PL232477B1 - System ekspresji gospodarza i sposób wytwarzania heteromerycznego kompleksu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Wynalazek odnosi się do ogólnej dziedziny rekombinacyjnej ekspresji polipeptydów w hodowli komórek zwierzęcych. W szczególności, wynalazek dotyczy systemu ekspresji gospodarza i sposobu wytwarzania heteromerycznego kompleksu obejmującego prowadzenie hodowli komórki gospodarza w warunkach, w których następuje ekspresja heteromerycznego kompleksu w komórce gospodarza.

Stan techniki

Wiele gospodarczo ważnych białek wytwarza się w komórkach modyfikowanych metodami inżynierii rekombinacyjnej, które są przystosowane do długoterminowego wzrostu w hodowli. Często białka ulegają ekspresji w postaci pojedynczego łańcucha polipeptydowego. W takich komórkach ulega ekspresji także wiele polipeptydów heterologicznych, które mogą ulegać asocjacji, tworząc heteromeryczne kompleksy, takie jak przykładowo przeciwciało, które powstaje w wyniku ekspresji równych części ciężkich łańcuchów i lekkich łańcuchów.

Jedną z trudności napotykanych przy prowadzeniu ekspresji heteromerycznych kompleksów w komórkach stanowi wytworzenie właściwych ilości każdego z rekombinacyjnych polipeptydów stanowiących składową danego kompleksu. Przykładowo, przy ekspresji przeciwciała często albo ciężki łańcuch albo lekki łańcuch ulega ekspresji na względnie wysokim poziomie względem odnośnego partnera; jednakże, otrzymanie linii komórkowej wykazującej ekspresję obu łańcuchów na wysokim poziomie i w przybliżeniu w równych ilościach jest trudne.

Trudności te skutkują dodatkowymi etapami, jak również powtarzaniem etapów w procesie generowania linii komórkowych wykazujących ekspresję rekombinacyjnych polipeptydów, co powoduje opóźnienia, które także istotnie zwiększają koszty związane z rekombinacyjną ekspresją polipeptydów. Zatem, w stanie techniki istnieje zapotrzebowanie na prostsze sposoby selekcjonowania pod kątem wysokiego poziomu ekspresji polipeptydów w hodowlach komórkowych, tak aby zwiększyć produkcję polipeptydów, a przez to obniżyć nakłady kosztowe i czasowe niezbędne do selekcji komórek wykazujących ekspresję takich polipeptydów. Niniejszy wynalazek zaspokaja to zapotrzebowanie poprzez zapewnienie ulepszonego sposobu selekcji komórek wykazujących ekspresję polipeptydów.

Podsumowanie wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest system ekspresji gospodarza obejmujący komórkę gospodarza, którą zmodyfikowano genetycznie w celu ekspresji pierwszego wektora kodującego transkrypt obejmujący pierwszą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą pierwszy ciężki łańcuch immunoglobulinowy lub lekki łańcuch immunoglobulinowy, przy czym transkrypcja wspomnianej pierwszej sekwencji kwasu nukleinowego jest indukowana równocześnie z transkrypcją drugiej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej pierwszą podjednostkę reduktazy dihydrofolianowej, oraz drugiego wektora kodującego transkrypt obejmujący trzecią sekwencję kwasu nukleinowego kodującą drugi ciężki łańcuch immunoglobulinowy lub lekki łańcuch immunoglobulinowy, który asocjuje z pierwszym ciężkim łańcuchem immunoglobulinowym lub lekkim łańcuchem immunoglobulinowym dla tworzenia kompleksu heteromerycznego, przy czym transkrypcja wspomnianej trzeciej sekwencji kwasu nukleinowego jest indukowana równocześnie z transkrypcją czwartej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej drugą podjednostkę reduktazy dihydrofolianowej, i przy czym wspomniane pierwsza i druga podjednostka reduktazy dihydrofolianowej asocjują dostarczając aktywność reduktazy dihydrofolianowej, przy czym wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu występuje pomiędzy pierwszą sekwencją kwasu nukleinowego a drugą sekwencją kwasu nukleinowego, przy czym wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu występuje pomiędzy trzecią sekwencją kwasu nukleinowego a czwartą sekwencją kwasu nukleinowego, a kompleksem heteromerycznym jest przeciwciało.

Korzystnie podjednostka reduktazy dihydrofolianowej markera jest polipeptydem fuzyjnym obejmującym domenę interakcyjną.

Korzystnie domena interakcyjna jest suwakiem leucynowym z polipeptydu wybranego z grupy obejmującej GCN4, C/EBP, c-Fos, c-Jun, c-Myc oraz c-Max.

Korzystnie dodatkowo koduje odmienny funkcjonalny marker selekcyjny wybrany z listy składającej się z zeomycyny, neomycyny, puromycyny, Blasticidin S oraz GPT.

Korzystnie komórka gospodarza jest wybrana z grupy składającej się z CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, linii komórkowej szpiczaka oraz komórek WI38.

Korzystnie obejmuje komórkę gospodarza, którą zmodyfikowano genetycznie dla ekspresji pierwszego wektora obejmującego pierwszą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą lekki łańcuch

PL 232 477 B1 immunoglobulinowy, przy czym transkrypcja wspomnianego lekkiego łańcucha jest indukowana równocześnie z transkrypcją drugiej sekwencji kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd fuzyjny pierwszej podjednostki reduktazy dihydrofolianowej połączonej z sekwencją dimeryzacji, oraz drug iego wektora obejmującego trzecią sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ciężki łańcuch immunoglobulinowy, przy czym transkrypcja wspomnianego ciężkiego łańcucha jest indukowana równocześnie z transkrypcją czwartej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd fuzyjny drugiej podjednostki reduktazy dihydrofolianowej połączonej z sekwencją dimeryzacji, przy czym każda podjednostka reduktazy dihydrofolianowej nie wykazuje aktywności reduktazy dihydrofolianowej przy ekspresji samodzielnej, a koekspresja pierwszej podjednostki reduktazy dihydrofolianowej z drugą podjednostką reduktazy dihydrofolianowej dostarcza aktywność reduktazy dihydrofolianowej.

Korzystnie jedną podjednostką reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) są aminokwasy 1-105 DHFR, a drugą podjednostką reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) są aminokwasy 106-187 DHFR.

Korzystnie sekwencja dimeryzacji połączona z podjednostką reduktazy dihydrofolianowej pochodzi z sekwencji suwaka leucynowego GCN4.

Korzystnie system ekspresji obejmuje komórkę gospodarza, którą zmodyfikowano genetycznie dla ekspresji pierwszego wektora kodującego transkrypt obejmujący pierwszą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ciężki łańcuch immunoglobulinowy, przy czym transkrypcja wspomnianej pierwszej sekwencji kwasu nukleinowego jest indukowana równocześnie z transkrypcją drugiej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej pierwszą podjednostkę reduktazy dihydrofolianowej, i drugiego wektora kodującego transkrypcję obejmującą trzecią sekwencję kwasu nukleinowego kodującą lekki łańcuch immunoglobulinowy, przy czym transkrypcja wspomnianej trzeciej sekwencji kwasu nukleinowego jest indukowana równocześnie z transkrypcją czwartej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej drugą podjednostkę reduktazy dihydrofolianowej, i przy czym wspomniane pierwsza i druga podjednostka reduktazy dihydrofolianowej asocjują dla dostarczenia aktywności reduktazy dihydrofolianowej.

Korzystnie podjednostka reduktazy dihydrofolianowej jest polipeptydem fuzyjnym obejmującym domenę interakcji.

Korzystnie domena interakcyjna jest suwakiem leucynowym z polipeptydu wybranego z grupy obejmującej GCN4, C/EBP, c-Fos, c-Jun, c-Myc oraz c-Max.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania heteromerycznego kompleksu obejmujący etap: prowadzenia hodowli komórki gospodarza wspomnianej powyżej w warunkach, w których następuje ekspresja heteromerycznego kompleksu w komórce gospodarza.

Korzystnie sposób obejmuje ponadto wyodrębnianie heteromerycznego kompleksu.

Zauważono, że wydajne wytwarzanie rekombinacyjnych heteromerycznych kompleksów w komórkach jest usprawnione, jeżeli każda składowa kompleksu ulega ekspresji w proporcjonalnych ilościach. I tak, niniejszym ujawnia się sposoby i kompozycje do selekcji komórek modyfikowanych metodami inżynierii rekombinacyjnej, które wykazują ekspresję więcej niż jednego polipeptydu, gdzie polipeptydy ulegają ekspresji w proporcjonalnych ilościach takich, że te polipeptydy mogą wydajnie ulegać asocjacji, tworząc heteromeryczny kompleks, oraz osiągana jest wyższa wydajność ekspresji.

Ujawniono przykładowo dwa wektory, przy czym każdy wektor obejmuje co najmniej dwie otwarte ramki odczytu, kodujące dwa różne polipeptydy. Przykładowo pierwszy wektor koduje pierwszy polipeptyd, który może ulegać asocjacji z odpowiednim pierwszym polipeptydem kodowanym przez drugi wektor, tworząc heteromeryczny kompleks. Ponadto, pierwszy wektor koduje drugi polipeptyd, który może ulegać asocjacji z odpowiednim drugim polipeptydem kodowanym przez drugi wektor, tworząc heteromeryczny kompleks wykazujący aktywność selekcyjną (umożliwiającą selekcję).

Ujawniono także izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, obejmującą pierwszy kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, przy czym ten pierwszy kwas nukleinowy jest połączony w sposób umożliwiający działanie z drugim kwasem nukleinowym, kodującym podjednostkę markera selekcyjnego, a wspomniana podjednostka lub podjednostki są zdolne do oddziaływania z inną podjednostką tego markera selekcyjnego, przez co zapewnia się aktywność selekcyjną.

