FI106306B - Menetelmä anti-GP39-vasta-aineiden valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä anti-GP39-vasta-aineiden valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI106306B FI106306B FI960978A FI960978A FI106306B FI 106306 B FI106306 B FI 106306B FI 960978 A FI960978 A FI 960978A FI 960978 A FI960978 A FI 960978A FI 106306 B FI106306 B FI 106306B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cell
- cells
- antigen
- antibody
- hybridoma
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 186
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims abstract description 133
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 claims abstract description 131
- 101000759376 Escherichia phage Mu Tail sheath protein Proteins 0.000 claims abstract description 129
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 33
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 28
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 230000001773 anti-convulsant effect Effects 0.000 claims 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 claims 1
- 229960003965 antiepileptics Drugs 0.000 claims 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 154
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 95
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 86
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 86
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 85
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 abstract description 52
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 abstract description 39
- 239000003446 ligand Substances 0.000 abstract description 33
- 239000012636 effector Substances 0.000 abstract description 28
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract description 27
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 abstract description 23
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 abstract description 20
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 abstract description 19
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 abstract description 17
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 abstract description 12
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 abstract description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 11
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 abstract description 10
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 7
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 80
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 51
- 230000004044 response Effects 0.000 description 50
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 47
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 36
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 28
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 28
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 28
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 28
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 25
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 21
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 21
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 19
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 18
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 17
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 11
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 101000866855 Homo sapiens Major histocompatibility complex class I-related gene protein Proteins 0.000 description 10
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 9
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 8
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 8
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 8
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 8
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 8
- 108010066813 Chitinase-3-Like Protein 1 Proteins 0.000 description 7
- 102000018704 Chitinase-3-Like Protein 1 Human genes 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000003172 anti-dna Effects 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 5
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 5
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 5
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 4
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 4
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 3
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 3
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 3
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 3
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 3
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710131437 Gene 39 protein Proteins 0.000 description 2
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 2
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 2
- 208000017760 chronic graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 201000006512 mast cell neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000006971 mastocytoma Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 102100025218 B-cell differentiation antigen CD72 Human genes 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010048396 Bone marrow transplant rejection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000023661 Haematological disease Diseases 0.000 description 1
- 101000934359 Homo sapiens B-cell differentiation antigen CD72 Proteins 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 235000002296 Ilex sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002294 Ilex volkensiana Nutrition 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100394237 Mus musculus Hand1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710126321 Pancreatic trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 230000010799 Receptor Interactions Effects 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 201000001322 T cell deficiency Diseases 0.000 description 1
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101710123661 Venom allergen 5 Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 208000024340 acute graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001668 ameliorated effect Effects 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000973 chemotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- -1 coatings Substances 0.000 description 1
- 229940125810 compound 20 Drugs 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009969 flowable effect Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- JAXFJECJQZDFJS-XHEPKHHKSA-N gtpl8555 Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)N[C@H](B1O[C@@]2(C)[C@H]3C[C@H](C3(C)C)C[C@H]2O1)CCC1=CC=C(F)C=C1 JAXFJECJQZDFJS-XHEPKHHKSA-N 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000044413 human MR1 Human genes 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000012442 inert solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001400 myeloablative effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- GGWBHVILAJZWKJ-KJEVSKRMSA-N ranitidine hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].[O-][N+](=O)\C=C(/NC)NCCSCC1=CC=C(CN(C)C)O1 GGWBHVILAJZWKJ-KJEVSKRMSA-N 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000003614 tolerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
106306
Menetelmä anti-GP39-vasta-aineiden valmistamiseksi Keksinnön tausta
Lepäävien T-solulymfosyyttien pinnalle täytyy saapua kaksi signaalia, jotka antaa 5 kaksi antigeenin tarjoavaa solua (APCs), jotta antigeenispesifmen T-soluaktivaatio ja kloonin laajeneminen saadaan aikaan (Jenkins, M. ja Schwartz, R. (1987) J. Exp. Med. 165, 302-319; Mueller, D. L, et ai. (1990) J. Immunol. 144, 3701-3709; Williams, I. R. ja Unanue, E. R. (1990) J. Immunol. 145, 85-93). T-solureseptorin (TCR) kautta välitetään ensimmäinen signaali, joka antaa immuunivasteelle spesifi-10 syyttä, minkä jälkeen suurimman histokompatibiliteettikompleksin (MHC) yhteydessä tarjottu, vieras antigeenipeptidi tunnistetaan. Yhteisstimulaatioksi nimitetty toinen signaali saa aikaan T-solujen jakaantumisen sekä sen, että niistä tulee toiminnallisia (Schwartz, R. H. (1990) Science 248, 1349-1356). Yhteisstimulaatio ei ole antigeenispesifmen eikä se rajoitu MHC:hen, ja arvellaan, että sen saa aikaan yksi 15 tai useampi erilainen solun pintamolekyyli, jota tai joita APC:t ilmentävät (Jenkins, M. K., et ai. (1988) J. Immunol. 140, 3324-3330; Linsley, P. S., et ai. (1991) J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, C. D. et ai. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 6575-6579; Young, J. W., et ai. (1992) J. Clin. Invest. 90, 229-237; Koulova, L., et ai. (1991) J. Exp. Med. 173, 759-762, Reiser, H., et ai. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. 20 USA. 89, 271-275; van-Seventer, G. A., et ai. (1990) J. Immunol. 144, 4579-4586; ·.·, LaSalle, J. M., et ai., (1991) J. Immunol. 147, 774-80; Dustin, M. I., et ai., (1989) J.
Exp. Med. 169, 503, Armitage, R. L, et ai. (1992) Nature 357, 80-82; Liu, Y., et ai. (1992) J. Exp. Med. 175, 437-445). Yhteen yhteisstimulaatiotiehen, joka kuuluu T-soluaktivaatioon, sisältyy T-solujen pinnalla sijaitseva molekyyli CD28. Tämä mo- • · ’···’ 25 lekyyli voi ottaa vastaan yhteistimulaatiosignaalin, jonka B-solujen tai muiden APC.iden pinnalla sijaitseva ligandi lähettää. Ligandit CD28:aa varten sisältävät B-; lymfosyyttiaktivaatioantigeenien B7-perheen jäseniä, kuten B7-linja (tai) B7-2:n (Freedman, A. S., et ai. (1987) J. Immunol. 137, 3260-3267; Freeman, G. J. et ai. - (1989) J. Immunol. 143, 2714-2722; Freeman, G. I, et ai. (1991) J. Exp. Med. 174, ·'**; 30 625-631; Freeman, G. J., et ai. (1993) Science 262, 909-911; Azuma, M., et ai., • . (1993) Nature 366, 76-79; Freeman, G. J. et ai. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185-
* * I
2192). B7-1 ja B7-2 ovat myös ligandeja toista molekyyliä CTLA4:ää varten, joka sijaitsee aktivoitujen T-solujen pinnalla, vaikka CTLA4:n rooli yhteisstimulaatiossa : on epäselvä.
• « 2 106306
Kun T-solulle annetaan antigeenille spesifinen signaali yhteisstimulaation signaalin kanssa, tämä tapahtuma johtaa T-solun aktivaatioon, johon voi sisältyä sekä T-solun uusien solujen tuotto, proliferaatio, että sytokiinin erittyminen. Sitä vastoin jos T-solu saa antigeenille spesifisen signaalin ilman yhteisstimulaation signaalia, ajatel-5 laan, että T-solussa indusoituu tällöin epäherkkyystila tai energian häviö, mikä saa aikaan mainitussa solussa antigeenille spesifisen toleranssin.
T-ja B-solujen väliset vuorovaikutukset esittävät keskeistä roolia immuunivasteissa. Humoraalisen immuniteetin induktio tyymuksesta riippuvaisia antigeenejä kohtaan tarvitsee "apua", jota T-auttajasolut (tässä yhteydessä myöhemmin nimitetty Th-10 soluiksi) antavat. Samalla kun Th-solujen vapauttamat liukoiset molekyylit (esim. lymfokiinit, kuten IL-4 ja IL-5) välittävät apua, jota annetaan B-lymfosyyteille, viimeksi mainittujen solujen aktivaatioon tarvitaan myös B- ja Th-solujen välistä vuorovaikutusta, jolle kosketus on välttämätöntä. Hirohata et ai., J. Immunol., 140, 3736-3744 (1988) ; Bartlett et ai., J. Immunol., 143, 1745-1754 (1989). Tämä ilmai-15 see, että B-solun aktivaatioon sisältyy välttämätön vuorovaikutus B- ja Th-solujen pintamolekyylien välillä. T-solun pinnan molekyylit välittävät siis kosketusta edellyttäviä T-solujen auttajaefektoritoimintoja. B- ja T-solujen välistä vuorovaikutusta, jonka edellytyksenä on kosketus, tukee havainto, jonka mukaan aktivoitujen T-solujen eristetyt plasmamembraanit voivat saada aikaan auttajatoimintoja, jotka ovat 20 välttämättömiä B-solun aktivaatiolle. Brian, Proc. Natl. Acad Sei. USA, 85, 564-568 (1988); Hodgkin et ai., J. Immunol., 145, 2025-2034 (1990); Noelle et ai., J. Immunol., 146, 1118-1124(1991).
• ·
Kypsymättömien ja kypsien B-solujen pinnalla on identifioitu molekyyli CD40, jo-ka saa aikaan B-solun proliferaation, kun vasta-aineet silloittavat sen. Valle et ai., 25 Eur. J. Immunol., 19, 1463-1467 (1989), Gordon et ai., J. Immunol., 140, 1425-. 1430 (1988); Gruber et ai., J. Immunol., 142, 4144-4152 (1989). CD40-molekyyli on kloonattuja luonnehdittu. Stamenkovic et ai., EMBO J., 8, 1403-1410 (1989).
* « · CD40:n ligandin gp39:n (nimitetty myös CD40-ligandiksi tai CD40L:ksi) molekyyli on myös kloonattuja luonnehdittu. Armitage et ai., Nature, 357, 80-82 (1992); Le-*··· 30 derman et ai., J. Exp. Med., 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et ai., EMBO J., 11, 4313-4319 (1992). Proteiini gp39 ilmentyy aktivoiduilla, mutta ei lepäävillä : CD4+-Th-soluilla. Spriggs et ai., J. Exp. Med., 176, 1543-1550 (1992); Lane et ai.,
Eur. J. Immunol., 22, 2573-2578 (1992), Roy et ai., J. Immunol., 151, 1-14 (1993). , \ Sellaiset solut, jotka on transfektoitu geenillä gp39 ja jotka ilmentävät pinnallaan · 35 gp39-proteiinia, voivat laukaista B-solun proliferaation ja yhdessä muiden stimu- 3 106306 loivien signaalien kanssa saada aikaan vasta-aineen tuoton. Armitage et ai., Nature, 357, 80-82 (1992); Hollenbaugh et ai., EMBOI, 11, 4313-4319 (1992).
Keksinnön yhteenveto
Solun pinnan molekyylit, jotka välittävät T-solujen auttajaefektorifunktioita, joiden 5 edellytyksenä on kontakti, ovat tärkeitä, jotta sellaiset immuunivasteet indusoituvat, jotka vaativat T-solun apua. T-solujen pinnalla sijaitsevien gp39-4:ien vuorovaikutus B-solujen pinnan CD40:ien kanssa esittää keskeistä roolia, kun B-soluvasteet aktivoituvat antigeenejä kohtaan. Esillä oleva keksintö perustuu ainakin osittain havaintoon, että myös sellaiset solun pinnan molekyylit, jotka välittävät kontaktia 10 edellyttäviä auttajaefektorifunktioita, esittävät kriittistä osaa T-solujen vasteessa antigeenejä kohtaan. On havaittu erityisesti, että sopivissa olosuhteissa sellaisen vuorovaikutuksen häirintä, joka vallitsee T-solun pinnalla sijaitsevan gp39:n ja sellaisen solun pinnalla sijaitsevan ligandin välillä, joka tarjoaa antigeenin T-solulle, voi saada aikaan antigeenispesifisen T-solutoleranssin. Niinpä sellainen solu, joka tarjoaa 15 antigeenin T-solulle, vaatii vuorovaikutusta solun pinnalla sijaitsevan gp39-ligandin (esim. CD40:n) ja T-solun pinnalla sijaitsevan gp39:n välillä, jotta saadaan aikaan signaaleja, jotka ovat välttämättömiä T-solun aktivaatiolle. gp39-ligandin ja gp39:n välisen vuorovaikutuksen inhibointi estää T-soluaktivoinnin ja saa aikaan pikemminkin antigeenispesifisen T-solutoleranssin.
20 Esillä oleva keksintö on yhteydessä antigeenispesifisen T-solutoleranssin indukti-. . oon. Menetelmiin sisältyy T-solun kontakti 1) sellaisen solun kanssa, joka tarjoaa T- ' solulle antigeenin ja jonka solun pinnalla on ligandi, joka on vuorovaikutuksessa T- solun pinnalla sijaitsevan sellaisen reseptorin kanssa, joka välittää auttajaefektori- • * · '•' J" funktioita, sekä 2) sellaisen T-solun pinnan reseptorin antagonistin kanssa, joka vä- 25 liitää auttajaefektorifunktioita, joiden edellytyksenä on kontakti. Antagonisti inhiboi reseptorin vuorovaikutuksen tämän ligandin kanssa. T-solu voi olla kosketuksissa ·.·* ·’ solun kanssa, joka tarjoaa antigeenin, ja antagonistin kanssa in vitro, tai vaihtoehtoi sesti soluja antagonisti voidaan antaa kohteelle T-solutoleranssin saamiseksi aikaan * ;***. in vivo.
• · · • · · 30 Edullisesti gp39 on reseptori sellaisen T-solun pinnalla, joka välittää auttajaefektori-·,{*: funktioita, joiden edellytyksenä on kontakti. Tässä sovellusmuodossa antagonisti on molekyyli, joka inhiboi gp39:n vuorovaikutuksen tämän ligandin kanssa sellaisen . \ solun pinnalla, joka tarjoaa T-solulle antigeenin. Erityisen edullinen gp39-antago- *** ‘ nisti on anti-gp39-vasta-aine. gp39-antagonisti on vaihtoehtoisesti gp39-ligandin 35 liukoinen muoto, esim. CD40. Sellainen solu, joka T-solulle tarjoaa antigeenin, on 4 106306 mieluummin B-solu. Viimeksi mainittu solu voi olla pieni, lepäävä B-solu. T-solu-toleranssin indusoimiseksi liukoista antigeeniä kohtaan B-solu voi olla kosketuksissa antigeenin kanssa, ennenkuin se on kosketuksissa T-solun kanssa (esim. ennen kohteelle antoa). Toisessa sovellusmuodossa T-solutoleranssin indusoimiseksi alloanti-5 geenejä kohtaan sellainen solu, joka tavallisesti tarjoaa T-solulle antigeenin, on allo-geeninen solu. Allogeeninen solu voi olla esim. allogeeninen B-solu, allogeeninen luuydinsolu, tai sellaisina soluina voi olla allogeenisiä pernasoluja tai ääreisverenkierron allogeenisiä soluja.
Esillä olevan keksinnön vasta-aineita voidaan käyttää esim. T-solutoleranssin ai-10 kaansaamiseksi liukoista antigeeniä, luuydinsiirrännäistä tai muita elinsiirrännäisiä kohtaan tai inhiboitaessa luuydinsiirroksen käänteishyljintää. Luuydinsiirrosten tapauksessa siirretyt luuydinsolut itse toimivat soluina, jotka tarjoavat T-soluille antigeenin. Niinpä Iuuydinsiirrännäisen hyväksymistä edistää se, että kohteelle annetaan allogeenistä luuydintä yhdessä gp39-antagonistin (esim. anti-gp39-vasta-aineen) 15 kanssa.
Tämä keksintö koskee anti-humaani-gp39-monoklonaalisia vasta-aineita, jotka pystyvät inhiboimaan B-solun proliferation, erilaistumisen sekä T-soluvasteet, sekä farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät tällaisia vasta-aineita. Keksinnön mukaisesti saadut anti-humaani-gp39-monoklonaaliset vasta-aineet ovat edullisia mo-20 duloitaessa immuunivasteita yleisesti ja erityisesti indusoitaessa antigeenispesifistä T-solutoleranssia. Edullisiin vasta-aineisiin kuuluvat monoklonaaliset vasta-aineet 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 ja 89-79, joita kuvataan esi- « · :·. merkissä 6. Monoklonaaliset vasta-aineet 89-76 ja 24-31 ovat erityisen edullisia.
. : ·. Hybridoomat 89-76 sekä 24-31, jotka tuottavat vastaavasti vasta-aineita 89-76 ja 24- • · · 25 31, talletettiin sellaisten säädösten mukaisesti, jotka on esitetty Budapestin sopi- muksessa, kokoelmaan the American Type Culture Collection, Parklawn Drive, • · ♦ III' Rockville, Md., syyskuun toisena päivänä vuonna 1994. Hybridoomalle 89-76 an nettiin ATCC-tulonumero HB 11713 ja hybridooma 24-31 sai ATCC-tulonumeron HB 11712. Vasta-aineet 24-31 ja 89-76 ovat IgGl-isotyyppiä.
• · « • » • · ·«· . ···. 30 Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
•«« « * : Niinpä keksintö saa aikaan monoklonaalisen anti-humaani-gp39-vasta-aineen (mAb), joka on IgGl-isotyyppiä. Keksinnön mukainen anti-humaani-gp39-mAb voi . inhiboida B-solun proliferation normaalissa in vitro -määrityksessä, esim. sellaisen • · · ; B-solun proliferation, joka on saatu aikaan käsittelemällä B-soluja interleukiini- 35 4:llä ja gp39:llä. Antihumaani-gp39-vasta-aine inhiboi B-solun proliferation, siten 5 106306 että IC50:n arvo (se on pitoisuus, joka on välttämätön solun jakaantumisen inhiboi-miseksi 50 %:lla), oli noin 0,01-5,0 pg/ml, mieluummin noin 0,1-2,5 pg/ml ja vielä mieluummin noin 0,1-1,25 pg/ml. Keksinnön mukaiset anti-humaani-gp39-mAb:t voivat inhiboida myös IgGrn, IgM:n ja (tai) IgA:n tuoton normaalissa in vitro -mää-5 rityksessä, esim. sellaisen IgG-tuoton, joka on indusoitu viljelemällä B-soluja aktivoitujen T-solujen kanssa (esim. T-solujen kanssa, jotka on aktivoitu käsittelemällä niitä anti-CD3-vasta-aineella). Anti-humaani-gp39-vasta-aine inhiboi mieluummin IgGrn, IgMrn ja (tai) IgArn B-solutuoton, siten että IC50 on noin 0,01-1,0 pg/ml tai mieluummin noin 0,01-0,1 pg/ml.
10 Edullisessa sovellusmuodossa keksinnön mukaisesti saatu anti-humaani-gp39-mAb sitoo epitoopin, jonka tunnistaa monoklonaalinen vasta-aine, joka valitaan 3E4:n, 2H5:n, 2H8:n, 4D9-8:n, 4D9-9:n, 24-31:n, 24-43:n, 89-76:n ja 89-79:n muodostamasta ryhmästä. Anti-humaani-gp39-mAb sitoo mieluummin epitoopin, jonka monoklonaalinen vasta-aine 24-31 tai 89-76 tunnistaa. mAbrn kyky sitoa epitooppi, 15 jonka jokin edellä mainituista vasta-aineista tunnistaa, voidaan määrittää normaalein ristikilpailumäärityksin. Esim. sellainen vasta-aine, joka sitoo saman epitoopin, jonka mAb 24-31 tunnistaa, kilpailee leimatun 24-3 l:n sitoutumisesta aktivoituihin T-soluihin, kun taas sellainen vasta-aine, joka sitoo eri epitoopin kuin sen, jonka mAb 24-31 tunnistaa, ei tule kilpailemaan leimatun 24-31 :n sitoutumisesta aktivoituihin 20 T-soluihin.
• · • ·
Keksintö antaa käyttöön keksinnön mukaisesti saatujen anti-humaani-gp39-vasta- • · • aineiden farmaseuttisia koostumuksia. Nämä koostumukset sisältävät tyypillisesti v : anti-humaani-gp39-mAb:tä (esim. mieluummin 24-3 lrtä tai 89-76:ta) sekä farma- • · · :... · seuttisesti hyväksyttävää kantaja-ainetta.
