene unnlater å bli aktivert via CD40-ligering, og er såldes ute av stand til å formidle induksjon av CTL'er. Dessuten viser våre studier at når miltceller blir utfordret in vitro med P815-celler, ble cellene som var eksponert for anti-gp39 in vivo, funnet ute av stand til å innlede en sekundær anti-H-2d CTL. Dette kan således indikere at anti-gp39 har indusert en tilstand av toleranse på T-celle-kompartmentet siden gp39 ikke er i stand til å engasjere CD40, det er således ingen B7/BB1 oppregulering og således vil T-cellene ikke bli ytterligere aktivert og forblir ikke-responsive. Det er også kjent at hvilende B-celler generelt er ineffektive stimulatorer av allogene T-celler i den blandede lymfocyttreaksjon dersom de ikke for-aktiveres av anti-IgM-antistoffer, PMA eller LPS (K. Inaba og R.M. Steinman

(1989) J. Exp. Med. 160:1717; J.P. Metley et al., (1989) J. Exp. Med. 169:239; M. Frohman og C. Cowing (1985) J. Immunol. 134:2269). Løselig monomert antigen rettet mot B-celler for presentasjon in vivo kan dessuten resultere i spesifikk T-celleanergi (E.E. Eynon og D. Parker

(1992) J. Exp. Med. 175:131). Det synes således åpenbart, avhengig av måten for administrering av antigen og involverte APCer, at det kan induseres anergi eller toleranse. Etter utfordring av P815-celler til CD8+T-celle-kompartmentet av milten, er B-celler ikke nødvendig for antigen presentasjon, og således kan alloantigen presenteres direkte og CTL induseres. Miltens manglende evne til respons på sekundær stimulering indikerer at allospesifikk toleranse er blitt indusert i systemet.

Dette i motsetning til tidligere resultater (T.M. Foy et al.,(1993) J. Exp. Med. 178:1567-1575) som indikerer at toleranse ikke blir indusert av antistoffet i et antigen-spesifikt system. De to systemer er forskjellige siden aGVHD-modellen presenterer alloantigen allerede bundet til antigen-presenterende celler, mens med antigen-spesifikke systemer antigenet administreres og tas opp in vivo, bearbeides og presenteres av profesjonelle APC. Det synes således at anti-gp39 kan ha forskjellige effekter avhengig av det antigen som anvendes og presentasjon av fremgangsmåten.

Det kan konkluderes at anti-gp39 kan indusere allospesifikk toleranse i både CD4+ og CD8+ kompartmentene av det immune system, og dette kan åpenbart være gunstig terapeutisk intervensjon med hensyn på transplantatimmunologi og immunterapi. Det er for-ståelig at for behandling av pasienter som undergår benmarg-transplantasjon at anti-gp39-terapi vil være tilstrekkelig for induksjon av toleranse til transplantatet og forebygge induksjon av slike konsekvenser av transplantat-behandlingene som GVHD.

Eksempel 6: Fremstilling og karakterisering av anti-gp39-

antistoffer

Eksperiment 1 - Antistoffer rettet mot humant gp39

For induksjon av antigen-spesifikk T-celletoleranse i et humant individ blir det foretrukket å administrere et antistoff rettet mot humant gp39. Følgende metodologi ble anvendt til å fremstille mus anti-humane gp3 9-monoklonale antistoffer. Balb/c-mus ble immunisert med et løselig gp39 fusjonsprotein, gp39-CD8, i komplett Freund's adjuvans (CFA). Musene ble deretter utfordret 6 uker senere med løselig gp39-CD8 i ikke-fullstendig Freund's adjuvans (TPA). Løselig gp39-CD8 ble gitt i løselig form 4 uker etter sekundær immunisering. Musene ble deretter boostet med aktiverte humant perifert blod lymfocytter 2 uker senere, etter-fulgt av en endelig boost med løselig gp39-CD8 etter ytterligere 2 uker. Splenocytter ble fusjonert med NS-l-fusjonspartneren på dag 4 etter endelig immunisering ifølge standard protokoller.

Kloner som frembringer anti-humane gp39-antistoffer ble utvalgt basert på en sammensatt screeningsfremgangsmåte. Kloner ble først screenet ved en platébindings-assay ved anvendelse av gp39-CD8. Positive kloner ble deretter screenet mot et kontroll CD8 fusjonsprotein, CD72-CD8. Kloner som scoret positive på CD8-CD72 platebindingsanalysen ble eliminert. De gjenværende kloner ble deretter screenet på hvilende og 6 timer aktivert humant perifert blod lymfocytter (PBL) ved flowcytometrisk analyse. Hybridomceller som farvet aktivert, men ikke hvilende, PBL ble betraktet som positive. Til slutt ble de gjenværende kloner testet for sin evne til å blokkere bindingen av CD40Ig til platebundet gp39.

