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Hintergrund der Erfindung
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Der letzte Schritt bei der Blutgerinnungskaskade ist die thrombinkatalysierte Umwandlung des löslichen Plasmaproteinfibrinogens in unlösliches Fibrin. Thrombin spaltet ein kleines Peptid (Fibrinopeptid A) aus einer der drei Komponentenketten (die Aα-Kette) des Fibrinogens. In der Folge polymerisieren Fibrinmonomere und werden durch aktivierten Faktor XIII quervernetzt, um ein stabiles Gerinsel zu bilden.
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Fibrinogen ist eine Schlüsselkomponente biologischer Gewebeleime (siehe z. B.
US-Patentschriften Nr. 4,377,572 und
4,442,655 ), welche die Bildung von natürlichen Blutgerinsel nachahmen, um die Blutstillung zu fördern und beschädigtes Gewebe zu reparieren. Gewebeleime bieten ein Hilfsmittel für oder eine Alternative zu Nähten, Klammern und anderen mechanischen Mitteln für den Wundverschluss. Die Hauptbestandteile dieser Produkte (Fibrinogen, Faktor XIII und Thrombin) werden jedoch aus gepooltem menschlichem Plasma durch Cryopräzipitation (z. B.
US-Patentschriften Nr. 4,377,572 ;
4,362,567 ;
4,909,251 ) oder Ethanolpräzipitation (z. B.
US-Patentschrift Nr. 4,442,655 ) oder aus Einzelspenderplasma (z. B.
US-Patentschrift Nr. 4,627,879 ; Spotnitz et al., Am. Surg. 55: 166–168, 1989) hergestellt. Das resultierende Fibrinogen/Faktor-XIII-Präparat wird mit Rinderthrombin unmittelbar vor Verwendung vermischt, um das Fibrinogen in Fibrin umzuwandeln und den Faktor XIII zu aktivieren, wodurch die Gerinnung des Klebemittels initiiert wird.
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Im Handel erhältliche Klebemittel stammen aus gepooltem Plasma. Da aus Blut gewonnene Produkte mit der Übertragung des menschlichen Immunschwächevirus (HIV), des Hepatitis-Virus und anderer Krankheitserreger in Verbindung gebracht worden sind, sind die Akzeptanz und Verfügbarkeit dieser Klebemittel beschränkt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind sie in den USA nicht zur Verwendung zugelassen.
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Während die Verwendung von autologem Plasma das Risiko einer Krankheitsübertragung reduziert, können autologe Klebemittel nur bei elektiven chirurgischen Eingriffen verwendet werden, wenn der Patient in der Lage ist, im Voraus das notwendige Blut zu spenden.
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Wie oben angeführt, besteht Fibrinogen aus drei Polypeptidketten, von denen jede in zwei Kopien in dem zusammengefügten Molekül vorhanden ist. Diese Ketten, die als Aα-, Bβ- und γ-Ketten bezeichnet werden, werden koordiniert exprimiert, zusammengefügt und durch die Leber sekretiert. Obwohl man erwarten könnte, dass die rekombinante DNA-Technologie eine Alternative für die Isolierung von Fibrinogen aus Plasma bereitstellen würde, hat sich dieses Ziel als schwer erreichbar herausgestellt. Die drei Fibrinogenketten wurden einzeln in E. coli (Lord, DNA 4: 33–38, 1985; Bolyard and Lord, Gene 66: 183–192, 1988; Bolyard and Lord, Blood 73: 1202–1206) exprimiert, wobei jedoch kein funktionales Fibrinogen in einem prokaryotischen System erzeugt wurde. Über die Expression von biologisch kompetentem Fibrinogen in Hefe wurde nichts berichtet. Kultivierte transfizierte Säugetierzellen wurden verwendet, um biologisch aktives Fibrinogen zu exprimieren (Farrell et al., Blood 74: 55a, 1989; Hartwig and Danishefsky, J. Biol. Chem. 266: 6578–6585, 1991; Farrell et al., Biochemistry 30: 9414–9420, 1991), aber die Expressionspegel waren so niedrig, dass die Produktion von rekombinantem Fibrinogen in kommerziellen Mengen nicht machbar ist. Experimentelle Ergebnisse deuten darauf hin, dass geringere Transkriptionsraten in kultivierten Zellen, im Vergleich zur Leber, eine Rolle bei den geringen Expressionsraten spielen könnten, die bis dato erzielt wurden, wobei aber eine Erhöhung der Menge von Fibrinogenketten-mRNA in transfizierten BHK-Zellen keine entsprechenden Anstiege bei der Fibrinogenproteinsekretion zur Folge hatte (Prunkard and Foster, XIV Congress of the International Society an Thrombosis and Haemostasis, 1993). Diese zuletzt genannten Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein geeignetes Zusammenfügen und Bearbeiten von Fibrinogen gewebespezifische Mechanismen einschließt, die in allgemeinen Laborzelllinien nicht vorhanden sind.
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Es besteht in diesem Fachbereich weiterhin eine Notwendigkeit für Verfahren zur Herstellung großer Mengen von qualitativ hochwertigem Fibrinogen für die Verwendung in Gewebeklebemitteln und bei anderen Anwendungen. Es besteht ein weiterer Bedarf an Fibrinogen, das frei von durch das Blut übertragenen Pathogenen ist. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Notwendigkeiten und bietet weitere, damit in Zusammenhang stehende Vorteile.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, kommerziell nützliche Mengen an rekombinantem Fibrinogen bereitzustellen, insbesondere an rekombinantem Humanfibronogen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Materialien und Verfahren zum Exprimieren von Fibrinogen in dem Säugetiergewebe von transgenen Tieren, insbesondere Viehzuchttieren wie Kühen, Schafen, Schweinen und Ziegen.
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Im Rahmen eines Aspektes stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen bereit, das Folgendes enthält: (a) Bereitstellen eines ersten DNA-Segmentes, das ein Sekretionssignal codiert, welches mit einer Fibrinogen-Aα-Kette funktional verbunden ist, eines zweiten DNA-Segmentes, das ein Sekretionssignal codiert, welches mit einer Fibrinogen-Bβ-Kette funktional verbunden ist, und eines dritten DNA-Segmentes, das ein Sekretionssignal codiert, welches mit einer Fibrinogen-γ-Kette funktional verbunden ist, wobei jedes der ersten, zweiten und dritten Segmente funktional mit zusätzlichen DNA-Segmenten, die für deren Expression in der Brustdrüse eines weiblichen Wirtssäugetiers notwendig sind, verbunden sind; und wobei die ersten, zweiten und dritten Segmente in einer einzelnen Expressionseinheit verbunden sind, (b) Einfügen der einzelnen Expressionseinheit in ein befruchtetes Ei einer nichtmenschlichen Säugetierspezies; (c) Einführen dieses Eies in einen Eileiter oder den Uterus eines Weibchens dieser Spezies, um Nachwuchs zu erhalten, der die DNA-Konstrukte trägt; (d) Züchten des Nachwuchses, um weibliche Nachkommen zu erzeugen, welche die ersten, zweiten und dritten DNA-Segmente exprimieren und Milch produzieren, die durch die genannten Segmente codiertes biokompetentes Fibrinogen enthält; (e) Auffangen der Milch der weiblichen Nachkommen; und (f) Gewinnen des Fibrinogens aus dieser Milch. Im Rahmen einer Ausführungsform wird das Ei, welches die eingefügten Segmente enthält, vor dem Einführen eine Zeit lang kultiviert.
