JP2005511031A - ヘテロマーポリペプチドを発現する細胞の選択 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、部分的には、細胞内での組換えヘテローマー複合体の効率的な産生が、該複合体の各成分が比例した量で発現されれば改善されるという前提に基づくものである。このように、本発明は、2以上のポリペプチドを発現する組換え工作された細胞を選択するための方法および組成物を提供する。この場合、該ポリペプチドは、それらのポリペプチドが効率的に会合してヘテロマー複合体を形成しうるよう比例した量で発現され、より高い発現が達成される。
細胞内での組換えヘテロマー複合体の効率的な産生は、該複合体の各成分が、比例した量で大量に発現されると改善される。本発明は、2以上の異種ポリペプチドを比例した量で発現する組換え操作された細胞を選択するための方法および組成物を提供するものであり、それらのポリペプチドは、従来の方法で製造されたヘテロマー複合体より高い発現レベルでヘテロマー複合体を形成するよう効率的に会合しうる。本発明は、所望の組換えヘテロマーポリペプチド複合体を高レベルで発現する細胞を選択するのに要する時間が短縮される点でも有利である。
選択マーカーのサブユニットを発現する組換えベクターの構築を以下のとおりに行った。以下の実験で使用する選択マーカーとして、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)を選択した。これまでの研究は、そのモジュラー三次元構造のため、DHFRが2つの部分に分解されうること、および相互作用ドメインを有する融合タンパク質として発現された場合には、ついでそれらのサブユニットが細胞内で再会合して選択活性をもたらしうることを示している。本発明の1つの実施形態において記載されている種々の核酸の順序の全般的概要については、図1を参照されたい。
94℃で5分間
94℃で30秒間‐‐‐‐‐
37℃で30秒間 │‐‐‐25サイクル
72℃で30秒間‐‐‐‐‐
72℃で7分間
4℃(維持)。
選択マーカーのサブユニットを発現する第2セットの組換えベクターの構築を以下のとおりに行った。配列内リボソーム進入部位(IRES)を含有するビシストロンベクターはpED4(Kaufman(1991),Nuc Acids Res.19(16):4485−4490)に基づく。基礎ベクターpDC318は、発現増強配列要素(EASE)のトランケート化600塩基対部分を含有するpG2.1(Aldrich(1998),Cytotechnology,28:9−17)の誘導体である。pDC317は、より大きな3.6キロベースのEASEを含有する類似ベクターである。PCRを用いて、GCN4ロイシンジッパー(LZ)および柔軟なリンカーを、選択マーカーであるジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)の2つの別々の断片に融合させた。該第1断片はアミノ酸1−105に伸長し、該第2断片はアミノ酸106−187を含む。ついで最終的なPCR産物をIRES要素の直下流のpDC317またはpDC318内にクローニングした。
前記ベクターのトランスフェクションをDHFR欠損CHO細胞系において行った。標準的なトランスフェクションプロトコールを用いた。細胞を37℃で対数期までインキュベートし、150μLのリポフェクタミン(Gibco BRL)を該製造業者の推奨どおりに使用して適当な濃度の精製プラスミドでトランスフェクトした。pDC321 LC:pDC322 HC:pCDNA3(Invitrogen)、pDC321 HC:pDC322 LC:pCDNA3、pDC323 LC:pDC323 HC:pCDNA3、またはpDC324 HC:pDC324 LC:pCDNA3が6:6:1の比となるよう、リポフェクタミン(Invitrogen)トランスフェクションを行った。
ついで未増幅および増幅プールを模擬産生条件下で評価した。より低い温度(例えば、31℃)への変化は、より高い力価を招く。より低い温度に変化させた20mL 振とうフラスコ培養において誘導を行った。抗体力価をELISAにより測定した。未増幅プールは80μg/mLの抗体を9日間で産生する一方、65.8%の最終生存率を維持した。3つの独立したプールを分析した。該増幅プールは平均で407.8μg/mLの抗体を10日間で産生し、平均最終生存率は47.2%であった。該プールの比産生度(qP)は10〜20μg/106細胞/日の範囲であった。
pDC321またはpDC322ベクターでトランスフェクトされた細胞から発現された抗体を標準的な方法により単離し、精製し、変性ゲルおよび天然ゲル上で移動させた。1mm、10ウェルの4〜20% Tris グリシンゲルを125Vで約2時間移動させた(Invitrogen,Cat.No.E6025)。該サンプルは加熱せず、5% βメルカプトエタノール(最終濃度2.5%)の存在下(還元)または非存在下(非還元)、2×天然ゲルTrisグリシンサンプルバッファー(Invitrogen,Cat.No.LC2673)内に懸濁させた。該サンプルバッファーは1×SDSランニングバッファーであった。該ゲル自体にSDSまたは還元剤が存在せず、示されているサンプルバッファーのみが存在する場合、該ゲルは非変性であった。
