FI106927B - Menetelmä sen määrittämiseksi, onko antigeeni TD-antigeeni vai TI-2-antigeeni - Google Patents
Menetelmä sen määrittämiseksi, onko antigeeni TD-antigeeni vai TI-2-antigeeni Download PDFInfo
- Publication number
- FI106927B FI106927B FI960979A FI960979A FI106927B FI 106927 B FI106927 B FI 106927B FI 960979 A FI960979 A FI 960979A FI 960979 A FI960979 A FI 960979A FI 106927 B FI106927 B FI 106927B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- cells
- cell
- antibodies
- Prior art date
Links
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 132
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 132
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 129
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 claims abstract description 117
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 claims abstract description 112
- 101000759376 Escherichia phage Mu Tail sheath protein Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims abstract description 44
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 claims abstract description 38
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 43
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 claims description 31
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 claims description 29
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 28
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 14
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 claims 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 abstract description 19
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 15
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract description 10
- 239000012636 effector Substances 0.000 abstract description 4
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 abstract description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 46
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 38
- 230000004044 response Effects 0.000 description 34
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 34
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 32
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 29
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 26
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 23
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 18
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 15
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 14
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 13
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 12
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 12
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 12
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 11
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 10
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 9
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 9
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 101710131437 Gene 39 protein Proteins 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 7
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 7
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 7
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 7
- 108010066813 Chitinase-3-Like Protein 1 Proteins 0.000 description 6
- 102000018704 Chitinase-3-Like Protein 1 Human genes 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 102100038196 Chitinase-3-like protein 1 Human genes 0.000 description 5
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 5
- 101000883515 Homo sapiens Chitinase-3-like protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 5
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 5
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 5
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 5
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 102000008203 CTLA-4 Antigen Human genes 0.000 description 3
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 206010066130 hyper-IgM syndrome Diseases 0.000 description 3
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 201000007155 CD40 ligand deficiency Diseases 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N Cyclosporin A Chemical compound CC[C@@H]1NC(=O)[C@H]([C@H](O)[C@H](C)C\C=C\C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C1=O PMATZTZNYRCHOR-CGLBZJNRSA-N 0.000 description 2
- 229930105110 Cyclosporin A Natural products 0.000 description 2
- 108010036949 Cyclosporine Proteins 0.000 description 2
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000889276 Homo sapiens Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 2
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 2
- 210000000447 Th1 cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000006391 Type 1 Hyper-IgM Immunodeficiency Syndrome Diseases 0.000 description 2
- 201000001696 X-linked hyper IgM syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N chlorobutanol Chemical compound CC(C)(O)C(Cl)(Cl)Cl OSASVXMJTNOKOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001265 ciclosporin Drugs 0.000 description 2
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 229930182912 cyclosporin Natural products 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 2
- 210000001280 germinal center Anatomy 0.000 description 2
- 208000026095 hyper-IgM syndrome type 1 Diseases 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 229940124589 immunosuppressive drug Drugs 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 108010042685 trinitrophenyl keyhole limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- HLXHCNWEVQNNKA-UHFFFAOYSA-N 5-methoxy-2,3-dihydro-1h-inden-2-amine Chemical compound COC1=CC=C2CC(N)CC2=C1 HLXHCNWEVQNNKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 235000003332 Ilex aquifolium Nutrition 0.000 description 1
- 235000002296 Ilex sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002294 Ilex volkensiana Nutrition 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000542855 Megathura crenulata Species 0.000 description 1
- 102400001132 Melanin-concentrating hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100394237 Mus musculus Hand1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010032605 Nerve Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710126321 Pancreatic trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000932075 Priacanthus hamrur Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 102100033725 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 16 Human genes 0.000 description 1
- 239000003070 absorption delaying agent Substances 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007503 antigenic stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008614 cellular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 229960004926 chlorobutanol Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- -1 coatings Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K dihydroxy(stearato)aluminium Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)O[Al](O)O UGMCXQCYOVCMTB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N diisopropyl fluorophosphate Chemical compound CC(C)OP(F)(=O)OC(C)C MUCZHBLJLSDCSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000003292 diminished effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005051 fluostigmine Drugs 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 239000004088 foaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003297 immature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 230000030214 innervation Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000004153 islets of langerhan Anatomy 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003519 mature b lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007799 mixed lymphocyte reaction assay Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003742 phenol Drugs 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000005212 secondary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009044 synergistic interaction Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010055746 trinitrophenyl-bovine serum albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
106927
Menetelmiä sen määrittämiseksi, onko antigeeni TD-antigeeni vai ΤΊ-2-antigee-ni
Keksinnön tausta 5 Immuunijärjestelmä pystyy tuottamaan vierasta antigeeniä kohtaan kahta tyyppiä antigeenispesifisiä vasteita. Soluvälitteinen immuniteetti on termi, jota käytetään, kun tarkoitetaan T-lymfosyyttien välittämän immuunijäijestelmän efektorifunktioita. Humoraalinen immuniteetti on termi, jota käytetään merkitsemään antigeenispesifis-ten vasta-aineiden tuottoa B-lymfosyyteillä. On kauan ymmärrelty, että humoraali-10 sen immuniteetin kehittyminen useimpia antigeenejä kohtaan ei vaadi vain vasta-ainetta tuottavia B-lymfosyyttejä, vaan myös auttaja-T-lymfosyyttien (tässä dokumentissa myöhemmin nimitetty Th:ksi) osallistumista. Mitchison, Eur. J. Immunol., 1; 18-25 (1971); Claman ja Chaperon; Transplant Rev., 1, 92-119 (1969); Katz et ai., Proc. Natl. Acad. USA, 70, 2624 2629 (1973); Raff et ai., Nature, 226, 1257-1260 15 (1970). Th-solut saavat aikaan tiettyjä signaaleja eli "apua" vasteena tyymuksesta riippuvaisten antigeenien (tässä dokumentissa myöhemmin TD) stimulaatiolle. Vaikka Th-solujen vapauttamat liukoiset molekyylit välittävät B-lymfosyyttien apua (esimerkiksi lymfokiinejä, kuten IL-4:ää ja IL-5:ttä) B-solujen aktivaatio vaatii myös kosketusta edellyttävää vuorovaikutusta B- ja Th-solujen välillä. Hirohata et ai., J. 20 Immunol., 140, 3736-3744 (1988); Bartlett et ai., J. Immunol., 143, 1745-1754 (1989). Tämä ilmaisee, että B-solun aktivoitumiselle on välttämätöntä B- ja Th-.! solujen pinnalla sijaitsevien molekyylien välisen vuorovaikutus. Tällaista vuorovai- *... kutusta tukee edelleen havainto, että aktivoitujen T-solujen eristetyt plasmamem- *·*/ braanit voivat saada aikaan auttajafunktioita, jotka ovat välttämättömiä B-solun akti- *···* 25 voitumiselle. Brian, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 564- 568 (1988); Hodgin et ai., J. Immunol., 145, 2025-2034 (1990), Noelle et ai., J. Immunol., 146, 1118-1124 (1991).
..... Epäkypsien sekä kypsien B-lymfosyyttien pinnalla on tunnistettu solun pintamole- kyyli CD40, joka silloittuessaan vasta-aineiden kanssa saa aikaan B-solun prolife-30 raation. Valle et ai., Eur. J. Immunol., 19, 1463-1467 (1989); Gordon et ai., J. Immunol., 140, 1425-1430 (1988); Gruber et ai., J. Immunol., 142, 4144-4152 (1989). CD40-molekyyli on kloonattuja karakterisoitu. Stamenkovic et ai., EMBO J., 8, .... 1403-1410 (1989). CD40:n ligandin eli gp39:n molekyyli (nimitetty myös CD40- ligandiksi eli CD40L:ksi) on myös kloonattuja karakterisoitu. Armitage et ai., Natu-" 35 re, 357, 80-82 (1992); Lederman et ai., J. Exp. Med., 175, 1091-1101 (1992); Hoi- 2 106927 leribaugh et ai., EMBO J., 11, 4313-4319 (1992). Gp39-proteiini ilmentyy aktivoiduilla mutta ei ilmenny lepäävillä CD4+-Th-soluilla. Spriggs et ai., J. Exp. Med., 176, 1543-1550 (1992); Lane et ai., Eur. J. Immunol., 22, 2573-2578 (1992); Roy et ai., J. Immunol., 151, 1-14 (1993). Sellaiset solut, jotka on transfektoitu gp39-gee-5 nillä ja jotka ilmentävät gp39-proteiinia pinnallaan, voivat laukaista B-solun prolife-raation ja yhdessä muiden stimuloivien signaalien kanssa ne voivat saada aikaan vasta-aineen tuoton. Armitage et ai, Nature, 357, 80-82 (1992); Hollenbaugh et ai, EMBO J., 11, 4313-4319 (1992).
Vaikka humoraalisen immuunivasteen induktio on isännän tärkeä puolustusmeka-10 nismi, tietyissä tilanteissa olisi hyödyllistä tukahduttaa määrätyn antigeenin vasta-aineen tuotto. Humoraalisen vasteen induktion tukahduttaminen allergeenia vastaan voisi esimerkiksi estää yksilön allergisen vasteen tai vähentää sitä. Kun terapeuttista vasta-ainetta annetaan, humoraalisen vasteen tukahduttaminen vasta-ainetta vastaan voisi lisäksi pidentää vasta-aineen terapeuttista tehoa.
15 Keksinnön yhteenveto
Eräs lähestymistapa humoraalisen immuniteetin tukahduttamiseksi on inhiboida B-solun aktivointi. Menetelmässä humoraalisen immuunivasteen inhiboimiseksi TD-antigeenia vastaan in vivo inhiboidaan Th-solun kyky stimuloida B-solua, sillä tavalla häiritään B-solun aktivointia ja vasta-aineen tuottoa. Th-solun pinnalla sijaitse-20 van gp39:n ja B-solun pinnalla sijaitsevan CD40:n vuorovaikutus in vivo on välttä-<;«. mätöntä B-solun myöhemmälle aktivoinnille. Sellaisia gp39:n antagonisteja, jotka .! ovat tehokkaita inhiboitaessa gp39:n vuorovaikutusta CD40:n kanssa in vivo, anne taan kohteelle TD-antigeenin kanssa humoraalisen immuniteetin tukahduttamiseksi *·*/ TD-antigeeniä vastaan. Annettu gp39-antagonisti voi olla vasta-aine, joka on suun- '···* 25 nattu gp39:ää vastaan. Gp39-vasta-aine on edullisessa sovellusmuodossa monoklo- naalinen vasta-aine, kuten esimerkiksi anti-humaani-gp39-vasta-aine tai anti-hiiri- • · · : gp39-vasta-aine (esimerkiksi MR1). Gp39-antagonisti voi olla vaihtoehtoisesti gp39:n ligandin CD40:n liukoinen muoto.
··» • « « · II^ Inhiboitu humoraalinen immuunivaste voi olla primaarinen humoraalinen immuuni- '1' 30 vaste, silloin kun kysymyksessä on alkualtistus antigeenille, tai se voi olla sekundaa- :, \ · rinen humoraalinen immuunivaste siinä tapauksessa, että kysymyksessä on uusinta- altistus antigeenille, joka on kohdattu aiemmin. Tässä dokumentissa kuvattuja mene- t# telmiä voidaan käyttää esimerkiksi inhiboitaessa antigeenille spesifisten IgM-, IgG-, • ·
IgD- ja (tai) IgE-vasta-aineiden tuotto. Menetelmät saavat lisäksi aikaan humoraalis-35 ten immuunivasteiden suppression in vivo.
3 106927 Tässä kuvataan menetelmiä TD-antigeenien vastaisten humoraalisten immuunivasteiden inhiboimiseksi. Sellaisiin antigeeneihin, jotka keksintö sulkee piiriinsä, sisältyy antigeenejä, joita kohtaan spesifisen vasta-aineen tuotto edellyttää gp39:n vuorovaikutusta B-solujen pinnalla sijaitsevan ligandin (esimerkiksi CD40) kanssa. TD-5 antigeeneihin tavallisesti kuuluu proteiiniantigeenejä. Keksinnön edullisissa sovel-lusmuodoissa antigeeni on terapeuttinen vasta-aine, lääke, allergeeni tai vieras solu. Esitetyt menetelmät ovat tehokkaita myös silloin, kun inhiboidaan humoraalisia immuunivasteita TD-antigeeniä kohtaan, vaikka ne säilyttävät humoraaliset immuunivasteet kateenkorvasta riippumattomille tyypin II (tässä dokumentissa myöhemmin 10 nimitetty TI-2-antigeeneiksi) antigeeneille.
Esitetään myös menetelmiä aktivoitujen Th-solujen auttajafunktion spesifiseksi inhiboimiseksi in vivo siten, että antamalla gp39-antagonistia häiritään gp39:n vuorovaikutusta B-solujen pinnan ligandin (esimerkiksi CD40:n kanssa) kanssa. Aktivoitujen Th-solujen auttajafunktio inhiboidaan tämän keksinnön mukaan in vivo poistamatta 15 Th-soluja tai vähentämättä niiden energiaa.
Esitetään lisäksi humoraalisten immuunivasteiden inhibointimenetelmiä m vivo, joissa menetelmissä käytetään gp39-antagonistin ja muun immunosupressiivisen agenssin yhdistettyä antoa. Muihin immunosupressiivisiin agensseihin, joita voidaan antaa yhdessä gp39-antagonistin kanssa, kuuluu sytokiinin inhibiittoreita, inhibiitto-20 reita sellaisia T-solun teitä varten, joita CD28 ja CTLA4 yhdessä stimuloivat, tai im-munosupressiivisia lääkeaineita.
4 4 4 4 4 • 4 4 : ·, Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan menetelmä sen määrittämi- 4 4 4 ]. ·. t seksi, onko antigeeni TD- vai TI-2-antigeeni. Tämä voidaan määrittää sen perusteel- 4 4 1 la, voidaanko vai ei antigeeniin kohdistuvat ei-humoraaliset immuunivasteet inhiboi- « · *··;’ 25 da gp39-antagonistilla.
• · · • · · • · 4
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
... Lyhyt kuvioiden kuvaus » · • 4 • · · ·'[*: Kuvio IA on pylväsdiagrammi, joka kuvaa primaarisen anti-SRBC-IgM-vasta-aine- . j. tuoton supressiota anti-gp39-käsittelyllä in vivo.
4 :...: 30 Kuvio IB on graafinen esitys, joka kuvaa primaarisen anti-SRBC-IgM-vasta-aineen . ·. : tuoton pitkällistä supressiota lyhytaikaisen anti-gp39-käsittelyn jälkeen in vivo.
4 4 106927
Kuvio 2A on pylväsdiagrammi, joka kuvaa sekundaarisen anti-KLH-vasta-aineen (erilaisten isotyyppien) tuoton supressointia anti-gp39-käsittelyllä in vivo. Vasta-ai-netiitterit mitattiin seitsemän päivän kuluttua antigeeniherätteestä eli testiannoksesta.
Kuvio 2B on pylväsdiagrammi, joka kuvaa sekundaarisen anti-KLH-vasta-aineen 5 (erilaisten isotyyppien) supressointia anti-gp39-käsittelyllä in vivo, Vasta-ainetiitte-rit mitattiin 14 päivän kuluttua vasta-aineherätteestä.
Kuvio 3 on graafinen pylväsdiagrammi, jossa on kaksi pylvästä, jotka kuvaavat primaarisen anti-ChiL6-IgM-vasta-aineen tuoton (vasen) ja sekundaarisen anti-ChiL6-IgG-vasta-aineen tuoton (oikea) supressiota, jonka an-gp39-käsittely in vivo saa ai-10 kaan.