• · • · » 25 Vielä eräs näkökohta koskee nukleiinihappoa, joka koodittaa anti-humaani-gp39- • · · mAbrtä (esim. DNArta, joka koodittaa immunoglobuliinin anti-humaani-gp39- ... mAbrn raskasta tai kevyttä ketjua tai niiden osaa). Tällainen nukleiinihappo voidaan « * eristää normaalitekniikoin solusta (esim. hybridoomasta), joka tuottaa anti-humaani- • · . ···’ gp39:ää, Esim. 24-31- tai 89-76-mAb:tä koodittava nukleiinihappo voidaan eristää ·:··; 30 vastaavasti 24-31- tai 89-76-hybridoomasta cDNA-kirjastoseulonnalla, PCR-ampli- . fikaatiolla tai muulla standarditekniikalla. Anti-humaani-gp39-mAb-ketjua kooditta- vaa nukleiinihappoa voidaan manipuloida normaalein yhdistelmä-DNA-tekniikoin, « · · jotta tuotetaan yhdistelmä-anti-humaani-gp39-mAb:ita, esim. kimeerisiä tai ihmis- « ' · · ·' käyttöön sopivaksi tehtyjä anti-humaani-gp3 9-mAb:itä.
6 106306
Ennen kaikkea voidaan sellainen nukleiinihappo, joka koodittaa anti-humaani-gp39-mAb:tä, sisällyttää ilmentymisvektoriin ja viedä se isäntäsoluun, jotta helpotetaan anti-humaani-gp39-vasta-aineiden rekombinanttimuotojen ilmentymistä ja valmistusta.
5 Kuvioiden lyhyt kuvaus
Kuvio 1 esittää graafisesta sellaista T-solutoleranssia proteiiniantigeenia kohtaan, joka on saatu aikaan anti-gp39-käsittelyllä in vivo. T-soluvasteet mitattiin in vitro, sen jälkeen kun "haaste" oli tehty sellaisella antigeenillä, jota aiemmin annettiin in vivo, antigeenisykäyksen saaneilla B-soluilla joko anti-gp39-vasta-aineen kanssa 10 tai ilman sitä.
Kuvio 2 esittää graafisesti sellaista T-solutoleranssia allogeenisiä B-soluja kohtaan, joka on saatu aikaan in vivo anti-gp39-käsittelyllä. T-soluvasteet mitattiin in vitro, sen jälkeen kun "haaste" oli tehty allogeenisillä B-soluilla, joita aiemmin annettiin in vivo, joko anti-gp39-vasta-aineen kanssa tai ilman sitä.
15 Kuvio 3A esittää graafisesti sellaisten primaaristen allogeenisten CTL-vasteiden inhibitiota, jotka indusoitiin allogeenisillä B-soluilla, kun vastaanottajaeläimiä käsitellään anti-gp3 9-vasta-aineella. Kyseessä olleet ryhmät ovat käsittelemättömät hiiret (), anti-gp39:llä käsitellyt hiiret (Δ) ja pernasolut, jotka ovat peräisin Balb/c-hiiriltä (·); käytettiin negatiivisina kontrolliefektorisoluina).
.V: 20 Kuviot 3B ja 3C esittävät graafisesti sellaisten primaaristen allogeenisten CTL-, vasteiden inhibitiota, joita LPS:IIä käsitellyt B-solublastit indusoivat, kun vastaanot- • tajaeläimiä käsitellään anti-gp39-vasta-aineella. Kuviot B ja C esittävät kahta itse- .···. näistä koetta. Edustetut ryhmät ovat LPS-blastit in vivo ilman käsittelyä ( ► ), anti- • · ”1' gp39:llä käsitellyt LPS-blastit in vivo anti-gp-39-käsittelyn kanssa (·), lepäävät B- **.1 25 solut in vivo ilman käsittelyä (o) sekä lepäävät B-solut in vivo anti-gp39-käsittelyn kanssa (□).
Kuvio 4A esittää graafisesti sellaisten sekundaaristen, allogeenisten CTL-vasteiden • m .·1·. inhibitiota, jotka on indusoitu allogeenisillä B-soluilla, kun vastaanottajaeläimiä • 11 , ·_ käsitellään anti-gp39-vasta-aineella. Esitetyt efektoriryhmät ovat seuraavat: HIg:llä • « | : 30 käsitellyt vastaanottajat (·), luonnolliset Balb/c:t ( ►) sekä anti-gp39:llä käsitellyt vastaanottajat (). Vastaava syngeeninen vaste (Balb/c-solut, joita on stimuloitu i Balb/c-soluilla) esitetään avoimin symbolein.
· · · · 1 · · • « 7 106306
Kuvio 4B esittää graafisesti allogeenisten CTL-vasteiden inhibition spesifisyyttä, kun käsitellään anti-gp39:llä. Kuviossa esitetään CTL-vasteet H-2k-kohteita vastaan luonnollisilla Balb/c-soluilla (o) tai sellaisilla soluilla, joille on saatu aikaan toleranssi H-2b:a kohtaan, siten että niille on annettu H-2b-haplotyypin B-soluja sekä 5 anti-gp39:ää ().
Kuvio 5 on on pylväsdiagrammi, joka esittää splenosyyttien lukumäärää isännässä, joka on saanut luuydinsiirrosta, eri ajankohtana isännälle toimitetun luuydinsiirrok-sen jälkeen, joka on tehty anti-gp39-vasta-aineen kanssa tai ilman sitä.
Kuvio 6A esittää graafisesti sellaisen IgA:n pitoisuutta, joka on tuotettu in vitro per-10 nan B-soluilla, jotka on otettu hiirestä, jolle on tehty luuydinsiirros joko anti-gp39-käsittelyn kanssa tai ilman sitä. Pernan B-solut poistettiin ja vasta-aineen tuotto mitattiin joko seitsemän tai neljäntoista päivän jälkeen luuydinsiirrosta.
Kuvio 6B esittää graafisesti sellaisen IgGl:n pitoisuutta, joka on tuotettu pernan B-soluilla in vitro, sen jälkeen kun ne on poistettu hiiristä, jotka saivat in vivo luu-15 ydinsiirroksen joko yhdessä anti-gp39-käsittelyn kanssa tai ilman sitä. Pernan B-solut poistettiin ja vasta-aineen tuotto mitattiin joko seitsemän tai 14 päivän jälkeen luuydinsiirroksesta.
Kuvio 7A esittää graafisesti seerumin IgE-pitoisuutta eri ajankohtina luuydinsiirrok-sen jälkeen hiirillä, jotka saivat luuydinsiirroksen joko anti-gp39-käsittelyn kanssa 20 tai ilman sitä. Kuvio 7B esittää graafisesti anti-DNA-vasta-aineen pitoisuuksia eri ajankohtina luuydinsiirroksen jälkeen hiirillä, jotka saivat luuydinsiirroksen joko : * · anti-gp39:n kanssa in vivo tai ilman sitä.
««·
• · I
• · · • _ .···. Kuviot 8A ja 8B esittävät graafisesti sellaisten sytotoksisten T-solujen sytolyyttistä aktiivisuutta in vitro, jotka on saatu hiiriltä, joille on toimitettu luuydinsiirros joko • · « t25 anti-gp39-käsittelyn kanssa in vivo tai ilman sitä, siten että on käytetty erilaisia ** * efektorin ja kohdesolun välisiä suhteita (E:T-suhde). Osakuviot A ja B edustavat kahta itsenäistä koetta. Kuviot 9A, 9B ja 9C ovat virtaussytometrituloksia siluettiku- vina, jotka kuvaavat ihmisen perifeerisen veren kuusi tuntia aktivoitujen lymfosyyt- tien värjäystä joko CD40Ig:llä (osakuvio A), mAb-4D9-8:lla (osakuvio B) tai mAb- : 30 4D9-9:llä (osakuvio C).
• · · · * * ’··' Kuviot 10A, 10B ja 10C ovat virtaussytometrituloksia siluettikuvina, jotka kuvaavat : ihmisen perifeerisen veren kuusi tuntia aktivoituja lymfosyyttejä, joita on viljelty «:··: syklosporiini A:n läsnäollessa ja jotka on värjätty joko mAb-4D98:lla (osakuvio A), mAb-4D9-9:llä (osakuvio B) tai CD40Ig:llä (osakuvio C).
8 106306
Kuviot 1 IA ja 1 IB ovat virtaussytometrituloksia siluettikuvina, jotka kuvaavat ihmisen perifeerisen veren kuusi tuntia aktivoitujen lymfosyyttien värjäystä CD40Ig:IIä leimaamattoman mAb-4D9-8:n (osakuvio A) tai leimaamattoman mAb-4D9-9:n (osakuvio B) läsnäollessa.
5 Kuvio 12 esittää graafisesti humaani B-solun sellaisen proliferaation inhibitiota, joka on indusoitu liukoisella gp39:llä ja IL-4:llä, kun soluja viljellään anti-humaani-gp39-mAb:iden 4D9-8:n, 4D9-9:n, 24-3 l:n, 24-43:n 89-76:n tai 89-79:n läsnäollessa.
Kuvio 13 esittää graafisesta allospesifistä seoslymfosyyttivastetta, kun soluja viljel-10 lään anti-humaani-gp39-mAb:iden 24-31 :n tai 89-79:n läsnäollessa.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tässä hakemuksessa esitetään menetelmiä antigeenispesifisen T-solutoleranssin indusointia varten. Menetelmiin sisältyy se, että T-solu saatetaan kosketuksiin 1) solun kanssa, joka tarjoaa T-solulle antigeenin ja jolla on pinnallaan ligandi, joka on 15 vuorovaikutuksessa T-solun pinnan sellaisen reseptorin kanssa, joka välittää auttaja-efektorifunktioita, joiden edellytyksenä on kosketus, ja 2) T-solun pinnalla sijaitsevan sellaisen reseptorin antagonistin kanssa, joka inhiboi reseptorin ja ligandin välisen vuorovaikutuksen. Tässä dokumentissa määriteltynä molekyyli tai reseptori, joka välittää kontaktia edellyttävät auttajaefektorifunktiot, on sellainen molekyyli tai . , 20 reseptori, joka ilmentyy Th-solun pinnalla ja joka on vuorovaikutuksessa ligandin • < j;'·' kanssa, joka sijaitsee efektorisolun pinnalla (esim. B-solun), jolloin reseptorin vuo- • | • ' ‘ rovaikutus ligandinsa kanssa on välttämätön efektorisoluvasteen (esim. B-solun ak- « 4 « V 1 tivaation) tuottamiseksi. Sen lisäksi, että tällainen molekyyli sisältyy efektorisolu- 1·« vasteisiin, on osoitettu, että tällainen molekyyli sisältyy T-solun vasteeseen antigee- : 25 niä kohtaan.
• · · 141 t « · • 4 | ’ T-solun pinnalla edullinen molekyyli on gp39, joka välittää kosketusta edellyttävän ... auttajaefektoritoiminnan. Niinpä edullisissa sovellusmuodoissa menetelmiin sisältyy • · '···' T-solun kosketus sellaisen solun kanssa, joka tarjoaa antigeenin ja gp39-antago- nistin. Näin ollen sellainen 12 solu, jota käytetään tarjoamaan antigeeni, on solu, jo- j 30 ka on vuorovaikutuksessa T-solun pinnalla sijaitsevan gp39:n kanssa, jotta T-solu « « · · aktivoituu (se on, luovuttaa välttämättömät signaalit T-solun aktivaatiota varten T- • « « . . solulle). Solu voi olla esim. B-solu, joka ilmentää CD40:tä ja luovuttaa antigeenin · : T-solulle. Kun inhiboidaan vuorovaikutus, joka vallitsee antigeenin tarjoavan solun pinnalla sijaitsevan gp39-ligandin ja T-solun pinnan gp39:n kanssa, T-solua ei akti- 9 106306 voida tarjotulla antigeenillä, vaan pikemminkin T-solu saadaan sietämään antigeeniä.
Hakemuksessa kuvattuja menetelmiä voidaan käyttää indusoimaan T-solutoleranssi antigeeniä kohtaan in vivo. Esim. sellainen solu, joka tarjoaa antigeenin T-soluIle, 5 voidaan antaa kohteelle yhdessä sellaisen reseptorin antagonistin kanssa, joka ilmentyy sellaisen T-solun pinnalla, joka välittää kosketusta edellyttävän auttajaefektori-toiminnan (esim. gp39-antagonisti). Menetelmiä voidaan käyttää edelleen, jotta saadaan aikaan T-solun sieto antigeeniä kohtaan in vitro, siten että T-solu saatetaan kosketuksiin in vitro solun kanssa, joka T-solulle tarjoaa antigeenin, yhdessä sellai-10 sen T-solun pinnalla ilmentyvän reseptorin antagonistin kanssa, joka välittää kontaktia edellyttävän auttajaefektoritoiminnan (esim. gp39-antagonistin kanssa). Sellaiset T-solut, jotka on saatu sietämään antigeeniä in vitro, voidaan sitten antaa kohteelle. Menetelmiä voidaan käyttää siihen, että kohteessa T-solu saadaan sietämään spesifistä antigeeniä tai siirrettyjä soluja, kuten esim. allogeenistä luuydintä 15 (esim. luuydinsiirrossa). Keksinnön vasta-aineet ovat myös käyttökelpoisia, kun inhiboidaan käänteishyljintää luuydinsiirron yhteydessä.
Keksinnön erilaisia näkökohtia kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavassa.
I gp39-antagonisti
Kuvattujen menetelmien mukaan gp39-antagonisti on kosketuksissa T-solun kanssa 20 (esim. annettu kohteelle), jotta häiritään T-solun pinnalla sijaitsevan gp39:n vuoro-' ·'.' vaikutusta gp39-ligandin kanssa antigeenin tarjoavan solun, kuten B-solun, pinnalla.
: gp39-antagonisti määritellään vasta-aineeksi, joka häiritsee tätä vuorovaikutusta.
« i a v : gp39-antagonisti voi olla vasta-aine, joka kohdistuu gp39:ään (esim. monoklonaali- ·****: nen vasta-aine gp39:ää vastaan), gp39:ään kohdistuvan vasta-aineen fragmentti : 25 (esim. Fab tai F(ab)' 2-fragmentit, kimeeriset tai ihmiskäyttöön sopiviksi tehdyt • · · vasta-aineet), gp39:n liukoiset muodot (esim. liukoinen CD40), gp39-ligandin fuu- « sioproteiinin liukoiset muodot (esim. liukoinen CD40Ig) tai farmaseuttiset aineet, f.·. jotka katkaisevat gp39-CD40-vuorovaikutuksen tai häiritsevät sitä.
• i • « · • · « A, Vasta-aineet I 4 * < f : 30 Nisäkäs (esim. hiiri, hamsteri tai kani) voidaan immunisoida gp39-proteiinin immu- < '··' nogeenisellä muodolla tai proteiinifragmentilla (esim. peptidifragmentilla), joka tuo i esiin vasta-ainevasteen nisäkkäässä. Sellaista solua, joka ilmentää pinnallaan gp39:ää, voidaan myös käyttää immunogeeninä. Vaihtoehtoisiin immunogeeneihin kuuluu puhdistettu gp39-proteiini tai sen fragmentteja. gp39 voidaan puhdistaa 10 106306 gp39:ää ilmentävistä soluista normaalein puhdistustekniikoin; gp39:n CDNA (Armitage et ai., Nature, 357, 80 82 (1992); Lederman et ai., J. Exp. Med., 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et ai., Embo J. , 11, 4313-4319 (1992)) voi ilmentyä isäntäsolussa, esim. bakteeri- tai nisäkässolulinjassa, ja gp39-proteiini voidaan 5 puhdistaa soluviljelmästä standarditekniikoin. gp39-peptidit voidaan syntetisoida gp39:n aminohapposekvenssin perusteella (julkistettu julkaisussa Armitage et ai.,
Nature, 357, 80-82 (1992) Lederman et ai., J. Exp. Med., 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et ai., EMBO J., 11, 4313-4319 (1992)) tunnettuja tekniikoita käyttämällä (esim. F-moc- tai T-boc-kemiallista synteesiä). Sellaisiin tekniikoihin, jotka 10 antavat immunogeenisuuttä proteiinille, sisältyy konjugaatio kantaja-aineisiin tai muut tekniikat, jotka tekniikan tason mukaan ovat hyvin tunnettuja. Esim. proteiinia voidaan antaa adjuvantin läsnäollessa. Immunisaatiotapahtumaa voidaan valvoa siten, että ilmaistaan vasta-ainetiitterit plasmassa tai seerumissa, vasta-ainemäärien mittaamiseen voidaan käyttää normaaleja ELISA- tai muita immunologisia pitoi-15 suusmäärityksiä, joissa immunogeeni on antigeeninä.
Immunisaation jälkeen voidaan saada antiseerumeita, jos halutaan, ja polyklonaali- set vasta-aineet voidaan erottaa seerumeista. Immunisoidusta eläimestä voidaan koota vasta-ainetta tuottavia soluja (lymfosyyttejä) monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamista varten ja sulauttaa ne myeloomasolujen kanssa normaalein somaatti- 20 sen solun sulauttamismenetelmin, tappaa nämä solut tällä tavalla ja tuottaa hybri- doomasoluja. Tällaiset tekniikat ovat tekniikan tason mukaan hyvin tunnettuja. Niitä . V: ovat esim. hybridoomatekniikka, jonka Kohler ja Milstein ovat kehittäneet (Nature :'«,, (1975) 256, 495-497) samoin kuin muut tekniikat, kuten esim. humaani B-soluhybri- doomatekniikka (Kozbar et ai., Immunol. Today (1983) 4, 72), EBV-hybridooma- .···. 25 tekniikka monoklonaalisten humaanivasta-aineiden valmistamiseksi (Cole et ai., • · ,*"t Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) (Allen R. Bliss, Inc., sivut 77-96) • * · III sekä kombinaatiovasta-ainekirjastojen seulonta (Huse et ai., Science (1988) 246, ·' ’ 1275). Hybridoomasolut voidaan seuloa immunokemiallisesti sellaisten vasta-ainei den tuoton suhteen, jotka reagoivat spesifisesti proteiinin tai peptidin tai eristettyjen ’...' 30 monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa.
im ’ t · • t · . Termi vasta-aine tässä yhteydessä käytettynä on tarkoitettu sisältämään sellaiset
* I
; : vasta-aineiden fragmentit, jotka ovat spesifisesti reaktiokykyisiä gp39-proteiinin tai * f sen peptidin tai gp39-fuusioproteiinin kanssa. Vasta-aineet voidaan fragmentoida : tavallisia tekniikoita käyttämällä ja fragmentit voidaan seuloa käyttökelpoisuuden « ·« 35 suhteen samalla tavalla, kuin edellä kuvataan kokonaisten vasta-aineiden kohdalla.
u 106306
Esimerkiksi F(ab')2-£ragmentteja voidaan valmistaa siten, että vasta-ainetta käsitellään pepsiinillä. Saatua F(ab')2-fragmenttia voidaan käsitellä siten, että pelkistetään disulfidisillat, jotta saadaan aikaan Fab-fragmentteja. Esillä olevan keksinnön mukaiseen vasta-aineeseen on lisäksi tarkoitus sisällyttää bispesifiset ja kimeeriset 5 molekyylit, joissa on anti-gp39-osa.
Kun sellaisia vasta-aineita, jotka on valmistettu eläimissä, käytetään ihmisillä terapeuttisesti, ne tunnistetaan vaihtelevassa määrin vieraiksi, ja potilaassa voi muodostua immuunivaste. Eräs sellainen lähestymistapa tämän ongelman vähentämiseksi tai poistamiseksi, joka on parempi kuin yleinen immunosupressio, on valmistaa kimee-10 risiä vasta-ainejohdannaisia, se on, vasta-ainemolekyylejä, joissa yhdistyy eläinperäinen muuttuva alue ja ihmisperäinen vakioalue. Kimeeriset vasta-ainemolekyylit voivat sisältää esim. antigeeniä sitovan domeenin, joka on peräisin hiiren tai muiden lajien vasta-aineesta, sekä ihmisperäisen vakioalueen. Kimeeristen vasta-aineiden valmistamiseksi on kuvattu suuri määrä lähestymistapoja ja niitä voidaan käyttää 15 sellaisten kimeeristen vasta-aineiden valmistukseen, jotka sisältävät immunoglobu-liinin vaihtelevan alueen, joka tunnistaa gp39:n. Ks. esim. julkaisuja Morrison et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81, 6851 (1985); Takeda et ai., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et ai., US-patentti nro 4 816 567; Boss et ai., US-patentti 4 816 397; Tanaguchi et ai., EP-patenttijulkaisu 171496; EP-patenttijulkaisu 0 173 494, GB-pa-20 tentti 2 177 096 B. Otaksutaan, että tällaiset kimeeriset vasta-aineet olisivat ihmisellä vähemmän immunogeenisiä kuin vastaava ei-kimeerinen vasta-aine.
• · « » i i ;/ Spesifisesti gp39-proteiinin tai peptidin kanssa reaktiokykyiset monoklonaaliset tai • · · kimeeriset vasta-aineet voidaan tehdä ihmiskäyttöön sopiviksi terapeuttisia humaani-tarkoituksia varten siten, että valmistetaan ihmisperäisiä muuttuvan alueen kimee- * · ’···’ 25 rejä, joissa vaihtelevan alueen osia, erityisesti antigeeniä sitovan domeenin säilytetyt runkoalueet ovat peräisin ihmiseltä ja hypervariaabelit alueet ovat ei-ihmisperäisiä.