Ujawniono także izolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, obejmującą pierwszy kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, przy czym ten pierwszy kwas nukleinowy jest połączony w sposób umożliwiający działanie z drugim kwasem nukleinowym kodującym podjednostkę markera selekcyjnego, a wspomniana podjednostka lub podjednostki są zdolne do oddziaływania z inną podjednostką tego markera selekcyjnego, przez co zapewnia się aktywność selekcyjną, a ponadto obejmującej trzeci kwas nukleinowy, kodujący polipeptyd zdolny do asocjacji z polipeptydem kodowanym przez pierwszy kwas nukleinowy z wytworzeniem heteromerycznego kompleksu, przy czym ten trzeci kwas nukleino4

PL 232 477 B1 wy jest połączony w sposób umożliwiający działanie z czwartym kwasem nukleinowym, kodującym co najmniej jedną podjednostkę markera selekcyjnego, a wspomniana podjednostka lub podjednostki są zdolne do asocjacji z podjednostką markera selekcyjnego polipeptydu kodowanego przez wspomniany drugi kwas nukleinowy, przez co zapewnia się aktywność selekcyjną.

Opisany powyżej heteromeryczny kompleks jest przeciwciałem, a opisany powyżej marker selekcyjny jest reduktazą dihydrofolianową, przy czym marker ten zgodnie z ujawnieniem może być wybrany z grupy obejmującej marker oporności na lek, metaboliczny marker przeżycia, marker barwny oraz marker fluorescencyjny.

Ujawniono także sposoby konstruowania cząsteczek kwasów nukleinowych, sposoby uzyskiwania komórek gospodarza wykazujących ekspresję kwasów nukleinowych, linie komórek gospodarza wykazujących ekspresję kwasów nukleinowych, a także sposoby wytwarzania i izolowania heteromerycznych kompleksów ulegających rekombinacyjnej ekspresji z kwasów nukleinowych w komórkach gospodarza.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 stanowi schematyczne przedstawienie wykorzystanych w przykładach konstruktów kwasu nukleinowego, z których każdy zawiera podjednostkę markera selekcyjnego i wykazuje ekspresję różnych polipeptydów, które mogą ulegać asocjacji, tworząc heteromeryczny kompleks w komórce. Zastosowane skróty mają następujące znaczenie: EASE - element sekwencji zwiększający ekspresję; CMV - promotor cytomegalowirusowy; HC - łańcuch ciężki; LC - łańcuch lekki; IRES - wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu; DHFR - reduktaza dihydrofolianowa, pA - sygnał poliadenylacji.

Szczegółowy opis

Wydajne wytwarzanie rekombinacyjnych heteromerycznych kompleksów w komórkach zwierzęcych jest usprawnione, jeżeli każda składowa kompleksu ulega ekspresji w proporcjonalnych i dużych ilościach. Przedmiotem niniejszego wynalazku są system ekspresji i sposób wytwarzania heteromerycznego kompleksu, które dzięki selekcji komórek modyfikowanych metodami inżynierii rekombinacyjnej wykazują ekspresję więcej niż jednego heterologicznego polipeptydu w proporcjonalnych ilościach, powodując iż polipeptydy mogą w sposób wydajny wchodzić w asocjacje, tworząc heteromeryczny kompleks, przy wyższym poziomie ekspresji niż w tradycyjnym wytwarzaniu heteromerycznych kompleksów. Niniejszy wynalazek jest również korzystny przez to, że skraca czas potrzebny do selekcji komórek wykazujących wysoki poziom ekspresji pożądanego rekombinacyjnego heteromerycznego kompleksu polipeptydowego.

W wynalazku wykorzystuje się marker selekcyjny, który może występować w postaci dwóch lub więcej niż dwóch podjednostek, które przy jednoczesnej ekspresji będą oddziaływać na siebie wzajemnie, zapewniając w ten sposób aktywność selekcyjną. Same indywidualne podjednostki nie wykazują znaczącej aktywności selekcyjnej, ale zapewniają aktywność selekcyjną, gdy ulegają jednoczesnej ekspresji z odpowiednią drugą podjednostką. Optymalna aktywność tych podjednostek może zależeć od ich oddziaływań wzajemnych i jako taka może być ułatwiona przez domeny interakcji. Takie domeny interakcji mogą być endogenne względem podjednostki lub heterologiczne względem podjednostki.

Cząsteczki kwasu nukleinowego są konstruowane tak, że kodują polipeptyd i podjednostkę markera selekcyjnego, ułożone tak, że ekspresja podjednostki jest skorelowana z ekspresją polipeptydu. Kiedy więc cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące obie podjednostki ulegają transfekcji do komórek i zastosuje się warunki selekcyjne, w przybliżeniu równy i wysoki poziom ekspresji każdej podjednostki zapewnia najwyższą aktywność selekcyjną. Ponadto, połączone w sposób umożliwiający działanie polipeptydy będą ulegać ekspresji w niemal równych i dużych ilościach, zapewnia się zatem optymalizację selekcji komórek wykazujących ekspresję pożądanych polipeptydów na równym i wysokim poziomie.

Wykorzystywać można dwie podjednostki markera selekcyjnego, z których każda ulega ekspresji jako białko fuzyjne z domeną interakcji. Podczas ekspresji domena interakcji wzmacnia asocjację lub dimeryzację obu podjednostek, tym samym umożliwiając tym podjednostkom funkcjonowanie i aktywność selekcyjną (na przykład, lecz nie wyłącznie, aktywność opisaną przez Pelletier i wsp., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci., 95:12141-12146).

Możliwe jest również zastosowanie trzech podjednostek markera selekcyjnego, z których każda ulega ekspresji jako białko fuzyjne do domeny interakcji, zwiększając w ten sposób asocjację, co zapewnia aktywność selekcyjną. Wówczas kompleks heteromeryczny ma trzy składowe. W ulegającym ekspresji wektorze lub wektorach sekwencje kodujące każdej z tych trzech składowych są połączone w sposób umożliwiający działanie z sekwencjami kodującymi każdą odpowiednią podjednostkę marPL 232 477 B1 kera selekcyjnego, na przykład z przeciwciałem bispecyficznym wykazującym ekspresję pojedynczego łańcucha ciężkiego i dwóch różnych łańcuchów lekkich, przy czym oba łańcuchy lekkie są zdolne do asocjacji z łańcuchem ciężkim. Możliwe jest zastosowanie znanych markerów selekcyjnych lub markerów, które dopiero zostaną ujawnione, zawierających cztery lub nawet więcej podjednostek.

Jak to zostanie przedstawione w przykładach, odkryto, że sposoby i kompozycje, które skracają czas niezbędny do selekcjonowania pożądanych komórek, wykazujących wysoki poziom ekspresji pojedynczego polipeptydu. Jak zostało ujawnione, możliwe jest także selekcjonowanie komórek wykazujących wysoki poziom ekspresji polipeptydów rekombinacyjnych.

W niektórych postaciach wykonania kwasy nukleinowe kodujące podjednostki markera selekcyjnego poddaje się fuzji w ramce z kwasem nukleinowym kodującym linker, który następnie poddaje się fuzji w ramce z kwasem nukleinowym kodującym domenę interakcji. Linkery mogą obejmować dowolną stosunkowo krótką giętką sekwencję, która umożliwia interakcję domeny interakcji i działanie podjednostek, zapewniające aktywność selekcyjną. W stanie techniki znanych jest wiele przykładów linkerów; mogą one obejmować GGPGG, GPGGG, w których zgodnie z jednoliterow ym kodem aminokwasów G oznacza glicynę, a P - prolinę. W jednej z postaci wykonania linkerem jest GGGGSGGGGGS (Curtis i wsp., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88(13):5809-5813).

Domena interakcji jest to domena obejmująca - lecz nie wyłącznie - polipeptydy zdolne do ułatwiania oddziaływania lub asocjacji dwóch lub więcej niż dwóch polipeptydów homologicznych lub heterologicznych. W rozumieniu niniejszego opisu określenie „asocjacja” lub „interakcja/oddziaływanie” oznaczają zależności między co najmniej dwiema cząsteczkami, w których jedna cząsteczka wiąże się z innymi i(lub) wpływa na aktywność innych cząsteczek. Oddziaływanie może obejmować bezpośrednie lub pośrednie wiązanie dwóch polipeptydów (lub polipeptydu i kwasu nukleinowego) bądź funkcyjną aktywację lub hamowanie aktywności cząsteczki przez inną cząsteczkę.

Ujawniono, iż domena interakcji może być domeną dimeryzacji. Domena dimeryzacji może być polipeptydem zdolnym do indukowania oddziaływania lub asocjacji dwóch polipeptydów. Występują dwa rodzaje dimerów: dimery zdolne do tworzenia homodimerów (z tą samą sekwencją) i dimery zdolne do tworzenia heterodimerów (z innymi sekwencjami).

Domeną interakcji może być zatem polipeptyd przyjmujący formę zwojów zwiniętych tak, jak w suwaku leucynowym. Suwak leucynowy typowo obejmuje około 35 aminokwasów, zawierających charakterystyczne siedem powtórzeń reszt z resztami hydrofobowymi w pierwszym i czwartym aminokwasie w powtórzeniu (Harbury i wsp., (1993) Science 262:1401). Suwak leucynowy jest zatem podatny na fuzję z polipeptydem i nadaje się do stosowania w celu oligomeryzacji polipeptydu, ponieważ jest małą cząsteczką i z mniejszym prawdopodobieństwem zaburzy normalną funkcję polipeptydu, niż by to mogła uczynić większa domena interakcji. Przykłady suwaków leucynowych obejmują (lecz nie wyłącznie) domeny suwaka leucynowego pochodzące z polipeptydów takich, jak GCN4, C/EBP, c-Fos, c-Jun, c-Myc i c-Max.

Dodatkowe przykłady domen dimeryzacji obejmują domeny helisa-pętla-helisa (Murre i wsp., (1989) Celi 58:537-544). Domeny dimeryzacji z tym motywem posiadają: receptor kwasu retinowego, receptor hormonu tarczycy, inne receptory jądrowe hormonów (Kurokawa i wsp., (1993) Genes Dev. 7:1423-1435) oraz czynniki transkrypcji drożdży GAL4 i HAP1 (Marmonstein i wsp., (1992) Nature 356:408-414; Zhang i wsp., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2851-2855; patent Stanów Zjednoczonych nr 5,624,818).