Ca. 300 kloner ble til å begynne med screenet mot gp39-CD8 og CD72-CD8 i platebindingsanalysene. Av disse kloner ble 30 funnet å detektere platebundet gp39 og ikke CD8. Disse kloner ble deretter screenet for deteksjon av gp39 på akti-verte humane PBL. Ca. 15 kloner detekterte et molekyl på aktivert PBL, men ikke på hvilende celler. Spesifisitet ble ytterligere bekreftet ved å bestemme klonenes kapasitet til å blokkere CD40Ig-deteksjon av plate-bundet gp39. 3 av 10 kloner testet blokk CD40Ig-binding i denne assay. Disse kloner var 3E4,2H5 og 2H8. Slike kloner foretrekkes for anvendelse i fremgangsmåtene beskrevet her. Kloner som testet positive på aktiverte, men ikke hvilende PBL, ble også screenet for reaktivitet med en aktivert rotte T-celle-klon, POMC8. Klonen 2H8 uttrykte kryssreaktivitet med denne rotte T-cellelinje.

Eksperiment 2 - Antistoffer rettet mot humant gp39

En lignende irnmuniseringsfremgangsmåte som den beskrevet i eksperiment 1 ble anvendt til å fremstille ytterligere antistoffer rettet mot humant gp39. Én Balb/c-mus ble injisert med løselig gp39-CD8 i CF A, etterfulgt av utfordring med 6 timer aktiverte humant perifert blod lymfocytter 4 uker senere. Musen ble der-etter boostet med løselig gp39-CD8 4 dager før fusjon av spleno-cytter med NS-l-fusjonspartneren ifølge standard protokoller. Screening av hybridomakloner ble gjenomført ved flow-cytometrisk farving av 6 timer aktiverte humane PBL'er. Kloner som farvet aktiverte men ikke hvilende humane PBL'er, ble selektert. 6 kloner, 4D9-8,4D9-9,24-31,24-43, 89-76 og 89-79, ble utvalgt for videre analyse.

Spesifisiteten av de utvalgte antistoffer ble bekreftet ved flere analyser. Først viste flow-cytometrisk analyse at alle 6 mAb'er farvet aktiverte, men ikke hvilende perifert blod T-celler (se fig. 9B og 9C for et representativt eksempel, som viser farving av aktiverte T-celler med henholdsvis 4D9-8 og 4D9-9). Ekspresjon av molekylet gjenkjent av hvert av de 6 antistoffer er detekterbart i løpet av 4 timer etter aktivering, er maksimal mellom 6 og 8 timer etter aktivering, og er ikke-detekterbart 24 timer etter aktivering. Alle 6 mAb'er gjenkjenner et molekyl uttrykt på

aktiverte CD3<+>PBL'er, overveiende av CD4<+->fenotype, men en del av CD8<+>T-cellene uttrykker også molekylet. Ekspresjon av molekylet gjenkjent av de 6 mAb'er blir inhibert ved tilstedeværelsen av cyklosporin A i kulturmediet, og likeså ekspresjonen av gp39 (se fig. 10A og 10B for et representativt eksempel, som viser farving av cyklosporin-behandlede T-celler med henholdsvis 4D9-8 og 4D9-9). Kinetikken og fordelingen av ekspresjonen av molekylet gjenkjent av disse

mAb'er er identisk med den for gp39, som detektert av fusjonsproteinet av humant CD40Ig. Alle 6 mAb'er blokkerer dessuten farvingen av gp39 med CD40Ig (se fig. 1 IA og 1 IB for et representativt eksempel som viser inhibering av gp39-farving med CD40Ig i nærvær av henholdsvis 4D9-8 og 4D9-9). I en ELISA-assay vil alle 6 mAb'er gjenkjenne gp39-CD8, en løselig fusjonsform av gp39-molekylet. Dessuten vil alle 6 mAb'er immun-utfelle et molekyl på

it

ca. 36 kd fra J S-metionin-merkede aktiverte humane PBL'er. Det immun-utfelte molekyl er identisk med det som utfelles av det humane CD40Ig fusjonsprotein.