• · * ; Tällaisia muutettuja immunoglobuliinimolekyylejä voidaan valmistaa useilla teknii koilla, jotka tekniikan tason mukaan ovat tunnettuja (esim. Teng et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80, 7308-7312 (1983), Kozbor et ai., Immunology Today, 4, • ·’**; 30 7279 (1983); Olsson et ai., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982), ja mieluummin niitä
. valmistetaan sellaisten ohjeiden mukaan, jotka on esitetty PCT-julkaisussa WO
92/06193 tai EP-0 239 400. Ihmiselle sopiviksi tehdyt vasta-aineet voivat olla kau-pallisesti valmistettuja, esim. Scotgen Limitedin, 2 Holly Road, Twickenham, Mid- : dlesex, Iso-Britannia, valmistamia.
« 35 Toinen menetelmä tuottaa spesifisiä vasta-aineita tai vasta-ainefragmentteja, jotka ovat reaktiokykyisiä gp39-proteiinia tai peptidiä kohtaan, on seuloa ilmentymiskir- 106306 12 jastoja, jotka koodittavat immunoglobuliinigeenejä tai niiden osia, jotka ilmentyvät bakteereissa gp39-proteiinin tai -peptidin kanssa. Esim. täydellisiä Fab-fragmentte-ja, VH-alueita ja FV-alueita voidaan ilmentää bakteereissa faagi-ilmentymiskirjas-toja käyttämällä. Ks. esim. seuraavista julkaisuista: Ward et ai., Nature, 341, 544-5 546 (1989); Huse et ai., Science, 246, 1275-1281 (1989); ja McCafferty et ai., Natu re, 348, 552-554 (1990). Tällaisten kirjastojen seulonta esim. gp39-peptidillä voi identifioida immunoglobuliinifragmentteja, jotka pystyvät reagoimaan gp39:n kanssa. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää SCID-hu-hiirtä (saatavissa Genpharmilta) vasta-aineiden tai niiden fragmenttien valmistukseen.
10 gp39:n vastaisten, humaani gp39 ja hiiren gp39 mukaan luettuina, sekä keksinnön menetelmissä käyttökelpoisten monoklonaalisten vasta-aineiden valmistusmenetelmiä kuvataan yksityiskohtaisemmin esimerkissä 6. Erityisen edullisia keksinnön an-ti-humaani-gp39-vasta-aineita ovat mab:t 24-31 ja 89-76, joita hybridoomat 24-31 ja 89-76 vastaavasti tuottavat. Hybridoomat 89-76 ja 24-31, jotka tuottavat vastaa-15 vasti 89-76 ja 24-31-vasta-aineita, talletettiin Budapestin sopimuksen säädöksen mukaan the American Type Culture Collectioniin, Parklawn Drive, Rockville, Md., syyskuun toisena päivänä 1994. Hybridoomalle 89-76 annettiin ATCC-tulonumero HB 11713 sekä hybridoomalle 24-31 ATCC-tulonumero HB 11712.
Yhdistelmä-anti-gp39-vasta-aineita, kuten kimeerisiä ja ihmiskäyttöön sopiviksi 20 tehtyjä vasta-aineita voidaan valmistaa manipuloimalla normaalien yhdistelmä-DNA-tekniikoiden mukaisesti nukleiinihappoa (esim DNA:ta), joka koodittaa anti- :·/ gp39-vasta-ainetta. Esillä olevan keksinnön toinen näkökohta koskee näin ollen • · · eristettyjä nukleiinihappomolekyylejä, jotka koodittavat immunoglobuliinin raskaita ja kevyitä ketjuja tai niiden osia, jota pystyvät reagoimaan gp39:n, erityisesti hu- • « 25 maani gp39:n kanssa. Immunoglobuliinia koodittava nukleiinihappo voi koodittaa immunoglobuliinin kevyen tai raskaan ketjun variaabelia aluetta kytketyn raskaan tai * * * : kevyen ketjun valtioalueen (tai sen osan) kanssa tai ilman sitä. Tällainen nukleiini happo voidaan eristää solusta (esim. hybridoomasta), joka valmistaa antihumaani-gp39-mAb:tä normaalein tekniikoin. Esim. 24-31- tai 89-76-mAb:tä koodittava nuk-30 leiinihappo voidaan eristää vastaavasti 24-31- tai 89-76-hybridoomasta cDNA-kir- • · « . jaston seulonnan avulla, PCR-amplifikaatiolla tai muulla standarditekniikalla. Ennen kaikkea anti-humaani-gp-39-mAb:ta koodittavan nukleiinihapon eristämisen ja sitä ’ ; ·' seuraavan mahdollisen manipulaation jälkeen voidaan mainittu nukleiinihappo sisäl- : lyttää ilmentymi s vektoriin ja viedä isäntäsoluun helpottamaan anti-humaani-gp-39- •: · - 35 vasta-aineiden yhdistelmämuotojen ilmentymistä ja tuottoa.
>3 106306 B. Liukoiset ligandit gp39:ää varten
Muut gp39-antagonistit, joita voidaan käyttää T-solutoleranssin indusointiin, ovat gp39-ligandin liukoisia muotoja. Monovalenttinen liukoinen ligandi gp39, kuten liukoinen CD40, voi sitoa gp39:n ja siten inhiboida gp39:n vuorovaikutuksen B-5 solujen pinnalla sijaitsevan CD40:n kanssa. Termi "liukoinen" ilmaisee, että ligandi ei ole liittynyt pysyvästi solumembraanin kanssa. Liukoinen gp39-ligandi voidaan valmistaa kemiallisen synteesin avulla tai mieluummin yhdistelmä-DNA-tekniikoil-la, esim. ilmentämällä ainoastaan ligandin solunulkoista domeenia (transmembraani-ja sytoplasmadomeenit puuttuvat). Edullinen liukoinen gp39-ligandi on liukoinen 10 CD40. Liukoinen gp39-ligandi voi olla vaihtoehtoisesti fuusioproteiinin muodossa.
Tällainen fuusioproteiini käsittää ainakin osan gp39-ligandia, joka on kiinnittynyt toiseen molekyyliin. CD40 voi ilmentyä esim. immunoglobuliinin (se on CD40Ig:n) kanssa. Eräässä sovellusmuodossa tuotetaan fuusioproteiini, joka sisältää CD40-molekyylin solunulkoisen domeeniosan aminohappotähteitä liitettyinä sellaisen sek-15 venssin aminohappotähteisiin, jotka vastaavat immunoglobuliinin raskaan ketjun sarana-, CH2-ja CH3-alueita, esim. Cxl:tä, jotta CD40Ig-fuusioproteiini muodostuu (ks. esim., Linsley et ai. (1991) J.Exp. Med. 1783, 721-730; Capon et ai. (1989) Nature 337, 525-531, ja Capon, US-patentti 5 116 964). Fuusioproteiini voidaan valmistaa kemiallisen synteesin avulla tai mieluummin yhdistelmä-DNA-tekniikoil-20 la, jotka perustuvat CD40:n cDNA:han (Stamenkovic et ai., EMBO I, 8, 1403-1410 (1989)).
• « • i « II Soluja antigeenispesifisen toleranssin indusointiin •«
I I
v : Esillä oleva keksintö perustuu ainakin osittain havaintoon, että kun T-solun anti- • · · geeninä on solu, joka sekä tarjoaa antigeenin sekä on vuorovaikutuksessa gp39:n L;\·· 25 kanssa, tuloksena on antigeenispesifmen T-solutoleranssi, kun antigeeni tarjotaan T- :T: solulle gp39:n antagonistin läsnäollessa. Sellaisiin soluihin, jotka pystyvät indusoi maan T-solutoleranssin tällä mekanismilla, sisältyy soluja, jotka tarjoavat T-solulle .···. antigeenin ja vaativat vuorovaikutusta ensiksi mainitun solun pinnalla sijaitsevan . .···. gp39-ligandin ja T-solun pinnalla sijaitsevan gp39:n välillä, jotta ne vapauttavat T- "* 30 solun aktivaatiolle välttämättömiä signaaleja T-solulle. Tämän vuorovaikutuksen • · i inhibitio estää T-solua aktivoitumasta tarjotulla antigeenillä, ja pikemminkin inhibi- tio indusoi antigeenispesifisen toleranssin T-solussa. T-solun aktivaation häirintä : gp39:n kautta voi estää yhteisesti stimuloivien molekyylien induktion antigeenin tarjoavan solun pinnalla (esim. B7-perheen molekyylit antigeenin tarjoavan solun, 35 kuten B-solun, pinnalla), niin että antigeenin tarjoava solu antaa vain antigeenisig-naalin yhteisstimuloivan signaalin puuttuessa ja indusoi täten toleranssin.
14 106306
Niinpä tässä kuvatuissa menetelmissä antigeenin tarjoava solu annetaan vastaanottavalle kohteelle. Ilmaisua "sellainen solu, joka tarjoaa antigeenin" ja "antigeenin tarjoava solu" käytetään tässä dokumentissa samaa merkitsevinä, ja niiden tarkoituksena on käsittää solut, jotka tarjoavat antigeenin vastaanottajan soluille, ja niihin kuu-5 luu B-lymfosyyttejä, "ammattimaisia" antigeenin tarjoavia soluja (esim. monosyytte-jä, dendriittisoluja, Langerhansin soluja) ja muita soluja, jotka tarjoavat antigeenin immuunisoluille (esim. keratinosyyttejä, endoteelisoluja, astrosyyttejä, fibroblasteja, oligodendrosyyttejä). On tämän lisäksi edullista, että antigeenin tarjoavalla solulla on vähennetty kapasiteetti stimuloida yhteisstimulaatiosignaalia vastaanottajan T-10 soluissa. Antigeenin tarjoavissa soluissa yhteisstimuloivat molekyylit, kuten proteiinien B7-perhe (esim. B7-1 ja B7-2) eivät ilmenny tai ne ilmentyvät vain vähän. Yhteisstimulaatiomolekyylien ilmentyminen mahdollisten antigeenin tarjoavien sellaisten solujen pinnalla, joita on määrä käyttää tässä kuvatussa menetelmässä, voidaan määrittää normaalein tekniikoin, esim. virtaussytometrillä siten, että käytetään 15 vasta-aineita, jotka kohdistuvat yhteisstimulaatiomolekyylejä vastaan.
T-solutoleranssin indusointiin edulliset antigeenin tarjoavat solut ovat lymfoidisolu-ja, esim. perifeerisen veren lymfosyyttejä tai pernasoluja. T-solutoleranssin indusointiin edullisia lymfoidisoluja ovat B-solut. Ne voidaan puhdistaa solujen seospo-pulaatioista (esim. muista solutyypeistä, joita on perifeerisessä veressä tai pernassa) 20 normaalein solunerottamistekniikoin. Kiinni tarttuvat solut voidaan poistaa esim. siten, että pernasoluja viljellään muovimaljoissa ja kootaan kiinnitarttumattomien
I
\v solujen populaatio. T-solut voidaan poistaa solujen seospopulaatiosta siten, että se- ospopulaatiota käsitellään anti-T-soluvasta-aineen (esim. anti-Thyl.l:n ja (tai) anti-Thyl.2:n) sekä komplementin seoksella. Eräässä sovellusmuodossa käytetään le-25 pääviä lymfoidisoluja, mieluummin lepääviä B-soluja, antigeenin tarjoavina soluina.
· ·
Lepäävät lymfoidisolut, kuten lepäävät B-solut, voidaan eristää tekniikan tason mu-kaisin menetelmin, esim. niiden pienen koon ja niiden tiheyden perusteella. Lepää- * · · viä lymfoidisoluja voidaan eristää esim. sentrifugaalisella lietteen vastavirtauutolla, ... kuten kuvataan H. P. Tonyn ja D. C. Parkerin julkaisussa (1985) J. Exp. Med. 161.
30 223-241.
• « · • · 9 99 9 ; Sellaisia soluja, joista puuttuu pienten, lepäävien lymfoidisolujen populaatio, voi- f · · daan saada lietteen sentrifugaatista vastavirtauuttamista käyttämällä ja kokoamalla ·;·’ jae tai jakeet 14-19 ml/minuutti, mieluummin 19 ml/minuutti (nopeudella (3200 ·.: j kierrosta minuutissa). Pienet, lepäävät lymfosyytit (esim. B-solut) voidaan eristää :··: 35 vaihtoehtoisesti jatkuvalla tiheysgadienttisentrifugoinnilla, esim. Ficoll-tai Percoll- gradienttia käyttämällä, ja pienten, lepäävien lymfosyyttien kerros voidaan saada is 106306 sentrifugoinnin jälkeen. Pienet lepäävät B-solut voidaan erottaa aktivoiduista B-soluista myös siten, että normaalein tekniikoin (esim. immunofluoresenssilla) määritetään yhteisstimulaatiomolekyylien, esim. B7-l:n ja (tai) B7-2:n, ilmentyminen aktivoitujen B-solujen pinnalla.
5 Antigeenin tarjoava solu, kuten B-solu, voidaan saattaa kosketuksiin antigeenin kanssa (esim. liukoisen proteiinin kanssa) ennen kuin se saatetaan kosketuksiin Τ'-solun kanssa (esim. ennen antoa kohteelle) ja sellaisen solun kanssa, jota käytettiin antamaan antigeeni T-solulle gp39-antagonistin läsnäollessa, jotta saatiin aikaan spesifinen T-solutoleranssi antigeenille (ks. esimerkki 1). Toleranssi alloantigeenejä 10 kohtaan voidaan saada aikaan vaihtoehtoisesti siten, että käytetään allogeenistä solua antigeenin antavana soluna (ks. esimerkit 2 ja 3). Allogeenisolu antaa allo-geeniproteiinin antigeenifragmentteja T-soluille. Eräässä sovellusmuodossa allo-geeninen solu on allogeeninen lymfoidisolu, kuten allogeeninen B-solu. Kohteen sietokykyä voidaan vaihtoehtoisesti lisätä perifeerisen veren soluilla (esim. perifee-15 risen veren lymfosyyteillä), perna- tai luuydinsoluilla. Luuydinsiirroksen tapauksessa luovuttajan luuytimen solut itse toimivat antigeenin tarjoavina soluina, jotka saatetaan kosketuksiin T-solujen kanssa (esim. annetaan kohteelle). Allogeenistä luuydintä voidaan näin ollen antaa yhdessä gp39-antagonistin kanssa, jotta vastaaotta-jassa saadaan aikaan toleranssi luuydintä kohtaan ja estetään käänteishyljintä (ks. 20 esimerkkejä 4 ja 5).
//. III Solujen ja gp-antagonistien anto • ·
I I
: " Antigeeni spesifinen T-solutoleranssi voidaan saada aikaan keksinnön mukaan siten, v : että kohteelle annetaan gp39-antagonistia yhdessä solun kanssa, joka tarjoaa T- • · · solulle antigeenin ja ilmentää ligandia, jolla on vuorovaikutuksia gp39:n kanssa T- 25 solun pinnalla. Edullisessa sovellusmuodossa antigeenin tarjoava soluja gp39-anta- gonisti annetaan samanaikaisesti. gp39-antagonistia voidaan antaa vaihtoehtoisesti ennen solujen antoa, esim. kun antagonisti on vastaaine, jolla on pitkä puoliintu- .··*. misaika. Siinä tapauksessa, että annettavat solut ovat luuydinsoluja, jolloin toivotaan . ,···, käänteishyljinnän inhibitiota, luuytimessä sijaitsevat luovuttajasolut voidaan tehdä 30 vastustuskykyisiksi, ennen kuin ne siirretään vastaanottajaisännälle, inkuboimalla i luovuttajan luuydintä B-solujen kanssa, jotka ovat peräisin isännästä, sekä gp39- \..: antagonistin kanssa in vitro. Gp39-käsittely voi jatkua in vivo luuydinsiirron aikana : ;·; tai sen jälkeen, jos on välttämätöntä. Sellaisissa kohteissa, joiden on määrä ottaa I...] vastaan luuydintä tai muuta elinsiirrännäistä, allogeeninen toleranssi siirrännäistä · 35 kohtaan voidaan saada aikaan kohteessa käsittelemällä kohdetta sellaisen hoito-ohjeen mukaan, joka saa aikaan allogeenisen toleranssin ennen elimen tai luuydinso- ie 106306 lujen siirtoa. Tämän esikäsittelyohjeen mukaan kohteelle voidaan antaa yhdessä gp39-antagonistin kanssa soluja, jotka ovat peräisin luovuttajasta. Luovuttajasta peräisin olevat solut voivat olla esim. B-soluja, koko perifeeristä verta tai sen jotain fraktiota (esim. perifeerisen veren lymfosyyttejä tai pieniä lepääviä lymfosyyttejä tai 5 B-soluja).
Antigeenin tarjoavien solujen (antagonistiin yhdistettynä) yhden annoksen annon on havaittu olevan riittävä indusoimaan T-solutoleranssi (ks. esimerkkejä). Annettujen, antigeenin tarjoavien solujen lukumäärä voi vaihdella käytetyn solutyypin, kudos-tai elinsiirrännäistyypin, vastaanottajan painon, yleisen tilan sekä muiden sellaisten 10 muuttujien mukaan, jotka ammattimies tuntee. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävä solujen sopiva määrä voidaan määrittää jollain tavanomaisilla menetelmillä, jotka ammattimies tuntee (esim. käyttämällä menetelmiä, joita esimerkeissä kuvataan). Soluja annetaan sellaisessa muodossa tai sellaista tietä, joka soveltuu toleranssin indusointiin vastaanottajassa. Soluja voidaan antaa fysiologisesti hyväksyt-15 tävässä liuoksessa, kuten esim. puskuroidussa keittosuolaliuoksessa tai sen kaltaisessa vehikkelissä. Solu annetaan mieluummin suonensisäisesti.
Keksinnön mukaista antagonistia annetaan kohteille farmaseuttiseen antoon in vivo biologisesti yhteensopivassa muodossa T-solutoleranssin aikaansaamiseksi. "Biologisesti yhteensopiva muoto m vivo -antoa varten" tarkoittaa annettavan antagonistin 20 sellaista muotoa, jossa proteiinin terapeuttiset vaikutukset ovat toksisia vaikutuksia \\ tärkeämmät. Termiin kohde tarkoitetaan sisällytettävän elävät organismit, joissa immuunivaste voidaan saada esiin, esim. nisäkkäät. Kohteiden esimerkkeihin kuulu- · · j... vat ihmiset, koirat, kissat, hiiret ja niiden transgeeniset lajit. gp39-antagonistia voi- I | | ’ L. daan antaa missä tahansa farmakologisessa muodossa, valinnaisesti farmaseuttisesta * « *··;* 25 hyväksyttävässä kantaja-aineessa. Antagonistin terapeuttisesti aktiivisen määrän ’··'·* anto määritellään sellaisena määränä, joka on tehokas sellaisina annoksina sellaisten v ; ajanjaksojen ajan, jotka ovat tarpeen halutun tuloksen saavuttamiseksi. Esim. gp39:n terapeuttisesti aktiivinen määrä voi vaihdella sellaisten tekijöiden mukaan, joita ovat sairauden vaihe, ikä, sukupuoli ja yksilön paino sekä antagonistin kyky tuoda halut- ·***: 30 tu vaste esiin yksilössä. Annosohje voidaan säätää siten, että saadaan aikaan optimi • · · . *. terapeuttinen vaste. Voidaan antaa esim. useita jaettuja annoksia päivittäin tai an- nosta voidaan vähentää suhteessa siihen, kuinka terapeuttisen tilanteen pakottava « · *···* tarve vaatii.
» · • · « > · « “ j Aktiivista yhdistettä (esim. antagonistia) voidaan antaa sopivalla tavalla, kuten in- 35 jektiona (ihonalaisesti, suonensisäisesti, jne.), suun kautta, sisäänhengityksen kautta, ihon läpi tai peräaukon kautta tapahtuvana antona. Aktiivinen yhdiste voidaan pääl- 17 106306 lystää antotien mukaisesti jollain materiaalilla, jotta yhdiste suojataan entsyymien, happojen tai muiden luonnonmukaisten, sellaisten olosuhteiden vaikutuksilta, jotka voivat inaktivoida yhdisteen. Suonensisäinen injektio on edullinen antotie.
gp39:n sellaista antoa varten, joka tapahtuu muuta tietä kuin parenteraalisesti, voi 5 olla tarpeellista päällystää antagonisti materiaalilla, joka estää inaktivaation, tai antaa se tällaisen materiaalin kanssa. Antagonisti voidaan antaa yksilölle sopivassa kantaja-aineessa tai ohenteessa, se voidaan antaa entsyymi-inhibiittoreiden kanssa tai sopivassa kantaja-aineessa kuten liposomeissa. Farmaseuttisesti hyväksyttäviin kantaja-aineisiin sisältyvät keittosuolaliuos ja puskureiden vesiliuokset. Entsyymi-10 inhibiittoreihin sisältyvät haiman trypsiini-inhibiittori, di-isopropyylifluorofosfaatti (DEP) ja trasyloli. Liposomeihin sisältyvät vesi-öljyssä-vedessä-emulsiot samoin kuin tavanomaiset liposomit (Strejan et ai., (1984) J. Neuroimmunol., 7, 27).
