NO321037B1 - Anvendelse av en gp39-antagonist og et TD antigen for fremstilling av et farmasoytisk preparat. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en gp39-antagonist og et TD

antigen for fremstilling av et farmasøytisk preparat.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Immunsystemet er i stand til å produsere to typer av antigen-spesifikke responser til fremmed antigen. Celle-

formidlet immunitet er betegnelsen som anvendes for å referere til effektorfunksjoner av immunsystemet formidlet av T-lymfocytter. Humoral immunitet er betegnelsen som anvendes for å referere til fremstilling av antigen-spesifikke antistoffer av B-lymfocytter.

Det har lenge vært anerkjent at utviklingen av humoral immunitet mot de fleste antigener

vil kreve ikke bare antistoff-produserende B-lymfocytter, men også involvering av hjelpe T (heretter Th)-lymfocytter. Mitchison, Eur. J. Immunol., 1:18-25 (1971); Claman og Chaperon, Transplant Rev., 1:92-119 (1969); Katz et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 70:2624-2629 (1973); Raff et al., Nature, 226:1257-1269 (1970). Visse signaler, eller "hjelp", tilveiebringes av Th-celler i respons på stimulering av thymus-avhengige (heretter TD)-antigener. Selv om en viss B-lymfocytt-hjelp formidles av løselige molekyler som

frigis av Th-celler (f.eks. lymfokiner såsom IL-4 og IL-5), vil aktivering av B-celler også

kreve en kontakt-avhengig interaksjon mellom B-celler og Th-celler. Hiroata et al., J.

Immunol., 140:3736-3744 (1988); Bartlett et al., J. Immunol., 143:1745-1754 (1989).

Dette viser at B-celleaktivering involverer en obligatorisk interaksjon mellom celleoverflatemolekyler på B-celler og Th-celler. En slik interaksjon understøttes videre ved den observasjon at isolerte plasmamembraner fra aktiverte T-celler kan tilveiebringe hjelperfunksjoner som er nødvendige for B-celleakitvering. Brian, Proe. Nati. Acad. Sei.

USA, 85:564-568 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol. 145:2025-2034 (1990); Noelle et al., J. Immunol.,146:1118-1124 (1991).

Et celleoverflatemolekyl, CD40, er blitt identifisert på umodne og modne B-

lymfocytter, som når de tverrbindes av antistoffer, induserer B-celleformering. Valle et al.,

Eur. J. Immunol., 19:1463-1467 (1989); Gordon et al., J. Immunol., 140:1425-1430

(1988); Gruber et al., J. Immunol., 142:4144-4152 (1989). CD40 er blitt klonet molekylært

og karakterisert. Stamenkovic et al., EMBO J., 8:1403-1410 (1989). En ligand for CD40,

gp39 (også kalt CD40-ligand eller CD40L) er også blitt klonet molekylært og karakterisert. Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101

(1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992). gp39-proteinet uttrykkes på aktiverte, men ikke hvilende, CD4<+> Th-celler. Spriggs et al., J. Exp. Med., 176:1543-1550

(1992); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22:2573-2578 (1992); Roy et al., J. Immumol., 151:1-14 (1993). Celler transfektert med gp39-genet og som uttrykker gp39-proteinet på sin overflate, kan utløse B-celleformering, og sammen med andre stimulatoriske signaler kan de indusere antistoff-fremstilling. Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992).

Selv om induksjon av en humoral immunrespons er en viktig mekanisme i vertsforsvaret, ville det i visse situasjoner være gunstig å undertrykke fremstilling av antistoff mot et bestemt antigen. F.eks. ville undertrykkelse av en humoral respons mot et allergen kunne forebygge eller redusere en allergen respons hos et individ. Dessuten, når et terapeutisk antistoff blir administrert, ville undertrykkelse av en humoral respons mot antistoffet kunne forlenge den terapeutiske virkning av antistoffet.

Sammendrag av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av en gp39-antagonist og et thymus avhengig (TD) antigen for fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av en humoral immunrespons til TD antigenet in vivo.

Én tilnærming til undertrykkelse av humoral immunitet er å inhibere B-celleaktiveringen. Den humorale immunrespons på et TD-antigen inhiberes in vivo ved å inhibere Th-cellens evne til å stimulere en B-celle, og derved interferere med B-celleaktiv-eringen og antistoffremstillingen. En in vivo interaksjon mellom gp39 på en Th-celle og CD40 på en B-celle for påfølgende aktivering av B-cellen er nødvendig. Antagonister for gp39, som er effektive for inhibering av interaksjonen av gp39 med CD40 in vivo, blir administrert til et individ sammen med et TD-antigen for å undertrykke humoral immunitet mot TD-antigenet. gp39-antagonisten som administreres kan være et antistoff rettet mot gp39. I en foretrukket utførelse vil gp39-antagonisten være et monoklonalt antistoff, såsom et anti-humant gp39-antistoff eller et anti-mus gp39-antistoff (f.eks. MR1). Kimæreantistoffer, humaniserte antistoffer og antistoff-fragmenter er også innenfor rammen av denne oppfinnelse. Alternativt kan gp39-antagonisten være en løselig form av gp39-liganden CD40. Løselige fusjonsproteiner av CD40 omfattes også av denne oppfinnelse.

Den humorale immunrespons som inhiberes kan være en primær humoral immunrespons, i tilfellet en første eksponering for et anti-gen, eller en sekundær humoral immunrespons, i tilfellet re-eksponering for et tidligere påstøtt antigen. Produksjon av antigen-spesifikke IgM-antistoffer, IgG-antistoffer, IgD-antistoffer og/eller IgE-antistoffer kan følgelig inhiberes. Forlenget undertrykkelse av humorale immunresponser in vivo oppnås også.

Inhibering av humorale immunresponser til TD-antigener er følgelig mulig. Oppfinnelsen omfatter følgelig anvendelse ifølge krav 1, hvori den humorale immunresponsen til et TD antigen omfatter en antigen spesifikk IgE respons til et TD antigen. Antigener omfattet anvendt i denne oppfinnelse inkluderer antigener for hvilke spesifikk antistoff-frernstilling krever interaksjon av gp39 med en ligand på overflaten av B-celler (f.eks. CD40). TD-antigener omfatter generelt proteinholdige antigener. Oppfinnelsen omfatter videre anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, hvori TD antigenet er et protein, TD antigenet er på celleoverflaten eller TD antigenet er et antistoff eller et terapeutisk middel.

Et annet aspekt ifølge denne oppfinnelse vedrører anvendelse av en gp39-antagonist og et TD antigen for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for inhibering av hjelper funksjonen til aktiverte Th celler indusert av TD antigenet in vivo. Dette skjer ved å interferere med interaksjonen av gp39 med en Ugand på overflaten av B-celler (f.eks. CD40) ved administrering av en gp39-antagonist. Ifølge denne fremgangsmåte inhiberes hjelpefunksjonen av aktiverte Th-celler in vivo uten utsletting eller anergisering av Th-celler.

Oppfinnelsen gjelder videre anvendelse av en gp39 antagonist for fremstilling av et farmasøytisk preparat for indusering av forlenget inhibisjon av én humoral immunrespons til et TD antigen in vivo i et individ som har blitt eksponert for TD antigenet. Det er videre mulig å kombinere en gp39-antagonist med et annet immunsuppresivt middel. Andre immunsuppresive midler som kan tilveiebringes i forbindelse med en gp39-antagonist, inkluderer cytokin-inhibitorer, inhibitorer av den CD28/CTLA4 T-celle ko-stimulatoriske mekanisme, eller immunsuppresive medikamenter.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. IA er et søylediagram som viser undertrykkelse av primær anti-SRBC IgM antistoffproduksjon ved in vivo anti-gp39-behandling. Fig. IB er et diagram som viser forlenget undertrykkelse av primær anti-SRBC IgM antistoffproduksjon etter kort tids in vivo anti-gp39-behandling. Fig. 2A er et søylediagram som viser undertrykkelse av sekundær anti-KLH antistoffproduksjon (forskjellige isotyper) ved in vivo anti-gp39-behandling. Antistofftitere ble målt

7 dager etter antigenutfordring.

Fig. 2B er et søylediagram som viser undertrykkelse av sekundær anti-KLH antistoffproduksjon (forskjellige isotyper) ved in vivo anti-gp39-behandling. Antistofftitere ble målt

14 dager etter antigenutfordring.

Fig. 3 er to søylediagram som viser undertrykkelse av primær anti-ChiL6 IgM antistoffproduksjon (venstre) og sekundær anti-ChiL6 IgGl antistoffproduksjon (høyre) ved in vivo anti-gp39-behandling. Fig. 4A er et søylediagram som viser undertrykkelse av primær anti-TNP IgM antistoffproduksjon ved immunisering med TNP-SRBC og in vivo anti-gp39-behandling. Fig. 4B er et søylediagram som viser mangel på undertrykkelse av primær anti-TNP IgM antistoffproduksjon ved immunisering med TNP-Ficoll og in vivo anti-gp39-behandling.

Fig. 5 er et søylediagram som viser intakt hjelpe-

aktivitet av T-celler tidligere eksponert for anti-gp39-behandling in vivo etter adoptiv overføring til ubehandlede mus, som viser at anti-gp39-administrering ikke funksjonelt utsletter Th-celler.

Fig. 6A er et Western blot som viser anti-gp39-antistoff til stede i serum 7,14 og 21 dager etter in vivo administrering. Fig. 6B er et diagram som viser prosent av gjenværende anti-gp39-aktivitet i serum 7,14 og 21 dager etter in vivo administrering. Fig. 7A, B og C er flow-cytometriske profiler som viser farvingen av 6 timer aktiverte humant perifert blod lymfocytter med enten CD40Ig (diagram A), mAb 4D9-8 (diagram B) eller mAb 4D9-9 (diagram C). Fig. 8 A, B og C er flow-cytometriske profiler som viser farvingen av 6 timer aktiverte humant perifert blod lymfocytter dyrket i nærvær av cyklosporin A farvet med enten

mAb 4D9-8 (diagram A) mAb 4D9-9 (diagram B) eller CD40Ig (diagram C).

Fig. 9A og B er flow-cytometriske profiler som viser farvingen av 6 timer aktiverte humant perifert blod lymfocytter med CD40Ig i nærvær av umerket mAb 4D9-8 (diagram A) eller umerket mAb 4D9-9 (diagram B). Fig. 10 er en grafisk fremstiling av inhiberingen av human B-celleformering indusert av løselig gp39 og DL-4 når celler er dyrket i nærvær av anti-humane gp39 mAb'er 4D9-8,4D9-9,24-31,24-43,89-76 eller 89-79. Fig. 11 er en grafisk gjengivelse av inhiberingen av en allo-spesifikk blandet lymfocyttrespons når celler er dyrket i nærvær av anti-humane gp39 mAb'er 24-31 eller 89-79.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Dannelsen av humoral immunitet mot thymus-avhengige (TD)-antigener krever ikke bare B-lymfocytter som kan frembringe spesifikke antistoffer mot et antigen, men også bidrag fra Th-celler som er nødvendige for aktivering av B-lymfocytter. Selv om T-celle-hjelpefunksjonen involverer fremstilling av cytokiner som anvendes av B-lymfocytter, kan Th-cellenes krav om B-celleaktivering ikke elimineres ved å tilveiebringe eksogene cytokiner for B-cellene. I stedet vil en kontakt-avhengig, cellemembran-formidlet interaksjon mellom B-celler og Th-celler være vesentlig for indusering av humorale responser. Et reseptor-ligand par involvert i denne interaksjon, CD40 og gp39, er identifisert. CD40 er til stede på B-celler og har evnen til å binde seg til gp39, som blir indusert på Th-celler etter aktivering, og fører til stimulering av B-cellene og til slutt til fremstilling av spesifikke antistoffer. Ødeleggelse av CD40-gp39-interaksjonen gir et middel til å interferere med dannelsen av en spesifikk humoral immunrespons.