Domena interakcji może być również domeną tetrameryzacji, która jest polipeptydem zdolnym do związania trzech innych domen tetrameryzacji z wytworzeniem tetramerycznego kompleksu. Przykłady białek zawierających domeny tetrameryzacji obejmują między innymi: represor laktozy E. coli (aminokwasy 46-360; Chakerian i wsp., (1991) J. Biol. Chem. 266:1371; Alberti i wsp., (1993) EMBO J. 12:3227 i Lewis i wsp., (1996) Nature 271:1247) i domenę tetrameryzacji p53 w resztach 322-355 (Clore i wsp., (1994) Science 265:386; Harbury i wsp., (1993) Science 262:1401; patent Stanów Zjednoczonych nr 5,573,925).

Jak ujawniono dwie podjednostki ulegają ekspresji z dwóch wektorów, przy czym pierwszy wektor obejmuje pierwszy kwas nukleinowy kodujący pierwszą podjednostkę polipeptydu, a kwas nukleinowy jest połączony w sposób umożliwiający działanie z drugim kwasem nukleinowym, kodującym podjednostkę markera selekcyjnego. Drugi wektor obejmuje trzeci kwas nukleinowy, kodujący polipeptyd zdolny do asocjacji z polipeptydem kodowanym przez pierwszy kwas nukleinowy, przy czym trzeci kwas nukleinowy jest połączony w sposób umożliwiający działanie z czwartym kwasem nukleinowym, kodującym inną jednostkę markera selekcyjnego. Oba wektory są zatem jednocześnie transfekowane

PL 232 477 B1 do populacji komórek i prowadzona jest selekcja pod kątem ekspresji markera selekcyjnego (złożonego z dwóch podjednostek).

Niniejszym ujawnia się także kwas nukleinowy kodujący oprócz podjednostki markera selekcyjnego i polipeptydu heteromerycznego kompleksu inny funkcjonalny marker selekcyjny. Określenie „inny funkcjonalny marker selekcyjny” nie jest podjednostką markera selekcyjnego, lecz jest białkiem wykazującym w pełni funkcjonalną aktywność selekcyjną. Jako inny funkcjonalny marker selekcyjny można stosować dobrze znane markery, takie jak zeomycyna, neomycyna, puromycyna, Blasticidin S lub GPT, który nadaje oporność na kwas mykofenolowy itp. Jak ujawniono możliwe są dwa wektory, przy czym każdy wektor obejmuje pierwszy kwas nukleinowy kodujący polipeptyd, który może tworzyć heteromeryczny kompleks, połączony w sposób umożliwiający działanie z drugim kwasem nukleinowym, kodującym co najmniej jedną podjednostkę markera selekcyjnego, jak również kwas nukleinowy kodujący inny funkcjonalny marker selekcyjny. Ponadto, odpowiednie polipeptydy kodowane przez pierwszy kwas nukleinowy każdego wektora mogą wchodzić w asocjację, tworząc kompleks; podjednostka lub podjednostki kodowane przez drugi kwas nukleinowy każdego wektora mogą wchodzić w asocjację, zapewniając aktywność selekcyjną, polipeptydy kodowane przez trzecie kwasy nukleinowe zapewniają zaś aktywność selekcyjną różną od aktywności selekcyjnej nadawanej przez podjednostki kodowane przez drugie kwasy nukleinowe. Pierwszy wektor może na przykład kodować oporność na neomycynę, a drugi wektor może kodować oporność na zeomycynę, lub tylko jeden wektor może zawierać dodatkowy, inny funkcjonalny marker selekcyjny. Jeden wektor jest zatem transfekowany do linii komórkowej i dokonywana jest selekcja (na przykład do komórek opornych na neomycynę dodaje się lek G418). Po selekcji można zastosować konwencjonalne metody do oznaczenia obecności wektora i poziomu ekspresji polipeptydów kodowanych przez kwasy nukleinowe w wektorze, na przykład przez zastosowanie metody PCR, metody Southern blot, metody ELISA, metody Western blot i podobnych metod. Po uzyskaniu wysokiego poziomu ekspresji do linii komórkowej transfekowany jest drugi wektor. Utrzymując warunki selekcji pierwszego wektora dokonuje się selekcji pod kątem drugiego markera selekcyjnego (to znaczy oporności na zeomycynę) i dokonuje się oceny pod kątem obecności drugiego wektora i ekspresji białek kodowanych przez odpowiednie wektory. W tej postaci wykonania, po ustaleniu, że oba wektory są obecne, stosuje się selekcję pod kątem ekspresji podjednostek, które uległy asocjacji w komórce, zapewniając aktywność selekcyjną, na przykład aktywność reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), jak opisano powyżej.

Ujawniono także, iż oba kwasy nukleinowe, kodujące niezależnie aktywności selekcyjne, mogą być równocześnie transfekowane i jednocześnie stosuje się selekcję. Po ustaleniu, że obecne są oba wektory, stosuje się selekcję pod kątem ekspresji podjednostek, które po asocjacji w komórce zapewniają aktywność selekcyjną, na przykład aktywność reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), jak opisano powyżej.

Ujawniono również, że możliwe jest aby każdy z wektorów kodujących niezależne aktywności selekcyjne, był transfekowany do odrębnej linii komórkowej. Po zastosowaniu selekcji i zidentyfikowaniu klonów, które wykazują wysoki poziom ekspresji białek kodowanych przez każdy pożądany wektor, komórki poddaje się fuzji w sposób opisany przez Hori i wsp. (patent Stanów Zjednoczonych nr 5,916,771). Po zakończeniu fuzji stosuje się selekcję pod kątem aktywności selekcyjnej zapewnianej przez podjednostki.

Ujawniono także, iż kwasy nukleinowe, opcjonalnie niewykazujące niezależnej aktywności selekcyjnej, można transfekować równocześnie trzecim wektorem. Trzeci wektor koduje odrębną aktywność selekcyjną, taką jak na przykład oporność na neomycynę lub beta-galaktozydazę, co może pozwalać na wstępną selekcję komórek skutecznie transfekowanych. Po przeprowadzeniu tej wstępnej selekcji można zastosować selekcję pod kątem aktywności selekcyjnej podjednostek, na przykład DHFR. Wówczas transfekowane są równe ilości dwóch wektorów ekspresji, podczas gdy trzeci wektor jest transfekowany w stężeniu stanowiącym 1/3 stężenia pierwszych dwóch wektorów (na przykład w proporcji 3:3:1). Znawca z dziedziny będzie zdawał sobie sprawę z tego, że różne odstępstwa od tych proporcji są możliwe.

Kwasy nukleinowe kodujące składową pożądanego heteromerycznego kompleksu mogą być otrzymane w postaci cDNA lub genomowego DNA sposobami znanymi w stanie techniki. mRNA kodujący pożądaną składową można na przykład izolować z odpowiedniego źródła z zastosowaniem standardowych metod izolowania RNA, a także z zastosowaniem chromatografii na oligo(dT)-celulozie w celu rozdzielenia mRNA poli-A. Jeżeli heteromerycznym kompleksem przewidzianym do ekspresji jest przeciwciało, odpowiednie źródła pożądanych kwasów nukleinowych można izolować z dojrzał ych

PL 232 477 B1 komórek B lub z hodowli hybrydom. Ponadto kwasy nukleinowe do stosowania można wytwarzać metodą syntezy chemicznej.

Przez określenie „heteromeryczny kompleks” rozumie się kompleks cząsteczkowy, utworzony w wyniku asocjacji co najmniej dwóch różnych cząsteczek. Asocjacja może być oddziaływaniem niekowalencyjnym lub przyłączeniem kowalencyjnym, na przykład przez wiązania dwusiarczkowe. Dwie różne cząsteczki są typowo dwoma różnymi polipeptydami, jednakże zakres wynalazku obejmuje heteromeryczne kompleksy między polipeptydami a kwasami nukleinowymi oraz między różnymi kwasami nukleinowymi. W jednej z postaci wykonania heteromeryczny kompleks zapewnia aktywność funkcjonalną taką, jak zdolność do wiązania substratu (na przykład immunoglobulina zdolna do wiązania odpowiedniego antygenu), aktywność enzymatyczną lub tym podobne. W jednej z postaci wykonania kompleks heteromeryczny według wynalazku jest wydzielany do pożywki hodowli komórek gospodarza, w których jest wytwarzany.

Heteromeryczny kompleks według wynalazku jest cząsteczką immunoglobuliny. Immunoglobulina w układach kręgowców jest przeciwciałem złożonym z dwóch identycznych łańcuchów lekkich i dwóch identycznych łańcuchów ciężkich. Te cztery łańcuchy są połączone razem wiązaniami dwusiarczkowymi tak, że każdy łańcuch lekki jest połączony z łańcuchem ciężkim, a łańcuchy ciężkie są powiązane poprzecznie ze sobą swymi końcami, razem tworząc heteromeryczny kompleks w kształcie litery „Y”. Jest znanych wiele metod, którymi można poddawać manipulacji DNA kodujący cząsteczki immunoglobuliny z wytworzeniem DNA zdolnych do kodowania rekombinacyjnych białek, takich jak przeciwciała o zwiększonej aktywności lub inne polipeptydy oparte na przeciwciele (patrz na przykład Larrick i wsp., (1989), Biotechnology 7:934-938; Reichmann i wsp., (1988), Nature 332:323-327; Roberts i wsp., (1987), Nature 328:731-734; Verhoeyen i wsp., (1988), Science 239:1534-1536; Chaudhary i wsp., (1989), Nature 339:394-397).