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Im Rahmen eines anderen Aspektes stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Fibrinogen bereit, welches folgende Schritte enthält: (a) Einbauen eines ersten DNA-Segmentes, das ein Sekretionssignal codiert, das funktional mit einer Fibrinogen-Aα-Kette verbunden ist, in ein Bβ-Lactoglobulin-Gen, um eine erste Genfusion zu erzeugen; (b) Einbauen eines zweiten DNA-Segmentes, das ein Sekretionssignal codiert, das funktional mit einer Fibrinogen-Bβ-Kette verbunden ist, in ein β-Lactoglobulin-Gen, um eine zweite Genfusion zu erzeugen; (c) Einbauen eines dritten DNA-Segmentes, das ein Sekretionssignal codiert, das mit einer Fibrinogen-γ-Kette funktional verbunden ist, in ein β-Lactoglobulin-Gen, um eine dritte Genfusion zu erzeugen; verknüpfen der ersten, zweiten und dritten Genfusionen in eine einzelne Expressionseinheit, (d) Einführen der einzelnen Expressionseinheit in die Keimbahn eines nichtmenschlichen Säugetieres, so dass die DNA-Segmente in der Brustdrüse des Säugetieres oder dessen weiblicher Nachkommen exprimiert werden und biokompetentes Fibrinogen in die Milch des Säugetieres oder dessen weiblicher Nachkommen sekretiert wird; (e) Auffangen der Milch des Säugetieres oder dessen weiblicher Nachkommen; und (f) Gewinnen des Fibrinogens aus der Milch. Im Rahmen bevorzugter Ausführungsformen ist das Säugetier ein Schaf, Schwein, eine Ziege oder ein Rind.
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Innerhalb eines anderen Aspektes stellt die Erfindung ein Verfahren zur Fibronogenproduktion bereit, welches folgende Schritte enthält: (a) Bereitstellen eines transgenen, weiblichen, nichtmenschlichen Säugetieres, das in seiner Keimbahn heterologe, Aα-, Bβ- und γ-Fibrinogenketten-codierende DNA-Segmente trägt, wobei diese Segmente in einer Brustdrüse des Säugetieres exprimiert werden und das durch die DNA-Segmente codierte Fibrinogen in die Milch des Säugetieres sekretiert wird; (b) Auffangen der Milch des Säugetieres und (c) Gewinnen des Fibrinogens dieser Milch, wobei dieser Bereitstellungsschritt folgendes aufweist: Einbauen eines ersten DNA-Segments, welches ein mit einer Aα-Fibrinogenkette operativ verbundenes Sektretionssignal kodiert, eines zweiten DNA-Segments, welches ein mit einer Bβ-Fibrinogenkette operativ verbundenes Sektretionssignal kodiert, und eines dritten DNA-Segments, welches ein mit einer γ-Fibrinogenkette operativ verbundenes Sektretionssignal kodiert, in die Keimlinie des weiblichen, nicht humanen Säugers, wobei jedes dieser ersten, zweiten und dritten Segmente mit zusätzlichen DNA-Segmenten operativ verbunden ist, die für deren Expression in der Brustdrüse eines weiblichen Wirtssäugetieres notwendig sind, wobei die ersten, zweiten und dritten Segmente in einer einzigen Expressionseinheit verbunden sind.
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Im Rahmen eines anderen Aspektes stellt die Erfindung ein Verfahren zur Produktion von transgenen Nachkommen eines nichtmenschlichen Säugetieres bereit, welches folgende Schritte enthält: (a) Bereitstellen eines ersten, Fibrinogen-Aα-Kette-codierenden DNA-Segmentes, eines zweiten, Fibrinogen-Bβ-Kette-codierenden DNA-Segmentes und eines dritten, Fibrinogen-γ-Kette-codierenden DNA-Segmentes, wobei jedes der ersten, zweiten und dritten Segmente funktional mit einem zusätzlichen DNA-Segment verbunden ist, welches für die Expression in der Brustdrüse eines weiblichen Wirtssäugetieres und die Sekretion in die Milch dieses weiblichen Wirtssäugetieres notwendig ist; verknüpfen der ersten zweiten und dritten Segmente in eine einzelne Expressionseinheit; (b) Einfügen der einzelnen Expressionseinheit in ein befruchtetes Ei einer nichtmenschlichen Säugetierspezies; (c) Einführen dieses Eies in einen Eileiter oder Uterus eines Weibchens der nichtmenschlichen Spezies, um Nachwuchs zu erhalten, der die ersten, zweiten und dritten DNA-Segmente trägt. In einem verwandten Aspekt sieht die Erfindung die Züchtung nicht-menschlicher Säugetiere gemäß diesem Verfahren vor.
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Diese und andere Aspekte der Erfindung werden dem Fachmann unter Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung und die beigefügten Zeichnungen klar werden.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt das Subklonieren einer Humanfibrinogen-A.alpha-Ketten-DNA-Sequenz.
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2 ist eine teilweise Restriktionskarte des Vektors Zem228. Die verwendeten Symbole sind MT-1p, Mausmetallothioneinpromotor; SV40t, SV40-Terminator und SV40p, SV40-Promotor.
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3 stellt das Subklonieren einer Humanfibrinogen-B.beta-Ketten-DNA-Sequenz dar.
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4 stellt das Subklonieren einer Humanfibrinogen.gamma.Ketten-DNA-Sequenz dar.
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5 ist eine teilweise Restriktionskarte des Vektors Zem219b. Die verwendeten Symbole sind MT-1p, Mausmetallothioneinpromotor; hGHt, Humanwachstumshormonterminator; SV40p, SV40-Promotor; DHFR, Dihydrofolatreduktase-Gen und SV40t, SV40-Terminator.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Vor der detaillierten Beschreibung der Erfindung werden zum besseren Verständnis bestimmte Begriffe, die hierin verwendet werden, definiert: So wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „biokompetentes Fibrinogen” ein Fibrinogen, das polymerisiert, wenn es mit Thrombin behandelt wird, um unlösliches Fibrin zu bilden.
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Der Begriff „Ei” wird verwendet, um ein unbefruchtetes Ovum, ein befruchtetes Ovum vor der Fusion der Pronuclei oder einen Embryo im Frühstadium (befruchtetes Ovum mit fusionierten Pronuclei) zu bezeichnen.
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Ein „weibliches Säugetier, das Milch produziert, die biokompetentes Fibrogen enthält”, ist ein weibliches Säugetier, das nach der Schwangerschaft und Geburt während der Laktationsperiode Milch produziert, die gewinnbare Mengen von biokompetentem Fibrinogen enthält. Fachleute werden erkennen, dass solche Tiere Milch und somit das Fibrinogen diskontinuierlich erzeugen werden.
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Der Begriff „Nachkommen” wird in seinem üblichen Sinn verwendet und schließt Kinder und Nachfahren ein.
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Der Begriff „heterolog” wird verwendet, um genetisches Material zu bezeichnen, das aus einer anderen Spezies stammt als jener, in welche es eingefügt wurde, oder ein Protein, das aus diesem genetischen Material erzeugt wird.
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Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird transgene Tiertechnologie verwendet, um Fibrinogen innerhalb der Brustdrüsen eines weiblichen Wirtssäugetiers zu erzeugen. Die Expression in der Brustdrüse und die anschließende Sekretion des Proteins von Interesse in die Milch löst viele Schwierigkeiten, die auftreten, wenn Proteine von anderen Quellen isoliert werden. Die Milch wird einfach aufgefangen, ist in großen Mengen verfügbar und biochemisch gut charakterisiert. Ferner sind die wichtigsten Milchproteine in der Milch in hohen Konzentrationen (von ungefähr 1 bis 15 g/l) vorhanden.
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Von einem kommerziellen Standpunkt aus betrachtet ist es eindeutig vorzuziehen, als Wirt eine Spezies zu verwenden, die eine große Milchausbeute aufweist. Während kleinere Tiere wie Mäuse und Ratten verwendet werden können (und in der Phase des Konzeptnachweises bevorzugt werden), wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt, Viehzuchtsäugetiere zu verwenden, einschließlich – ohne darauf beschränkt zu sein – Schweine, Ziegen, Schafe und Kühe. Schafe werden besonders bevorzugt, und zwar aufgrund von Faktoren wie die vorherige Geschichte von Transgenese in dieser Spezies, der Milchausbeute, der Kosten und der guten Verfügbarkeit von Ausrüstungen zum Auffangen von Schafsmilch. Siehe
WO 88/00239 bezüglich eines Vergleichs von Faktoren, welche die Auswahl der Wirtsspezies beeinflussen. Es ist im Allgemeinen wünschenswert, eine Zucht von Wirtstier zu verwenden, die für die Verwendung in der Milchwirtschaft gezüchtet wurde, beispielsweise das Ostfrieslandschaf, oder Milchvieh durch Züchten der transgenen Linie zu einem späteren Zeitpunkt einzuführen. Auf jeden Fall sollten Tiere verwendet werden, von denen bekannt ist, dass sie sich in einem guten Gesundheitszustand befinden.