Kuvio 4A on graafinen pylväsdiagrammi, joka kuvaa primaarisen anti-TNP-IgM-vasta-aineen tuoton supressiota, joka saadaan aikaan immunisoimalla TNP-SRBC:llä ja anti-gp39-käsittelyllä in vivo.
Kuvio 4B on graafinen pylväsdiagrammi, joka kuvaa primaarisen anti-TNP-IgM-15 vasta-aineen tuoton supressiota, joka saadaan aikaan immunisoimalla TNP-Ficollilla ja anti-gp39-käsittelyllä in vivo.
Kuvio 5 on graafinen pylväsdiagrammi, joka esittää toimintakykyistä sellaisten T-solujen auttaja-aktiivisuutta, jotka on asetettu alttiiksi anti-gp-käsittelylle in vivo, sen jälkeen kun mainitut T-solut on adoptiivisesti siirretty käsittelemättömiin hiiriin, : 20 ja diagrammi havainnollistaa sen, että anti-gp39:n anto ei poista Th-solujen toimin- : ‘ , takykyä.
t t I
Kuvio 6A on Westem-blotti, joka kuvaa anti-gp39-aktiivisuutta seerumissa 7, 14 ja • · ’···’ 21 päivän kuluttua annon jälkeen in vivo.
« * *
• · I
·»«
Kuvio 6B on graafinen esitys, joka kuvaa jäljelle jäänyttä anti-gp39-aktiivisuutta 25 seerumissa 7, 14 ja 21 päivän kuluttua annon jälkeen in vivo.
··· *···* Kuviot 7A, B ja C ovat virtaussytometrillä saatujen tulosten profiilikuvia, jotka esit- ‘: tävät ihmisen perifeerisen veren kuusi tuntia aktivoitujen lymfosyyttien värjäytymis- : tä joko CD40Ig:llä (osakuvio A), mAb-4D9-8:lla (osakuvio B) tai mAb-4D9-9:llä . · · ·. (osakuvio C).
« « » 30 Kuviot 8A, B ja C ovat virtaussytometrillä saatujen tulosten profiilikuvia, jotka •; · · > esittävät ihmisen perifeerisen veren kuusi tuntia aktivoitujen sellaisten lymfosyyttien j 106927 värjäytymistä joko mAb-4D9-8:lla (osakuva A), mAb-4D9-9:llä (osakuva B) tai CD40Ig:llä (osa kuva C), joita on viljelty sykloporiinin läsnäollessa.
Kuviot 9A ja B ovat virtaussytometrillä saatujen tulosten profiilikuvia, jotka esittävät ihmisen perifeerisen veren lymfosyyttejä, joita on aktivoitu kuusi tuntia 5 CD40Ig:llä leimaamattoman mAb-4D9-8:n (osakuvio A) tai leimaamattoman mAb-4D9-9:n (osakuvio B) läsnäollessa.
Kuvio 10 on graafinen esitys, joka kuvaa liukoisella gp39:llä ja IL-4:llä indusoidun humaani-B-solujen proliferaation inhibitiota, joka saadaan aikaan, kun soluja viljellään anti-humaani-gp39:n monoklonaalisten vasta-aineiden 4D9-8:n, 4D9-9:n, 24-10 3 l:n, 89-76:n tai 89-79:n läsnäollessa.
Kuvio 11 on graafinen esitys, joka kuvaa allo-spesifisen seoslymfosyyttivasteen inhibitiota, kun soluja viljellään anti-humaani-gp39:n monoklonaalisten vasta-aineiden 24-31 tai 89-79 läsnäollessa.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 15 Humoraalisen immuniteetin tuotto tyymuksesta riippuvaisia (TD) antigeenejä kohtaan ei vaadi vain B-lymfosyyttejä, jotka voivat tuottaa spesifisiä vasta-aineita antigeeniä kohtaan, vaan se tarvitsee myös apua Th-soluilta, jotka ovat välttämättömiä B-lymfosyyttien aktivaatiolle. Vaikka T-auttajasolun toimintaan sisältyy sellaisten sytokiinien tuotto, joita B-lymfosyytit käyttävät hyväksi, Th-solujen välttämättö-. i : 20 myyttä B-solun aktivaatiolle ei voida poistaa siten, että B-soluille annetaan eksogee- : ‘ . nisiä sytokiinejä. Kontaktia edellyttävä, solumembraanin välittämä vuorovaikutus B- ja Th-solujen välillä on pikemminkin humoraalisten vasteiden indusoinnin olennai-.·*·. nen osa. On identifioitu tähän vuorovaikutukseen liittyvä reseptori-ligandipari, CD40 ja gp39. CD40 on B-solujen pinnalla, ja sillä on kyky sitoutua gp39:ään, joka • · · 25 saadaan aikaan Th-solujen pinnalla aktivaation jälkeen ja joka johtaa B-solujen sti- * mulointiin ja viime kädessä spesifisten vasta-aineiden tuottoon. CD40-gp39-vuoro- vaikutuksen hajoaminen tarjoaa keinot häiritä spesifisen humoraalisen immuunivas- *···* teen tuottoa.
··» • · • · · Tämä hakemus koskee näin ollen TD-antigeenin vastaisten humoraalisten immuuni-30 vasteiden inhibointimenetelmiä m vivo. Humoraaliset immmunivasteet inhiboidaan '···' siten, että häiritään vuorovaikutusta Th-solun pinnalla sijaitsevan molekyylin, joka välittää auttajaefektoritoimintaa, jonka edellytyksenä on kosketus, ja mainitun mole-·:··: kyylin sellaisen ligandin kanssa, joka sijaitsee B-lymfosyytin pinnalla. Edullisessa sovellusmuodossa humoraaliset immuunivasteet inhiboidaan häiritsemällä T-solun 6 106927 pinnalla sijaitsevan gp39:n ja B-solun, joka on alttiina TD-antigeenille, pinnalla sijaitsevan CD40:n välistä vuorovaikutusta siten, että kohteelle annetaan gp39-antago-nistia in vivo. Eräässä sovellusmuodossa B-solu altistetaan TD-antigeenille siten, että antigeeni annetaan in vivo gp39-antagonistin kanssa. Tämä TD-antigeeni on 5 mieluummin terapeuttinen agenssi, esimerkiksi terapeuttinen vasta-aine tai lääke, jonka annon tarkoitus on hoitaa potilasta ja jonka suhteen humoraalisten vasteiden inhibointi sitä vastaan voi tuottaa tulokseksi agenssin pitkällisen terapeuttisen tehon. Toisessa sovellusmuodossa TD-antigeeni on antigeeni, jolle henkilö on alttiina ympäristön taholta, esimerkiksi mainittu antigeeni on allergaani, jolloin humoraalinen 10 vaste on kohteelle haitallinen, se tuottaa esimerkiksi allergisen reaktion. Humoraali-sen immuunivasteen inhibitio tekisi tässä tilanteessa hoidon kannalta hyvää potilaalle.
I. GP39-antagonistit
Esitettyjen menetelmien mukaan gp39-antagonistia annetaan kohteelle, jotta häiri-15 tään T-solujen pinnalla sijaitsevan gp39:n vuorovaikutusta B-solujen pinnalla sijaitsevan gp39-ligandin välillä. Gp39-antagonisti määritellään molekyyliksi, joka häiritsee tätä vuorovaikutusta. GP39-antagonisti voi olla vasta-aine, joka kohdistuu gp39:ää vastaan (esimerkiksi monoklonaalinen gp39:n vasta-aine). Mainittuna antagonistina voi olla gp39:n vasta-aine, sen fragmentteja tai johdannaisia (esimerkiksi 20 Fab tai F(ab)'2-fragmentteja, kimeerisiä tai ihmiskäyttöön sopivaksi tehtyjä vasta-aineita) gp39:n ligandin liukoisia muotoja (esimerkkinä liukoinen CD40), gp-39:n : ligandin fuusioproteiinin liukoisia muotoja (esimerkkinä liukoinen CD40Ig) tai far- i' ·.. maseuttisia agensseja, jotka estävät gp39-CD40-vuorovaikutuksen.
« · · L. A. Vasta-aineet • · • · • · · 25 Nisäkäs (esimerkiksi hiiri, hamsteri tai kani) voidaan immunisoida gp39-proteiinin tai proteiinifragmentin immunogeenisellä muodolla (esimerkiksi peptidifragmentil-la), joka saa vasta-ainevasteen esiin nisäkkäässä. Sellaista solua, joka ilmentää pin-.···. nallaan gp39:ää, voidaan myös käyttää immunogeeninä. Vaihtoehtoisiin immuno- .···. geeneihin kuuluu puhdistettu gp39-proteiini tai sen puhdistettuja proteiinifragment- *·’ 30 teja. GP39 voidaan puhdistaa normaalein puhdistustekniikoin solusta, joka ilmentää i sitä; gp39-cDNA (Armitage et ai., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et ai., J.
Exp. Med., 175: 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et ai, EMBO J., 11, 4313-4319 .···. (1992) voidaan ilmentää isäntäsolussa, esimerkiksi bakteeri- tai nisäkässolulinjassa . . ja gp-proteiini voidaan puhdistaa. GP39-peptidejä voidaan syntetisoida gp39:n ami- 35 nohapposekvenssin mukaan (Armitage et ai, Nature, 357, 80-82 (1992); Lederman 7 106927 et ai., J. Exp. Med., 175, 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et ai., EMBO J., 11, 4313-4319 (1992)). Sellaisiin tekniikoihin, joilla proteiinille saadaan aikaan immu-nogeenisuus, kuuluu proteiinin konjugointi kantaja-aineisiin tai muita tunnettuja tekniikan tason mukaisia menttelytapoja. Proteiini voidaan antaa esimerkiksi adju-5 vantin kanssa. Vasta-aineiden muodostuksen kulkua voidaan seurata siten, että ilmaistaan vasta-ainetiitterit plasmassa tai seerumissa. Vasta-aineiden määrän määrittämiseen voidaan käyttää normaalia ELISAa tai muita immunologisia pitoisuus-määrityksiä siten, että immunogeeniä käytetään antigeeninä.
Immunisaation jälkeen voidaan saada antiseerumeita ja, jos halutaan, niistä voidaan 10 eristää polyklonaaliset vasta-aineet. Monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi voidaan immunisoiduista eläimistä koota vasta-aineita tuottavia soluja (lymfosyyttejä) ja sulauttaa ne myeloomasolujen kanssa normaalein somaattisen solun fuusiome-nettelytavoin, tehdä ne täten kuolemattomiksi ja tuottaa hybridoomasoluja. Tällaiset tekniikat ovat tekniikan tason mukaan hyvin tunnettuja. Esimerkiksi kehitettiin hyb-15 ridoomatekniikka, jonka kehittäjät olivat alunperin Kohler ja Milstein (Nature (1975) 256, 495-497) samoin kuin muita tekniikoita, kuten esimerkiksi humaani-B-soluhybridoomatekniikka (Kozbar et ai., Immunol. Today (1983) 4, 72), EBV-hyb-ridoomatekniikan ihmisen monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamiseksi (Cole et ai., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985) (Allen R. Bliss, Inc., sivuilla 20 77-96) sekä kombinaatiovasta-ainekirjastojen seulonta (Huse et ai., Science (1989) 246, 1275). Hybridoomasoluja voidaan immunokemiallisesti seuloa sellaisten vasta-aineiden tuoton suhteen, jotka reagoivat spesifisesti proteiinin tai peptidin ja eris- 1 1 ' ' tettyjen monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa.
t I
Tässä dokumentissa käytetyn termin vasta-aine tarkoituksena on sisältää vasta-ai- . · · *. 25 neen fragmentit, j otka myös reagoivat spesifisesti gp3 9-proteiinin tai sen peptidin tai . .·. gp39-fuusioproteiinin kanssa. Vasta-aineet voidaan fragmentoida tavanomaisia tek- • · · niikoita käyttämällä ja fragmentit voidaan seuloa niiden käyttökelpoisuuden suhteen • · · * samalla tavalla kuin edellä kuvattiin täydellisten vasta-aineiden kohdalla. F(ab')2- ... fragmentteja voidaan tuottaa esimerkiksi siten, että vasta-ainetta käsitellään pepsii- • * 30 nillä. Saatua F(ab')2-fragmenttia voidaan käsitellä disulfidisiltojen pelkistämiseksi, *···: jotta tuotetaan Fab-fragmentteja. Esillä olevan keksinnön mukaisen vasta-aineen on • : ‘: tarkoitettu käsittävän vielä kaksoisspesifiset ja kimeeriset molekyylit, joissa on anti- gp39-osa.
• : .: Kun muissa kohteissa kuin ihmisissä tuottettuja vasta-aineita käytetään hoitotarkoi- •: · ·: 35 tuksessa ihmisellä, ne tunnistetaan vaihtelevassa määrin vieraiksi, ja ne voivat tuot taa potilaassa immuunivasteen. Eräs tapa vähentää tätä ongelmaa tai poistaa se, mi- 8 106927 kä on suotavampaa yleistä immunosupressiota kohtaan, on tuotaa kimeerisiä vasta-ainejohdannaisia, se on, vasta-ainemolekyylejä, joissa on sekä ei-humaani, eläinperäinen vaihteleva alue sekä ihmisperäinen muuttumaton alue. Kimeerisiin vasta-ai-nemolekyyleihin voi sisältyä esimerkiksi antigeenin sitova domeeni, joka on peräisin 5 hiiren rotan tai muiden lajien vasta-aineista, ihmisperäisten muuttumattomien alueiden kanssa. On kuvattu kimeeristen vasta-aineiden useita valmistustapoja ja niitä voidaan käyttää sellaisten kimeeristen vasta-aineiden valmistukseen, jotka sisältävät immunoglobuliinin vaihtelevan alueen, joka tunnistaa gp39:n. Katso esimerkiksi seuraavia julkaisuja: Morrison et ai., Proc. Natl. Scad. Sei. U.S.A. 81, 6851 (1985); 10 Takeda et ai., Nature 314, 452 (1985), Cabilly et ai., US-patentti 4 816 567; Boss et ai., US-patentti nro 4 816 397; Tanaguchi et ai., EP-patenttijulkaisu 171496; EP-patenttijulkaisu 0173495, GB-patenttijulkaisu 2 177 096 B. Otaksutaan, että tällaiset kimeeriset vasta-aineet voisivat olla humaani kohteessa vähemmän immunogeenisiä kuin vastaava ei-kimeerinen vasta-aine.
15 Sellaisia monoklonaalisia tai kimeerisiä vasta-aineita, jotka spesifisesti pystyvät reagoimaan gp39-proteiinin tai -peptidin kanssa, voidaan tehdä terapeuttisia tarkoituksia varten ihmiselle käyttökelpoisiksi siten, että tuotetaan humaani muuttumattoman alueen kimeereja, joissa vaihtelevien alueiden osat, erityisesti antigeeniä sitovan domeenin muuttumattomat runkoalueet ovat ihmiseltä peräisin ja ainoastaan hyper-20 variaabelit alueet ovat ei-ihmisperäisiä. Tällaisia muutettuja immvmoglobuliinimole-kyylejä voidaan valmistaa jollain useista tunnetuista, tekniikan tason mukaisista menettelytavoista (esim. Teng et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80, 7308-7312 ’·' ' (1983); Kozbor et ai., Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et ai., Meth. En- 1 * zymol., 92, 3-16 (1982)), ja ne valmistetaan mieluummin sellaisten opetusten mu- v · 25 kaisesti, jotka esitetään PCT-julkaisussa WO92/06193 tai EP 0239400. Ihmiskäyt- « · · töön sopivaksi tehdyt vasta-aineet voivat olla esimerkiksi Scotgen Limitedin, 2 : Holly Road, Twickenham, Middlesex, Iso-Britannia, tuottamia.