Aktiivinen yhdiste voidaan antaa myös parenteraalisesti tai intraperitoneaalisesti. Dispersiot voidaan valmistaa glyseroliin, nestemäisiin polyetyleeniglykoleihin ja 15 niiden seoksiin ja öljyihin. Nämä valmisteet voivat sisältää säilöntäainetta mikro-organismien kasvun estämiseksi tavanomaisissa varastointiolosuhteissa ja normaalissa käytössä.
Injektoitavat farmaseuttiset koostumukset sisältävät steriilejä vesiliuoksia (silloin kun ne ovat vesiliukoisia) tai dispersioita sekä steriileitä jauheita steriilien, injektoi- . . 20 tavien liuosten valmistamiseksi hetkessä. Kaikissa tapauksissa koostumuksen täytyy .: · olla steriili, ja sen täytyy olla juokseva siinä määrin, että se on helposti ruiskutetta- • « " vissa. Sen täytyy kestää valmistusolosuhteissa sekä varastoinnin aikana, ja se täytyy • I ( '·’ ' varjella mikro-organismien, kuten esim. bakteereiden ja sienien, aiheuttamatta • <« saastumiselta. Kantaja-aine voi olla liuotin tai dispersion väliaine, joka sisältää « 25 esim. vettä, etanolia, polyolia (esim. glyserolia, propyleeniglykolia ja nestemäistä :T: polyetyleeniglykolia yms.) sekä niiden sopivia seoksia. Sopiva juoksevuus voidaan pitää yllä esim. siten, että käytetään päällystettä, kuten lesitiiniä, dispersion tapauk- ;**·. sessa pidetään yllä sopivaa partikkelikokoa ja siten, että käytetään pinta-aktiiivisia ··· .···. aineita. Mikro-organismien toiminta voidaan estää erilaisin bakteerien- ja sienten- 30 vastaisin ainein, esim. parabeenin, klooributanolin, fenolin, askorbiinihapon yms.
* t t : avulla. Momssa tapauksissa on edullista sisällyttää koostumukseen isotonisia amei- ta, esim. sokereita, polyalkoholeja, kuten mannitolia, sorbitolia, natriumkloridia. j Injektoitavien koostumusten pidennetty absortio saadaan aikaan sisällyttämällä • M · ....: koostumukseen ainetta, joka viivyttää absorptiota, esim. alumiinimonosteraattia ja 35 gelatiinia.
18 106306
Steriilejä injektoitavia liuoksia voidaan valmistaa siten, että tarvittava määrä aktiivista yhdistettä (esim. gp39:n antagonistia) sisällytetään sopivaan liuottimeen yhden edellä mainitun ainesosan tai tarpeen mukaan niiden yhdistelmän kanssa, minkä jälkeen liuos (liuokset) steriloidaan suodattamalla. Dispersiot valmistetaan tavallisesti 5 siten, että aktiivinen yhdiste sisällytetään steriiliin vehikkeliin, joka sisältää dispersion perusväliaineen ja tarvittavia muita ainesosia, jotka valitaan edellä mainittujen joukosta. Kun on kyse steriileistä jauheista, joita käytetään steriilien injektoitavien liuosten valmistukseen, edullisia valmistustapoja ovat tyhjö- sekä jäädytyskuivaus, joilla saadaan jauhe, jossa on aktiivista ainesosaa (esim. antagonistia) sekä jotakin 10 haluttua, lisäksi tulevaa ainesosaa, joka on peräisin sen aiemmin steriiliksi suodatetusta liuoksesta.
Kun aktiivinen yhdiste suojataan sopivasti, kuten edellä kuvataan, proteiinia voidaan antaa suun kautta, esim. inertin liuottimen tai assimiloituvan, syötäväksi kelpaavan kantaja-aineen kanssa. "Farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja-aine" tässä yhteydes-15 sä käytettynä sisältää minkä tahansa liuottimen ja kaikki liuottimet, dispersion väliaineet, päällysteet, bakteerien- ja sienienvastaiset agenssit, isotoniset ja absorptiota viivyttävät aineet yms. Tällaisten väliaineiden ja agenssien käyttö farmaseuttisesti aktiivisia aineita varten on tekniikan tason mukaan hyvin tunnettua. Paitsi sikäli kuin jokin tavanomainen väliaine tai agenssi ei sovi yhteen aktiivisen yhdisteen 20 kanssa, sen käyttöä terapeuttisissa koostumuksissa on harkittava. Koostumuksiin voidaan sisällyttää täydentäviä, aktiivisia yhdisteitä.
• « • « • »
On erityisen edullista formuloida parenteraaliset koostumukset annosyksikön muo-,'·<·, toon, jotta anto helpottuu ja annostus yhdenmukaistuu. Tässä yhteydessä käytettynä • f < annosyksikkömuoto viittaa fysikaalisesti erillisiin yksiköihin, jotka on sovitettu yk-*··;* 25 sikköannostuksiksi hoidettavia nisäkäskohteita varten; kukin yksikkö sisältää aktiivi- I I ( '·;·* sen yhdisteen ennalta määrätyn määrän, jonka on laskettu saavan aikaan haluttu te- ν’ ; rapeuttinen vaikutus haluttuun farmaseuttiseen kantaja-aineeseen yhdistettynä.
Keksinnön mukaisten annosyksikkömuotojen spesifikaation määräävät (a) aktiivisen yhdisteen ainutlaatuiset ominaisuudet sekä tietty, saavutettava terapeuttinen efekti ·**’; 30 sekä (b) rajoitukset, jotka ovat yhdistelmävalmistuksen tekniikan tasolle luonteen- . \# omaisia, kun kysymyksessä on aktiivinen yhdiste yksilöiden herkkyyden hoitoon, ja < · « " ’, * spesifikaatio on niiden mukainen.
I · • _ : Sen lisäksi, että T-solujen toleranssimuodostus tapahtuu in vitro, keksintö käsittää T-solujen toleranssinmuodostuksen in vitro, esim. siten, että mainitut solut saatetaan 35 kosketuksiin antigeenin tarjoavan solun kanssa gp39-antagonistin länäollessa. T-solut voidaan saada esim. hoidettavalta kohteelta, niitä käsitellään toleranssin muo-
• I
dostusta varten in vitro siten, että niitä viljellään antigeenin tarjoavien solujen sekä antagonistin kanssa ja sitten ne annetaan kohteelle uudestaan.
19 106306 Tässä kuvattuja menetelmiä voidaan käyttää indusoitaessa T-solutoleranssi erilaisia antigeenejä kohtaan. T-solutoleranssi voidaan indusoida esim. liukoista antigeeniä 5 (liukoista proteiinia) kohtaan, kuten esimerkissä 1 kuvataan. T-soluja voidaan käsitellä toleranssin aikaansaamiseksi sellaisia antigeenejä kohtaan, jotka sisältyvät autoimmuunisairauksiin, tai sellaisiin häiriöihin, jotka liittyvät epänormaaleihin immuunivasteisiin. Eräässä sovellusmuodossa antigeeni on esim. autoantigeeni. Toisessa sovellusmuodossa antigeeni on allergeeni. T-soluja voidaan käsitellä tolerans-10 sin saavuttamiseksi vaihtoehtoisesti antigeenejä kohtaan, jotka ilmentyvät vieraiden solujen pinnalla (kuten kuvataan esimerkeissä 2-59), Niinpä vielä muissa sovellus-muodoissa antigeeni on alloantigeeni tai ksenoantigeeni. T-solutoleranssin induktiolla alloantigeenejä ja ksenoantigeenejä kohtaan on erityistä käyttöä elinsiirrossa, esim. inhiboitaessa luovuttajan siirrännäisen, esim. kudos-, elin- tai luuydinsiirrän-15 näisen, hyljintää, transplantaatin vastaanottajassa. Edellä esitettyjen menettelytapojen lisäksi luovuttajan T-solujen käsittely luuydinsiirrännäisessä toleranssin saavuttamiseksi on käyttökelpoinen tapa, kun inhiboidaan käänteishyljintää (ks. esim. esimerkkiä 5).
Keksintöä valaisevat vielä seuraavat esimerkit, joiden ei tulisi olla konstruoidut si- 20 ten, että ne rajoittavat keksintöä. Tässä patenttihakemuksessa mainittujen kaikkien ,y. viitteiden, patenttien ja julkaistujen patenttihakemusten sisällöt sisällytetään tähän • : *. dokumenttiin viitteinä.
# »
• < « t I I
v ’ Esimerkki 1: Antigeenispesifisen toleranssin indusointi • · · • ♦ • · ··· . Menetelmät · · • · 4 • · · v : 25 Hiiriä immunisoitiin KHL:llä käsitellyillä pernan B-lymfosyyteillä viiden päivän ajan. Primaarisen immunisaation aikana eläimiä käsiteltiin anti-gp-39-vasta-aineella \..i MR1 tai ne jätettiin käsittelemättä. Viiden päivän kuluttua immunisaation alusta hiirille annettiin paikallisesti (käpälään) "haaste" eli testiannos KHL:ää, joka oli täydellisessä Freundin adjuvantissa (CFA). Hiiret tapettiin viisi päivää myöhemmin, ' 30 tyhjentyvät lymfasolmukkeet poistettiin ja määritettiin in vitro T-solujen jakaantu- ’”** misvaste KHL:ää kohtaan.
« · • · « t t «
Ml I
» • · 106306 20
Tulokset
Eläimiä immunisoitiin aktivoiduilla B-lymfosyyteillä, joita oli käsitelty antigeenillä, ja sen jälkeen niille annettiin testiannos samaa antigeeniä, joka sai aikaan immuunivasteet immunisoivaa antigeeniä kohtaan. Vaste mitattiin antigeenispesifisten T-5 lymfosyyttien proliferaationa, joka esitetään kuviossa 1. Eläinten käsittely anti-gp39-vasta-aineella primaari-immunisaation aikana antaa tulokseksi sen, että anti-geenispesifisiltä T-lymfosyyteiltä puuttuu vaste, kun niitä käsitellään antigeenillä in vitro. Sellaisilla T-lymfosyyteillä, jotka saatiin anti-gp39-vasta-aineella käsitellyistä eläimistä, ilmeni vähentynyttä proliferaatiokykyä, kun niitä verrattiin T-10 lymfosyytteihin, jotka saatiin käsittelemättömien eläinten lymfasolmukkeista.
Esimerkki 2: T-soIutoleranssin induktio allogeenisiä soluja kohtaan
Menetelmät
Balb/c(H-2d)-hiiriä immunisoitiin allogeenisillä pernasoluilla, jotka saatiin DBA/2(H-2b)-hiiriltä. Eläimiä käsiteltiin anti-gp30-vasta-aineella MRl.llä viiden 15 päivän ajan immunisoinnin jälkeen tai ne jätettiin käsittelemättä. Eläimet tapettiin kuudentena päivänä ja niistä poistettiin pernat. Anti-gp39-vasta-aineella käsitellyistä tai käsittelemättömistä eläimistä saadut pernasolut viljeltiin tämän jälkeen in vitro ilman mitään kiihoketta tai säteilytettyjen DBA/2-pemasoIujen kanssa. Proliferaa- tiovaste tälle sekundaariselle allergeeniselle ärsykkeelle mitattiin kolmantena päivä- .':': 20 nä viljelyn alettua.
• «
Tulokset • « « • # «
Allogeenisillä pernan B-soluilla immunisoiduista eläimistä saaduissa T-lymfosyy- : teissä ilmeni voimakkaita proliferaatiovasteita, kun mainitut T-lymfosyytit viisi päi- • · · .vää myöhemmin saivat in vitro "haasteen", joka käsitti samoja B-soluja (kuvio 2). « 25 Allogeenisillä pernan B-soluilla immunisoiduista ja anti-gp39-vasta-aineella käsitel-lyistä hiiristä saatujen T-lymfosyyttien proliferaatiokyky kuitenkin on vähentynyt, • 9 kun viimeksi mainitut lymfosyytit myöhemmin saivat "haasteen" in vitro. Anti- ·;** gp39-vasta-aineella käsitellyillä hiirillä vaste "haastetta" kohtaan vähenee arviolta # · :. · · 50 prosenttia verrattuna hiiriin, jotka olivat kontrolleina.
• · « · * · • · · t · I I I • · · • ·
Esimerkki 3: Anti-gp39-käsittely häiritsee CTL-vasteiden kehittymistä allo- geenisiä B-soluja kohtaan 2I 106306 Tässä esimerkissä tutkittiin gp39:n roolia sytotoksisten T-solujen (CTL) tuotossa. Sen seikan määrittämiseksi, millainen gp39:n funktio on CTL:n kehityksessä, tut-5 kittiin anti-gp39-käsittelyn vaikutuksia allospesifisten CTL:ien tuottoon siten, että immunisoitiin allogeenisillä B-soluilla. Tutkittiin anti-gp-käsittelyn vaikutuksia sekä primaarisiin että sekundaarisiin CTL-vasteisiin.
Primaariset CTL-vasteet
Sen seikan tutkimiseksi, voiko anti-gp-39 estää allogeenisiä B-soluja tuomasta esiin 10 allospesifisiä CTL-vasteita in vivo, vastaanottajahiirille annettiin allogeenisiä B-soluja (pernasoluja, joista T-solut oli poistettu), anti-gp39:n kanssa tai ilman sitä. Balb/c-hiiriä (naaraspuolisia, kuuden - kahdeksan viikon ikäisiä, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) immunisoitiin C57BL/6:n (naaraspuolinen, kuuden - kahdeksan viikon ikäinen, Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) pernasoluilla (30-15 50xl06), joista T-solut oli poistettu anti-Thy 1.2:11a (askites, valmistettu ATCC- kloonista HO 13.4) ja käsittelemällä kaniinin komplementilla. Sitten näitä vastaanot-tajahiiriä käsiteltiin anti-gp39:llä viiden päivän ajan (250 mg vastaanottajaa kohti päivinä 0, 2 ja 4) tai ne jätettiin käsittelemättä. Viidentenä päivänä pernat poistettiin ja CTL-vasteet mitattiin siten, että käytettiin 4 tunnin mittaista kromin vapautumis-20 määritystä. Negatiivisina efektorisolukontrolleina käytettiin pernasoluja, jotka saa-tiin esikäsittelemättömistä Balb/c-hiiristä. Käytetyt kohdesolut olivat naaraspuolisia • * · · E-Kl (H-2b, T-solulymfooma, joka on peräisin C57BL/6-kannasta) sekä P815 (H-2d, : *: *: mastosytooma, joka on peräisin DBA/2j-kannasta). 5ICr:llä leimatut kohdesolut pestiin ja niitä siirrostettiin 1 x 104 solua kammiota kohti 96-kammioisille levyille ; ;·. 25 efektorisolujen kanssa siten, että efektoir.kohde-suhteet (E:T) olivat 100:1, 20:1 ja • · » 4:1. Levyjä sentrifugoitiin lyhytaikaisesti ja sitten niitä inkuboitiin 37 °C:ssa, vii- siprosenttisessa C02:ssa, neljän tunnin ajan. Levyjä sentrifugoitiin vielä kerran ja kustakin kammiosta koottiin 100 ml solutonta supematanttia gamma-säteilyn mitta- . ;;;* usta varten (LKB Clinigamma, Wallac Inc., Gaithesburg, MD). Spesifisen hajoami- • · ·; ·’ 30 sen prosenttimäärä mitattiin kaavan (a-b)/c mukaan, jossa kaavassa a = efektorisolu- : jen kanssa inkuboiduista kohdesoluista vapautunut iskujen lukumäärä minuutissa, b = yksinomaan viljelyalustan kanssa inkuboiduista kohdesoluista vapautunut isku- • · « . *. jen lukumäärä minuutissa (spontaani vapautuminen) ja c = kohdesoluista jäädytys- " ‘ j sulatuksella vapautunut iskujen lukumäärä minuutissa (arviolta 80 prosenttia sisälly- 35 tettyjen iskujen kokonaismäärästä minuutissa). Mikään tutkituista solunäytteistä ei hajottanut P815-kohteita. E-naaraspuolisia Kl-kohteita koskevia tuloksia kuvataan 22 106306 kuviossa 3A, jossa esitetyt ryhmät ovat seuraavat: käsittelemättömät hiiret (), anti-gp39:llä käsitellyt hiiret (Δ) sekä pernasolut, jotka on saatu esikäsittelemättömistä Balb/c-hiiristä (·; käytetty negatiivisin kontrolliefektorisoluina). Tulokset havainnollistavat, että sellaiset hiiret, jotka saivat anti-gp39:ää ja allogeenisiä soluja, eivät 5 tuottaneet primaari-CTL-vastetta in vivo vasteena allogeenisille B-soluille. Sitä vastoin anti-gp39:n puuttuessa allogeeniset B-solut herkistivät vastaanottajan allo-antigeeniä kohtaan ja indusoivat melkoisen CTL-vasteen.
Sen määrittämiseksi, voisiko anti-gp39 lisätä vain sellaisten B-solujen tolerogeenistä vaikutusta, joita ei oltu aktivoitu, käytettiin LPS:llä aktivoituja B-soluja CTL:n esi-10 käsittelyyn anti-gp39:n läsnäollessa sekä puuttuessa. Sellaiset B-solut, jotka olivat peräisin C57BL/6-hiiriltä, valmistettiin edellä kuvatulla tavalla ja niitä viljeltiin kahden päivän ajan siten, että lipopolysakkaridia (LPS; 50 mg/ml; Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) oli läsnä tai se puuttui. Solut koottiin ja niitä pestiin perusteellisesti ja ne injektoitiin Balb/c-vastaanottajahiirten vatsaonteloon. Vastaanottajahiiriä 15 joko käsiteltiin anti-gp39:llä päivinä 0, 2 ja 4, kuten edellä kuvataan, tai niitä ei käsitelty. Viidentenä päivänä pernat poistettiin ja CTL-vasteet määritettiin edellä kuvatulla tavalla. Kahden itsenäisen kokeen tulokset esitetään kuviossa 3B (ylimmässä ja alimmassa osakuviossa). Edustetut ryhmät olivat seuraavat: LPS-blastit in vivo ilman käsittelyä (>), LPS-blastit, joita oli käsitelty in vivo anti-gp39:llä (·), lepäävät 20 B-solut in vivo ilman käsittelyä (O) ja lepäävät B-solut, joita oli käsitelty in vivo anti-gp39:llä (□). Tulokset ilmaisevat, että anti-gp39-käsittely myös vähensi, vaikka . V: ei kokonaan, primaari-CTL-vastetta allogeenisille LPS-blasteille.
Sekundaariset CTL-vasteet • t t
« f I
:***: Anti-gp39:n ja allogeenisen B-solunannon CTL:n muodostumiseen kohdistuvan sy- : ;’j 25 säyksen tutkimiseksi sellaisia pernasoluja, jotka saatiin käsitellyistä ja käsittelemät- • · · tömistä hiiristä, stimuloitiin in vitro ja CTL-vasteiden piiri tutkittiin. Balb/c-hiiriä esikäsiteltiin in vivo C57BL/6:sta peräisin olevilla B-soluilla, kuten edellä kuvattiin.