Følgelig gjelder denne oppfinnelse anvendelse av en gp39-antagonist og et thymus avhengig (TD) antigen for fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av en humoral immunrespons til TD antigenet in vivo.

Humorale immunresponser inhiberes ved å interferere med interaksjonen av et molekyl på en Th-celle som formidler kontakt-avhengig hjelpe-effektorfunksjon og dens ligand på overflaten av en B-lymfocytt. I en foretrukket utførelse inhiberes humorale immunresponser ved å interferere med interaksjonen av gp39 på en T-celle og CD40 på en B-celle eksponert for TD-antigenet gjennom administrering av en gp39-antagonist til et individ in vivo. I én utførelse eksponeres B-cellen for TD-antigenet ved administrering av antigenet in vivo med gp39-antagonisten. Fortrinnsvis vil dette TD-antigen være et terapeutisk middel, f.eks. et terapeutisk antistoff eller medikament, som administreres til pasienten for terapeutisk behandling, og for hvilket inhibering av humorale immunresponser mot dette kan resultere i forlenget terapeutisk virkning av midlet. I en annen utførelse vil TD-antigenet være et antigen som et individ eksponeres for miljømessig, f.eks. et allergen, og hvori en humoral immunrespons er skadelig for individet, og f.eks. resulterer i en allergisk reaksjon. Inhibering av en humoral immunrespons i denne situasjon ville være terapeutisk gunstig for individet.

I. gp39-antagonister

En gp39-antagonist administreres til et individ for å interferere med interaksjonen av gp39 på T-celler med en gp39-ligand på B-celler. En gp39-antagonist defineres som et molekyl som interfererer med denne interaksjon. gp39-antagonisten kan være et antistoff rettet mot gp39, f.eks. et monoklonalt antistoff mot gp39, fragmenter eller derivat av et antistoff rettet mot gp39, f.eks. Fab eller F(b)'2-fragmenter, kimæreantistoffer eller humaniserte antistoffer, løselige former av en gp39-ligand, f.eks. løselig CD40, løselige former av et fusjonsprotein av en gp39-ligand, f.eks. løselig CD40Ig, eller farmasøytiske midler som avbryter gp39-CD40-interaksjonen.

A. Antistoffer

Et pattedyr, f.eks. en mus, hamster eller kanin kan immuniseres med en immunogen form av gp39-protein eller proteinfragmenter, f.eks. peptidfragment, som fremkaller en antistoffrespons i pattedyret. En celle som uttrykker gp39 på sin overflate kan også anvendes som immunogenet. Alternative immunogener omfatter renset gp39-protein eller protein-

fragmenter. gp39 kan renses fra en gp39-uttrykkende celle ved standard renseteknikk; gp39 cDNA (Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med.,

175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)) kan uttrykkes i en vertscelle, f.eks. bakterier eller en pattedyrcellelinje, og gp39-proteinet renses. gp39-peptider kan syntetiseres basert på aminosyresekvensen til gp39 (Armitage et al., Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11:4313-4319 (1992)). Teknikker for å gi immunogenisitet til et protein omfatter konjugering til bærere eller andre teknikker velkjent i teknologien. F.eks. kan proteinet administreres i nærvær av adj uvans. Utviklingen av immuniseringen kan overvåkes ved bestemmelse av antistoff-titere i plasma eller serum. Standard ELISA eller

annen irnmunoassay kan anvendes med immunogenet som antigen for å bestemme nivået av antistoffer.

Etter immunisering kan det oppnås antisera og, om ønsket, polyklonale antistoffer isolert fra disse sera. For å fremstille monoklonale antistoffer kan antistoffproduserende celler (lymfocytter) høstes fra et immunisert dyr og sammensmeltes med myelomaceller ved standard somatiske cellefusjons-fremgansgmåter for således å udødeliggjøre disse celler og gi hybridomaceller. Slike teknikker er velkjent i teknologien. F.eks. hybridomateknikken opprinnelig utviklet av Kohler og Milstein (Nature (1975) 256:495-497) såvel som annen teknikk såsom human B-celle hybridomateknikken (Kozbar et al., Immunol. Today (1983) 4:72), EBV-hybridomateknikken for fremstilling av humane monoklonale antistoffer (Cole et al., Monoclonal Antibodies in Cancer Therapy (1985)

(Allen R. Bliss, Inc. s. 77-96), og screening av kombinatoriske antistoff-bibliotek (Huse et al., Science (1989) 246:1275). Hybridomaceller kan screenes immunokjemisk for fremstilling av antistoffer som er spesifikt reaktive med proteinet eller peptidet og monoklonale antistoffer isoleres.

Betegnelsen antistoff som anvendt her er ment å omfatte fragmenter derav som også er spesifikt reaktive med gp39-protein eller peptid derav eller gp39 fusjonsprotein. Antistoffer kan fragmenteres ved anvendelse av konvensjonell teknikk, og fragmentene screenes for anvendelighet på samme måte som beskrevet ovenfor for hele antistoffer. F.eks. kan det dannes Ftab^-fragmenter ved behandling av antistoff med pepsin. Det resulterende Ffab^-fragment kan behandles for å redusere disulfidbroer under dannelse av Fab-fragmenter. Antistoffet er videre ment å omfatte bispesifikke og kimæremolekyler som har en anti-gp39-del.

Når antistoffer fremstilt i ikke-humane individer blir anvendt terapeutisk på mennesker, blir de gjenkjent i varierende grad som fremmede, og en immunrespons kan dannes i pasienten. Én tilnærming for å minimalisere eller eliminere dette problem, som er å foretrekke fremfor generell immun-undertrykkelse, er å frembringe kimære antistoff-derivater, d.v.s. antistoffmolekyler som kombinerer en ikke-human dyr variabel region og en human konstant region. Kimære antistoff-molekyler kan omfatte f.eks. det antigen-bindende domene fra et antistoff fra en mus, rotte eller andre arter, med humane konstante regioner. Flere forskjellige tilnærminger for fremstilling av kimære antistoffer er beskrevet, og kan anvendes til å lage kimære antistoffer som inneholder den immunoglobulin-variable region som gjenkjenner gp39. Se f.eks. Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:6851 (1985); Takeda et al., Nature 314:452 (1985), Cabilly et al., US-patent nr. 4.816.567; Boss et al., US-patent nr. 4.816.397; Tanaguchi et al., Europeisk patentpublikasjon EP171496;

Europeisk patentpublikasjon 0173494, britisk patent GB 2177096B. Det forventes at slike kimære antistoffer ville være mindre immunogene i et humant individ enn det tilsvarende ikke-kimæreantistoff.

For human terapeutiske formål kan de monoklonale eller kimære antistoffer som er spesifikt reaktive med et gp39-protein eller peptid humaniseres ytterligere ved fremstilling av humane konstant region chimerer, hvori deler av de variable regioner, spesielt de konserverte rammeverk-regioner av det antigen-bindende domene, er av human opprinnelse og bare de hypervariable regioner er av ikke-human opprinnelse. Slike forandrede immunglobulin-molekyler kan lages ved hvilken som helst av flere teknikker kjent i teknologien (f.eks. Teng et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., 80:7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today, 4:7279 (1983); Olsson et al., Meth. EnzymoL, 92:3-16

(1982)), og lages fortrinnsvis ifølge beskrivelsene i PCT-publikasjon WO92/06193 eller EP 0239400. Humaniserte antistoffer kan fremstilles kommersielt av f.eks. Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, GB.

En annen fremgangsmåte til å danne spesifikke antistoffer, eller antistoff-fragmenter, reaktive mot et gp39-protein eller peptid, er å screene ekspresjonsbibliotek som koder for immunglobulin-gener, eller deler derav, uttrykt i bakterier med et gp39-protein eller peptid. F.eks. kan komplette Fab-fragmenter, VH-regioner og FV-regioner uttrykkes i bakterier ved anvendelse av fag-ekspresjonsbibliotek. Se f.eks. Ward et al., Nature, 341:544-546 (1989); Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989); og McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Screening av slike bibliotek med f.eks. et gp39-peptid kan identifisere immunoglobulinfragmenter reaktive med gp39. Alternativt kan SCID-hu musen utviklet av Genpharm, anvendes til fremstilling av antistoffer eller fragmenter derav.

B. Løselige ligander for gp39

Andre gp39-antagonister som kan administreres for å undertrykke humoral immunitet er løselige former av en gp39-ligand. En enverdig løselig ligand av gp39 kan binde gp39 og derved inhibere interaksjonen av gp39 med CD40 på B-celler. Uttrykket løselig indikerer at liganden ikke er permanent forbundet med en cellemembran. En løselig gp39-ligand kan fremstilles ved kjemisk syntese, eller fortrinnsvis ved rekombinant DNA-teknikk. En foretrukket løselig gp39-ligand er løselig CD40. Alternativt kan en løselig gp39-ligand være i form av et fusjonsprotein. Et slikt fusjonsprotein omfatter minst en del av gp39-liganden bundet til et andre molekyl. F.eks. kan CD40 uttrykkes som et fusjonsprotein med immunglobulin CD40Ig. I én utførelse fremstilles et fusjonsprotein omfattende aminosyrerester fra en ekstracellulær domenedel av CD40 bundet sammen med aminosyrerester av en sekvens tilsvarende hengsleregionene CH2 og CH3 av Cyl under dannelse av et CD40Ig fusjonsprotein (se f.eks. Linsley et al., (1991) J.Exp. Med. 1783:721-730; Capon et al., (1989) Nature 337,525-531; og Capon ILS. 5.116.964). Fusjonsproteinet kan fremstilles ved kjemisk syntese, eller fortirnnsvis ved rekombinant DNA-teknikk basert på cDNA fra CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403-1410

(1989)).