• · · ^ « · · • · «
Toinen menetelmä, jolla tuotetaan spesifisiä vasta-aineita tai vasta-aineffagmentteja, jotka pystyvät reagoimaan gp39-proteiinia tai -peptidiä vastaan, on, että gp39-prote- • ♦ 30 iinin tai -peptidin kanssa seulotaan ilmentymiskirjastoja, jotka koodittavat tällaisia • · immunoglobuliinin geenejä tai niiden osia. Täydellisiä Fab-ffagmentteja, VH- ja Fv-: : alueita esimerkiksi voidaan ilmentää bakteereissa siten, että käytetään faagi-ilmenty- .···. miskirjastoja. Katso esimerkiksi julkaisua Ward et ai., Nature, 341, 544-546 (1989); ·’ Huse et ai., Science, 246, 1275-1281 (1989) sekä McCafferty et ai., Nature, 348, 35 552-554 (1990). Tällaisia kirjastoja seulomalla esimerkiksi gp39-peptidin kanssa voidaan identifioida immunoglobuliinifragmentteja, jotka pystyvät reagoimaan 9 106927 gp39:n kanssa. Vasta-aineita tai niiden fragmentteja voidaan tuottaa vaihtoehtoisesti SCID-hu-hiiressä, jonka Genpharm on kehittänyt.
B. Liukoiset gp39:n ligandit
Muut gp39:n antagonistit, joita voidaan antaa humoraalisen immuniteetin tukahdut-5 tamiseksi, ovat gp39:n ligandin liukoisia muotoja. Monovalenttinen, liukoinen gp39:n ligandi voi sitoa gp39:n, se inhiboi tällä tavalla gp39:n vuorovaikutuksen CD40:n kanssa B-solujen pinnalla. Termi liukoinen ilmaisee, että ligandi ei ole kestävästi liittynyt solumembraaniin. Liukoinen gp39-ligandi voidaan valmistaa kemiallisen synteesin avulla tai mieluummin yhdistelmä-DNA-tekniikoilla. Edullinen 10 liukoinen gp39-ligandi on liukoinen CD40. Liukoinen gp39-ligandi voi olla vaihtoehtoisesti fuusioproteiinimuodossa. Tällainen fuusioproteiini käsittää ainakin gp39-ligandin osan, joka on kiinnittynyt toiseen molekyyliin. CD40 voidaan ilmentää esi-merkisi fuusioproteiinina immunoglobuliinin kanssa (CD40Ig). Eräässä sovellus-muodossa tuotetaan fuusioproteiinia, joka käsittää CD40:n solunulkoisen domeeni-15 osan aminohappotähteitä, jotka ovat liitetyt sekvenssin aminohappotähteisiin, jotka vastaavat saranaa, Cxl:n CH2-ja CH3-alueita, jotta CD40Ig-fuusioproteiini muodostuu (katso esimerkiksi Linsley et ai. (1991) J. Exp. Med. 1783, 721-730; Capon et ai. (1989) Nature 337, 525-531; sekä Capon US-patentti 5 116 964). Fuusioproteiini voidaan tuottaa kemiallisen synteesin avulla tai mieluummin yhdistelmä-DNA-tek-20 nilkoilla, jotka perustuvat CD40:n cDNA:han (Stamenkovic et ai., EMBO L, 8, 1403-1410 (1989)).
•«« « « . II. Antigeenit, joiden vastainen humoraalinen immuniteetti tukahdutetaan •« · : Keksintö suunnataan sellaisiin antigeeneihin kohdistuvan humoraalisen immunitee- • · · tin tukahduttamiseen, jotka vaativat kontaktia edellyttäviä auttajatoimintoja, joita : 25 Th-solut antavat. Klassisesta tyymuksesta riippuvaisiksi antigeeneiksi (TD) luokitel- lut antigeenit sisältyvät keksintöön. Th-solujen suoman, kontaktia edellyttävän "avun" tarve voi johtua T-solujen pinnalla sijaitsevan gp39:n ja B-solujen pinnalla _ .···. sijaitsevan CD40:n välisen vuorovaikutuksen välttämättömyydestä. Kuten esillä ole- j", vassa keksinnössä määritellään, termin "TD-antigeeni" tarkoitus on käsittää antigee- *!* 30 nit, jotka vaativat gp39-CD40-vuorovaikutusta T- ja B-solujen välillä humoraalisen :. i i immuunivasteen indusoimiseksi antigeeniä vastaan. Proteiiniantigeenit ovat tavalli- sesti TD-antigeenejä. TD-antigeenin toinen muoto, jonka keksintö sisältää, on mole-. · · . kyyli, jota sanotaan hapteeniksi ja joka on kytketty proteiiniin. Proteiini toimii tässä .'. *; tapauksessa kantajana T-soluavun aikaansaamiseksi, jotta indusoidaan humoraalisia 35 immuunivasteita hapteenia kohtaan.
10 106927 TD-antigeenia voidaan antaa kohteelle liukoisessa muodossa, esimerkiksi liukoisen proteiinin injektiona, tai TD-antigeeni voi olla solun pinnalla, esimerkiksi se voi olla solun pintaproteiini. TD-antigeenia voidaan antaa kohteelle gp39-antagonistin kanssa tai kohde voidaan asettaa alttiiksi TD-antigeenille ympäristöstä käsin, esimerkiksi 5 allergeenille. Edullisissa sovellusmuodoissa TD-antigeeni on agenssi, joka annetaan kohteelle hoitotarkoituksessa. Tämä agenssi voi olla esimerkiksi terapeuttinen vasta-aine tai terapeuttisen lääkkeen muu muoto, joka voi olla TD-antigeeni. Humoraali-sen immuunivasteen inhibointi esimerkiksi terapeuttista vasta-ainetta vastaan voi pidentää viimeksi mainitun tehoa in vivo estämällä sen puhdistuman kohteessa. Tera-10 peuttisina agensseina toimivat pienet molekyylit voivat olla myös kohdeantigeeneja, joita vastaan humoraalinen vaste tukahdutetaan, jos näitä molekyylejä (toimivat hap-teeneina) annetaan proteiinin tai muun kantajan kanssa, joka indusoi T-solun autta-jafunktion B-solujen aktivoimiseksi; humoraalisen immuniteetin tukahduttaminen näitä terapeuttisia agensseja vastaan voi samalla tavalla pidentää niiden tehoa.
15 Tässä esitetyt menetelmät saavat aikaan humoraalisen immuniteetin supression TD-antigeenejä kohtaan, kun taas ne eivät vaikuta vasteisiin antigeenejä kohtaan, jotka ovat tyymuksesta riippumatonta II-tyyppiä (TI-2). TI-2-antigeeneihin sisältyy polysakkarideja ja lipidejä, jotka eivät voi epäspesifisesti aktivoida B-soluja polyklonaa-lisella tavalla. Kyseessä olevassa keksinnössä määriteltynä termi "TI-2-antigeeni" 20 tarkoitetaan sisältämään kaikki antigeenit, jotka eivät vaadi gp39-CD40-vuorovaiku-tusta T- ja B-solujen välillä humoraalisen immuunivasteen indusoimiseksi antigee-... niä kohtaan. Tämä keksintö saa aikaan menetelmän sen seikan identifioimiseksi, on-
I I
'; ko antigeeni TD-antigeeni vai TI-2-antigeeni, kuten keksinnössä on määritelty, siten « • *' että määritetään, voidaanko humoraaliset immuunivasteet antigeeniä kohtaan inhi- v ; 25 boida gp39-antagonistilla.
• M
• * • · «·» . III. Humoraalisen immuniteetin tukahduttaminen • · · ··· ··· • · » V * Tässä kuvataan menetelmiä humoraalisen immuunivasteen inhiboimiseksi TD-anti- geeniä vastaan. Humoraalinen immuunivaste voi olla primaarinen immuunivaste, • » « ·,,,· kun kysymyksessä on ensimmäinen altistus TD-antigeenille, tai vaste voi olla se- *”]: 30 kundaarinen humoraalinen immuunivaste, kun kysymyksessä on antigeenille uudel- ; ‘ leenaltistus. Vasta-aineiden yhden tai useamman isotyypin tuotto voidaan inhiboida.
I « · ‘^. *t Sellaisen primaarisen humoraalisen immuunivasteen suhteen, jossa IgM on vallitse- va, tuotettu vasta-aine, IgM:n tuotto tukahdutetaan valtaosaltaan. Sekundaarisen •.,immuunivasteen suhteen voidaan tukahduttaa usean erilaisen isotyypin tuotto, IgM, *·.··: 35 IgG ja IgE mukaan lukien.
H 106927
Kuvataan menetelmiä TD-antigeenin vastaisen, humoraalisen immuniteetin pidennettyä tukahduttamista vastaan. Tässä yhteydessä käytettynä "pidennetty tukahduttaminen" tarkoittaa, että TD-antigeenin vastaisen vasta-aineen tuoton tukahduttaminen jatkuu, sen jälkeen kun gp39:n antagonistin anto in vivo on päättynyt.
5 IV. Gp39:n antagonistin anto
Humoraalinen immuunivaste TD-antigeeniä kohtaan voidaan estää tässä dokumentissa kuvattujen ohjeiden mukaan siten, että gp39-antagonistia annetaan kohteelle, joka on alttiina TD-antigeenille. Eräässä sovellusmuodossa gp39-antagonistia annetaan yhdessä TD-antigeenin kanssa. GP39-antagonistia annetaan mieluummin sa-10 manaikaisesti TD-antigeenin kanssa tai sen jälkeen, kunhan vain gp39-antagonisti annetaan ennen kuin TD-antigeeni on saanut aikaan B-soluaktivaation. Toisessa sovellusmuodossa kohde altistetaan antigeenille, joka on peräisin ympäristöstä. Tässä tapauksessa gp39-antagonisti tulisi antaa in vivo antigeenille altistuksen jälkeen, riittävän pian B-soluaktivaation estämiseksi.
15 Humoraalisten immuunivasteiden tukahduttamiseksi kohteelle annetaan in vivo esitetyn mukaisia antagonisteja farmaseuttista antoa varten biologisesti yhteen sopivassa muodossa. "Biologisesti yhteen sopivalla muodolla, joka soveltuu in vivo -antoon" tarkoitetaan annettavan antagonistin muotoa, jossa proteiinin terapeuttiset vaikutukset painavat vahassa enemmän kuin mitkään toksiset vaikutukset. Termin, 20 kohde, on tarkoitettu sisältävän eläviä organismeja, joissa immuunivaste voidaan : ·. houkutella esiin, esimerkiksi nisäkkäitä. Kohteiden esimerkkeihin sisältyy ihmisiä, * . koiria, kissoja, hiiriä, rottia ja niiden transgeenisiä lajeja. Sellaista antagonistia, joka häiritsee gp39:n ja CD40:n vuorovaikutusta, kuten tässä dokumentissa kuvattiin, voidaan antaa missä tahansa farmakologisessa muodossa ja farmaseuttisesti hyväk- • · · 25 syttävässä kantajassa. Terapeuttisten koostumusten terapeuttisesti aktiivisen määrän • · · *·* * anto määritellään määräksi, joka on tehokas sellaisina annoksina ja aikajaksoina, jotka ovat välttämättömiä halutun tuloksen saavuttamiseksi. Esimerkiksi terapeutti- M» sesti aktiivinen määrä antagonistia, joka häiritsee gp39:n ja CD40:n välistä vuoro-·”*: vaikutusta, voi vaihdella tekijöiden mukaan, joita ovat esimerkiksi yksilön sairauden . ’·, 30 vaihe, ikä, sukupuoli ja paino sekä antagonistin kyky houkutella haluttu vaste esiin yksilössä. Annostusohjelmat voidaan säätää siten, että saadaan aikaan optimi terapeuttinen vaste. Voidaan antaa esimerkiksi päivittäin useita jaettuja annoksia tai an-·,./ nosta voidaan vähentää oikeassa suhteessa hoitotilanteen välttämättömän tarpeen •: ·': mukaan.
12 106927
Aktiivista yhdistettä (esimerkiksi antagonistia) voidaan antaa sopivalla tavalla, kuten esimerkiksi ruiskeena (ihonalaisena, laskimonsisäisenä, jne.), suun kautta, inhalaa-tiona, ihon läpi tai se voidaan antaa peräsuolen kautta. Autotien mukaisesti aktiivinen yhdiste voidaan päällystää materiaalilla, joka suojaa yhdistettä entsyymien ja 5 happojen toiminnalta ja muilta luonnonmukaisilta olosuhteilta, jotka voivat inakti-voida sen.
Muuta kuin parenteraalista antoa varten antagonisti, joka häiritsee gp39:n ja CD40:n vuorovaikutusta, voi olla välttämätöntä päällystää materiaalilla, joka estää sen inak-tivoitumisen, tai antaa antagonisti yhdessä mainitun materiaalin kanssa. Antagonisti 10 voidaan antaa yksilölle esimerkiksi sopivassa kantajassa tai ohentimessa, se voidaan antaa yhdessä entsyymi-inhibiittoreiden kanssa tai sopivassa kantajassa, kuten esimerkiksi liposomeissa. Farmaseuttisesti hyväksyttäviin ohentimiin kuuluvat keitto-suolaliuos ja puskurien vesiliuokset. Entsyymi-inhibiittoreihin sisältyvät haiman trypsiini-inhibiittori, di-isopropyylifluorofosfaatti (DEP) sekä trasyloli. Liposomei-15 hin kuuluvat emulsiot vesi-öljyssä-vedessä samoin kuin tavanomaiset liposomit (Strejan et ai., (1984) J. Neuroimmunol 7, 27).
Aktiivinen yhdiste voidaan antaa myös parenteraalisesti tai vatsakalvononteloon. Dispersiot voidaan valmistaa glyseroliin, nestemäisiin polyetyleeniglykoleihin ja niiden seoksiin ja öljyihin. Tavallisissa varastointi ja käyttöolosuhteissa nämä val-20 misteet voivat sisältää säilöntäainetta mikro-organismien kasvun estämiseksi.
: \ Injektointiin soveltuviin farmaseuttisiin koostumuksiin kuuluu steriilejä vesiliuoksia " : ·. (silloin kun yhdisteet ovat vesiliukoisia) tai dispersioita sekä steriilejä jauheita sterii- * * * lien, injektoitavien liuosten tai dispersioiden hetkessä tapahtuvaa valmistusta varten. Kaikissa tapauksissa koostumuksen täytyy olla steriili ja sen tulee olla siinä määrin « · · *·//.’ 25 juokseva, että se on helposti ruiskutettavissa. Sen täytyy kestää valmistusolosuhteet • * * *·* ja varastointi, ja se tulee varjella mikro-organismien, kuten bakteereiden ja sienien saastuttavalta vaikutukselta. Kantaja voi olla liuotin tai dispersion väliaine, joka si- • · · sältää esimerkiksi vettä, etanolia, polyolia (esimerkiksi glyserolia, propyleeniglyko- • ^ lia ja nestemäistä polyetyleeniglykolia yms.) ja niiden seoksia. Sopivaa juoksevuutta : .·. 30 voidaan pitää yllä esimerkiksi käyttämällä päällystettä, kuten lesitiiniä, pitämällä « · · yllä vaadittua partikkelikokoa dispersion tapauksessa ja käyttämällä pinta-aktiivisia aineita. Mikro-organismien toiminta estetään erilaisin bakteerien- ja sientenvastaisin agenssein, esimerkiksi parabeenien, klooributanolin, fenolin, askorbiinihapon, time-rosaalin yms. avulla. Monissa tapauksissa koostumukseen on suotavaa sisällyttää 35 isotonisia agensseja, esimerkiksi sokereita, polyalkoholeja, kuten mannitolia, sorbitolia, natriumkloridia. Ruiskutettavien koostumusten pidennetty absorptio voidaan saada aikaan siten, että koostumukseen sisällytetään agenssia, joka viivästyttää ab sorptiota, esimerkiksi alumiinimonostearaattia ja gelatiinia.