Den funksjonelle aktivitet av de 6 utvalgte mAVer (4D9-8,4D9-9,24-32,24-43, 89,76 og 89-79) ble analysert som følger. Først målte man evnen til mAb'er til å inhibere formeringen av rensede humane B-celler dyrket med IL-4 og løselig gp39. Rensede humane B-celler ble dyrket med gp39 og IL-4 i nærvær eller fråvær av rensede monoklonale antistoffer eller CD40Ig ved doseringer mellom 0 og 12,5 jug/ml. B-celleformering ble bestemt etter 3 dager i kultur ved thymidin-inkorporering. Resultatene (vist i fig. 12) demonstrerer at alle 6 mAb'er kan inhibere B-celle-formering indusert av gp39 og EL-4. mAb'er 89-76 og 24-31 var mest effektive til å inhibere den induserte B-celleformering. IC^Q-verdien (konsentrasjonen av antistoff nødvendig for å

inhibere B-celle-formeringen med 50%) var ca. 1 fig/ ml for 89-76 og ca. 1,25 /ig/ml for 24-31.

Deretter undersøkte man evnen til mAb til å inhibere B-celle-differensiering, som målt ved Ig-produksjon indusert av anti-CD3 aktiverte T-celler og IL-2. Rensede IgD<+> humane B-celler ble fremstilt ved positiv seleksjon med FACS og deretter dyrket med anti-CD3-aktiverte humane T-celler (mitomycin C-behandlede) og IL-2 i 6 dager i nærvær eller fråvær av rensede anti-gp39 monoklonale antistoffer ved doseringer mellom 0 og 10 pg/ml. IgM, IgG og IgA produksjon ble bestemt ved ELISA på dag 6. Resultatene (vist nedenfor i tabell 3) demonstrerer at alle 6 antistoffer kan inhibere T-celle-avhengig B-celle-differensiering som målt ved IgM, IgG og IgA-produksjon. IC^-verdien (konsentrasjon av antistoff som er nødvendig for å inhibere Ig-produksjon med 50%) var i området 1,0 ug/ ml til under 0,1 /ig/ml for de 6 mAVer, innbefattet 24-31 og 89-76 antistoffene.

For å undersøke effekten av anti-gp39 mAb på T-celle-responser ble mAb'ene inkludert i standard blandede lymfocytt-reaksjoner (MLR). 300000 humane perifert blod lymfocytter (respondere = R) ble dyrket med 100000 bestrålte allogene perifert blod lymfocytter (stimulatorer = S) i nærvær eller fravær av anti-gp39 mAb'er (10 /ig/ml). Kulturene ble pulset med 3H-thymidin på dag 4, 5 eller 6 og høstet 18 timer senere. Alle 6 anti-humane gp39 mAb'er inhiberte allo-spesifikke responser som målt ved MLR (se fig. 13 for et representativt eksempel som viser inhibering av allo-spesifikke responser når R og S inkuberes i nærvær av 24-31 eller 89-76; et CTLA4-immunglobulin-fusjonsprotein og et anti-CD28 mAb ble anvendt som positive kontroller).

For å bestemme hvorvidt de 6 mAVer gjenkjente bestemte epitoper på det humane gp39-molekyl ble det gjennomført kryssblokkings-eksperimenter. Aktiverte humane PBL'er ble først blokkert med hver av de 6 mAb'er (25 /tg/ml ukonjugert antistoff). Cellene ble vasket og deretter farvet med 10 jLtg/ml av biotin-konjugert antistoff, etterfulgt av reaksjon med phyto-erytrin-konjugert avidin (PE-Av). Farvingen av cellene med PE-Av ble analysert ved FACS. Resultatene er vist nedenfor i tabell 4.

Alle antistoffer blokkerte bindingen av CD40Ig til aktiverte humane PBL'er. Disse data vist i tabell 4 demonstrerer imidlertid klart at noen antistoffer mislykkes i å blokkere bindingen av andre antistoffer til aktiverte humane PBL'er, hvilket antyder at de gjenkjenner bestemte epitoper på de humane gp39-molekyler.

89-76 og 24-31 hybridomacellene, som produserer henholdsvis 89-76 og 24-31 antistoffene, ble deponert under bestemmelsene i Budapestavtalen hos the American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md, 2. september 1994. 89-76 hybridomacellen ble gitt ATCC adgangsnummerHB 11713 og 24-31 hybridomacellen ble gitt ATCC adgangsnummer HB 11712. 24-31 og 89-76 antistoffene er av IgGl-isotypen.

Eksperiment 3 - Antistoffer rettet mot mus gp39

Her skal gp39-antagonisten være et anti-mus gp39 monoklonalt antistoff, MR1. Følgende frem-gangsmåte ble anvendt til fremstilling av MR1 monoklonalt anti-stoff, og kan anvendes til å lage andre antistoffer rettet mot gp39.