Sellaiset pernasolut, jotka ovat peräisin eläimistä, joita oli käsitelty anti-gp39:llä se-• · / kä kontrollilla käytetyllä hamsterin Ig:llä (HIg:llä), poistettiin ja 5 x 10 solua vil- 30 jeltiin viiden päivän ajan ("reagoijat") pernan monien B-solukantojen kanssa (val- : mistettu anti-Thyl.2 + komplementtikäsittelyllä), joita oli käsitelty mitomysiinillä (2,5 mg/ml 37 °C:ssa, Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) siten, että stimulaattorei-. \ den määrä oli tällöin 5 x 106/ml. Stimulaattoriryhmiä olivat C57BL/6 (H-2b) sekä ' ‘ ! Balb/c (H-2d), joilla vastaavasti ilmeni sekundaarinen, allogeeninen vaste sekä pri- 35 maarinen, syngeeninen vaste. Stimuloija- ja reagoijasoluja viljeltiin juuri valmistetussa herkistämisväliaineessa RPMI-1640 (Bio Whittaker Walkersville, MD), jossa 106306 23 oli 1 x 105 M 2-merkaptoetanolia (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), 2 mM L-glutamiinia (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO), 500 U/ml penisilliiniä ja 5000 U/ml streptomysiiniä (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO). Viiden päivän kuluttua reagoijasolut koottiin ja kuolleet solut poistettiin, siten että ne sentrifugoitiin tiheys-5 gradientissa. Saatuja eläviä soluja käytettiin efektoreina CTL-määrityksessä edellä kuvatulla tavalla. Kohteisiin kuului E-naaraspuolinen K1 (H-2b, T-solulymfooma, joka on peräisin C57BL/6-kannasta) sekä P815 (H-2d, mastosytooma, joka on peräisin DBA/2J-kannasta). Tulokset esitetään kuviossa 4A. Allogeenisesti stimuloidut efektoriryhmät olivat seuraavat: HIg:llä käsitellyt vastaanottajat (·), luonnonmukai-10 set Balb/c (>) ja anti-gp39:llä käsitellyt vastaanottajat (). Vastaava syngeeninen vaste (Balb/c-solut, jotka on stimuloitu Balb/c-soluilla) ilmaistaan avoimin merkein. Kuten osattiin odottaa, hiirien immunisaatio in vivo allogeenisillä pernasoluilla, joista T-solut oli poistettu (H-2b), ilman anti-gp39-käsittelyä johti selvään sekundaariseen CTL-vasteeseen in vitro. Lisääntynyttä sekundaarista anti-H-2b-CTL-15 vastetta ei havaittu, jos hiirille annettiin anti-gp39:ää in vivo.
CTL-vasteiden anti-gp39:llä tapahtuvan inhibition spesifisyyden määrittämiseksi edellä kuvattuista pemaviljelmistä analysoitiin anti-H-2k:n allogeeniset vasteet (allo-geenisten vasteiden kolmas ryhmä) siten, että CTL-määrityksessä stimulaattoreina käytettiin pernan B10BR-(H-2k)-B-soluja ja kohteina käytettiin SL8:aa (H-2k:ta, 20 spontaania T-solulymfoomaa, joka oli peräisin AKR-kannasta). Tulokset esitetään kuviossa 4B. Esitetyt ryhmät ovat luonnonmukainen Balb/c (O) sekä anti-gp39:llä käsitellyt vastaanottajat (). Tulokset havainnollistavat, että anti-H-2b:lle spesifisten CTL-vasteiden inhibitio anti-gp39-käsittelyllä oli allospesifistä, koska H-2b:n sekä . ·: . anti-gp39:n anto eivät muuttaneet CTL-vastetta in vitro sivullista alloantigeeniä (H- .···. 25 2k) kohtaan.
• · ·
Kun näistä tuloksista tehdään yhteenveto, ne osoittavat, että anti-gp39 häiritsee ai- ··· : lospesifisten CTL-vasteiden (sekä primaaristen että sekundaaristen) kehittämistä.
Asiaankuuluvalle alloantigeenille spesifisiä CTL-prekursoreita on vielä läsnä anti- gp39:n läsnäollessa, koska sekundaarisessa viljelmässä in vitro voidaan havainnol- ·***; 30 listaa jonkin verran anti-H-2b-CTL-aktiivisuutta. Voidaan tehdä sellainen johtopää- . *. tös, että anti-gp39-käsittely vähensi sekundaarista vastetta in vitro siten, että se esti CTL:n vaikuttamalla CTL:n määrään tai vähentämällä sitä. Lepäävien B-solujen käyttö ei ole välttämätön tämän vasteen puuttumisen havainnollistamiselle, koska if: anti-gp39 huononsi myös allogeenista CTL-vastetta, jonka LPS-blastit indusoivat.
« • · 24 106306
Esimerkki 4: Hiiren allogeenisen luuytimen siirto indusoi stabiileja kimeerejä gp39:n vasta-aineella käsitellyissä vastaanottajissa
Monien sellaisten hematologisten häiriöiden hoitoon, joita ei voida parantaa kemo-terapeuttisilla menetelmillä, sisältyy allogeenisen luuytimen siirto. Tähän aggressii-5 viseen hoitoon sisältyy kemoterapia, jossa käytetään suuria myeloablatiivisia annoksia kytkettyinä allogeenisen luuytimen perfuusioon, mikä tekee mahdolliseksi hävittää täydellisesti klonogeeniset kasvainsolut.
On jo osoitettu, että kateenkorvan säteilyttäminen, kateenkorvan T-solujen poistaminen lisää stabiilien kimeerien esiintymistiheyttä, kun käytetään T-solujen vastai-10 siä monoklonaalisia vasta-aineita (MAB:itä), anti-CD-mAb:t mukaan luettuina. Tämä vasta-aineen anto-ohjelma johti T-solupuutokseen ja täten luovuttajaa kohtaan spesifiseen sietoon, joka voitiin osoittaa luovuttajan ihosiirrännäisten sietona. Pysyvän allogeenisen yhdistämisen epäonnistuminen 300 radin WBI-käsittelyn, anti-T-solu-mAb-käsittelyn in vivo ja allogeenisen luuytimen annon jälkeen voi olla tulok-15 sena siitä, että T-solut tyymuksen sisällä ovat muuttumattomina. Anti-CD4-mAb:n ja anti-CDS-mAb:n käyttö voi johtaa perifeerisen veren sekä pernan T-solujen tehokkaaseen poistoon, kun taas tyymuksen T-solut ovat yksinkertaisesti mAb:iden päällystämiä eikä niitä ole poistettu. Täten hiirien kateenkorvan säteilytys pannaan toimeen.
20 Menetelmät • · • · • ( • · Käytettiin hiirimallia siirrettäessä Fl.n allogeenista luuydintä (BMT) vanhempaan, ; . jotta väitettiin indusoimasta käänteishyljintäreaktiota. Käytettiin Fl-kantaa CB6, jot- .···. ka ovat (C57BL/6xBalb/c)Fl:tä, jotka ovat peräisin H-2d/b:n kokonais MHC- haplotyypistä. Luuydin poistettiin ja se injektoitiin laskimonsisäisesti BALB/c-van- • · · 25 hempaan, MRl:een, jota oli säteilytetty, anti-gp39-vasta-aineen kanssa tai ilman sitä. Koko ruumiiseen kohdistuvan säteilytyksen tasot (WBI) vaihtelivat kimerismin parhaan tason määrittämiseksi ja jotta voitiin verrata anti-gp39-vasta-aineella käsi-teltyjä ja käsittelemättömiä eläimiä kullakin säteilytystasolla. Kimerismi määritettiin virtaussytometrianalyysillä, joka pantiin toimeen perifeerisen veren H-2 -MHC-hap-: .·. 30 lotyypin lymfosyyteillä, joita on H-2d (BALB/c)-hiirissä. Aiemmin on osoitettu, että [·’ tämä hiirien yhdistelmä soveltuu ja että kimeerit voidaan saada 500 ja 600 radin 'F suuruisella koko kehon säteilytyksellä.
9 · % V · · • · · « • · 25 106306
Tulokset
Kimerismi havaittiin identifioimalla virtaussytometrillä solut (H-2b), jotka olivat peräisin C57BL/6:sta. Kimerismin havaittiin kehittyvän hiirissä, joita oli säteilytetty 400, 500 ja 600 radin suuruisella koko kehon säilytyksellä 14 päivän aikana vain, 5 jos hiiriä käsiteltiin anti-gp39-vasta-aineella tutkimuksen alusta lähtien. Sellaiset hiiret, jotka eivät saaneet mitää vasta-ainetta, hylkivät soluja kaikilla säteilytystasoilla, joilla niitä oli käsitelty, paitsi kun annettiin 600 radia koko keholle, jolloin ne hyväksyivät luuytimen samassa määrin kuin ryhmä, jota käsiteltiin vasta-aineella ja säteilytettiin 400 radilla (taulukko 1). Havaittiin, että kimerismin taso kuuden viikon 10 mittaisen käsittelun jälkeen, kun käytettiin 400, 500 ja 600 radia sekä anti-gp39-vasta-aineterapiaa, oli vastaavasti 70,7 + 5,74, 94,1 ja 84,4 + 8,56, kun taas säteily-tettäessä 600 radilla ilman mitään muuta käsittelyä niiden havaittiin olevan 85,7 + 5,9 kimeerisiä (taulukko 2). Solujen fenotyypitys tässä kohden ilmaisi, että T-soluis-ta, B-soluista ja makrofageista oli tullut kimeerisiä ja samassa määrin, kun käytettiin 15 400 radin suuruista säteilytystä verrattuna ryhmään, joka sai 600 radia säteilyä eikä muuta käsittelyä (taulukko 2). Kävi myös ilmi, että anti-gp-39-vasta-ainekäsittely ei muuttanut merkittävästi minkään lymfoidisolujen populaation kokonaisprosenttia periferiassa. Kun lopetettiin eläinten käsittely anti-gp39-vasta-aineella, havaittiin, että eläimet olivat transplantaation jälkeen stabiilisti kimeerisiä aina kahdeksaan 20 viikkoon saakka.
'.'. Taulukko I
* · I
• I
" Koko kehon säteily- Anti-gp39:llä käsiteltyjen, Kimeeristen eläinten luku- ‘ tystaso (radeja) kimeeristen eläinten luku- määrä, eläimiä ei käsitelty _määrä_anti-gp39:llä_ _0__0(5)__0(5)_ •V*: 200__0(5)__0(5)_ _400__9(9)_ 0(9)_ 0 450__3(5)__0(9)_ 500__4(5)__2(5)_ 600 7(9) 7(9)
* « I
* I a ': * Koko kehon säteilytyksen tasot tuottivat kimerismin. Suluissa esitetyt luvut ilmaise- * · :. i : vat kullakin tasolla tutkittujen eläinten kokonaislukumäärän. 1 t 26 106306
Taulukko 2
Radeja Käsittely B-solut T-solut Mac.
___________II-2K1* LI-2Kbf II-2Kb 400_+ 70,7+5,74 89+2,6 45,6+13,3 82,3+3,3 500_+_94J_JOO_89_JOO_ 600_+ 84,4+8,56 99,3+0,94 72,3+15,9 91,1+8,3 600 ~ 1- 85,7+519 j 97,3+1,77 67,1+10,3 91+9
Prosenttimäärä B- ja T-soluja sekä makrofageja (Mac.), jotka ovat positiivisia H-2Kb:n suhteen, +standardivirhe.
5 Esimerkki 5: AHogeeninen luuydintransplantaatio yhdistettynä vastaanottajan käsittelyyn anti-gp39:llä, joka inhiboi akuutin ja kroonisen käänteishyljinnän Tässä esimerkissä käytettiin seuraavaa metodiikkaa:
Hiiret: DBA/2 (H-2d), C57BL/6 (H-2b)- sekä B6D2F,, ((C57BL/6 (H-2d)x DBA/2)Fi-hybridi)-hiiret saatiin NCI-laboratorioista (Bethesda, Maryland) ja niitä 10 pidettiin viruksettomassa ympäristössä Dartmouthin Medical Schoolin eläinlaitok-sessa. Kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt hiiret olivat naaraspuolisia ja iältään kuuden - kahdeksan viikon ikäisiä.
• : : Kroonisen GVHD:N induktio: Krooninen GVHD saatiin aikaan siten, että laskimon- ' ., sisäisesti ruiskutettiin parentaalisia (DBA/2) pernasoluja vastaanottajiin, jotka olivat :' i ‘. 15 sellaisia (C57BL/6xDBA/2)Frhybridejä, joita ei oltu säteilytetty (Fast, L.D. (1990) .··*, J. Immunol. 144, 4177). Parentaaliset hiiret nukutettiin ja ne tapettiin vääntämällä • · · . .·. kaula sijoiltaan ja niiltä poistettiin perna. Erotetut pernasolut pestiin ja lietettiin uu- • « # delleen RPMI 1640 -väliaineeseen (Whittaker, Waldersville, Maryland) laskimonsi- • · · ' säistä ruisketta varten Fi-vastaanottajiin.
20 Akuutin GVHD:N induktio: Akuutti GVHD saatiin aikaan ruiskuttamalla laskimon- • · · ·*’: sisäisesti parentaalisia C57BL/6-pemasoluja vastaanottajiin, jotka olivat säteilyttä- mättömiä (C57BL/6xDBA/2)Frhybridejä. Solut valmistettiin siirtoa varten samalla ':;.: tavalla kuin kroonista GVHD:tä indusoitaessa.
: !·. Vasta-aineet: Anti-gp39:MRl tuotettiin askiteksessa ja puhdistettiin ioninvaihto- .‘.'J 25 HPLC:llä, kuten aiemmin kuvataan (Foy, T.M. et ai. (1993) J. Exp. Med. 178, 1567-1575; Noelle, R.J. et ai. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89, 6550). Poly-klonaaliset anti-isotyyppivasta-aineet: kaikki anti-IgGi, ja IgA-vasta-aineet sekä 27 106306 normaalit kontrollit saatiin Southern Biotecnology Associatesilta, Inc., (Birmingham AL). Anti-IgE-vasta-aineet: kaikki anti-IgE-vasta-aineet (BIE3 ja biotiini AM95) sekä standardit (A3B1), joita käytettiin IgE:lle erikoisesti suunnitellussa ELISAssa, olivat tohtori T. Waldschmidtin, IA, ystävällinen lahja. Anti-MCH-haplotyyppiset 5 vasta-aineet: H-2Kb-FITC:hen konjugoitu vasta-aine sekä H-2Dd-biotiiniin konjugoi-tu vasta-aine saatiin PharMingeniltä (San Diego, CA).
Solulinjat: Käytettiin solulinjoja, joihin kuuluivat P815 (H-2d) sekä LB27,4 (H-2bxd), jotka saatiin the American Type Culture Collectionista. Solulinja cl. 18.5 (H-2B) saatiin ystävällisenä lahjana tohtori William R. Greeniltä.
10 Polyklonaalisen Ig:n tuotto in vitro: Kontrolli- ja CGVHD-hiiristä poistettiin pernat ja valmistettiin yksinkertaiset solususpensiot. Soluja käsiteltiin Trisillä puskuroidulla ammoniumkloridilla erytrosyyttien poistamiseksi ja valkosolujen kokonaismäärä laskettiin visuaalisesti hemosytometrillä. Soluja inkuboitiin (5 x 106) yhdessä millit-rassa täydellistä (C)RPMI 1640 -alustaa (täydennetty 10 prosentilla vasikan sikiön 15 seerumia (Hyclone, Logan UT, 25 mmoolia/1 HEPESiä, 2 mmoolia/1 L-glutamiinia, 5000 U/ml penisilliiniä ja 5000 mg/ml streptomysiiniä) kolmen päivän ajan 37 °C;ssa, viisiprosenttisessa COi'.ssa. Viljelmäsupematantit koottiin ja ja solut koottiin niistä ja Ig määritettiin isotyypille spesifisellä ELISA-määrityksellä.
Isotyypille spesifiset ja antigeenille spesifiset ELISA-määritykset: ELISA IgGjin ja 20 IgA:n ilmaisua varten: Vuohen antihiiri-IgGi:a tai -IgA:ta (10 pg/ml; Southern Bio- f 4 technology Associates, Inc., Birmingham AL), joka oli PBS:ssa, absorboitiin 96-i kammioisen polyvinyylimikrotiitterilevyn kammioiden pinnalle yhden tunnin ajan ( t t ; 37 °C:ssa, sitten yön ajan 4 °C:ssa. Levyt pestiin ja niitä käsiteltiin PBS:llä, joka si- sälsi yhden prosentin FCS:ää, yhden tunnin ajan 37 °C:ssa. Levyt pestiin jälleen ja : j': 25 niihin lisättiin sopivat supematanttien ja standardikontrollien (IgGi ja IgA, Southern
Biotechnology Associates, Inc., Birmingham AL) laimennuksia kahden tunnin ajaksi 37 °C:ssa. Mainitun ajan kuluttua levyjä pestiin kolme kertaa ja niihin lisättiin alka- ,···, liseen fosfataasiin konjugoitua anti-hiiri- IgGi:ta tai IgA:ta (laimennukset 1/500) • · . (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, Alabama) kahden tunnin *.·· 30 ajaksi 37 °C:ssa. Levyjä pestiin perusteellisesti ja niihin lisättiin fosfaattisubstraattia * i i.i · (1 pg/ml; Sigma Diagnostics, St. Louis, MO), jolloin tuloksena oli sopiva värin f’’: muuttuminen. Lukemat määritettiin ELISA-lukijalla (Dynatech Laboratorie, Inc.) : 410 nm:n absorbanssilla. Ig:n pitoisuudet määritettiin vertaamalla sopivalla isotyy- • · · ! pillä laadittuun standardikäyrään ja ne ilmaistiin keskiarvolla + standardivirhe 35 (n=3).
28 106306
IgE:n ilmaisu ELISAlla: 96-kammioisen mikrotiitterilevyn kammiot päällystettiin anti-hiiri-IgE:tä sitovalla vasta-aineella (B1E3 (2 pg/ml)) yön ajan 4 °C:ssa ja sitten levyjä käsiteltiin PBS:llä, joka sisälsi yhden prosentin FCS:ää, yhden tunnin ajan 37 °C:ssa. Levyjä pestiin jälleen ja niihin lisättiin supematanttien ja standardikont-5 rollien (A3Bl(IgE)) sopivia laimennuksia kahden tunnin ajaksi 37 °C:ssa. Levyt pestiin perusteellisesti ja kuhunkin kammioon lisättiin EM95-biotiinia (5 mg/ml) ja niitä inkuboitiin kahden tunnin ajan 37 °C:ssa. Tämän ajan jälkeen lisättiin alkali-seen fosfataasiin konjugoitua streptavidiinia (laimennus 1/500) kahden tunnin ajaksi ja sitten kammioita pestiin perusteellisesti, ennen kuin niihin lisättiin fosfataasi-10 substraattia (1 mg/ml); Sigma Diagnostics, St. Louis, MO), minkä tuloksena väri muuttui sopivasti. Lukemat määritettiin ELISA-lukijalla (Dynatech Laboratories, Inc.) 410 nm:n absorbanssilla. Ig:n pitoisuudet määritettiin vertaamalla standardi-käyrään ja ne ilmaistiin keskiarvolla + standardivirhe (n=3).
Anti-DNA-Ab:n ilmaisu ELISAlla: Vasikan kateenkorvan DNA.ta (Sigma, St.
15 Louis, MO.) (5 pg/ml) liuotettiin kytkentäpuskuriin, joka sisälsi 0,1 moolia natriu- mkarbonaatti/natriumbikarbonaattia (pH 9,8). Tätä keitettiin 10 minuutin ajan ja sitten sitä inkuboitiin jäiden päällä 3 minuutin ajan, Sitten määritettiin DNA.n OD.
260 ja pitoisuus säädettiin siten, että saatiin DNA:n pitoisuudeksi vaadittu 5 pg/ml.
Liuosta lisättiin sitten 100 pl:aa 96-kammioisen polyvinyylimikrotiitterilevyn kam- 20 mioihin ja levyjä inkuboitiin yön ajan 4 °C:ssa. Sitten levyjä pestiin kolme kertaa ja niitä käsiteltiin yhden tunnin ajan 37 °C:ssa PBS:llä, joka sisälsi 1 prosenttia FCS:ää ja 0,02 prosenttia natriumatsidia. Levyt pestiin jälleen ja niihin lisättiin seeruminäyt- :' ., teiden sarjalaimennukset (100 ml) ja niitä inkuboitiin kahden tunnin ajan 37 °C:ssa.
:' '« Kuhunkin kammioon lisättiin sitten ilmaisuun käytettävää vasta-ainetta, alkaliseen .··*. 25 fosfataasiin kytkettyä vuohen anti-hiiri-IgGi :ta, ja inkuboitiin jälleen kerran kahden . ", tunnin ajan 37 °C:ssa. Levyt pestiin perusteellisesti ja niihin lisättiin fosfataasin • · · ,‘|Jt substraattia (1 mg/ml, Sigma Diagnostics, St. Luis, Mo), mikä johti sopivaan värin ’ muutokseen. Lukemat määritettiin ELISA-lukijalla (Dynatech Laboratories, Inc.) 410 nm:n absorbanssilla. Vasta-ainetiittereitä verrattiin positiivisiin seeruminäyt- ’;·* 30 teisiin ja tulokset ilmaistiin mielivaltaisina yksikköinä.