13 106927
Voidaan valmistaa steriilejä injektoitavia liuoksia siten, että riittävä määrä aktiivista yhdistettä (esimerkiksi antagonistia, joka häiritsee gp39:n ja CD40:n välistä vuoro-5 vaikutusta) sisällytetään sopivaan liuottimeen yhden kanssa edellä mainituista ainesosista tai niiden yhdistelmän kanssa ja tarvittaessa tämän jälkeen steriloidaan suodattamalla. Dispersiot valmistetaan tavallisesti sisällyttämällä aktiivista yhdistettä steriiliin vehikkeliin, joka sisältää dispersion perusväliaineen ja edellä mainituista aineista tarvittavat muut ainesosat. Kun kysymyksessä ovat steriilit jauheet 10 steriilien, injektoitavien liuosten valmistusta varten, edullisia valmistusmenetelmiä ovat tyhjö- ja jäädytyskuivaus, joka tuottaa aktiivisen ainesosan (esimerkiksi antagonistin) sekä muun lisäksi tulevan halutun ainesosan jauheena niiden steriiliksi suodatetusta liuoksesta.
Kun aktiivinen yhdiste on suojattu sopivasti, kuten edellä kuvattiin, proteiini voi-15 daan antaa suun kautta, esimerkiksi reagoimattoman ohentimen tai assimiloituvan, syötäväksi kelpaavan kantajan kanssa. Tässä dokumentissa käytetty termi "farmaseuttisesti hyväksyttävä kantaja-aine" sisältää mitkä tahansa ja kaikki liuottimet, dispersion väliaineet, päällysteet, bakteerien ja sienien vastaiset agenssit, isotoniset ja absorptiota viivyttävät agenssit yms. Tällaisten väliaineiden ja agenssien käyttö far-20 maseuttisesti aktiivisia aineita varten on tekniikan tason mukaan hyvin tunnettua.
•.: : Tavanomaisen väliaineen tai agenssin käyttö terapeuttisissa koostumuksissa on mah- • ' · dollista, lukuunottamatta sitä, että tällainen väliaine tai agenssi ei sovi yhteen aktii- : : visen yhdisteen kanssa. Koostumukseen voidaan sisällyttää myös täydentäviä aktii- : ‘: visia yhdisteitä.
··* * « • · · y*. 25 On erityisen edullista formuloida parenteraaliset koostumukset annosyksikön muo- » · · ’·’ toon annon helpottamiseksi ja jotta saadaan aikaan tasainen annostus. Tässä doku mentissa termillä annosyksikkö tarkoitetaan fysikaalisesti erillisiä yksiköitä, jotka • · · ·...* soveltuvat hoidettaville nisäkäskohteille yksikköannoksiksi; kukin yksikkö sisältää *,.halutun farmaseuttisen kantajan kanssa aktiivista yhdistettä ennalta määritellyn mää-: 30 rän, jonka on laskettu saavan aikaan terapeuttinen vaikutus. Keksinnön mukaisia an- ‘ , nosyksikkömuotoja varten spesifikaation sanelevat (a) aktiivisen yhdisteen ainutlaa- '' tuiset ominaisuudet sekä saavutettava tietty terapeuttinen vaikutus sekä (b) sellaiset rajoitukset, jotka ovat luonteenomaisia tällaisen aktiivisen yhdisteen seostamiselle : yksilöiden herkkyyden hoitoa varten, ja spesifikaatiot ovat suoraan mainittujen teki- 35 joiden mukaiset.
14 106927 V. Gp39-antagonistien ja muiden immunosupressiivisten agenssien yhteisanto
On osoitettu, että liukoisella CTLA-4:llä tapahtuvan CD28:n, Th-solujen pinnalla sijaitsevan yhteisstimulaatiomolekyylin, laukaisun häirintä tukahduttaa myös TD-vasta-ainevasteita (30) ja estää heterograftin hyljinnän (31). Samalla tavalla kuin 5 anti-gp-39:n anto liukoinen CTLA-4 sai aikaan pitkällisen immuunisupressiotilan. Koska anti-gp39 ja CTLA-4 välittävät immunosupressiiviset vaikutuksensa humo-raalisen immuunivasteen erillisillä tasoilla, näiden kahden immunosupressiivisen lääkkeen yhteisanto voi saada aikaan immuniteetissa additiivisia ja synergistisiä immunosupressiivisia vaikutuksia.
10 IgE-vasta-aineet välittävät allergisia vasteita. IgE-vasteiden tuotto edellyttää syto-kiini-IL-4:ää. TD-antigeeniin kohdistuvien IgE-vasteiden inhibitio voi olla tehokkaampaa, kun annetaan yhdessä gp39-antagonistia ja IL-4:n inhibiittoria, esimerkiksi anti-IL-4-vasta-ainetta.
Keksintöä valaistaan vielä seuraavin esimerkein, joita ei pitäisi tulkita rajoittaviksi. 15 Kaikkien viitteiden sisällöt ja julkaistut patenttihakemukset, jotka tässä hakemuksessa mainitaan, on liitetty viitteinä. Sellaisen patenttihakemuksen sisältö, joka on jätetty samana päivänä esillä olevan dokumentin kanssa ja joka on Randolf J. Noellen et ai. nimellä ja jonka otsikko on "Methods for Inducing Antigen-Specific T Cell Tolerance", sisällytetään tähän dokumenttiin viitteenä.
20 Esimerkeissä käytettiin seuraavaa metodiikkaa.
: : : Materiaalit ja menetelmät • *
Eläimet. Tässä tutkimuksessa esitetyissä in vivo -kokeissa käytettiin naaraspuolisia, 6-8 viikon ikäisiä Balb/c-hiiriä (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Eläimiä • · · pidettiin erityisessä patogeenittomassa laitteessa Dartmouth Medical Schoolissa.
25 Auttaja-T-solukloonit (Thl). D1.6, I-Ad-restriktioentsyymillä käsitellylle kaniinin .···. Ig:lle spesifinen Thl-klooni (21) saatiin tohtori David Parkerilta, University of Mass, at Worcester. Tässä julkaisussa Dl. 6 :ta nimitetään Thl:ksi.
• · · : : Reagenssit ja vasta-aineet.
MR1, hamsterin monoklonaalinen anti-hiiri-gp39-vasta-aine (16) puhdistettiin aski- « 30 tesnesteestä DEAE-HPLC:llä. Hamsterin Ig:tä (HIg), jota käytettiin kontrollivasta-aineena, puhdistettiin hamsterin seerumista (Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbuty, NY). RG7/7.6.HL, hiiren anti-rotta-kappa-ketju-vasta-aine (RG7) 15 106927 (reagoi ristiin hamsterin kappaketjun kanssa) (22), yhdistettiin HRPO.n tai FITC:n kanssa ja sitä käytettiin sekundaarisena reagenssina MRl:n ja HIg:n ilmaisuun. Affiniteetilla puhdistettua vuohen anti-hiiren-IgM:ää, -IgGiihtä, IgG2a:a, IgG2b:tä ja IgGsia (Southern Biotechnology, Birmingham AI) käytettiin ilmaisuvasta-aineina 5 antigeenille spesifisissä ELISA-määrityksissä samoin kuin kokonais-IgM- ja -IgGr ELISA-menetelmissä. BlE3:a (jonka tohtori T. Waldschmidt, Iowan yliopistosta, ystävällisesti antoi käyttöön), monoklonaalista anti-hiiri-IgE:tä käytettiin vasta-aineena ilmaisuun IgE-anti-KLH-ELISA-määrityksessä. Kimeerisen L6:n (Chi-L6), joka on ihmiskäyttöön sopivaksi tehty, kasvainantigeenille L6 (23) spesifinen IgGi, 10 Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle WA, antoi ystävällisesti käyttöön. Anti-CD4, GK 1.5 (24) valmistettiin askitesnesteestä. Lampaan veren punasolut (SRBC) hankittiin Colorado Serum Co.:lta (Denver, CO). Sea Plaque-agaroosi saatiin anti-SRBC-plakkimääritystä varten FMC Corporationilta (Rockland MA). Kanin pentujen komplementti ostettiin Cedarlanelta (Homby, Ontario Kana-15 da). Keyhole-maljakotilon (Megathura crenulata) hankittiin Calbiochemilta (LaJolla, CA). Täydellinen Freundin adjuvantti immunisointia varten saatiin Sigma Chemical Co:lta (St. Louis, MO). TNP-SRBC, TNP-KLH ja TNP-BSA valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla (25).
Immunisaatio primaaristen ja sekundaaristen vasta-ainevasteiden tuottamiseksi 20 in vivo • < « v : Primaariset immuunivasteet. Primaaristen vasteiden tuomiseksi esiin SRBCitä tai '· TNP-SRBC:tä kohtaan hiiriä immunisoitiin yksiprosenttisella SRBC- tai TNP- SRBC-suspensiolla (laskimonsisäisesti). IgM, anti-SRBC-vaste, määritettiin viiden-: tenä päivänä antigeenin annon jälkeen siten, että käytettiin Jeme-plakkimäärityksen • · · 25 muunnosta (26). IgM-anti-TNP-vasteet mitattiin ELISAlla kuudentena päivänä. Pii- • O · .·;·. maariset vasteet heterologiselle immunoglobuliinille Chi-L6 tuotettiin vatsaontelon sisäisellä immunisaatiolla, johon käytettiin hiirtä kohti 100 pg Chi-L6:tta alumiini-... sulfaatissa. Seerumin anti-Chi-L6-IgM-vasta-aine mitattiin seitsemäntenä päivänä.
Primaariset vasteet TNP-Ficollille tuotettiin immunisoimalla 25 pg:lla TNP-Ficollia *;·* 30 vatsakalvonontelon sisäisesti (i.p.) Anti-TNP-IgM-vaste mitattiin kuudentena päivä- : nä ELISAlla.
Sekundaariset immuunivasteet. Sekundaaristen humoraalisten vasteiden tuottami-•,,,; seksi KLH:ta kohtaan, eläimiä immunisoitiin KLH:lla, joka oli CFA:ssa (50 pg; vat- ':: sakalvonontelon sisäisesti). Hiiriä käsiteltiin myöhemmin 10 pg:lla liukoista KLH:ta 35 (vatsakalvonontelon sisäisesti) kolme kuukautta myöhemmin. Anti-KLH-vasta-aine-vaste mitattiin immuunien hiirten seerumista seitsemäntenä päivänä isotyypille spe- 16 106927 sifisiä ELISA-määrityksiä käyttämällä. Sekundaariset vasta-ainevasteet Chi-L6:lle tuotettiin käsittelemällä immuuneita Chi-L6-hiiriä 10 μ§:1ΐ3 Chi-L6 (i.p.). Seerumin anti-Chi-L6-IgGi-vasta-ainevaste mitattiin seitsemän päivän kuluttua.
Anti-gp39-käsittely. Steriiliä, HPLC:llä puhdistettua anti-gp39:ää (MR1) tai HIg:tä 5 (vasta-ainekontrollina) annettiin (i.p.) päivinä 0, 2 ja 4 immunisaation tai testiannok-sen eli "haasteen" jälkeen kussakin kokeessa esitetyllä tavalla.
Antigeenille spesifiset ELISAt. Antigeenille spesifiset IgM-, IgGr, IgG2a-, IgG2b-, IgG3- ja IgE-vasta-ainetiitterit määritettiin spesifisiä ELISA-määrityksiä käyttämällä. Lyhyesti sanottuna antigeeniä (KLH:ta, Chi-L6:ta, TNPi6-BSA:ta tai TNPi6-BSA:ta 10 tai TNP2-BSA:ta 1 mg/ml PBS.ssä) absorboitiin taipuisille polyvinyylimikrotiitteri-levyille yön ajan 4 °C:ssa. Levyt pestiin ja reaktio pysäytettiin PBS:llä, jossa oli yksi prosentti FCS-natriumatsidia. Laimennettuja seeruminäytteitä inkuboitiin kahden tunnin ajan 37 °C:ssa. Näytteet pestiin ja niistä määritettiin antigeenille spesifiset filtterit yhdellä seuraavista alkaliseen fosfataasiin kytketyistä, antigeenin ilmai-15 suun käytettävistä vasta-aineista, jotka olivat vuohen anti-hiiri-IgM, -IgG|, -IgG2a, -IgG2b, tai -IgG3 (Southern Biotechnology, Birmingham. AI). Käytettiin IgE:lle spesifistä ELISAa biotiiniin konjugoidun BlE3:n kanssa, mitä seurasi alkaliseen fosfataasiin kytketty avidiini (South San Francisco, VA). Kaikki ELISA-määritykset kehitettiin alkalisen fosfataasin reaktiolla fosfataasisubstraatin kanssa (Sigma Chemical, 20 Co., St. Louis, MO). Levyt analysoitiin 410 rmosä ELISA-lukijalla Dynatech 1 MR700. Yksiköt edustavat mielivaltaisia arvoja, jotka perustuvat standardi-immuu- i '· niseerumin titrauskäyrään. Kaikkien koeryhmien näytteet titrattiin suhteissa 1:100 - : : 1:100 000 ja filtteri otettiin selville monipisteanalyysillä. Anti-KLH-, anti-Chi-L6- : ": ja anti-TNP-vasta-aineiden tasot kontrolleissa, jotka eivät saaneet testiannosta, oli- ; f; 25 vat ilmaisutasoa pienempiä.
• · · • » · • * * ’·* Seerumin anti-gp39:n ilmaisu :***: Koskemattoman anti-gp39:n kvantitointi anti-gp39:llä käsiteltyjen hiirien seerumis- • ·« .***. sa: Sellaisilta hiiriltä, jotka saivat 750 μg anti-gp39:ää (250 μg päivinä 0, 2 ja 4), • · · otettiin seerumia päivinä 7, 14 ja 21 anti-gp39-käsittelyn jälkeen. Seerumi ajettiin • · * ' ' ‘ 30 7,5-prosenttisella SDS-geelillä pelkistämättömissä olosuhteissa, näyte siirrettiin nit- roselluloosalle ja blotattiin HRPO.hon yhdistetyllä RG7:llä. Kemiluminesenssiin : perustuvan ilmaisun jälkeen blotin alueet, jotka vastasivat 150-165 kDa:ta, seulottiin ja numerisoitiin Apple Scanneriä sekä Image 4.1-tietokoneohjelmistoa käyttämällä.
