JP2877788B2 - 新規なサイトカインに対する抗体 - Google Patents

新規なサイトカインに対する抗体

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規なサイトカイ
ン (cytokine) に関する。より具体的には、本発明は、
ヒトＣＤ４０に結合し、アゴニスト及びアンタゴニスト
活性の両方を有する可溶性で膜結合型のマウス及びヒト
サイトカインのクローニングに関する。
【０００２】
【従来の技術】“インターロイキン”の呼称を有するサ
イトカインは、免疫エフェクター細胞に影響を及ぼすタ
ンパク質因子である。インターロイキン−１からインタ
ーロイキン−１２までで呼ばれているサイトカインが報
告されており、インターロイキンと命名されている。他
の既知のサイトカインには、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳ
Ｆ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マスト
細胞成長因子（ＭＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血
小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧ
Ｆ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、γ−インターフ
ェロン（γ−ＩＦＮ）等が含まれる。
【０００３】２種の異なるＴＮＦレセプター（タイプＩ
及びタイプII）のＤＮＡがクローン化されている（スミ
ス (Smith) ら, Science 248:1019, 1990；及びシャル
(Schall) ら, Cell 61:361, 1990)。両方の型のＴＮＦ
レセプターは互いに関連していて、そのメンバーに神経
成長因子レセプター（ジョンソン (Johnson) ら,Cell 4
7:545, 1986)、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０（スタメンコビック
(Stamenkovic)ら, EMBO J. 8:1403, 1989）、Ｔ細胞抗
原ＯＸ４０（マレット (Mallett) ら,EMBO J. 9:1063,
1990）、ヒトＦａｓ抗原（イトウ (Itoh) ら, Cell 66:
233,1991) 及びマウス４−１ＢＢレセプター（クォン
(Kwon) ら, Cell Immunol.121:414, 1989〔クォンら
Ｉ〕及びクォンら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:19
63, 1989〔クォンらII〕）が含まれるレセプターのファ
ミリーに属している。
【０００４】ヒトＣＤ４０タンパク質（ＣＤ４０）は、
３0,６００の分子量、及び疎水性アミノ酸を主として含
む１９アミノ酸分泌シグナルペプチドを有する２７７ア
ミノ酸のペプチドである（スタメンコビックら）。成熟
ヒトＣＤ４０タンパク質の分子量（グリコシル化は除
く）は２8,３００である。ヒトＣＤ４０をコードするｃ
ＤＮＡは、バーキットリンパ腫細胞系ラージから調製さ
れたｃＤＮＡライブラリーから単離された。ＣＤ４０ｃ
ＤＮＡによりコードされる推定上のタンパク質は、推定
上のリーダー配列、膜貫通ドメイン及び膜結合レセプタ
ータンパク質に共通の幾つかの他の特徴を含む。ＣＤ４
０は、Ｂリンパ球、上皮細胞及び幾つかのカルチノーマ
（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞系上で発現されることが見
出されている。
【０００５】ＣＤ４０に対して向けられたモノクローナ
ル抗体（ｍＡｂ）は、ヒトＢ細胞の種々の機能的作用を
媒介することが示されている。これら作用には：(a) 同
型付着（ゴードン (Gordon) ら, J. Immunol. 140:142
5, 1988〔ゴードンらＩ〕）；(b) 細胞の大きさの増加
（ゴードンらＩ及びバーレ (Valle) ら, Eur. J.Immuno
l. 19:1463, 1989）；(c) 抗ＩｇＭ、抗ＣＤ２０ｍＡ
ｂ、フォルボールエステル単独（クラーク (Clark) ら,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4494, 1986；及びパ
ウリー (Paulie) ら, J. Immunol. 142:590, 1989)、又
はインターロイキン−４と組み合わせたフォルボールエ
ステル（ゴードンら, Eur. J.Immunol. 17:1535, 1987
〔ゴードンらII〕）で活性化されたＢ細胞の増殖；及び
(d) インターロイキン−４（ＩＬ−４）刺激Ｔ−除去培
養物からのＩｇＥ（ジャバラ (Jabara) ら, J. Exp. Me
d. 172:1861, 1990；ザング (Zhang) ら, J. Immunol.
146:1836, 1991）及びＩｇＭ（ガスカン (Gascan) ら,
J. Immunol.147:8, 1991）の産生が含まれる。
【０００６】バンチェレイア (Banchereau) ら, Clin.
Immunol. Spectrum 3:8, 1991〔バンチェレイアらＩ〕
によりｍＡｂ８９と呼ばれるかかる抗体の１つが、比較
的低い抗体濃度（３０ｎｇ／ｍｌ又は約１０-10 Ｍ）で
ヒトＢ細胞増殖を誘発することが見出されている。増殖
は２〜３週間続いて１０倍に拡大したヒトＢ細胞個体群
が得られた。ＣＤ４０表面分子がＩｇＭにより架橋され
た場合は、Ｂ細胞の最高の刺激が起こった。もう１つの
抗ＣＤ４０ｍＡｂのＦａｂ断片は、弱い増殖応答を誘発
しただけであった。更に、バンチェレイアら, Science
251:70, 1991〔バンチェレイアらII〕は、ヒトＦｃレセ
プターで形質移入したマウス線維芽細胞のＬｔｋ- 細胞
系及びヒトＣＤ４０に特異的なモノクローナル抗体の両
方と共にインキュベートすると、休止期のヒトＢ細胞が
持続した増殖の状態に入ることを報告した。バンチェレ
イアらIIは、架橋ＣＤ４０がＢ細胞のクローン拡大に必
要であることを見出した。
【０００７】ＣＤ２３は、Ｔ細胞ではなく殆どのＩｇＭ
- ／ＩｇＤ- 成熟Ｂ細胞上で発現されることが見出され
ている低親和性ＩｇＥレセプターである。ＣＤ２３は配
列決定されており、その配列はキクタニ (Kikutani)
ら, Cell 47:657, 1986 に記載されている。可溶性ＣＤ
２３（ｓＣＤ２３）は、ウサギにおいて発熱反応を誘発
し、この反応はヒトＩｇＥの投与によって阻害されるこ
とが見出された（ガーデリ (Ghaderi) ら, Immunology
73:510, 1991)。従って、ＣＤ２３は可溶性ＣＤ４０又
はＣＤ４０−Ｌ作用の適切なマーカーであると言える。
【０００８】本発明がなされる以前にＣＤ４０のリガン
ドは知られていない。従って、当該技術分野において、
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０−Ｌ）を同定しかつその特
性を明らかにする必要が存在する。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】新規なサイトカイン
（以下“ＣＤ４０−Ｌ”という）を単離してその特性を
明らかにした。代表的なマウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配列番号：１
及び図１に開示し、そのアミノ酸配列も配列番号：２に
掲げる。代表的なヒトＣＤ４０−ＬｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列及び推定アミノ酸配列を配列番号：１１及び図
２に開示し、そのアミノ酸配列も配列番号：１２に掲げ
る。本発明は、更に、温和な又は苛酷なストリンジェン
ト条件下（ｕｎｄｅｒ ｍｏｄｅｒａｔｅ ｏｒ ｓｅｖ
ｅｒｅ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
ｓ）で、配列番号：１１によって規定されるプローブ
（ヒトＣＤ４０−Ｌのコーディング領域）に、配列番
号：１１のヌクレオチド４６からヌクレオチド８２８ま
でに及ぶ該配列の断片に、又は図２（配列番号：１１）
に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ配列又はそれらの断片にハ
イブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされ
る他のＣＤ４０−Ｌポリペプチドも含む。本発明は、更
に、遺伝子コードの縮重により、上記の核酸配列によっ
てコードされるポリペプチドに実質的に同一又は実質的
に類似のポリペプチドをコードする核酸配列、及びそれ
らに相補的な配列を含む。
【００１０】ＣＤ４０−Ｌは、そのＣ−末端で細胞外領
域を有し、Ｎ−末端で膜貫通領域と細胞内領域を有する
タイプII膜ポリペプチドである。マウスＣＤ４０−Ｌの
可溶体は、ＥＬ−４細胞からの上澄み液の中に見出され
ており、ＥＬ−４細胞は、ここに記載したビオチニル化
ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質に基づいて選別したもの
である。可溶性ＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４０−Ｌの細胞外
領域又はその断片を含む。マウスＣＤ４０−Ｌのタンパ
ク質配列は図１及び配列番号：２に記載されており、ヒ
トＣＤ４０−Ｌのタンパク質配列は図２及び配列番号：
１２に記載されている。マウスＣＤ４０−Ｌの細胞外領
域は、図１及び配列番号：２のアミノ酸４７からアミノ
酸２６０に及んでおり、ヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外領域
は、図２及び配列番号：１２のアミノ酸４７からアミノ
酸２６１に及んでいる。ＣＤ４０−Ｌの生物活性は、こ
のサイトカインのＣＤ４０との結合によって媒介されて
おり、Ｂ細胞増殖及びＩｇＥ分泌を含む抗体分泌を含
む。
【００１１】本発明は、更に、配列番号：１及び配列番
号：１１に及び図１及び２に記載したＣＤ４０−Ｌのヌ
クレオチド配列又はＣＤ４０−Ｌの該ヌクレオチド配列
に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ配列から選ばれる少なくと
も約１２ヌクレオチドの配列に対応するアンチセンス又
はセンスオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチ
ド又はリボヌクレオチド）を提供する。かかるアンチセ
ンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ４０−Ｌｍ
ＲＮＡの転写又はポリペプチドの翻訳を阻止する。
【００１２】より更には、本発明は、ＣＤ４０−Ｌ免疫
原に特異的な抗体を生ずる免疫原として働くことのでき
る、配列番号：１又は配列番号：１１によりコードされ
るアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１０アミノ酸の
タンパク質配列に対応するＣＤ４０−Ｌペプチド断片を
提供する。かかるＣＤ４０−Ｌ免疫原断片は、ＣＤ４０
−Ｌに特異的なモノクローナル抗体を供給する際に、抗
原決定基として役立ち得る。
【００１３】本発明は、また、ヒトＣＤ４０の細胞外領
域を含むヒトＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質及び可溶性
ＣＤ４０タンパク質（ｓＣＤ４０）も提供する。ｓＣＤ
４０及びＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の両方は、ＣＤ
４０−Ｌ又は抗ＣＤ４０ｍＡｂ誘導Ｂ細胞刺激、Ｂ細胞
内でのＩＬ−４誘導ＩｇＥ刺激及びＩＬ−４誘導ＣＤ２
３誘発を阻害することができる。
【００１４】
【課題を解決するための手段】マウス及びヒトＣＤ４０
のリガンドとして働くことのできる新規なポリペプチド
を単離して配列決定した。より詳しくは、これらリガン
ドをコードするｃＤＮＡをクローン化して配列決定し
た。更に、組換えＣＤ４０−Ｌポリペプチドの発現方法
も提供する。ＣＤ４０−Ｌポリペプチドには、ヒト又は
マウスＣＤ４０−Ｌの誘導体又は類縁体の如き、他の型
の哺乳動物ＣＤ４０−Ｌが含まれる。マウス及びヒトＣ
Ｄ４０−Ｌは、完全長のＣ−末端においてそれぞれ２１
４及び２１５アミノ酸細胞外領域、つまり膜結合ポリペ
プチドを含む。該細胞外領域は、ＣＤ４０に結合するド
メインを含有する。マウス及びヒトＣＤ４０−Ｌは、更
に、いずれかの側に荷電したアミノ酸により描写される
相同な疎水性２４アミノ酸膜貫通領域及びそれらのＮ−
末端において２２アミノ酸細胞内領域を含む。本発明
は、更に、該細胞外領域の全部若しくは一部分又は該細
胞外領域の誘導体を含む完全長ＣＤ４０−Ｌポリペプチ
ド又はその断片、及びマウス又はヒトＣＤ４０−Ｌをコ
ードするｃＤＮＡで形質移入され、膜結合タンパク質と
してヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌを発現する哺乳動物細
胞を包含する。
【００１５】本発明は、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドをコ
ードする単離されたＤＮＡ配列及びかかる単離されたＤ
ＮＡ配列に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む。該単
離されたＤＮＡ配列及びそれらの相補体は、(a) 図２
（配列番号：１１）に記載したＤＮＡ配列のヌクレオチ
ド１８４から８２８、ヌクレオチド１９３から８２８又
はヌクレオチド１９３から７６２及びそれらの相補体、
(b) 温和なストリンジェント条件下で、(a) のＤＮＡ配
列又はそれらの相補体とハイブリダイズし、ＣＤ４０−
Ｌポリペプチド、その類縁体又は誘導体をコードするＤ
ＮＡ配列、及び(c) 遺伝子コードの縮重により、前述の
ＤＮＡ配列又はそれらの相補体のいずれかによってコー
ドされるＣＤ４０−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列からなる群から選ばれる。加えて、本発明は、ＣＤ
４０−Ｌポリペプチド及びその類縁体をコードするＤＮ
Ａ配列を含むベクター、及びかかるベクターで形質移入
された宿主細胞を包含する。
【００１６】ここに開示した新規なサイトカインは、Ｃ
Ｄ４０、つまりＴＮＦレセプタースーパーファミリーの
メンバーであるレセプター、のリガンドである。従っ
て、ＣＤ４０−Ｌは、例えば、Ｂリンパ球によって発現
されることが知られている、ＣＤ４０を介するシグナル
の変換を司っているようである。完全長ＣＤ４０−Ｌ
は、そのＣ−末端において細胞外領域、膜貫通領域、及
びそのＮ−末端において細胞内領域を有する膜結合ポリ
ペプチドである。ＣＤ４０−Ｌの可溶体は、該細胞外領
域又はその断片から作ることができ、可溶性ＣＤ４０−
Ｌは、ＣＤ４０−Ｌの膜結合体を発現する細胞からの培
養上澄み液中に見出された。マウスＣＤ４０−Ｌの細胞
外領域のタンパク質配列は、図１及び配列番号：２のア
ミノ酸４７からアミノ酸２６０に及ぶ。ヒトＣＤ４０−
Ｌの細胞外領域のタンパク質配列は、図２及び配列番
号：１２のアミノ酸４７からアミノ酸２６１に及ぶ。Ｃ
Ｄ４０−Ｌの生物活性は、ＣＤ４０又はその種特異的同
族体と結合することによって媒介され、Ｂ細胞の増殖及
び活性化Ｂ細胞のからのイムノグロブリン分泌の誘発を
含む。ＣＤ４０−Ｌ（可溶性モノマー型及びオリゴマー
型並びに膜結合型を含む）は、添加ＩＬ−４の存在なし
にＢ細胞増殖及びイムノグロブリン分泌（ＩｇＥ分泌は
除く）をもたらすことができ、活性を媒介するためにＩ
Ｌ−４及び架橋を必要とする抗ＣＤ４０抗体とは対照的
である。
【００１７】ＣＤ４０−Ｌとは、ＣＤ４０又はＣＤ４０
の哺乳動物同族体に結合することのできるポリペプチド
のことをいう。ここで用いる場合、“ＣＤ４０−Ｌ”と
いう用語には、膜貫通及び細胞内領域を欠く可溶性ＣＤ
４０−Ｌポリペプチド、ヒトＣＤ４０−Ｌの哺乳動物同
族体、ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌの類縁体、又はヒト
又はマウスＣＤ４０−Ｌの誘導体が含まれる。
【００１８】ＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４０−Ｌポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によっても
得ることができる。ここで言うＣＤ４０−Ｌ類縁体は、
ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌの配列に実質的に相同性の
ポリペプチドであるが、１又は２以上の欠失、挿入又は
置換の故に、天然配列のＣＤ４０−Ｌ（ヒト又はマウス
種）ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する。Ｃ
Ｄ４０−Ｌの類縁体は、オリゴヌクレオチド合成及び連
結により又は部位特異的突然変異誘発により調製したＤ
ＮＡ構築体から合成することができる。
【００１９】グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基
等の如き他の化学部分と共有結合性又は集合性複合体を
形成することによって、又はアミノ酸配列突然変異体を
作り出すことによって、ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌの
一次アミノ酸構造を修飾し、ＣＤ４０−Ｌ誘導体を作り
出すことができる。ＣＤ４０−Ｌの共有結合性誘導体
は、特定の官能基をＣＤ４０−Ｌアミノ酸側鎖又はＣＤ
４０−ＬポリペプチドのＮ−末端若しくはＣ−末端又は
その細胞外ドメインに連結することによって調製する。
本発明の範囲に入るＣＤ４０−Ｌの他の誘導体には、例
えば、Ｎ−末端又はＣ−末端融合のような組換え培養物
中での合成によるＣＤ４０−Ｌと他のタンパク質又はポ
リペプチドとの共有結合性又は集合性複合体又はその断
片が含まれる。例えば、該複合体は、翻訳と同時に又は
翻訳後に該複合体の移動をその合成部位から細胞膜若し
くは細胞壁の内側若しくは外側へと行う、ＣＤ４０−Ｌ
ポリペプチドのＮ−末端領域又はＣ−末端領域における
シグナル又はリーダーポリペプチド配列を含んでもよい
（例えば、サッカロミセス属のα−因子リーダー）。Ｃ
Ｄ４０−Ｌポリペプチド融合体は、ＣＤ４０−Ｌの精製
及び同定を容易にするために付加したポリペプチド（例
えば、ポリ−Ｈｉｓ）を含んでもよく、又、新規な多官
能性存在物を提供するために他のサイトカインとの融合
体を含んでもよい。他のサイトカインには、例えば、イ
ンターロイキン−１から１３までのいずれか、ＴＮＦ
（腫瘍壊死因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファ
ージコロニー刺激因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー
刺激因子）、ＭＧＦ（マスト細胞成長因子）、ＥＧＦ
（表皮成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、
ＮＧＦ（神経成長因子）、ＥＰＯ（エリスロポイエチ
ン）、γ−ＩＦＮ（γ−インターフェロン）、４−１Ｂ
Ｂ−Ｌ（４−１ＢＢリガンド）及び免疫細胞成長、分化
又は機能に影響を及ぼす他のサイトカインが含まれる。
【００２０】本発明の範囲内の核酸配列には、温和な又
は苛酷なストリンジェント条件下で、配列番号：１又は
配列番号：１１のヌクレオチド配列にハイブリダイズす
るＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列又は相補的な配列が含ま
れる。温和にストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件とは、例えば、サムブルーク (Sambrook) ら,Mol
ecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol.1,
pp.1.101-104, ColdSpring Harbor Laboratory Press,
(1989) に記載されている条件をいう。サムブルークら
によって定義された温和でストリンジェントな条件に
は、５×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ、1.０ｍＭ ＥＤＴＡ
（ｐＨ8.０）の予備洗浄溶液の使用及び５０℃で一晩の
５×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションが含まれる。苛
酷でストリンジェントな条件には、より高温でのハイブ
リダイゼーション及び洗浄が含まれる。
【００２１】ＣＤ４０−Ｌの生物活性は、例えば、ＣＤ
４０のリガンド結合ドメインへの結合の競合により測定
することができる（即ち、競合結合測定法）。マウスＣ
Ｄ４０−Ｌ及びヒトＣＤ４０−Ｌの両方がヒトＣＤ４０