'** • 11 . Donoriperäisten solujen ilmaisu virtaussytometrillä: Pernat poistettiin normaaleilta BDF, cGVHD-hiiriltä, joita oli käsitelty anti-gp39:llä tai jotka olivat käsittelemät- • · tömiä, ja valmistettiin yksinkertainen solususpensio. Solut kerrostettiin Ficoll-: Hypaquelle (4:1) ja sitten niitä sentrifugoitiin nopeudella 2000 kierrosta minuutissa •: · ·: 35 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Muodostunut lymfosyyttikerros poistettiin ja se pestiin kerran BSSillä, joka sisälsi 5 prosenttia FCS:ää ja värjäykseen käytettiin 29 106306 1 x 106 solua putkea kohti lopullisessa 50 μ1:η tilavuudessa. Kuhunkin putkeen lisättiin 50 pl:aa rotan seerumia, jotta estettiin epäspesifinen vasta-aineiden sitoutuminen. Solut värjättiin (a) kontrollivasta-aineilla: rotan Ig-FITC:llä (lopullinen laimennus 1:100) sekä PE-streptavidiinilla (lopullinen laimennus 1:500) ja (b) FITC 5 H-2Kb:llä sekä biotiiniin kytketyllä H-2Dd:llä (molemmat lopullisena laimennuksena 1:100). Soluja inkuboitiin 20 minuutin ajan jäiden päällä ja sitten ne pestiin kahdesti jotta sitoutumattomat vasta-aineet saatiin poistettua. PE-streptavidiinia (lopullinen lainennus 1:500) lisättiin lopuksi sopivaan putkeen, 20 minuutin ajaksi jäiden päällä, biotiiniin konjugoidun vasta-aineen ilmaisemiseksi. Soluja pestiin jälleen kaksi ker-10 taa analyysiä varten, joka toimitettiin laitteella Becton Dickinsonin FACScan-lait-teella. Positiivisen pulssin avainnuksen jälkeen etummaisen ja sivusironnan kautta koottiin näytettä kohti 10 000 tapahtumaa asiaankuuluvan MHC-haplotyypin suhteen positiivisten solujen prosenttimäärän määrittämiseksi.
Kromin vapautumisen määritys CTL-määrityksen arviointia varten: 5ICr:lla leimatut 15 kohdesolut pestiin ja siveltiin 96-kammioisille levyille lxlO4 solua kammiota kohti efektorisolujen kanssa siten, että suhde E.T oli 100:1, 20:1 ja 4:1. Käytetyt kohdesolut olivat P815 (H-2d), LB27.4 (H-2bxd) sekä cl 18,5 (H-2b). Levyjä sentrifugoitiin lyhyesti ja sitten niitä inkuboitiin 37 °C:ssa, viisiprosenttisessa C02:ssa neljän tunnin ajan. Levyt sentrifugoitiin vielä kerran ja erä solutonta supematanttia koottiin 20 kustakin kammiosta gammalaskijalla suoritettavaa laskua varten. Spesifisen hajoamisen prosenttimäärä määritetään kaavan (a-b)/c avulla, jolloin iskuja minuutissa, v,i joita vapautuu kohdesoluista, joita on inkuboitu efektorisolujen kanssa, b = iskuja minuutissa, joita vapautuu kohdesoluista, joita inkuboitiin alustan kanssa yksinään (spontaani vapautuminen) ja c = kohdesoluille saadut, jäädytys-sulatuksella vapau-25 tuvat iskut minuutissa (arviolta 80 prosenttia liittyneistä iskujen kokonaismäärästä . minuutissa).
• · · ' • « « «· · v * Akuuttien GVHD-pemasolujen sekundaarinen stimulaatio in vitro. Akuutit GVHD- pemasolut poistettiin anti-gp39:llä käsitellyistä, HIg:llä käsitellyistä ja käsittelemät-tömistä eläimistä. Pernoista poistettiin punasolut ja sitten ne annosteltiin lxlO4 [**: 30 solua kammiota kohti. Sopiviin kammioihin lisättiin säteilytettyjä stimulaattorisoluja (P815). Seitsemän päivän jälkeen toimitettiin CTL-määritykset sopivia kohteita ';;.; kohtaan, kuten aiemmin mainittiin.
• w : .·. Tulokset
f » I
• * « t * * GVHD tuottaa hiiressä tulokseksi pernan suurentuneisuuden. Eräs cGVHD:n seura- 35 uksista hiiressä on pernan suurentuminen. Ensisijaisesti isännän omat solut suodat- 30 106306 tuvat pernaan ja laajentavat sitä, vaikka tämä on vaste luovuttajasolujen läsnäololle (Rolink, A.G. et ai. (1983) J. Exp. Med. 158, 546). Kuvio 5 ilmaisee, että 7-14 päivän kuluttua cGVHD:n alkamisesta, pernat sisältävät melkein kaksi kertaa niin paljon leukosyyttejä kuin hiiri ilman cGCHD.tä. CGVHD.N taudin puhjetessa hiirien 5 hoito anti-gp39:llä (250 pg/hiiri, päivinä 0, 2, 4 ja 6) vähentää leukosyyttien (perna) lukumäärää cGVHD-hiirillä, sellaisiin arvoihin, jotka olivat identtisiä niiden arvojen kanssa, jotka saatiin hiiriltä, jotka eivät poteneet mainittua tautia.
GVHD:n indusoitua polyklonaalisen immunoglobuliinin ylituotanto
On raportoitu, että sellaisilla hiirillä, jotka potevat cGVHD:ta, on Ig:n ylituotantoa, 10 joka johtuu samaa alkuperää olevista vuorovaikutuksista luovuttajan T-solujen ja B-solujen välillä (Morris et ai. (1990) J. Exp. Med. 171, 503) . Sen seikan määrittämiseksi, inhiboiko anti-gp39 Ig:n ylituotantoa, annettiin cGVHD:tä poteville hiirille anti-gp39:ää. Päivinä 7 ja 14 poistettiin pernat kontrollilla sekä cGVHD-hiiriltä ja B-soluista määritettiin in vitro IgGpn ja IgA:n spontaani tuotto in vitro. cGVHDitä 15 potevilta hiiriltä saadut splenosyytit tuottivat in vitro suuria määriä IgA.ta ja IgGpa (kuviot 6A ja 6B). Sellaiset splenosyytit, jotka saatiin hiiriltä, jotka potivat cGVHDitä ja joita käsiteltiin anti-gp39:llä (päivinä 0, 2, 4 ja 6) tuottivat kuitenkin TgGi :tä ja IgA:ta sellaisia määriä, jotka olivat identtiset niillä hiirillä tuotettujen määrien kanssa, joilla ei ollut mainittua sairautta. Anti-gp39:n lisäys sellaisten hiir-20 ten pernasolujen viljelmiin, jotka potivat cGVHD:tä, ei vähentänyt Ig:n tuoton tasoa in vitro, mikä viittaa siihen, että anti-gp39 vaikuttaa in vivo.
« i i - ^ r i
• T
: " Kun näissä kokeissa käytettiin kontrollina hamsterin Ig:tä (HIg), havaittiin, ettei
f I I
v : GVHD:n induktiossa ilmennyt mitään inhibitiota, vaan sairaus suorastaan korostui, * > * ei ainoastaan polyklonaalisen Ig:n tuottona, vaan myös sairaudesta aiheutuvana per- :#:Jj 25 nan suurentumisena. Ig:n tuottotaso lisääntyi kahdeksankertaiseksi, kun GVHD in- :*’.· dusoitiin yhden viikon ajan HIg:llä hoidettuihin hiiriin, verrattuna hoitamattomiin hiiriin, joihin GDHD indusoitiin yhden viikon ajan, oli ilmeistä, että itse HIg on .···, immunogeeninen. Fpvastaanottajahiiriä, joita ei hoidettu, päätettiin sen tähden ,’”t nimittää asiaankuuluvaksi kontrolliryhmäksi.
« • · * | 30 Anti-gp39:n vaikutus GVHD:N indusoimaan seerumin hyper-IgE:hen ja anti- i » « · DNA-autovasta-aineisiin i · • « · * ij’: cGVHD:n kulkua voidaan tarkkailla seerumin IgE:n sekä kaksisäikeisen DNA:n vasta-aineiden nousun perusteella (Morris, S. E. et ai. (1990) J. Exp. Med. 171, 503). Seerumin IgE:n määrä mitattiin IgE:lle spesifisellä ELISAlla. Hiiriin aikaan 31 106306 saatua kroonista GVHD:tä hoidettiin anti-gp39:llä päivinä 0, 2, 4 ja 6 ja sitten ei enää annettu mitään vasta-ainetta.
Hiiristä otettiin verta viikoittain ja selvitettiin seerumien IgE:n määrät (kuvio 7A). cGVHD sai aikaan seerumin IgE-tasojen 10-15-kertaisen lisääntymisen. Anti-5 gp39:n anto inhiboi cGVHD:n indusoimat seerumin IgE:n lisäykset aina kahdeksaan viikkoon saakka sairauden puhkeamisesta. Seerumin lisääntyneen IgE:n inhibition lisäksi anti-gp39 saa aikaan myös seerumin anti-DNA:n autovasta-aineiden tuoton eston. Krooninen GVHD aiheuttaa 5-10-kertaisen lisäyksen anti-DNA-vasta-ainei-den havaitussa tasossa, jota anti-gp39-hoito vähensi (kuvio 7B).
10 Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että anti-gp39:n (MRl-klooni) puoliintumisaika on 12 päivää (Foy, T. M. et ai. (1993) J. Exp. Med. 178, 1567-1575). Anti-gp39:lle spesifiset ELISA-määritykset ilmaisevat, että käsiteltyjen hiirien seerumissa ei ollut ilmaistavissa anti-gp39:ää kahdeksan viikon kuluttua hoidosta. Pysyvä anti-gp39 ei sen tähden voi selittää cGVDH:n pitkällistä tukahduttamista. Tehtiin siirto-15 tutkimuksia sen tutkimiseksi, voivatko sellaiset splenosyytit siirtää cGVHD:tä, jotka olivat peräisin hiiriltä, joilla oli cGVHD, sekä sellaisilta hiiriltä, joille oli annettu anti-gp39:ää. Sellaisilta hiiriltä saadut splenosyytit, jotka oli saatu hiiriltä, joille oli annettu cGVHD:tä sekä anti-gp39:ää, eivät kyenneet saamaan aikaan IgE:n lisääntymistä seerumissa eikä anti-DNA-autovasta-aineita adoptiosiirrossa; sitä vastoin 20 splenosyytit, jotka olivat peräisin sellaisilta hiiriltä, joissa oli cGHVD, lisäsivät slgE.tä ja anti-DNA-vasta-aineita. Nämä tulokset viittaavat siihen, että alloreaktiivi- • · ·.·.·* set T-solut on saatu anti-gp39-käsittelyllä passiivisiksi.
• « « « • · ·
Alloreaktiivisten luovuttajasolujen ilmaisu • * « «
Kun analysoitiin sellaisten hiirien pernoja luovuttajaperäisten solujen suhteen, joissa • _ :.j.: 25 cGVHD oli saatu aikaan, havaittiin, että verrattuna normaaliin BDF^een, joka vär- :T: jäytyy kaksinkertaisesti positiiviseksi H-2Kb:n ja H-2Dd:n suhteen, cGVHDrllä oli arviolta 5-7 prosenttia luovuttajan soluja. Nämä solut olivat peräisin DBA/2:sta ja ;**·. sen tähden ne värjäytyvät yksikertaisesti positiivisiksi H-2Dd:n suhteen. Nämä solut .···. olivat ilmaistavissa anti-gp39-käsittelystä huolimatta. Tämä valaisee sitä seikkaa, '·* 30 että anti-gp39-käsittely sallii donorisolujen siirtämisen sallimatta mitään auttaja- : toimintoa vastaanottajan B-solujen suhteen, mikä antaa tulokseksi Ig:n tuoton käsit- • ·« : telemättömässä cGVHD-ryhmässä.
« « • · · · · « · · · « f » I · • · 32 106306
Anti-gp39-käsittelyn vaikutus akuutin GVHD:N induktioon
Akuutti GVHD liittyy lisääntyneen anti-allogeenisen CTL-vasteen induktioon. Vaikka on selvää, että gp39-CD40-vuorovaikutukset ovat kriittisiä Th-B-soluvuoro-vaikutuksille, ei ole selvää, voiko anti-gp39-terapia muuttaa muiden immuuniefekto-5 rimekanismien induktiota. AGVHD indusoitiin siten, että Fl-vastaanottajalle annettiin C57BL/6-pemasoluja. Kuten kuviossa 8 esitetään, 12 päivän kuluttua allogee-nisten solujen siirrosta mitattiin selvä H-2b-anti-H-2d-CTL-vaste. Hiirien käsittely anti-gp39:llä mutta ei HIg.llä esti H-2b-anti-H-2d CTL.N tuoton (kuvio 8). Anti-gp39:llä tapahtunut hoito vähensi CTL-vasteita yhdessä kahdesta kokeesta pienem-10 miksi kuin havaittiin luonnonmukaisilla pernasoluilla. Tämä viittaa GVHD-hiiristä saatuihin pemasoluihin, joilla annetaan "heräte". Jos näitä pernasoluja sitten viljellään seitsemän päivän ajan säteilytettyjen P815-solujen kanssa ja sitten toimitetaan CTL-määritys, nämä solut eivät onnistu saamaan aikaan sekundaarista stimulaatiota P815-soluja kohtaan, kuitenkin normaali BDF1-perna saa aikaan primaarivasteen. 15 Sellaisilla hiirillä, joihin oli indusoitu aGVHD, mutta joita ei oltu käsitelty, sekundaarinen immuunivaste ilmeni odotetusti. Nämä tulokset ilmaisevat, että akuuttien GVHD-hiirien käsittely anti-gp39:llä tekee CD8+-populaation passiiviseksi sekundaariselle stimulaatiolle.
Tulosten tarkastelu 20 Pernan suurentuneisuuden suunnan muutos (kuvio 5), Ig:n ylituotannon inhibitio (kuviot 6A ja 6B), seerumin IgE:n tasojen inhibitio sekä anti-DNA-autovasta-aine- • * _ tuotannon (kuviot 7A ja 7B) inhibitio hiirissä, joissa on indusoitu GVH sekä joille on annettu anti-gp39:ää, viittaavat siihen, että anti-gp39 estää siirrettyjen T-solujen .···. kyvyn saada aikaan isännän B-solun aktivaatio. Tämä splenomegalian inhibitio ja • · 25 polyklonaalisen IgGi:n ja IgA:n tuotto jää alhaiseksi seitsemän päivän ajaksi vasta-aineen annon päättymisestä. IgE:n ja anti-DNA-vasta-aineiden väheneminen kestää • · » ’·’ * kahdeksan viikkoa, vaikka käsittely on päättynyt. Nämä tulokset ilmaisevat, että re- aktiokykyisten T-solujen klonaalinen puuttuminen on vaikuttanut T-solutoimintaan • t ♦ tai että on ilmennyt T-solujen energian puuttumista. Aiemmin on osoitettu (Van den 30 Eertwegh et ai. (1993) J. Exp. Med. 178, 1555-1565), että sytokiiniä tuottavat solut : X säilyvät normaaleina vasta-aineella käsitellyissä hiirissä immunisoitujen hiirien X·’ in situ -tutkimuksissa. Tämä ilmaisee, että T-solut eivät häviä käsittelyn seuraukse- • # ”/ na. Kun cGVHD-hiiristä analysoitiin donoriperäisten solujen läsnäolo, niitä Iöy- « · : dettiin, olipa eläin sitten käsitelty anti-gp39:llä tai käsittelemätön. Anti-gp39:llä on 35 täten kyky indusoida passiivinen tila näihin donorin T-soluihin, mikä sallii vasta-ainevasteiden inhibition. Jos pernoja siirretään näistä eläimistä luonnonmukaisiin 33 106306 vastaanottajiin, vasta-aineiden määrä itse asiassa lisääntyy, kun luovuttajien pernat ovat käsittelemättömiä cGVHD:ita, mutta anti-gp39:llä käsitellyt cGVHD-hiiret eivät pysty saamaan aikaan sekundaarista cGVHD-tilaa siirron jälkeen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että anti-gp39 häiritsee T-solujen kykyä tuoda esiin voimakasta 5 kliinistä GVHD-immunopatologiaa sekä splenomegaliaa, niin että vasta-aineen anto tuo esiin reagoimattomuuden CD4+-alapopulaatiossa.
On raportoitu, että tarvitaan B-soluja auttamaan CTL:ien induktiota, mikä on nähtävissä, kun sellaisilla hiirillä, joilta puuttuu B-soluja, tutkitaan suojaavan T-solu-immuniteetin induktiota Friendin leukemiaviruksen hiirellä aikaansaamaa leukemiaa 10 kohtaan (Schultz, K.R. et ai. (1990) Science 249). Täten on ajateltavissa, että sellaisilla hiirillä, joissa on indusoitu aGVHD, anti-gp39 inhiboi B-solujen aktivaatiota ja estää täten antigeenin läsnäolon ja täten tärkeimmät CD8+T-solut. On myös ehdotettu, että CD8+CTL:n synnyttäminen edellyttää vuorovaikutusta luokkaan Π rajoittuneiden Th-solujen kanssa (von Boehmer, H. et ai. (1979) J. Exp. Med. 150, 1134; 15 Keene, J. et ai. (1982) J. Exp. Med. 155, 768) ja että kun TCR-affiniteetti on vähäinen, tarvitaan CD4+:n välittämää T-soluapua in vivo (Gao, X. et ai. (1991) J. Immunol. 147, 3268).
On tehty tutkimuksia, joissa on tarkasteltu CD28-B7/BBl-vuorovaikutusten roolia CD8+CTL-vasteiden induktiossa. Havaittiin, että CD28-B7/BB1-vuorovaikutukset 20 olivat tarpeellisia ja riittäviä luokan I MCH-spesifisen CTL:n tuottamiselle (Harding, F.A. ja Allison, J.P. (1993) J. Exp. Med. 177, 1791). On viitattu siihen, • c v'.· että CD40:n ligandi voi olla tärkeä B7:n induktori (Ranheim, E. A. ja Kipps, T. J.
f '< (1993) J. Exp. Med. 177, 925), kuten sellaiset tutkimukset esittävät, joihin sisältyy B7:n ilmentymisen inhibitio CD40:n vasta-aineiden aiheuttamana normaaleilla ja ;·**; 25 leukemiasoluilla pinnalla. Nämä tutkimukset yhdessä ilmaisevat, että anti-gp39 voi t · · . estää CD4+T-solujen vuorovaikutuksen B-solujen kanssa jättäen täten indusoimatta .··*. B7:n ilmentymisen, mikä sallii sen, että B-solu tehokkaasti aktivoi T-solun prolife- raatiota ja saa sen tuottamaan sytokiinejä. Yhteenvetona nämä tulokset viittaavat ... siihen, että CD4+T-soluja tarvitaan CTL-muodostumisen induktioon ensin T-B- • « 30 solujen samaa alkuperää olevalla vuorovaikutuksella gp39:n ja sen ligandin CD40:n ···’ välillä. CD40:n merkinanto B-solujen pinnalla sallii sitten B7/BBl:tä lisäävän sääte- : lyn. B7/BBl:n keskinäinen vuorovaikutus sen ligandin CD28:n kanssa T-solujen ;·*·. pinnalla voimistaa sitten T-solun proliferaatiota ja sytokiinin tuottoa. Jos T-solulle I ( t kuitenkin annetaan vain yksi signaali, se on gp39:n-vuorovaikutus CD40:n kanssa, • aa ; 35 eikä se saa toista signaalia, silloin T-soluun indusoidaan reagoimattomuus ja siitä ’ * tulee siedätetty tai siltä on poistettu energia.
34 106306 Nämä tutkimukset ilmaisevat, että kun aGVHD indusoidaan hiirissä, saadaan anti-H-2d-vaste. Kuitenkin jos eläimiä käsitellään anti-gp39:llä, silloin ei havaita mitään CTL-vastetta. Voi olla selvää, että anti-gp39 inhiboi CTL:n muodostumista aiemmin kuvatulla menetelmällä (Schultz, K. R. et ai. (1990) Science 249). B-solujen akti-5 vaatio CD40-ligaation kautta epäonnistuu, ja B-solut eivät kykene täten edistämään CTL:ien induktiota. Tutkimuksemme osoittivat lisäksi, että kun pernasoluja stimuloidaan in vitro P815-soluilla, sellaiset solut, jotka olivat alttiina anti-gp39:lle in vivo, havaittiin kykenemättömiksi saamaan aikaan sekundaarista anti-H-2dCTL:a. Voidaan täten osoittaa, että anti-gp39 on indusoinut toleranssitilan T-soluosaston 10 pinnalle, koska gp39 ei kykyne kytkemään CD40:tä, täten ei ole olemassa mitään B7/BBl:ää lisäävää säätelyä ja näin ollen T-soluja ei saada enää aktivoitua ja ne jäävät passiivisiksi. On myös tunnettua, että lepäävät B-solut tavallisesti ovat allogee-nisten T-solujen tehottomia stimulaattoreita seoslymfosyyttien reaktiossa lukuunottamatta esiaktivaatiota anti-IgM-vasta-aineilla, PMA:lla tai LPS:Ilä (Inaba, K. ja 15 Steinman, R.M. (1989) J. Exp. Med. 160, 1717; Metley, J. P. et ai. (1989) J. Exp. Med. 169, 239; Frohman, M. ja Cowing, C. (1985) J. Immunol. 134, 2269). Tämän lisäksi B-soluihin kohdistuva liukoinen monomeeriantigeeni, joka on tarkoitettu annettavaksi in vivo, voi antaa tulokseksi spesifisen T-solun energian häviön (Eynon, E. E. ja Parker, D. (1992) J. Exp. Med. 175, 131). Täten näyttää todistettavalta, että 20 antigeenin ja kytkeytyvien APC:iden antomenetelmän mukaan voidaan indusoida energian puutos tai toleranssi. Annettaessa P815-solujen testiannos eli "haaste" pernan CD8+T-soluosastoa vastaan, ei tarvita antigeenin tarjontaan, alloantigeeni voi-daan antaa täten suoraan ja CTL voidaan indusoida. Pernojen passiivisuus sekun-;·. daarista stimulaatiota kohtaan ilmaisee, että tässä järjestelmässä voidaan indusoida 25 allospesifinen toleranssi.