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Fibrinogen, das gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, kann Humanfibrinogen oder Fibrinogen eines nichtmenschlichen Tieres sein. Für medizinische Verwendungen wird die Verwendung von Proteinen bevorzugt, die für den Patienten nativ sind. Die vorliegende Erfindung stellt somit Fibrinogen zur Verwendung in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin bereit. Geklonte DNA-Moleküle, welche die Komponentenketten von Humanfibrinogen codieren, werden von Rixon et al. (Biochem. 22: 3237, 1983), Chung et al., (Biochem. 22: 3244, 1983), Chung et al. (Biochem. 22: 3250, 1983), Chung et al. (Adv. Exp. Med. Biol. 281: 39–48, 1990) und Chung et al. (Arm. NY Acad. Sci. 408: 449–456, 1983) offenbart. Rinderfibrinogenklone werden von Brown et al. (Nuc. Acids Res. 17: 6397, 1989) und Chung et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 466–1470, 1981) offenbart. Andere Säugetierfibrinogenklone werden von Murakawa et al. (Thromb. Haemost. 69: 351–360, 1993) offenbart. Repräsentative Sequenzen von humanen Aα- und .gmma.Kettengenen werden in SEQ ID Nr. 1, 3 bzw. 5 gezeigt. Fachleute werden erkennen, dass allele Varianten dieser Sequenzen bestehen werden, dass zusätzliche Varianten durch Aminosäuresubstitution, -deletion oder -insertion erzeugt werden können, und dass solche Varianten im Rahmen der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Im Allgemeinen wird bevorzugt, dass alle technischen Varianten nur eine begrenzte Anzahl an Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen aufweisen und dass alle Substitutionen konservativ sind. Somit wird bevorzugt, Fibrinogenkettenpolypeptide zu erzeugen, welche in Bezug auf die Sequenz mindestens zu 90%, vorzugsweise mindestens zu 95% und bevorzugter zu mindestens 99% oder mehr mit den entsprechenden nativen Ketten identisch sind. Der Begriff „γ-Kette” schließt die alternativ gespleißte gamma'-Kette von Fibrinogen ein (Chung et al., Biochem. 23: 4232–4236, 1984). Eine humane γ-Ketten-Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NR. 6 gezeigt. Die kürzere γ-Kette wird durch alternative Spleißung bei den Nucleotiden 9511 und 10054 von SEQ ID NR. 5 erzeugt, was zu einer Translation führt, die nach dem Nucleotid 10065 von SEQ ID NR. 5 endet.
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Um die Expression in der Brustdrüse zu erhalten, wird ein Transkriptionspromotor aus einem Milchprotein-Gen verwendet. Zu den Milchprotein-Genen gehören jene Gene, welche Caseine, β-Lactoglobulin (BLG), α-Lactalbumin und Milchserum acidisches-Protein codieren. Der β-Lactoglobulinpromotor wird bevorzugt. In dem Fall des Rinder-β-Lactoglobulin-Gens wird im Allgemeinen eine Region von mindestens dem proximalen 406 bp der 5' flankierenden Sequenz des Rinder-BLG-Gens verwendet werden (innerhalb der Nucleotide 3844 bis 4257 von SEQ ID NR. 7 enthalten). Größere Abschnitte der 5' flankierenden Sequenz, bis zu ungefähr 5 kbp, werden bevorzugt. Ein größeres DNA-Segment, das die 5' flankierende Promotorregion und die Region aufweist, welche den 5' nichtcodierenden Abschnitt des Beta-Lactoglobulingens codiert (innerhalb der Nucleotide 1 bis 4257 von SEQ ID NR. 7 enthalten), wird besonders bevorzugt. Siehe Whitelaw et al., Biochem J. 286: 31–39, 1992. Ähnliche Fragmente von Promotor-DNA von anderen Spezies sind ebenfalls geeignet.
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Andere Regionen des Beta-Lactoglobulingens können ebenfalls in Konstrukte eingebaut werden, so wie genome Regionen des zu exprimierenden Gens. Es ist allgemein auf dem Fachgebiet anerkannt, dass Konstrukte, denen es zum Beispiel an Intronen fehlt, im Vergleich zu solchen, die solche DNA-Sequenzen enthalten, schlecht exprimieren (siehe Brinster et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836–840, 1988; Palmiter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478–482, 1991; Whitelaw et al., Transgenic Res. 1: 3–13, 1991;
WO 89/01343 ;
WO 91/02318 ). In dieser Hinsicht wird im Allgemeinen bevorzugt, wann immer dies möglich ist, genome Sequenzen zu verwenden, die alle oder einige der nativen Introne eines Gens enthalten, welches das Protein oder Polypeptid von Interesse codiert. Im Rahmen bestimmter Ausführungsformen der Erfindung wird der weitere Einschluss von mindestens einigen Intronen aus dem Beta-Lactoglobulinen bevorzugt. Eine solche Region ist ein DNA-Segment, das für Intronspleißung und RNA-Polyadenylierung aus der 3' nichtcodierenden Region des Schaf-Beta-Lactoblobulingens sorgt. Wenn es durch die natürlichen 3' nichtcodierenden Sequenzen eines Gens ersetzt wird, kann dieses Schaf-Beta-Lactoglobulinsegment die Expressionspegel des Proteins oder Polypeptids von Interesse verstärken und stabilisieren. Im Rahmen anderer Ausführungsformen wird die Region, welche das Start-ATG von einer oder mehreren Fibrinogensequenzen umgibt, mit entsprechenden Sequenzen aus einem milchspezifischen Protein-Gen ersetzt. Dieses Ersetzen stellt eine putative gewebespezifische Startumgebung zur Verstärkung der Expression bereit. Es ist praktisch, die gesamte Fibrinogenkette pre-pro und die 5' nichtcodierenden Sequenzen mit jenen von beispielsweise dem BLG-Gen zu ersetzen, obwohl kleinere Regionen ersetzt werden können.
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Zur Expression von Fibrinogen werden DNA-Segmente, welche jede der drei Komponenten-Polypeptidketten von Fibrinogen codieren, funktional mit zusätzlichen DNA-Segmenten verbunden, die für ihre Expression erforderlich sind, um Expressionseinheiten zu produzieren. Solche zusätzlichen Segmente enthalten den oben erwähnten Milchproteingen-Promotor sowie Sequenzen, welche für die Termination der Transkription und Polyadenylierung von mRNA sorgen. Die Expressionseinheiten werden ferner ein DNA-Segment enthalten, welches ein Sekretionssignal codiert, das funktional mit dem Segment verbunden ist, das die Fibrinogenpolypeptidkette codiert. Das Sekretionssignal kann ein natives Fibrinogensekretionssignal sein oder eines von einem anderen Protein, wie ein Milchprotein. Der Begriff „Sekretionssignal” wird hierin verwendet, um jenen Abschnitt eines Proteins zu bezeichnen, der dieses durch den sekretorischen Pfad einer Zelle nach außen hin leitet. Sekretionssignale befinden sich am häufigsten an den Amino-Endungen von Proteinen. Siehe zum Beispiel von Heinje, Nuc. Acids. Res. 14: 4683–4690, 1986; und Meade et al.,
U.S.-Patentschrift Nr. 4,873,316 .
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Die Konstruktion von Expressionseinheiten wird praktischer Weise durch das Einführen einer Fibrinogenkettensequenz in einen Plasmid- oder Phagen-Vektor durchgeführt, welcher die zusätzlichen DNA-Segmente enthält, obwohl die Expressionseinheit im Wesentlichen durch jede Ligationssequenz konstruiert werden kann. Es ist besonders praktisch, einen Vektor bereitzustellen, der ein DNA-Segment enthält, welches ein Milchprotein codiert, und die codierende Sequenz für das Milchprotein durch jene einer Fibrinogenkette (einschließlich eines Sekretionssignals) zu ersetzen, wodurch eine Genfusion erzeugt wird, welche die Expressionskontrollsequenzen des Milchprotein-Gens enthält. Auf jeden Fall erleichtert das Klonieren der Expressionseinheiten in Plasmiden oder anderen Vektoren die Amplifizierung der Fibrinogensequenzen. Die Amplifizierung wird praktischer Weise in bakteriellen Wirtszellen (z. B. E. coli) durchgeführt, so dass die Vektoren typischer Weise einen Replikationsursprung und einen selektierbarken Marker enthalten, der in bakteriellen Wirtszellen funktional ist.