II. Antigener mot hvilke humoral immunitet undertrykkes

Det er følgelig beskrevet undertrykking av humoral immunitet mot antigener som krever kontaktavhengige hjelpe-funksjoner avgitt av Th-celler. Antigener klassisk beskrevet som thymus-avhengige (TD)-antigener er omfattet av denne oppfinnelse. Nødvendigheten av kontaktavhengig "hjelp" fra Th-celler kan skyldes nødvendigheten av en interaksjon mellom gp39 på T-celler og CD40 på B-celler. Som definert av foreliggende oppfinnelse er betegnelsen "TD antigen" ment å omfatte antigener som krever en gp39-CD40-interaksjon mellom T-celler og B-celler for induksjon av en humoral immunrespons mot antigenet. Generelt vil protein antigener være TD-antigener. En annen form av TD-antigen er et molekyl, referert til som et hapten, bundet til et protein. I dette tilfelle vil proteinet virke som en bærer for indusering av T-cellehjelp for å indusere humorale immunresponser mot haptenet.

TD-antigenet kan administreres i løselig form til et individ, f.eks. injeksjon av et løselig protein, eller TD-antigenet kan være på overflaten av en celle, f.eks. et celleoverflateprotein. TD-antigenet kan administreres til et individ med en gp39-antagonist eller et individ kan eksponeres for et TD-antigen miljømessig, f.eks. et allergen. I foretrukne utførelser vil TD-antigenet være et middel som administreres til et individ for terapeutiske formål. Dette middel kan være f.eks. et terapeutisk antistoff eller en annen form av terapeutisk medikament som er et TD-antigen. Inhibering av humoral immunrespons mot f.eks. et terapeutisk antistoff kan forlenge dets virkning in vivo ved å forhindre "clearance" av det terapeutiske antistoff i et individ. Små molekyler som virker som terapeutiske midler kan også være mål-antigener mot hvike en humoral respons blir undertrykket dersom disse molekyler som fungerer som haptener blir administrert med et protein eller en annen bærer som induserer T-celle-hjelpefunksjon for å aktivere B-celler; undertrykkelse av humoral immunitet mot disse terapeutiske midler kan likeså forlenge deres effektivitet.

HI. Undertrykking av humoral immunitet

Den humorale immunresponsen mot et TD-antigen inhiberes. Den humorale immunrespons, kan være en primær immunrespons, i tilfellet en første eksponering for et TD-antigen, eller responsen kan være en sekundær humoral immunrespons, i tilfellet re-eksponering av antigenet. Fremstilling av én eller flere isotyper av antistoffer kan inhiberes. For en primær humoral immunrespons, hvor IgM er det overveiende antistoff som produseres, vil IgM-produksjonen være overveiende undertrykket. For sekundær immunrespons kan produksjonen av flere forskjellige isotyper, innbefattet IgM, IgG og IgE være undertrykket.

Denne oppfinnelse tilveiebringer videre anvendelse av en gp39 antagonist for fremstilling av et farmasøytisk preparat for indusering av forlenget inhibisjon av en humoral immunrespons til et TD antigen in vivo i et individ som har blitt eksponert for TD antigenet. Som anvendt her skal "forlenget undertrykking" bety at undertrykking av antistoff-produksjon mot et TD-antigen blir opprettholdt etter at administrering av en gp39-antagonisk in vivo er blitt avsluttet.

IV. Administrering av gp39-antagonister

Humorale immunresponser til et TD-antigen kan inhiberes som beskrevet heri ved administrering av en gp39-antagonist til et individ som eksponeres for TD-antigenet. I én utførelse administreres gp39-antagonisten i forbindelse med TD-antigenet. gp39-antagonisten administreres fortrinnsvis samtidig med TD-antigenet, men kan administreres før administrering av TD-antigenet eller etter TD-antigenet, så lenge som gp39-antagonisten administrert før TD-antigenet har indusert B-celle aktivering. I andre utførelser blir et individ eksponert for et antigen miljømessig. I dette tilfelle bør en gp39-antagonist administreres in vivo etter eksponering for antigenet, tilstrekkelig nært i tid til å forhindre B-celle-aktivering.

Antagonistene administreres til individer i en biologisk forlikelig form egnet for farmasøytisk administrering in vivo for å undertrykke humorale immunresponer. Ved "biologisk forlikelig form egnet for administrering in vivo" menes en form av antagonisten som skal administreres hvor eventuelle toksiske effekter er oppveiet av de terapeutiske effekter av proteinet. Betegnelsen "individ" er ment å omfatte levende organismer hvori en immunrespons kan fremkalles, f.eks. pattedyr. Eksempler på individer omfatter mennesker, hunder, katter, mus, rotter og transgene arter derav. Administrering av en antagonist som interfererer med interaksjonen av gp39 og CD40 som beskrevet her kan være i hvilken som helst farmakologisk form og.en farmasøytisk akseptabel bærer. Administering av en terapeutisk aktiv mengde av terapeutiske preparater defineres som en mengde som er effektiv, ved doseringer og i tidsrom som er nødvendige for å oppnå det ønskede resultat. En terapeutisk aktiv mengde av en antagonist som interfererer med interaksjonen av gp39 og CD40 kan f.eks. variere ifølge faktorer såsom sykdommens tilstand, individets alder, kjønn og vekt, og antagonistens evne til å fremkalle en ønsket respons hos individet. Doseringsregimer kan justeres for å tilveiebringe den optimale terapeutiske respons. F.eks. kan flere oppdelte doser administreres daglig, eller dosen kan reduseres proporsjonalt som angitt ved den preserende karakter av den terapeutiske situasjon.

Den aktiv forbindelse (f.eks. antagonist) kan administreres på hensiktsmessig måte såsom ved injeksjon (subkutan, intravenøs etc), oral administrering, inhalasjon, transdermal påføring eller rektal administering. Avhengig av administre-ringsveien kan den aktive forbindelse være belagt med et materiale for å beskytte forbindelsen fra virkningen av enzymer, syrer og andre naturlige betingelser som kan inaktivere forbindelsen.

For å administrere en antagonist som interfererer med interaksjonen av gp39 og CD40 på andre måter enn ved parenteral administrering, kan det være nødvendig å belegge antagonisten med, eller ko-adrninistrere antagonisten sammen med, et materiale for å forhindre dens inaktivering. En antagonist kan f.eks. administreres til et individ i en hensiktsmessig bærer eller fortynningsmiddel, ko-adnunistreres med enzym-

inhibitorer eller i en hensiktsmessig bærer såsom liposomer. Farmasøytisk akseptable fortynningsmidler omfatter saltholdige og vandige bufferløsninger. Enzyminhibitorer omfatter pancreas trypsin inhibitorer, diisopropylfluorfosfat (DEP) og trasylol. Liposomer inkluderer vann-i-olje-i-vann emulsjoner såvel som konvensjonelle liposomer. (Strejan et al., (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).

Den aktive forbindelse kan også administreres parenteralt eller intrapeirtonealt.

Dispersjoner kan også fremstilles i glycerol, flytende polyetylenglykoler og blandinger derav og i oljer. Under ordnære betingelser for lagring og anvendelse kan disse preparater inneholde et konserveirngsmiddel for å forhindre vekst av mikroorganismer.

Farmasøytiske blandinger egnet for injiserbar anvendelse omfatter sterile vandige løsninger (hvor de er vannløselige) eller dispersjoner og sterile pulvere for øyeblikkelig fremstilling av sterile injiserbare løsninger eller dispersjoner. I alle tilfeller må blandingen være steril og må være flytende i den grad at den lett lar seg sprøyte inn med en sprøyte. Den må være stabil under fremstillings- og lagringsbetingelser og må beskyttes mot den forurensende virkning av mikroorganismer såsom bakterier og sopp. Bæreren kan være et løsningsmiddel eller et dispersjohsmedium inneholdende f.eks. vann, etanol, polyol (f.eks. glycerol, propylenglykol, og flytende polyetylenglykol, og lignende), og egnede blandinger derav. Hensiktsmessig fluiditet kan opprettholdes f.eks. ved anvendelse av et belegg såsom lecitin, ved å opprettholde den nødvendige partikkelstørrelse i tilfelle dispersjon og ved anvendelse av tensider. Beskyttelse mot virkningen av mikroorganismer kan oppnås ved forskjellige antibakterielle og antisoppmidler, f.eks. parabener, klorbutanol, fenol, askorbinsyre, thimerosal og lignende. I mange tilfeller vil det være å foretrekke å

inkludere isotoniske midler, f.eks. sukkere, polyalkoholer såsom mannitol, sorbitol, natriumklorid i blandingen. Forlenget absorpsjon av de injiserbare blandinger kan bringes i stand ved å inkludere i blandingen et middel som forsinker absorpsjonen, f.eks. aluminium-monostearat og gelatin.

Sterile injiserbare løsninger kan fremstilles ved inkorporering av den aktive forbindelse (f.eks. antagonist som interfererer med interaksjonen av gp39 og CD40) i den nødvendige mengde i et hensiktsmessig løsningsmiddel med én eller en kombinasjon av bestanddeler nevnt ovenfor, etter behov, etterfulgt av filtersteirlisering. Generelt fremstilles dispersjoner ved inkorporering av den aktive forbindelse i en steril bærer som inneholder et basisk dispersjonsmedium og de nødvendige andre bestanddeler fira dem som er nevnt ovenfor. I tilfellet sterile pulvere for fremstilling av sterile injiserbare løsninger vil de foretrukne fremstillingsfremgangsmåter være vakuumtørking og frysetørking som gir et pulver av den aktive bestanddel (f.eks. antagonist) pluss eventuelle ytterligere ønskelige bestanddeler fra en tidligere steril filtrert løsning derav.

Når den aktive forbindelse er hensiktsmessig beskyttet, som beskrevet ovenfor, kan proteinet administreres oralt, f.eks. med et inert fortynningsmiddel eller en assimilerbar spiselig bærer. Som anvendt her skal "farmasøytisk akseptabel bærer" omfatte hvilket som helst og alle løsningsmidler, dispersjonsmedier, belegg, antibakterielle og antisoppmidler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler, og lignende. Anvendelse av slike medier og midler for farmasøytisk aktive substanser er velkjent i teknologien. Unntatt så lenge som eventuelle konvensjonelle medier eller midler er uforlikelige med den aktive forbindelse, blir anvendelse derav i de terapeutiske blandinger overveiet. Supplementerende aktive for-bindelser kan også inkorporeres i blandingene.

Det er spesielt fordelaktig å formulere parenterale preparater i doseringsenhetsform for grei administrering og jevnhet i doseringen. Doseringsenhetsform som anvendt her skal referere til fysisk adskilte enheter egnet som enhetsdoseringer for pattedyrindividene som skal behandles; idet hver enhet inneholder en forutbestemt mengde av aktiv forbindelse beregnet å frembringe den ønskede terapeutiske effekt i forbindelse med den nødvendige farmasøytiske bærer. Spesifikasjonen for doseringsenhetsformene ifølge oppfinnelsen er diktert av og direkte avhengig av (a) de unike egenskaper av den aktive forbindelse og den spesielle terapeutiske effekt som skal oppnås, og (b) de iboende begrensninger i teknologen for sammensetning av en slik aktiv forbindelse for behandling av sensitivitet hos individer.