17 106927
Biologisesti aktiivisen anti-gp39:n analysointi käsiteltyjen hiirien seerumista: Anti-CD3:lla aktivoitu Thl, joka ilmentää gp39:ää, värjättiin sellaisen seerumin laimennuksilla, jotka otettiin hiiristä, jotka saivat 750 μg anti-gp39:ää (250 μg:aa päivinä 0, 2, 4), seerumiin jäljelle jääneen gp39:n biologisesti aktiivisen määrän määrittämi-5 seksi. Anti-gp39:ää sisältävien seerumeiden titrauksia inkuboitiin aktivoitujen Thl-solukloonien kanssa 30 minuutin ajan 4 °C:ssa, minkä jälkeen ne pestiin ja sitten niitä inkuboitiin FITC-RG7:llä 30 minuutin ajan 4 °C:ssa. Laadittiin MFI:n standar-dikäyrä anti-gp39:ää vastaan käyttämällä puhdistettua anti-gp39:ää. Näytteet analysoitiin Becton Dickison FACScanillä ja seerumiin jäljelle jääneen anti-gp39:n määrä 10 pääteltiin anti-gp39-standardikäyrän perusteella. Seerumin anti-gp39:n taso, joka saatiin seitsemäntenä päivänä, otettiin 100 prosentiksi.
Auttaja-T-solujen adoptiivinen siirto. Hiiriä immunisoitiin SRBCillä (200 μΐ yksi-prosenttista SRBC:tä, i.v.) ja niille annettiin anti-gp39:ää tai HIg:tä (250 μg päivinä 0, 2, 4) Immunisoimattomista tai SRBCillä immunisoiduista hiiristä otettiin spleno-15 syytit, poistettiin erytrosyytit, pestiin ja siirrettiin (i.v. 50 x 106/hiiri) säteilytettyihin (600 radia) vastaanottajiin yhdessä sellaisten pernasolujen kanssa, jotka saatiin TNP-KLH:lla käsitellyiltä (TNP-KLH-CFA, 50 pg, i.p.) hiiriltä, jotka olivat immuu-ni-B-solujen lähteenä, tai ilman mainittuja pernasoluja. Siirron ajankohtana hiiret immunisoitiin TNP-SRBC:llä (200 μΐ yksiprosenttista TNP-SRBC:tä, i.v.). Kuuden-20 tena päivänä siirron jälkeen määritettiin seerumin anti-TNP-IgGi-tiitterit.
Esimerkki 1: Anti-gp39 inhiboi primaaristen vasta-ainevasteiden tuoton eryt- « « • '·· rosyyttiantigeenejä kohtaan 4 4 < /.·, Tällaisissa potilaissa havaittu huonontunut TD-immuniteetti sekä anti-gp39:n ja CD40-Ig:n voimakkaat inhiboivat vaikutukset Tpsta riippuvaiseen B-soluaktivaati-25 oon in vitro, antavat perusteet tutkia anti-gp39:n mahdollisia immunosupressiivisia • · · *♦* vaikutuksia humoraalisesti välittyvään immuniteettiin in vivo. Gp39-CD40-vuoro- vaikutusten roolin tutkimiseksi primaarisissa humoraalisissa TD-immuunivasteissa, • · · määritettiin anti-gp39:n annon in vivo -vaikutus primaariseen vasta-ainevasteeseen • * · lampaan punasoluja kohtaan (SRBC). Eläimet immunisoitiin SRBCillä ja niille an- : 30 nettiin anti-gp39-mAb:tä (tai kontrolli-HIg:tä) neljän päivän ajan. Viidentenä päivä- • ♦ · •' nä varmistettiin anti-gp39:llä käsiteltyjen, HIgillä käsiteltyjen ja kontrollihiirien pri
maarinen anti-SRBC-vasta-ainevaste. Sellaisten hiirien IgM-anti-SRBC-plakkia muodostavan solun vaste (PFC), jotka saivat kaikkiaan 1,5 mg:aa anti-gp39:ää ’: ‘': (500 pg/hiiri päivinä 0, 2 ja 4), pieneni 99 prosenttia, kun verrattiin anti-SCBC-PFC
35 -vasteeseen, joka saatiin kontrolli- tai HIgillä käsitellyillä hiirillä (kuvio IA). Tämän lisäksi niin vähäisen määrän kuin 300 pgin anto hiirtä kohti (100 pg/hiiri päivinä 0, 1* 106927 2 ja 4) vähensi primaarista anti-SRBC-immuunivastetta 66 prosentilla. Näiden kokeiden tulokset havainnollistavat, että anti-gp39-käsittely poistaa primaariset vasta-ainevasteet in vivo.
Anti-gp39:n immunosupressiivisten, SRBC:n vastaiseen primaariseen immuunivas-5 teeseen kohdistuvien vaikutusten kesto määritettiin myöhemmin. SRBC:llä immunisoituja hiiriä käsiteltiin anti-gp39:llä neljän päivän ajan ja eri ajankohtina niistä määritettiin kyky saada aikaan primaarinen anti-SRBC-vaste. Tässä kokeiden sarjassa kaikki eläimet immunisoitiin SRBC:llä päivänä 0 ja niille annettiin anti-gp39:ää tai HIg:tä päivinä 0, 2, 4. IgM-anti-SRBC-PFC-vaste mitattiin yhdeltä ryhmältä vii-10 dentenä päivänä. Muille SRBC-immuuniryhmille annettiin testiannos SRBC:tä seitsemäntenä ja 14. päivänä. Viiden päivän kuluttua kunkin antigeenitestiannoksen jälkeen (päivinä 12 ja 19) mitattiin IgM-anti-SRBC-PFC-vaste. Yhden sellaisen kokeen tulokset esitetään kuviossa IB. Kuten kuviosta IA käy ilmi, primaariset anti-SRBC-vasteet inhiboituivat 80-90 prosenttisesti viidentenä päivänä, sen jälkeen kun 15 anti-gp-39:n anto alkoi. Sen lisäksi primaariset anti-SRBC-vasteet inhiboituivat myös >90-prosenttisesti 12. ja 14. päivänä anti-gp39-käsittelyn jälkeen. Nämä tulokset havainnollistavat, että lyhyt anti-gp39-käsittely antaa tulokseksi primaaristen vasta-ainevasteiden pitkitetyn inhibition.
Esimerkki 2: Anti-gp39 inhiboi sekundaaristen KLH-vasta-ainevasteiden kehit-20 tämisen : ·. Primaarisia vasta-ainevasteita tutkivat kokeet viittaavat siihen, että gp39-CD40-vuo- . : . rovaikutukset esittävät kriittistä roolia primaarisen humoraali-immuniteetin alkuun- « « · panossa. Nämä kokeet eivät kuitenkaan osoita, tarvitaanko sekundaaristen vasta-
• I
'*! ainevasteiden kehittämiseen gp39:stä riippuvaisia CD40-viestitystä. Anti-gp39:n an- *··.·. 25 non vaikutukset sekundaariseen immuunivasteeseen liukoista, KLH.ta sisältävää » I i ’ ♦ ’ * testiannosta kohtaan määritettiin KLH:n suhteen immuuneissa hiirissä.
Anti-gp39:n sellaisia anto-ohjelmia käyttämällä, jotka vähensivät primaarista anti-.*·*. SRBC-PFC-vastetta, suunniteltiin kokeita anti-gp39-käsittelyn sellaisten vaikutusten arvioimiseksi, jotka kohdistuvat sekundaarisiin vasta-ainevasteisiin. Näisssä kokeis- ♦ ♦ · ' 30 sa KLH:n suhteen immuuneille hiirille (immunisoitu kolme kuukautta aiemmin CFA:lla ja KLH:lla) annettiin testiannos liukoista KLH:ta (10 pg/hiiri/laskimonsi-; säisesti). Antigeenitestiannoksen antopäivänä (päivänä 0) annettiin hiirille myös ....: 250 pg anti-gp39:ää tai HIg:tä, minkä toisena ja neljäntenä päivänä annettiin anti- gp39:ää tai HIg:tä. Seitsemäntenä päivänä (kuvio 2, osakuvio A) ja 14. päivänä 35 (kuvio 2, osakuvio B) KLH-testiannoksen jälkeen hiiristä vuodatettiin verta ja mää- 19 106927 ritettiin anti-KLH-IgM-, -IgGr, -IgG2a-, -IgG2b-, -IgG3- sekä -IgE-vasta-aineet. Tulokset havainnollistavat useita seikkoja: 1) testiannos, jossa oli liukoista KLH:ta sai aikaan kestävän sekundaarisen immuunivasteen, joka kesti aina 14. päivään saakka; 2) anti-gp39:n anto vähensi merkittävästi mitattujen isotyyppien sekundaarista anti-5 KLH-vastetta, kun verrattiin HIg:n yhtä suurien määrien antoon; ja 3) anti-gp39:n immunosupressiiviset vaikutukset näyttivät kestävän ainakin 14 päivää anti-gp39:n käsittelyn jälkeen. Yhteenvetona voidaan sanoa näiden kokeiden havainnollistavan, että anti-gp39 esti myös sekudaaristen humoraalisten immuunivasteiden kehittämisen samalla tavalla kuin se esti primaariset humoraaliset immuunivasteet.
10 Esimerkki 3: anti-gp39 inhiboi vasta-ainevasteiden kehittämisen heterologista Ig:tä kohtaan
Kuviossa 1 esitetyt kokeet havainnollistavat anti-gp39:n immunosupressiivisen aktiivisuuden primaarisen vasteen aikana voimakkaasti immunogeenista partikkeli-maista antigeeniä SRBC:tä kohtaan. Erytrosyyttien soluluonne tekee ne ainutlaatui-15 seksi sen suhteen, että niillä on kyky herättää voimakkaita immuunivasteita. Hetero-logiset Ig-molekyylit jakavat nämä ominaisuudet ja ovat erittäin immunogeenisiä ja sen tähden ne antavat käyttöön uuden antigeenimallijärjestelmän, jolla voi tutkia anti-gp39-hoidon vaikutuksia primaaristen ja sekundaaristen vasta-ainevasteiden kehittämiseen. Eläimiä immunisoitiin heterologisella Ig-molekyylillä, Chi-L6:lla, ih-20 miskäyttöön sopivaksi tehdyllä hiiren anti-tuumorisolun mAbillä ja niitä käsiteltiin . ' anti-gp39:llä tai kontrolli-HIg:llä. Seitsemän päivän kuluttua koottiin seerumit ja < « : 1 · · määritettiin anti-Chi-L6-IgM-vasta-aineiden tuotto. Hiirille annettiin sen lisäksi 14 päivän kuluttua immunisoinnista ja anti-gp39-käsittelyn jälkeen testiannos Chi-L6:ta ja 21. päivänä määritettiin anti-Chi-L6-IgGrvasta-aineen tuotto. Kuvio 3 esittää täl- : 25 laisen kokeen tuloksia. Primaarinen vasta-ainevaste Chi-L6:ta kohtaan inhiboitui • · · >90-prosenttisesti hiirissä, joita oli käsitelty anti-gp39:llä verrattuina HIg:llä käsiteltyihin hiiriin. Ennen kaikkea sekundaarinen IgGl-vaste Chi-L6:ta kohtaan inhiboitui ...φ samalla tavalla. Nämä tulokset havainnollistavat, että anti-gp39-käsittely poistaa '.II' pnmaanset ja sekundaariset vasta-ainevasteet TD-antigeenin toista tyyppiä, hetero- ··.1' 30 logista Ig:tä kohtaan, yhtä tehokkaasti kuin se tukahduttaa vasteet erytrosyyttejä ja : ’ t liukoisia proteiiniantigeenejä kohtaan.
I (
Esimerkki 4: Anti-gp39 ei inhiboi primaaristen vasta-ainevasteiden tuottoa T:n suhteen itsenäistä tyypin II antigeeniä, TNP-Ficollia, kohtaan
Vaikka aiemmat kokeet havainnollistavat, että anti-gp39 estää tehokkaasti primaaris-35 ten ja sekundaaristen vasta-ainevasteiden tuoton TD-antigeenejä kohtaan in vivo, on 20 106927 epäselvää, onko gp39-CD-vuorovaikutuksilla osuutta TI-antigeenien vastaisten hu-moraalisten vasteiden alkuunpanossa. Oheiset tulokset havainnollistavat, että TI-tyypin II antigeenillä, TNP-Ficollilla, suoritettu immunisaatio tuottaa gp39:n ilmentymisen Th-soluilla in vivo. Sen seikan osoittamiseksi, ovatko gp39-CD40-vuoro-5 vaikutukset välttämättömiä tämän TI-antigeenin vasta-ainevasteiden kehittämiselle, määritettiin anti-gp39-käsittelyn vaikutus hiiriin, jotka oli immunisoitu TNP-Ficollilla. Sellaisia hiiriä, jotka oli immunisoitu TNP-Ficollilla tai TNP-SRBC:llä, käsiteltiin anti-gp39:llä tai HIg:llä ja anti-TNP-IgM-vasta-ainevaste määritettiin kuuden päivän kuluttua. Kuvio 4A havainnollistaa, että TD-antigeenillä, TNP-SRBC:llä, 10 immunisoidut eläimet toivat seerumissa esiin anti-TNP-vasta-ainevasteita. Kuten aiemmin kuvattujen kokeiden perusteella pääteltiin, anti-gp39-käsittely inhiboi dramaattisesti näissä hiirissä tuotetun anti-TNP-vasteen. Sitä vastoin hiirillä, jotka oli immunisoitu TNP-Ficollilla, nousi suurempitiitterisiä anti-TNP-vasta-ainevasteita (kuvio 4B), anti-gp39-hoito ei kuitenkaan inhiboi vasta-ainevastetta TNP-Ficollille. 15 Näistä kokeista saadut tulokset havainnollistavat, että TD-antigeeneihin kohdistuvista vasteista poiketen anti-gp39 ei estä humoraalisten vasteiden kehittämistä TNP-Ficollia kohtaan, mikä viittaa siihen, että gp39 ei vaikuta TI-antigeenien vastaisiin vasteisiin.