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Bei den Verfahren der gegenständlichen Erfindung sind die drei Expressionseinheiten in einem einzelnen geeigneten Vektor verbunden, wie etwa ein künstliches Hefe-Chromosom oder ein Phage-P1-Klon. Kodierungssequenzen für die drei Ketten können in polycistronischen Expressionseinheiten kombiniert werden (siehe z. B. Levinson et al.,
U.S. Patentschrift Nr. 4,713,339 ).
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Die einzelne Expressionseinheit wird danach in befruchtete Eier (einschließlich Embryos im Frühstadium) der ausgewählten Wirtsspezien eingefügt. Das Einfügen von heterologer DNA kann über eine oder mehrere Routen erfolgen, einschließlich Mikroinjektion (z. B.
U.S.-Patentschrift Nr. 4,873,191 ), retrovirale Infektion (Jaenisch, Science 240: 1468–1474, 1988) oder stellengerichtete Integration unter Verwendung von embryonalen Stammzellen (ES) (rezensiert durch Bradley et al., Bio/Technology 10: 534–539, 1992). Die Eier werden dann in die Eileitungen oder Uteri von pseudoschwangeren Weibchen eingepflanzt, und es wird ihnen ermöglicht, sich bis zum Ende zu entwickeln. Nachwuchs, welcher die eingefügte DNA in seiner Keimbahn trägt, kann die DNA auf seine Nachkommen in der normalen Mendelschen Weise weitergeben, wodurch die Entwicklung von transgenen Herden ermöglicht wird. Allgemeine Verfahren zur Erzeugung von transgenen Tieren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6: 179–183, 1988; Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645–651, 1985; Buhler et al., Bio/Technology 8: 140–143, 1990; Ebert et al., Bio/Technology 9: 835–838, 1991; Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 844–847, 1991; Wall et al., J. Cell. Biochem. 49: 113–120, 1992; und WIPO-Veröffentlichungen
WO 88/00239 ,
WO 90/05188 ,
WO 92/11757 ; und
GB 87/00458 , welche hiermit hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden. Techniken für das Einfügen von fremden DNA-Sequenzen in Säugetiere und ihre Keimzellen wurden ursprünglich in der Maus entwickelt. Siehe z. B. Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380–7384, 1980; Gordon and Ruddle, Science 214: 1244–1246, 1981; Palmiter and Brinster, Cell 41: 343–345, 1985; Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438–4442, 1985; und Hogan et al. (ibid.). Diese Techniken wurden in der Folge zur Verwendung mit größeren Tieren angepasst, einschließlich Zuchtviehspezien (siehe z. B. WIPO-Veröffentlichungen
WO 88/00239 ,
WO 90/05188 und
WO 92/11757 ; und Simons et al., Bio/Technology 6: 179–183, 1988). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei der effizientesten Route, die bis dato bei der Erzeugung von transgenen Mäusen oder Zuchtvieh verwendet wird, mehrere hundert lineare Moleküle der DNA von Interesse in einen oder mehrere Pronuclei eines befruchteten Eies injiziert werden. Die Injektion von DNA in das Cytoplasma eines Zygoten kann ebenfalls durchgeführt werden.
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Um eine ausgewogene Expression jeder Fibrinogenkette zu erhalten, um eine effiziente Bildung des reifen Proteins zu ermöglichen, befinden sich die drei Expressionseinheiten auf demselben DNA-Molekül für das Einfügen in Eier. Dieser Ansatz kann jedoch technische Probleme mit sich bringen, zum Beispiel bei der Injektion und bei den Manipulationsphasen. Zum Beispiel kann die Größe von Fibrinogenexpressionseinheiten die Verwendung von künstlichen Hefechromosomen (YACs) oder des Phagen P1 erfordern, um die DNA vor der Injektion zu amplifizieren und zu manipulieren. Wenn dieser Ansatz verfolgt wird, sind Segmente der zu injizierenden DNA, welche alle drei Expressionseinheiten enthalten, sehr groß, wodurch eine Änderung des Injektionsverfahren beispielsweise durch Verwendung von Nadeln mit größeren Bohrungen erforderlich ist. Im Allgemeinen werden weibliche Tiere durch eine Behandlung mit follikelstimulierendem Hormon superovuliert und danach gepaart. Befruchtete Eier werden aufgefangen und die heterologe DNA unter Anwendung bekannter Verfahren in die Eier injiziert. Siehe zum Beispiel die
US-Patentschrift Nr. 4,873,191 ; Gordon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7380–7384, 1980; Gordon and Ruddle, Science 214: 1244–1246, 1981; Palmiter and Brinster, Cell 41: 343–345, 1985; Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438–4442, 1985; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons et al., Bio/Technology 6: 179–183, 1988; Wall et al., Biol. Reprod. 32: 645–651, 1985; Buhler et al., Bio/Technology 8: 140–143, 1990; Ebert et al., Bio/Technology 9: 835–838, 1991; Krimpenfort et al., Bio/Technology 9: 844–847, 1991; Wall et al., J. Cell. Biochem 49: 113–120, 1992; WIPO-Veröffentlichungen
WO 88/00239 ,
WO 90/05118 und
WO 92/11757 ; und
GB 87/00458 .
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Für die Injektion in befruchtete Eier werden die Expressionseinheiten aus ihren jeweiligen Vektoren durch Digestion mit geeigneten Restriktionsenzymen entfernt. Aus praktischen Gründen wird bevorzugt, die Vektoren so zu gestalten, dass die Expressionseinheiten durch Spaltung mit Enzymen entfernt werden, die weder innerhalb der Expressionseinheiten noch sonst wo in den Vektoren schneiden. Die Expressionseinheiten werden durch herkömmliche Verfahren gewonnen, zum Beispiel durch Elektroeluierung, gefolgt von Phenolextraktion und Ethanolpräzipitation, Sucrosedichtegradientzentrifugation oder Kombinationen dieser Vorgangsweisen.
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DNA wird in Eier im Wesentlichen so injiziert, wie in Hogan et al., ibid., beschrieben. In einer typischen Injektion werden Eier in einer Schale eines Embryokulturmediums unter Verwendung eines Stereozoom-Mikroskops angeordnet (x50 oder x63 Vergrößerung wird bevorzugt). Geeignete Medien sind z. B. Hepes (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) oder bicarbonatgepufferte Medien wie M2 oder M16 (erhältlich bei Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) oder ein synthetisches Eileitermedium (unten beschrieben). Die Eier werden gesichert und zum Zentrum eines Glasobjektträgers auf einer Injektionsvorrichtung übertragen, zum Beispiel mit Hilfe einer Drummond-Pipette, einschließlich eines Kapillarröhrchens. In diesem Stadium wird eine Betrachtung mit geringerer Vergrößerung (z. B. x4) verwendet. Unter Verwendung der Haltepipette der Injektionsvorrichtung werden die Eier zentral auf dem Objektträger positioniert. Einzelne Eier werden sequentiell an der Haltepipette befestigt, um dann injiziert zu werden. Für jedes Injektionsverfahren wird die Haltepipette/das Ei in das Zentrum des Sichtfelds positioniert. Die Injektionsnadel wird dann direkt unter das Ei angeordnet. Vorzugsweise unter Verwendung von x40 Nomarski-Objektiven werden beide Manipulatorhöhen eingestellt, um sowohl das Ei als auch die Nadel zu fokussieren. Die Pronuclei werden durch Drehen des Eies und Einstellen der Haltepipetteanordnung nach Bedarf eingestellt. Sobald der Pronucleus positioniert worden ist, wird die Höhe des Manipulators geändert, um die pronucleare Membran zu fokussieren. Die Injektionsnadel wird unterhalb des Eies positioniert, so dass die Nadelspitze in einer Position unterhalb des Zentrums des Pronucleus ist. Die Position der Nadel wird danach mit Hilfe der Injektionsmanipulatoranordnung geändert, um die Nadel und den Pronucleus auf dieselbe fokale Ebene zu bringen. Die Nadel wird über den Joystick auf der Injektionsmanipulatoranordnung in eine Position rechts von dem Ei bewegt. Mit einer kurzen, fortlaufenden Stichbewegung wird die pronucleare Membran durchstoßen, um die Nadelspitze innerhalb des Pronucleus zu belassen. Auf die Injektionsnadel wird über die Glasspritze Druck ausgeübt, bis der Pronucleus auf ungefähr das doppelte seines Volumens anschwillt. Zu diesem Zeitpunkt wird die Nadel langsam entfernt. Nun wird auf eine geringere Vergrößerung (z. B. x4) zurückgekehrt, das injizierte Ei zu einem anderen Bereich des Objektträgers bewegt und das Verfahren mit einem anderen Ei wiederholt.