Jak ujawniono można wykorzystywać rekombinowane komórki, wytwarzające w pełni ludzkie przeciwciała (na przykład przeciwciała, które wytwarza się, stosując biblioteki przeciwciał i(lub) zwierzęta transgeniczne i ewentualnie dalej modyfikuje się je in vitro), jak również przeciwciała humanizowane. Patrz na przykład Cabilly i wsp., patent Stanów Zjednoczonych nr 4,816,567; Cabilly i wsp., patent europejski nr 0,125,023 B1; Boss i wsp., patent Stanów Zjednoczonych nr 4,816,397; Boss i wsp., patent europejski nr 0,120,694 B1; Neuberger, M. S. i wsp., WO 86/01533; Neuberger, M. S. i wsp., patent europejski nr 0,194,276 B1; Winter, patent Stanów Zjednoczonych nr 5,225,539; Winter, patent europejski nr 0,239,400 B1; Queen i wsp., patent europejski nr 0,451,216 B1; i Padlan i wsp., patent europejski nr 0,519,596 A1. Mając na względzie powyższe niniejszy wynalazek może na przykład znaleźć zastosowanie w celu indukowania ekspresji przeciwciał ludzkich i(lub) humanizowanych, które immunoswoiście rozpoznają swoiste cele komórkowe, takie jak na przykład receptor ludzkiego EGF, antygen her-2/neu, antygen CEA, antygen błonowy swoisty dla gruczołu krokowego (PSMA), CD5, CD11a, CD18, NGF, CD20, CD45, Ep-cam, inne cząsteczki powierzchniowe komórek nowotworowych, TNF-alfa, TGF-b1, VEGF, inne cytokiny, integryna alfa 4 beta 7, IgE, białka wirusowe (na przykład białka cytomegalowirusa) itd.

Przykłady heteromerycznych kompleksów, oprócz immunoglobulin, mogą obejmować między innymi dowolne białka heterodimeryczne lub heterooligomeryczne, takie jak na przykład BMP2/BMP7, białko osteogenne, enzym przekształcający interleukinę 1 (ICE), różne receptory interleukiny (na przykład receptor IL-18, receptor IL-13, receptor IL-4 i receptor IL-7), receptory jądrowe, takie jak receptory retinoidowe, receptory komórek T, integryny, takie jak cząsteczki adhezji komórkowej, integryny beta-1, receptor czynnika martwicy nowotworów (TNFR) oraz rozpuszczalne i związane z błoną formy głównych białek kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I oraz klasy II. W przypadku heteromerycznych kompleksów będących receptorami, mogą one być zarówno rozpuszczalne, jak i stanowić związane z błoną formy tych polipeptydów. Opisy dodatkowych białek heteromerycznych, które można wytwarzać można znaleźć na przykład w Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, t. II (pod red. Aggarwal i Gutterman, Blackwell Sciences, Cambridge MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (pod red. McKay i Leigh, Oxford University Press Inc., New York, 1993) i The Cytokine Handbook (pod red. A. W. Thompson; Academic Press, San Diego CA; 1991).

W rozumieniu niniejszego opisu określenie „białko fuzyjne” odnosi się do białka lub domeny białkowej (na przykład rozpuszczalnej domeny zewnątrzkomórkowej), poddanych fuzji z białkiem lub peptydem heterologicznym. Przykłady takich białek fuzyjnych obejmują białka ulegające ekspresji w postaci fuzji z częścią cząsteczki immunoglobuliny, białka ulegające ekspresji jako białka fuzyjne z ugrupowaniem suwakowym oraz nowe, wielofunkcyjne białka, takie jak białka fuzyjne cytokin i czyn8

PL 232 477 B1 ników wzrostu (na przykład GM-CSF i IL-3, MGF i IL-3). W publikacjach WO 93/08207 i WO 96/40918 opisano wytwarzanie różnych rozpuszczalnych, oligomerycznych postaci cząsteczki określonej jako CD40L, w tym, odpowiednio, immunoglobulinowe białko fuzyjne i suwakowe białko fuzyjne, a metody omówione w tych publikacjach nadają się do zastosowania w stosunku do innych białek. Ekspresji jako białko fuzyjne może ulegać dowolna z cząsteczek tutaj opisanych, w tym między innymi zewnątrzkomórkowa domena cząsteczki receptora komórkowego, enzym, hormon, cytokina, część cząsteczki immunoglobuliny, domena suwakowa i epitop.

Wynalazek znajduje szczególne zastosowanie w ulepszaniu wytwarzania heteromerycznych kompleksów w wyniku procesów hodowli komórkowej. Linie komórkowe można poddawać zabiegom inżynierii genetycznej w celu nadania im zdolności ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania handlowego lub naukowego. Przez „zabiegi inżynierii genetycznej” rozumie się poddawanie linii komórkowej transfekcji, transformacji lub transdukcji cząsteczką rekombinacyjnego polinukleotydu tak, aby komórka ta mogła wykazywać ekspresję pożądanego białka. Sposoby i wektory do zabiegów inżynierii genetycznej na komórkach i(lub) liniach komórkowych, mających na celu uzyskanie ekspresji białka stanowiącego przedmiot zainteresowania, są dobrze znane znawcom z dziedziny; różne metody omówiono na przykład w Current Protocols in Molecular Biology pod red. Ausubel i wsp. (Wiley & Sons, New York, 1988, i aktualizacje kwartalne) i w Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Laboratory Press, 1989).

Oprócz kwasu nukleinowego kodującego pożądaną składową heteromerycznego kompleksu, konstrukty wektorowe mogą obejmować dodatkowe składowe, ułatwiające replikację w komórkach prokariotycznych i(lub) eukariotycznych, integrację konstruktu do chromosomu eukariotycznego, a także markery ułatwiające selekcję i(lub) skrining pod kątem wykrywania komórek zawierających dany konstrukt. Wektory mogą być rekombinacyjnymi wektorami DNA, obejmującymi między innymi plazmidy, fagi, fagemidy, kosmidy, wirusy, retrowirusy i tym podobne, które wprowadzają pożądany kwas nukleinowy do komórki.

Kwas nukleinowy jest „połączony w sposób umożliwiający działanie”, jeżeli znajduje się w zależności funkcjonalnej z innym kwasem nukleinowym. Dokładniej, określenie „połączony w sposób umożliwiający działanie” oznacza, że jednocześnie indukowana jest transkrypcja dwóch różnych kwasów nukleinowych, kodujących różne polipeptydy. Określenie „połączony w sposób umożliwiający działanie” ma również oznaczać, że sprzężone kwasy nukleinowe mogą przylegać do siebie w pojedynczej jednostce transkrypcyjnej, gdy translacja jest kierowana od jednego lub więcej niż jednego rybosomalnego miejsca startowego (na przykład od wewnętrznego miejsca „start” na rybosomie).

Sposoby można również stosować w połączeniu ze znanymi lub jeszcze nieodkrytymi sposobami indukowania wytwarzania białek rekombinacyjnych. Przez określenie „warunki indukowania” należy rozumieć metody zwiększania względnego wytwarzania na komórkę pożądanego białka rekombinacyjnego. Takie metody obejmują na przykład przesunięcie w stronę niskiej temperatury, dodawanie środków chemicznych oraz dowolne kombinacje znanych lub jeszcze nieodkrytych metod, a także różne jeszcze nieopisane i(lub) nieodkryte metody indukcji. Typowo, hodowlę wsadową lub perfuzyjną komórek o dużej gęstości indukuje się pod kątem wytwarzania rekombinacyjnego białka. Inne procesy komórkowe (takie jak wzrost i podział) często hamuje się, aby skierować większą część energii komórki na produkcję białka rekombinacyjnego.

Jak ujawniono można stosować dowolny marker selekcyjny, zawierający podjednostki uzupełniające - zgodnie z wynalazkiem jest to reduktaza dihydrofolianowa. W rozumieniu niniejszego opisu określenie „podjednostka” - jeżeli odnosi się do markera selekcyjnego - dotyczy części markera selekcyjnego. Ponadto, pierwsza podjednostka markera selekcyjnego może ulegać ekspresji z drugą odmienną podjednostką tego samego markera selekcyjnego, zapewniając poziom aktywności selekcyjnej, który nie występuje w żadnej podjednostce samodzielnie. Określenie „podjednostka” może również odnosić się do polipeptydu z mutacjami uzupełnianymi przez inny zmutowany polipeptyd, który także stanowi odmienną podjednostkę markera selekcyjnego.

Jak ujawniono można stosować markery selekcyjne, które nadają oporność na określone leki, które są zwykle toksyczne wobec komórek zwierzęcych. Nieograniczającymi przykładami markerów selekcyjnych nadających oporność są na przykład następujące substancje: zeomycyna (zeo); puromycyna (PAC); Blasticidin S (BlaS), GPT, które nadaje oporność na kwas mykofenolowy (Mulligan i Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); gen oporności na neomycynę, który nadaje oporność na aminoglikozyd G-418 (Colberre-Garapin i wsp., 1981, J. Mol. Biol. 150:1) i hygro, który nadaje oporność na higromycynę (Santerre i wsp., 1984, Gene 30:147).

PL 232 477 B1

Jak ujawniono można również stosować enzymy metaboliczne, które nadają zdolność przeżycia komórki lub indukują śmierć komórki w określonych warunkach. Przykłady obejmują między innymi: reduktazę dihydrofolianową (DHFR); kinazę tymidynową (TK) wirusa opryszczki zwykłej (Wigier i wsp., 1977, Cell 11:223), fosforybozylotransferazę hipoksantynowo-guaninową (HGPRT) (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026) i fosforybozylotransferazę adeninową (APRT) (Lowy i wsp., 1980, Cell 22:817), będące genami, które można zastosować w komórkach z niedoborem (brakiem), odpowiednio TK, HGPRT lub APRT.

Stosowanym markerem selekcyjnym według niniejszego wynalazku jest reduktaza dihydrofolianowa (DHFR). DHFR może być również stosowana w odniesieniu do oporności na antymetabolit metotreksat (Wigler i wsp., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O’Hare i wsp., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527). W szczególności, stosowana według niniejszego wynalazku DHFR dzieli się na dwie podjednostki: F[1,2] i F [3] (od aminokwasów 1-105 i 106-187), a asocjacja podjednostek w komórce jest promowana przez domeny interakcji przyłączone do odpowiednich podjednostek (patrz poniższe przykłady; Pelletier i wsp., 1998, PNAS, 95:12141-12146). Podczas procesów selekcji komórki, w których brak jest aktywności DHFR, nie będą wzrastać w pożywce do selekcji (-GHT) bez aktywności DHFR. Wzrost powraca pod wpływem asocjacji z fragmentami DHFR. Alternatywnie można stosować komórki wykazujące ekspresję endogennego DHFR, a transfektanty można selekcjonować na podstawie nabycia podwyższonej oporności na toksyczny poziom metotreksatu.