Esimerkki 5: Anti-gp39:n anto ei toiminnallisesti poista SRBCrlle spesifistä 20 Th:ta 1 : Aiempien kokeiden perusteella tiedetään, että anti-gp39 häiritsee humoraalisen TD- : ' immuniteetin kehittymistä; kuitenkaan sellainen mekanismi, jolla anti-gp39-käsittely tukahduttaa humoraalisia vasteita, ei ole selvä. Anti-gp39:n aikaansaama immuuni-supressio voi välittyä tavoilla, jotka ovat seuraavat: 1) gp39:ää kantavien T-solujen . 25 negatiivinen viestitys, joka aiheuttaa Th-solujen energian puuttumisen; 2) anti- gp39:ää kantavien CD4+T-solujen, sytotoksinen deleetio, jota mAb välittää; ja (tai) 3) estetään gp39:n sitoutuminen CD40:een. Suoritettiin koesarja, jotta saatiin selvä ^^ käsitys siitä, mikä näistä mekanismeita voi toimia pitkittyneessä immuunisupressios sa, joka havaittiin anti-gp-39-hoidossa. Sellaisen mahdollisuuden tutkimiseksi, että • « ··/’ 30 anti-gp39-käsittely olisi poistanut antigeenille spesifisen Th:n tai tehnyt sen tehotto- : maksi, gp39:llä käsitellyistä hiiristä mitattiin antigeenille spesifinen Th-funktio :"': adoptiivisella siirrolla. Lyhyesti sanottuna hiiret immunisoitiin SRBC:llä (SRBC:lle spesifisen Th:n esikäsittelyä varten) ja niille annettiin anti-gp39:ää tai HIg:tä '". (250 pg/hiiri päivinä 0, 2, 4). Seitsemän päivän kuluttua siirrettiin pernasoluja adop- 35 tiivisesti vastaanottajahiiriin immunisoimattomista hiiristä tai SRBC-immuuneja pernasoluja HIg:llä tai anti-gp39:llä käsitellyistä hiiristä TNP-immuunien pernasolu- 2i 106927 jen kanssa, jota olivat TNP:llä käsiteltyjen B-solujen lähteenä. Hiirille annettiin samanaikaisesti testiannos TNP-SRBC:tä ja viidentenä päivänä otettiin selville anti-TNP-IgGi-tiitteri. SRBC:llä esikäsiteltyjä T-auttajasoluja tarvitaan tuomaan esiin sekundaarinen anti-TNP-vaste vastaanottajahiirissä, kuten havainnollistettiin sellaisen 5 seikan avulla, että ne vastaanottajat, jotka saivat pernasoluja ei-immuuneilta luovuttajilta, tuottivat ollennaisesti vähemmän anti-TNP-IgGl:ää verrattuina niihin hiiriin, jotka saivat pernasoluja SRBC:llä esikäsitellyistä eläimistä (kuvio 5). Sitä tärkeämpää on, että kokeen tulokset paljastavat, että SRBC-auttaja-aktiivisuus, joka oli peräisin HIg:llä ja anti-gp39:llä käsitellyistä hiiristä, oli samankaltaista, mikä ilmaisi 10 sen, että anti-gp39-käsittely ei muuttanut Th-funktiota tai estänyt Th:n esikäsittelyä. Ennen kaikkea anti-gp39-käsittely ei poistanut eikä tehnyt tehottomaksi antigeenille reagoivia Th:ita, koska ne siirron jälkeen saivat aikaan auttaja-efektoritoiminnan.
Esimerkki 6: Hamsterin anti-gp39:n puhdistuma in vivo
Aiemmat tutkimukset ovat näyttäneet toteen, että anti-gp39(MRl) estää gp39:n si-15 toutumisen CD40:een (15) ja tukee täten hypoteesia, jonka mukaan anti-gp39:n im-munosupressiiviset vaikutukset johtuvat gp39-CD40-vuorovaikutusten estymisestä. Olettaen, että tämä hypoteesi on oikea, anti-gp39:n annon yhteydessä havaittu pitkäkestoinen immuunisupressio edellyttää anti-gp39:n säilyvyyttä isännässä. Sen seikan toteamiseksi, voitaisiinko anti-gp39 ilmaista sen ajanjakson suhteen, jonka im-20 muunisupressio oli selvä, määritettiin anti-gp39:n puhdistuman nopeus in vivo see-v : rumista. Hiirille annettiin vasta-ainehoito (3 x 250 μg anti-gp39:ää) neljän päivän
< I
; ' aikana ja määritettiin seerumin anti-gp39:n tasot seitsemän, 14 ja 21 päivän kuluttua v : vasta-aineen annon jälkeen. Pelkistymättömän MRl:n (160 kd) Westem-blottiana- i”': lyysi ilmaisi, että seerumin anti-gp39 voitiin ilmaista ainakin 21 päivän kuluttua : ;*· 25 vasta-ainevastehoidon alusta (kuvio 6A). Anti-gp39:n pitoisuus eläinten seerumeissa • · · 21. päivänä oli noin viisi prosenttia (pyyhkäisydensitometrin perusteella määritettynä), kun sitä verrattiin signaaleihin, jotka olivat peräisin sellaisten eläinten seeru- ..., meistä, jotka analysoitiin seitsemän päivän kuluttua vasta-ainehoidon alusta.
• · • · « • · ♦
Vaikka määrityksen perusteella seerumissa oli intaktia anti-gp39:ää, oli myös tärke-: .·. 30 ää varmistaa, että anti-gp39 oli biologisesti aktiivista. Sen tähden gp39:ää kantavan
Th:n värjäykseen käytettiin sellaisia seerumeita, jotka saatiin hiiriltä, joille annettiin 3 x 250 μg anti-gp39:ää neljän päivän kuluessa (kuvio 6B). Anti-gp39:n taso seerumissa viimeisen injektion jälkeen (seitsemän päivän kuluttua vasta-ainekäsit-telystä) asetettiin 100 prosentiksi. Neljäntoista päivän kuluttua vasta-ainehoidon 35 aloittamisesta seerumissa ilmaistiin noin 10-15 prosenttia biologisesti aktiivisesta anti-gp39-mAb:stä. Kahdenkymmenen päivän kuluttua hoidon aloittamisesta see- 22 106927 nimiin jäi kahdesta kolmeen prosenttia anti-gp39:ää. Sen tähden intaktin gp39:n määrittäminen Westen-blottauksella sekä biologisesti aktiivisen anti-gp39:n määrittäminen ilmaisivat, että noin viisi prosenttia anti-gp39:stä oli läsnä 21 päivän kuluttaa anti-gp39:n hoidon aloittamisesta. Nämä tulokset havainnollistavat, että anti-5 gp39:n puoliintumisaika oli noin 12 päivää, ja ne antavat todisteen, joka pitää yhtä sellaisen olettamuksen kanssa, että humoraalisten vasteiden tukahduttaminen anti-gp39:llä johtuu siitä, että Th-funktion lamaantuminen jatkuu.
Esillä oleva tutkimus havainnollistaa, että kun in vivo annetaan anti-gp39-vasta-ainetta, joka in vitro ehkäisee gp39-CD40-vuor o vaikutukset, sekä primaariset että 10 sekundaariset humoraaliset immuunivasteet inhiboituvat perusteellisesti TD-antigee-nejä mutta eivät TI-tyypin II antigeenejä kohtaan. Tämä tutkimus havainnollistaa lisäksi sen, että anti-gp39-käsittely ei estä antigeenin esikäsittelemien Th-solujen esikäsittelyä. Siksi gp39-Cd40-ligandi-reseptoriparia voidaan käyttää humoraalisen immuunivasteen terapeuttisen manipulaation kohteena.
15 Selvän käsityksen saamiseksi siitä, kuinka anti-gp39 käyttää immunosupressiivistä vaikutustaan humoraaliseen inununitettiin, osoitettiin anti-gp39:n suorat vaikutukset
Th-funktioon. Tulokset ilmaisevat, että SRJBC-immuuni Th, joka on peräisin anti- gp3 9-käsitellyistä hiiristä, pystyi täydellisesti antamaan apua adoptiivisen siirron jälkeen, mikä viittaa siihen, että anti-gp39-käsittely ei aiheuttanet Th:n poistoa tai 20 energian häviämistä in vivo. Nämä tulokset johtivat teorioiden rakenteluun, joiden : mukaan anti-gp39 välittää immunosupressiiviset vaikutuksensa estämällä gp39:n \ '· sitoutumisen CD40:een eikä inaktivoimalla gp39:ää kantavaa Th:ta. Tätä hypoteesia : tukevissa tutkimuksissa in vitro on todettu, että anti-gp39 estää CD40:n sitoutumi- sen gp39:ään (16). Tämän lisäksi seerumissa voitiin havaita biologisesti aktiivista : 25 anti-gp39:ää sellaisen ajanjakson ajan, jonka immuunisupressio oli selvä. Vaikka • · · vain viisi prosenttia anti-gp39:stä oli läsnä seerumissa ajankohtana, jolloin immuunisupressio oli ilmeinen, on mahdollista, että anti-gp39:n paikalliset kudospitoisuu- #... φ det olivat sekundaaristen lymfoidielinten spesifisissä kohdissa suuremmat ja puhdis- • · IV. t tumanopeudet olivat pienemmät kuin seerumin anti-gp39:llä. Hiirien käsittely anti- ·;·* 30 gp39:llä inhiboi primaarisen immuunivasteen SRBC:tä kohtaan ja heterologinen Ig ϊ : : >90 prosenttia pitkittyneitä aikajaksoja. Olettaen, että anti-gp39 välittää inhibition siten, että se estää gp39:n funktion, nämä tulokset sisältävät gp39-CD40-vuorovaikutukset, jotka ovat välttämättömiä primaaristen immuunivasteiden kehitykselle TD- ' . antigeenejä kohtaan. Immunohistokemiallinen analyysi näyttää toteen, että gp39 in-
4 t I > I
35 dusoituu, mikä on seuraus TD-antigeeneillä suoritetusta immunisaatiosta ja että sillä voi olla funktionaalista merkitystä. Gp39:n ilmentymistä koskevat tutkimukset in 23 106927 situ ilmaisevat, että gp39-CD40-vuorovaikutusten aloituskohta primaaristen humo-raalisten immuunivasteiden aikana on periarteriolaaristen lymfoidikerrosten (PALS) perifeerisillä ja pernan terminaalisten arteriolien (TA) ympärillä. Juuri näissä kohdissa gp39:ää ilmentävän Th:n ja antigeenille spesifisten B-solujen välisten konju-5 gaattien havaittiin olevan asetetut rinnakkain, mikä antaa aiheen olettaa, että ulompi PALS on T-solu-B-solu-vuorovaikutusten pääkohta primaaristen humoraalisten immuunivasteiden aikana. Sen tähden PALS voi olla kohta, jossa anti-gp39 on vuorovaikutuksessa gp39:ää ilmentävien Th-solujen kanssa, jotta se viime kädessä inhiboi T-B-vuorovaikutuksen ja myöhemmän Ig-tuoton.
10 Samoin kuin primaariset vasteet, myös sellaisen hiiren sekundaarinen, humoraalinen immuunivaste, jota oli esikäsitelty CFA:ssa olevaa KLH:ta vastaan, osoittautui myös inhiboituvan anti-gp39:n annolla. Yhdenmukaisesti sen kanssa, että anti-gp39 vähentää antiSRBC-PFC:tä, havaittiin antigeenitestiannoksen vastaisten vasta-ainetiit-tereiden vähenevän seerumissa. Kaikkien anti-KLH-Ig-isotyyppien (IgM, IgG], 15 IgG2a, IgG2b, IgG3 sekä IgE) mitatut seerumin filtterit vähenivät, kun hiiriä käsiteltiin anti-gp39:llä. Anti-gp39:n annon vaikutus oli ilmeinen ainakin 14 päivän ajan sekundaarisen antigeenitestiannoksen jälkeen, mikä näytti toteen, että anti-gp39 sai aikaan jatkuvan immuunisupression. KLHihon kohdistuvien sekundaaristen vasteiden anti-gp39-välitteinen immuunisupressio ei tapahdu ainoastaan KLHrta kohtaan, kos-20 ka anti-gp39-hoito inhiboi myös sekundaariset immuunivasteet heterologista Ig:tä ja heterologisia erytrosyyttejä kohtaan. Gp39:ää ilmentävän Th'.n anatominen jakaan-·;·. tuminen oli identtinen primaarisessa immunisaatiossa havaitun jakaantumisen kans- ;·. sa, gp-39:ää ilmentävän T^n lukumäärä immuunipemassa kuitenkin lisääntyi pri- ... maaristen immuunivasteiden aikana. Immuunin pernan germinaalikeskuksessa tai *;*.* 25 follikkeleissa ei havaittu yhtään gp39:ää ilmentävää Thita. Täten näyttää siltä, että • ♦ *···/ B-solut saadaan reagoimaan aktivoiduille Th-soluille pernan PALSissä ja TA:ssa, ja • · · ’ · * ·* myöhemmin ne vaeltavat follikkeleihin ja germinaalisiin keskuksiin.
• · · ·. · · • · «
Esillä olevan keksinnön polttopisteenä oli havainnollistaa anti-gp39:n mahdollinen .···. käyttö TD-humoraalisen immuniteetin säätelyssä. Lyhyet hoito-ohjelmat, joissa käy- 30 tettiin anti-gp39:ää, tuottivat pitkällisen tukahtumisen, tämän terapeuttisen vasta-*!* aineen houkuttelevan ominaisuuden. Erityistä mielenkiintoa voi olla anti-gp39:n ky- i.: : vyllä estää primaarisia ja sekundaarisia humoraalisia vasteita muita heterologisia, te- rapeuttisia vasta-aineita, kuten Chi-L6:ta, kohtaan. Tämä sallisi potilaiden altistami-. · · . sen heterologisten terapeuttisten vasta-aineiden annolle.
24 106927
Esimerkki 7: Anti-gp39-vasta-aineiden tuotto ja karakterisointi Koe 1 - Humaani gp39:ään kohdistetut vasta-aineet
Antigeenispesifisen T-solutoleranssin indusoimiseksi ihmiskohteessa on edullista antaa kohteelle humaani gp39:ään suunnattua vasta-ainetta. Hiiren monoklonaalisten 5 anti-humaani-gp39-vasta-aineiden tuottamiseksi käytettiin seuraavaa metodiikkaa. Balb/c-hiiriä immunisoitiin liukoisella gp39-fuusioproteiinilla, gp39-CD8:lla, joka oli täydellisessä Freundin adjuvantissa (CFA). Tämän jälkeen kuusi viikkoa myöhemmin hiirille annettiin testiannos liukoista gp39-CD8:aa, joka oli epätäydellisessä Freundin adjuvantissa (IFA). Liukoista gp39-CD8:aa annettiin liukoisessa muodossa 10 4 viikon ajan sekundaarisen immunisaation jälkeen. Hiirille annettiin sitten kaksi viikkoa myöhemmin tehosteannos, joka oli ihmisen perifeerisen veren aktivoituja lymfosyyttejä, joiden jälkeen vielä kahden viikon kuluttua annettiin lopullinen tehosteannos liukoista gp39-CD8:aa. Neljäntenä päivänä lopullisen immunisaation jälkeen splenosyytit sulautettiin NS-l-fuusiopartnerin kanssa normaalien menettely-15 tapojen mukaan.
Anti-humaani-gp39-vasta-aineita tuottavat kloonit valittiin monikertaisen seulonta-menettelytavan mukaan. Aluksi kloonit seulottiin levyynsitoutumismäärityksen avulla, johon käytettiin gp39-CD8:aa. Positiiviset kloonit seulottiin sitten kontrollina toimivaa CD8-fuusioproteiinia, CD72-CD8:aa, vastaan. Sellaiset kloonit, jotka 20 CD8-CD72-levyynsitoutumistestissä arvioitiin positiivisiksi, poistettiin. Tämän jäl-. : : keen jäljelle jääneet kloonit seulottiin lepäävillä ja perifeerisen veren kuusi tuntia •' ·.. aktivoiduilla lymfosyyteilla (PBL) virtaussytometrianalyysin avulla. Sellaisia hybri- ;':'; doomia, jotka värjäsivät aktivoituja mutta ei lepääviä PBL:iä, pidettiin positiivisina.
.···. Jäljelle jääneet kloonit tutkittiin lopuksi niiden kyvyn suhteen estää CD40Ig:n sitou- 25 tuminen levyyn sidottuun gp39:ään.