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Nachdem die DNA injiziert wurde, können die Eier kultiviert werden, um den Pronuclei zu erlauben, zu fusionieren, wodurch einzellige Embryos oder Embryos in einem späteren Stadium erzeugt werden. Im Allgemeinen werden die Eier ungefähr bei Körpertemperatur der verwendeten Spezies in einem gepufferten Medium kultiviert, das ausgewogene Salze und Serum enthält. Überlebende Embryos werden dann zu den pseudoschwangeren aufnehmenden Weibchen übertragen, typischer Weise indem sie in den Eileiter oder Uterus eingeführt werden, und es wird ihnen ermöglicht, sich zu Ende zu entwickeln. Während der Embryogenese integriert sich die injizierte DNA in einer zufälligen Weise in die Genome einer kleinen Anzahl der sich entwickelnden Embryos.
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Potentieller transgener Nachwuchs wird durch Blutproben und/oder Gewebebiopsie untersucht. Aus diesen Proben wird DNA erstellt und auf das Vorhandensein des injizierten Konstruktes durch Techniken wie Polymerasekettenreaktion (PCR; siehe Mullis,
US-Patentschrift Nr. 4,683,202 ) und Southern-Blotting (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503, 1975; Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) überprüft. Transgene Founder-Tiere oder GOs können vollständig transgen sein, wobei sie in allen ihren Zellen Transgene aufweisen, oder mosaikartig sein, wobei sie Transgene nur in einer Teilmenge von Zellen aufweisen (siehe zum Beispiel Wilkie et al., Develop. Biol. 118: 9–18, 1986). In letzterem Fall können Gruppen von Keimzellen ganz oder teilweise transgen sein. In letzterem Fall wird die Anzahl von transgenen Nachkommen aus einem Gründer-Tier geringer sein als die erwarteten 50%, die durch die Mendel'schen Prinzipien vorhergesagt werden. Gründer-G0-Tiere werden bis zur geschlechtlichen Reife gezüchtet und danach gepaart, um Nachwuchs oder G1s zu erhalten. Die G1s werden auch auf die Gegenwart des Transgens untersucht, um die Übertragung von den Gründer-G0-Tieren aus zu zeigen in dem Fall von männlichen G0s können diese mit mehreren nicht-transgenen Weibchen gepaart werden, um zahlreichen Nachwuchs zu erzeugen. Dies erhöht die Chancen, dass eine Transgenübertragung eintritt. Weibliche G0-Gründer können auf natürliche Weise gepaart, künstlich besamt oder superovuliert werden, um viele Eier zu erhalten, die auf Ersatzmütter übertragen werden. Der zuletzt genannte Vorgang ergibt die besten Chancen für eine Übertragung in Tieren, welche eine begrenzte Anzahl an Jungen aufweisen. Die oben beschriebenen Züchtungsverfahren werden verwendet, um Tiere zu erhalten, welche die DNA auf nachfolgende Generationen oder Nachwuchs in der normalen Mendelschen Weise übertragen können, wodurch die Entwicklung von z. B. Kolonien (Mäuse), Herden (Schafe) oder anderen Herden (Schweine, Ziegen und Kühe) transgener Tiere ermöglicht wird.
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Die Milch von laktierenden G0- und G1-Weibchen wird auf die Expression des heterologen Proteins unter Anwendung von immunologischen Techniken wie ELISA (siehe Harlow and Lane, Antibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) und Western-Blotting (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350–4354, 1979) untersucht. Aus einer Reihe von auf dem Fachgebiet bekannten Gründen wird erwartet, dass sich die Expressionspegel des heterologen Proteins je nach Individuum voneinander unterscheiden.
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Eine zufriedenstellende Familie von Tieren sollte drei Kriterien erfüllen: Die Tiere sollten von demselben Gründer-G0-Tier stammen; sie sollten eine stabile Übertragung des Transgens aufweisen; und sie sollten stabile Expressionspegel von Generation zu Generation und von Laktation zu Laktation der einzelnen Tiere aufweisen. Diese Prinzipien wurden dargestellt und besprochen (Carver et al., Bio/Technology 11: 1263–1270, 1993). Tiere aus einer solchen geeigneten Familie werden als eine „Linie” bezeichnet. Anfangs werden männliche Tiere, G0 oder G1, verwendet, um eine Herde von produzierenden Tieren durch natürliche oder künstliche Besamung zu gewinnen. Auf diese Weise können viele weibliche Tiere, welche dasselbe Transgenintegrationsereignis enthalten, schnell erzeugt werden, so dass aus ihnen Milch erhalten werden kann.
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Das Fibrinogen wird aus Milch unter Anwendung von Standardverfahren, beispielsweise Abschöpfen, Präzipitation, Filtrierung und Proteinchromatographietechniken, gewonnen.
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Fibrinogen, das gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wird, ist in der Human- und der Veterinärmedizin nützlich z. B. bei der Formulierung von chirurgischen Klebemitteln. Klebemittel dieser Art sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z. B.
US-Patentschriften Nr. 4,377,572 ;
4,442,655 ;
4,462,567 und
4,627,879 . Im Allgemeinen werden Fibrinogen und Faktor XIII kombiniert, um eine erste Komponente zu bilden, die unmittelbar vor der Verwendung mit einer zweiten Komponente vermischt wird, welche Thrombin enthält. Das Thrombin wandelt das Fibrinogen in Fibrin um, wodurch das Gemisch geliert, und aktiviert den Faktor XIII. Der aktivierte Faktor XIII quervernetzt das Fibrin, um die Klebemittelmatrix zu stärken und zu stabilisieren. Solche Klebemittel enthalten typischer Weise von ungefähr 30 mg/ml bis ungefähr 100 mg/ml Fibrinogen und von ungefähr 50 μg/ml bis ungefähr 500 μg/ml Faktor XIII. Sie können auch zusätzliche Inhaltsstoffe enthalten, wie Aprotinin, Albumin, Fibronektin, Quellmittel und Lösungsvermittler. Verfahren zur Herstellung von Faktor XIII sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel
U.S.-Patentschrift Nr. 5,204,447 . Das Fibrinogen ist auch für das Beschichten von Oberflächen von polymeren Artikeln nützlich, z. B. synthetische Gefäßtransplantate, so wie in der
US-Patentschrift Nr. 5,272,074 offenbart.
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Die Erfindung wird ferner durch folgende nicht einschränkend wirkende Beispiele dargestellt. Diese Beispiele sind nur insofern ein Teil der gegenständlichen Erfindung, als sie in den Schutzbereich der Ansprüche fallen. Jene Beispiele oder Teile der Beispiele, die außerhalb des Schutzbereichs der Ansprüche fallen, sind rein als Hintergrundinformation vorgesehen.
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Beispiele
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Beispiel I
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Die mehrfache Klonierungsstelle des Vektors pUC18 (Panisch-Perron et al., Gene 33: 103–119, 1985) wurde entfernt und durch ein synthetisches Doppelstrang-Oligonucleotid (die Stränge sind in SEQ ID Nr. 8 und SEQ ID Nr. 27 gezeigt) ersetzt, welches die Restriktionsstellen Pvu I/Mlu I/Eco RV/Xba I/Pvu I/Mlu I enthält und von 5' Überhängen flankiert ist, die mit den Restriktionsstellen Eco RI und Hind III kompatibel sind. pUC18 wurde sowohl mit Eco III als auch Hind III gespalten, die 5' terminalen Phosphatgruppen wurden mit Kälberdarmphosphatase entfernt und das Oligonucleotid in die Vektor-Hauptkette ligiert. Die DNA-Sequenz über die Verbindung wurde durch Sequenzierung bestätigt und das neue Plasmid als pUCPM bezeichnet.