V.Ko-administrering av gp39-antagonister og andre

immunosuppresive midler

Det har blitt vist at interferensen ved løselig CTLA-4 av CD28-utløsning, et kostimulerende molekyl på Tn-celler, også vil undertrykke TD-antistoffresponser (30) og blokkere avstøtning av xenogene transplantat (31). I likhet med anti-gp39-administrering induserte løselig CTLA-4 en tilstand av forlenget irnmunundertrykking. Fordi anti-gp39 og CTLA-4 formidler sin immunundertrykkende effekt på bestemte trinn av den humorale immunrespons, kan koadministrering av disse to immunosuppresive medikamenter gi additive eller synergistiske immunosuppresive effekter på immuniteten.

Allergiske responser blir formidlet av IgE-antistoffer. Fremkalling av IgE-responser krever cytokinet IL-4. Inhibering av IgE-responser mot et TD-antigen kan bli mer effektiv ved ko-administrering av en gp39-antagonist og en inhibitor for IL-4, f.eks. et anti-IL-4 antistoff.

Denne oppfinnelse illustreres ytterligere ved følgende eksempler. Innholdet av en patentsøknad registrert på den samme dato som denne i navnet til Randolph J. Noelle et al., og med tittelen "Methods for Inducing Antigen-Specific T Cell Tolerance".

Følgende metodologi ble anvendt i eksemplene.

Materialer og metoder

Dyr. 6-8 uker gamle Balb/c hunnmus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) ble ..anvendt for in vivo eksperimentene som presenteres i denne studie. Dyrene ble holdt i den spesifikt patogen-frie dyrestall ved Dartmouth Medical School.

Hjelpe-T-cellekloner (TnL D1.6, en I-Ad<->klippet, kanin Ig-spesifikk Thl-klon (21) ble skaffet fra Dr. David Parker, University of Mass. i Worcester. I denne publikasjon skal det refereres til D1.6 som Tn 1.

Reagenser og antistoffer. MR1, hamster anti-mus gp39 mAb (16) ble renset ved DEAE HPCL fra ascitesvæske. Hamster lg (Hig), anvendt som kontrollantistoff, ble renset på lignende måte fra hamsterserum (Accurate Chemical and Scientific Corp. Westbuty. NY). RG7/7.6HL, et mus anti-rotte K-kjede (sterkt kryssreaktiv med hamster k kjede) antistoff, (RG7), (22), ble konjugert med HRPO eller FITC og anvendt som et sekundært reagens for deteksjon av MR1 og Hig. Affinitets-renset geit anti-mus IgM, IgGj, I<gG>2a, IgG2b°S

IgGg (Southern Biotechnology, Birmingham Al) ble anvendt som deteksjons-antistoffer i den antigen-spesifikke ELISA såvel som i den totale IgM og IgGj ELISA. B1E3,

(vennligst skaffet av Dr. T. Waldschmidt, Univ. of Iowa) et monoklonalt anti-murint IgE, ble anvendt som deteksjons-antistoffet for IgE anti-KLH ELISA. Chimert-L6 (CHi-L6), et humanisert IgG^ spesifikt for tumor antigenet L6 (23), var vennlig skaffet av Bristol-Meyers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle WA. Anti-CD4,GK 1.5, (24), ble fremstilt ved HPLC-rensing av ascitesvæske. Sau røde blodlegemer (SRBC) ble kjøpt fra Colorado Serum Co. (Denver, CO). Sea Plaque agarose for anvendelse i anti-SRBC-plak-assay ble skaffet fra FMC Corporation (Rockland MA). Kaninunge-komplement ble kjøpt fra Cederlane (Hornby, Ontario Canada). KLH, Keyhole-limpet hemacyanin, (fra Megathura crenulata) ble kjøpt fra Calbiochem (LaJolla, CA). Komplett Freund's adjuvans

(CFA) for immuniseringer ble levert fra Sigma Chemical Co (St. Louis, MO). TNP-SRBC, TNP-KLH og TNP-BSA ble fremstilt som tidligere beskrevet (25).

Immuniseringer for dannelse av in vivo primære og sekundære

antistoffresponser

Primære immunresponser. For å fremkalle primære antistoff-responser på SRBC eller TNP-SRBC, ble musene immunisert med 200 ul av 1% SRBC eller TNP-SRBC-suspensjon (i.v.). IgM, anti-SRBC responsen ble bestemt 5 dager etter administrering av antigen ved anvendelse av en modifikasjon av Jerne-plak-assay (26). IgM anti-TNP-responser ble målt ved ELISA på dag 6. Primære responser på det heterologe immunoglobulin Chi-L6 ble dannet ved i.p. immunisering av 100 ug CW-L6 på alum pr. mus. Serum IgM anti-Chi-L6 antistoffresponsen ble målt etter 7 dager. Primære responser på TNP-Ficoll ble dannet ved immunisering med 25 ug av TNP-Ficoll i.p. IgM anti-TNP-responsen ble målt på dag 6 med ELISA.

Sekundære immunresponser. For dannelse av sekundære humorale responser på KLH, ble dyrene immunisert med KLH i CFA (50 ug; i.p.). Musene ble deretter utfordret med 10 ug av løselig KLH (i.p.) 3 måneder senere. Anti-KLH-antistoffresponsen ble målt på dag 7 fra serum av immune mus ved anvendelse av isotype-spesifikk ELISA. Sekundære antistoffresponser på Chi-L6 ble dannet ved Utfordring av Chi-L6 immune mus med 10 fig løselig Chi-L6, i.p. Serum IgGj anti-Chi-L6-antistoffresponsen ble målt etter 7 dager.

Anti-gp39-behandling. Steril HPLC-renset anti-gp39 (MR 1) eller Hig (som antistoffkontroll) ble administrert (i.p.) på dag 0, dag 2, dag 4 post-immunisering eller utfordring som angitt for hvert eksperiment.

Antigen-spesifikk ELISA. De antigen-spesifikke IgM, IgGj, IgG2a, lE@2b' *<g>^3°SIgE-antistofftitere ble bestemt ved anvendelse av isotyp-spesifikk ELISA. I korthet ble antigen (1 mg/ml av KLH, Chi-L6, TNPjg-BSA, eller TNP2-BSA i PBS) absorbert på fleksible polyvinyl mikrotiterskåler, over natten ved 4°C. Platene ble vasket og blokkert med PBS-1%FCS natriumazid. Fortynnede serumprøver ble inkubert i 2 timer ved 37°C. Prøvene ble vasket og den antigen-spesifikke antistoff-titer bestemt med ett av de følgende alkalisk-fosfatase-konjugertedeteksjonsantistoffer: geit anti-mus IgM, IgGj, IgG2a, IgG^ eller

IgG-j (Southern Biotechnology, Birmingham, Al). Den IgE-spesifikke ELISA ble påvist ved anvendelse av biotin-konjugert B1E3 etterfulgt av alkalisk-fosfatase avidin (South San Francisco, CA). Alle ELISA ble fremkalt ved reaksjon av alkalisk fosfatase med fosfatasesubstrat (Sigma Chemical, Co., St. Louis, MO). Platene ble analysert på en Dynatech MR700 ELISA-leser ved 410 nm. Enhetene representerer vilkårlige verdier basert på titreringskurven for et standard immunserum. Alle eksperimentelle grupper ble titrert fra 1:100 til

1:100.000 og titeren bestemt basert på flerpunktanalyse. Nivået av anti-KLH, anti-Chi-L6 og anti-TNP-antistoffer i ikke-utfordrede kontroller var under påvisningsgrensen.

Deteksjon av serum anti-gp39

Kvantifisering av intakt anti-gp39 i serum av anti-gp39-behandlede mus: Serum fra mus som fikk 750 ug anti-gp39

(250 ug på dag 0, d2, d4) ble oppnådd på dagene 7,14 og 21 etter initiering av anti-gp39-behandling. Serumet ble kjørt på en 7,5% SDS gel under ikke-reduserende betingelser, overført til nitrocellulose, og blottet med HRPO-konjugert RG7. Etter kjemiluminiscens-påvisning ble områder av blotten tilsvarende 150-165 kDa scannet og digitalisert ved anvendelse av en Apple Scanner og Image 4.1 software-programmet.

Analyse for biologisk aktiv anti-gp39 i serum av behandlede mus: Anti-CD3-aktivert Tnl,

som uttrykker gp39, ble farvet med fortynninger av serum fra mus som fikk 750 ug anti-gp39 (250 p.g på dagene 0,2, og 4) for å bestemme mengden av biologisk aktiv gp39 som var tilbake i serumet. Tilreiinger av serum inneholdende anti-gp39 ble inkubert med aktivert Tfll cellekloner i 30 min. ved 4°C, etterfulgt av vasking og påfølgende inkubering med F1TC-RG7 i 30 min. ved 4°C. En standardkurve av MFI vs anti-gp39-konsentrasjon ble laget ved anvendelse av renset anti-gp39. Prøvene ble analysert på en Becton Dickin-son FACScan og prosenten anti-gp39 som var tilbake i serum ble utledet basert på anti-gp39-standardkurven. Nivået av anti-gp39 som var til stede i serum på dag 7 ble satt til 100%.

Adoptiv overføring av hjelpe-T-celler. Mus ble immunisert med SRBC (200 ul av 1% SRBC, i.v.) og administrert anti-gp39 eller Hig (250 ug på dag 0,2 og 4). På dag 7 ble splenocyttene fra ikke-immune eller SRBC-immune mus fjernet, erytrocytt-utarmet, vasket og overført (i.v., 50 x 10^/mus) i bestrålte mottakere (600 rad) med eller uten 50 x 10^

miltceller fra TNP-KLH-primede (TNP-KLH-CFA, 50 ug i.p.) mus som en kilde for immune B-celler. Ved tiden for overføring ble musene immunisert med TNP-SRBC (200

ul av 1% TNP-SRBC i.v.). Serum IgGj anti-TNP-titere ble bestemt på dag 6 etter overføring.

Eksempel 1: Anti-gp39 inhiberer generering av primære

antistoffresponser på erytrocytt-antigener

Den forringede TD-immunitet som observeres hos pasienter med HIM, såvel som

de kraftige inhibitoriske effekter av anti-gp39 og CD40-Ig på Tn-avhengig B-

celleaktivering in vitro, utgjorde basis for studiet av de potensielle immunundertrykkende effekter av anti-gp39 på humoralformidlet immunitet in vivo. For å undersøke rollen til gp39-CD40-interaksjoner ved primære TD humorale immunresponser, ble effekten av in vivo-administrering av anti-gp39 på den primære antistoffrespons på sau røde blodlegemer (SRBC) bestemt. Dyrene ble immunisert med SRBC og administrert anti-gp39 mAb (eller kontroll Hig) i løpet av 4 dager. På dag 5 ble den primære anti-SRBC antistoffrespons av anti-gp39-behandlede, HIg-behandlede, og kontrollmus bestemt. Den IgM anti-SRBC plakk-dannende celle (PFC)-respons hos mus som fikk tilsammen 1,5 mg av anti-gp39

(500 ug/mus på dag 0, 2 og 4) ble redusert 99% sammenlignet med anti-SRBC PFC-

responsen fra kontrollmus eller HIg-behandlede mus (fig. IA). Dessuten, administrering av så lite som 300 ug/mus (100 ug/mus på dag 0,2 og 4) av anti-gp39 reduserte den anti-

SRBC primære immunrespons med 66%. Resultater av disse eksperimenter viser at anti-gp39-behandling fjerner primære antistoffresponser in vivo.