に結合する。ヒトＣＤ４０についてのマウスＣＤ４０−
Ｌ（選別したマウスＥＬ−４0.９細胞上で発現したも
の）の結合親和性は、約1.７４×１０9 Ｍ-1であった。
同じく、ヒトＣＤ４０についてのマウスＣＤ４０−Ｌ
（選別していないマウスＥＬ−４6.１細胞上で発現した
もの）の結合親和性は、約2.３×１０9 Ｍ-1であった。
両方の結合親和性測定値は、サイトカイン／サイトカイ
ンレセプター結合の通常の範囲内である。
【００２２】ＣＤ４０−Ｌポリペプチドについての競合
結合測定法の１つの形は、放射標識した可溶性の図１
（配列番号：１）によるマウスＣＤ４０−Ｌ又は図２
（配列番号：１１）によるヒトＣＤ４０−Ｌ、及びＣＤ
４０を発現する無傷細胞（例えば、ヒトＢ細胞）を用い
る。無傷細胞の代わりに、プロテインＡ又はプロテイン
Ｇ相互作用を介してそのＦｃ領域で固相に結合した（Ｃ
Ｄ４０／Ｆｃ融合タンパク質の如き）可溶性ＣＤ４０と
置き換えてもよい。競合結合測定法の第２の形は、ＣＤ
４０／Ｆｃ融合タンパク質の如き放射標識した可溶性Ｃ
Ｄ４０、及びＣＤ４０−Ｌを発現する無傷細胞を用い
る。また、可溶性ＣＤ４０−Ｌを固相に結合してもよ
い。
【００２３】競合結合測定法は、標準的な方法を用いて
行うことができる。例えば、放射標識マウスＣＤ４０−
Ｌを用いて推定上のＣＤ４０−Ｌ同族体と競合させ、表
面結合ＣＤ４０に対する結合活性を測定することができ
る。競合的オートラジオグラフプレート結合測定法によ
り定量的結果を得ることができ、又定量的結果を得るた
めにスキャッチャードプロットを用いることもできる。
【００２４】ＣＤ４０を発現する無傷細胞での競合結合
測定法は、２つの方法で行うことができる。第１の方法
では、懸濁液中で又は組織培養プレートへの粘着による
かのいずれかでＢ細胞を成育させる。粘着細胞は、３７
℃で１０分間、５ｍＭ ＥＤＴＡで処理することによっ
て剥がすことができる。第２の方法では、膜結合ＣＤ４
０を発現する形質移入ＣＯＳ細胞を用いることができ
る。ＣＯＳ細胞又は他の哺乳動物細胞を適当なベクター
中のヒトＣＤ４０ｃＤＮＡで形質移入して、細胞外領域
を有する完全長ＣＤ４０を細胞外に発現させることがで
きる。
【００２５】また、可溶性ＣＤ４０を、カラムクロマト
グラフィーマトリックス、又は試験管又は125Ｉの如き
検出可能な部分の存在についての分析に適する類似の支
持体の如き固相に結合してもよい。固相への結合は、例
えば、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を得て、それをプ
ロテインＡ又はプロテインＧ表面に結合させることによ
って行うことができる。
【００２６】ＣＤ４０−Ｌ及びその同族体の生物活性を
測定する他の手段は、複合化した可溶性ＣＤ４０（例え
ば、125Ｉ−ＣＤ４０／Ｆｃ）を上記と類似の競合測定
法において用いることである。しかしながら、この場合
は、ＣＤ４０−Ｌを発現する無傷細胞、又は固体支持体
に結合した可溶性ＣＤ４０−Ｌを用いて、推定上のＣＤ
４０同族体を含有するサンプルに複合化した可溶性ＣＤ
４０のＣＤ４０−Ｌへの結合についての競合を測定す
る。
【００２７】ＣＤ４０−Ｌは、Ｂ細胞増殖検定法で生物
活性を測定することによって分析してもよい。ヒトＢ細
胞は、デフランス (Defrance) ら, J. Immunol. 139:11
35,1987 により記載された陰性選択法及びパーコール
(Percoll) 密度沈降法による精製により、ヒト扁桃腺か
ら得ることができる。バーキットリンパ腫細胞系を用い
て、ＣＤ４０−Ｌに応答する細胞増殖を測定してもよ
い。バーキットリンパ腫細胞系の例には、例えば、ラー
ジ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ８６）、ダウジ (Daudi)（ＡＴＣ
Ｃ ＣＣＬ２１３）及びナマルワ (Namalwa)（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ１４３２）が含まれる。膜結合ＣＤ４０−Ｌは
Ｂ細胞増殖を刺激した。オリゴマー、好ましくはダイマ
ーのＣＤ４０−Ｌは、Ｂ細胞増殖を刺激することができ
る。ＣＤ４０（レセプター）は、Ｂ細胞のＣＤ４０−Ｌ
増殖に対抗する。
【００２８】ＣＤ４０−Ｌ生物活性を測定するための他
の分析法は、ＣＤ４０−Ｌ又はその誘導体又は類縁体に
よる活性化に応答してＢ細胞により産生されるイムノグ
ロブリンを測定することである。例えば、培養液中５×
１０5 細胞／ｍｌのＢ細胞と共に少なくとも７日間イン
キュベートすることによって、ポリクローナルイムノグ
ロブリン分泌を測定することができる。イムノグロブリ
ン（Ｉｇ）産生は、マリスゼウスキー (Maliszewski)
ら, J. Immunol. 144:3028, 1990 〔マリスゼウスキー
らＩ〕又はマリスゼウスキーら, Eur. J. Immunol. 20:
1735, 1990〔マリスゼウスキーらII〕に記載された如き
ＥＬＩＳＡ分析法により測定することができる。マウス
Ｂ細胞は、例えば、マウスから採取して、グラブシュタ
イン(Grabstein) ら, J. Exp. Med. 163:1405, 1986
〔グラブシュタインらＩ〕、マリスゼウスキーらＩ及び
マリスゼウスキーらIIに記載された操作に従って培養す
ることによって得ることができる。
【００２９】ＣＤ４０−Ｌを、ＣＤ４０を発現する細胞
を検出するための結合分析に用いることもできる。例え
ば、図１（配列番号：１）によるマウスＣＤ４０−Ｌ若
しくは図２（配列番号：１１）によるヒトＣＤ４０−
Ｌ、又はその細胞外ドメイン又は断片を、125Ｉの如き
検出可能部分と複合化させることができる。125Ｉでの
放射標識は、高い特異的活性に標識された機能性125Ｉ
−ＣＤ４０−Ｌ分子を生成する多くの標準的方法のいず
れかにより行うことができる。また、比色定量又は蛍光
定量反応を触媒することのできる酵素の如き他の検出可
能部分、ビオチン又はアビジンを用いてもよい。ＣＤ４
０を発現する細胞を複合化ＣＤ４０−Ｌと接触させるこ
とができる。インキュベーション後に未結合複合化ＣＤ
４０−Ｌを除いて、検出可能部分を用いて結合を測定す
る。
【００３０】ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、ダイマー又
はトリマーの如きオリゴマーとして存在してもよい。オ
リゴマーは、異なるＣＤ４０−Ｌポリペプチド上のシス
テイン残基間で形成されるジスルフィド結合により連結
される。また、２つの可溶性ＣＤ４０−ＬドメインをＧ
ｌｙ4ＳｅｒＧｌｙ5Ｓｅｒリンカー配列、又は米国特許
第5,０７3,６２７号に記載された他のリンカー配列で連
結することができる。なお、米国特許第5,０７3,６２７
号は参照によりここに組み入れられるものとする。ＣＤ
４０／Ｆｃ融合タンパク質について記載したようにし
て、可溶性ＣＤ４０−ＬのＣ−末端（細胞外ドメイン）
をＩｇＧ１のＦｃ領域（例えば、配列番号：３）に融合
させることによって、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを作り
出してもよい。ＣＤ４０−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質は、
その組み立てが抗体分子のＨ鎖に非常に似ており、二価
のＣＤ４０−Ｌを形成している。融合タンパク質が抗体
のＨ鎖とＬ鎖の両方でできているなら、４つのＣＤ４０
−Ｌ細胞外ドメインだけでＣＤ４０−Ｌオリゴマーを形
成することが可能である。
【００３１】融合タンパク質は、望ましい配列からの断
片の酵素切断及び連結の慣用技術を用いて調製してもよ
い。合成オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ法を用いて
目的の断片を調製及び／又は増幅することができる。目
的の配列に該当する合成オリゴヌクレオチドのオーバー
ラッピングを使用して、融合タンパク質をコードするＤ
ＮＡ構築体を調製することもできる。融合タンパク質
は、ＣＤ４０−Ｌと、リーダー（又はシグナルペプチ
ド）配列、Ｆｃ領域、リンカー配列、及び融合タンパク
質を容易に精製できかつ速やかに検出できる手段を提供
する高度に抗原性の部分をコードする配列を含む２又は
３以上の付加的な配列を含むこともできる。
【００３２】シグナルペプチドは、細胞からのタンパク
質の分泌を促進する。代表的はシグナルペプチドは、ヒ
トインターロイキン−７（ＩＬ−７；グッドウィン (Go
odwin) ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:302, 198
9；図２Ｂ）のリーダー配列のアミノ末端２５アミノ酸
である。他のシグナルペプチドを用いてもよい。例え
ば、ＩＬ−７リーダー配列内の一定のヌクレオチドを、
アミノ酸配列を変化させることなく変化させることがで
きる。更に、ＩＬ−７配列がリーダー配列として働く能
力に影響を及ぼさないアミノ酸変化を行うことができ
る。
【００３３】Ｆｌａｇ（登録商標）オクタペプチド（Ａ
ｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓ
ｐ−Ｌｙｓ）は、融合タンパク質の生物活性を変化させ
ず、高度に抗原性であって特異的モノクローナル抗体に
より可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現され
た融合タンパク質の検出と迅速にしかつ精製を容易にす
る。Ｆｌａｇ（登録商標）配列も、Ａｓｐ−Ｌｙｓ対合
の直後の残基においてウシ粘膜エンテロキナーゼにより
特異的に切断され、このペプチドでキャップされた融合
タンパク質は、大腸菌内での細胞内分解に対して抵抗性
であり得る。Ｆｌａｇ（登録商標）配列に結合するマウ
スモノクローナル抗体を、受託番号ＨＢ９２５９でＡＴ
ＣＣに寄託した。Ｆｌａｇ（登録商標）配列を含む融合
タンパク質の精製において該抗体を使用する方法は、米
国特許第5,０１1,９１２号に記載されており、参照によ
ってここに組み入れられるものとする。
【００３４】適当なＦｃ領域は、プロテインＡ又はプロ
テインＧに結合でき、また別に、該Ｆｃ領域を含む融合
タンパク質の精製又は検出に用いることのできる抗体に
よって認識されるＦｃ領域として定義される。好ましい
Ｆｃ領域には、ヒトＩｇＧ1又はマウスＩｇＧ1 のＦｃ
領域が含まれる。１つの例は、配列番号：３に示したヒ
トＩｇＧ1 Ｆｃ領域であり、もう１つの例は、鋳型とし
てヒトｃＤＮＡを用いる、配列番号：９及び配列番号：
１０からのオリゴヌクレオチドプライマーからのＰＣＲ
により得られるｃＤＮＡによりコードされるＦｃ領域で
ある。適当なＦｃ領域の一部分も用いることができ、例
えば、プロテインＡへの結合を司っているアミノ酸の配
列を欠失した結果、生じたＦｃ領域がプロテインＡにで
はなくプロテインＧに結合するようになったヒトＩｇＧ
1 のＦｃ領域がある。
【００３５】〔Ｇｌｙ4 Ｓｅｒ〕3 繰り返し配列は、Ｃ
Ｄ４０−Ｌがその第二及び第三構造に正確に折り重なる
のを確実にするのに充分な距離だけ、ＣＤ４０−Ｌの細
胞外領域を融合タンパク質のＦｃ部分から離すリンカー
配列を提供する。適するリンカー配列は、(1) 柔軟に延
びたコンフォメーションに適合し、(2) 融合タンパク質
の機能性ドメインと相互作用するおそれのある整然とし
た第二構造を形成しようとする傾向を示さず、そして
(3) 機能性タンパク質ドメインとの相互作用を助長する
おそれのある疎水性又は荷電性が最小のものであろう。
柔軟なタンパク質領域内の典型的な表面アミノ酸には、
Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒが含まれる。事実上、Ｇｌ
ｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含有するアミノ酸配列のあらゆ
る組み合わせが、リンカー配列についての上の規準を満
足すると考えられる。Ｔｈｒ及びＡｌａの如き他の殆ど
中性のアミノ酸をリンカー配列に用いてもよい。リンカ
ー配列の長さは多様に変化してもよいが、該融合タンパ
ク質の生物活性に有意な影響を与えてはならない。融合
したタンパク質が、機能性ドメインを離して立体的干渉
を防ぐのに用いることのできる必須ではないＮ−又はＣ
−末端アミノ酸領域を有する場合は、リンカー配列は不
要である。
【００３６】ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、図１（配列
番号：１）及び図２（配列番号：１１）に示したＣＤ４
０−Ｌの細胞外ドメインを含む可溶性ポリペプチドとし
て又はマウス及びヒト配列についてそれぞれ図１（配列
番号：１）及び図２（配列番号：１１）に示した該細胞
外ドメイン、膜貫通領域及び短い細胞内ドメインを含む
膜結合ポリペプチドとして存在してもよい。更に、本発
明は、ジスルフィド相互作用により連結されるか、又は
スペーサーアミノ酸連結基を有するか若しくは有しない
融合ポリマーとして発現されるＣＤ４０−Ｌ細胞外ドメ
インのオリゴマー又はその断片を包含する。例えば、ダ
イマーＣＤ４０−Ｌ分子は、ＩｇＧ Ｆｃ領域連結基に
より連結され得る。
【００３７】理論に拘束されることないが、膜結合ＣＤ
４０−Ｌ及びオリゴマーＣＤ４０−Ｌは、従来はＩＬ−
４の存在下で架橋抗ＣＤ４０抗体によって達成されたに
過ぎなかったＩｇ形成及びＢ細胞の増殖を刺激する活性
をもたらすことができる。更に、ＣＤ４０−Ｌの細胞外
ドメインだけを含み、ＣＤ４０レセプターに結合できる
モノマー可溶性ＣＤ４０−Ｌは、膜結合及びオリゴマー
ＣＤ４０−Ｌ及び／又は架橋抗ＣＤ４０抗体の活性に対
抗するのに役立つと考えられる。更に、膜結合ＣＤ４０
−ＬとＣＤ４０との相互作用が、抗原特異性抗体産生及
びポリクローナルＩｇ分泌の両方へのＢ細胞成長及び分
化のＴ細胞接触依存性誘発を司る主要な分子相互作用で
あると考えられる。この点で、完全長ＣＤ４０−Ｌ（即
ち、膜結合性であり、細胞内ドメイン、膜貫通領域及び
細胞外ドメイン又はそれらの断片を有する）をコードす
るｃＤＮＡで形質移入された哺乳動物細胞は、Ｂ細胞成
長、分化及び抗原特異性抗体産生の刺激を誘発するＴ細
胞の能力に関し、Ｔ細胞を真似ることができる。オリゴ
マー可溶性ＣＤ４０−Ｌ、好ましくは細胞外領域のダイ
マーの活性は、膜結合ＣＤ４０−Ｌの生物活性を真似る
ことができると考えられる。更に、可溶性モノマーＣＤ
４０−Ｌ（該細胞外ドメイン又はその断片を含む）は、
ＣＤ４０レセプターに結合してＴ細胞とＢ細胞の相互作
用を阻止し、従って、それ自体モノマー型又はオリゴマ
ー型であってもよいＣＤ４０（レセプター）細胞外ドメ
インに類似する活性を有することができる。また、ＣＤ
４０−Ｌは、Ｂ細胞成長、分化及び抗原特異性抗体産生
の刺激を誘発できる可溶性因子として働くために、オリ
ゴマー（好ましくはダイマー）であることができる。従
って、膜結合ＣＤ４０−Ｌ及びオリゴマーＣＤ４０−Ｌ
は、ＣＤ４０アゴニストとして働く一方で、可溶性（モ
ノマー）ＣＤ４０−Ｌ及び可溶性ＣＤ４０は、シグナル
を有意に伝達することなくＣＤ４０レセプター部位を遮
断することにより又はＢ細胞及び他の標的細胞上のＣＤ
４０部位にＣＤ４０−Ｌが結合するを阻止することによ
り、ＣＤ４０アンタゴニストとしても働くと考えられ
る。
【００３８】ＣＤ４０アゴニスト及びＣＤ４０アンタゴ
ニストの両方は有用な治療活性を有するであろう。例え
ば、ＣＤ４０アゴニスト（即ち、膜結合ＣＤ４０−Ｌ及
びオリゴマーＣＤ４０−Ｌ）は、ワクチンアジュバント
として及びハイブリドーマ細胞からのｍＡｂ産生を刺激
するのに有用である。ＣＤ４０アンタゴニスト（即ち、
ＣＤ４０レセプター、ＣＤ４０／Ｆｃ及びできるだけ可
溶性のモノマーＣＤ４０−Ｌ）は、アレルギー、狼瘡、
慢性間接リウマチ、インシュリン依存真性糖尿病（ＩＤ
ＤＭ）、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）等の如き高レベ
ルの抗原抗体複合体の存在を特徴とする自己免疫疾患の
治療に有用である。
【００３９】ヒトＢ細胞からのＩｇＥ分泌は、Ｔ細胞存
在下でＩＬ−４により誘発され得る（ベルセリ (Vercel
li) ら, J. Exp. Med. 169:1295, 1989)。更に、ＩｇＥ
産生は、抗ＣＤ４０ｍＡｂの添加によって、Ｔ細胞除去
ＰＢＭ（末梢血単核細胞）から誘発され得る（ジャバラ
ら, J. Exp. Med. 172:1861, 1990 及びザングら, J.Im
munol. 146:1836, 1991）。本発明は、更に、Ｔ細胞存
在下のＩＬ−４により又はＣＤ４０−Ｌ（好ましくは、
膜結合ＣＤ４０−Ｌ）により活性化された活性化Ｂ細胞
からのＩｇＥ産生を阻害する方法であって、ここに記載
したＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質又は配列番号：３に
記載したｃＤＮＡ配列によりコードされる可溶性ＣＤ４
０を有効量投与することを含む方法を包含する。同様
に、ＣＤ４０レセプター及びできるだけ可溶性のＣＤ４
０−Ｌ（モノマーだけ）も、他の抗体アイソタイプの分
泌を遮断することができる。
【００４０】本発明は、更に、天然パターンのグリコシ
ル化を伴うか又は伴わないＣＤ４０−Ｌポリペプチドを
包含する。酵母又は哺乳動物発現系（例えば、ＣＯＳ−
７細胞）内で発現されたＣＤ４０−Ｌは、何を発現系に
選ぶかに依存して、分子量及びグリコシル化パターンに
関し、天然ＣＤ４０−Ｌポリペプチドと類似していても
有意に異なっていてもよい。大腸菌の如き細菌発現系で
のＣＤ４０−Ｌポリペプチドの発現により、グリコシル
化されていない分子が得られる。
【００４１】生物活性又は結合に必要ではない、アミノ
酸残基若しくは配列の種々の付加体若しくは置換体、又
は末端若しくは内部残基若しくは配列の欠失体をコード
するＤＮＡ構築体を調製することができる。例えば、細
胞外ＣＤ４０−Ｌ Ｎ−グリコシル化部位を修飾してグ
リコシル化を前もって排除し、酵母発現系を用いて同種
の炭水化物減少類縁体を発現させることができる。真核
性ポリペプチドにおけるＮ−グリコシル化部位は、アミ
ノ酸三連体Ａｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられる。ここ
で、ＸはＰｒｏを除くいずれかのアミノ酸であり、Ｙは
Ｓｅｒ又はＴｈｒである。この三連体をコードするヌク
レオチド配列を適当に修飾すると、Ａｓｎ側鎖における
炭水化物残基の結合を妨げる置換、付加又は欠失をもた
らすであろう。他の例では、タンパク質の復元の際の正
しくない分子内ジスルフィド橋の形成を防ぎながら、Ｃ
ｙｓ残基をコードする配列を変化させて、Ｃｙｓ残基を
欠失又は他のアミノ酸と置換させることができる。ヒト
ＣＤ４０−Ｌは、その細胞外ドメイン内に５つのＣｙｓ
残基を含む。かくして、タンパク質三次構造又はジスル
フィド結合形成に影響を及ぼさずに、該５つのＣｙｓ残
基のうち少なくとも１つを他のアミノ酸で置換するか又
は欠失させることができる。
【００４２】突然変異誘発への他のアプローチは、ＫＥ
Ｘ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を
増進するために二塩基性アミノ酸残基をコードする配列
の修飾を包含する。末端又は内部残基又は配列をコード
する配列を欠失させることにより、ＣＤ４０−Ｌポリペ
プチドのサブユニットを構築してもよい。
【００４３】ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、多エクソン
遺伝子によりコードされる。本発明は、更に、転写後の
異なるｍＲＮＡスプライシングを原因とすることができ
る別のｍＲＮＡ構築体、及びここに開示したｃＤＮＡと
同一性又は類似性を有する領域を共有する別のｍＲＮＡ
構築体を包含する。
【００４４】アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチ
ドは、標的ＣＤ４０−ＬｍＲＮＡ（センス）又はＣＤ４
０−Ｌ ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本
鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含む。本
発明によるアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチド
は、配列番号：１若しくは配列番号：１１の、又は配列
番号：１若しくは配列番号：１１に相補的なＤＮＡ又は
ＲＮＡの断片を含む。かかる断片は、少なくとも約１４
のヌクレオチドを含む。好ましくは、かかる断片は、約
１４〜約３０のヌクレオチドを含む。ＣＤ４０−Ｌのｃ
ＤＮＡ配列に基づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌ
クレオチドを作り出す能力は、例えば、シュタイン (St
ein) 及びコーエン (Cohen), Cancer Res. 48:2659, 19
88 及びファン・デル・クロール (Van der Krol) ら, B
ioTechniques 6:958, 1988 に記載されている。
【００４５】アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチ
ドの標的核酸配列への結合により、二重鎖の形成がもた
らされ、この二重鎖形成が、該二重鎖の分解の増進、転
写又は翻訳の早期終結を含む幾つかの手段のうちの１つ
又は他の手段により翻訳（ＲＮＡ）又は転写（ＤＮＡ）
を遮断する。適するポリメラーゼプロモーターには、あ
らゆるＲＮＡポリメラーゼについてのプロモーター、又
はあらゆるＤＮＡポリメラーゼについてのプロモーター
が含まれる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチ
ドは、更に、修飾された糖−ホスホジエステル主鎖（又
はＷＯ９１／０６６２９に記載されたものの如き他の糖
結合）を有するオリゴヌクレオチドを含む。この場合、
かかる糖結合は内因性ヌクレアーゼに耐性である。耐性
糖結合を有するかかるオリゴヌクレオチドは、in vivo
で安定である（即ち、酵素分解に対して抵抗できる）
が、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性を保
持している。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの他の例には、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたも
のの如き有機部分、及びポリ（Ｌ−リシン）の如き標的
核酸配列についての該オリゴヌクレオチドの親和性を高
める他の部分に共有結合したオリゴヌクレオチドが含ま
れる。更になお、エリプチシン (ellipticine)の如き挿
入剤 (intercalating agent)、及びアルキル化剤又は金
属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに
付けて、標的ヌクレオチド配列に対する該アンチセンス
又はセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を変えても
よい。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、
例えば、ＣａＰＯ4 媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポ
レーションを含むあらゆる遺伝子移入法、又はエプスタ
イン・バー・ウィルスの如き他の遺伝子移入ベクターに
よって標的核酸配列を含有する細胞の中に導入すること
ができる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチド
は、好ましくは、該アンチセンス又はセンスオリゴヌク
レオチドを適当なレトロウィルスベクターの中に挿入
し、次いで、細胞と該挿入した配列を含有するレトロウ
ィルスベクターを in vivo 又は ex vivo のいずれかで
接触させることによって、標的核酸配列を含有する細胞
の中に導入される。適するレトロウィルスベクターに
は、マウスレトロウィルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−Ｍ
ｕＬＶ由来のレトロウィルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣ
Ｔ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃ（ＰＣＴ出願ＵＳ９０／０２６５
６を参照のこと）と呼称される二重コピーベクターが含
まれるがこれらに限定されない。また、他のプロモータ
ー配列を用いて該オリゴヌクレオチドを発現してもよ
い。
【００４６】センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドは、また、ＷＯ９１／０４７５３に記載されたような
リガンド結合分子を有する複合体の形成によって、標的
ヌクレオチド配列を含有する細胞の中に導入してもよ
い。適するリガンド結合分子には、細胞表面レセプタ
ー、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプ
ターに結合する他のリガンドが含まれるがこれらに限定
されない。リガンド結合分子の複合化が、該リガンド結
合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する能
力を実質的に妨害しないか、又は該センス又はアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド若しくはその複合体が細胞の中
に入り込むのを遮断しないのが好ましい。
【００４７】また、センス又はアンチセンスオリゴヌク
レオチドを、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたような
オリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスの形成によっ
て、標的核酸配列を含有する細胞の中に導入してもよ
い。該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂
質コンプレックスは、好ましくは内因性リパーゼによっ
て細胞内で解離される。
【００４８】マウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡの配列を直接
発現法によって得た。ヒトＣＤ４０−Ｌの配列は、マウ
スＣＤ４０−ＬｃＤＮＡをプローブとして用いて種間交
叉ハイブリダイゼーション法によって得た。
【００４９】本発明者らは、まず、スタメンコビック
(Stamenkovic) らに公表された配列（配列番号：４）に
基づくプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）法により、ヒトＣＤ４０の細胞外領域のクローン
（そのレセプター）を得ることによってマウスＣＤ４０
−Ｌをクローン化した。上流のオリゴヌクレオチドプラ
イマー ５'−ＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣ
ＧＴＣＴＧＣＣ−３'（配列番号：５）が、ＣＤ４０の
イニシエーターメチオニンから上流にＳａｌＩ部位を導
入し、下流のオリゴヌクレオチドプライマー ５'−ＣＣ
ＧＴＣＧＡＣＧＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＧ
Ｇ−３'（配列番号：６）は、ＣＤ４０のアミノ酸１９
２の後ろに終結コドンを挿入し、そのあとにＸｂａ１及
びＳａｌＩ部位が続く。増幅したｃＤＮＡをＳａｌＩで
消化し、ｐＤＣ４０６（マクマハン(McMahan) ら, EMBO
J. 10:2821, 1991）にクローン化してｐＤＣ４０６／
ｓＣＤ４０を構築した。
【００５０】第２のＣＤ４０レセプター断片（配列番
号：４）を、ヒトＩｇＧ１（配列番号：３）のＦｃドメ
インへの融合用にＰＣＲ法により得た。簡単に説明する
と、上流のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：
５）及び融合鋳型（配列番号：４）は前と同じであっ
た。下流のオリゴヌクレオチドプライマーは、ＣＤ４０
のアミノ酸１９３の後ろにアミノ酸Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌ
ｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ（配列番号：８）を挿入する５'−Ａ
ＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＡＣＧＴＡＴＣＴＣＡ
ＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＣ−３'（配列番号：
７）であった。Ｇｌｕ及びＰｒｏは、ヒトＩｇＧ１の蝶
番部の最初の２つのアミノ酸であり、そのあとにＢgl I
I 制限部位が続く。該Ｂgl II 制限部位は、ＣＤ４０の
細胞外ドメインをヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の残りに融合す
るのに用いた。
【００５１】他のレセプターからのリガンド結合ドメイ
ンを含む他の融合タンパク質は、レセプターのリガンド
結合ドメインのＤＮＡ配列を得て、プロテインＡ若しく
はプロテインＧ、又はアフィニティ精製のできる他のポ
リペプチド、例えば、アビジン又はストレプトアビジン
に結合する抗体分子のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列
にこの配列を融合させることによって作ることができ
る。得られる遺伝子構築体を哺乳動物細胞の中に導入し
て、融合タンパク質の一過性発現を行うことができる。
レセプター／Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡ又は
プロテインＧアフィニティ精製により精製することがで
きる。レセプター／アビジン融合タンパク質は、ビオチ
ンアフィニティクロマトグラフィーにより精製すること
ができる。その後、高濃度の塩溶液又は他の適当な緩衝
液で溶出することによって、該融合タンパク質をカラム
から分離することができる。
【００５２】本発明者らは、ヒトの細胞からのｃＤＮＡ
を鋳型として用い、上流のオリゴヌクレオチドプライマ
ー ５'−ＴＡＴＴＡＡＴＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＧＧＣＣ
ＣＡＧＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３'
（配列番号：９）及び下流のオリゴヌクレオチドプライ
マー ５'−ＧＣＣＡＧＣＴＴＡＡＣＴＡＧＴＴＣＡＴＴ
ＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡ−３'（配列番
号：１０）を用いるＰＣＲ増幅法により、ヒトＩｇＧ１
Ｆｃ領域をコードするｃＤＮＡを得た。該ＰＣＲ増幅ｃ
ＤＮＡは、蝶番部の開始部位の近くにＢgl II を導入し
た。これは、ＣＤ４０の細胞外ドメインを連結してｓＣ
Ｄ４０／Ｆｃ融合ｃＤＮＡを構築するのに用い、この融
合ｃＤＮＡは、ｐＤＣ４０６内に連結してｐＤＣ４０６
／ＣＤ４０／Ｆｃを構築した。他の適するＦｃ領域は、
高い親和性でプロテインＡ又はプロテインＧと結合でき
るあらゆる領域として定義され、ヒトＩｇＧ１又はマウ
スＩｇＧ１のＦｃ領域が含まれる。１つの例は、配列番
号：３に示したヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域又はヒトｃＤＮＡ
を鋳型として配列番号：９及び配列番号：１０からのオ
リゴヌクレオチドプライマーからのＰＣＲにより得られ
るｃＤＮＡである。
【００５３】レセプター／Ｆｃ融合分子は、好ましく
は、組換え哺乳動物細胞の培養で合成される。というの
は、それらは原核細胞発現法により合成するには一般に
あまりに大きくかつ複雑過ぎるからである。レセプター
／Ｆｃ融合タンパク質の発現に適する哺乳動物細胞の例
には、ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）及びＣＯ
Ｓ−７細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１）が含まれ、両
方共サルの腎臓由来のものである。
【００５４】ＤＮＡ構築体ｐＤＣ４０６／ＣＤ４０／Ｆ
ｃをサル腎臓細胞系ＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ１０４７８）内に形質移入した。ｐＤＣ４０６プラ
スミドは、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ
Ｖ）、及びエプスタイン・バー・ウィルス（ＥＢＶ）由
来の調節配列を含む。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞系は、エ
プスタイン・バー・ウィルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−
１）をコードし、ヒトＣＭＶ即時−初期 (immediate-ea
rly) エンハンサー／プロモーター由来のＥＢＮＡ−１
を構成的に発現する遺伝子でＣＶ−１細胞系を形質移入
することにより得られた。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ｐＤ
Ｃ４０６の如きＥＢＶ複製起点を含有する発現ベクター
のエピソーム複製を可能にする。
【００５５】ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を発現する
形質移入体は、初めに、ドットブロット法又はウェスタ
ンブロット法を用いて同定される。次いで、上澄み液を
ドットブロット又はゲル電気泳動に付してから、Ｇ２８
−５ｍＡｂ（ヒトＣＤ４０レセプターに結合する抗体）
と結合させるために該電気泳動したタンパク質を移す。
次いで、ブロットしたタンパク質を放射標識125Ｉ−プ
ロテインＡと共にインキュベートし、洗浄して未結合標
識を除き、そしてＦｃの発現について検査した。モノク
ローナル抗体Ｇ２８−５は、クラーク (Clark) らの前
記文献に従って作った。
【００５６】該融合構築体を発現する細胞を同定したの
で、形質移入細胞の大規模培養を行って、ＣＤ４０／Ｆ
ｃを発現する細胞からの上澄み液を蓄積した。上澄み液
中のＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質をアフィニティ精製
により精製した。簡単に説明すると、哺乳動物細胞上澄
み液を（例えば、0.４５μフィルターで）濾過し、濾液
をプロテインＡ／Ｇ抗体アフィニティカラム（シュライ
ハー (Schleicher) 及びシュエル (Schuell), キーン
(Keene), ＮＨ）に４℃で1.５ｃｍ×１2.０ｃｍカラム
について８０ｍｌ／ｈの流速で適用することによって、
ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を含有する１リッターの
培養上澄み液を精製した。フリーのタンパク質が洗浄緩
衝液中に検出されなくなるまで、カラムをＰＢＳ中の0.
５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。最後に、ＰＢＳでカラムを
洗浄した。結合した融合タンパク質をｐＨ2.８の２５ｍ
Ｍクエン酸緩衝液でカラムから溶出させ、ｐＨ9.１の５
００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液でｐＨ７にした。該溶出し
たＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の銀染色ＳＤＳゲルに
より、＞９８％純度であることが分かった。
【００５７】ここに記載したようにして、可溶性ＣＤ４
０（ｓＣＤ４０）及びＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を
作った。形質移入ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞により発現さ
れたｓＣＤ４０をアフィニティ精製するために、該上澄
み液をＧ２８−５（抗ＣＤ４０ｍＡｂ）アフィニティカ
ラムに通して精製した。タンパク質含有画分をプール
し、Ｇ２８−５結合測定及び還元剤として１ｍＭジチオ
スレイトールの存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ナトリウ
ムドデシルサルフェート・ポリアクリルアミドゲル電気
泳動）による分析のためにアリコートを取った。分子量
２8,１００ダルトンの１本のバンドが見られた。還元剤
なしでは、ｓＣＤ４０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は２本の
バンドを示し、大きいバンドの分子量は５6,０００であ
り、小さい方のバンドの分子量は２8,０００であった。
該バンディングパターンは、ｓＣＤ４０の大部分は溶液
中でジスルフィド結合ホモダイマーとして存在すること
を示している。２8,０００のバンドはフリーのモノマー
である。
【００５８】銀染色によりＣＤ４０タンパク質を可視化
した。サンプルタンパク質濃度は、超純粋ウシ血清アル
ブミンをスタンダードとするマイクロＢＣＡ測定法（ピ
アス(Pierce)）を用いて測定した。可溶性ＣＤ４０純度
及びタンパク質濃度は、アミノ酸分析により確認した。
精製した可溶性ＣＤ４０をＰＶＤＦペーパーに吸収さ
せ、アプライド・バイオシステムズ・モデル４７７Ａタ
ンパク質配列分析装置で、Ｎ−末端タンパク質配列分析
についてのメーカーの説明書に従って、該ペーパーを自
動エドマン分解に付した。この操作は、ｓＣＤ４０のタ
ンパク質配列を点検した。
【００５９】可溶性ＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃ融合タ
ンパク質は、抗ＣＤ４０ｍＡｂ（Ｇ２８−５）の不存在
下でヒトＢ細胞応答を調節することができた。精製した
扁桃腺Ｂ細胞を抗ＩｇＭ及びヒトＩＬ−４と一緒に培養
して、ｓＣＤ４０又はＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の
いずれかを添加した。どの型のＣＤ４０も、（トリチウ
ム標識チミジン取り込みにより測定して）Ｂ細胞増殖へ
の阻害作用を有さなかった。対照的に、ＩＬ−４レセプ
ターは、濃度に依存して、ＩＬ−４誘導Ｂ細胞増殖を阻
害した。
【００６０】２ドナーＭＬＣ（混合リンパ球培養）系で
ＩＬ−４誘導ＩｇＥ分泌を阻害する能力について可溶性
ＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃを試験した。３実験におい
て、ＣＤ４０の濃度が増加するにつれて、ＩｇＥ産生の
レベルが減少した。１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した可
溶性ＣＤ４０は、アレルギーのこのモデルにおけるＩｇ
Ｅ分泌を完全に阻害することができた。更に、ＣＤ４０
／Ｆｃもその可溶性等価物と類似の作用を有した。しか
しながら、ＩＬ−７レセプター・Ｆｃ融合タンパク質
（公表されたＩＬ−７レセプター配列で類似の操作によ
り作った）の添加は、このモデルにおけるＩｇＥの分泌
に影響を及ぼさなかった。
【００６１】ＣＤ２３のレベルもｓＣＤ４０又はＣＤ４
０／Ｆｃ融合タンパク質に対応して同じＭＬＣで測定し
た。可溶性ＣＤ４０は、ＩＬ−４単独で刺激した培養物
に比較して、６日目で小さいが再現性よくｓＣＤ２３レ
ベルを低下させたが、１２日目に同じ培養物においてよ
り強い阻害作用を示した。ＩＬ−４刺激Ｔ除去ＰＢＭ
（末梢血マクロファージ）Ｅ- 細胞による可溶性ＣＤ２
３の誘発もｓＣＤ４０の添加により同じく影響を受け、
６日目でｓＣＤ２３レベルが小さく低下し、１２日目で
より著しい阻害作用を示した。各培養系において、ＣＤ
４０／Ｆｃ融合タンパク質での結果は、ｓＣＤ４０での
結果と実質的に同じであった。
【００６２】ＣＤ４０−ＬのｃＤＮＡを単離するため
に、市販の固相剤（ＩＯＤＯ−ＧＥＮ，ピアス）を用い
て、精製したＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を125Ｉで
放射標識した。この操作において、５μｇのＩＯＤＯ−
ＧＥＮを１０×７５ｍｍガラス試験管の底にプレート
し、７５μｌの0.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ7.４）及
び２０μｌ（２ｍＣｉ）Ｎａ125Ｉと共に４℃で２０分
間インキュベートした。次いで、４５μｌＰＢＳ（リン
酸塩緩衝液）中に５μｇのＣＤ４０／Ｆｃを含有する第
２ガラス試験管に該溶液を移して、この反応混合液を４
℃で２０分間インキュベートした。２ｍｌ充填容量のセ
ファデックス（登録商標）Ｇ−２５（シグマ）でゲル濾
過することによってこの反応混合物を分画してから、2.
５％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、0.２％
（ｖ／ｖ）ナトリウムアジド及びｐＨ7.４の２０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ結合培地を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中
で平衡化した。最終プールの125ＩＣＤ４０／Ｆｃを結
合培地中１×１０-7Ｍの作業ストック溶液に希釈して、
レセプター結合活性の検出し得る損失なしに４℃で１ヵ
月まで貯蔵した。
【００６３】ビオチニル化ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク
質の結合に基づいて、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分離）
により選別したＥＬ−４細胞系からｃＤＮＡライブラリ
ーを調製した。選別したＥＬ−４細胞によるＣＤ４０の
リガンドの発現に基づく蛍光強度の有意な変化があるま
で、細胞を５回選別した。該５回選別細胞をＥＬ−４0.