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Die β-Lactoglobulin (BLG)-Gensequenzen aus pSS1tgXS (offenbart in der WIPO-Veröffentlichung
WO 88/00239 ) wurden als ein Sal I-Xba-I-Fragment ausgeschnitten und in den Vektor pUCPM rekloniert, der mit Sal I und Xba I geschnitten worden war, um den Vektor pUCXS zu erzeugen. pUCXS ist somit ein pUC18-Derivat, welches das gesamte BLG-Gen von der Sal-I-Stelle bis zur Xba-I-Stelle von Phage SS1 enthält (Ali and Clark, J. Mol. Biol. 199: 415–426, 1988).
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Das Plasmid pSS1tgSE (offenbart in der WIPO-Veröffentlichung
WO 88/00239 ) enthält ein 1290-bp-BLG-Fragment, flankiert von Sph I und EcoR I Restriktionsstellen, eine Region, die eine unikale Not I Stelle und eine einzelne Pvu II Stelle überspannt, welche in dem 5' untranslatierten Leader von BLG mRNA liegt. In diese Pvu II Stelle wurde ein doppelstrangiger, 8 bp DNA-Linker (5'-GGATATCC-3') ligiert, der die Erkennungsstelle für das Enzym Eco RV codiert. Dieses Plasmid wurde als pSS1tgSE/RV bezeichnet. DNA-Sequenzen, die durch Sph I und Not I Restriktionsstellen in pSS1tgSE/RV gebunden sind, wurden durch enzymatische Digestion ausgeschnitten und verwendet, um das äquivalente Fragment in pUCXS zu ersetzen. Das resultierende Plasmid wurde als pUCXSRV bezeichnet. Die Sequenz des BLG-Inserts in pUCSXRV wird in SEQ ID NR. 7 gezeigt, mit der unikalen Eco RV Stelle bei Nucleotid 4245 in der 5' untranslatierten Leader-Region des BLG-Gens. Diese Stelle ermöglicht das Einführen beliebiger zusätzlicher DNA-Sequenzen unter der Kontrolle des BLG-Promotors 3' zur Transkriptionsstartstelle.
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Unter Verwendung der Primer BLGAMP3 (5'-TGG ATC CCC TGC CGG TGC CTC TGG-3'; SEQ ID NR. 9) und BLGAMP4 (5'-AAC GCG TCA TCC TCT GTG AGC CAG-3'; SE ID NR. 10) wurde ein PCR-Fragment von ungefähr 650 bp aus den Sequenzen unmittelbar 3' zum Stopp-Codon des BLG-Gens in pUCXSRV produziert. Das PCR-Fragment wurde konstruiert, um eine BamH-I-Stelle an seinem 5'-Ende und eine Mlu-I-Stelle an seinem 3'-Ende aufzuweisen und wurde als solches in BamH I und Mlu I geschnittenes pGEM7zf(+) (Promega) kloniert, um pDAM200(+) zu ergeben.
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pUCXSRV wurde mit Kpn I digeriert und die größte, vektorenthaltende Bande wurde gelgereinigt. Diese Bande enthielt die gesamten pUC-Plasmidsequenzen und einige 3' nichtcodierende Sequenzen aus dem BLG-Gen. In diese Hauptkette wurde das kleine Kpn-I-Fragment aus pDAM200(+) ligiert, welches in der korrekten Ausrichtung effizient eine BamH-I-Stelle an dem äußersten 5' Ende von 2,6 Kbp der BLG 3' flankierenden Region konstruierte. Dieses Plasmid wurde als pBLAC200 bezeichnet. Ein 2,6 Kbp Cla I-Xba-I-Fragment aus pBLAC200 wurde in einen Cla I-Xba I geschnittenen pSP72-Vektor (Promega) ligiert, wodurch eine EcoR-V-Stelle unmittelbar stromaufwärts von den BLG-Sequenzen platziert wurde. Dieses Plasmid wurde als pBLAC210 bezeichnet.
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Das 2,6 Kbp Eco RV-Xba I Fragment aus pBLAC210 wurde in Eco RV-Xba I geschnittenen pUCXSRV ligiert, um pMAD6 zu bilden. Dadurch wurden in der Tat alle codierenden und Intronsequenzen aus pUCXSRV ausgeschnitten, wodurch ein BLG-Minigen gebildet wurde, das aus 4,3 Kbp von 5' Promotor und 2,6 Kbp von 3' stromabwärtigen Sequenzen, welche eine einzigartige EcoR-V-Stelle flankieren, besteht. Ein Oligonucleotid-Linker (ZC6830: ACTACGTAGT; SEQ ID NR. 11) wurde in die Eco-RV-Stelle von pMAD6 eingefügt. Diese Modifizierung zerstörte die Eco-RV-Stelle und erzeugte eine Sna-BI-Stelle, die für Klonierungszwecke verwendet werden soll. Der Vektor wurde als pMAD6-Sna bezeichnet. Messenger-RNA startet stromaufwärts von der Sna-BI-Stelle und endet stromabwärts von der Sna-BI-Stelle. Das Vorläufertranskript wird ein einfaches BLG-abgeleitetes Intron codieren, Intron 6, welches zur Gänze innerhalb der 3' untranslatierten Region des Gens liegt.
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Beispiel II
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Klone, welche die einzelnen Fibrinogenketten codieren, wurden aus dem Labor von Dr. Earl W. Davle, University of Washington, Seattle, erhalten. Ein genomer Fibrinogen-Aα-Ketten-Klon (Chung et al., 1990, ibid.) wurde aus dem Plasmid BS4 erhalten. Dieses Plasmid enthält den Aα-Klon, der in die Sal I und Bam HI Stellen des Vektors pUC18 eingefügt wurde, es fehlt ihm aber die Codierungssequenz für die ersten vier Aminosäuren der Aα-Kette. Eine genome Bβ-Ketten-DNA (Chung et al., ibid.) wurde aus einem Lambda-Charon-4A-Phage-Klon (als βlamda4 bezeichnet) als zwei EcoRI-Fragmente von jeweils ca. 5.6 Kbp isoliert. Die zwei Fragmente wurden getrennt in pUC19 kloniert, der mit Eco RI digeriert und mit Kälberdarmphosphatase behandelt wurde. Die resultierenden Klone wurden durch Digestion mit dem Restriktionsenzym Pvu II untersucht, um Plasmide mit den 5' und 3' Bβ Einschüben zu unterscheiden (als Beta5'RI/puc und Beta3'RI/puc bezeichnet). Genome .gamma.Ketten-Klone wurden so isoliert wie von Rixon et al. beschrieben (Biochemistry 24: 2077–2086, 1985). Der Klon p.gamma.12A9 enthält 5' nichtcodierende Sequenzen und ungefähr 4535 bp von .gamma.Ketten-Codierungssequenz. Klon p.gamma.12F3 enthält die verbleibende Codierungssequenz und 3' nicht-codierende Nucleotide. Beide sind pBR322-basierende Plasmide mit den Fibrinogensequenzen eingefügt an der EcoRI-Stelle. Diese Plasmide wurden als Matrize für die jeweiligen PCR-Reaktionen verwendet.
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Die Fibrinogenketten-codierenden Sequenzen wurden für das Einfügen in Expressionsvektoren unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR), wie allgemein durch Mullis beschrieben (
US-Patentschrift Nr. 4,683,202 ) maßgeschneidert. Dieses Verfahren entfernte native 5' und 3' untranslatierte Sequenzen, fügte eine 9-Basen-Sequenz (CCT GCA GCC) stromaufwärts des ersten ATG von jeder Codierungssequenz hinzu, stellte die ersten vier Codons für die Aα-Kettensequenz bereit, entfernte eine interne Mlu-I-Stelle in der Aα-Sequenz und fügte Restriktionsstellen hinzu, um nachfolgende Klonierungsschritte zu erleichtern.