Metotreksat można również stosować do amplifikowania rekombinacyjnych kwasów nukleinowych po selekcji komórek wrażliwych na -GHT. Selekcja przebiega zwykle przy stężeniu metotreksatu wynoszącym 25 nM, korzystniej 50 nM, jeszcze korzystniej 150 nM, najkorzystniej 300 nM. Specjalista będzie wiedział, że stężenie metotreksatu przy amplifikacji rekombinacyjnych kwasów nukleinowych, które zapewniają oporność na ten lek, jak tu opisano, może wynosić aż 500 nM lub więcej. Amplifikacja przy użyciu wektorów i ujawnionych sposobów jest szczególnie korzystna, ponieważ stwierdzono, że w przypadku ekspresji łańcuchów ciężkich i lekkich oba łańcuchy są amplifikowane w przybliżeniu na równym poziomie.

Jak ujawniono można również stosować markery selekcyjne oparte na selekcji ze względu na zabarwienie. W szczególnym przykładzie można stosować beta-galaktozydazę (Blau i wsp., WO 98/44350). Można również stosować markery fluorescencyjne; na przykład do selekcji klonalnej komórek w celu pomiaru interakcji białek w testach komplementacji fragmentów białek stosuje się GFP (Remy i Michnick, (1999) Proc. Natl. Acad. Sci., 96:5394-5399). Podobnie, do wykrywania komórek wykazujących ekspresję fragmentów komplementujących DHFR można stosować metotreksat sprzężony z fluoresceiną (Remy i Michnick, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci., 98:7678-83.). Korzystną cechą markerów fluorescencyjnych jest to, że taką selekcję można przeprowadzić w dowolnym rodzaju komórek zwierzęcych i nie jest ona ograniczona do komórek z niedoborem na szlaku metabolicznym, jak to ma miejsce na przykład przy selekcji DHFR, ani nie wymaga wrażliwości na lek, taki jak na przykład neomycyna.

W znaczeniu tutaj stosowanym określenie „polipeptyd” obejmuje występujące w naturze lub wytwarzane metodami ekspresji rekombinacyjnej, łącznie z obróbką pre- i posttranslacyjną, białka lub ich fragmenty, które typowo zachowują strukturę drugorzędową. Białka są dużymi cząsteczkami o dużej masie cząsteczkowej (od około 10 000 w przypadku małych białek [o 50-100 aminokwasach] do ponad 1 000 000 w przypadku pewnych form białek); są one zbudowane z różnych ilości tych samych 20 aminokwasów, które w nienaruszonym białku są połączone w całość kowalencyjnymi wiązaniami chemicznymi, zwanymi wiązaniami peptydowymi. Aminokwasy, połączone razem, tworzą liniowe, nierozgałęzione struktury polimerowe, zwane łańcuchami polipeptydowymi; łańcuchy takie mogą zawierać setki reszt aminokwasowych; są one uporządkowane w określony sposób, specyficzny dla określonego białka. Określenie „peptyd” obejmuje krótkie fragmenty polipeptydów lub białek, o długości zasadniczo mniejszej niż 20 aminokwasów.

Przez określenie „hodowla komórkowa” należy rozumieć wzrost i namnażanie komórek na zewnątrz organizmu wielokomórkowego lub tkanki. Typowo, hodowlę komórkową prowadzi się w warunkach jałowych, z regulacją temperatury i atmosfery, na płytkach do hodowli tkankowej (na przykład płytki 10-cm, płytki 96-studzienkowe itp.) lub w postaci hodowli osadzonych na nośniku (na przykład na kulkach mikronośnikowych) lub w zawiesinie, na przykład w butlach typu roller. Hodowle można prowadzić w kolbach z wytrząsaniem, w bioreaktorach o małych rozmiarach i(lub) bioreaktorach o dużych rozmiarach. Bioreaktor jest urządzeniem stosowanym do hodowli komórkowych, w którym można monitorować i korygować warunki środowiskowe, takie jak temperatura, atmosfera, mieszanie

PL 232 477 B1 (wytrząsanie) i(lub) pH. Wiele przedsiębiorstw (na przykład: ABS Inc., Wilmington, DE, Stany Zjednoczone; Cell Trends, Inc., Middletown, MD, Stany Zjednoczone), jak również uniwersytetów i(lub) organizacji sponsorowanych przez rząd (na przykład: The Cell Culture Center, Minneapolis, MN, Stany Zjednoczone) oferuje komercyjne usługi w zakresie hodowli komórkowych.

Optymalne okresy, przez jakie hodowle pozostają w kontakcie ze środkiem selekcjonującym pod kątem aktywności selekcyjnej, są dłuższe, niż typowy czas jednego normalnego cyklu wzrostu (na przykład w przypadku komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) donosi się, że jeden cykl wzrostu trwa około 20-22 godzin - Rasmussen i wsp., (1998) Cytotechnology, 28:31-42). I tak, w jednej z postaci wykonania hodowle obejmują warunki selekcyjne, takie jak na przykład leki, metabolity lub substraty zabarwienia, korzystnie przez co najmniej około jeden dzień, korzystniej przez około 3 dni, jeszcze korzystniej przez około 7 dni.

Dostępnych jest wiele różnych zwierzęcych linii komórkowych odpowiednich do wzrostu w hodowli, na przykład z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Stany Zjednoczone) i NRRL (Peoria, IL, Stany Zjednoczone). Do grupy linii komórkowych typowo powszechnie stosowanych w laboratoriach przemysłowych lub akademickich zalicza się na przykład linie komórkowe CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, CV1, MDCK, 293, 3T3, PC12, komórek szpiczaka (np. NSO) i WI38. Stosować można także linie komórkowe inne niż zwierzęce, na przykład linie komórek roślin, owadów (na przykład sf9), drożdży lub bakterii, takich jak E. coli.

W szczególnych postaciach wykonania preferowanymi liniami komórek gospodarza CHO są zmutowane linie komórkowe z niedoborem reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) (Urlaub i wsp., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220), DXB11 i DG-44, ponieważ sprawny układ ekspresji genów selekcjonowanych ze względu na DHFR i nadających się do amplifikacji pozwala na ekspresję białek rekombinacyjnych w tych komórkach na wysokim poziomie (Kaufman R. J., 1990, Meth Enzymol 185:527-566). Ponadto, te komórki są łatwe do manipulacji przy wykorzystaniu do hodowli adherentnych lub w zawiesinie, i wykazują względnie dobrą stabilność genetyczną. Ponadto, można wprowadzać nowe linie komórek zwierzęcych sposobami dobrze znanymi specjalistom (na przykład przez transformację, infekcję wirusową i(lub) selekcję itd.).

Jak zauważono wyżej, do ekspresji heteromerycznych kompleksów można wykorzystywać różnorodne układy gospodarz-wektor ekspresji. Jeżeli heteromeryczny kompleks jest rozpuszczalny, peptyd lub polipeptydy mogą być wyodrębnione z hodowli, to znaczy z komórek gospodarza w przypadkach, w których heteromeryczne kompleksy nie są wydzielane, i z pożywki hodowlanej w przypadkach, kiedy heteromeryczne kompleksy są wydzielane z komórek. Jednakże, takie systemy ekspresji obejmują również komórki gospodarza poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej, które wykazują ekspresję heteromerycznych kompleksów zakotwiczonych w błonie komórkowej.

Oczyszczanie lub wzbogacanie heteromerycznych kompleksów z takich układów ekspresji można przeprowadzić przy użyciu odpowiednich detergentów oraz miceli lipidowych oraz sposobów dobrze znanych znawcom z dziedziny. Jednakże, takie poddane obróbce metodami inżynierii genetycznej komórki gospodarza - jako takie - można stosować w sytuacjach, w których ważne jest nie tylko zachowanie charakterystyki strukturalnej i funkcjonalnej kompleksów heteromerycznych, lecz także ocena aktywności biologicznej, na przykład w testach skriningowych leków.

Można zbierać białko ulegające ekspresji sposobami według wynalazku. Ponadto, białko to można oczyszczać lub częściowo oczyszczać z takiej hodowli lub składowej (na przykład z pożywki hodowlanej, wyciągów komórkowych lub płynów ustrojowych), stosując znane procesy. Zwrot „częściowo oczyszczone” oznacza, że przeprowadzono pewną procedurę - lub procedury - frakcjonowania, lecz oprócz pożądanego białka obecne są także inne rodzaje polipeptydów (co najmniej 10%). Przez określenie „oczyszczone” należy rozumieć, że białko jest zasadniczo homogenne, to znaczy zawiera poniżej 1% zanieczyszczeń białkowych. Procedury frakcjonowania mogą obejmować między innymi: jeden lub więcej niż jeden etapów filtracji, wirowania, wytrącania, rozdzielania faz, oczyszczania na zasadzie powinowactwa, filtracji żelowej, chromatografii jonowymiennej, chromatografii z wyłączaniem ze względu na rozmiar (SEC), chromatografii z oddziaływaniem hydrofobowym (HIC; przy użyciu takich żywic jak eter fenylowy, eter butylowy lub eter propylowy), HPLC lub pewne kombinacje powyższych operacji.

Dalsza obróbka białek jest również możliwa. Przez określenie „obróbka” należy rozumieć to, że białka można poddawać wymianie buforu, wyjaławianiu, można je pakować w opakowania masowe i(lub) pakować w porcjach przeznaczonych dla ostatecznego użytkownika. Do celów wynalazku określenie „jałowa postać luzem” oznacza, że preparat jest wolny lub zasadniczo wolny od zanieczyszczeń

PL 232 477 B1 mikrobiologicznych (w takim stopniu, jaki jest dopuszczalny dla żywności i(lub) leków) i ma określony skład i stężenie.

Określenie „jałowa postać dawki jednostkowej” oznacza formę, która jest odpowiednia do podawania lub spożywania przez pacjentów i(lub) użytkowników. Takie kompozycje mogą zawierać skuteczne ilości białka, w połączeniu z innymi składnikami, takimi jak dopuszczalny fizjologicznie rozcieńczalnik, nośnik lub zaróbka. Określenie „fizjologicznie dopuszczalny” oznacza materiał nietoksyczny, który nie zaburza skuteczności aktywności biologicznej składnika czynnego (składników czynnych).