５細胞と呼び、ＥＬ−４0.５ｍＲＮＡからのｃＤＮＡラ
イブラリーを作成するためにこれら細胞を培養した。簡
単に説明すると、ｃＤＮＡを合成し、空のｐＤＣ４０６
ベクターの中に挿入して大腸菌に中に形質転換した。形
質転換体をプールし、該プールからのＤＮＡを単離し、
ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の中に形質移入して発現クローニ
ングライブラリーを作成した。形質移入ＣＶ１−ＥＢＮ
Ａ細胞をスライド上で３日間培養してＣＤ４０−Ｌを一
過性発現させた。次いで、該形質移入細胞を含有するス
ライドを放射標識ＣＤ４０／Ｆｃと一緒にインキュベー
トし、洗浄して未結合ＣＤ４０／Ｆｃを除き、そしてグ
ルタルアルデヒドで定着した。該定着スライドを液状写
真乳剤に漬けて暗所で露光した。該スライドを現像した
後、顕微鏡でそれらを別々に検査して、明るいバックグ
ランドに対するオートラジオグラフの銀粒子の存在によ
りＣＤ４０−Ｌを発現する細胞を同定した。
【００６４】ＥＬ−４0.５細胞からの発現クローニング
ライブラリーをスクリーニングし、約２０００の別々の
クローンを含有する１つのプールを、125Ｉ標識ＣＤ４
０／Ｆｃ融合タンパク質との結合について陽性であると
同定した。このプールを約２００コロニーのより小さな
プールに分割した。該小さなプールを上記のようにして
スクリーニングした。該小さなプールのうちの１つがＣ
Ｄ４０−Ｌについて陽性であった。
【００６５】１つのクローンを単離して標準法により配
列決定し、図１及び配列番号：１に示したマウスＣＤ４
０−ＬのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を得た。
【００６６】ヒト同族ＣＤ４０−ＬｃＤＮＡを種間交叉
ハイブリダイゼーション法により見出した。簡単に説明
すると、ＣＤ３（１０ｎｇ／ｍｌ）及びインターロイキ
ン−２（ＩＬ−２，１０ｎｇ／ｍｌ）に結合するＯＫＴ
３抗体（ＡＴＣＣ，ロックビル，ＭＤ）で６日間処理し
た末梢血リンパ球から、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）
ｃＤＮＡライブラリーを作った。該ＰＢＬ細胞を洗浄
し、次いで１０ｎｇ／ｍｌＰＭＡ（フォルボールミリス
テートアセテート，シグマ，セントルイス）及び５００
ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（カルバイオケム (Calbioch
em)）で４時間刺激した。刺激したＰＢＬ細胞からｍＲ
ＮＡを単離し、ｃＤＮＡを生成させてｃＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩリンカーに連結した。連結したｃＤＮＡを、メーカ
ーの説明書に従って、λｇｔ１０ファージクローニング
ビヒクル（ギガパック（登録商標）ストラタジーン，サ
ンディエゴ，ＣＡ）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。ファ
ージを増幅し、１５ｃｍプレート当たり約２0,０００フ
ァージの密度でプレートして、マニアチス (Maniatis)
ら, Molecular Biology: A Laboratory Manual, ColdSp
ring Harbor Laboratory, NY, 1982, pp.316-328 に記
載されているようにして、ファージリフトを行った。配
列番号：１及び図１のヌクレオチド１３からヌクレオチ
ド７９３までのマウスＣＤ４０−Ｌのコーティング領域
に対応するマウスプローブを構築した。このプローブ
は、温和または苛酷なストリンジェント条件で、ＰＢＬ
ライブラリーファージリフトとハイブリダイズした。簡
単に説明すると、ハイブリダイゼーション条件は、６×
ＳＳＣ、１×デンハルツ溶液、２ｍＭ ＥＤＴＡ、0.５
％Ｎｐ４０（ノニデットＰ−４０洗浄剤）で６３℃で一
晩行うものであった。これに続いて、３×ＳＳＣ、0.１
％ＳＤＳ中、５５℃で３時間洗浄し、Ｘ線フィルムに一
晩露光した。１０００プラーク当たり約１プラークの頻
度で陽性プラークを同定した。陽性プラークを２回精製
して増幅した培養物からｃＤＮＡを調製した。
【００６７】ここに開示したマウス又はヒトＣＤ４０−
ＬｃＤＮＡ配列は、種間交叉ハイブリダイゼーション法
によりマウス又はヒトＣＤ４０−Ｌの他の哺乳動物同族
体をコードするｃＤＮＡを得るために用いることができ
る。簡単に説明すると、図１（配列番号：１）に記載し
たマウスＣＤ４０−Ｌ又は図２（配列番号：１１）に記
載したヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外領域のヌクレオチド配
列からオリゴヌクレオチドプローブを作成する。このプ
ローブは、マニアチスらの前記文献に記載されたものの
如き標準法によって作ることができる。マウス又はヒト
プローブを用いて、温和なストリンジェント条件で、哺
乳動物ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックライブラリ
ーをスクリーニングする。哺乳動物ｃＤＮＡライブラリ
ー又はゲノミックライブラリーの例には、ｃＤＮＡにつ
いて、哺乳動物の末梢血リンパ球から作られるライブラ
リーが含まれる。また、種々の細胞系から単離した種々
のｃＤＮＡライブラリー又はｍＲＮＡをノーザンハイブ
リダイゼーションによりスクリーニングして、哺乳動物
ＣＤ４０−Ｌ ＤＮＡ又はｍＲＮＡの適当な供給源を確
認することができる。
【００６８】組換えＤＮＡ法によるＣＤ４０−Ｌの発現
のための組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウ
ィルス、又は昆虫遺伝子由来のものの如き適当な転写又
は翻訳調節ヌクレオチド配列に機能できるように連結さ
れた、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドをコードする合成又は
ｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を含むＣＤ４０−Ｌ ＤＮＡ
配列を含む。調節配列の例には、遺伝子発現において調
節の役割を有する配列（例えば、転写プロモーター又は
エンハンサー）、任意要素である転写を制御するための
オペレーター配列、ｍＲＮＡリボソーム結合部位をコー
ドする配列、及び転写及び翻訳の開始及び終結を制御す
る適当な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配
列がＣＤ４０−Ｌ ＤＮＡ配列に機能的に関係する場合
は、機能できるように連結される。かくして、プロモー
ターヌクレオチド配列がＣＤ４０−Ｌ ＤＮＡ配列の転
写を制御する場合は、該プロモーターヌクレオチド配列
はＣＤ４０−Ｌ ＤＮＡ配列に機能できるように連結さ
れる。更に、リボソーム結合部位がベクター内で翻訳を
促進する位置にある場合は、該リボソーム結合部位はＣ
Ｄ４０−Ｌポリペプチドのための配列に機能できるよう
に連結しているといえる。加えて、シグナルペプチドを
コードする配列を発現ベクターの中に組み込むことがで
きる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のた
めのＤＮＡ配列をＣＤ４０−Ｌ ＤＮＡ配列に機能でき
るように連結してもよい。該シグナルペプチドは、酵母
宿主細胞により翻訳される融合ポリペプチドの細胞外分
泌を向上させることができる前駆体アミノ酸配列として
発現される。
【００６９】ＣＤ４０−Ｌポリペプチドの発現に適する
宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が含ま
れる。原核細胞には、グラム陰性又はグラム陽性微生
物、例えば、大腸菌又は杆菌が含まれる。形質転換に適
する原核宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズ
ミチフス菌、並びにシュードモナス属、ストレプトミセ
ス属、及びブドウ球菌属に属するいろいろな他の種が含
まれる。高等真核細胞には哺乳動物器官の株化細胞系が
含まれる。ここに開示したＤＮＡ構築体由来のＲＮＡを
用い、無細胞翻訳系を用いてＣＤ４０−Ｌポリペプチド
を産生することもできるかも知れない。細菌、菌類、酵
母、及び哺乳動物細胞宿主で用いるのに適切なクローニ
ング及び発現ベクターは、例えば、パウエルスら、Clon
ing Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New Yo
rk, (1985) に記載されている。
【００７０】大腸菌の如き原核宿主細胞においては、Ｃ
Ｄ４０−Ｌポリペプチド又は類縁体は、該原核宿主細胞
内での該組換えポリペプチドの発現を促進するために、
Ｎ−末端メチオニン残基を含んでもよい。該Ｎ−末端Ｍ
ｅｔを、発現した組換えＣＤ４０−Ｌポリペプチドから
切断してもよい。原核宿主細胞は、広範囲なタンパク質
分解又はジスルフィドプロセシングが必要でないＣＤ４
０−Ｌポリペプチドの発現に用いることができる。
【００７１】組換えＣＤ４０−Ｌ ＤＮＡ配列を保持す
る発現ベクターを適した宿主微生物又は哺乳動物細胞系
の実質的に均質な培養液に形質移入又は形質転換する。
形質転換された宿主細胞は、ＣＤ４０−Ｌポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列で形質転換又は形質移入
された細胞で、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを発現する。
発現されたＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、宿主細胞の性
質及び該宿主細胞内の挿入された遺伝子構築体に依存し
て、該宿主細胞内と止まりかつ／又は培養上澄み液内に
分泌されるであろう。
【００７２】原核宿主細胞内に形質移入された発現ベク
ターは、一般に、１又は２以上の表現型選択可能マーカ
ー (phenotypic selectable markers) を含む。表現型
選択可能マーカーは、例えば、抗生物質耐性を与えるか
又は独立栄養要求性を満たすタンパク質をコードする遺
伝子、及び該宿主内での増幅を保証するために該宿主に
より認識される複製起点である。原核宿主細胞に有用な
他の発現ベクターは、市販のプラスミド由来の細菌起源
の選択可能マーカーを含む。この選択可能マーカーは、
クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１
７）の遺伝子要素を含むことができる。ｐＢＲ３２２は
アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子
を含有するので、形質転換細胞を同定する簡単な手段を
提供する。ｐＢＲ３２２“バックボーン”部分は、適当
なプロモーター及びＣＤ４０−ＬＤＮＡ配列と連結して
いる。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３
−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ，ウプサ
ラ，スウェーデン）及びｐＧＥＭ１（プロメガ・バイオ
テック，マジソン，ＷＩ，ＵＳＡ）が含まれる。
【００７３】プロモーター配列は、普通、組換え原核宿
主細胞発現ベクターに用いられる。普通のプロモーター
配列には、β−ラクタマーゼ（ペリシリナーゼ）、ラク
トースプロモーター系（チャン (Chang) ら, Nature 27
5:615, 1978；及びジョデル(Goeddel) ら, Nature 281:
544, 1979）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター
系（ジョデルら, Nucl. Acids Res. 8:4057, 1980；及
びＥＰ−Ａ−３６７７６）及びｔａｃプロモーター（マ
ニアチスら, Molecular Cloning: A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor Laboratory, p.412, 1982）が
含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージ
λＰL プロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプ
レッサー配列を用いる。該λＰL プロモーターの誘導体
が組み込まれているアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションから入手できるプラスミドベクターには、
プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３
７０９２）内のレジデント）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌
ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内のレジデント）が含ま
れる。
【００７４】ＣＤ４０−Ｌを酵母宿主細胞内で、好まし
くはサッカロミセス属（例えば、サッカロミセス・セレ
ビシエ）から発現してもよい。ピチア (Pchia) 属又は
クルイベロミセス (Kluyveromyces) 属の如き他の酵母
の属を用いてもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラス
ミドからの複製起点配列、autonomoosly replicatingse
quence （ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル
化のための配列、及び転写終結のための配列を含有する
ことが多いであろう。好ましくは、酵母ベクターは、複
製起点配列及び選択可能マーカーを含む。酵母ベクター
に適するプロモーター配列には、メタロチオネインのた
めのプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ
（ヒッツェマン (Hitzeman) ら, J. Biol. Chem. 255:2
073, 1980）又は他の解糖酵素（ヘス (Hess) ら, J. Ad
v. Enzyme Reg. 7:149, 1968；及びホーランド (Hollan
d) ら, Biochem. 17:4900, 1978）、例えば、エノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラー
ゼ、ホスホフルコトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ
ェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレ−トムター
ゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソ
メラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコ
キナーゼが含まれる。酵母発現に用いるのに適する他の
ベクター及びプロモーターは、ヒッツェマン，ＥＰ−Ａ
−７3,６５７に更に記載されている。
【００７５】大腸菌内での選択及び複製のために、例え
ば、ｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子及
び複製起点）を用いて酵母ベクターを組み立てることが
できる。酵母発現構築体内に含まれることができる他の
酵母ＤＮＡ配列には、グルコース抑制可能ＡＤＨ２プロ
モーター及びα−因子分泌リーダーが含まれる。該ＡＤ
Ｈ２プロモーターは、ラッセル (Russell) ら（J. Bio
l. Chem. 258:2674,1982）及びベイヤー (Beier) ら（N
ature 300:724, 1982）に記載されている。酵母α−因
子分泌リーダー配列は異種ポリペプチドの分泌を行う。
α−因子分泌リーダー配列は、プロモーター配列と構造
遺伝子配列の間に挿入されることが多い。例えば、カー
ヤン (Kurjan) ら, Cell 30:933, 1982 及びビター (Bi
tter)ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984
を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分
泌を促進するのに適する他のリーダー配列は、当業者に
知られている。リーダー配列の３'末端の近傍を修飾し
て１又は２以上の制限部位を含有させてもよい。これ
は、構造遺伝子へのリーダー配列の融合を促進するであ
ろう。
【００７６】酵母形質転換の手順は当業者に知られてい
る。かかる手順の１つは、ヒネン(Hinnen) らにより、P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978 に記載され
ている。ヒネンらの手順は、選択培地中でＴｒｐ+ 形質
転換体を選択しており、該選択培地は、0.６７％酵母窒
素原基礎培地、0.５％カザミノ酸、２％グルコース、１
０μｇ／ｍｌアデニン及び２０μｇ／ｍｌウラシルから
なる。
【００７７】ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベク
ターにより形質転換された酵母宿主細胞は、発現を誘発
するために“富 (rich)”培地内で成育させてもよい。
富培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニン及び８０μｇ／
ｍｌウラシルを補充した１％酵母エキス、２％ペプト
ン、及び１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ２
プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から使い
尽くされたときに起こる。
【００７８】哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて
組換えＣＤ４０−Ｌポリペプチドを発現することもでき
るかも知れない。適する哺乳動物宿主細胞系の例には、
サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５
１）（グルツマン (Gluzman)ら, Cell 23:175, 198
1）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣ
ＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞、ヒーラー細胞、及びＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１
０）細胞系が含まれる。適する哺乳動物発現ベクター
は、複製起点、プロモーター配列、構造遺伝子に連結し
たエンハンサー、リボソーム結合部位の如き他の５'又
は３’フランキング非転写配列、ポリアデニル化部位、
スプライス供与体及び受容体部位、及び転写終結配列等
の非転写 (nontranscribed) 要素を含む。
【００７９】哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転
写及び翻訳制御配列をウィルスゲノムから切り取っても
よい。例えば、普通に用いられる哺乳動物細胞プロモー
ター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウィル
ス、アデノウィルス２、シミアンウィルス４０（ＳＶ４
０）、及びヒトサイトメガロウィルスから誘導される。
ＳＶ４０ウィルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、Ｓ
Ｖ４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサ
ー、スプライス、及びポリアデニル化部位を用いて、哺
乳動物宿主細胞内の構造遺伝子配列の発現に必要な他の
遺伝子要素を供給してもよい。ウィルス初期及び後期プ
ロモーターは、その両方がウィルス複製起点も含有する
ことができる断片としてウィルスゲノムから容易に得ら
れるので、特に有用である（ファイアス (Fiers) ら, N
ature 273:113, 1978）。ＳＶ４０ウィルス複製起点部
位内に位置するＨｉｎｄIII 部位からＢglＩ部位に及ぶ
約２５０ｂｐ配列が含まれていることを条件として、よ
り小さい又はより大きなＳＶ４０断片も用いることがで
きる。
【００８０】代表的な哺乳動物発現ベクターは、オカヤ
マ (Okayama) 及びバーグ (Berg)（Mol. Cell. Biol.