Hamstere ble immunisert intraperitonealt med 5-10^ aktiverte Tnl-celler (dl .6) med ukentlige mellomrom i 6 uker. Nfir serum-titeren mot murin Tfll var høyere enn ca. 1:10000, ble det gjennom-ført cellefusjoner med polyetylenglykol under anvendelse av immune hamster-splenocytter og NS-1. Supematant fra brønner inne-holdende voksende hybridomaceller ble screenet ved tlowcytometri på hvilende og aktivert Tnl. Én spesiell hybridoma som produserte et Mab som selektivt gjenkjente aktivert Th ble ytterligere testet og subklonet for å avlede MR1. MR1 ble produsert i ascites og renset ved ionebytter HPLC. En hybridoma MR1 er blitt deponert hos the American Type Culture Collection og tilordnet adgangs-nummer HB11048.

Ekvivalenter

Fagfolk på dette område vil anerkjenne, eller være i stand til å finne ut ved anvendelse av ikke mer enn rutineeksperimenter, mange ekvivalenter til de spesifikke utførelser av oppfinnelsen beskrevet her.

Claims (57)

1. Anvendelse av a) en celle som presenterer antigen til en T-celle og har CD40 på dets overflate; og b) en gp39 antagonist for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å indusere antigen-spesifikk T-celle toleranse.

2. Anvendelse av a) en celle som presenterer antigen til en T-celle og har CD40 på dets overflate; b) et antigen assosiert med cellen som presenterer antigenet for en T celle; og c) en gp39 antagonist for fremstilling av et farmasøytisk preparat for å indusere antigen-spesifikk T-celle toleranse.

3. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 eller 2, hvori gp39 antagonisten er et anti-gp39-antistoff eller et gp39-bindende fragment derav eller en oppløselig form av en gp39 ligand.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvori anti-gp39-antistoffet er et anti-humant gp39-antistoff.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvori anti-gp39-antistoffet er et monoklonalt antistoff.

6. Anvendelse ifølge krav 5, hvori anti-gp39-antistoffet er monoklonalt antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712.

7. Anvendelse ifølge krav 5, hvori anti-gp39-antistoffet er monoklonalt antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

8. Anvendelse ifølge krav 5, hvori anti-gp39-antistoffet er et kimært monoklonalt antistoff.

9. Anvendelse ifølge krav 5, hvori anti-gp39-antistoffet er et humanisert monoklonalt antistoff.

10. Anvendelse ifølge krav 3, hvori gp39 antagonisten er en løselig form av CD40.

11. Anvendelse ifølge krav 10, hvori gp39 antagonisten er valgt fra oppløselig CD40 og et CD40 fusjonsprotein.

12. Anvendelse ifølge krav 3, hvori cellen er en lymfoid celle.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvori den lymfoide celle er en B-celle.

14. Anvendelse ifølge krav 13, hvori B-cellen er en B-celle.

15. Anvendelse ifølge krav 13, hvori cellen er en allogen B-celle.

16. Anvendelse ifølge krav 13, hvori B-cellen bringes i kontakt med antigen før den kommer i kontakt med T-cellen.

17. Anvendelse ifølge krav 3, hvori antigenet er et protein.

18. Anvendelse ifølge krav 17, hvori antigenet er et autoantigen.

19. Anvendelse ifølge krav 17, hvori antigenet er et allo-antigen.

20. Anvendelse ifølge krav 3, hvori antigenet er et allergen.

21. Anvendelse ifølge krav 3, hvori gp39 antagonisten er et gp39-bindende fragment av et anti-gp39 antistoff.

22. Anvendelse ifølge krav 21, hvori det gp39-bindende fragmentet er valgt fra gruppen bestående av Fab, F(ab')2 og Fv.

23. Anvendelse ifølge krav 21, hvori det gp39-bindende fragmentet omfatter lett og tungkjedevariable regioner av antistoffet 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller antistoffet 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

24. Anvendelse ifølge krav 21, hvori det gp39-bindende fragmentet omfatter lette og tungkjede hypervariable regioner av antistoffet 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller antistoffet 89-76, med deponeringsnr. ATCC 11713.

25. Anvendelse ifølge krav 8, hvori anti-gp39 antistoffet er et kimært monoklonalt antistoff omfattende lette og tunkjedevariable regioner av antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

26. Anvendelse ifølge krav 9, hvori anti-gp39 antistoffet er et humanisert monoklonalt antistoff som omfatter lette og tungkjede hypervariable regioner av antistoffet 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller antistoffet 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

27. Anvendelse ifølge krav 11, hvori CD40 fusjonsproteinet er CD40Ig.

28. Anvendelse ifølge krav 12, hvori den antigen-presenterende cellen er en profesjonell antigen-presenterende celle.

29. Anvendelse ifølge krav 28, hvori den antigen-presenterende cellen er en monocytt, en dendrittisk celle eller en Langerhans celle.