Varigheten av de immunundertrykkende effekter av anti-gp39 på den primære humorale immunrespons på SRBC ble deretter undersøkt. Mus immunisert med SRBC ble behandlet med anti gp39 i 4 dager og undersøkt ved forskjellige senere tidspunkter på evnen til å yte en primær anti-SRBC-respons. I dette sett av eksperimenter ble allé dyrene immunisert med SRBC på dag 0 og administrert anti-gp39 eller Hig på dagene 0,2 og 4. IgM anti-SRBC PFC-responsen ble målt for en gruppe på dag 5. Ytterligere SRBC-immune grupper ble utfordret med SRBC på dag 7 eller dag 14. 5 dager etter hver antigene utfordring (resp. dag 12 og dag 19), ble IgM anti-SRBC PFC-responsen målt.

Resultatene av ett slikt eksperiment er gjengitt i fig. IB.

Som i fig. IA ble de primære anti-SRBC-responser inhibert 80-90%

5 dager etter at anti-gp39-administreringen var begynt. I tillegg ble de primære anti-SRBC-responser 12 dager og 19 dager etter anti-gp39-behandlingen også inhibert >90%. Disse resultater viser at kort anti-gp39-behandling resulterer i forlenget inhibering av primære antistoff-responser.

Eksempel 2: Anti-gp39 inhiberer generering av sekundære anti-KLH-antistoff-responser

Eksperimenter som undersøker primære antistoff-responser antyder at gp39-CD40-interaksjoner spiller en kritisk rolle ved initieringen av primær humoral immunitet. Disse eksperimenter gjelder imidlertid ikke hvorvidt gp39-avhengig CD40-signalering er nødvendig for dannelen av sekundære antistoff-responser. Effektene av anti-gp39-administrering på den sekundære immunrespons på løselig utfordring med KLH ble derfor bestemt i KLH-immune mus.

Ved anvendelse av programmer for anti-gp39-administrering som reduserte den primære anti-SRBC PFC-respons blir det utformet eksperimenter for å evaluere effektene av anti-gp39-behandling på de sekundære antistoff-responser. I disse eksperimenter ble KLH-immune mus (immunisert 3 måneder før med CFA og KLH) utfordret med løselig KLH (10 ug/mus (i.v.). På dagen for antigenutfordringen (dag 0) ble musene også gitt 250 ug av anti-gp39 eller Hig, etterfulgt av anti-gp39 eller Hig på dag 2 og dag 4. På dag 7 (fig. 2, diagram A) og dag 14 (fig. 2, diagram B) etter utfordring med KLH, ble musene avblødd og titeren for IgM, IgGj, IgG2a, IgG2b IgGj og IgE anti-KLH-antistoffer bestemt. Resultatene demonstrerer flere poenger: 1) utfordring med løselig KLH induserte en varig sekundær immunrespons som holdt seg i opp til 14 dager; 2) adminstreringen av anti-gp39 reduserte signifikant den sekundære anti-KLH-respons på de målte isotyper sammenlignet med administreringen av like store mengder av Hig; og 3) de immunundertrykkende effekter av anti-gp39 syntes å bli opprettholdt i minst 14 dager etter initieringen av anti-gp39-behandlingen. Tilsammen demonstrerer resultatene av disse eksperimenter at i likhet med primære humorale immunresponser ble dannelsen av sekundære humorale immunresponser også blokkert av anti-gp39.

Eksempel 3: Anti-gp39 inhiberer generering av

antistoffresponser på heterologt lg

Eksperimentene gjengitt i fig. 1 demonstrerer den immun-undertrykkende aktivitet av anti-gp39 under en primær respons på et sterkt immunogént partikkelformig antigen, SRBC. Den cellulære karakter av erytrocytter gjør dem unike i sin evne til å fremkalle sterke immunresponser. Heterologe Ig-molekyler deler denne egenskap at de er høyst immunogene, og tilveiebringer derfor et ytterligere modell-antigensystem for undersøkelse av effektene av anti-gp39-behandling på dannelsen av primære og sekundære antistoffresponser. Dyr ble immunisert med et heterologt Ig-molekyl, Chi-L6, et humanisert mus anti-tumorcelle mAb, og behandlet med anti-gp39 eller kontroll Hig. Etter 7 dager ble sera oppsamlet og analysert for fremstilling av IgM anti-Chi-L6-antistoffer. I tillegg ble musene utfordret med Chi-L6 14 dager etter den første immunisering og anti-gp39-behandling, og analysert for IgGj anti-Chi-L6-antistoffproduksjon på dag 21. Fig. 3

gjengir resultatene av et slikt eksperiment. Den primære antistoffrespons på Chi-L6 hos mus behandlet med anti-gp39 inhiberes av >90% sammenlignet med HIg-behandlede mus. Dessuten inhiberes på lignende måte den sekundære IgGl-respons på Chi-L6. Disse resultater demonstrerer at anti-gp39-behandling fjerner primære og sekundære antistoffresponser på en andre type av TD-antigen, heterologt lg, like effektivt som den undertrykker responser på erytrocytt og løselige protein-antigener.

Eksempel 4: Anti-gp39 inhiberer ikke generering av primære

antistoffresponser på det T-uavhengige type II-

antigen, TNP-Ficoll

Selv om de tidligere eksperimenter viser at anti-gp39 effektivt blokkerer dannelsen av primære og sekundære antistoffresponser på TD-antigener in vivo, er det uklart hvorvidt gp39-CD40-interaksjoner spiller en rolle ved initieringen av humorale responser på Tl-antigener. Data presentert i den vedlagte publikasjon viser at immunisering med TI-type II antigenet, TNP-Ficoll, resulterer i gp39-ekspresjon av T-celler in vivo. For å undersøke hvorvidt gp39-CD40-interaksjoner er nødvendige for dannelsen av antistoffresponser på dette Tl-antigen, ble effekten av anti-gp39-behandling på mus immunisert med TNP-Ficoll, bestemt. Mus immunisert med TNP-Ficoll eller TNP-SRBC ble behandlet med anti-gp39 eller Hig, og IgM anu^TNP-antistoffresponsen bestemt etter 6 dager. Fig. 4A demonstrerer at dyr immunisert med TD-antigenet TNP-SRBC fremkaller signifikante anti-TNP serum antistoffresponser. Som forutsagt ut fra de tidligere beskrevne eksperimenter vil anti-gp39-behandling dramatisk inhibere den primære anti-TNP-respons dannet hos disse mus. I motsetning vil mus immunisert med TNP-Ficoll i en høyere titrert anti-TNP-antistoff-respons (fig. 4B) og behandling med anti-gp39 imidlertid ikke inhibere antistoffresponsen på TNP-Ficoll. Resultater av disse eksperimenter viser at i motsetning til responsene på TD-antigener vil anti-gp39 ikke blokkere dannelsen av humorale responser på TNP-Ficoll, hvilket antyder at responser på Tl-antigener kan være gp39-uavhengige.

Eksempel 5: Anti-gp39-administrering vil ikke funksjonelt

utslette SRBC-spesifikke Th

Ut fra de tidligere eksperimenter er det kjent at anti-gp39 interfererer med utviklingen av TD humoral immunitet; den mekanisme hvorved anti-gp39-behandling undertrykker humorale responser er imidlertid ikke klar. Immunundertrykkelse ved anti-gp39 kunne formidles ved: 1) den negative signalering av gp39-bærende T-celler som forårsaker Tn-anergi; 2) mAb-formidlet cytotoksisk utslettelse av anti-gp39-bærende CD4<+> T-celler; og/eller 3) blokkeringen av gp39-binding til CD40. En serie eksperimenter ble gjennomført for å oppnå innsikt i hvilke av disse mekanismer som kan være operative ved den forlengede immunundertrykkelse som observeres med anti-gp39-terapi. For å undersøke den mulighet at antigen-spesifikk TQ ble utslettet eller anergisert ved anti-gp39-terapi, ble antigen-spesifikk T^-funksjon fra gp39-behandlede mus målt ved adoptiv overføring. I korthet ble musene immunisert med SRBC (for å prime SRBC-spesifikk Tn) og administrert anti-gp39 eller Hig (250 ug/mus på dagene 0,2 og 4). Etter 7 dager ble miltceller fra ikke-immuniserte mus eller SRBC-immune miltceller fra HIg-behandlede eller anti-gp39-behandlede mus adoptivt overført til mottakermus med TNP-immune miltceller som en kilde for TNP-primede B-celler. Musene ble samtidig utfordret med TNP-SRBC, og IgGj anti-TNP-titeren bestemt på dag 5. SRBC-primede T-hjelpeceller er nødvendige for å fremkalle en sekundær anti-TNP-respons i mottakermusen som demonstrert ved det faktum at mottakere som fikk miltceller fra ikke-immune donorer ga i alt vesentlig lavere IgGl anti-TNP sammenlignet med de mus som fikk miltceller fra SRBC-primede dyr (fig. 5). Viktigere er det at resultater av disse eksperimenter åpenbarte at SRBC-hjelpeaktiviteten fra HIg-behandlede og anti-gp39-behandlede mus var den samme, hvilket viste at anti-gp39-behandling ikke forandret Tn-funksjonen eller blokkerte primingen av Tn. Antigen-responsive Tn ble heller ikke utslettet eller anergisert som et resultat av anti-gp39-behandling, ettersom de ga hjelpe-effektorfunksjon etter overføring.

Eksempel 6: In vivo "clearance" av hamster anti-gp39

Tidligere studier har etablert at anti-gp39 (MR1) blokkerer bindingen av gp39 til CD40 (15) og understøtter således den hypotese at de in vivo immunundertrykkende effekter av anti-gp39 skyldes blokkeringen av gp39-CD40-interaksjoner. Antas det at denne hypotese er korrekt, vil den forlengede immunundertrykkelse som observeres med anti-gp39-administrering kreve utholdenhet av anti-gp39 i verten. For å bestemme hvorvidt anti-gp39 kunne detekteres innenfor det tidsrom som immunundertrykkelsen var åpenbar, ble in vivo fjernings-(clearance)hastigheten for anti-gp39 fra serum bestemt. Musene ble gitt et regime av antistoff (3 x 250 ug anti-gp39) i løpet av 4 dager og undersøkt for nivået av serum anti-gp39 på dag 7, dag 14 og dag 21 etter initieringen av antistoff administrering. Western blot-analyse for ikke-redusert MR1 (160 kd) indikerte at intakt, serum anti-gp39 kunne detekteres i minst 21 dager etter initieringen av antistoffbehandling (fig. 6A). Serumkonsentrasjonen av anti-gp39 i dyrene ved 21 dager var ca. 5% (basert på scanning-deirsitometri) sammenlignet med signalene avledet fra serum av dyr analysert 7 dager etter initiering av antistoff-terapi.