* · · • · · « · « v : Levyyn sitoutumismäärityksessä seulottiin aluksi arviolta noin 300 kloonia gp39- CD8:aa ja CD72-CD8:aa. Näistä klooneista kolmenkymmenen havaittiin ilmaisevan levyyn sidotun gp39:n eikä CD8:aa. Nämä kloonit seulottiin myöhemmin gp39:n ilmaisun suhteen, mihin käytettiin aktivoitua humaani PBL.ää. Arviolta noin 15 * · · 30 kloonia ilmaisi molekyylin aktivoidulla PBL:llä mutta ei lepäävillä soluilla. Spesifisyys varmistettiin vielä määrittämällä kloonien kapasiteetti estää levyyn sidotun gp39:n CD40Ig-ilmaisu. Tässä määrityksessä kolme kloonia kymmenestä esti ; : CD40Ig-sitoutumisen. Nämä kloonit olivat 3E4, 2H5 ja 2H8. Tällaiset kloonit ovat ;·· edullisia käytettäviksi menetelmissä, joita kuvataan tässä dokumentissa. Sellaiset 35 kloonit, jotka tutkittaessa olivat positiivisia aktivoiduilla mutta eivät lepäävillä 25 106927 PBL:illä, seulottiin myös niiden kyvyn suhteen reagoida rotan aktivoidun T-solu-kloonin, POMC8:n, kanssa. Klooni 2H8 ilmensi ristireaktiokykyä rotan tämän T-solulinjan kanssa.
Koe 2 - Humaani gp39:ään kohdistetut vasta-aineet 5 Kokeessa 1 kuvatun immunisaatiomenettelyn kaltaista menettelytapaa käytettiin sellaisten lisävasta-aineiden tuottamiseen, jotka oli suunnattu humaani gp39:ää vastaan. Yksi Balb/c-hiiri immunisoitiin liukoisella gp39-CD8:lla, joka oli CFA:ssa, minkä jälkeen neljä viikkoa myöhemmin annettiin testiannos ihmisen perifeerisen veren kuusi tuntia aktivoituja lymfosyyttejä. Hiiri sai myöhemmin tehosteen, joka 10 oli liukoista gp39-CD8:aa, neljä päivää ennen splenosyyttien sulauttamista NS-1-fuusiopartnerin kanssa, mikä tapahtu normaali käytäntöjen mukaisesti. Hybridoo-makloonit seulottiin kuusi tuntia aktivoitujen humaani PBL:ien virtaussytometri-värjäyksellä. Valittiin kloonit, jotka värjäsivät aktivoituja mutta eivät lepääviä PBL:iä. Lisäanalyysejä varten valittiin kuusi kloonia, jotka olivat 4D9-8, 4D9-9, 24-15 31,24-43, 89-76 ja 89-79.
Valittujen vasta-aineiden spesifisyys varmistettiin useilla määrityksillä. Ensiksi vir-taussytometrianalyysi havainnollisti, että kaikki kuusi mAb:tä värjäsivät aktivoituja mutta ei lepääviä perifeerisen veren T-soluja (katso kuviota 7B ja 7C tyypillisen esimerkin suhteen, joka kuvaa aktivoitujen T-solujen värjäytymistä vastaavasti 4D9-20 8:11a ja 4D9-9:llä).
« I I
.! Kunkin kuuden vasta-aineen tunnistaman molekyylin ilmentyminen on havaittavissa • « « aktivaation neljän tunnin sisällä, se on suurimmillaan kuuden - kahdeksan tunnin
« I I
'·' ' välillä aktivaation jälkeen eikä se ole ilmaistavissa 24 tuntia aktivaatiosta. Kaikki • · · • · + *·”* kuusi mAb:tä tunnistavat molekyylin, joka ilmentyi aktivoiduilla CD3 PBL:illä, en- 25 sisijaisesti CD4+-fenotyyppi mutta myös osa CD8+-T-soluja ihnentää molekyyliä.
• · · : Kuuden mAb:n tunnistaman molekyylin ilmentyminen inhiboituu syklosporiinilla, joka on viljelyalustassa, kuten gp39:n ilmentyminen (katso tyypillisten esimerkkien : * “: suhteen kuviota 8 A ja 8B, jotka kuvaavat syklosporiinilla käsiteltyjen T-solujen vär- jäytymistä vastaavasti 4D9-8:lla ja 4D9-9:llä). Näiden mAbiiden tunnistaman mole- • · · 30 kyylin ilmentymisen kinetiikat ja jakaantuminen ovat yhtäläiset gp39:n kanssa, kuten saatiin selville humaani CD40Ig:n fuusioproteiinin avulla. Lisäksi kaikki kuusi '···' mAb:tä estävät gp39:n värjäytymisen CD40Ig:llä (katso tyypillisen esimerkin suh- : ‘ “: teen kuviota 9A ja 9B, jotka kuvaavat gp39:n CD40Ig:llä värjäytymisen inhibitiota • ; · ·: vastaavasti 4D9-8:n ja 4D9-9:n läsnäollessa). ELISA-määrityksessä kaikki kuusi 35 mAb:tä tunnistavat gp39-CD8:n, joka on gp39-molekyylin liukoinen fuusiomuoto.
2« 106927
Kaikki kuusi mAb:tä ennen kaikkea immunosaostavat 35S-metioniinilla leimatusta, aktivoiduista humaani PBL:istä molekyylin, jonka koko on noin 36 kd:tä. Immuno-saostettu molekyyli on identtinen molekyylin kanssa, jonka humaani CD40Ig-fuu-sioproteiini saosti.
5 Kuuden valitun mAb:n (4D9-8, 4D9-9, 24-32, 24-43, 89-76 ja 89-79) funktionaalinen aktiivisuus määritettiin seuraavasti. Ensin mitattiin mAb:iden kyky inhiboida sellaisten puhdistettujen humaani B-solujen proliferaatio, jotka oli viljelty IL-4:n ja gp39:n kanssa. Puhdistettuja humaani B-soluja viljeltiin gp39:n ja IL-4:n kanssa siten, että läsnä oli monoklonaalisia vasta-aineita tai CD40Ig:tä annoksina, jotka oli-10 vat 0 - 12,5 μg/ml, tai mainitut vasta-aineet tai CD40Ig puuttuivat kasvualustasta. B-soluproliferaatio määritettiin viljelmässä kolmen päivän kuluttua tymidiinin liittymisen avulla. Tulokset (esitetty kuviossa 10) havainnollistavat, että kaikki kuusi mAb:tä voivat inhiboida B-soluproliferaation, jonka gp39 ja IL-4 saavat aikaan. Monoklonaaliset vasta-aineet 89-76 ja 24-31 olivat tehokkaimmat, kun indusoitu B-15 soluproliferaatio inhiboitiin.
Seuraavaksi tutkittiin mAb:iden kyky inhiboida B-solun erilaistuminen siten, että se mitattiin sellaisena Ig:n tuottona, jonka sai aikaan anti-CD3:n aktivoimat T-solut ja 11-2. Valmistettiin puhdistettuja humaani IgD+-B-soluja FACS:llä suoritetun positiivisen valinnan avulla ja sitten niitä viljeltiin anti-CD3:lla aktivoitujen humaani T-20 solujen (käsitelty mitomysiini C:llä) ja IL-2:n kanssa kuuden päivän ajan siten, että läsnä oli puhdistettuja monoklonaalisia anti-gp39-vasta-aineita annoksina, jotka oli-vat 1-10 pg/ml, tai ilman niitä. IgM:n, IgG:n ja IgA:n tuotto määritettiin ELI-SAlla : '* kuudentena päivänä. Tulokset (esitetty seuraavassa taulukossa 1) havainnollistavat, v : että kaikki kuusi vasta-ainetta voivat inhiboida T-solusta riippuvaisen B-solun eri- • · · 25 laistumisen, kun se mitataan IgM:n, IgG:n ja IgA:n tuottona.
« • · ♦ ♦ « ♦ • ♦ ♦ • ♦ · * · ♦ « · ♦ • · · < « • · · • « « ♦ · « 27 106927
Taulukko 1
Immunoglobuliinin tuotto
mAb__ug/ml__IgM__IgG__IgA
ei yhtään__17 500__6710__4471 4D9-8 0,1 4813 2130 2819 1.0 4394 2558 1519 __|A0__1081__389__396 4D9-9 0,1 3594 919 1731 1.0 2659 1233 1606 __1A0__374__448__266 24-31 0,1 3863 981 344 1.0 1287 314 165 ___]A0__1120__596__23 24-43 0,1 6227 4132 432 1.0 3193 2130 192 __1A0__7021__1232__1081 89-76 0,1 3783 1069 344 1.0 2180 352 171 __1A0__818__551__19 89-79 0,1 9763 1924 3021 1.0 2314 460 156 10.0 183 135 434 I I I « :' i ‘: Monoklonaalisten anti-gp39-vasta-aineiden vaikutuksen tutkimiseksi T-soluvasteilla .*·*. monoklonaalisia vasta-aineita sisällytettiin normaaleihin seoslymfosyyttireaktioihin • · » . .·. 5 (MLR). Viljeltiin 300 000 ihmisen perifeerisen veren lymfosyyttiä (vasteen muo- ,·*;*. dostaja = R) allogeenisen perifeerisen veren 100 000 säteilytetyn lymfosyytin c · · (stimulaattorit = S) kanssa monoklonaalisten anti-gp39-vasta-aineiden (10 μ^πύ) ... läsnäollessa tai niiden puuttuessa. Viljelmille annettiin sykäys 3H-tymidiiniä neljän- ···* tenä, viidentenä tai kuudentena päivänä ja viljelmät koottiin 18 tuntia myöhemmin.
10 Kaikki kuusi monoklonaalisia anti-humaani-gp39-vasta-ainetta inhiboivat allospesi-fiset vasteet MJRillä niitattuina (katso tyypillisen esimerkin suhteen kuviota 11, joka kuvaa allospesifisten vasteiden inhibitiota, kun R:ää ja S:ää inkuboidaan 24-3 linja 89-76:n läsnäollessa; CTLA4-immunoglobuliinifuusioproteiinia ja monoklonaalisia · anti-CD28-vasta-ainetta käytettiin positiivisina kontrolleina).
28 106927
Sen seikan määrittämiseksi, tunnistivatko kuusi monoklonaalista vasta-ainetta erillisiä epitooppeja humaani-gp39-molekyylillä, pantiin toimeen ristiinestokokeita. Aktivoidut humaani-PBL:t estettiin ensin kallakin kuudesta mAb:stä (konjugoimatonta vasta-ainetta 25 pg/ml). Soluja pestiin ja sitten ne värjättiin biotiiniin konjugoidulla 5 vasta-aineella (10 pg/ml), minkä jälkeen niiden annettiin reagoida fytoerytriiniin konjugoidun avidiinin kanssa (PE-Αν). Solujen värjäytyminen PE-Av:llä analysoitiin FACS:llä. Tulokset esitetään alla taulukossa 2.
Taulukko 2
Esto__Värjäävä vasta-aine_
Ab__4D9-8 4D9-9 24-31 24-43 89-76 89-79 ei mitään +++__+++__++++ ++++ ++++ ++++ 4D9-8 ND - ++++ ++++ +++__+++ 4D9-9 +++__ND__+++__++++ +++__+++ 24-31__+__+__ND__+++__++__++ 24-43__+__+__+++__ND__++__+_ 89-76 +__+__+++__+++__ND__+++
89-79 +__++__+++__+++__+++__ND
·;, 10 Värjäytymisen intensiteetti ja positiivisten solujen prosenttimäärä esitetään symbo- lilla + (++++ = MI>200, +++ = MI>125; ++ = MI>50; + = MI >25; - = ei sellaista värjäytymistä, joka on enemmän kuin tausta). ND = ei määritetty.
Kaikki vasta-aineet estivät CD40Ig:n sitoutumisen aktivoituihin humaani PBL:iin. : Taulukossa 2 esitetyt tulokset kuitenkin havainnollistavat selvästi, että joidenkin • I t 15 vasta-aineiden epäonnistui estää muiden vasta-aineiden sitoutuminen aktivoituihin humaani PBJ:iin, mikä viittaa siihen, että ne tunnistavat humaani gp39-molekyyleil- , ·... lä erilaisia epitooppeja.
• · · • · *
Hybridoomat 89-76 ja 24-31, jotka tuottavat vastaavasti 89-76 ja 24-31-vasta-aineita, talletettiin Budapestin sopimuksen säädösten mukaan the American type 20 Culture Collectioniin, Parklawn Drive, Rockville, Md., syyskuun toisena päivänä • 1994. Hybridoomalle 89-76 annettiin ATCC-tulonumero HB 11713 ja hybridoomal- '... ‘ le 24-31 annettiin ATCC-tulonumero HB 11712.
29 106927
Koe 3 - Hiiren gp39:ään kohdistetut vasta-aineet
Keksinnön eräässä sovellusmuodossa gp39-antagonisti on monoklonaalinen anti-hiiri-gp39-vasta-aine, MR1. Monoklonaalisen MRI-vasta-aineen tuottamiseksi käytettiin seuraavaa menetelmää ja sitä voidaan käyttää muiden gp39:ään kohdistuvien 5 vasta-aineiden tuottamiseen.
Hamsterit immunisoitiin vatsakalvonontelon sisäisesti 5-106:lla aktivoidulla Thl-solulla (dl.6) viikon välein kuuden viikon ajan. Kun seerumin tiitteri hiiren Thl:tä kohtaan oli suurempi kuin noin 1:10 000, solut sulautettiin yhteen polyetyleeni-glykolin kanssa käyttämällä immuunin hamsterin splenosyyttejä ja NS-l:tä. Sellaiset 10 supematantit, jotka saatiin kammioista, jotka sisälsivät kasvavia hybridoomia, seulottiin virtaussytometrillä, lepäävällä ja aktivoidulla Thl:llä. Eräs erityinen hybri-dooma, joka tuotti Mab:tä, joka selektiivisesti tunnisti aktivoidun Th:n, tutkittiin edelleen ja alakloonattiin MRl:n saamiseksi. MR1 tuotettiin askiteksessä ja se puhdistettiin ioninvaihto-HPLC:llä. Hybridooma MR1 on talletettu the American Type 15 Culture Collectioniin ja sille on annettu tulonumero HB 11048.
Esimerkeissä sekä keksinnön yksityiskohtaisessa kuvauksessa viitataan numeroin seuraaviin viitteisiin.
1. Inaba K., M.D. Witmer, R.M. Steinman, 1984, Clustering of dendritic cells, helper T lymphocytes, and B cells during primary antibody resposes in vitro. J. Exp. ·:·. 20 Med. 160:858.
< ( c : 2. Inaba K., R.M. Steinman. 1985. Protein-specific helper T-lymphocyte formation v initiated by dendritic cells. Science. 229:475.
• · · « · · . .·. 3. Noelle R.J., E.C. Snow. 1991. Cognate Interractions of helper T-cells and B- cells. Immunol. Tod. 11:361.
25 4. Gordon J., M.J. Millsum, G.R. Guy, J.A. Ledbetter. 1987. Synergistic interaction • · · ;between interleukin 4 and anti-Bp50 (CDw40) revealed in a novel B cell restimula- ”*: tion assay. Eur. J. Immuno. 17:1535.
• . 5. Clark E.A., J.A. Ledbetter. 1986. Activation of human B cells mediated through :...: two distinct cell surface differentiation antigens, Bp35 ja Bp 50. Proc. Natl. Acad.
30 Sei. USA.. 83:4494.
30 1 0 6 9 2 7 6. Stamenkovic I., E.A. Clark, B. Seed. 1989. A B-lymphocyte activation molecule related to the nerve growth factor receptor and induced by cytokines in carcinomas. EMBO. 8:1403.
7. Hollenbaugh D., L. Grosmaire. C.D. Kullas, N.J. Chalupny, R.J. Noelle, I. Sta- 5 menkovic, J.A. Ledbetter, A. Aruffo, 1992. The human T cell antigen p39, a member of the TNF gene family, is aligand for the CD40 receptor: Expression of soluble form of gp39 with B cell co-stimulatory activity. EMBO. 11: 4313.