30. Anvendelse ifølge krav 29, hvori den antigen-presenterende cellen er valgt fra gruppen bestående av kerantinocytter, endotelial celler, astrocytter, oligodendrocytter og fibroblaster

31. Anvendelse av en gp39 antagonist som inhiberer interaksjonen av gp39 med CD40 for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for indusering av antigen-spesifikk T-celletoleranse in vivo i et individ eksponert for et slikt antigen.

32. Anvendelse av en gp39 antagonist for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for indusering av antigen-spesifikk T-celletoleranse i et individ, hvori gp39 antagonisten inhiberer interaksjonen av gp39 på en T-celleoverflate med CD40 på overflaten av en celle som presenterer antigen for en T-celle og medierer kontakt-avhengig hjelpeeffektor funksjon.

33. Anvendelse ifølge hvilket som helst av kravene 31 eller 32, hvori gp39 antagonisten er valgt fra gruppen bestående av anti-gp39 antistoffer; fragmenter av anti-gp39 antistoffer som bindes spesifikt til gp39; oppløselig CD40 og oppløselige CD40 fusjonsproteiner.

34. Anvendelse ifølge krav 33, hvori anti-gp39 antistoffet er et anti-humant gp39 antistoff.

35. Anvendelse ifølge krav 34, hvori anti-gp39 antistoffet er et monoklonalt antistoff.

36. Anvendelse ifølge krav 35, hvori anti-gp39 antistoffet er et monoklonalt antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712.

37. Anvendelse ifølge krav 35, hvori anti-gp39 antistoffet er monoklonalt antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

38. Anvendelse ifølge krav 35, hvori anti-gp39 antistoffet er kimært mononoklonalt antistoff.

39. Anvendelse ifølge krav 38, hvori anti-gp39 antistoffet er et kimært monoklonalt antistoff omfattende lett og tungkjedevariable regioner av antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

40. Anvendelse ifølge krav 35, hvori anti-gp39 antistoffet er et humanisert monoklonalt antistoff.

41. Anvendelse ifølge krav 40, hvori anti-gp39 antistoffet er et humanisert monoklonalt antistoff som omfatter lett og tungkjedehypervariable regioner av antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

42. Anvendelse ifølge krav 33, hvori anti-gp39 antagonisten er et gp39-bindende fragment av et anti-gp39 antistoff.

43. Anvendelse ifølge krav 42, hvori gp39-bindende fragment er valgt fra gruppen bestående av Fab, F(ab')2,og Fv.

44. Anvendelse ifølge krav 42, hvori gp39-bindende fragment omfatter lett og tunkjedevariable regioner av antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

45. Anvendelse ifølge krav 42, hvori gp39-bindende fragment omfatter lett og tungkjedevariable regioner av antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

46. Anvendelse ifølge krav 33, hvori gp39 antagonisten er CD40 fusjonsprotein CD40Ig.

47. Anvendelse ifølge krav 33, hvori den antigen-presenterende cellen er en lymfoid celle.

48. Anvendelse ifølge krav 47, hvori den antigen-presenterende cellen er en B lymfocytt.

49. Anvendelse ifølge krav 33, hvori den antigen-presenterende cellen er en profesjonell antigen-presenterende celle.

50. Anvendelse ifølge krav 49, hvori den antigen-presenterende cellen er en monocytt, en dendrittisk celle eller en Langerhans celle.

51. Anvendelse ifølge krav 33, hvori den antigen-presenterende cellen er valgt fra gruppen bestående av keratinocytter, endotelisk celler, astrocytter, oligodendrocytter, og fibroblaster.

52. Anvendelse ifølge krav 33, hvori den antigen-presenterende cellen er i perifert blod.

53. Anvendelse ifølge krav 33, hvori den antigen-presenterende cellen er i alogen eller xenogen benmarg.

54. Anvendelse ifølge krav 33, hvori antigenet er et autoantigen.

55. Anvendelse ifølge krav 33, hvori antigenet er et alloantigen.

56. Anvendelse ifølge krav 33, hvori antigenet er et xenoantigen.

57. Anvendelse ifølge krav 33, hvori den farmasøytiske sammensetningen induserer antigen-spesifikk T-celletoleranse overfor allogen eller xenogen benmarg.