Selv om det ble bestemt at intakt anti-gp39 var til stede i serum, var det også viktig å fastslå at dette anti-gp39 var biologisk aktivt. Sera fra mus som fikk 3 x 250 ug av anti-gp39 i løpet av 4 dager ble derfor anvendt til å farve gp39-bærende Tn (fig. 6B). Nivået av serum anti-gp39 3 dager etter den siste injeksjon (7 dager etter initiering av antistoff-behandling) ble satt til 100%. 14 dager etter initieringen av antistoff-terapi, ble det detektert ca. 10-15% av det biologisk aktive anti-gp39 mAb i serum. 21 dager post-initiering av terapi, var det 2-3% av anti-gp39 tilbake i serum. Både bestemmelsen av intakt gp39 ved Western blotting og av biologisk aktivt anti-gp39 åpenbarte derfor at ca. 5% av anti-gp39 var til stede 21 dager etter begynnelsen av anti-gp39-terapien. Disse resultater viser at halveringstiden for anti-gp39 må være ca. 12 dager og er bevis i overensstemmelse med den hypotese at forlenget undertrykkelse av humorale immunresponser med anti-gp39 skyldes vedvarende blokkering av Tn-funksjonen.

Foreliggende studie demonstrerer at in vivo administrering av et anti-gp39-antistoff som blokkerer gp39-CD40-interaksjonene in vitro, resulterer i alvorlig inhibering av både primære og sekun-dære humorale immunresponser på TD-antigener, men ikke på TI-type II antigener. I tillegg viser denne studie at anti-gp39-behandling ikke vil blokkere primingen av antigen-primede Tn-celler. gp39-CD40 ligand-reseptorparet kan derfor anvendes som et mål for den terapeutiske manipulering av den humorale immunrespons.

For å få innsikt i hvordan anti-gp39 utøvet sin immun-undertrykkende effekt på humoral immunitet, undersøkte man de direkte effekter av anti-gp39 på T^-funksjonen. Disse data viser at SRBC-immune TQ fra anti-gp39-behandlede mus var fullstendig i stand til å gi hjelp etter adoptiv overføring, hvilket antyder at anti-gp39-behandling ikke forårsaket Tn-utslettelse eller anergi in vivo. Disse resultater førte til den spekulasjon at ahti-gp39 formidler sine immunundertrykkende effekter ved å blokkere gp39-binding til CD40, og ikke ved inaktivering av gp39-bærende Tfl. Til understøttelse for denne hypotese har in vitro studier etablert at anti-gp39 blokkerer bindingen av CD40 til gp39 (16). Biologisk aktivt anti-gp39 kunne dessuten detekteres i serum i den tidsperiode som immunundertrykkelsen var åpenbar. Selv om bare 5% av anti-gp39 var til stede i serum på en tid da immunundertrykkelsen var åpenbar, er det mulig at de lokale vevskonsentrasjoner av anti-gp39 på bestemte steder av sekundære lymfoide organer er høyere og "clearance"-hastigheten er lavere enn den for serum anti-gp39. Behandling av mus med anti-gp39 inhiberte den primære immunrespons på SRBC og heterologt Ig>90% i forlengede tidsperioder. Antas det at anti-gp39 formidler inhiberingen ved blokkering av gp39-funksjonen, vil disse data implisere gp39-CD40-interaksjoner som essensielle ved utviklingen av primære immunresponser på TD-antigener. Immuno-histokjemisk analyse fastslår at gp39 induseres som konsekvens av immunisering med TD-antigener og kan være av funksjonell signifikans. In situ-studiene av gp39-ekspresjon illustrerer at det opprinnelige sete for gp39-CD40-interaksjoner undér primære humorale immunresponser er i de perifere aspekter av de periarteriolare lymfoid-skjeder (PALS) og omkring de terminale arterioler (TA) i milten. Det er på disse steder at konjugater mellom gp39-uttrykkende TR og antigen-spesifikke B-celler ble funnet i jukstaposisjon, hvilket antyder at de ytre PALS er et hovedsete for T-celle-B-celle-interaksjoner under primære humorale immunresponser. Disse PALS kan derfor være det sted hvor anti-gp39 interagerer med gp39-uttrykkende Tn-celler for til slutt å inhibere T-B-interaksjon og påfølgende Ig-produksjon.

I likhet med primære responser ble også den sekundære humorale immunrespons hos mus primet til KLH i CFA vist å bli inhibert ved administreringen av anti-gp39.1 overensstemmelse med reduksjonen av anti-SRBC PFC ved anti-gp39, ble det også observert reduksjoner i serum antistoff-titer på antigen utfordring. Serum-titeren for alle anti-KLH Ig-isotyper som ble målt (IgM, IgG j, I<g>G2a, <!gG>2|j. IgG3 og IgE) ble redusert ved behandling av mus med anti-gp39.

Effekten av anti-gp39-administrering var åpenbar i minst 14 dager etter sekundær utfordring med antigen, som etablerte en vedvarende immunundertrykkelse ved anti-gp39. Anu-gp39-forrriidlet immun-undertrykkelse av sekundære responser på KLH er ikke unik for KLH, siden sekundære immunresponser på heterologt lg og heterologe erytrocytter også ble inhibert ved anti-gp39-terapi. Den anatomiske fordeling av gp39-uttrykkende Tfl var identisk med den som ble observert etter primær immunisering, mens frekvensen av gp39-uttrykkende TQ i immun milt var øket sammenlignet med den som ble observert under primære immunresponser. Ingen gp39-uttrykkende Tfl ble funnet i kimsentrene eller folliklene i immun milt. Det synes således at B-celler blir utløst til å respondere på aktiverte Tn-celler i PALS og TA i milten og senere migererer til folliklene og kimsentrene. Fokus av den foreliggende studie var å demonstrere den potensielle anvendelse av anti-gp39 til kontroll av TD humoral immunitet. Korte behandlingsregimer med anti-gp39 resulterte i forlenget undertrykkelse, en attraktiv attributt ved dette terapeutiske antistoff. Av spesiell interesse kan være evnen til anti-gp39 til å forhindre primære og sekundære humorale responser på andre heterologe, terapeutiske antistoffer såsom Chi-L6. Dette ville tillate eksponering av pasienter for gjen-tatt administrering av heterologe terapeutiske antistoffer.

Eksempel 7: Fremstilling og karakterisering av anti-gp39-

antistoffer

Eksperiment 1 - Antistoffer rettet mot humant gp39

For å indusere antigen-spesifikk T-celletoleranse i et menneskelig individ, er det foretrukket å administrere et antistoff rettet mot humant gp39. Følgende metodologi ble anvendt til å fremstille mus anti-humant gp39 monoklonale antistoffer. Balbc/mus ble immunisert med et løselig gp39-fusjonsprotein, gp39-CD8, i komplett Freund's adjuvans (CFA). Musene ble deretter utfordret 6 uker senere med løselig gp39-CD8 i ufullstendig Freund's adjuvans (JFA). Løselig gp39-CD8 ble gitt i løselig form 4 uker etter sekundær immunisering. Musene ble deretter boostet med aktiverte humant perifert blod lymfocytter 2 uker senere, etterfulgt av en endelig boost med løselig gp39-CD8 etter ytterligere 2 uker. Splenocytter ble fusjonert med NS-1 fusjonspartneren på dag 4 etter endelig immunisering ifølge standard protokoller.

Kloner som fremstiller anti-humane gp39-antistoffer ble utvalgt basert på en sammensatt screeningsfremgangsmåte. Klonene ble først screenet ved en platebindings-assay ved anvendelse av gp39-CD8. Positive kloner ble deretter screenet mot et kontroll CD8-fusjonsprotein, CD72t CD8. Klonene som scoret positivt på CD8-CD72 platebindings-analysen ble eliminert. De gjenværende kloner ble deretter screenet på hvilende og 6 timer aktiverte humant perifert blod lymfocytter (PBL) ved flow-cytometrisk analyse. Hybridomceller som farvet aktivert, men ikke hvilende, PBL ble ansett som positive. TU slutt ble de gjenværende kloner testet for sin evne til å blokkere bindingen av CD40Ig til plate-bundet gp39.

Ca. 300 kloner ble først screenet mot gp39-CD8 og CD72-CD8 i platebindings-analysene. Av disse kloner ble 30 funnet å detektere plate-bundet gp39 og ikke CD8. Disse kloner ble deretter screenet for deteksjon av gp39 på aktivert humant PBL. Ca. 15 kloner detekterte et molekyl på aktivert PBL, men ikke hvilende celler. Spesifisitet ble ytterligere bekreftet ved å bestemme klonenes evne til å blokkere CD40Ig-deteksjon av plate-biindet gp39. 3 av. 10 testede kloner blokkerer CD40Ig-binding i denne assay. Disse kloner var 3E4,2H5 og 2H8. Slike kloner blir foretrukket for anvendelse i fremgangsmåtene beskrevet her. Kloner som testet positivt på aktiverte, men ikke hvilende PBL, ble også screenet for reaktivitet men en aktivert rotte T-celle klon, POMC8. Klonen 2H8 uttrykte kryssreaktivitet med denne rotte T-cellelinje.

Eksperiment 2 - Antistoffer rettet mot humant gp39

En lignende immuniseringsfremgangsmåte som den beskrevet i eksperiment 1 ble anvendt til å frembringe ytterligere antistoffer rettet mot humant gp39. Én Balb/c-mus ble immunisert med løselig gp39-CD8 i CFA, etterfulgt av utfordring med 6 timer aktiverte humant perifert blod lymfocytter 4 uker senere. Musen ble deretter boostet med løselig gp39-CD8 4 dager før fusjonering av splenocytter med NS-1-fusjonspartneren ifølge standard protokoller. Screening av hybridomakloner ble gjenomført ved flow-cytometrisk farving av 6 timer aktiverte humane PBL'er. Kloner som farvet aktiverte men ikke hvilende humane PBL'er, ble selektert. 6 kloner, 4D9-8,4D9-9,24-31,24-43,89-76 og 89-79, ble utvalgt for videre analyse.

Spesifisiteten av de utvalgte antistoffer ble bekreftet ved flere analyser. Først viste flow-cytometrisk analyse at alle 6 mAb'er farver aktiverte, men ikke hvilende perifert blod T-celler (se fig. 7B og 7C for et representativt eksempel, som viser farving av aktiverte T-celler med henholdsvis 4D9-8 og 4D9-9). Ekspresjon av molekylet gjenkjent av hvert av de 6 antistoffer er detekterbart i løpet av 4 timer etter aktivering, er maksimal mellom 6 til 8 timer etter aktivering, og er ikke-detekterbart 24 timer etter aktivering. Alle 6 mAb'er gjenkjenner et molekyl uttrykt på

aktiverte CD3<+>PBL'er, overveiende av CD4<+->fenotypen, men en del av CDS^-cellene uttrykker også molekylet. Ekspresjon av molekylet gjenkjent av de 6 mAb'er blir inhibert ved tilstede-værelsen av cyklosporin A i kulturmediet, og likeså ekspresjonen av gp39 (se fig. 8A og 8B for et representativt eksempel, som viser farving av cyklosporin-behandlede T-celler med henholdsvis 4D9-8 og 4D9-9). Kinetikken for og fordelingen av ekspresjonen av molekylet gjenkjent av disse mAb'er er identisk med den for gp39, som detektert av fusjonsproteinet av humant CD40Ig. Dessuten vil alle 6 mAb'er blokkere farvingen av gp39 ved CD40Ig (se fig. 9A og 9B for et representativt eksempel som viser inhibering av gp39-farving ved CD40Ig i nærvær av henholdsvis 4D9-8 og 4D9-9). I en ELISA-assay vil alle 6 mAb'er gjenkjenne gp39-CD8, en løselig fusjonsform av gp39-molekylet. Dessuten vil allé 6 mAb'er immunutfelle et molekyl på ca. 36 kd fra S-metionin-merkede aktiverte humane PBJ<J>er. Det immunutfelte molekyl er identisk med det som utfelles av det humane CD40Ig fusjonsprotein.