Po opisaniu wynalazku przedstawia się poniższe przykłady - celem ilustracji, nie zaś ograniczenia.

Przykłady

P r z y k ł a d 1. Konstruowanie wektorów komplementacji DHFR

Konstruowanie rekombinacyjnych wektorów wykazujących ekspresję podjednostek markera selekcyjnego przeprowadzono w następujący sposób. Jako marker selekcyjny do stosowania w poniższych doświadczeniach wybrano reduktazę dihydrofolianową (DHFR). Uprzednie badania wykazały, że z uwagi na modułową strukturę trójwymiarową DHFR może być podzielona na dwie części i przy ekspresji w formie białka fuzyjnego posiadającego domenę interakcji podjednostki mogą ulegać ponownej asocjacji (reasocjacji) w komórce, zapewniając aktywność selekcyjną. Ogólny przegląd kolejności poszczególnych kwasów nukleinowych przedstawiono na Fig. 1.

Do wytwarzania kwasów nukleinowych odpowiednich do wklonowania do wektorów ekspresji kodujących fuzję domeny interakcji suwaka leucynowego, poddanej fuzji z linkerem polipeptydu poddanego fuzji z podjednostką DHFR, wykorzystywano sekwencyjną reakcję łańcuchową z udziałem polimerazy (PCR) - SOEing. Pokrótce, SOEing PCR jest to rozcięcie genów przez częściowo nakładające się przedłużenie rekombinujących cząsteczek DNA na miejscach połączenia bez stosowania endonukleaz restrykcyjnych ani ligazy (Methods in Molecular Biology, t. 15, „PCR Protocols: Current Methods and Applications” i „Rozdział 25: In Vitro Recombination”, pod red. B. A. White, 1993, Humana Press, Inc., Totowa, NJ; i „Mutagenesis of DNA”, Robert M. Horton, str. 251-261).

Fragmenty z genów, które mają być rekombinowane, wytwarzano w odrębnych łańcuchowych reakcjach polimerazy (PCR). Primery są tak zaprojektowane, że końce produktów zawierają sekwencje komplementarne, takie jak wspólne miejsce restrykcyjne, to znaczy BamH1. Kiedy te produkty PCR następnie zmiesza się, zdenaturuje oraz ponownie wygrzeje, nici zawierające odpowiadające sobie sekwencje przy swych końcach 3' zachodzą na siebie i działają jako primery dla siebie nawzajem (Horton i wsp., (1989) Gene, 77(1):61-8).

Primery stosowane w niniejszym przykładzie są następujące:

JM238 5-ATATCTCGAGATCCGTGCCATCATGTCTGACCGTATGAAAC-3’

JM239 5’-GCCACCGCCGGATCCACCGCCACCCCGCTCGCCTACCAGCTTTT-3’

JM240 5’-GGTGGATCCGGCGGTGGCGGCGGCTCAATGGTTCGACCATTGAAC-3’

PDHFR106 5’-ATATCAATTGTTATTCCGGTTGTTCAATAAGTC-3’

JM242 5’-GTGGATCCGGCGGTGGCGGCGGCTCATTGGCAAGTAAAGTAGACA-3’

JM244 5’-ATATCAATTGTTAGTCTTTCTTCTCGTAGACTT-3’

Zastosowano następującą strategię tworzenia kwasu nukleinowego kodującego domenę interakcji suwaka leucynowego przyłączoną w ramce do linkera przyłączonego w ramce do aminokwasów 1-105 DHFR. W pierwszej reakcji PCR amplifikowano suwak leucynowy drożdży GCN4 (Lz) przy użyciu primerów JM238 (SEQ ID NO:1) oraz JM239 (SEQ ID NO:2). We wszystkich reakcjach PCR korzystano z systemu Roche Expand High Fidelity PCR, który zawierał wszystkie wymagane reagenty z wyjątkiem 10 mM dNTP, które są dostępne w handlu. Warunki cyklu termicznego (PCR, warunki 1) były następujące:

94°C przez 5 minut

94°C przez 30 sekund-----37°C przez 30 sekund |-----25 cykli

72°C przez 30 sekund-----72°C przez 7 minut

4°C (zatrzymanie).

Primer JM238 ma miejsce Xho1 przy końcu 5’, a primer JM239 ma miejsce BamH1 przy końcu 5’. Primery JM240 (SEQ ID NO:3) i PDHFR106 (SEQ ID NO:4) zastosowano jednocześnie do amplifikacji metodą PCR podjednostki DHFR kodującej aminokwasy 1-105 DHFR (SEQ ID NO:5) [takie same warunki jak wyżej, z tą jedynie różnicą, że czas obróbki w temperaturze 94°C wynosił 1 minutę, a w temperaturze 72°C - 25 cykli (PCR, warunki 2)]. JM240 ma miejsce BamH1 przy końcu 5’, a PDHFR106 ma

PL 232 477 B1 miejsce Mfe1 przy końcu 5'. Każdy odpowiedni produkt reakcji PCR oczyszczono na żelu znanymi metodami oczyszczania na żelu; drugą reakcję PCR przeprowadzono, stosując PCR-warunki 2. Produkt końcowy wklonowano następnie do wektora pGEM-T (Promega) i sekwencjonowano.

Podobną strategię zastosowano do uzyskania kwasu nukleinowego kodującego suwak leucynowy, przyłączony w ramce do linkera przyłączonego w ramce do aminokwasów 106-187 DHFR. W pierwszej reakcji PCR amplifikowano suwak leucynowy drożdży GCN4 przy użyciu primerów JM238 (SEQ ID NO:1) i JM239 (SEQ ID NO:2), stosując warunki PCR-warunki 1. Primer JM238 ma miejsce Xho1 przy końcu 5', a primer JN239 ma miejsce BamH1 przy końcu 5'. Primery JM242 (SEQ ID NO:6) oraz JM244 (SEQ ID NO:7) zastosowano jednocześnie do amplifikacji metodą PCR podjednostki DHFR kodującej aminokwasy 106-187 DHFR (SEQ ID NO:5), zgodnie z PCR-warunki 1. JM242 ma miejsce BamH1 przy końcu 5', a JM244 ma miejsce Mfe1 przy końcu 5'. Każdy odpowiedni produkt PCR oczyszczono na żelu znanymi metodami oczyszczania na żelu; drugą reakcję PCR przeprowadzono, stosując PCR-warunki 1. Produkt końcowy wklonowano następnie do wektora pGEM-T (Promega) i sekwencjonowano.

Po zweryfikowaniu prawidłowości sekwencji fragmenty Lz-linker-DHFR 1-105 (363 pary zasad) i Lz-linker-DHFR 106-187 (343 pary zasad) odcięto od wektora pGEM-T z użyciem Xho1 i Mfe1, a uzyskane kwasy nukleinowe oczyszczono na żelu. Wektor pDC317 wytrawiono Not1 i Xho1, i wyodrębniono element IRES (wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu) o 558 parach zasad przez oczyszczanie na żelu. Ponieważ Xho1 nie jest unikalnym miejscem w pDC317, przeprowadzono potrójną ligację między elementem IRES Not1/Xho1, fragmentem Lz-linker-DHFR 1-105 Xho1/Mfe1 i fragmentem Lz-linker-DHFR 106-187 w pDC317, i produkty izolowania poddano testom, potwierdzając skuteczność ligacji przez trawienie restrykcyjne.

Geny łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała (Ab), kodujące przeciwciało swoiście rozp oznające mysi receptor 4 interleukiny (IL4R), wklonowano do wektorów wytworzonych w sposób opisany powyżej. Wytrawiono łańcuch ciężki anty-IL4R (HC) za pomocą Not1 i Sal1. Z tego wytrawiania metodą oczyszczania na żelu izolowano fragment o 1413 parach zasad. Podobnie, łańcuch lekki (LC) przeciwciała anty-IL4R odcięto tymi samymi enzymami od wektora i fragment łańcucha lekkiego o 736 parach zasad oczyszczono na żelu. Wektory Lz-linker-DHFR-pDC317 (zarówno 1-105, jak i 106-187) również rozcięto Not1 i Sal1 , i łańcuchy ciężki i lekki wklonowano do odpowiednich wektorów ekspresji. Otrzymano następujące kombinacje:

HC Ab IL4R: Lz-łącznik-DHFR 1-105 pDC317

LC Ab IL4R: Lz-linker-DHFR 106-187 pDC317

LC Ab IL4R: Lz-linker-DHFR 1-105 pDC317

HC Ab IL4R: Lz-linker-DHFR 106-187 pDC317

P r z y k ł a d 2. Konstruowanie drugiego zestawu wektorów komplementacji DHFR

Konstruowanie drugiego zestawu rekombinacyjnych wektorów, wykazujących ekspresję podjednostek markera selekcyjnego, przeprowadzono następująco. Wektory bicistronowe zawierające wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu (IRES) są oparte na pED4 (Kaufman (1991), Nuc Acids Res. 19(16):44854490). Wektor podstawowy - pDC318 - jest pochodną pG2.1 (Aldrich, (1998), Cytotechnology, 28:9-17), zawierającą obciętą część o 600 parach zasad elementu sekwencji zwiększającej ekspresję (EASE). Wektor pDC317 jest wektorem podobnym, który zawiera większy, bo składający się z 3,6 kilozasad, EASE. Zastosowano metodę PCR do wykonania fuzji suwaka leucynowego GCN4 (LZ) i giętkiego linkera do dwóch oddzielnych fragmentów markera selekcyjnego reduktazy dihydrofolianowej (DHFR). Pierwszy fragment rozciąga się od aminokwasu 1 do 105, a drugi fragment obejmuje aminokwasy 106-187. Końcowe produkty PCR następnie klonowano do pDC317 lub pDC318 tuż poniżej elementu IRES.