メトトレキセート曝露後のDHFR発現の付随的増幅を確認するために、蛍光活性化細胞分取(FACS)分析を用いた。未増幅および増幅プールを、DHFRに結合するフルオレセイン標識メトトレキセートで標識し、FACS Calibur分析装置上で分析した。未標識の未トランスフェクト化CS9細胞を対照として使用した。予想どおり、未増幅プールおよび増幅プールの両方がDHFR活性を示す。25nM メトトレキセート増幅プールにおいては、0nM メトトレキセート未増幅プールの場合より大きな度合の蛍光が観察される。これは、抗体発現の増幅がDHFR発現の増幅と相関することを証明している。
本発明の範囲は、本発明の個々の態様の単一の例示と意図される本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものではなく、機能的に等価な方法および成分は本発明の範囲内である。実際のところ、前記の説明および添付図面から、本明細書に示され記載されているもの以外に、本発明の種々の修飾が当業者に明らかとなろう。そのような修飾は添付の請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
Claims (19)
- ポリペプチドをコードする第1核酸を含み、該第1核酸は、選択マーカーのサブユニットをコードする第2核酸に機能しうる形で連結されており、該サブユニットは該選択マーカーの別のサブユニットと相互作用して選択活性を付与しうる、単離された核酸分子。
- 該第1核酸がコードするポリペプチドと会合してヘテロマー複合体を形成しうるポリペプチドをコードする第3核酸(該第3核酸は選択マーカーのサブユニットの少なくとも1つをコードする第4核酸に機能しうる形で連結されており、該サブユニットは該第2核酸がコードするポリペプチド選択マーカーサブユニットに会合して選択活性を付与しうる)を更に含む、請求項1記載の核酸分子。
- 該ヘテロマー複合体が抗体である、請求項2記載の単離された核酸分子。
- 該第1核酸が、抗体重鎖および抗体軽鎖よりなる群から選ばれるポリペプチドをコードする、請求項1記載の単離された核酸分子。
- 該選択マーカーが、薬物耐性マーカー、代謝生存マーカー、発色マーカーおよび蛍光マーカーよりなる群から選ばれる、請求項1記載の単離された核酸分子。
- 該選択マーカーが、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性、βガラクトシダーゼおよびグリーン蛍光タンパク質よりなる群から選ばれる、請求項5記載の単離された核酸分子。
- 配列内リボソーム進入部位が該第1核酸と該第2核酸との間に存在する、請求項1記載の単離された核酸分子。
- 配列内リボソーム進入部位が該第3核酸と該第4核酸との間に存在する、請求項2記載の単離された核酸分子。
- 該選択マーカーサブユニットが、相互作用ドメインを含む融合ポリペプチドである、請求項1記載の単離された核酸分子。
- 該相互作用ドメインが、GCN4、C/EBP、c−Fos、c−Jun、c−Mycおよびc−Maxよりなる群から選ばれるポリペプチドに由来するロイシンジッパーである、請求項9記載の単離された核酸分子。
- ゼオマイシン、ネオマイシン、ピューロマイシン、ブラストサイジンSおよびGPTよりなる群から選ばれる異なる機能的選択マーカーを更にコードする、請求項1記載の単離された核酸分子。
- 請求項1記載の単離された核酸分子を含んでなる組換えベクター。
- 請求項1記載の単離された核酸分子を含有するよう遺伝的に工作された宿主細胞。
- CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3、骨髄腫細胞系およびWI38細胞よりなる群から選ばれる、請求項13記載の宿主細胞。
- 該第1核酸がコードするポリペプチドに会合してヘテロマー複合体を形成しうるポリペプチドをコードする第3核酸(該第3核酸は、選択マーカーのサブユニットの少なくとも1つをコードする第4核酸に機能しうる形で連結されており、該サブユニットは、該第2核酸がコードするポリペプチド選択マーカーサブユニットに会合して選択活性を付与しうる)を含む第2の単離された核酸分子で形質転換された、請求項13記載の宿主細胞。
- 該宿主細胞により該ヘテロマー複合体が発現される条件下で請求項15記載の宿主細胞を培養する工程を含んでなる方法。
- 該ヘテロマー複合体が抗体である、請求項16記載の方法。
- 該ヘテロマー複合体を単離することを更に含む、請求項16記載の方法。
- 該宿主細胞が、CHO、VERO、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3、骨髄腫細胞系およびWI38細胞よりなる群から選ばれる、請求項16記載の方法。
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