Den funksjonelle aktivitet av de 6 utvalgte mAb'er (4D9-8,4D9-9,24-32,24-43,89-76 og 89-79) ble analysert som følger. Først målte man evnen til mAb'er til å inhibere formeringen av rensede humane B-celler dyrket med IL-4 og løselig gp39. Rensede humane B-celler ble dyrket med gp39 og IL-4 i nærvær eller fravær av rensede monoklonale antistoffer eller CD40Ig ved doseringer mellom 0 og 12,5 ug/ml. B-celleformering ble bestemt etter 3 dager i kultur ved thymidin-inkorpbrering. Resultatene (vist i fig. 10) demonstrerer at alle 6 mAb'er kan inhibere B-célleformering indusert av gp39 og BL-4. mAb'er 89-76 og 24-31 var mest effektive til å inhibere den induserte B-celleformering.

Deretter undersøkte man evnen til mAb til å inhibere B-celle-differensiering, som målt ved Ig-produksjon indusert av anti-CD3 aktiverte T-celler og IL-2. Rensede IgD<+> humane B-celler ble fremstilt ved positiv seleksjon med FACS og deretter dyrket med anti-CD3-aktiverte humane T-celler (mitomycin C-behandlede) og IL-2 i 6 dager i nærvær eller fravær av rensede anti-gp39 monoklonale antistoffer ved doseringer mellom 0 og 10 ug/ml. IgM, IgG og IgA produksjon ble bestemt ved ELISA på dag 6. Resultatene (vist nedenfor i tabell 1) demonstrerer at alle 6 antistoffer kan inhibere T-celle-avhengig B-celle-differensiering, som målt ved IgM, IgG og IgA-produksjon.

For å undersøke effekten av anti-gp39 mAb'ene på T-celle-responser ble mAb'ene inkludert i standard blandede lymfocytt-reaksjoner (MLR). 300000 humant perifert blod lymfocytter (respondere = R) ble dyrket med 100000 bestrålte allogene perifert blod lymfocytter (stimulatorer = S) i nærvær eller fravær av anti-gp39 mAb'er (10 ug/ml). Kulturene ble pulset med 3H-thymidin på dagene 4,5 eller 6 og høstet 18 timer senere. Alle 6 anti-humane gp39 mAb'er inhiberte allo-spesifikke responser som målt ved MLR (se fig. 11 for et representativt eksempel som viser inhibering av allo-spesifikke responser når R og S inkuberes i nærvær av 24-31 eller 89-76; et CTlA4-immunoglobulin-fusjohsprotein og et anti-CD28 mAb ble anvendt som positive kontroller).

For å bestemme hvorvidt de 6 mAb'er gjenkjente bestemte epitoper på det humane gp39-molekyl, ble det gjennomført kryssblokkerings-eksperimenter. Aktiverte humane PBL'er ble først blokkert med hver av de 6 mAb'er (25 ug/ml ukonjugert antistoff). Cellene ble vasket og deretter farvet med 10 ug/ml av biotinkonjugert antistoff, etterfulgt av reaksjon med phyto-erytrinkonjugert avidin (PE-Av). Farvingen av cellene med PE-Av ble analysert med FACS. Resultatene er vist nedenfor i tabell 2.

Intensiteten av farving og prosenten av positive celler er representert ved + symbolet (++++ = MI>200;+++= MI>125;

++ = MI>50; + = MI>25; - ingen farving over bakgrunnen). ND = ikke bestemt.

Alle antistoffer blokkerte bindingen av CD40Ig til aktiverte humane PBL'er. Disse data vist i tabell 2 demonstrerer imidlertid klart den manglende evne hos noen antistoffer til å blokkere bindingen av andre antistoffer til aktiverte humane PBL'er, hvilket antyder at de gjenkjenner bestemte epitoper på de humane gp39-molekyler.

89-76 og 24-31 hybridomacellene, som produserer henholdsvis 89-76 og 24-31 antistoffene, ble deponert under bestemmelsene i Budapestavtalen hos the American Type Culture Collection, Parklawn Drive, Rockville, Md, 2. september 1994. 89-76 hybridomacellen ble gitt ATCC adgangsnr. HB 11713 og 24-31 hybridomacellen ble gitt ATCC adgangsnr. HB 11712.

Eksperiment 3 - Antistoffer rettet mot mus gp39

I én utførelse ifølge denne oppfinnelse skal gp39-antagonisten være et anti-mus gp39 monoklonalt antistoff, MR1. Følgende fremgangsmåte ble anvendt til fremstilling av det MR1 monoklonale antistoff, og kan anvendes til å danne andre antistoffer rettet mot gp39.

Hamstere ble immunisert intraperitonealt med 5-10^ aktiverte Tnl-celler (dl.6)

med ukentlige mellomrom i 6 uker. Når serumtiteren mot murine Tfll var høyere enn ca.

1:10000, ble det gjennom-ført cellefusjoner med polyetylenglykol under anvendelse av immune hamster-splenocytter og NS-1. Supernatant fra brønner inneholdende voksende hybridomaceller ble screenet ved flowcytometri på hvilende og aktivert Tfll. Én spesiell hybridoma som produserte et Mab som selektivt gjenkjente aktiverte Tn ble ytterligere testet og subklonet for å avlede MR1. MR1 ble produsert i ascites og renset ved ionebytter HPLC. En hybridomacelle MR1 er blitt deponert hos the American Type Culture Collection og har fått adgangsnummer HB 11048.

Det er referert til følgende referanser ved nummeret i eksemplene og den detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen: 1. Inaba K., M.D. Witmer, R.M. Steinman, 1984. Clustering of dendritic cells, helper T lymphocytes, and B cells during primary antibody responses in vitro. J.Exp.Med. 160-858

2. Inaba K., R.M. Steinman. 1985. Protein-specific helper

T-lymphocyte formation initiated by dendritic cells. Science. 229:475.

3. Noelle R.J., E.C. Snow. 1991. Cognate interactions of helper T Cells and B cells. Immunol. Tod. 11:361. 4. Gordon J., M.J. Millsum, G.R. Guy, J.A. Ledbetter. 1987. Synergistic interaction between interleukin 4 and anti-Bp50 (CDw40) revealed in a novel B cell restimulation assay. Eur. J. Immunol. 17:1535. 5. Clark E.A., J.A. Ledbetter. 1986: Activation of human B cells mediated through two distinct cell surface differentiation antigens, Bp35 and Bp 50. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 83:4494. 6. Stamenkovic I., E.A. Clark, B. Seed. 1989. A B-lymphocyte activation molecule related to the nerve growth factor receptor and induced by cytokines in carcinomas. EMBO. 8:1403. 7- Hollenbaugh D., L. Grosmaire, CD. Kullas, N.J. Chalupny, R.J. Noelle, I. Stamenkovic, J.A. Ledbetter, A: Aruffo. 1992. The human T cell antigen p39, a member of the TNF gene family, as aligand for the CD40 receptor: Expression of a soluble form of gp39 with B cell co-stimulatory activity. EMBO. 11:4313. 8. Armitage R.J., W.C. Fanslow, L. Strockbine, T.A. Sato, K.N. Clifford, B.M. Macduff, D.M. Anderson, S.D. Gimpel, T. Davis-Smith, CR. Maliszewski, E.A. Clark, CA. Smith, K.H. Grabstein, D. Cosman, M.K. Spriggs. 1982. Molecular and biological characterization of a murine ligand for CD40. Nature. 357:80. 9. Valle A., CE. Zuber, T. Defrance, O. Djossou, R.M. De, J. Banchereau. 1989. Activation of human B lymphocytes through CD40 and interleukin 4. Eur. J. Immunol. 19:1463. 10. Gordon J., M.J. Millsum, R.L. Flores, S. Gillis. 1989. Regulation of resting and cycling human B lymphocytes via surface the accessory molecules interleukin-4, CD23 and CD40. Immunology. 68:526. 11. Jabara H.H., S.M. Fu, R.S. Geha, D. Vercelli. 1990. CD40 and IgE: synergism between anti-CD40 monoclonal antibody and interleukin 4 in the induction of IgE synthetis by highly purified human B cells. J.Exp.Med. 172:1861. 12. Banchereau J., F. Rousset. 1991. Growing human B lymphocytes in the CD40 system. Nature. 353:678. 13. Armitage R.J., T.A. Sato, B.M. Macduff, K.N. Clifford, A.R. Alpert, CA. Smith, W.C Fanslow. 1992. Identification of a source of biologically active CD40 ligand. Eur. J. Immunol. 22:2071. 14. Lane P., A. Traunecker, S. Hubele, S. Inui, A. Lanzavecchia, D. Gray. 1992. Activated human T cells express a ligand for the human B cell-associated antigen CD40 which participates in T cell-dependent activation of B lymphocytes. Eur. J. Immunol. 22:2573. 15. Noelle R.J., J.A. Ledbetter, A. Aruffo. 1992. CD40 and its ligand, an essential ligand-receptor pair for thymus-dependent B cell activation. Immunol. Tod. 13:431. 16. Noelle R.J. M. Roy, D.M. Shepherd, I. Stamenkovic, J.A. Ledbetter, A. Aruffo. 1992. A novel ligand on activated T helper cell binds CD40 and transduces the signal for the cognate activation of B cells. Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 89;6550. 17. - Allen R.C., R.J. Armitage, M.E. Conley, H. Rosenblatt, N.A. Jenkins, N.G.

Copeland, M.A. Bedell, S. Edelhoff, J. Disteche, D.K. Simoneaux, W.C Fanslow, J. Belmont, M.K. Spriggs. 1993. CD40 ligand gene defects responsible for X-linked hyper-IgM Syndrome. Science. 259:990.

18. Aruffo A., M. Farrington, D. Hollenbaugh, Li X, A. Milatovich, S. Nonoyama,

J. Bajorath, L.S. Grosmaire, R. Stenkamp, M. Neubauer, R.L. Roberts, R.J. Noelle, Ledbetter, U. J.A. Francke, H.D. Ochs. 1993. The CD40 ligand, gp39, is defective in activated T cells from patients with X-linked hyper- IGM syndrome. Cell. 72:291. 19. DiSanto J.P., J.Y. Bonnefoy, J.F. Gauchat, A. Fischer, G. de Saint Basile. 1993. CD40 ligand mutations in X-linked immunodefiency with hyper-IgM. Nature. 361:541.