• · · Tämä tulos on vastakohta aiemmalle tuloksille (Foy, T.M. et ai. (1993) J. Exp. Med.
178, 1567-1575), jotka ilmaisevat, että vasta-aine ei indusoi tuota toleranssia anti- :T: geenispesifisessä järjestelmässä. Kaksi järjestelmää eroaa toisistaan, koska aGVHD- malli tarjoaa alloantigeenin, joka jo on sidottu antigeenin tarjoamiin soluihin, kun .···. 30 taas antigeenispesifisten järjestelmien kanssa antigeeni annetaan ja otetaan kiinni ··· .···. in vivo. Sitä prosessoi ja sen luovuttaa menetelmän mukainen APC. Näyttää siltä, ’· * että anti-gp39:llä on erilaisia vaikutuksia käytetyn antigeenin ja tarjontamenetelmän : mukaan.
• « · • · P p
P · P
. Voidaan päätellä, että anti-gp39 voi indusoida allospesifisen toleranssin immuuni- P P · ; 35 systeemin sekä CD4+- että CD8+-osastoissa, ja tämä voi olla selvä hyvää tekevä te rapeuttinen toimenpide, kun ajatellaan siirrännäisen immunologiaa ja immunotera- 35 106306 piaa. On mahdollista, että sellaisilla potilailla, joille tapahtuu luuydinsiirroksia, anti-gp39-hoito on riittävä toleranssin indusoimiseksi siirrännäistä kohtaan ja estämään siirrännäiskäsittelyjen sellaiset seuraukset kuten GVHD.
Esimerkki 6: Anti-gp39-vasta-aineiden tuotto ja luonnehtiminen 5 Koe 1 - Humaani gp39:ää vastaan suunnatut vasta-aineet
Antigeenispesifisen T-solutoleranssin indusoimiseksi ihmisellä on edullista antaa vasta-ainetta, joka on suunnattu ihmisen gp39:ää kohtaan. Käytettiin seuraavaa metodiikkaa monoklonaalisten hiiren anti-humaani-gp39-vasta-aineiden tuottoon. Balb/c-hiiriä immunisoitiin liukoisella gp39-fuusioproteiinilla, gp39-CD8:lla, täy-10 dellisessä Freundin adjuvantissa (CFA). Tämän jälkeen, kuusi viikkoa myöhemmin, hiirille annettiin haaste liukoisella gp39-CD8:lla, joka oli epätäydellisessä Freundin adjuvantissa (IFA). Liukoista gp39-CD8:aa annettiin liukoisessa muodossa neljän viikon kuluttua toisesta immunisaatiosta. Sitten hiirien immunisointia tehostettiin aktivoiduilla ihmisen perifeerisen veren lymfosyyteillä kaksi viikkoa myöhemmin, 15 minkä jälkeen vielä kahden viikon kuluttua annettiin lopullinen tehoste, joka käsitti liukoista gp39-CD8:aa. Splenosyytit sulautettiin normaalien ohjeiden mukaan NS-1-sulautuspartnerin kanssa neljäntenä päivänä lopullisesta immunisaatiosta.
Anti-humaani-gp39-vasta-aineita tuottavat kloonit valittiin moninkertaisen seulontamenetelmän perusteella. Kloonit seulottiin aluksi levyllä toimitetulla sidontamääri-. . 20 tyksellä (by a plate binding assay), jossa käytettiin gp39-CD8:aa. Positiiviset kloonit * seulottiin sitten kontrollilla toimivaa CD8-fuusioproteiinia, CD72-CD8:aa vastaan.
, t'' Poistettiin sellaiset kloonit, jotka arvosteltiin positiivisiksi levyllä suoritetulla CD8- < < f ' · ‘ ' CD72-sidontamäärityksellä. Tämän jälkeen jäljelle jäävät kloonit seulottiin lepäävil- läjä kuusi tuntia aktivoiduilla ihmisen perifeerisen veren lymfosyyteillä (PBL) vir-25 taussytometrianalyysiä käyttäen. Sellaisia hybridoomia pidettiin positiivisina, jotka :T: värjäsivät aktivoituja mutteivät lepääviä PBL:iä. Jäljelle jäävät kloonit tutkittiin lo puksi niiden kyvyn suhteen estää CD40Ig:n sitoutuminen levyyn sidottuun gp39:ään.
• · · • · ·;·* Arviolta 300 kloonia seulottiin levyynsitoutumismäärityksissä aluksi gp39-CD8:aa i 30 ja CD72-CDB:aa vastaan. Näistä klooneista 30:n havaittiin ilmaisevan levyyn sidot-tua gp3g:ää mutta ei CD:tä. Nämä kloonit seulottiin myöhemmin gp39:n ilmaisun suhteen aktivoidulla humaani-PBL:llä. Arviolta 15 kloonia ilmaisi molekyylin akti-’** ; voidulla PBL:llä mutta ei lepäävillä soluilla. Lisäksi varmistettiin spesifisyys siten, että määritettiin kloonien kyky estää levyyn sidotun gp39:n ilmaisu CD40Ig:n avul- 36 106306 la. Kolme kymmenestä tutkitusta kloonista esti CD40Ig:n sitomisen tässä määrityksessä. Nämä kloonit olivat 3E4, 2H5 ja 2H8. Tällaisia klooneja pidetään edullisina käytettäviksi tässä dokumentissa kuvatuissa menetelmissä. Sellaiset kloonit, jotka tutkimuksen perusteella olivat positiivisia aktivoiduilla mutta eivät lepäävillä 5 PBL:illä, seulottiin myös reaktiokyvyn suhteen rotan aktivoidun T-solukloonin, POMC8:n kanssa. Klooni 2H8 ilmensi ristireaktiokykyä rotan tämän T-solulinjan kanssa.
Koe 2 - Humaani-gp39:ää kohti suunnatut vasta-aineet
Esimerkissä 1 kuvatun menettelytavan kaltaista menetelmää käytettiin lisävasta-10 aineiden tuottamiseen humaani-gp39:ää vastaan. Yksi Balb/c-hiiri immunisoitiin liukoisella gp39-CD8:lla, joka oli CFA.ssa, mitä seurasi stimulointi kuusi tuntia aktivoiduilla ihmisen perifeerisen veren lymfosyyteillä, mikä tapahtui neljä viikkoa myöhemmin. Tämän jälkeen hiiret saivat tehosteen liukoisella gp39-CDB:lla neljä päivää ennen splenosyyttien sulauttamista NS-l-sulauttamispartnerin kanssa nor-15 maalien ohjeiden mukaisesti. Hybridoomakloonit seulottiin ihmisen kuusi tuntia aktivoitujen PBL:ien virtaussytometrivärjäyksellä. Valittiin kloonit, jotka värjäsivät aktivoituja mutta ei lepääviä ihmisen PBL:iä. Lisäanalyysiä varten valittiin kuusi kloonia, jotka olivat 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 ja 89-79.
Valittujen vasta-aineiden spesifisyys varmistettiin useilla määrityksillä. Virtaussy- 20 tometrianalyysi havainnollisti ensin, että kaikki kuusi mAb:tä värjäsivät aktivoituja mutta eivät perifeerisen veren lepääviä T-soluja (ks. tyypillisten esimerkkien suh- teen kuvioita 9B sekä 9C, jotka kuvaavat aktivoitujen T-solujen värjäytymistä vas- . ·: . taavasti 4D9-8 :IIa ja 4D9-9:llä). Kunkin kuuden vasta-aineen tunnistaman molekyy- .···. Iin ilmentyminen on ilmaistavissa neljän tunnin kuluttua aktivaatiosta, se on suu- • · 25 riimuillaan kuuden - kahdeksan tunnin kuluttua aktivaatiosta, ja eikä se ole havait- · · ·* ;;; tavissa 24 tunnin kuluttua aktivaation jälkeen. Kaikki kuusi mAb.tä tunnistavat mo- • · · ’·* ' lekyylin, joka ilmentyi aktivoiduilla CD3+PBL:illä, jotka olivat pääasiassa CD4+- fenotyyppiä, mutta osa CD8+T-soluja ilmensi myös molekyyliä. Kuuden mAb:n • · · ·... tunnistaman molekyylin ilmentyminen inhiboitui viljelyalustassa, jossa oli syk- • « · 30 losporiini A:ta, kuten gp39:n ilmentyminen (ks. kuvioita 10A ja 10B, jotka kuvaavat : tyypillisinä esimerkkeinä syklosporiinilla käsiteltyjen T-solujen värjäytymistä vas- I « · taavasti 4D9-8:lla ja 4D9-9:llä). Näiden mAb:iden tunnistaman molekyylin ilmen- < · tymisen kinetiikat ja leviäminen ovat identtisiä gp39:n ilmentymisen vastaavien : ominaisuuksien kanssa, kuten humaani-CD40Ig:n fuusioproteiini ilmaisi. Tämän li- 35 säksi kaikki kuusi mAb:tä estävät gp39:n värjäytymisen CD40Ig:llä (ks. kuvioita 1 IA ja 1 Ib, jotka edustavat tyypillisiä esimerkkejä, jotka kuvaavat CD40Ig:llä ta- 37 106306 pahtuvan gp39:n värjäytymisen inhibitiota vastaavasti 4D9-8:n ja 4D9-9:n läsnäollessa). ELISA-määrityksessä kaikki kuusi mAbrtä tunnistavat gp39-CD8:n, joka on gp39-molekyylin liukoinen fuusiomuoto. Ennen kaikkea kaikki kuusi mAb:tä im-munosaostavat noin 36 kd:n 35 suuruisen molekyylin, joka on peräisin S-metio-5 niinillä leimatuista, aktivoiduista humaani PBListä. Immunosaostettu molekyyli on yhtäläinen humaani CD40Ig-fuusioproteiinilla saostetun fuusioproteiinin kanssa.
Kuuden valitun mAb:n (4D9-8, 4D9-9, 24-32, 24-43, 89-76 ja 89-79) funktionaalinen aktiivisuus määritettiin seuraavasti. Ensin mitattiin mAb:iden kyky inhiboida sellaisten puhdistettujen humaani B-solujen proliferaatio, joita oli viljelty IL4:n ja 10 liukoisen gp39:n kanssa. Puhdistettuja ihmisen B-soluja viljeltiin gp39:n ja IL-4:n kanssa puhdistettujen monoklonaalisten vasta-aineiden tai CD401g:n kanssa sekä ilman niitä, annosten ollessa 0-12,5 pg/ml. B-soluproliferaatio määritettiin viljelmästä kolmen päivän kuluttua tymidiinin liittymisen avulla. Tulokset (esitetty kuviossa 12) havainnollistavat, että kaikki kuusi mAb:tä estävät B-solun proliferaation, 15 jonka gp39 ja IL-4 indusoivat mAb:t 89-76 ja 2431 olivat tehokkaimmat inhiboitaes sa indusoitua B-soluproliferaatiota. IC50 (sellaisen vasta-aineen pitoisuus, joka inhiboi B-solujen proliferaation 50-prosenttisesti) oli arviolta 1 pg/ml vasta-aineella 89-76 ja noin 1,25 pg/ml vasta-aineella 24-31.
Seuraavaksi tutkittiin mAb:iden kyky inhiboida B-solun erilaistuminen, joka mitat-20 tiin Ig:n tuottona, jonka anti-CD3:n aktivoimat T-solut ja IL-2 saivat aikaan. Valmistettiin puhdistettuja IgD+-humaani-B-soluja positiivisen valinnan avulla, johon käy-lettiin FACS:ää, ja sitten viljeltiin anti-CD3:lla aktivoitujen humaani-T-solujen I r '«· (mitomysiini C:llä käsiteltyjä) sekä IL-2:n kanssa kuuden päivän ajan puhdistettujen :Τί monoklonaalisten anti-gp-39-vasta-aineiden kanssa annosten ollessa 0-10 pg/ml.
25 IgM:n, IgG:n ja IgA:n tuotto määritettiin ELISAlla kuudentena päivänä. Tulokset • · · ; (esitetty myöhemmin taulukossa 3) havainnollistavat, että kaikki kuusi vasta-ainetta • · » voivat inhiboida B-solun erilaistumista, johon T-solu vaikuttaa, IgM:n, IgG:n ja
IgA:n tuoton avulla mitattuna. IC50 (sellaisen vasta-aineen pitoisuus, joka tarvitaan inhiboimaan Ig:n tuotto 50-prosenttisesti) oli alueella, joka oli kuudella mAb:lla ' ’1:.** 30 1,0 - < 0,1 pg/ml, vasta-aineet 24-31 ja 89-76 mukaanluettuina.
« ·
Ml • f « « • · · • · · • · « « · « « · « « · « · · 38 106306
Taulukko 3
Immunoglobuliinin tuotto mAb____μηι/ιηΐ_IgM___IgG_ IgA_ ei mitään____17500___6710_ 4471_ 4D9-8 0,1 4813 2130 2819 1.0 4394 2558 1519 10.0 _ 1081_ 389 396_ 4D9-9 0,1 3594 919 1731 1.0 2659 1233 1606 ___374_44S_ 266_ 24-31 0,1 3863 981 344 1.0 1287 314 165 _____JO^O__Π20_j>94_23_ 24-43 0,1 6227 4132 432 1.0 3193 2130 192 __1010_ 7021__1232 1081_ 89-76 0,1 3783 1069 344 1.0 2180 352 171 _JA0__JH8_551_ 19_ 89-79 0,1 9763 1924 3021 1.0 2314 460 156 10.0 183 135 434 « — —— ' 1— -----1—---------—I- - t
Anti-gp39-mAb:iden vaikutuksen tutkimiseksi T-soluvasteiden suhteen, mAb:t sisäl- • · 5 lytettiin normaaleihin seoslymfosyyttireaktioihin (MLR). Viljeltiin 300 000 ihmisen '·?·’ perifeerisen veren lymfosyyttiä (stimulukseen reagoivat = R) 100 000 säteilytetyn v * allogeenisen perifeerisen veren lymfosyytin kanssa (stimulaattorit = S) anti-gp39- mAb:iden läsnäollessa ja puuttuessa (10 μg/ml). Viljelmille annettiin 3H-tymidiini-sykäykset päivinä 4, 5 tai 6 ja viljelmät koottiin 18 tuntia myöhemmin. Kaikki kuusi ·]“: 10 anti-humaani-gp39-mAb:tä inhiboivat allospesifisiä vasteita, jotka mitattiin MRL.llä . (ks. tyypillistä esimerkkiä kuviosta 13, joka kuvaa allospesifisten vasteiden inhibi- tiota, kun R:ää ja S:ää inkuboidaan 24-3 l:n tai 89-76:n läsnäollessa, CTLA4- • · immunoglobuliinifuusioproteiinia ja anti-CD28-mAb:tä käytettiin positiivisina kont-rolleina).
39 106306
Sen seikan määrittämiseksi, tunnistivatko kuusi mAb:tä erillisiä epitooppeja hu-maani-gp39-molekyylin pinnalla, tehtiin ristiinestokokeita. Aktivoidut humaani-PBL:t estettiin ensin kullakin kuudesta mAb:stä (25 pg/ml konjugoimatonta vasta-ainetta). Solut pestiin ja sitten ne värjättiin biotiinin konjugoidulla vasta-aineella, 5 jonka pitoisuus oli 10 pg/ml, mitä seurasi reaktio fytoerytriiniin konjugoidun avi-diinin kanssa (PE-Αν). Solujen värjäys PE-Av:llä analysoitiin FACS:llä. Tulokset esitetään seuraavassa taulukossa 4.
Taulukko 4
Esto Värjäävä vasta-aine
Ab 4D9-8 4D9-9 24-31 24-43 89-76 89-79 ei mitään +++_+++ ++++ ++++ ++++ ++++ 4D9-8 ND_____++++ ++++ +++_+++ 4D9-9 +++ ND +++_++++ +++_+++__ 24-31 +_+_ND_+++ ++_++__ 24-43 +__+_ +++_ND__++_+_ 89-76 +_+_+++_+-H-_ND_+++_ 89-79 +_++_+++_+++_+++_ND_ 10 Värjäyksen intensiteetti ja positiivisten solujen prosenttimäärä esitetään symbolina + (++++ = MI>200; +++ MI>125; ++ = MI>50; + = MI>25; - = ei mitään värjäytymis- :' ·,, tä, joka on enemmän kuin tausta). ND = ei määritelty.
< < ( «tr
Kaikki vasta-aineet estivät CD40Ig:n sitoutumisen aktivoituihin humaani-PBLiiin.
• · *···’ 15 Taulukossa 4 esitetyt tulokset havainnollistavat kuitenkin selvästi, että muutamat vasta-aineet eivät onnistuneet estämään muiden vasta-aineiden sitoutumista aktivoi- • · · ; tuihin humaani-PBL:iin, mikä viittaa siihen, että ne tunnistavat erilaisia epitooppeja humaani-gp39-molekyylien pinnalla.
Ml * · v · !!’. Hybridoomat 89-76 ja 24-31, jotka vastaavasti tuottavat vasta-aineita 89-76 ja 24- ·;** 20 31, talletettiin Budapestin säädösten mukaan The American Type Culture Collec- • » · tioniin, Parklawn Drive, Rockville, Md., syyskuun toisena päivänä vuonna 1994.
j Hybridoomalle 89-76 annettiin ATCC-tulonumero HB 11713 ja hybridoomalle 24- ; 31 annettiin ATCC-tulonumero HB 11712. Vasta-aineet 24-31 ja 89-76 ovat IgGl- • · a isotyyppiä.
• * 40 106306
Koe 3 - Hiiren gp39:ään kohdistuvat vasta-aineet
Keksinnön erässä sovellusmuodossa gp39-antagonisti on monoklonaalinen hiiren anti-gp39-vasta-aine MR1. Käytettiin seuraavaa menetelmää monoklonaalisen MR 1-vasta-aineen tuottamiseksi ja sitä voidaan käyttää muiden sellaisten vasta-5 aineiden tuottamiseen, jotka kohdistuvat gp39:ään.
Hamstereita immunisoitiin vatsakalvonontelon sisälle 5- 106:lla aktivoidulla Thl-so-lulla (dl,6) kerran viikossa kuuden viikon ajan. Kun seerumin tiitteri hiiren Thl:htä kohtaan oli suurempi kuin noin 1:10 000, solujen yhteensulauttaminen toimitettiin polyetyleeniglykolilla siten, että käytettiin immuunin hamsterin splenosyyttejä sekä 10 NS-l:tä. Kammioista saadut supematantit, jotka sisälsivät kasvavia hybridoomia, seulottiin virtaussytometrian avulla, lepäävillä ja aktivoiduilla Thl:illä. Yksi erityinen hybridooma, joka tuotti mAb:tä, joka selektiivisestä tunnisti aktivoidun Thl:n, tutkittiin edelleen ja alakloonattiin MRl.n saamiseksi. MR1 tuotettiin askiteksessa ja puhdistettiin ioninvaihto-HPLC:llä. Hybridooma MR1 on tallennettu the Ameri-15 can Type Culture Collectioniin ja sille on annettu tulonumero HB 11048.
Alan ammattimies tajuaa tai pystyy vain normaaleja rutiinimenetelmiä käyttämällä ottamaan selville samanarvoisuuksia tässä dokumentissa kuvatun keksinnön monille spesifisille sovellusmuodoille. Seuraavien vaatimusten on tarkoitus sisältää tällaiset samanarvoisuudet. Kaikkien sellaisten viitteiden ja patenttihakemusten sisällöt, jotka 20 on mainittu tässä hakemuksessa, sisällytetään esillä olevaan hakemukseen viitteinä.