Element IRES zmodyfikowano na bazie wektora pED3 wytworzonego przez Davies i wsp., w celu wzmożenia translacji fragmentów Lz-linker-DHFR (Davies, (1992), J. Virol., 66(4):1924-1932). Zmianę tę wprowadzono do fragmentów IRES Lz-linker-DHFR w pDC317 przy zastosowaniu metody PCR, stosując primer JM256 5'-GATAATATGGCCACAACCATGTCTGACCGTATGAAACA-3', podkreślenie ATG zaznacza przejście od IRES pED3 do Lz. Następnie fragmenty subklonowano do pGEM-T (Invitrogen), zawierającego sekwencję IRES o pełnej długości. Fragmenty IRES pED3 Lz-linker-DHFR 1 -105 i 106-187 wklonowano następnie do pDC318, tworząc odpowiednio pDC321 i pDC322, lub do pDC317, tworząc pDC323 lub pDC324.

Łańcuchy mysiego przeciwciała anty-IL4R wklonowano do wielokrotnych miejsc klonowania pDC321 i pDC322, tuż powyżej IRES pED3, tworząc LC pDC321, HC pDC321, LC pDC322

PL 232 477 B1 i HC pDC322. Podobnie, łańcuch lekki i łańcuch ciężki wklonowano do wielokrotnych miejsc klonowania pDC317 i pDC324, uzyskując LC pDC323, HC pDC323, LC pDC324 i HC pDC324.

P r z y k ł a d 3. Transfekcja i selekcja

Transfekcję powyższych wektorów przeprowadzono w linii komórkowej CHO, wykazującej brak (niedobór) DHFR. Zastosowano standardowe protokoły transfekcji. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C do fazy wzrostu logarytmicznego i transfekowano oczyszczonymi plazmidami w odpowiednim stężeniu w 150 pl lipofektaminy (Gibco BRL), według zaleceń producenta. Transfekcje lipofektaminą (Invitrogen) przeprowadzono przy zastosowaniu proporcji 6:6:1 w układach LC pDC321:HC pDC322:pCDNA3 (Invitrogen), HC pDC321:LC pDC322:pCDNA3, LC pDC323:HC pDC323:pCDNA3 lub HC pDC324:LC pDC324:pCDNA3.

Wstępną selekcję przeprowadzono w wytrząsanych kolbach w pożywce do selekcji niezawierającej DHFR, z dodatkiem G418, uzyskując do 70% żywotności, a następnie w pożywce do selekcji zawierającej DHFR i niezawierającej glicyny, hipoksantyny ani tymidyny (-GHT), uzyskując do 90% żywotności. Pule materiału uzyskanego po selekcji G418 i -GHT wystawiono na działanie 25 nM metotreksatu, próbując dokonać amplifikacji łańcuchów przeciwciała i tym samym wzmóc produkcję przeciwciała w pulach. Obie pule materiału: nieamplifikowana i amplifikowana, wykazywały stabilną produkcję przeciwciała w tym czasie.

W celu klonowania, transfekowane komórki rozcieńczono i naniesiono bezpośrednio na płytki 96-studzienkowe w pożywce wzrostowej -T. Nie była potrzebna selekcja wstępna w pożywce G418 ani -GHT.

W przypadku wektorów pDC321 i pDC322 nieamplifikowana pula utrzymywała qP na poziomie 1 pg/10⁶ komórek/dzień. Wzrost qP w przypadku puli amplifikowanej koreluje ze wzrostem żywotności po odzyskaniu komórek z selekcji. Wartość qP puli amplifikowanej zawierała się w przedziale od 8 do 18 pg/10⁶ komórek/dzień, co wskazuje na 8-18-krotny wzrost produkcji przeciwciała w porównaniu z pulą nieamplifikowaną. Oceniono pięć niezależnych puli i stwierdzono, że wykazują one podobny poziom ekspresji. Poza analizą tych puli, dwa spośród tych klonów przeniesiono do wytrząsanych kolb, powielono z użyciem 25 nM metotreksatu i oceniono pod kątem ekspresji. Ekspresja była podobna do wyników opisanych w odniesieniu do omówionych puli.

W przypadku wektorów pDC323 i pDC324, a mianowicie wektorów z elementem EASE o 3,6 kilozasad, pula nieamplifikowana zachowała wartość qP na poziomie 5 pg/10⁶ komórek/dzień.

P r z y k ł a d 4. Ekspresja przeciwciał z wektorów komplementacji

Następnie pule nieamplifikowane i amplifikowane oceniono w symulowanych warunkach wytwarzania. Przesunięcie ku niższej temperaturze, na przykład 31°C, prowadzi do uzyskania wyższych mian. Indukcję przeprowadzono w hodowlach o objętości 20 ml, prowadzonych w wytrząsanych kolbach z przesunięciem do niższej temperatury. Miana przeciwciał mierzono, stosując ELISA. Pula nieamplifikowana wytworzyła 80 pg/ml przeciwciała w ciągu 9 dni, zachowując końcową żywotność na poziomie 65,8%. Analizowano trzy niezależne pule. Pule amplifikowane wytworzyły przeciętnie 407,8 pg/ml przeciwciała w ciągu 10 dni, z przeciętną końcową żywotnością wynoszącą 47,2%. Produktywność właściwa (qP) tych puli zawierała się w przedziale 10-20 pg/10⁶ komórek/dzień.

P r z y k ł a d 5. Analizy przeciwciał metodą Western Blot

Izolowano przeciwciała ulegające ekspresji z komórek transfekowanych wektorami pDC321 lub pDC322 standardowymi metodami, oczyszczono je i wprowadzono na żele denaturujące, jak również natywne. Zastosowano 4-20% żel Tris Glycine o grubości 1 mm, 10 studzienek (Invitrogen, nr kat. E6025) przy napięciu 125 V, czas około 2 godzin. Próbek nie ogrzewano i zawieszono je w buforze próbki 2X natywny żel Tris Glycine (Invitrogen, nr kat. LC2673) z dodatkiem (zredukowany) lub bez dodatku (niezredukowany) 5% beta merkaptoetanolu (końcowe stężenie 2,5%). Buforem próbki był bufor rozdzielający 1X SDS. Żele były żelami niedenaturującymi, gdyż nie zawierały SDS ani środków redukujących w samym żelu, a jedynie wskazane bufory próbek.

Transfer na nitrocelulozę (Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, Invitrogen, LC2001) prowadzono przez 45 minut przy napięciu 33 V. Błony zablokowano na noc w temperaturze 4°C w 5% odtłuszczonym mleku w proszku w PBST (0,1% Tween 20) lub w roztworze „blotto”. Oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa kozie przeciwciało antymysie lgG(H+L), sprzężone z HRP (Bio-Rad, nr kat. 170-6516), o powinowactwie właściwym do blotingu, rozcieńczono w stosunku 1:2000 w roztworze „blotto” i zastosowano do blotów przez okres 2,5 godziny. Następnie każdy z blotów przemywano 5-krotnie przez 5 minut PBST i wywoływano przez 30 sekund, stosując odczynniki ECL do detekcji metodą Western blot (Amersham Pharmacia Biotech, nr kat. RPN2106).

PL 232 477 B1

Wszystkie próbki pochodziły z supernatantów hodowli z serii 90. Ściślej, oczyszczone przeciwciało pobierano z indukowanej, nieamplifikowanej hodowli i oczyszczano na kolumnie z białkiem G. 0 nM supernatantu zatężono 10-krotnie przy użyciu urządzenia do zatężania Millipore (UFV2BCC40) przy 3000 obrotów/minutę, ponieważ jego stężenie oznaczone przy użyciu Mu FC ELISA było niższe niż w innych próbkach. Badanie na niezredukowanym żelu wykazało, że łańcuchy ciężki i lekki przeciwciała występują we wszystkich przypadkach i że w supernatantach 25 i 50 nM ilość wolnego łańcucha lekkiego lub dimeryzowanego łańcucha lekkiego jest bardzo mała, a w supernatantach 0 nM nie ma ich wcale, oraz że w oczyszczonym przeciwciele (Ab) znajduje się pewna niewielka ilość zdimeryzowanych łańcuchów lekkich.

Łańcuchy ciężkie i lekkie występowały we wszystkich supernatantach w równych proporcjach jako oczyszczone przeciwciało, i - co istotne - w supernatantach amplikowanych metotreksatem ogólna ilość przeciwciała jest znacznie większa, co jest zgodne z wynikami w przykładzie 3.

Przeciwciała oczyszczono również z komórek transfekowanych wektorami pDC323 lub pDC324. Proporcje łańcuchów ciężkich i lekkich na niezredukowanym żelu w przeciwciałach z supernatantów komórek były równe, z bardzo małą ilością wolnego łańcucha lekkiego lub zdimeryzowanego łańcucha lekkiego.

P r z y k ł a d 6. Analiza FACS ekspresji DHFR

Zastosowano analizę metodą sortowania komórek aktywowanego fluorescencyjnie (FACS) w celu zweryfikowania współprądowej amplifikacji ekspresji DHFR po wystawieniu na działanie metotreksatu. Pule nieamplifikowane i amplifikowane wyznakowano, stosując fluorescencyjnie znakowany metotreksat, który wiąże DHFR, i analizowano przy użyciu analizatora FACS Calibur. Jako kontroli użyto nieznakowanych, nietransfekowanych komórek CS9. Jak się spodziewano, zarówno pule nieamplifikowane, jak i amplifikowane wykazały aktywność DHFR. Większy stopień fluorescencji obserwowano w puli amplifikowanej 25 nM metotreksatem w porównaniu z nieamplifikowaną pulą 0 nM metotreksatu. To potwierdza, że amplifikacja ekspresji przeciwciała koreluje z amplifikacją ekspresji DHFR.

Równoważniki i odpowiedniki

Niniejszy wynalazek nie ma być ograniczony w swym zakresie przez konkretne opisane tu postacie, które mają na celu jedynie ilustrację indywidualnych aspektów wynalazku. Zakres niniejszego wynalazku obejmuje funkcjonalnie równoważne systemy i sposoby. W istocie, na podstawie powyższego ujawnienia i załączonych rysunków dla specjalisty oczywiste będą różne modyfikacje wynalazku, oprócz modyfikacji przedstawionych i opisanych tutaj. Modyfikacje takie mają być uważane za objęte zakresem załączonych zastrzeżeń.

Wszystkie publikacje, patenty i zgłoszenia patentowe wymienione w powyższym opisie są włączone do tego opisu przez odwołanie, w takim samym zakresie, jak gdyby przy każdej publikacji, każdym patencie lub zgłoszeniu patentowym konkretnie i oddzielnie zaznaczono, że ujawnienie w nich zawarte włącza się przez odwołanie.