20. Korthauer U., D. Graf, H.W. Mages, F. Brieres, M.

Padayachee, S. Malcolm, A.G. Ugazio, L.D. Notarangelo, R.L. Levinsky, A. Kroczek. 1993) Defective Expression of T-cell CD40 ligand causes X-linked immunodeficiency with hyper-IgM. Nature. 361:539.

21. Kurt-Jones E., S. Hamberg, J. Ohara, W.E. Paul, A.K. Abbas. 1987. Heterogeneity of helper/inducer T lymphocytes. I. Lymphokine production. J.Exp.Med. 166:1774. 22. Springer T.A., A. Bhattacharya, J.T. Cardoza, F. Sanchez-Madrid. 1982. Monoclonal antibodies specific for rat IgGl, IgG2a, and IgG2b subclasses, and kappa chain monotypic and allotypic determinants: reagents for use with rat monoclonal antibodies. Hybrid. 1:25. 23. Hellstrom 1.1986. Monoclonal mouse antibodies raised against human lung carcinoma. Can. Res. 46:3917. 24. Wilde D.B., P. Marrack, J. Kappler, D.P. Dialynas, F.W. Fitch. 1983. Evidencé implicating L3T4 in class U MHC antigen reactivity; monoclonal antibody GK1.5 (anti-L3/4a) blocks class JJ MHC antigen-specific proliferation, release of lymphokines, and binding by cloned murine helper T lymphocyte lines. J. Immunol. 131:2178. 25. Snow E.C., R.J. Noelle. 1987. Thymus-dependent antigenic stimulation of hapten-specific B lymphocytes. Immunol. Rev. 99:173. 26. Jerne N.K., C. Henry, A.A. Nordin, H. Fuji, A.M. Koros, and I. Lefkovits. 1974. Plaque forming cells: Methodology and theory. Transplant Rev. 18:130. 27. Ochs H.D., R.J. Wedgewood. 1989. Disorders of the B cell system. In Immunologic disorders in infants and children. Third ed., E.R. Sreihm, ed. (Philadelphia: W.B. Saunders), pp. 226. 28. Notarangelo L.D., M. Duse, A.G. Ugazio.. 1992. Immuno-deficiency with hyper-IgM (HIM). Immunodef. Rev. 3:101. 29. Shizuru J.A., S.A. Alters, C.G. Fathman. 1992. Anti-CD4 monoclonal antibodies in therapy: Creation of nonclassical tolerance in the adult. Immunol. Rev. 129:103. 30. Linsley P.S., P.M. Wallace, J. Johnson, M.G. Gibson, J.L. Greene, J.A. Ledbetter, C. Singh, M.A. Tepper. 1992. Immuno-suppression in vivo by a soluble form of the CTLA-4T cell activation molecule. Science. 257:792. 31. Lenschow D. J., Y. Zeng, J.R. Thistlethwaite, A. Montag, W. Brady, M.G. Gibson, P.S. Linsley, J.A. Bluestone. 1992. Long-term survival of xenogeneic pancreatic islet grafts induced by CTLA4Ig. Science. 257:789.

Ekvivalenter

Fagfolk på dette område vil anerkjenne, eller være i stand til å finne ut ved anvendelse av ikke mer enn rutine-eksperimenter, mange ekvivalenter til de spesifikke utførelser av oppfinnelsen beskrevet her.

Claims (57)

1. Anvendelse av en gp39-antagonist og et thymus avhengig (TD) antigen for fremstilling av et farmasøytisk preparat for inhibering av en humoral immunrespons til TD antigenet in vivo.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori gp39-antagonisten er et anti-gp39 antistoff eller et gp39-bindende fragment derav eller en oppløselig form av en gp39 ligand.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvori den humorale immunresponsen til et TD antigen omfatter en antigen spesifikk IgE respons til et TD antigen.

4. Anvendelse av en gp39-antagonist og et TD antigen for fremstilling av en farmasøytisk sammensetning for inhibering av hjelper funksjonen til aktiverte Th celler indusert av TD antigenet in vivo.

5. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-5, hvori den humorale immunresponsen er en primær humoral immunrespons.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-2, hvori den humorale immunresponsen er en sekundær humoral immunrespons.

7. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, hvori TD antigenet er et protein.

8. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, hvori TD antigenet er på celleoverflaten.

9. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, hvori TD antigenet er et antistoff.

10. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, hvori TD antigenet er et terapeutisk middel.

11. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, hvori gp39-antagonisten er anti-gp39 antistoff eller et gp39-bindende fragment derav.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvori anti-gp39 antistoffet er monoklonalt antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712.

13. Anvendelse ifølge krav 1, hvori anti-gp39 antistoffet er monoklonalt antistoff 89-, med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

14. Anvendelse ifølge krav 11, hvori anti-gp39 antistoffet er et chimerisk monoklonalt antistoff.

15. Anvendelse ifølge krav 11, hvori anti-gp39 antistoffet er et humanisert monoklonalt antistoff.

16. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, hvori gp39 antagonisten er en oppløselig form av en gp39 ligand.

17. Anvendelse ifølge krav 16, hvori gp39 liganden er valgt fra CD40 og et CD40 fusjons protein.

18. Anvendelse ifølge krav 17, hvori gp39 liganden er CD40 fusjonsproteinet CD40Ig.

19. Anvendelse ifølge krav 3, hvori TD antigenet er et allergen.

20. Anvendelse ifølge krav 19, hvori det farmasøytiske preparatet videre omfatter en IL-4 inhibitor.

21. Anvendelse ifølge krav 20, hvori IL-4 inhibitoren er et anti-IL-4 antistoff.

22. Anvendelse ifølge krav 4, hvori de aktiverte Th cellene ikke er deletert.

23. Anvendelse ifølge krav 4, hvori de aktiverte Th cellene ikke er anergisert.

24. Anvendelse ifølge krav 14, hvori anti-gp29 antistoffet er et kimært monoklonalt antistoff omfattende lett og tungkjede variable regioner av antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB11713.

25. Anvendelse ifølge krav 15, hvori anti-gp39 antistoffet er et humanisert monoklonalt antistoff omfattende lett og tungkjede hypervariable regioner av antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB11713.

26. Anvendelse ifølge krav 11, hvori gp39-antagonisten er et gp39-bindende fragment av et anti-gp39 antistoff.

27. Anvendelse ifølge krav 26, hvori gp39-bindende fragment er valgt fra gruppen bestående av Fab, F(ab')2, og Fv.

28. Anvendelse ifølge krav 26, hvori gp39-bindende fragment omfatter lett og tungkjede variable regioner av antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB11712 eller antistoff. 89-76, med deponeringsnr. ATCC nr. HB11713.

29. Anvendelse ifølge krav 26, hvori gp39-bindende fragment omfatter lett og tungkjede hypervariable regioner av antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB11712 eller antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB11713.

30. Anvendelse av en gp39 antagonist for fremstilling av et farmasøytisk preparat for indusering av forlenget inhibisjon av en humoral immunrespons til et TD antigen in vivo i et individ som har blitt eksponert for TD antigenet.

31. Anvendelse ifølge krav 30, hvori TD antigenet skal administrere til et individ, samtidig med eller etter den farmasøytiske sammensetningen inneholdende gp39 antagonisten.

32. Anvendelse ifølge krav 30, hvori den humorale immunresponsen er en primiær humoral immunrespons.

33. Anvendelse ifølge krav 30, hvori den humorale immunresponsen er en sekundær humoralrespons.

34. Anvendelse ifølge krav 30, hvori den humorale immunresponsen som omfatter en antigen spesifikk IgE respons til et TD antigen.

35. Anvendelse ifølge krav 34, hvori TD antigenet er et allergen.

36. Anvendelse ifølge krav 35, hvori det farmasøytiske preparatet videre omfatter en IL-4 inhibitor.

37. Anvendelse ifølge krav 36, hvori IL-4 inhibitoren er et anti-IL-4 antistoff.

38. Anvendelse ifølge krav 30, hvori TD antigenet er et protein.

39. Anvendelse ifølge krav 30, hvori TD antigenet er på celleoverflaten.

40. Anvendelse ifølge krav 30, hvori TD antigenet er et antistoff.

41. Anvendelse ifølge krav 30, hvori TD antigenet er et terapeutisk middel.

42. Anvendelse ifølge krav 30, hvori TD antigenet skal bli administrert før administrering av det farmasøytiske preparatet inneholdende gp39 antagonisten.

43. Anvendelse ifølge krav 30, hvori TD antigenet skal bli administrert samtidig med administrering av det farmasøytiske preparatet inneholdende gp39 antagonisten.

44. Anvendelse ifølge krav 30, hvori gp39 antagonisten er et anti-gp39 antistoff eller et gp39-bindende fragment derav eller en oppløselig form av gp39 ligand.

45. Anvendelse ifølge krav 44, hvori gp39 antagonisten er et anti-gp39 antistoff eller et gp39-bindende fragment derav.

46. Anvendelse ifølge krav 45, hvori anti-gp39 antistoffet er monoklonalt antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller monoklonalt antistoff 89-76 med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

47. Anvendelse ifølge krav 45, hvori anti-gp39 antistoffet er et kimært monoklonalt antistoff.

48. Anvendelse ifølge krav 47, hvori anti-gp39 antistoffet er kimært monoklonalt antistoff omfattende lett og tungkjede variable regioner av antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC. HB11712 eller antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

49. Anvendelse ifølge krav 45, hvori anti-gp39 antistoffet er et humanisert monoklonalt antistoff.

50. Anvendelse ifølge krav 49, hvori anti-gp39 antistoffet er et humanisert monoklonalt antistoff omfattende et lett og tungkjede hypervariable regioner av antistoffet 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB11713.

51. Anvendelse ifølge krav 45, hvori gp39 antagonisten er et gp39-bindende fragment av et anti-gp39 antistoff.

52. Anvendelse ifølge krav 50, hvori gp39-bindende fragment derav er valgt fra gruppen bestående av Fab, F(ab'>2. og Fv.

53. Anvendelse ifølge krav 51, hvori det gp39-bindende fragmentet omfatteriett og tungkjede variable regioner av antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB 11712 eller antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB11713.

54. Anvendelse ifølge krav 51, hvori gp39-bindende fragment omfatter lett og tungkjede hypervariable regioner av antistoff 24-31, med deponeringsnr. ATCC HB11712 eller antistoff 89-76, med deponeringsnr. ATCC HB 11713.

55. Anvendelse ifølge krav 44, hvori gp39 antagonisten er en oppløselig form av en gp39 ligand.

56. Anvendelse ifølge krav 55, hvori gp39 liganden er valgt fra CD40 og et CD40 fusjonsprotein.

57. Anvendelse ifølge krav 56, hvori gp39 liganden er CD40 fusjonsprotein CD40Ig.