3:280, 1983）により開示されているようにして構築す
ることができる。コスマン (Cosman) らにより Nature
312:768, 1984 に記載された有用な高発現ベクター、つ
まりＰＭＬＳＶ Ｎ１／Ｎ４をＡＴＣＣ３９８９０とし
て寄託した。追加の有用な哺乳動物発現ベクターは、Ｅ
Ｐ−Ａ−０３６７５６６及び１９９１年５月１６日に出
願された米国特許出願第０７／７０1,４１５号に記載さ
れている。これらは、参照によりここに組み入れられる
ものとする。ＣＤ４０−Ｌの如きタイプIIタンパク質細
胞外領域の発現のためには、米国特許第4,９６5,１９５
号に記載されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）につ
いてのシグナル配列、又は１９８４年７月２日に出願さ
れた米国特許出願第０６／６２６,６６７号に記載され
たインターロイキン−２レセプターについてのシグナル
配列の如き異種のシグナル配列を加えるべきである。
【００８１】ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌは、細胞内及
び膜貫通領域が含まれている場合には膜結合型で、又細
胞外領域だけの場合は可溶型で作ることができる。本発
明者らは、膜結合マウスＣＤ４０−Ｌを発現する細胞を
産するために、哺乳動物細胞内で完全長マウスＣＤ４０
−Ｌを発現させた。本明細書中の実施例６に記載した方
法を用いて、ＨＡＶＥＯベクター内の図１（配列番号：
１）に示したｃＤＮＡで又はＨＡＶＥＯ空ベクターでＣ
Ｖ−１細胞を形質移入した。これは、膜結合マウスＣＤ
４０−Ｌを発現する形質移入ＣＶ−１細胞を産した。こ
れら細胞を、以下の実施例１０〜１３に報告した一連の
実験用に、膜結合マウスＣＤ４０−Ｌの供給源として用
いた。
【００８２】組換えＣＤ４０−Ｌポリペプチドの精製 ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、ＣＤ４０−Ｌポリペプチ
ドを発現するのに必要な培養条件下で、形質転換した宿
主細胞を培養することによって調製することができる。
次いで、生成した発現ポリペプチドを培養培地又は細胞
抽出物から精製することができる。所望により、市販の
タンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン (Amico
n) 又はミリポア・ペリコン (Millipore Pellicon) 超
濾過装置を用いて、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを濃縮し
てもよい。濃縮工程後、ゲル濾過媒質の如き精製マトリ
ックスに適用することができる。また、例えば、ペンダ
ントのジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマ
トリックス又は支持体、等のアニオン交換樹脂を使用す
ることができる。該マトリックスは、アクリルアミド、
アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質
精製に普通に用いられる他のタイプであってもよい。ま
た、カチオン交換工程を採用してもよい。適するカチオ
ン交換体には、スルホプロピル又はカルボキシメチル基
を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプ
ロピル基が好ましい。
【００８３】最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質（例え
ば、ペンダントのメチル又は他の脂肪族基を有するシリ
カゲル）を用いる１又は２以上の逆相高速液体クロマト
グラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を採用して、ＣＤ４
０−Ｌを更に精製することができる。実質的に均質な組
換えタンパク質を得るために、前述の幾つか又は全ての
精製工程を組み合わせて採用することもできる。
【００８４】ＣＤ４０リガンド結合ドメインを含むアフ
ィニティカラムを利用して、発現したＣＤ４０−Ｌポリ
ペプチドをアフィニティ精製することも可能である。Ｃ
Ｄ４０−Ｌポリペプチドは、高い塩濃度の溶出用緩衝液
でアフィニティカラムから分離することができ、次い
で、使用するために低い塩濃度の緩衝液で透析すること
ができる。
【００８５】細菌培養で産生した組換えタンパク質は、
通常、最初に宿主細胞を崩壊させ、遠心分離し、不溶性
ポリペプチドの場合には細胞ペレットから抽出し、可溶
性ポリペプチドの場合には上澄み液から抽出した後、１
又は２以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティ精
製又はサイズ排除クロマトグラフィー工程を行うことに
よって単離される。最後に、最終精製工程のためにＲＰ
−ＨＰＬＣを採用してもよい。微生物細胞は、凍結融解
の繰り返し、音波破砕、機械的崩壊、又は細胞溶解剤を
用いる方法を含む、あらゆる慣用的方法によって崩壊す
ることができる。
【００８６】形質転換酵母宿主細胞は、好ましくはＣＤ
４０−Ｌをポリペプチド分泌物として発現させるために
用いる。これは精製を簡単にする。酵母宿主細胞醗酵か
ら分泌された組換えポリペプチドは、ウルダル (Urdal)
ら（J. Chromatog. 296:171, 1984）により開示された
方法と類似の方法により精製することができる。ウルダ
ルらは、分取ＨＰＬＣカラムでの組換えヒトＩＬ−２の
精製に、２つの逐次 (sequential) 逆相ＨＰＬＣ工程を
記載している。
【００８７】ＣＤ４０−Ｌ組成物の投与 本発明は、適当な希釈剤又は製剤上の担体中に有効量の
ＣＤ４０−Ｌを含む治療用組成物及び該組成物を用いて
哺乳動物を治療する方法を提供する。治療用途には、症
状に適する方法で治療するために、精製したＣＤ４０−
Ｌ又は生物学的に活性なその類縁体を、患者に、好まし
くはヒトに投与する。かくして、例えば、目的の治療効
果を得るために投与される（例えば、可溶性細胞外ドメ
イン又はその断片の形の）ＣＤ４０−Ｌ医薬組成物を、
濃縮塊注射、継続的点滴、徐放型移植、又は他の適当な
方法によって与えることができる。典型的には、ＣＤ４
０−Ｌ治療剤は、生理学的に許容できる製剤上の担体、
補助剤又は希釈剤と混合した精製ＣＤ４０−Ｌポリペプ
チドを含む医薬組成物の形で投与されよう。かかる担体
は、採用する投与量及び濃度で患者に対して非毒性であ
ろう。通常は、かかる組成物の製剤は、ＣＤ４０−Ｌポ
リペプチドを、緩衝剤；アスコルビン酸の如き酸化防止
剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパ
ク質；アミノ酸；グルコース、スクロース又はデキスト
ランを含む炭水化物；ＥＤＴＡの如きキレート剤；グル
タチオン及び他の安定剤及び補助剤と混合することを伴
う。中性緩衝食塩水又は同種の血清アルブミンと混合し
た食塩水は、非常に適した希釈剤である。ＣＤ４０−Ｌ
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、コード
する核酸配列及び有効なセンス又はアンチセンスオリゴ
ヌクレオチドを含有する有効量のベクターを投与するこ
とによって in vivo で投与してもよい。更に、ＣＤ４
０−Ｌ ＤＮＡ又はｍＲＮＡを含有する細胞を個体から
取り、遺伝子移入技術を用いて該細胞内にアンチセンス
又はセンスオリゴヌクレオチドを組み込み、そして該細
胞を該個体内に再注入することにより、ＣＤ４０−Ｌセ
ンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを ex vivo
で投与してもよい。
【００８８】以下の実施例は特定の態様を説明しするこ
とを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図
するものではない。
【００８９】
【実施例】実施例１ この実施例は、ＣＤ４０リガンドをコードするｃＤＮＡ
クローンの検出に用いる可溶性ＣＤ４０−Ｌ／Ｆｃ融合
タンパク質を発現するＣＤ４０−Ｌ／ＦｃＤＮＡ構築体
の構築を説明するものである。ポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）法を用い、スタメンコビックらの前記文献に
公表された配列に基づいて、完全ＣＤ４０ヒトレセプタ
ー配列の細胞外領域又はリガンド結合ドメインのｃＤＮ
Ａ配列を得た。ＣＤ４０プラスミド（ＣＤＭ８）をＰＣ
Ｒ増幅の鋳型として用いた。ＣＤＭ８は、スタメンコビ
ックらの文献に記載されており該著者から得たものであ
る。５'（上流）及び３'（下流）オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いるＰＣＲ法（サルキ (Sarki) ら, Scien
ce 239:487, 1988）を用いて、ＣＤ４０細胞外リガンド
結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を増幅した。上流
のオリゴヌクレオチドプライマー ５'−ＣＣＧＴＣＧＡ
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＧＴＣＴＧＣＣ−３'（配列
番号：５）は、ＣＤ４０のイニシエーターメチオニンか
ら上流にＳａｌＩ部位を導入し、下流のオリゴヌクレオ
チドプライマー ５'−ＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣ
ＴＡＣＧＴＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡ
Ｃ−３'（配列番号：７）は、ＣＤ４０のアミノ酸１９
３の後ろにアミノ酸Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｒ
ｇ（配列番号：８）を挿入する。Ｇｌｕ及びＰｒｏは、
ヒトＩｇＧ１の蝶番部の最初の２つのアミノ酸であり、
そのあとにＢgl II 制限部位が続く。該Ｂgl II 制限部
位は、ＣＤ４０の細胞外ドメインをヒトＩｇＧ１Ｆｃ領
域の残りに融合するのに用いた。
【００９０】ＤＮＡ構築体ｐＤＣ４０６／ＣＤ４０／Ｆ
ｃをサル腎臓細胞系ＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ１０４７８）内に形質移入した。ｐＤＣ４０６プラ
スミドは、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ
Ｖ）、及びエプスタイン・バー・ウィルス（ＥＢＶ）由
来の調節配列を含む。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞系は、エ
プスタイン・バー・ウィルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−
１）をコードし、ヒトＣＭＶ即時−初期 (immediate-ea
rly) エンハンサー／プロモーター由来のＥＢＮＡ−１
を構成的に発現する遺伝子でＣＶ−１細胞系を形質移入
することにより得られた。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ｐＤ
Ｃ４０６の如きＥＢＶ複製起点を含有する発現ベクター
のエピソーム複製を可能にする。
【００９１】該融合構築体を発現する細胞を同定したの
で、形質移入細胞の大規模培養を行って、ＣＤ４０／Ｆ
ｃを発現する細胞からの上澄み液を蓄積した。上澄み液
中のＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質をアフィニティ精製
により精製した。簡単に説明すると、哺乳動物細胞上澄
み液を（例えば、0.４５μフィルターで）濾過し、濾液
をプロテインＡ／Ｇ抗体アフィニティカラム（シュライ
ハー (Schleicher) 及びシュエル (Schuell), キーン
(Keene), ＮＨ）に４℃で1.５ｃｍ×１2.０ｃｍカラム
について８０ｍｌ／ｈの流速で適用することによって、
ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を含有する１リッターの
培養上澄み液を精製した。フリーのタンパク質が洗浄緩
衝液中に検出されなくなるまで、カラムをＰＢＳ（リン
酸塩緩衝液）中の０.５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。最後
に、ＰＢＳでカラムを洗浄した。結合した融合タンパク
質をｐＨ2.８の２５ｍＭクエン酸緩衝液でカラムから溶
出させ、ｐＨ9.１の５００ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液でｐ
Ｈ７にした。該溶出したＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質
の銀染色ＳＤＳゲルにより、＞９８％純度であることが
分かった。
【００９２】市販の固相剤（ＩＯＤＯ−ＧＥＮ，ピア
ス）を用いて、精製したＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質
を125Ｉでヨウ素化した。この操作において、５μｇの
ＩＯＤＯ−ＧＥＮを１０×７５ｍｍガラス試験管の底に
プレートし、７５μｌの0.１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ
7.４）及び２０μｌ（２ｍＣｉ）Ｎａ125Ｉと共に４℃
で２０分間インキュベートした。次いで、４５μｌＰＢ
Ｓ中に５μｇのＣＤ４０／Ｆｃを含有する第２ガラス管
に該溶液を移して、この反応混合液を４℃で２０分間イ
ンキュベートした。２ｍｌ充填容量のセファデックス
（登録商標）Ｇ−２５（シグマ）でゲル濾過することに
よってこの反応混合物を分画してから、2.５％（ｖ／
ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、0.２％（ｖ／ｖ）
ナトリウムアジド及びｐＨ7.４の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
結合培地を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で平衡化し
た。最終プールの125ＩＣＤ４０／Ｆｃを結合培地中１
×１０-7Ｍの作業ストック溶液に希釈して、レセプター
結合活性の検出し得る損失なしに４℃で１ヵ月まで貯蔵
した。
【００９３】約５０〜６０％の標識取り込みが認められ
た。放射性ヨウ素化は、１×１０15〜５×１０15ｃｐｍ
／nmolの範囲の比活性をもたらした（タンパク質の分子
当たり放射性ヨウ素原子0.４２〜2.０）。ＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によ
り、予想値と一致する単一の標識ポリペプチドの存在が
明らかとなった。該標識融合タンパク質は、９８％トリ
クロロ酢酸（ＴＣＡ）より大きい沈澱性であった。これ
は、125Ｉが該タンパク質に共有結合したことを示して
いる。
【００９４】実施例２ この実施例は、ＣＤ４０−Ｌを発現すると推定される細
胞系の選択を説明するものである。実施例１に記載した
放射標識ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を用いて幾つか
の細胞系をスクリーニングした。簡単に説明すると、標
準法に従って定量的な結合性研究を行い、種々の細胞系
についてスキャッチャードプロットを得た。クローン細
胞系（ＥＬ−４，ＡＴＣＣカタログＴＩＰ３９）マウス
胸腺腫細胞系を同定して選別した。選別に先立って、Ｅ
Ｌ−４細胞が細胞当たり約４５０分子のＣＤ４０−Ｌを
発現することを見出した。７回選別細胞をＥＬ−４0.７
と呼び、これを成育させると細胞当たり約１0,０００分
子のＣＤ４０−Ｌを発現することが見出された。最後
に、９回選別細胞をＥＬ−４0.９と呼び、これを成育さ
せると細胞当たり約１5,０００分子のＣＤ４０−Ｌを発
現することを見出された。
【００９５】実施例３ この実施例は、マウスＣＤ４０−Ｌの発現クローニング
のためのｃＤＮＡライブラリーの調製を説明するもので
ある。該ライブラリーは、ＥＬ−４0.５と呼ぶマウス胸
腺腫細胞系ＥＬ−４（ＡＴＣＣ ＴＩＰ３９）の５回選
別クローンから調製した。ＥＬ−４0.５細胞は、ＦＡＣ
Ｓ（蛍光活性化セルソーター）中、ビオチニル化ＣＤ４
０／Ｆｃ融合タンパク質で５回選別したＥＬ−４細胞で
あった。米国特許第4,９６8,６０７号に本質的に記載さ
れたＥＬ−４0.５から得たＲＮＡからｃＤＮＡライブラ
リーを作った。なお、この開示内容は参照によりここに
組み入れられるものとする。簡単に説明すると、ＥＬ−
４0.５細胞系から抽出したトータルＲＮＡから単離した
ポリ（Ａ）+ ｍＲＮＡの逆転写によりｃＤＮＡライブラ
リーを構築した。該ライブラリー構築法は、オウスベル
(Ausubel) ら編,Current Protocols In Molecular Bio
logy, Vol.1, (1987) に記載された方法と実質的に同じ
であった。ポリ（Ａ）+ ｍＲＮＡは、オリゴｄＴセルロ
ースクロマトグラフィーにより単離し、二本鎖ｃＤＮＡ
は、実質的にガブラー (Gubler) ら,Gene 25:263, 1983
に記載された通りに作った。ポリ（Ａ）+ ｍＲＮＡ断
片を、ランダムヘキサヌクレオチドをプライマーに用い
て逆転写酵素によりＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドに転
化した。次いで、ＲＮアーゼＨをＤＮＡポリメラーゼＩ
と組み合わせて用いて、該ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッ
ドを二本鎖ｃＤＮＡ断片に転化した。生成した二本鎖ｃ
ＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンド型に
した。
【００９６】 ＳａｌＩアダプター ５'−ＴＣＧ ＡＣＴ ＧＧＡ ＡＣＧ ＡＧＡ ＣＧＡ ＣＣＴ ＧＣＴ−３' ＧＡ ＣＣＴ ＴＧＣ ＴＣＴ ＧＣＴ ＧＧＡ ＣＧＡ−５' を、ヘイマーレ (Haymerle) ら, Nucleic Acids Res. 1
4:8615, 1986 に記載されているようにして、生成した
ブラントエンド型ｃＤＮＡの５'末端に連結した。６８
℃でのゲル濾過クロマトグラフィーにより未連結アダプ
ターを除いた。これは、２４ヌクレオチド非自己相補的
(non-self-complementary) オーバーハングをｃＤＮＡ
上に残した。同じ操作を用いて、哺乳動物発現ベクター
ｐＤＣ４０６の５'ＳａｌＩ末端を、ｃＤＮＡに付加し
たものと相補的な２４ヌクレオチドオーバーハングに転
化した。アダプター化ベクターとｃＤＮＡの最適割合を
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下で連結した。透
析した連結混合物を大腸菌株ＤＨ５α内にエレクトロポ
レーションで取り込ませ、アンピシリンプレート上で形
質転換体を選択した。
【００９７】プール当たり約2,０００クローンの形質転
換大腸菌からなる複数のプールからプラスミドＤＮＡを
単離した。ＤＥＡＥ−デキストランを用いて、単離した
ＤＮＡをＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の不完全集密層内に形質
移入し、続いてルスマン (Luthman) ら, Nucl. Acids R
es. 11:1295, 1983 及びマクカッチャン (McCutchan)
ら, J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1986 に記載され
た操作に実質的に従ってクロロキン処理を行った。
【００９８】ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞を完全培地（１０％
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５
０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭ Ｌ−グル
タミンを含有するダルベッコ修飾イーグル培地）中に維
持し、１ウェル有室スライド(chambered slides) （Ｌ
ａｂ−Ｔｅｋ）に約２×１０5 細胞／ウェルの密度でプ
レートした。該スライドを１ｍｌヒトフィブロネクチン
（１０μｇ／ｍｌＰＢＳ）で３０分間前処理し、続いて
ＰＢＳで１回洗浄した。１層に成育している粘着細胞か
ら培地を除いて、６6.６μＭクロロキンサルフェートを
含有する1.５ｍｌ完全培地に置き換えた。約0.２ｍｌの
ＤＮＡ溶液（クロロキンを含有する完全培地中に２μｇ
ＤＮＡ、0.５ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン）を該
細胞に加えて、該混合物を３７℃で約５時間インキュベ
ートした。インキュベーション後、培地を除いて１０％
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含有する完全培地
を添加することによって、該細胞に2.５〜２０分間衝撃
を与えた。衝撃を与えた後、溶液を新たな完全培地と置
き換えた。細胞を２〜３日間培養して成育させて、挿入
したＤＮＡ配列を一過性発現させた。これら条件によ
り、生存するＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞中、３０〜８０％の
形質移入頻度がもたらされた。
【００９９】実施例４ この実施例は、実施例１で作った標識ＣＤ４０／Ｆｃ融
合タンパク質での実施例３で作った発現クローニングラ
イブラリーのスクリーニングを説明するものである。４
８〜７２時間後、実施例１で調製した放射性ヨウ素化Ｃ
Ｄ４０／Ｆｃ融合タンパク質を用いて、実施例３で作っ
たＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の形質移入単層を、ＣＤ４０−
Ｌの発現についてスライドオートラジオグラフィーによ
り分析した。形質移入ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞を結合培地
（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２ｍ
ｇ／ｍｌナトリウムアジド、ｐＨ7.２の２０ｍＭ ＨＥ
ＰＥＳ、及び５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳を含有するＲＰＭ
Ｉ１６４０）で１度洗浄し、１×１０-9Ｍ 125Ｉ−ＣＤ
４０／Ｆｃ融合タンパク質を含有する結合培地中で４℃
で２時間インキュベートした。インキュベーション後、
該有室スライド内の細胞を結合培地で３回洗浄し、続い
てＰＢＳ（ｐＨ7.３）で２回洗浄して未結合放射標識融
合タンパク質を除いた。
【０１００】ＰＢＳ中の１０％グルタルアルデヒド中で
インキュベート（室温で３０分間）することによって該
細胞を定着させ、ＰＢＳ中で２回洗浄して風乾した。該
スライドをコダックＧＴＮＢ−２写真乳剤（水で６倍希
釈）中に漬け、そして光遮断ボックス内の暗所で２〜４
日間室温で露光した。該スライドをコダックＤ１９現像
液中で現像し、水で濯いで Agfa Ｇ４３３Ｃ定着剤中で
定着した。該スライドを２５〜４０×の倍率の顕微鏡で
個別に検査した。明るいバックグランドに対するオート
ラジオグラフィーの銀粒子の存在により、ＣＤ４０−Ｌ
を発現する細胞を示す陽性のスライドを特定した。
【０１０１】約２０００の別々のクローンを含有する１
つのプールが、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質との結合
について強い陽性と同定された。このプールを力価測定
してプレートし、それぞれ約２００コロニーを含有する
プレートを得た。各プレートを掻き取って、上記と同じ
操作に従ってＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞内に形質移入するた
めにプールしたプラスミドＤＮＡを得た。先に記載した
スライドオートラジオグラフィーにより該より小さなプ
ールをスクリーニングした。該小さなプールのうちの１
つについて、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質に結合でき
る発現遺伝子産物が存在することが示され、これがＣＤ
４０−Ｌについて陽性であるクローンを含有した。
【０１０２】この陽性の小さなプールを力価測定してプ
レートし、別々のコロニーを得た。約４００の別々のコ
ロニーを採取して９６ウェルプレートの別々のウェル内
の培養培地に接種した。行及び列毎にプールすることに
より培養物を混合し、該混合した培養物を用いて最終ラ
ウンドの形質移入及びスクリーニング用のＤＮＡを調製
した。陽性行及び陽性列の交叉部分が強い陽性コロニー
であることを示した。１０の強い陽性コロニー（即ち、
候補クローン）を同定した。それぞれの候補クローンか
らＤＮＡを単離して、形質移入及びスクリーニングを行
った。５候補クローンがＣＤ４０／Ｆｃへの結合により
陽性であった。５陽性候補クローン全てが１４６８ヌク
レオチドのｃＤＮＡ挿入体を含有することが、ジデオキ
シヌクレオチド配列決定法により確認された。該ＣＤ４
０−ＬクローンのｃＤＮＡコーティング領域は、図１及
び配列番号：１の配列に対応する。
【０１０３】ｐＤＣ４０６−ｍＣＤ４０−Ｌと命名し
た、マウスＣＤ４０−Ｌ配列を含有するクローニングベ
クターを、１９９１年１２月６日にアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション，ロックビル，ＭＤ（ＡＴ
ＣＣ）に、受託番号６８８７２で寄託した。このクロー
ンのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配列番
号：１及び図１に示した。
【０１０４】実施例５ この実施例は、マウスＣＤ４０−Ｌの配列からデザイン
したプローブを用いてヒトＣＤ４０−Ｌ同族体を単離す
るのに用いた種間交叉ハイブリダイゼーション法を説明
するものである。マウスＣＤ４０−ＬクローンｐＤＣ４
０６−ＣＤ４０−Ｌからコーティング領域（ヌクレオチ
ド１３からヌクレオチド７９３まで）を切り取り、ラン
ダムプライマー（ベーリンガー・マンハイム）を用いて
該断片を32Ｐ標識することによって、マウスＣＤ４０−
Ｌプローブを作った。
【０１０５】λｇｔ１０アームを用いて、ヒト末梢血リ
ンパ球（ＰＢＬ）ｃＤＮＡライブラリーをλファージベ
クター内に構築し、市販のキット（ギガパック（登録商
標）ストラタジェン，サンディエゴ，ＣＡ）を用い、メ
ーカーの説明書に従って invitro でパッケージングし
た。該ＰＢＬ細胞は、正常なボランティアから得、１０
ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）、及び１０ｎｇ
／ｍｌのヒトＩＬ−２（イムネックス，シアトル，Ｗ
Ａ）で６日間処理したものである。該ＰＢＬ細胞を洗浄
し、５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（カルバイオケ
ム）及び１０ｎｇ／ｍｌＰＭＡ（シグマ）で４時間刺激
した。該刺激したＰＢＬ細胞からｍＲＮＡ及びｃＤＮＡ
を得て、メーカーの説明書に従ってλｇｔ１０ファージ
ベクター（ギガパック（登録商標）ストラタジェン）内
にパッケージングした。
【０１０６】該マウスプローブを、６×ＳＳＣ（１５ｍ
Ｍクエン酸トリナトリウム、及び１６５ｍＭ塩化ナトリ
ウム）、１×デンハルツ溶液、２ｍＭ ＥＤＴＡ、0.５
％Ｎｐ４０中、６３℃で一晩、ファージｃＤＮＡにハイ
ブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに続いて、
３×ＳＳＣ、0.１％ＳＤＳで、約５５℃で３時間洗浄し
た。オートラジオグラフィーにより、特異的なバンドを
可視化した。
【０１０７】ｈＣＤ４０−Ｌと命名した、ヒトＣＤ４０
−Ｌ配列を含有するクローニングベクターを、１９９１
年１２月６日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション，ロックビル，ＭＤ（ＡＴＣＣ）に、受託番号
６８８７３で寄託した。このクローンのヌクレオチド配
列及び推定アミノ酸配列を配列番号：１１及び図２に示
した。
【０１０８】実施例６ この実施例は、ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞内での膜結合マウ
スＣＤ４０−Ｌの発現を説明するものである。マクマハ
ン (McMahan) ら, EMBO J. 10:2821, 1991 に記載さ
れ、本明細書の実施例３に記載した方法の如き標準法を
用いて、ＨＡＶＥＯベクター内のマウスＣＤ４０−Ｌｃ
ＤＮＡ又は空のＨＡＶＥＯベクターをＣＶ１−ＥＢＮＡ
細胞内に形質移入した。簡単に説明すると、１０％ウシ
胎児血清を補充した１０ｍｌのダルベッコ最小必須培地
（メディアム）に、１０ｃｍ培養皿当たり２×１０6 細
胞の密度でＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞をプレートした。細胞
を３７℃で一晩粘着させた。該メディアムを、６6.７μ
Ｍクロロキン及びｍＣＤ４０−Ｌをコードする５μｇの
ｃＤＮＡを含有するＤＮＡ混合物を含有する1.５ｍｌの
メディアムと置き換えた。１７５μｌ及び２５μｌのＤ
ＥＡＥデキストラン（ＰＢＳ中４ｍｇ／ｍｌ）を含む培
地も該細胞に添加した。該細胞とｃＤＮＡを３７℃で５
時間インキュベートした。該ｃＤＮＡ混合物を除いて、
１０％ＤＭＳＯを含有する１ｍｌの新たなメディアムで
該細胞に2.５分間衝撃を加えた。該メディアムを新たな
メディアムと置き換えて、細胞を少なくとも３日間成育
させた。
【０１０９】実施例７ この実施例は、ＣＤ４０−Ｌに対するモノクローナル抗
体の調製を説明するものである。精製マウスＣＤ４０−
Ｌ又はヒトＣＤ４０−Ｌの試料を、ここに記載したＣＯ
Ｓ細胞発現及びＣＤ４０／Ｆｃアフィニティ精製により
調製する。精製ＣＤ４０−Ｌは、慣用法、例えば、米国
特許第4,４１1,９９３号に記載された方法を用いて、Ｃ
Ｄ４０−Ｌに対するモノクローナル抗体を生成すること
ができる。簡単に説明すると、ＣＤ４０−Ｌを免疫原と
して完全フロインドアジュバント中に乳化し、１０〜１
００μｇの範囲の量を皮下又は腹腔内注射してマウスを
免疫感作する。１０〜１２日後、免疫感作した該動物
に、不完全フロインドアジュバント中に乳化したＣＤ４
０−Ｌを追加注射する。その後、週１回から週２回の免
疫スケジュールでマウスを周期的に注射する。ＣＤ４０
−Ｌ抗体についてドットブロット分析又はＥＬＩＳＡ
（酵素結合免疫吸着検定法）により試験するために、眼
縁後部からの採血又は尾の先端の切除により、血清サン
プルを周期的に採取する。
【０１１０】適当な抗体力価の検出に続いて、食塩水中
のＣＤ４０−Ｌを陽性マウスに最後に１回静脈内注射す
る。３〜４日後に、該動物を殺して、脾臓細胞を採取
し、そして脾臓細胞をマウスミエローマ細胞系（例え
ば、ＮＳ１又はＡｇ8.６５３）と融合させる。融合によ
りハイブリドーマ細胞が生成し、これをＨＡＴ（ハイポ
キサンチン、アミノプテリン及びチミジン）選択培地中
でマルチプルマイクロタイタープレートにプレートし
て、未融合細胞、ミエローマハイブリッド、及び脾臓細
胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
【０１１１】エングバル（Engvall) ら, Immunochem.