PL 232 477 Β1

LISTA SEKWENCJI <110> IMMUNEX CORPORATION <l20> SELEKCJAKOM0REKZDOLNYCHDOEKSPRES.il POLIPEPTYDÓW HETEROMERYCZNYCH <l30> 3265A <l40> 10/251,447 <141> 2002-09-20 <150> US 60/323,394 <151> 2001-09-20 <160> 8 < 170> PatentI n versi on 3.1 <210> 1 <211> 41 <2!2> DNA <213> sztuczna <220>

<223> PrimerPCR <400> I atatctcgag atccgtgcca tcatgtctga ccgtatgaaa c 41 <210> 2 <211> 44 <212> DNA <213> sztuczna <220>

<223> Primer PCR <400> 2 gccaccgccg gatccaccgc caccccgctc gcctaccagc tttt 44 <210> 3 <211> 45 <212> DNA <213> sztuczna <220>

<223> Primer PCR <400> 3

PL 232 477 Β1 ggtggatccg gcggtggcgg cggctcaatg gttcgaccat tgaac 45 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> sztuczna <220>

<223> Primer PCR <400> 4 atatcaattg ttattccggt tgttcaataa gtc 33 <210> 5 <21l> 187 <212> PRT <213> Mus musculus <400 5

Met

Val

Arg

Pro

Leu

Asn

Cys Ile

Val

Ala

Val

Ser

Gin

Asn

Met

Gly

1

5

10

15

Ile Gly Lys Asn

Gly

Asp

Leu Pro

Trp

Pro

Pro

Leu

Arg

Asn

Glu

Phe

20

25

30

Lys

Tyr

Phc

Gin

Arg

Met

ΊΊίγ Thr

Thr

Ser

Ser

Val

Glu

Gly

Lys

Gin

35

40

45

Asn

Leu

Val

Ile

Met

Gly

Arg Lys

Thr

Trp

Phe

Ser

Ile

Pro

Glu

Ly s

50

55

60

Asn

Arg Pro

Lei

i Ly:

5 As]

a Arg Ile

Asr

i Ile

Val

Leu

Ser

Arg

Glu

Leu

65

70

75

80

Lys

Glu

Pro

Pro

Arg

Gly

Ala His

Phe

Leu

Ala

Lys

Ser

Leu

Asp

Asp

85

90

95

Ala

Leu

Arg

Leu

Ile

Glu

Gin Pro

Glu

Leu

Ala

Ser

Lys

Val

Asp

Met

100

105

1 10

Val

Trp

ile

Val

Gly

Gly

Ser Ser ’

Val

Tyr

Gin

Glu

Ala

Met

Asn

Gin

115

120

1

.25

Pro

Gly

His

Leu

Arg

Leu

Phe Val

Thr

Arg

Ile

Met

Gin

Glu

Phe

(Ilu

130

135

140

Ser

Asp

Thr

Phe

Phe

Pro

Glu Ile

Asp

Leu

Gly

Lys

Ty r

Lys

Leu

l.eu

145

150

155

160

Pro

Glu

Tyr

Pro

Gly

Val

Leu Ser

Glu

Val

Gin

Glu

Glu

Lys

Gly

Ile

165

170

175

Lys

Tyr

Lys

Phe

Glu

Val

Tyr Glu

Lys

Lys

Asp

ISO

185

<210> 6

PL 232 477 Β1 <2ll> 45 <2l2> DNA <2l3> sztuczna <220>

<223> Primer PCR <400> 6 gtggatccgg cggtggcggc ggctcattgg caagtaaagt agaca 45 <2IO> 7 <21l> 33 <2l2> DNA <213> sztuczna <220>

<223> Primer PCR <400> 7 atatcaattg ttagtctttc ttctcgtaga ctt 33 <210> 8 <2ll> 38 <212> DNA <213> sztuczna <220>

<223> Primer PCR <400> 8 gataatatgg ccacaaccat gictgaccgt atgaaaca 38

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. System ekspresji gospodarza obejmujący komórkę gospodarza, którą zmodyfikowano genetycznie w celu ekspresji pierwszego wektora kodującego transkrypt obejmujący pierwszą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą pierwszy ciężki łańcuch immunoglobulinowy lub lekki łańcuch immunoglobulinowy, przy czym transkrypcja wspomnianej pierwszej sekwencji kwasu nukleinowego jest indukowana równocześnie z transkrypcją drugiej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej pierwszą podjednostkę reduktazy dihydrofolianowej, oraz drugiego wektora kodującego transkrypt obejmujący trzecią sekwencję kwasu nukleinowego kodującą drugi ciężki łańcuch immunoglobulinowy lub lekki łańcuch immunoglobulinowy, który asocjuje z pierwszym ciężkim łańcuchem immunoglobulinowym lub lekkim łańcuchem immunoglobulinowym dla tworzenia kompleksu heteromerycznego, przy czym transkrypcja wspomnianej trzeciej sekwencji kwasu nukleinowego jest indukowana równocześnie z transkrypcją czwartej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej drugą podjednostkę reduktazy dihydrofolianowej, i przy czym wspomniane pierwsza i druga podjednostka reduktazy dihydrofolianowej asocjują dostarczając aktywność reduktazy dihydrofolianowej, przy czym wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu występuje pomiędzy pierwszą sekwencją kwasu nukleinowego a drugą sekwencją kwasu nukleinowego, przy czym wewnętrzne miejsce wiązania rybosomu

   PL 232 477 B1 występuje pomiędzy trzecią sekwencją kwasu nukleinowego a czwartą sekwencją kwasu nukleinowego, a kompleksem heteromerycznym jest przeciwciało.
2. 2. System ekspresji gospodarza według zastrz. 1, znamienny tym, że podjednostka reduktazy dihydrofolianowej markera jest polipeptydem fuzyjnym obejmującym domenę interakcyjną.
3. 3. System ekspresji gospodarza według zastrz. 2, znamienny tym, że domena interakcyjna jest suwakiem leucynowym z polipeptydu wybranego z grupy obejmującej GCN4, C/EBP, c-Fos, c-Jun, c-Myc oraz c-Max.
4. 4. System ekspresji gospodarza według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo koduje odmienny funkcjonalny marker selekcyjny wybrany z listy składającej się z zeomycyny, neomycyny, puromycyny, Blasticidin S oraz GPT.
5. 5. System ekspresji gospodarza według zastrz. 1, znamienny tym, że komórka gospodarza jest wybrana z grupy składającej się z CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3, linii komórkowej szpiczaka oraz komórek WI38.
6. 6. System ekspresji gospodarza według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje komórkę gospodarza, którą zmodyfikowano genetycznie dla ekspresji pierwszego wektora obejmującego pierwszą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą lekki łańcuch immunoglobulinowy, przy czym transkrypcja wspomnianego lekkiego łańcucha jest indukowana równocześnie z transkrypcją drugiej sekwencji kwasu nukleinowego, która koduje polipeptyd fuzyjny pierwszej podjednostki reduktazy dihydrofolianowej połączonej z sekwencją dimeryzacji, oraz drugiego wektora obejmującego trzecią sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ciężki łańcuch immunoglobulinowy, przy czym transkrypcja wspomnianego ciężkiego łańcucha jest indukowana równocześnie z transkrypcją czwartej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej polipeptyd fuzyjny drugiej podjednostki reduktazy dihydrofolianowej połączonej z sekwencją dimeryzacji, przy czym każda podjednostka reduktazy dihydrofolianowej nie wykazuje aktywności reduktazy dihydrofolianowej przy ekspresji samodzielnej, a koekspresja pierwszej podjednostki reduktazy dihydrofolianowej z drugą podjednostką reduktazy dihydrofolianowej dostarcza aktywność reduktazy dihydrofolianowej.
7. 7. System ekspresji gospodarza według zastrz. 6, znamienny tym, że jedną podjednostką reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) są aminokwasy 1-105 DHFR, a drugą podjednostką reduktazy dihydrofolianowej (DHFR) są aminokwasy 106-187 DHFR.
8. 8. System ekspresji gospodarza według zastrz. 7, znamienny tym, że sekwencja dimeryzacji połączona z podjednostką reduktazy dihydrofolianowej pochodzi z sekwencji suwaka leucynowego GCN4.
9. 9. System ekspresji gospodarza według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje komórkę gospodarza, którą zmodyfikowano genetycznie dla ekspresji pierwszego wektora kodującego transkrypt obejmujący pierwszą sekwencję kwasu nukleinowego kodującą ciężki łańcuch immunoglobulinowy, przy czym transkrypcja wspomnianej pierwszej sekwencji kwasu nukleinowego jest indukowana równocześnie z transkrypcją drugiej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej pierwszą podjednostkę reduktazy dihydrofolianowej, i drugiego wektora kodującego transkrypcję obejmującą trzecią sekwencję kwasu nukleinowego kodującą lekki łańcuch immunoglobulinowy, przy czym transkrypcja wspomnianej trzeciej sekwencji kwasu nukleinowego jest indukowana równocześnie z transkrypcją czwartej sekwencji kwasu nukleinowego kodującej drugą podjednostkę reduktazy dihydrofolianowej, i przy czym wspomniane pierwsza i druga podjednostka reduktazy dihydrofolianowej asocjują dla dostarczenia aktywności reduktazy dihydrofolianowej.
10. 10. System ekspresji gospodarza według zastrz. 9, znamienny tym, że podjednostka reduktazy dihydrofolianowej jest polipeptydem fuzyjnym obejmującym domenę interakcji.
11. 11. System ekspresji gospodarza według zastrz. 10, znamienny tym, że domena interakcyjna jest suwakiem leucynowym z polipeptydu wybranego z grupy obejmującej GCN4, C/EBP, c-Fos, c-Jun, c-Myc oraz c-Max.
12. 12. Sposób wytwarzania heteromerycznego kompleksu obejmujący etap: prowadzenia hodowli komórki gospodarza według zastrz. 1 w warunkach, w których następuje ekspresja heteromerycznego kompleksu w komórce gospodarza.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że obejmuje ponadto wyodrębnianie heteromerycznego kompleksu.