8. Armitage R.J., W.C. Fanslow, L. Stockbine, T.A. Sato, K.N. Clifford, B.M. Macduff, D.M. Anderson, S.D. Gimpel, T.Davis-Smith, C.R. Maliszewski, E.A.
10 Clark, C.A. Smith, K.H. Gragstein, D. Cosman, M.K. Spriggs. 1992. Molecular and biological characterization of a murine ligand for CD40. Nature. 357:80.
9. Valle A., C.E. Zuber, T. Deffance, O. Djossou, R.M. De, J. Banchereau. 1989. Activation of human B lymphocytes through CD40 and interleukin 4. Eur. J. Immunol. 19:1463.
15 10. Gordon J., M.J. Millsum, R.L. Flores, S. Gillis. 1989. Regulation of resting and cycling human B lymphocytes via surface the accessory molecules interleukin-4, DC23 and CD40. Immunology. 68:526.
11. Jabara H.H., S.M. Fu, R.S. Geha, D. Vercelli. 1990. CD40 and IgE: synergism between anti-CD40 monoclonal antibody and interleukin 4 in the induction of IgE
‘; ‘ 20 synthesis by highly purified human B cells. J. Exp. Med. 172:1861.
12. Banchereau J., F. Rousset. 1991. Growing human B lymphocytes in the CD40 system. Nature. 353:678.
• · · ’·:·* 13. Armitage R.J., T.A. Sato, B.M. Macduff, K.N. Clifford, A.R. Alpert, C.A.
; Smith, W.C. Fanslow. 1992, Identification of source of biologically active CD40 li- 25 gand. Eur. J. Immunol. 22:2071.
• · · • · • · ,·*·. 14. Lane P., A. Traunecker, S. Hubele, S. Inui, A. Lanza-vecchia, D. Gray. 1992.
T Activated human T cells express a ligand for the human B cell-associated antigen ,,:: CD40 which participates in T-cell-dependent activation of B lymphocytes. Eur. J.
:,,,: Immunol. 22:2573.
30 15. Noelle R.J., J.A. Ledbetter, A. Aruffo. 1992. CD40 and its ligans, an essential ':" · ligand-receptor pair for thymus-dependent B cell activation. Immunol. Tod. 13:431.
3i 106927 16. Noelle R.J., M.Roy, D.M. Shepherd, I. Stamenkovic, J.A. Ledbetter, A. Aruffo. 1992. A novel ligand on activated T helper cells binds CD40 and transduces the signal for the cognate activation of B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:6550.
17. Allen R.C., R.J. Armitage, M.E. Conley, H. Rosenblatt, N.A. Jenkins, N.G. Co-5 peland, M.A. Bedell, S. Edelhoff, J. Disteche, D.K. Simoneaux, W.C. Fanslow, J.
Belmont, M.K. Spriggs. 1993. CD40 ligand gene defects responsible for X-linked hyper-IgM Syndrome. Science. 259:990.
18. Aruffo A., M. Farrington, D. Hollenbaugh, Li X., A. Milatovich, S. Nonoyama, J. Bajorath, L.S. Grosmaire, R. Stenkamp, M. Neubauer, R.L. Roberts, R.J. Noelle, 10 Ledbetter, U.J.A. Franke, H.D. Ochs. 1993. The CD40 ligand, gp39, is defective in activated T cells from patients with X-linked hyper- IgM syndrome. Cell. 72:291.
19. DiSanto J.P., J.Y. Bonnefoy, J.F. Gauchat, A. Fischer, G. de Saint Basile. 1993. CD40 ligand mutations in X- linked immunodefiency with hyper- IgM. Nature. 361:541.
15 20. Korthauer U., D. Graf, H.W. Mages, F. Brieres, M. Padayachee, S. Malcolm, A.G. Ugazio, L.D. Notarangelo, R.L. Levinsky, A. Kroczek. 1993. Defective Expression of T-cell CD40 ligand causes X-linked immunodeficiency with hyper-IgM. Nature. 361:539.
21. Kurt-Jones E., S. Hamberg, J. Ohara, W.E. Paul, A.K. Abbas. 1987. Heteroge-‘;' 20 neity of helper/inducer T lymphocytes. I. Lymphokine production. J. Exp. Med.
: 166:1774.
i 1 · • 4 4 « « ( .1·1. 22. Springer T.A., A. Bhattacharya, J.T. Cardoza, F. Sanchez-Madrid. 1982. Mo- . noclonal antibodies specific for rat IgGl, IgG2a, and IgG2b subclasses, and kappa ,1[1. chain monotypic and allotypic determinants: reagents for use with rat monoclonal 25 antibodies. Hybrid. 1:25.
23. Hellström I. 1986. Monoclonal mouse antibodies raised against human lung carcinoma. Can. Res. 46:3917.
« ..: : 24. Wilde D.B., P. Marrack, J. Kappler, D.P. Dialynas, F.W. Fitch. 1983. Evidence implicating L3T4 in class II MCH antigen reactivity; monoclonal antibody GK1.5 30 (anti-L3T4a) blocks class II MHC antigen-specific proliferation, release of _'''; lymphokines, and binding by cloned murine helper T lymphocyte lines. J. Immunol.
131:2178.
32 106927 25. Sbow E.C., R.J. Noelle. 1987. Thymus-dependent antigenic stimulation of hapten-specific B lymphocytes. Immuno. Rev. 99:173.
26. Jeme N.K.C. Henry, A.A. Nordin, H. Fuji, A.M. Koros, and I. Lefkovits. 1974. Plaque forming cells: Methodology and theory. Transplant Rev. 18:130.
5 27. Ochs H.D., R.J. Wedgewood. 1989. Disorders of the B cell system. In Immuno logic disorders in infants and children. Third, ed., E.R. Sreihm, ed. (Philadelphia: W.B. Saunders), s. 226.
28. Notarangelo L.D., M. Duse, A.G. Ugazio. 1992. Immunodeficiency with hyper-IgM (HIM). Immunodef. Rev. 3:101.
10 29. Shiruzu J.A., S.A. Alters, C.G. Fathman, 1992. Anti-CD4 monoclonal antibo dies in therapy: Creation of nonclassical tolerance in the adult. Immunol. Rev. 129:103.
30. Linsley P.S., P.M. Wallace, J. Johnson, M.G. Gibson, J.L. Greene, J.A: Ledbetter, C. Singh, M.A. Tepper. 1992. Immunosuppression in vivo by a soluble 15 form of the CTLA-4T cell activation molecule. Science. 257:792.
31. Lenschow D.J., Y. Zeng, J.R. Thislethwaite, A. Montag, W. Brady, M.G. Gibson, P.S. Linsley, J.A. Bluestone. 1992. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA41g. Science. 257:789.
I I I
Samanarvoisuudet v : 20 Alan ammattimies tulee näkemään tai pystyy varmistamaan, ainoastaan rutiinimaisia • · · menetelmiä käyttämällä, monia samanarvoisuuksia tässä dokumentissa kuvatun keksinnön sovellusmuodon kanssa. Sellaiset samanarvoisuudet tarkoitetaan sisälly-tettäviksi seuraaviin patenttivaatimuksiin. 1 · · ·»· • · · •
I I
( I
( I (
'1114 I I
Claims (11)
1. Menetelmä sen määrittämiseksi in vitro, onko antigeeni TD-antigeeni (tyymuksesta riippuvainen antigeeni) vai TI-2-antigeeni (tyymuksesta riippumaton antigeeni), tunnettu siitä, että T- ja B-solut altistetaan koostumukselle, jossa on an- 5 tigeenia ja gp39-antagonistia, ja määritetään, estyvätkö humoraaliset immuunivasteet mainitulle antigeenille.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antagonisti on anti-gp39-vasta-aine.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että TD-antigeeni 10 on proteiini.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että TD-antigeeni on vasta-aine.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että TD-antigeeni . ekspressoituu solun pinnalla.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antagonisti on gp39-ligandin liukoinen muoto.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antagonisti on liukoinen CD40-fuusioproteiini.
: 8. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anti-gp39- ;':': 20 vasta-aine on kimeerinen monoklonaalinen vasta-aine. * * ·
9. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anti-gp39- t · · *·*·' vasta-aine on humanisoitu monoklonaalinen vasta-aine. • · · • · I • · ·
10. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anti-gp39-vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine 24-31 (ATCC HB 11712). • · · • · · • · ···' 25
11. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että anti-gp39- ; ’ i ‘: vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine 89-76 (ATCC HB 11713). I · I I I I I • « · « · · « I · 34 106927
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11599093A | 1993-09-02 | 1993-09-02 | |
| US11599093 | 1993-09-02 | ||
| US08/232,929 US5869049A (en) | 1993-09-02 | 1994-04-25 | Methods of inducing T cell unresponsiveness to bone marrow with gp39 antagonists |
| US23292994 | 1994-04-25 | ||
| US9409872 | 1994-09-02 | ||
| PCT/US1994/009872 WO1995006480A1 (en) | 1993-09-02 | 1994-09-02 | Methods of prolonged suppression of humoral immunity |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI960979A0 FI960979A0 (fi) | 1996-03-01 |
| FI960979A FI960979A (fi) | 1996-04-30 |
| FI106927B true FI106927B (fi) | 2001-05-15 |
Family
ID=26813793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI960979A FI106927B (fi) | 1993-09-02 | 1996-03-01 | Menetelmä sen määrittämiseksi, onko antigeeni TD-antigeeni vai TI-2-antigeeni |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0742721B1 (fi) |
| JP (1) | JP2840131B2 (fi) |
| CN (1) | CN1137726C (fi) |
| AT (1) | ATE179616T1 (fi) |
| AU (3) | AU7643094A (fi) |
| DE (1) | DE69418349T2 (fi) |
| DK (1) | DK0742721T3 (fi) |
| ES (1) | ES2134954T3 (fi) |
| FI (1) | FI106927B (fi) |
| GR (1) | GR3030762T3 (fi) |
| IL (1) | IL110852A (fi) |
| NO (1) | NO321037B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ273208A (fi) |
| WO (1) | WO1995006480A1 (fi) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7070777B1 (en) | 1991-11-15 | 2006-07-04 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for inhibiting inflammation with an antibody that binds the 5C8 protein |
| US5474771A (en) | 1991-11-15 | 1995-12-12 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same |
| US5876950A (en) * | 1995-01-26 | 1999-03-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Monoclonal antibodies specific for different epitopes of human GP39 and methods for their use in diagnosis and therapy |
| US6001358A (en) | 1995-11-07 | 1999-12-14 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof |
| US6440418B1 (en) | 1995-11-07 | 2002-08-27 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Methods of treating autoimmune diseases with gp39-specific antibodies |
| DE69837322T2 (de) * | 1997-01-10 | 2007-11-22 | Biogen Idec Ma Inc., Cambridge | Verfahren zur therapeutischen verabreichung von anti-cd40l-mitteln |
| WO2000072882A1 (fr) * | 1999-06-01 | 2000-12-07 | Eisai Co., Ltd. | Agents prophylactiques du purpura thrombocytopenique idiopathique |
| WO2001079555A2 (en) | 2000-04-14 | 2001-10-25 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Roles of jak/stat family members in tolerance induction |
| CA2408691A1 (en) | 2000-05-12 | 2001-11-22 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. | Compositions and methods for achieving immune suppression |
| US7563443B2 (en) | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
| WO2013013708A1 (en) | 2011-07-26 | 2013-01-31 | Fundació Institut D'investigació Biomèdica De Bellvitge | Treatment of acute rejection in renal transplant |
| AU2015204503B2 (en) | 2014-01-13 | 2020-07-09 | Baylor Research Institute | Novel vaccines against HPV and HPV-related diseases |
| CA2994825A1 (en) | 2015-08-05 | 2017-02-09 | Janssen Biotech, Inc. | Anti-cd154 antibodies and methods of using them |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0897983B1 (en) * | 1991-10-25 | 2003-05-07 | Immunex Corporation | Antibody against CD40-L |
| IL104684A0 (en) * | 1992-02-14 | 1993-06-10 | Bristol Myers Squibb Co | The cd40cr receptor and ligands therefor |
| AU655349B2 (en) * | 1992-02-17 | 1994-12-15 | Kenji Nakamura | An antibacterial porous inorganic capsule and a process for producing the same |
-
1994
- 1994-09-02 EP EP94926660A patent/EP0742721B1/en not_active Revoked
- 1994-09-02 AT AT94926660T patent/ATE179616T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 WO PCT/US1994/009872 patent/WO1995006480A1/en active IP Right Grant
- 1994-09-02 JP JP7508266A patent/JP2840131B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 DE DE69418349T patent/DE69418349T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-09-02 ES ES94926660T patent/ES2134954T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-09-02 DK DK94926660T patent/DK0742721T3/da active
- 1994-09-02 AU AU76430/94A patent/AU7643094A/en not_active Abandoned
- 1994-09-02 IL IL11085294A patent/IL110852A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 NZ NZ273208A patent/NZ273208A/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-09-02 CN CNB941940055A patent/CN1137726C/zh not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-03-01 FI FI960979A patent/FI106927B/fi active
- 1996-03-01 NO NO19960863A patent/NO321037B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-01-29 AU AU14220/99A patent/AU734853B2/en not_active Ceased
- 1999-07-14 GR GR990401847T patent/GR3030762T3/el unknown
-
2004
- 2004-12-16 AU AU2004240180A patent/AU2004240180B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69418349T2 (de) | 1999-09-09 |
| NO960863L (no) | 1996-04-30 |
| GR3030762T3 (en) | 1999-11-30 |
| DE69418349D1 (de) | 1999-06-10 |
| JP2840131B2 (ja) | 1998-12-24 |
| FI960979A (fi) | 1996-04-30 |
| NO321037B1 (no) | 2006-03-06 |
| EP0742721A1 (en) | 1996-11-20 |
| AU734853B2 (en) | 2001-06-21 |
| NZ273208A (en) | 2000-12-22 |
| NO960863D0 (no) | 1996-03-01 |
| FI960979A0 (fi) | 1996-03-01 |
| DK0742721T3 (da) | 1999-11-01 |
| JPH09502184A (ja) | 1997-03-04 |
| AU2004240180A1 (en) | 2005-01-27 |
| WO1995006480A1 (en) | 1995-03-09 |
| AU7643094A (en) | 1995-03-22 |
| AU2004240180B2 (en) | 2007-08-09 |
| ES2134954T3 (es) | 1999-10-16 |
| IL110852A0 (en) | 1994-11-28 |
| IL110852A (en) | 1999-05-09 |
| CN1137726C (zh) | 2004-02-11 |
| AU1422099A (en) | 1999-04-01 |
| ATE179616T1 (de) | 1999-05-15 |
| CN1137758A (zh) | 1996-12-11 |
| EP0742721B1 (en) | 1999-05-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI118792B (fi) | Käyttöjä T-solutoleranssin indusoinniksi kudos- tai elinsiirrännäiselle | |
| FI106306B (fi) | Menetelmä anti-GP39-vasta-aineiden valmistamiseksi | |
| US5942229A (en) | Method for prolonged suppression of humoral immune response to a thymus-dependent antigen therapeutic agent | |
| FI106927B (fi) | Menetelmä sen määrittämiseksi, onko antigeeni TD-antigeeni vai TI-2-antigeeni | |
| AU779647B2 (en) | Methods of prolonged suppression of humoral immunity | |
| AU678532C (en) | Methods for inducing antigen-specific T cell tolerance | |
| HU220192B (hu) | Gyógyszerkészítmények a humorális immunitás gátlására |