8:871, 1971 及び米国特許第4,７０3,００４号に開示さ
れた方法を適用して、精製ＣＤ４０−Ｌに対する反応性
について、このハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡにより
スクリーニングする。陽性ハイブリドーマ細胞を同系Ｂ
ＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ＣＤ４
０−Ｌモノクローナル抗体を含有する腹水を得ることが
できる。また、種々の方法により、ハイブリドーマ細胞
をフラスコ又は回転容器中で in vitro で成育させるこ
とができる。マウス腹水中に生成したモノクローナル抗
体は、硫酸アンモニウム沈澱をしてからゲル排除クロマ
トグラフィーに付することによって精製することができ
る。また、ＣＤ４０−Ｌへの結合に基づくアフィニティ
クロマトグラフィーができるので、プロテインＡ又はプ
ロテインＧへの抗体結合に基づくアフィニティクロマト
グラフィーを用いることもできる。
【０１１２】実施例８ この実施例は、ｓＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃ融合タン
パク質の抗アレルギー治療作用を説明するものである。
可溶性ＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃを、２ドナーＭＬＣ
系におけるＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）誘導ＩｇＥ分泌を
阻害するそれらの能力について試験した。３実験からの
データを表１に示す。
【０１１３】
【表１】 表 １ ＩｇＥ（ng／ml） 添加 実験１ 実験２ 実験３ 培地 ＜0.１ ＜0.１ ＜0.１ IL-4 ２４ ４７ ５４ IL-4 + sCD40 (0.1 μg/ml) １９ ｎｄ ３８ IL-4 + sCD40 (0.3 μg/ml) １４ ２９ ２４ IL-4 + sCD40 (1 μg/ml) １０ ２４ ８ IL-4 + sCD40 (3 μg/ml) ７ １９ ２ IL-4 + IL-7R/Fc (10 μg/ml) ２１ ｎｄ ５８
【０１１４】培養１２日後にＩｇＥレベルをＥＬＩＳＡ
法により測定した。簡単に説明すると、ＰＢＳ（リン酸
塩緩衝液）で１：５００に希釈したマウスｍＡｂ抗ヒト
ＩｇＥ（ジメド (Zymed)）で平底９６ウェルマイクロタ
イタープレート（コーニング）をコーティングした。３
回洗浄した後、５％脱脂粉乳を用いて遮断工程を行い、
続いてヒトＩｇＥスタンダード又は試験上澄み液を滴定
した。３回洗浄した後、ビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＥ
（キルケガード (Kirkegaard) 及びペリー(Perry)）を
１：５００の希釈度で添加した。この後、更に洗浄し、
次いで、１：５００の希釈度でストレプトアビジン−Ｈ
ＲＰ（ジメド）を添加した。更に洗浄した後、ＴＭＢ基
質（キルケガード及びペリー）を用いて反応を行い、５
２０ｎｍで吸光度を測定した。全ての洗浄工程は、ＰＢ
Ｓプラス0.０５％ツィーン中で行った。全てのインキュ
ベーション工程は、１００μｌ／ウェルの容量で室温で
１時間行った。この測定法の感度は、１００ｐｇ／ｍｌ
である。
【０１１５】実施例９ この実施例は、可溶性ＣＤ２３がＩＬ−４（５ｎｇ／ｍ
ｌ）刺激Ｂ細胞から脱落するのを阻害するｓＣＤ４０及
びＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の作用を説明するもの
である。可溶性ＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃを、２ドナ
ーＭＬＣ系におけるＩＬ−４誘導ｓＣＤ２３脱落を阻害
するそれらの能力について試験した。３実験からのデー
タを表２に示す。
【０１１６】
【表２】 表 ２ ｓＣＤ２３（ng／ml） 添加 実験１ 実験２ 実験３ ６日目 12日目 ６日目 12日目 ６日目 12日目 Ｅ- + 培地 ５５ ＜0.５ ２４ １０ １０ ５ + IL-4 １１５ ５５ ９６ ６２ ４４ ２７ + IL-4 + sCD40 (1 μg/ml) ｎｄ ｎｄ ８８ ３６ ３８ ９ + IL-4 + sCD40 (3 μg/ml) ９７ ４ ８２ ３１ ４０ ４ + IL-4 + sCD40 (10μg/ml) ｎｄ ｎｄ ７２ ２８ ｎｄ ｎｄ + IL-4 +IL-7R/Fc(3μg/ml) １１１ ４８ １０３ ６７ ４０ ２２ PBM + 培地 １２ ＜0.５ １５ ５ ３ １０ + IL-4 ３９ ２５５ ４７ ２２ ４８ ２６ + IL-4 + sCD40 (1 μg/ml) ｎｄ ｎｄ ４４ １８ ４６ １８ + IL-4 + sCD40 (3 μg/ml) ２４ ６ ３７ １１ ４５ １２ + IL-4 + sCD40 (10μg/ml) ｎｄ ｎｄ ２８ ５ ｎｄ ｎｄ + IL-4 +IL-7R/Fc(3μg/ml) ３５ ２６ ４３ ２０ ５０ ２３
【０１１７】培養６及び１２日後に市販のｓＣＤ２３Ｅ
ＬＩＳＡ検出キット（ビンディング・サイト，サンディ
エゴ，ＣＡ）により可溶性ＣＤ２３レベルを測定した。
その感度限界は５００ｐｇ／ｍｌであった。約１×１０
5 細胞／ウェルを、平底９６ウェルマイクロタイタープ
レート（インターマウンテン・サイエンティフィック，
バウンチファル，ＵＴ）で、表２に示した時間、示した
添加物の存在下又は不存在下で３重に培養した。結果は
ｓＣＤ４０の抗アレルギー作用を示している。ｓＣＤ４
０の代わりにＣＤ４０／Ｆｃを用いて類似の研究を行い
（データは示していない）、類似の結果が得られた。従
って、実施例８及び９のこれらデータは、ＣＤ４０につ
いての抗アレルギー特性を示すものである。
【０１１８】実施例１０ この実施例は、ヒトＢ細胞についての膜結合マウスＣＤ
４０−ＬのＢ細胞増殖活性を説明するものである。ヒス
トパクー (Histopaque) （登録商標）（シグマ，セント
ルイス，ＭＯ）での密度勾配遠心分離により、正常なボ
ランティアからの末梢血からヒト末梢血単核細胞（ＰＢ
ＭＣ）を単離した。臭化２−アミノエチルイソチオウロ
ニウム処理ＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球）でのロゼッティン
グ及び更にヒストパクーでの密度勾配遠心分離によりＴ
細胞を除くことによって、細胞（Ｅ-）のＴ細胞除去試
料を得た。１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を
加えたＰＲＭＩ培地中、３７℃、１０％ＣＯ2雰囲気下
で、Ｂ細胞増殖分析をＥ-試料で行った。約１×１０5
Ｅ-細胞／ウェルを、平底９６ウェルマイクロタイター
プレート（コーニング）で、７日間、形質移入ＣＶ１−
ＥＢＮＡ細胞（実施例６に記載した）の存在下で３重に
培養した。該ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞は、マウスＣＤ４０
−ＬｃＤＮＡ又は空ベクターで形質移入されたものであ
る。培養の最終８時間、該細胞を１μＣｉ／ウェルのト
リチウム標識チミジン（２５Ｃｉ／nmole ，アマシャ
ム，アーリントンハイト，ＩＬ）でパルスした。自動細
胞採取装置でグラスファイバーディスク上に細胞を採取
し、取り込まれたｃｐｍを液体シンチレーションスペク
トロメトリにより測定した。
【０１１９】図４ａは、空ベクター（ＨＡＶＥＯ）又は
ＨＡＶＥＯベクター中のマウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡで
形質移入されたＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞のヒトＢ細胞増殖
の比較を示している。これらデータは、膜結合ＣＤ４０
−Ｌが、協同分裂促進因子の不存在下でヒトＢ細胞増殖
を刺激することを示している。図４ｂは、培養物中に１
０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４を添加した以外は同じ実験
を示している。この実験では、ＩＬ−４が膜結合マウス
ＣＤ４０−ＬのＢ細胞分裂促進活性を僅かに増進してい
る。図５は、図４ｂに示した実験を繰り返したものであ
る。しかしながら、該実験を繰り返した場合には、ＩＬ
−４協同分裂促進活性の形跡はなかった。ＣＤ４０−Ｌ
の分裂促進活性の形跡はあった。従って、膜結合ＣＤ４
０−ＬはヒトＢ細胞の増殖を刺激する。
【０１２０】実施例１１ この実施例は、実施例１０で単離したＥ-細胞からのＩ
ｇＥ産生及びＣＤ２３脱落を刺激する膜結合マウスＣＤ
４０−Ｌの作用を説明するものである。約１×１０5 細
胞／ウェルを平底９６ウェルヌンクマイクロタイタープ
レート（インターマウンテン・サイエンティフィック，
バウンチファル，ＵＴ）で、イスコフ(Iscove,s) 修飾
ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）プラス１０％ＦＣＳ中、１
０％ＣＯ2の加湿雰囲気下で３重に培養した。培地に
は、５０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（シグマ）、
0.５％ウシ血清アルブミン（シグマ）及びそれぞれ１μ
ｇ／ｍｌのオレイン、リノレイン及びパルミチン酸（シ
グマ）を補充した。５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−４の存在下
で、Ｅ-細胞を１０日間培養した。マウスＣＤ４０−Ｌ
又は空ベクターで形質移入したある力価のＣＶ１−ＥＢ
ＮＡ細胞を添加した。１０日後、実施例８に記載したＥ
ＬＩＳＡ法によりＩｇＥを又は実施例９に記載した方法
によりＣＤ２３脱落を分析した。
【０１２１】図６は、Ｅ-細胞と空ベクター（ＨＡＶＥ
Ｏ）又はＣＤ４０−Ｌで形質移入されたＣＶ１−ＥＢＮ
Ａ細胞の培養物について、上澄み液中のＩｇＥ産生（ｎ
ｇ／ｍｌ）の比較を示している。３０００ＣＶ１−ＥＢ
ＮＡ細胞までは差が見られないが、１００００又は３０
０００のＣＤ４０−Ｌ形質移入ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の
添加で、有意なＩｇＥ産生がもたらされた。比較とし
て、Ｅ-細胞を培地単独で又は５ｎｇ／ｍｌＩＬ−４と
共に又は５ｎｇ／ｍｌＩＬ−４プラス５００ｎｇ／ｍｌ
Ｇ２８−５抗体と共にインキュベートした場合、ＩｇＥ
産生はそれぞれ4.７、2.９及び＞６００ｎｇ／ｍｌであ
った。図７において、ＣＤ２３脱落を測定した場合、Ｃ
Ｄ４０−Ｌで形質移入された１００００又は３００００
のＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞は、空ベクターコントロールＣ
Ｖ１−ＥＢＮＡ細胞に比較して、増加したＣＤ２３脱落
を示した。比較として、Ｅ-細胞を培地単独で又は５ｎ
ｇ／ｍｌＩＬ−４と共に又は５ｎｇ／ｍｌＩＬ−４プラ
ス５００ｎｇ／ｍｌＧ２８−５抗体と共にインキュベー
トした場合、ＣＤ２３脱落はそれぞれ＜0.１、2.４及び
１1.２ｎｇ／ｍｌであった。これらデータは、ＩｇＥ産
生及びＣＤ２３脱落の両方が膜結合ＣＤ４０−Ｌに付随
する生物活性であることを示している。
【０１２２】実施例１２ この実施例は、Ｂ細胞増殖活性、ポリクローナルイムノ
グロブリン（Ｉｇ）産生、抗原特異性抗体形成及び膜結
合及び可溶性ＣＤ４０−Ｌを臨床応用に用いる種々の方
法を説明するものである。本発明者らは、前記のグラブ
シュタインらＩ、前記のマリスゼウスキーらＩ及び前記
のマリスゼウスキーらIIに記載された操作に従って、マ
ウス脾臓Ｂ細胞を得た。簡単に説明すると、Ｔ細胞抗血
清及び補体を用いるＴ細胞除去及び、セファデックス
（登録商標）Ｇ１０カラムに通すことによる粘着細胞除
去、及びヤギ抗マウスＩｇＭでコーティングしたペトリ
皿上でのパンニングによるＢ細胞陽性選択により、細胞
の混合培養物を精製した。精製したＢ細胞を、ＲＰＭ
Ｉ、ウシ胎児血清（Ｂ細胞増殖分析用に５％及びプラー
ク形成細胞分析又はポリクローナル抗体分析用に２０
％）、２−メルカプトエタノール、抗生物質、アミノ
酸、及びビルベート中で培養した。Ｂ細胞増殖は、実施
例１０及び前記のグラブシュタインらＩ、前記のマリス
ゼウスキーらＩ及び前記のマリスゼウスキーらIIに記載
された測定法に従って測定した。抗原特異性抗体形成
は、グラブシュタインら, J. Mol. Cell. Immunol. 2:1
99, 1986〔グラブシュタインらII〕に記載された操作に
従って測定した。簡単に説明すると、抗原特異性抗体形
成は、抗原としてヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）（0.０３％
ｖ／ｖ）を１ｍｌ当たり１×１０6 マウスＢ細胞の培地
2.０ｍｌ中で用いた。該Ｂ細胞培養物を５日間インキュ
ベートして、前記のグラブシュタインらIIに記載された
イエルネ溶血プラーク測定法により、プラーク形成細胞
を測定した。細胞数はコールタカウンター（ｃｏｕｌｔ
ｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒ）で計数した。ポリクローナルＩ
ｇ分泌は、前記のマリスゼウスキーらＩ及び前記のマリ
スゼウスキーらIIに記載されたようにして、2.０ｍｌ培
地当たり１×１０6 Ｂ細胞の７日目培養物中で、アイソ
タイプ特異的ＥＬＩＳＡ分析法により測定した。
【０１２３】ＣＤ４０−Ｌ若しくは空ベクターで形質移
入されたＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞、又は７Ａ１細胞（Ｔ細
胞ヘルパークローン）によるＢ細胞増殖の結果を図８、
１０及び１２に示す。これらデータは、ＣＤ４０−Ｌに
より最も大きいＢ細胞増殖が生じたことを示している。
Ｔ細胞ヘルパー細胞７Ａ１及び７Ｃ１は、Ｂ細胞増殖に
小さな作用しか有さなかった。
【０１２４】抗原特異性抗体形成に関する種々の細胞の
作用を図９及び１１に示す。図９は、プラーク形成細胞
を、Ｔ細胞ヘルパークローン７Ａ１と可溶性ＣＤ４０−
Ｌを分泌するマウスＥＬ−４0.９細胞とを比較しながら
示している。ＥＬ−４0.９細胞は、抗原特異性抗体形成
に関して阻害的作用を有しているようである。図１１
は、Ｔ細胞ヘルパー細胞７Ｃ２及び空ベクター又はＣＤ
４０−Ｌのいずれかで形質移入されたＣＶ１−ＥＢＮＡ
細胞についてのＰＦＣ（プラーク形成細胞）を示す。７
Ｃ２細胞及び膜結合ＣＤ４０−Ｌの両方が、抗原特異性
抗体形成（ＰＦＣ）を刺激した。図１３は、１０ｎｇ／
ｍｌインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下又は不
存在下でのＣＤ４０−Ｌ及び７Ａ１細胞の抗原特異性抗
体形成を比較している。ＩＬ−２は、７Ａ１細胞につい
てＰＦＣを増加したが、膜結合ＣＤ４０−Ｌにより生ず
るＰＦＣを増加しなかった。
【０１２５】マウスＢ細胞によるポリクローナルＩｇ産
生を、刺激又は阻害について、サイトカインＩＬ−４
（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−５（ＣＯＳ細胞上澄み液
の１：４０希釈液）の存在下で又はサイトカインを添加
せずに、膜結合ＣＤ４０−Ｌ、コントロールＣＶ１−Ｅ
ＢＮＡ細胞及びヘルパーＴ細胞７Ａ１で比較した。Ｉｇ
Ａ、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＭ及びＩｇＧ
１の量をそれぞれ表３〜８に示す。
【０１２６】
【表３】 表 ３ ＩｇＡ，ｎｇ／ｍｌ ＃細胞数 培地 +IL-4 +IL-5 ＣＤ４０−Ｌ 2 × 105 666.275 ± 174.444 64.639 ± 51.780 1 × 105 288.085 ± 20.773 291.831 ± 10.673 1 × 104 53.750 ± 36.531 910.072 ± 62.713 ＨＡＶＥＯ 2 × 105 0 628.190 ± 42.907 1 × 105 0 477.755 ± 57.478 1 × 104 0 295.640 ± 12.736 ７Ａ１(2Ｃ11） 1 × 106 0 2177.549 ± 377.052 2 × 105 0 646.898 ± 86.325 1 × 105 0 480.671 ± 40.011 培地 0 458.152 ± 77.258 ＬＰＳ 88.531 ± 31.248 132.336 ± 51.356
【０１２７】
【表４】 表 ４ ＩｇＧ３，ｎｇ／ｍｌ ＃細胞数 培地 +IL-4 +IL-5 ＣＤ４０−Ｌ 2 × 105 108.427 ± 14.359 0 1 × 105 118.079 ± 8.021 46.535 ± 9.899 1 × 104 127.591 ± 6.268 467.023 ± 78.276 ＨＡＶＥＯ 2 × 105 0 29.773 ± 5.224 1 × 105 11.205 ± 4.434 66.323 ± 8.673 1 × 104 26.389 ± 10.221 34.671 ± 12.975 ７Ａ１(2Ｃ11） 1 × 106 33.420 ± 9.972 820.856 ± 39.442 2 × 105 0 436.074 ± 59.332 1 × 105 0 239.760 ± 45.978 培地 21.808 ± 7.107 64.773 ± 13.924 ＬＰＳ 816.697 ± 43.553 103.720 ± 11.883
【０１２８】
【表５】 表 ５ ＩｇＥ，ｎｇ／ｍｌ ＃細胞数 培地 +IL-4 +IL-5 ＣＤ４０−Ｌ 2 × 105 0 64.144 ± 4.979 1 × 105 0 83.493 ± 9.093 1 × 104 0 461.155 ± 60.514 ＨＡＶＥＯ 2 × 105 0 0 1 × 105 0 4.208 ± 0.527 1 × 104 0 0 ７Ａ１(2Ｃ11） 1 × 106 0 208.091 ± 8.090 2 × 105 0 32.530 ± 0.723 1 × 105 0 15.889 ± 2.947 培地 0 12.602 ± 1.460 ＬＰＳ 0 408.355 ± 9.764
【０１２９】
【表６】 表 ６ ＩｇＧ２ｂ，ｎｇ／ｍｌ ＃細胞数 培地 +IL-4 +IL-5 ＣＤ４０−Ｌ 2 × 105 0 0 1 × 105 0 6.230 ± 0.285 1 × 104 0 47.414 ± 0.241 ＨＡＶＥＯ 2 × 105 0 7.001 ± 2.358 1 × 105 0 6.230 ± 2.285 1 × 104 0 9.620 ± 2.650 ７Ａ１(2Ｃ11） 1 × 106 0 189.343 ± 2.837 2 × 105 0 22.431 ± 6.835 1 × 105 0 7.207 ± 1.580 培地 0 7.422 ± 1.602 ＬＰＳ 0 33.291 ± 3.183
【０１３０】
【表７】 表 ７ ＩｇＭ，ｎｇ／ｍｌ ＃細胞数 培地 +IL-4 +IL-5 ＣＤ４０−Ｌ 2 × 105 1.805 ± 0.639 0.439 ± 0.184 1 × 105 2.237 ± 0.583 5.878 ± 0.858 1 × 104 2.293 ± 0.595 96.730 ± 13.009 ＨＡＶＥＯ 2 × 105 0 10.890 ± 2.126 1 × 105 0 13.303 ± 0.993 1 × 104 0.624 ± 0.178 22.538 ± 2.304 ７Ａ１(2Ｃ11） 1 × 106 0.769 ± 0.124 104.857 ± 17.463 2 × 105 0.142 ± 0.052 27.016 ± 1.706 1 × 105 0.126 ± 0.048 13.070 ± 0.600 培地 0.231 ± 0.057 36.809 ± 2.860 ＬＰＳ 53.302 ± 9.668 41.974 ± 6.158
【０１３１】
【表８】 表 ８ ＩｇＧ１，ｎｇ／ｍｌ ＃細胞数 培地 +IL-4 +IL-5 ＣＤ４０−Ｌ 2 × 105 0 130.185 ± 24.547 1 × 105 0 310.588 ± 1.261 1 × 104 0 270.727 ± 17.511 ＨＡＶＥＯ 2 × 105 0 187.668 ± 57.730 1 × 105 0 43.320 ± 49.770 1 × 104 0 1363.464 ± 45.841 ７Ａ１(2Ｃ11） 1 × 106 0 145.652 ± 136.070 2 × 105 0 365.563 ± 24.276 1 × 105 0 449.475 ± 101.012 培地 0 133.660 ± 386.231 ＬＰＳ 0 246.213 ± 21.526
【０１３２】これらデータは、ＣＤ４０とそのリガンド
との相互作用が、抗原特異性抗体産生及びポリクローナ
ルＩｇ分泌の両方へのＢ細胞成長及び分化のＴ細胞接触
依存性誘発を司る主要な分子性相互作用であることを示
している。そういうことであるから、これらデータは、
可溶性ＣＤ４０、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質及びで
きるだけ可溶性のＣＤ４０−Ｌ（モノマー）によるこの
相互作用のアンタゴニストが、抗体応答の発生を有意に
防げることを示唆している。従って、ＣＤ４０、ＣＤ４
０／Ｆｃ融合タンパク質及び可溶性ＣＤ４０−ＬがＣＤ
４０アンタゴニストとして有用な臨床的状況には、アレ
ルギー、狼瘡、慢性間接リウマチ、インシュリン依存真
性糖尿病、及び自己免疫抗体又は抗原／抗体複合体がそ
の疾患の臨床病理学上の原因である他のあらゆる疾患が
含まれる。更に、膜結合ＣＤ４０−Ｌ又はオリゴマー可
溶性ＣＤ４０−Ｌは、Ｂ細胞増殖及び抗体産生を刺激す
るのに有用であろう。そういうことであるから、ＣＤ４
０−Ｌのこれら形態は、ワクチンアジュバントに及びハ
イブリドーマ細胞からのｍＡｂ分泌のための刺激剤とし
て最も有用である。
【０１３３】実施例１３ この実施例は、末梢血単核細胞（Ｅ-）の増殖及びそれ
からのＩｇＥ分泌への膜結合ＣＤ４０−Ｌの作用を説明
するものである。実施例１０に記載した操作に従ってＥ
-細胞を得て、空ベクター又はｍＣＤ４０−ＬｃＤＮＡ
で形質移入されたＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の存在下で７又
は１０日間インキュベートした。更に、ＣＤ４０／Ｆｃ
融合タンパク質（実施例１に記載）又はＴＮＦレセプタ
ー／Ｆｃ融合タンパク質（ＷＯ９１／０３５５３に記
載）を図１４に示した幾つかの試料に添加した。ＩｇＥ
分泌は実施例８に記載した操作に従って測定し、Ｂ細胞
増殖は実施例１０に記載した操作に従って測定した。
【０１３４】Ｂ細胞増殖及びＩｇＥ分泌についての結果
を、形質移入ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の５種の異なる濃度
について図１４に示す。膜結合ＣＤ４０−Ｌの存在下
で、Ｂ細胞増殖及びＩｇＥ分泌の両方が増加した。ＣＤ
４０／Ｆｃ融合タンパク質の添加は、Ｂ細胞増殖及びＩ
ｇＥ分泌の両方を失わせた。ＴＮＦレセプター／Ｆｃ融
合タンパク質は何の作用も有さなかった。ＩｇＥ分泌に
ついての比較として、コントロール物質（形質移入ＣＶ
１−ＥＢＮＡ細胞なし）としてのＩＬ−４の添加はこの
分析でＩｇＥを産生せず、ＩＬ−４プラスＧ２８−５抗
ＣＤ４０ｍＡｂの添加は、この分析で２9.７ｎｇ／ｍｌ
のＩｇＥをもたらした。
【０１３５】実施例１４ この実施例は、ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２構築体という可溶
性ＣＤ４０−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＤ４
０−Ｌ／ＦｃＤＮＡ構築体の構築を説明するものであ
る。ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２をコードするＤＮＡは、リー
ダー（又はシグナル）ぺプチド、ホップ (Hopp) ら（ホ
ップら, Bio/Technology 6:1204, 1988）により記載さ
れた８アミノ酸の親水性配列（Ｆｌａｇ（登録商標）と
いう）、イムノグロブリンの適当なＦｃ領域、〔Ｇｌｙ
4Ｓｅｒ〕3 繰り返し配列（参照によりここに組み入れ
られる米国特許第5,０７3,６２７号に記載）又は他の適
当なリンカー配列、及びアミノ酸５０からアミノ酸２６
１（配列番号：１１）のヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外領域
をコードする配列を含む。リーダー配列、Ｆｌａｇ（登
録商標）、及びヒトＩｇＧ1 Ｆｃをコードする断片の酵
素切断及び連結の慣用法を用いて、リーダー配列、Ｆｌ
ａｇ（登録商標）、及びヒトＩｇＧ1 Ｆｃを含有するｐ
ＤＣ４０６発現ベクターを調製し、Ｎｓｉ１及びＮｏｔ
１で消化した。
【０１３６】５'（上流）及び３'（下流）オリゴヌクレ
オチドプライマーを用いるＰＣＲ法（サルキ (Sarki)
ら, Science 239:487, 1988）を利用して、ヒトＣＤ４
０−Ｌ（ＡＴＣＣ６８８７３；配列番号：１１）を含有
するクローニングベクターからのＣＤ４０細胞外リガン
ド結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を増幅し、ＰＣ
Ｒ断片を形成した。上流オリゴヌクレオチドプライマー
（配列番号：１３）は、リンカー配列（〔Ｇｌｙ4Ｓｅ
ｒ〕3 ＳｅｒＳｅｒ）から上流にＮｓｉ１部位を導入
し、この後にＣＤ４０−Ｌの細胞外領域の２１ヌクレオ
チド（配列番号：１１のアミノ酸５１から５７まで）が
続いた。下流オリゴヌクレオチドプライマー（配列番
号：１４）は、ＣＤ４０−Ｌの終止コドンのすぐ下流に
Ｎｏｔ１部位を導入した。次いで、リーダー配列、Ｆｌ
ａｇ（登録商標）、及びヒトＩｇＧ1Ｆｃを含有するｐ
ＤＣ４０６発現ベクター内に該ＰＣＲ断片を連結した。
そのヌクレオチド配列及びＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２の推定
アミノ酸配列を配列番号：１５及び配列番号：１６に示
した。生成したＤＮＡ構築体（ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２）
をサル腎臓細胞系ＣＶ１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
１０４７８）内に形質移入した。該構築体は、ＣＤ４０