• ti 1 · • · ♦ • · · • · 4 • 14 • « · • · · • · t ·«· * · • · • · · ··· • · ··· • · • · a • t1 ·
• M
• · • · • « · • « • « · I 4 I • · · • *
Claims (3)
1. Förfarande för framställning av en monoklonal antihuman-gp39-antikropp, kännetecknat av att man odlar · ’*! en hybridoma 24-31, som har deponerats med ATCC-depositionsnumret HB 11712, eller en hybridoma 89-76, som har deponerats med ATCC-depositionsnumret HB • · ♦ ’·’ * 20 11713, eller en cellinje, som producerar en antihuman-antikropp som binder densamma epitopen som antikroppen som producerats antingen med hybridoman • · · 24-31 som deponerats med ATCC-depositionsnumret HB 11712, eller med hybridoman 89-76 som deponerats med ATCC-depositionsnumret HB 11713, och ätervinner den monoklonala antihuman-gp39-antikroppen. • • · · ·...· 25 2. Hybridoma 24-31, kannetecknad av att den har deponerats med ATCC- depositionsnumret HB 11712. • · • · I I ·
1. Menetelmä monoklonaalisen anti-humaani-gp39-vasta-aineen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä viljellään hybridoomaa 24-31, joka on talletettu ATCC-talletusnumerolla HB 11712, tai hy-5 bridoomaa 89-76, joka on talletettu ATCC-talletusnumerolla HB 11713, tai solulin-jaa, joka tuottaa anti-humaani-vasta-ainetta, joka sitoo saman epitoopin kuin vasta-aine, joka on tuotettu joko hybridoomalla 24-31, joka on talletettu ATCC-talletusnumerolla HB 11712, tai hybridoomalla 89-76, joka on talletettu ATCC-talletusnumerolla HB 11713, 10 ja otetaan talteen monoklonaalinen anti-humaani-gp39-vasta-aine.
2. Hybridooma 24-31, tunnettu siitä, että se on talletettu ATCC-talletusnumerolla HB 11712.
3. Hybridooma 89-76, tunnettu siitä, että se on talletettu ATCC-talletusnumerolla HB 11713. v.: 15 Patentkrav I I « · * ·
3. Hybridoma 89-76, kannetecknad av att den har deponerats med ATCC-depositionsnumret HB 11713.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11625593A | 1993-09-02 | 1993-09-02 | |
| US11625593 | 1993-09-02 | ||
| US23292994 | 1994-04-25 | ||
| US08/232,929 US5869049A (en) | 1993-09-02 | 1994-04-25 | Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists |
| PCT/US1994/009871 WO1995006666A1 (en) | 1993-09-02 | 1994-09-02 | Anti-gp39 antibodies and uses therefor |
| US9409871 | 1994-09-02 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI960978A0 FI960978A0 (fi) | 1996-03-01 |
| FI960978A FI960978A (fi) | 1996-04-29 |
| FI106306B true FI106306B (fi) | 2001-01-15 |
Family
ID=26814047
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI960980A FI105528B (fi) | 1993-09-02 | 1996-03-01 | Menetelmiä antigeenispesifisen T-solutoleranssin indusoimiseksi |
| FI960978A FI106306B (fi) | 1993-09-02 | 1996-03-01 | Menetelmä anti-GP39-vasta-aineiden valmistamiseksi |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI960980A FI105528B (fi) | 1993-09-02 | 1996-03-01 | Menetelmiä antigeenispesifisen T-solutoleranssin indusoimiseksi |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US5747037A (fi) |
| EP (2) | EP0721469B1 (fi) |
| JP (3) | JP2991499B2 (fi) |
| CN (2) | CN100341896C (fi) |
| AT (2) | ATE188487T1 (fi) |
| AU (2) | AU696235B2 (fi) |
| DE (2) | DE69422523T2 (fi) |
| DK (2) | DK0721346T3 (fi) |
| ES (2) | ES2120067T3 (fi) |
| FI (2) | FI105528B (fi) |
| GR (2) | GR3027658T3 (fi) |
| HU (2) | HU220296B (fi) |
| IL (1) | IL110855A (fi) |
| NO (2) | NO321098B1 (fi) |
| NZ (3) | NZ273207A (fi) |
| PT (1) | PT721469E (fi) |
| WO (2) | WO1995006666A1 (fi) |
Families Citing this family (81)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5962406A (en) * | 1991-10-25 | 1999-10-05 | Immunex Corporation | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same |
| US5474771A (en) | 1991-11-15 | 1995-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same |
| US7070777B1 (en) | 1991-11-15 | 2006-07-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for inhibiting inflammation with an antibody that binds the 5C8 protein |
| JP2991499B2 (ja) * | 1993-09-02 | 1999-12-20 | トラスティーズ・オブ・ダートマス・カレッジ | 抗ｇｐ３９抗体およびその用途 |
| US5683693A (en) * | 1994-04-25 | 1997-11-04 | Trustees Of Dartmouth College | Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40 |
| US5876950A (en) * | 1995-01-26 | 1999-03-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy |
| JPH08239324A (ja) * | 1995-03-03 | 1996-09-17 | Fusanori Hamashima | 免疫抑制剤 |
| US6113898A (en) | 1995-06-07 | 2000-09-05 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies |
| US5833987A (en) * | 1995-06-07 | 1998-11-10 | Trustees Of Dartmouth College | Treatment of T cell mediated autoimmune disorders |
| US7153508B2 (en) | 1995-06-07 | 2006-12-26 | Biogen Idec Inc. | Treatment of B cell lymphoma using anti-CD80 antibodies that do not inhibit the binding of CD80 to CTLA-4 |
| US7175847B1 (en) | 1995-06-07 | 2007-02-13 | Biogen Idec Inc. | Treating intestinal inflammation with anti-CD80 antibodies that do not inhibit CD80 binding to CTLA-4 |
| US6440418B1 (en) * | 1995-11-07 | 2002-08-27 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies |
| US6001358A (en) * | 1995-11-07 | 1999-12-14 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof |
| US6340459B1 (en) | 1995-12-01 | 2002-01-22 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients |
| WO1997034633A1 (en) * | 1996-03-20 | 1997-09-25 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for inhibiting an immune response by blocking the gp39/cd40 and ctla4/cd28/b7 pathways and compositions for use therewith |
| DE19634159C1 (de) * | 1996-08-23 | 1997-09-25 | Gsf Forschungszentrum Umwelt | Induktion einer Tumorimmunität durch Injektion von Hybridzellen |
| AU4352997A (en) * | 1996-08-30 | 1998-03-19 | Genzyme Corporation | Inhibition of primary and/or secondary immune response to repeat adenoviral vector administration using cd40l specific antibodies |
| CZ244399A3 (cs) * | 1997-01-10 | 1999-10-13 | Biogen, Inc. | Použití sloučeniny anti-CD40L pro výrobu léku pro léčení imunologických onemocnění |
| US6428782B1 (en) * | 1997-05-23 | 2002-08-06 | Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. | Non-myeloablative tolerogenic treatment |
| ES2277460T3 (es) | 1998-12-14 | 2007-07-01 | Genetics Institute, Llc | Cadena del receptor de la citoquina. |
| US7553487B2 (en) * | 1998-12-14 | 2009-06-30 | Genetics Institute, Llc | Method and compositions for treating asthma |
| WO2000038708A1 (en) * | 1998-12-24 | 2000-07-06 | Phairson Medical Inc. | Treatment and prevention of immune rejection reactions |
| EP1101495A4 (en) * | 1999-06-01 | 2003-05-07 | Eisai Co Ltd | PREVENTIVE AGENTS AGAINST IDIOPATHIC THROMOBOCYTOPENIC PURPURA |
| AU5641100A (en) * | 1999-06-29 | 2001-01-31 | University Of Massachusetts | Methods for inducing t cell non-responsiveness to a tissue or organ graft |
| US20020028178A1 (en) * | 2000-07-12 | 2002-03-07 | Nabil Hanna | Treatment of B cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications |
| US20030170231A1 (en) * | 2000-03-06 | 2003-09-11 | Toshihiko Yamauchi | Remedies and preventives for antiphospholipid antibody syndrome |
| WO2001079555A2 (en) | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Roles of jak/stat family members in tolerance induction |
| CA2405632A1 (en) * | 2000-04-25 | 2001-11-01 | Idec Pharmaceutical Corporation | Intrathecal administration of rituximab for treatment of central nervous system lymphomas |
| RU2270691C2 (ru) | 2000-05-12 | 2006-02-27 | Бет Израел Диконесс Медикал Сентер, Инк. | Композиции и способы достижения иммунной супрессии |
| CA2410188A1 (en) * | 2000-06-06 | 2001-12-13 | Idec Pharmaceutical Corporation | Non-agonistic antibodies to human gp39, compositions containing, and therapeutic use thereof |
| TWI311564B (en) | 2000-07-03 | 2009-07-01 | Bristol Myers Squibb Compan | Methods for treating rheumatic diseases using a soluble ctla4 molecule |
| US20040022787A1 (en) | 2000-07-03 | 2004-02-05 | Robert Cohen | Methods for treating an autoimmune disease using a soluble CTLA4 molecule and a DMARD or NSAID |
| AU2002220165A1 (en) * | 2000-11-14 | 2002-05-27 | The University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Non-lethal methods for conditioning a recipient for bone marrow transplantation |
| US7754208B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US20030133939A1 (en) * | 2001-01-17 | 2003-07-17 | Genecraft, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US7829084B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| US20020159996A1 (en) * | 2001-01-31 | 2002-10-31 | Kandasamy Hariharan | Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders |
| US20030211107A1 (en) * | 2002-01-31 | 2003-11-13 | Kandasamy Hariharan | Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders |
| US20030103971A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-06-05 | Kandasamy Hariharan | Immunoregulatory antibodies and uses thereof |
| US20070065436A1 (en) * | 2001-01-31 | 2007-03-22 | Biogen Idec Inc. | Anti-cd80 antibody having adcc activity for adcc mediated killing of b cell lymphoma cells alone or in combination with other therapies |
| US20040058445A1 (en) * | 2001-04-26 | 2004-03-25 | Ledbetter Jeffrey Alan | Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB |
| DK1397153T3 (da) | 2001-05-23 | 2008-05-26 | Bristol Myers Squibb Co | Fremgangsmåde til beskyttelse af allogent ö-celle-transplantat ved anvendelse af oplöselige CTLA4-mutantmolekyler |
| US20050069549A1 (en) | 2002-01-14 | 2005-03-31 | William Herman | Targeted ligands |
| US20030180292A1 (en) * | 2002-03-14 | 2003-09-25 | Idec Pharmaceuticals | Treatment of B cell malignancies using anti-CD40L antibodies in combination with anti-CD20 antibodies and/or chemotherapeutics and radiotherapy |
| US20030219436A1 (en) * | 2002-03-15 | 2003-11-27 | Ledbetter Jeffrey A. | Compositions and methods to regulate an immune response using CD83 gene expressed in tumors and using soluble CD83-Ig fusion protein |
| AU2003220820A1 (en) * | 2002-04-03 | 2003-10-27 | Eisai Co., Ltd. | Remedies for pemphigus containing cd40l antagonist as the active ingredient |
| JP2006512895A (ja) * | 2002-06-28 | 2006-04-20 | ドマンティス リミテッド | リガンド |
| CN1326878C (zh) * | 2003-04-29 | 2007-07-18 | 中国抗体制药有限公司 | 抗人非何杰金淋巴瘤嵌合抗体及其衍生物与应用 |
| CA2528551A1 (en) * | 2003-06-13 | 2005-01-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Aglycosyl anti-cd154 (cd40 ligand) antibodies and uses thereof |
| AU2011224032B2 (en) * | 2003-06-13 | 2013-01-31 | Biogen Ma Inc. | Aglycosyl Anti-CD154 (CD40 Ligand) Antibodies and Uses Thereof |
| US7754209B2 (en) | 2003-07-26 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals | Binding constructs and methods for use thereof |
| DK1711528T3 (da) * | 2003-12-23 | 2012-08-20 | Genentech Inc | Behandling af cancer med hidtil ukendte anti-il 13 monoklonale antistoffer |
| US7501121B2 (en) * | 2004-06-17 | 2009-03-10 | Wyeth | IL-13 binding agents |
| US20090098142A1 (en) * | 2004-06-09 | 2009-04-16 | Kasaian Marion T | Methods and compositions for treating and monitoring treatment of IL-13-associated disorders |
| AR049390A1 (es) * | 2004-06-09 | 2006-07-26 | Wyeth Corp | Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos |
| AU2005287406B2 (en) | 2004-07-26 | 2011-08-18 | Biogen Ma Inc. | Anti-CD154 antibodies |
| US7563443B2 (en) * | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
| US8785140B2 (en) * | 2005-02-02 | 2014-07-22 | New South Innovations Pty Limited | Cd4+ Cd25+ T-cells activated to a specific antigen |
| CN100423775C (zh) * | 2005-04-15 | 2008-10-08 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 牛衣原体病灭活疫苗及其制备与检验方法 |
| PL1889065T3 (pl) | 2005-05-18 | 2013-12-31 | Novartis Ag | Metody diagnostyki i leczenia chorób posiadających składnik autoimmunologiczny i/lub zapalny |
| NI200800032A (es) * | 2005-07-25 | 2009-03-23 | Reducción de célula b utilizando moléculas de unión específicas cd37 y cd20 | |
| ES2363891T3 (es) * | 2006-03-20 | 2011-08-18 | The Regents Of The University Of California | Anticuerpos contra el antígeno de células troncales de la próstata (psca) modificados genéticamente para el direccionamiento al cáncer. |
| MX2008015524A (es) * | 2006-06-12 | 2009-01-13 | Trubion Pharmaceuticals Inc | Proteinas de union multivalentes monocatenarias con funcion efectora. |
| US8569059B2 (en) | 2006-08-02 | 2013-10-29 | Newsouth Innovations Pty Limited | Method of identifying CD4+ CD25+ T-cells activated to an antigen which express CD8 |
| JP2010527916A (ja) * | 2007-04-23 | 2010-08-19 | ワイス・エルエルシー | Ｉｌ−１３関連障害を治療する方法および組成物ならびにその治療をモニターする方法 |
| WO2009032949A2 (en) | 2007-09-04 | 2009-03-12 | The Regents Of The University Of California | High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection |
| EP2052848A1 (de) | 2007-10-27 | 2009-04-29 | Joint Solar Silicon GmbH & Co. KG | Aufbereitung von Formlingen aus Reinstsilizium |
| SI2132228T1 (sl) * | 2008-04-11 | 2011-10-28 | Emergent Product Dev Seatle | CD37 imunoterapevtik in kombinacija z njegovim bifunkcionalnim kemoterapevtikom |
| US8961991B2 (en) * | 2009-03-10 | 2015-02-24 | Baylor Research Institute | Anti-CD40 targeted fusion proteins |
| US20100069616A1 (en) * | 2008-08-06 | 2010-03-18 | The Regents Of The University Of California | Engineered antibody-nanoparticle conjugates |
| WO2010093467A1 (en) * | 2009-02-10 | 2010-08-19 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for inducing transplantation tolerance |
| WO2013013708A1 (en) | 2011-07-26 | 2013-01-31 | Fundació Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge | Treatment of acute rejection in renal transplant |
| PL3044323T3 (pl) | 2013-09-13 | 2022-06-27 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Sposoby wykrywania i ilościowego oznaczania białka komórki gospodarza w liniach komórkowych |
| NZ756750A (en) | 2013-09-13 | 2022-05-27 | Genentech Inc | Methods and compositions comprising purified recombinant polypeptides |
| MA41459A (fr) | 2015-02-03 | 2017-12-12 | Als Therapy Development Inst | Anticorps anti-cd40l et méthodes pour traiter des maladies ou des troubles liés aux cd40l |
| KR20180037984A (ko) | 2015-07-14 | 2018-04-13 | 이뮤넥스트, 인크. | 개선된 결합 특징, 기능적 특징 및 안전성 특징을 구비한 항-cd154 항체 및 인간 면역요법에서의 용도 |
| CN107921128B (zh) | 2015-08-05 | 2022-04-26 | 詹森生物科技公司 | 抗cd154抗体及其使用方法 |
| WO2017053469A2 (en) | 2015-09-21 | 2017-03-30 | Aptevo Research And Development Llc | Cd3 binding polypeptides |
| CA2946465C (en) | 2015-11-12 | 2022-03-29 | Delta Faucet Company | Ozone generator for a faucet |
| KR20200010294A (ko) | 2017-05-24 | 2020-01-30 | 에이엘에스 테라피 디벨럽먼트 인스티튜트 | 치료용 항-cd40 리간드 항체 |
| KR102142499B1 (ko) * | 2019-09-11 | 2020-08-10 | 재단법인 오송첨단의료산업진흥재단 | Ykl-40 표적 인간 단일클론항체 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5645820A (en) * | 1987-06-24 | 1997-07-08 | Autoimmune, Inc. | Treatment of autoimmune diseases by aerosol administration of autoantigens |
| US5690933A (en) * | 1989-05-31 | 1997-11-25 | Glaxo Wellcome Inc. | Monoclonal antibodies for inducing tolerance |
| US5962406A (en) * | 1991-10-25 | 1999-10-05 | Immunex Corporation | Recombinant soluble CD40 ligand polypeptide and pharmaceutical composition containing the same |
| DE69233402T3 (de) * | 1991-10-25 | 2009-06-25 | Immunex Corp., Seattle | Neue cytokine |
| US5474771A (en) * | 1991-11-15 | 1995-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same |
| CA2089229C (en) * | 1992-02-14 | 2010-04-13 | Alejandro A. Aruffo | Cd40cr receptor and ligands therefor |
| AU5098493A (en) * | 1992-08-21 | 1994-03-15 | Schering Corporation | Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40 |
| US5597563A (en) * | 1992-09-04 | 1997-01-28 | Beschorner; William E. | Method induction of antigen-specific immune tolerance |
| US5540926A (en) * | 1992-09-04 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb Company | Soluble and its use in B cell stimulation |
| JP2991499B2 (ja) * | 1993-09-02 | 1999-12-20 | トラスティーズ・オブ・ダートマス・カレッジ | 抗ｇｐ３９抗体およびその用途 |
| ZA946765B (en) * | 1993-09-02 | 1996-02-15 | Dartmouth College | Methods of prolonged suppression of humoral immunity |
| US5683693A (en) * | 1994-04-25 | 1997-11-04 | Trustees Of Dartmouth College | Method for inducing T cell unresponsiveness to a tissue or organ graft with anti-CD40 ligand antibody or soluble CD40 |
-
1994
- 1994-09-02 JP JP7508265A patent/JP2991499B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 NZ NZ273207A patent/NZ273207A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 JP JP7508291A patent/JP3007977B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 AT AT94926659T patent/ATE188487T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 EP EP94926659A patent/EP0721469B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-02 WO PCT/US1994/009871 patent/WO1995006666A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-02 CN CNB941939189A patent/CN100341896C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 DK DK94926677T patent/DK0721346T3/da active
- 1994-09-02 HU HU9600521A patent/HU220296B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 PT PT94926659T patent/PT721469E/pt unknown
- 1994-09-02 HU HU9700522A patent/HU218610B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 AU AU76429/94A patent/AU696235B2/en not_active Ceased
- 1994-09-02 EP EP94926677A patent/EP0721346B1/en not_active Revoked
- 1994-09-02 DK DK94926659T patent/DK0721469T3/da active
- 1994-09-02 DE DE69422523T patent/DE69422523T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 WO PCT/US1994/009953 patent/WO1995006481A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-02 NZ NZ549136A patent/NZ549136A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 CN CN94194007A patent/CN1127351C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 NZ NZ273221A patent/NZ273221A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 AT AT94926677T patent/ATE167062T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 ES ES94926677T patent/ES2120067T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-02 DE DE69411025T patent/DE69411025T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 IL IL11085594A patent/IL110855A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 ES ES94926659T patent/ES2143553T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/475,847 patent/US5747037A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-01 NO NO19960861A patent/NO321098B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-03-01 FI FI960980A patent/FI105528B/fi active
- 1996-03-01 NO NO19960862A patent/NO321036B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-03-01 FI FI960978A patent/FI106306B/fi active
-
1997
- 1997-08-21 AU AU35183/97A patent/AU707110B2/en not_active Ceased
-
1998
- 1998-03-27 US US09/049,043 patent/US5876718A/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-30 US US09/069,871 patent/US6312692B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-08-14 GR GR980401834T patent/GR3027658T3/el unknown
- 1998-10-01 US US09/164,568 patent/US7722874B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-12 JP JP10289353A patent/JP3098739B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-03-29 GR GR20000400784T patent/GR3033095T3/el not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-04-17 US US11/405,876 patent/US20060222649A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI106306B (fi) | Menetelmä anti-GP39-vasta-aineiden valmistamiseksi | |
| US5869049A (en) | Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists | |
| AU710925B2 (en) | Methods for inducing T cell tolerance to a tissue or organ graft | |
| FI106927B (fi) | Menetelmä sen määrittämiseksi, onko antigeeni TD-antigeeni vai TI-2-antigeeni | |
| AU678532C (en) | Methods for inducing antigen-specific T cell tolerance |