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Unter Bezugnahme auf 1 wurde das 5' Ende der Aα Codierungssequenz in einer PCR-Reaktion maßgeschneidert, welche 20 pmole für jeden der Primer ZC6632 (SEQ ID NR. 12) und ZC6627 (SEQ ID NR 13) enthält, ungefähr 10 ng Plasmid BS4 Matrizen-DNA, 10 μl einer Mischung, die jeweils 2.5 mM dNTP enthält, 7,5 μl 10fach Pyrococcus furiosus (Pfu)-DNA-Polymerasepuffer #1 (200 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,2, 100 mM KCl, 60 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 100 μg/ml nukleasefreies Rinderserumalbumin) (Stratagene, La Jolla, CA) und Wasser auf 75 μl enthält. Das Gemisch wurde auf 94°C in einem DNA Thermocyclen (Perkin-Elmer Corp. Norwal, CT) erhitzt. Zum erhitzten Gemisch wurden 25 μl eines Gemischs hinzugefügt, das 2,5 μl 10fach Pfu-Puffer #1, 22 μl H2O und 1 μl 2,5 Einheiten/μl Pfu DNA-Polymerase (Stratagene) enthielt. Die Reaktionen wurden in einem DNA Thermocyclen (Perkin-Elmer) fünf Zyklen lang mit 94°, 45 Sekunden durchgeführt; 40°, 90 Sekunden; 72°, 120 Sekunden; 20 Zyklen mit 94°, 45 Sekunden; 45°, 90 Sekunden; 72°, 120 Sekunden; danach sieben Minuten lang bei 72° inkubiert. Das 5'-PCR-erzeugte Fragment wurde mit Bar HI und Hind III digeriert und das Bam HI-Hind-III-Fragment danach an ein internes 2,91-Kbp-Hind-III-Xba-I-Fragment und Bam HI, Xba I-digerierten pUC18 ligiert. PCR-erzeugte Exonsequenzen wurden sequenziert.
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Unter nochmaliger Bezugnahme auf 1 wurde das 3'-Ende der Aα-Codierungssequenz in einer Reihe von Schritten maßgeschneidert, in denen die Mlu-I-Stelle 563 Basen stromaufwärts von dem Stopp-Codon der Aα-Sequenz mit Hilfe einer Überlappungsextensions-PCR-Reaktion mutiert wurde (Ho et al., Gene 77: 51–59, 1989). In der ersten Reaktion wurden 40 pmole von jedem der Primer ZC6521 (SEQ ID NR. 14) und ZC6520 (SEQ ID NR. 15) mit ungefähr 10 ng Plasmid-BS4-Matrizen-DNA in einem Reaktionsgemisch, wie oben beschrieben, kombiniert. Die Reaktion wurde 5 Zyklen lang bei 94°, 45 Sekunden; 40°, 60 Sekunden; 72°, 120 Sekunden durchgeführt; 15 Zyklen bei 94°, 45 Sekunden; 45°, 60 Sekunden; 72°, 120 Sekunden; danach sieben Minuten lang bei 72° inkubiert. Eine zweite Reaktion wurde in derselben Weise unter Verwendung von 40 pmole von jedem der Primer ZC6519 (SEQ ID NR. 16) und ZC6518 (SEQ ID NR. 17) und BS4 als Matrize durchgeführt. Die PCR-erzeugten DNA-Fragmente aus der ersten und der zweiten Reaktion wurden durch Gel-Elektrophorese und Eluierung aus dem Gel isoliert. Ungefähr 1/10 jedes gewonnenen Reaktionsproduktes wurde mit 40 pmole von jedem der Primer ZC6521 (SEQ ID NR. 14) und ZC6518 (SEQ ID NR. 17) in einer PCR-Reaktion kombiniert, in welcher die komplementären 3'-Enden von jedem Fragment (welche die Einzelbasenänderung enthielten) ein Annealing durchmachten und als ein Primer für die 3'-Extension des komplementären Strangs dienten. Die PCR wurde unter Verwendung derselben Reaktionsbedingungen wie in dem ersten und dem zweiten 3'-PCR-Schritt durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde danach mit Xba I und Bar HI digeriert und das Xba I-Bam HI-Fragment in Xba I, Bam HI-digerierten pUC18 kloniert. PCR-erzeugte Exone wurden sequenziert.
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Wie in
1 gezeigt, wurden das 5' Bam HI-Xba I Fragment (3,9 Kbp) und das 3' Xba I-Bam HI Fragment (1,3 Kbp) in die Bam HI Stelle des Vectors Zcm228 eingefügt. Zcm228 ist ein pUC18-Derivat, welches eine Bam HI Klonierungsstelle zwischen einem Maus-MT-1-Promotor und einem SV40-Terminator, und einen Neomycinwiderstandsmarker, flankiert durch SV40-Promotor- und -Terminatorsequenzen, aufweist. Siehe dazu die Veröffentlichung des Europäischen Patentamtes
EP 319,944 und
2. Die gesamte Aα-Codierungssequenz wurde aus dem Zem228-Vektor als ein Sna-BI-Fragment isoliert, welches in die Sna-BI-Stelle des Plasmids pMAD6-Sna eingefügt wurde.
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Bezugnehmend auf 3 das 5'-Ende der Bβ-Kette durch PCR wurde unter Verwendung der Oligonucleotide ZC6629 (SEQ ID NR. 18), ZC6630 (SEQ ID NR. 19) und ZC6625 (SEQ ID NR. 20) maßgeschneidert. Diese Primer wurden in paarweisen Kombinationen (ZC6629+ZC6625 oder ZC6630+ZC6625) verwendet, um Bβ-Codierungssequenzen zu erzeugen, und zwar beginnend am ersten ATG-Codon (Position 470 in SEQ ID NR. 3) (als N1-Beta bezeichnet) oder dem dritten ATG-Codon (Position 512 in SEQ ID NR. 3) (als N3-Beta bezeichnet). Ungefähr 5 ng Beta5'RI/puc-Matrizen-DNA wurde mit 20 pmole von jedem der Primer (N1-Beta:ZC6629, SEQ ID NR. 18 + ZC6625, SEQ ID NR. 20; oder N3-Beta:ZC6630, SEQ ID NR. 19 + ZC6625, SEQ ID NR. 20) in einem Reaktionsgemisch, wie oben beschrieben, kombiniert. Die Gemische wurden 5 Zyklen lang inkubiert bei 94°, 45 Sekunden; 40°, 120 Sekunden; (N1-Beta) oder 90 Sekunden (N3-Beta); 72°, 120 Sekunden; 20 Zyklen von 94°, 45 Sekunden; 45°, 120 Sekunden; (N1-Beta) oder 90 Sekunden (N3-Beta); 72°, 120 Sekunden; danach sieben Minuten lang bei 72° inkubiert. Die zwei Reaktionsprodukte N1, 555 bp oder N3, 510 bp) wurden jeweils mit Eco RI und Bgl II digeriert und die Fragmente an das interne Bgl II-Xba I Fragment und Eco RI + Xba I-digerierte pUC19 ligiert. Das 3'-Ende der Bβ-Sequenz wurde in einem Reaktionsgemisch, wie oben beschrieben, unter Verwendung der Oligonucleotidprimer ZC6626 (SEQ ID NR. 21) und ZC6624 (SEQ ID NR. 22) und ungefähr 5 ng Beta3'RI/puc-Matrize maßgeschneidert. Die Gemische wurden 5 Zyklen lang inkubiert bei 94°, 45 Sekunden; 40°, 90 Sekunden; 72°, 120 Sekunden; 15 Zyklen von 94°, 45 Sekunden; 45°, 90 Sekunden; 72°, 120 Sekunden; danach sieben Minuten lang bei 72° inkubiert. Ein 990 bp Bgl II-Eco RI Fragment wurde isoliert. Dieses 3'-Fragment wurde an das benachbarte Codierungsfragment (340 bp, SphI-Bgl II) und Sph I + Eco RI-digerierte pUC19 ligiert. Die 3' und 5' PCR-erzeugten Exons wurden sequenziert. Ein dritter Zwischenvektor wurde konstruiert, indem zwei interne Fragmente (4285 bp Xba I-Eco RI und 383 kb Eco RI-Sph I) in Xba I + Sph I-digeriertem pUCl9 kombiniert wurden. Die gesamte Bβ-Codierungssequenz (zwei Formen) wurde dann zusammengefügt, indem eines der 5' Eco RI-Xba I Fragmente, das interne Xba I-Sph I Fragment, das 3' Sph I-Eco RI-Fragment und der Eco RI-digerierte Vektor pUC19 ligiert wurden. Die Bβ-Sequenz wurde danach als ein 7,6 Kbp Sna BI Fragment isoliert und in die Sna BI Stelle von pMAD6-Sna eingefügt.