に結合できる可溶性ＣＤ４０−Ｌをコードした。このこ
とは、ＣＤ４０を発現する細胞を用いる蛍光活性化細胞
選別（ＦＡＣＳ）分析で認められる結合により証明され
た。
【０１３７】ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２をコードする構築体
で形質移入したヒト胚性腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ１５７３）の大規模培養物を成育させて、ＣＤ４０
−Ｌ／ＦＣ２を含有する上澄み液を蓄積した。２９３細
胞系、つまりヒトアデノウィルス５ＤＮＡにより形質転
換された一次ヒト胚性腎臓の永久系は、ｐＤＣ４０６ベ
クター内に連結された組換えタンパク質の発現を可能に
する。上澄み液中のＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２融合タンパク
質をアフィニティ精製により精製した。簡単に説明する
と、哺乳動物細胞上澄み液を濾過（例えば、0.４５μフ
ィルターで）し、ストレプトアビジン−アガロース（ピ
アスケミカル，ロックフォード，ＩＬ，ＵＳＡ）に結合
したビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ジャクソン・イム
ノリサーチ・ラボラトリーズ社，ウエストグローブ，Ｐ
Ａ，ＵＳＡ）を含む抗体アフィニティカラムに濾液を４
℃で1.５ｃｍ×１2.０ｃｍカラムについて約６０〜８０
ｍｌ／ｈの流速で適用することによって、ＣＤ４０−Ｌ
／ＦＣ融合タンパク質を含有する培養上澄み液を精製し
た。フリーのタンパク質が洗浄緩衝液中に検出されなく
なるまで、カラムの約２０倍容量のＰＢＳ（リン酸塩緩
衝液）でカラムを洗浄した。結合した融合タンパク質を
ｐＨ2.８の１2.５ｍＭクエン酸緩衝液，７５ｍＭ Ｎａ
Ｃｌでカラムから溶出させ、ｐＨ9.１の５００ｍＭ Ｈ
ＥＰＥＳ緩衝液でｐＨ７にした。精製したオリゴマーＣ
Ｄ４０−Ｌ／ＦＣペプチドは、協同刺激物質の不存在下
でヒトＢ細胞増殖を誘発し、（適当なサイトカインと協
力して）膜結合ＣＤ４０−Ｌについて実施例１２に記載
したようにＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＭの産生を
もたらした。
【０１３８】実施例１５ この実施例は、トリマーＣＤ４０−Ｌという可溶性ＣＤ
４０−Ｌ融合タンパク質を発現するＣＤ４０−Ｌ ＤＮ
Ａ構築体の構築を説明するものである。トリマーＣＤ４
０−Ｌは、リーダー配列、“ロイシンジッパー”という
３３アミノ酸配列（配列番号：１７）、及びホップら
（ホップら, Bio/Technology 6:1204, 1988）により記
載された８アミノ酸の親水性配列（Ｆｌａｇ（登録商
標）という）、続いてアミノ酸５０からアミノ酸２６１
のヒトＣＤ４０−Ｌ（配列番号：１１）の細胞外領域を
含有する。リーダー配列及びＦｌａｇ（登録商標）配列
の有用性は、詳細な説明の欄に記載した。配列番号：１
７で示される３３アミノ酸配列は、溶液中で自然に三量
化する。かくして、この３３アミノ酸を含む融合タンパ
ク質は、自然にトリマー又はマルチマーを形成すると考
えられる。
【０１３９】リーダー配列、上記の３３アミノ酸配列、
及びＦｌａｇ配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成
し、次いで実施例１４に記載したようにして調製した配
列番号：１１のアミノ酸５１からアミノ酸２６１をコー
ドするＤＮＡ断片に該最終産物を連結することにより、
該構築体を調製する。
【０１４０】発現ベクターｐＤＣ４０６内の生成連結産
物をサル腎臓細胞系ＣＶ１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ ＣＲ
Ｌ１０４７８）内に形質移入した。ｐＤＣ４０６プラス
ミドは、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、
及びエプスタイン・バー・ウィルス（ＥＢＶ）由来の調
節配列を含む。ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系は、エプスタイ
ン・バー・ウィルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコー
ドし、ヒトＣＭＶ即時−初期 (immediate-early) エン
ハンサー／プロモーター由来のＥＢＮＡ−１を構成的に
発現する遺伝子で、ＣＶ−１細胞系を形質移入すること
により得られた。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ｐＤＣ４０６
の如きＥＢＶ複製起点を含有する発現ベクターのエピソ
ーム複製を可能にする。
【０１４１】一旦、該融合構築体を発現する細胞を同定
すると、形質移入細胞の大規模培養を行ってトリマーＣ
Ｄ４０−Ｌを発現する細胞からの上澄み液を蓄積する。
実質的に米国特許第5,０１1,９１２号に記載されたアフ
ィニティ精製により、上澄み液中のトリマーＣＤ４０−
Ｌ融合タンパク質を精製する。溶出したＣＤ４０−Ｌ融
合タンパク質の銀染色ＳＤＳゲルを調製して純度を測定
することができる。
【０１４２】
【配列表】
【０１４３】(2) 配列情報 SEQ ID NO:1: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 783 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: cDNA (iii) ハイポセティカル: NO (iv) アンチセンス: NO (vi) 起源: (A) 生物名: MOUSE (vii) 直接の起源: (B) クローン名: CD40-L (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: CDS (B) 存在位置: 1..783 (xi) 配列: SEQ ID NO:1: ATG ATA GAA ACA TAC AGC CAA CCT TCC CCC AGA TCC GTG GCA ACT GGA 48 Met Ile Glu Thr Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Arg Ser Val Ala Thr Gly 1 5 10 15 CTT CCA GCG AGC ATG AAG ATT TTT ATG TAT TTA CTT ACT GTT TTC CTT 96 Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 ATC ACC CAA ATG ATT GGA TCT GTG CTT TTT GCT GTG TAT CTT CAT AGA 144 Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Val Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 AGA TTG GAT AAG GTC GAA GAG GAA GTA AAC CTT CAT GAA GAT TTT GTA 192 Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 TTC ATA AAA AAG CTA AAG AGA TGC AAC AAA GGA GAA GGA TCT TTA TCC 240 Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser 65 70 75 80 TTG CTG AAC TGT GAG GAG ATG AGA AGG CAA TTT GAA GAC CTT GTC AAG 288 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys 85 90 95 GAT ATA ACG TTA AAC AAA GAA GAG AAA AAA GAA AAC AGC TTT GAA ATG 336 Asp Ile Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met 100 105 110 CAA AGA GGT GAT GAG GAT CCT CAA ATT GCA GCA CAC GTT GTA AGC GAA 384 Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu 115 120 125 GCC AAC AGT AAT GCA GCA TCC GTT CTA CAG TGG GCC AAG AAA GGA TAT 432 Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr 130 135 140 TAT ACC ATG AAA AGC AAC TTG GTA ATG CTT GAA AAT GGG AAA CAG CTG 480 Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu 145 150 155 160 ACG GTT AAA AGA GAA GGA CTC TAT TAT GTC TAC ACT CAA GTC ACC TTC 528 Thr Val Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gln Val Thr Phe 165 170 175 TGC TCT AAT CGG GAG CCT TCG AGT CAA CGC CCA TTC ATC GTC GGC CTC 576 Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly Leu 180 185 190 TGG CTG AAG CCC AGC ATT GGA TCT GAG AGA ATC TTA CTC AAG GCG GCA 624 Trp Leu Lys Pro Ser Ile Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala 195 200 205 AAT ACC CAC AGT TCC TCC CAG CTT TGC GAG CAG CAG TCT GTT CAC TTG 672 Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Val His Leu 210 215 220 GGC GGA GTG TTT GAA TTA CAA GCT GGT GCT TCT GTG TTT GTC AAC GTG 720 Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val 225 230 235 240 ACT GAA GCA AGC CAA GTG ATC CAC AGA GTT GGC TTC TCA TCT TTT GGC 768 Thr Glu Ala Ser Gln Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser Ser Phe Gly 245 250 255 TTA CTC AAA CTC TGA 7 83 Leu Leu Lys Leu 260
【０１４４】(2) 配列情報 SEQ ID NO:2: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 260 アミノ酸 (B) 型: アミノ酸 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: タンパク質 (xi) 配列: SEQ ID NO:2: Met Ile Glu Thr Tyr Ser Gln Pro Ser Pro Arg Ser Val Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ala Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Val Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Val Glu Glu Glu Val Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Ile Lys Lys Leu Lys Arg Cys Asn Lys Gly Glu Gly Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Met Arg Arg Gln Phe Glu Asp Leu Val Lys 85 90 95 Asp Ile Thr Leu Asn Lys Glu Glu Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met 100 105 110 Gln Arg Gly Asp Glu Asp Pro Gln Ile Ala Ala His Val Val Ser Glu 115 120 125 Ala Asn Ser Asn Ala Ala Ser Val Leu Gln Trp Ala Lys Lys Gly Tyr 130 135 140 Tyr Thr Met Lys Ser Asn Leu Val Met Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu 145 150 155 160 Thr Val Lys Arg Glu Gly Leu Tyr Tyr Val Tyr Thr Gln Val Thr Phe 165 170 175 Cys Ser Asn Arg Glu Pro Ser Ser Gln Arg Pro Phe Ile Val Gly Leu 180 185 190 Trp Leu Lys Pro Ser Ile Gly Ser Glu Arg Ile Leu Leu Lys Ala Ala 195 200 205 Asn Thr His Ser Ser Ser Gln Leu Cys Glu Gln Gln Ser Val His Leu 210 215 220 Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Ala Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val 225 230 235 240 Thr Glu Ala Ser Gln Val Ile His Arg Val Gly Phe Ser Ser Phe Gly 245 250 255 Leu Leu Lys Leu 260
【０１４５】(2) 配列情報 SEQ ID NO:3: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 740 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: cDNA (iii) ハイポセティカル: NO (iv) アンチセンス: NO (vi) 起源: (A) 生物名: ヒト (vii) 直接の起源: (B) クローン名: IgG1 Fc (xi) 配列: SEQ ID NO:3: CGGTACCGCT AGCGTCGACA GGCCTAGGAT ATCGATACGT AGAGCCCAGA TCTTGTGACA 60 AAACTCACAC ATGCCCACCG TGCCCAGCAC CTGAACTCCT GGGGGGACCG TCAGTCTTCC 120 TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACATGCG 180 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC GTGGACGGCG 240 TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGC ACGTACCGGG 300 TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAGGAC TACAAGTGCA 360 AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TGCAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC 420 AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG ACCAAGAACC 480 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG GCACATCGCC GTGGAGTGGG 540 AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG GACTCCGACG 600 GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG 660 TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT 720 CCCTGTCTCC GGGTAAATGA 740
【０１４６】(2) 配列情報 SEQ ID NO:4: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 519 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: cDNA (iii) ハイポセティカル: NO (iv) アンチセンス: NO (vi) 起源: (A) 生物名: ヒト (vii) 直接の起源: (B) クローン名: CD40 EXTRACELLULAR REGION (xi) 配列: SEQ ID NO:4: CAGAACCACC CACTGCATGC AGAGAAAAAC AGTACCTAAT AAACAGTCAG TGCTGTTCTT 60 TGTGCCAGCC AGGACAGAAA CTGGTGAGTG ACTGCACAGA GTTCACTGAA ACGGAATGCC 120 TTCCTTGCGG TGAAAGCGAA TTCCTAGACA CCTGGAACAG AGAGACACAC TGCCACCAGC 180 ACAAATACTG CGACCCCAAC CTAGGGCTTC GGGTCCAGCA GAAGGGCACC TCAGAAACAG 240 ACACCATCTG CACCTGTGAA GAAGGCTGGC ACTGTACGAG TGAGGCCTGT GAGAGCTGTG 300 TCCTGCACCG CTCATGCTCG CCCGGCTTTG GGGTCAAGCA GATTGCTACA GGGGTTTCTG 360 ATACCATCTG CGAGCCCTGC CCAGTCGGCT TCTTCTCCAA TGTGTCATCT GCTTTCGAAA 420 AATGTCACCC TTGGACAAGC TGTGAGACCA AAGACCTGGT TGTGCAACAG GCAGGCACAA 480 ACAAGACTGA TGTTGTCTGT GGTCCCCAGG ATCGGCTGA 519
【０１４７】(2) 配列情報 SEQ ID NO:5: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 26 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: cDNA (iii) ハイポセティカル: NO (iv) アンチセンス: NO (vi) 起源: (A) 生物名: PCR PRIMER (vii) 直接の起源: (B) クローン名: CD40 5' PRIMER (xi) 配列: SEQ ID NO:5: CCGTCGACCA CCATGGTTCG TCTGCC 26
【０１４８】(2) 配列情報 SEQ ID NO:6: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 28 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: cDNA (iii) ハイポセティカル: NO (iv) アンチセンス: NO (vi) 起源: (A) 生物名: PCR PRIMER (vii) 直接の起源: (B) クローン名: CD40 3' PRIMER (xi) 配列: SEQ ID NO:6: CCGTCGACGT CTAGAGCCGA TCCTGGGG 28
【０１４９】(2) 配列情報 SEQ ID NO:7: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: cDNA (iii) ハイポセティカル: NO (vi) 起源: (A) 生物名: PCR PRIMER (vii) 直接の起源: (B) クローン名: CD40 3' DOWNSTREAM PRIMER (xi) 配列: SEQ ID NO:7: ACAAGATCTG GGCTCTACGT ACTCAGCCGA TCCTGGGGAC 40
【０１５０】(2) 配列情報 SEQ ID NO:8: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 5 アミノ酸 (B) 型: アミノ酸 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: ペプチド (iii) ハイポセティカル: NO (v) フラグメント型: 中間部 (vi) 起源: (A) 生物名: PENTAペプチド (xi) 配列: SEQ ID NO:8: Tyr Val Gly Pro Arg 1 5
【０１５１】(2) 配列情報 SEQ ID NO:9: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 43 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: cDNA (iii) ハイポセティカル: NO (vi) 起源: (A) 生物名: PCR PRIMER (vii) 直接の起源: (B) クローン名: ヒト IGG1/FC 5' PRIMER (xi) 配列: SEQ ID NO:9: TATTAATCAT TCAGTAGGGC CCAGATCTTG TGACAAAACT CAC 43
【０１５２】(2) 配列情報 SEQ ID NO:10: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: cDNA (iii) ハイポセティカル: NO (iv) アンチセンス: NO (vi) 起源: (A) 生物名: PCR PRIMER (vii) 直接の起源: (B) クローン名: ヒト IGG1/FC 3' DOWNSTREAM PRIMER (xi) 配列: SEQ ID NO:10: GCCAGCTTAA CTAGTTCATT TACCCGGAGA CAGGGAGA 38
【０１５３】(2) 配列情報 SEQ ID NO:11: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 840 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: cDNA (iii) ハイポセティカル: NO (iv) アンチセンス: NO (vi) 起源: (A) 生物名: ヒト (vii) 直接の起源: (B) クローン名: CD40-L (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: CDS (B) 存在位置: 46..831 (xi) 配列: SEQ ID NO:11: TGCCACCTTC TCTGCCAGAA GATACCATTT CAACTTTAAC ACAGC ATG ATC GAA 54 Met Ile Glu 1 ACA TAC AAC CAA ACT TCT CCC CGA TCT GCG GCC ACT GGA CTG CCC ATC 102 Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly Leu Pro Ile 5 10 15 AGC ATG AAA ATT TTT ATG TAT TTA CTT ACT GTT TTT CTT ATC ACC CAG 150 Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu Ile Thr Gln 20 25 30 35 ATG ATT GGG TCA GCA CTT TTT GCT GTG TAT CTT CAT AGA AGG TTG GAC 198 Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg Arg Leu Asp 40 45 50 AAG ATA GAA GAT GAA AGG AAT CTT CAT GAA GAT TTT GTA TTC ATG AAA 246 Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys 55 60 65 ACG ATA CAG AGA TGC AAC ACA GGA GAA AGA TCC TTA TCC TTA CTG AAC 294 Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn 70 75 80 TGT GAG GAG ATT AAA AGC CAG TTT GAA GGC TTT GTG AAG GAT ATA ATG 342 Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys Asp Ile Met 85 90 95 TTA AAC AAA GAG GAG ACG AAG AAA GAA AAC AGC TTT GAA ATG CAA AAA 390 Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys 100 105 110 115 GGT GAT CAG AAT CCT CAA ATT GCG GCA CAT GTC ATA AGT GAG GCC AGC 438 Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser 120 125 130 AGT AAA ACA ACA TCT GTG TTA CAG TGG GCT GAA AAA GGA TAC TAC ACC 486 Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr 135 140 145 ATG AGC AAC AAC TTG GTA ACC CTG GAA AAT GGG AAA CAG CTG ACC GTT 534 Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val 150 155 160 AAA AGA CAA GGA CTC TAT TAT ATC TAT GCC CAA GTC ACC TTC TGT TCC 582 Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser 165 170 175 AAT CGG GAA GCT TCG AGT CAA GCT CCA TTT ATA GCC AGC CTC TGC CTA 630 Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu 180 185 190 195 AAG TCC CCC GGT AGA TTC GAG AGA ATC TTA CTC AGA GCT GCA AAT ACC 678 Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr 200 205 210 CAC AGT TCC GCC AAA CCT TGC GGG CAA CAA TCC ATT CAC TTG GGA GGA 726 His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly 215 220 225 GTA TTT GAA TTG CAA CCA GGT GCT TCG GTG TTT GTC AAT GTG ACT GAT 774 Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp 230 235 240 CCA AGC CAA GTG AGC CAT GGC ACT GGC TTC ACG TCC TTT GGC TTA CTC 822 Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu 245 250 255 AAA CTC TGAACAGTGT CA 840 Lys Leu 260
【０１５４】(2) 配列情報 SEQ ID NO:12: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 261 アミノ酸 (B) 型: アミノ酸 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: タンパク質 (xi) 配列: SEQ ID NO:12: Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 95 Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln 145 150 155 160 Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn 225 230 235 240 Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260
【０１５５】(2) 配列情報 SEQ ID NO:13: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 73 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: cDNA to mRNA (iii) ハイポセティカル: NO (iv) アンチセンス: NO (xi) 配列: SEQ ID NO:13: TGGTGGCGGA GGGTCAGGCG GAGGTGGGTC CGGAGGCGGG GGTTCAAGTT CTGACAAGAT 60 AGAAGATGAA AGG 73
【０１５６】(2) 配列情報 SEQ ID NO:14: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 21 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: cDNA (iii) ハイポセティカル: NO (iv) アンチセンス: NO (xi) 配列: SEQ ID NO:14: GGCCGCTCAG AGTTTGAGTA A 21
【０１５７】(2) 配列情報 SEQ ID NO:15: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 1425 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: cDNA to mRNA (iii) ハイポセティカル: NO (iv) アンチセンス: NO (vii) 直接の起源: (B) クローン名: ヒト CD40-L/FC2 (soluble CD40-L) (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: CDS (B) 存在位置: 4..1422 (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: mat ペプチド (B) 存在位置: 79..1422 (ix) 特徴: (A) NAME/KEY: sig ペプチド (B) 存在位置: 4..78 (xi) 配列: SEQ ID NO:15: TAT ATG TTC CAT GTT TCT TTT AGA TAT ATC TTT GGA ATT CCT CCA CTG 48 Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu -25 -20 -15 ATC CTT GTT CTG CTG CCT GTC ACT AGC TCT GAC TAC AAA GAT GAC GAT 96 Ile Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp -10 -5 1 5 GAT AAA AGA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA 144 Asp Lys Arg Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 10 15 20 CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC 192 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 25 30 35 AAG GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG 240 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 40 45 50 GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG 288 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 55 60 65 70 GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG 336 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 75 80 85 TAC AAC AGC ACG TAC CGG GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG 384 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 90 95 100 GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC 432 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 105 110 115 CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC 480 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 120 125 130 CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC 528 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 135 140 145 150 AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC 576 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 155 160 165 GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC 624 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 170 175 180 AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC 672 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 185 190 195 AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC 720 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 200 205 210 TCA TGC TCC GTG ATG CAT GGT GGC GGA GGG TCA GGC GGA GGT GGG TCC 768 Ser Cys Ser Val Met His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 215 220 225 230 GGA GGC GGG GGT TCA AGT TCT GAC AAG ATA GAA GAT GAA AGG AAT CTT 816 Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu 235 240 245 CAT GAA GAT TTT GTA TTC ATG AAA ACG ATA CAG AGA TGC AAC ACA GGA 864 His Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly 250 255 260 GAA AGA TCC TTA TCC TTA CTG AAC TGT GAG GAG ATT AAA AGC CAG TTT 912 Glu Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe 265 270 275 GAA GGC TTT GTG AAG GAT ATA ATG TTA AAC AAA GAG GAG ACG AAG AAA 960 Glu Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys 280 285 290 GAA AAC AGC TTT GAA ATG CAA AAA GGT GAT CAG AAT CCT CAA ATT GCG 1008 Glu Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala 295 300 305 310 GCA CAT GTC ATA AGT GAG GCC AGC AGT AAA ACA ACA TCT GTG TTA CAG 1056 Ala His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln 315 320 325 TGG GCT GAA AAA GGA TAC TAC ACC ATG AGC AAC AAC TTG GTA ACC CTG 1104 Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu 330 335 340 GAA AAT GGG AAA CAG CTG ACC GTT AAA AGA CAA GGA CTC TAT TAT ATC 1152 Glu Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile 345 350 355 TAT GCC CAA GTC ACC TTC TGT TCC AAT CGG GAA GCT TCG AGT CAA GCT 1200 Tyr Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala 360 365 370 CCA TTT ATA GCC AGC CTC TGC CTA AAG TCC CCC GGT AGA TTC GAG AGA 1248 Pro Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg 375 380 385 390 ATC TTA CTC AGA GCT GCA AAT ACC CAC AGT TCC GCC AAA CCT TGC GGG 1296 Ile Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly 395 400 405 CAA CAA TCC ATT CAC TTG GGA GGA GTA TTT GAA TTG CAA CCA GGT GCT 1344 Gln Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala 410 415 420 TCG GTG TTT GTC AAT GTG ACT GAT CCA AGC CAA GTG AGC CAT GGC ACT 1392 Ser Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr 425 430 435 GGC TTC ACG TCC TTT GGC TTA CTC AAA CTC TGA 1425 Gly Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 440 445
【０１５８】(2) 配列情報 SEQ ID NO:16: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 473 アミノ酸 (B) 型: アミノ酸 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: タンパク質 (xi) 配列: SEQ ID NO:16: Met Phe His Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Ile Pro Pro Leu Ile -25 -20 -15 -10 Leu Val Leu Leu Pro Val Thr Ser Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp -5 1 5 Lys Arg Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 10 15 20 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 25 30 35 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 40 45 50 55 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 60 65 70 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 75 80 85 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 90 95 100 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 105 110 115 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 120 125 130 135 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 140 145 150 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 155 160 165 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 170 175 180 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 185 190 195 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 200 205 210 215 Cys Ser Val Met His Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 220 225 230 Gly Gly Gly Ser Ser Ser Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His 235 240 245 Glu Asp Phe Val Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu 250 255 260 Arg Ser Leu Ser Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu 265 270 275 Gly Phe Val Lys Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu 280 285 290 295 Asn Ser Phe Glu Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala 300 305 310 His Val Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp 315 320 325 Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu 330 335 340 Asn Gly Lys Gln Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr 345 350 355 Ala Gln Val Thr Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro 360 365 370 375 Phe Ile Ala Ser Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile 380 385 390 Leu Leu Arg Ala Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln 395 400 405 Gln Ser Ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser 410 415 420 Val Phe Val Asn Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly 425 430 435 Phe Thr Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 440 445
【０１５９】(2) 配列情報 SEQ ID NO:17: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 33 アミノ酸 (B) 型: アミノ酸 (D) トポロジー: 直鎖状 (ii) 配列の種類: ペプチド (xi) 配列: SEQ ID NO:17: Arg Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys Ile Glu Glu Ile Leu Ser Lys Ile 1 5 10 15 Tyr His Ile Glu Asn Glu Ile Ala Arg Ile Lys Lys Leu Ile Gly Glu 20 25 30 Arg
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、マウスＣＤ４０−Ｌに対応するヌクレ
オチド及びアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、そ
の細胞内ドメインとしてそのＮ−末端、それに続く膜貫
通領域、及び該ポリペプチドのＣ−末端において細胞外
ドメインを有するタイプIIポリペプチドである。細胞内
ドメイン及び膜貫通領域のいずれよりも長い細胞外ドメ
インは、１つのＮ結合グリコシル化部位及び４つのシス
テイン（Ｃｙｓ）残基から見て２つのジスルフィド結合
を含有し得る。
【図２】図２は、ヒトＣＤ４０−Ｌに対応するヌクレオ
チド及びアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、その
細胞内ドメインとしてそのＮ−末端、それに続く膜貫通
領域、及び該ポリペプチドのＣ−末端において細胞外ド
メインを有するタイプIIポリペプチドである。細胞内ド
メイン及び膜貫通領域のいずれよりも長い細胞外ドメイ
ンは、１つのＮ結合グリコシル化部位及び５つのシステ
イン（Ｃｙｓ）残基から見て２つのジスルフィド結合を
含有し得る。
【図３】図３は、アミノ酸レベルで７7.７％相同性を示
すヒト及びマウスＣＤ４０−Ｌのタンパク質配列の比較
を示す。
【図４】図４は、完全長マウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡ
（配列番号：１）で形質移入したＣＶ１細胞と共にイン
キュベーションすることによって生じたＴ細胞除去ヒト
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を示す。このＣＶ１
細胞は、空ベクター（ＨＡＶＥＯ）で形質移入したＣＶ
１細胞と比較した場合に結合型ＣＤ４０−Ｌ（ＣＤ４０
−Ｌ+ ＣＶ１細胞）を発現するが結合型マウスＣＤ４０
−Ｌを発現しない。７日増殖結果は、ＣＤ４０−Ｌ+ Ｃ
Ｖ１細胞が、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在
下又は不存在下で、Ｔ細胞除去ＰＢＭＣの増殖を有意に
高めることを示している。
【図５】図５は、結合型マウスＣＤ４０−Ｌ及び１０ｎ
ｇ／ｍｌのＩＬ−４を添加したＴ細胞除去ＰＢＭＣ増殖
の二次測定値を示す。これらデータは、ＩＬ−４は協同
分裂促進作用 (co-mitogenic effect) がないが、結合
型ＣＤ４０−Ｌは強力な分裂促進作用を維持することを
示している。
【図６】図６は、結合型ＣＤ４０−ＬがＩｇＥ分泌を増
加させることを示す。
【図７】図７は、ＩＬ−４の存在下で膜結合ＣＤ４０−
ＬがＣＤ２３脱落を刺激することを示す。
【図８】図８は、膜結合マウスＣＤ４０−Ｌ又はヘルパ
ーＴ細胞クローンである７Ａ１細胞により生ずるマウス
脾臓Ｂ細胞の増殖を示す。
【図９】図９は、抗ヒツジ赤血球（ＳＣＢＣ）によるプ
ラーク形成細胞（ＰＦＣ）により示される抗原特異性応
答の誘発についてのマウスＥＬ−４0.９細胞、つまりマ
ウスＣＤ４０−Ｌの発現に基づいて選別した選別細胞系
とＴ細胞７Ａ１との比較を示す。
【図１０】図１０は、膜結合ＣＤ４０−Ｌと、異なるｃ
ＤＮＡで形質移入された他の細胞タイプとのＢ細胞増殖
活性の比較を示す。膜結合ＣＤ４０−Ｌは、ヘルパー細
胞クローン又は他のコントロール細胞よりも有意に大き
いＢ細胞増殖活性を示した。
【図１１】図１１は、７Ｃ２細胞（ヘルパーＴ細胞クロ
ーン）及びマウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡで形質移入され
たＣＶ１細胞が、抗ＳＣＢＣプラーク形成細胞を誘発す
ることを示す。
【図１２】図１２は、マウスＢ細胞増殖の誘発について
の、２つのヘルパーＴ細胞クローンと膜結合ＣＤ４０−
Ｌを発現する細胞との比較を示す。
【図１３】図１３は、添加したインターロイキン−２
（ＩＬ−２）の存在下又は不存在下での膜結合ＣＤ４０
−Ｌ及びヘルパーＴ細胞クローンによる抗原特異性プラ
ーク形成細胞の誘発を示す。
【図１４】図１４は、Ｂ細胞増殖及びＩｇＥ分泌を刺激
する膜結合ＣＤ４０−Ｌの作用を示す。膜結合ＣＤ４０
−Ｌの作用はＴＮＦレセプターによってではなくＣＤ４
０レセプターによって阻害された。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＣ 39/395 ＡＢＥ Ｃ０７Ｋ 16/24 ＡＢＦ // Ｃ１２Ｎ 5/10 ＡＢＪ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ファンスロウ，ウィリアム・シー アメリカ合衆国ワシントン州98023，フ ェデラル・ウェイ，トゥエンティセカン ド・アベニュー・サウスウエスト 32204 (72)発明者 スプリッグス，メラニー・ケイ アメリカ合衆国ワシントン州98119，シ アトル，トゥエルブス・アベニュー・ウ エスト 2256 (72)発明者 スリニヴァッサン，サブハッシニ アメリカ合衆国ワシントン州98034，カ ークランド，ノースイースト・ハンドレ ッドトゥエンティナインス・ストリート 11325 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ＣＤ４０−ＬまたはＣＤ４０−Ｌ免疫原と
    免疫反応性の抗体。
  2. 【請求項２】モノクローナル抗体である、請求項１に記
    載の抗体。
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