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Bezugnehmend auf 4, es wurde das 5'-Ende der Gammakettensequenz durch PCR maßgeschneidert, unter Verwendung der Oligonucleotidprimer ZC6514 (SEQ ID NR. 23) und ZC6517 (SEQ ID NR. 24) und ungefähr 50 ng p.gamma.12A9 als Matrize. Die PCR-Reaktion wurde wie oben beschrieben unter Verwendung von 40 pM jedes Primers durchgeführt. Die Reaktion wurde 5 Zyklen lang bei 94°, 45 Sekunden; 40°, 60 Sekunden, 72°, 120 Sekunden durchgeführt, gefolgt von 15 Zyklen bei 94°, 45 Sekunden; 45°, 60 Sekunden; 72°, 120 Sekunden. Das resultierende 213 bp Fragment wurde mit Bam HI und Spe I digeriert und das resultierende Restriktionsfragment mit dem benachbarten stromabwärtigen 4.4 kb Spe I-Eco RI Fragment und Bam HI + Eco RI digeriertem pUC19 ligiert. Das 3'-Ende der Gammakettensequenz wurde maßgeschneidert, unter Verwendung von Oligonucleotidprimern ZC6516 (SEQ ID NR. 25) und ZC6515 (SEQ ID NR. 26), unter Verwendung von 40 pM von jedem Primer, ungefähr 50 ng p.gamma.12F3-Matrize und demselben thermischen Zyklusplan, der für das 5'-Fragment verwendet wurde. Das resultierende 500 bp Fragment wurde mit Spe I und Bam HI digeriert und das resultierende Restriktionsfragment mit dem stromaufwärtigen 2,77 kb Eco RI-Spe I Fragment und Eco RI + Bam HI-digerierten pUC19 ligiert. Alle PCR-erzeugten Exons wurden sequenziert. Die gesamte γ'-Ketten-Codierungssequenz wurde danach zusammengefügt, indem ein 4,5 Kbp Bam HI-Eco RI 5' Fragment, ein 1,1 Kbp Eco RI-Pst I internes Fragment und ein 2,14 Kbp Pst I-Xba 13' Fragment in Bam HI + -Xba I-digeriertem Zem219B ligiert wurden. Zem219b ist ein pUC18-abgeleiteter Vektor, welcher einen Mausmetallothioneinpromotor und einen DHFR-selektierbaren Marker enthält, der funktional mit einem SV40-Promotor verbunden ist (5). Plasmid Zem219b wurde bei der American Type Culture Collection als ein E. coli XL1-blue Transformant unter der Zugriffsnummer 68979 hinterlegt. Die gesamte γ'-Ketten-Codiemngssequenz wurde danach als ein 7,8 Kbp Sna BI Fragment isoliert und in die Sna BI Stelle von pMAD6-Sna eingefügt.
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Beispiel III
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Mäuse für anfängliches Züchten (C57BL6J, CBACA) wurden von Harlan Olac Ltd. (Bicester, UK) erhalten. Diese wurden in Paaren gepaart, um F1-Hybrid-Cross (B6CBAF1) für empfangende Weibchen, superovulierte Weibchen, männliche Zuchttiere und vasektomierte Männchen zu erzeugen. Alle Tiere wurden auf einem Zyklus von 14 Stunden Licht/10 Stunden Dunkelheit gehalten, und es wurde ihnen Wasser und Nahrung ad libitum zugeführt (Special Diet Services RM3, Edinburgh, Schottland).
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Transgene Mäuse wurden im Wesentlichen so erzeugt wie in Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986, beschrieben, das hiermit zur Gänze durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Weibliche B6CBAF1-Tiere wurden im Alter von 4 bis 5 Wochen durch eine i.p.-Injektion von Gonadotrophin-Serum trächtiger Stuten superovuliert (FOLLIGON, Vet-Drug, Falkirk, Schottland) (5iu), gefolgt von einer i.p.-Injektion von menschlichem chorionischem Gonadotrophin 45 Stunden später (CHORULON, Vet-Drug, Palkirk, Schottland (5iu). Danach wurden sie mit einem männlichen Zuchttier über Nacht gepaart. Solche Weibchen wurden danach auf Kopulationsplugs hin untersucht. Jene, die sich gepaart hatten, wurden eingeschläfert, und ihre Eier wurden für eine Mikroinjektion aufgefangen.
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DNA wurde in die befruchteten Eier injiziert, wie in Hogan et al. (ibid.) beschrieben. Kurz gesagt, wurde jeder der Vektoren, die A.alpha-, B.beta- und gamma-Expressionseinheiten enthielten, mit Mlu I digeriert und die Expressionseinheiten durch Sucrosegradientzentrifugation isoliert. Alle verwendeten Chemikalien waren analysenrein (Sigma Chemical Co. St. Louis, Mo, USA) und alle Lösungen steril und nukleasefrei. Lösungen von 20% und 40% Sucrose in 1 M NaCl, 20 mM Tris pH-Wert 8,0, 5 mM EDTA wurden unter Verwendung von UHP-Wasser hergestellt und filtersterilisiert. Eine 30% Sucroselösung wurde durch Mischen von gleichen Volumina der 20% und 40% Lösungen hergestellt. Ein Gradient wurde hergestellt durch Schichten von 0,5 ml Schritten der 40%, 30% und 20% Sucroselösungen in eine 2-ml-Polyallomerröhre, der erlaubt wurde, eine Stunde lang zu stehen. 100 μl DNA-Lösung (max. 8 μg DNA) wurden auf die Spitze des Gradienten geladen, und der Gradient wurde 17 bis 20 Stunden lang mit 26.000 Umdrehungen/Minute, bei 15°C in einer Beckman TL100-Ultrazentrifuge unter Verwendung eines TLS-55-Rotors zentrifugiert (Beckman Instruments, Fullerton, Calif., USA). Die Gradienten wurden mittels Durchstechen des Röhrenbodens mit einer 20 ga. Nadel und Auffangen der Tropfen in einer 96-Well-Microtiterplatte fraktioniert. 3 μl Aliquote wurden auf einem 1% Agarose-Minigel analysiert. Fraktionen, welche das gewünschte DNA-Fragment enthielten, wurden gepoolt und mit Ethanol über Nacht bei –20°C in 0,3 M Natriumacetat präzipitiert. DNA-Pellets wurden in 50–100 μl UHP-Wasser resuspendiert und durch Fluorimetrie quantifiziert. Die Expressionseinheiten wurden in Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung ohne Kalzium und Magnesium verdünnt (pro Liter enthaltend 0,2 g KCl, 0,2 g KH2PO4, 8,0 g NaCl, 1,15 g Na2HPO4), in einem molaren Verhältnis von 1:1:1 gemischt (entweder unter Verwendung der N1-Beta- oder der N3-Beta-Expressionseinheit), wobei die Konzentration auf ungefähr 6 μg/ml eingestellt wurde, und in die Eier injiziert (etwa 2 pi Gesamt-DNA-Lösung pro Ei).
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Die empfangenden Weibchen im Alter von 6 bis 8 Wochen werden präpariert, indem B6CBAF1-Weibchen in natürlichem Östrus mit vasektomierten Männchen gepaart wurden. Weibchen, die Kopulationsplugs besaßen, wurden danach für den Transfer von mikroinjizierten Eiern aufbewahrt.
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Nach der Geburt von potentiellen transgenen Tieren werden im Alter von vier Wochen Schwanzbiopsien unter Anästhesie entnommen. Die Gewebeproben werden in 2 ml Schwanzpuffer (0,3 M Na-Acetat, 50 mM HCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,5, 0,5% NP40, 0,5% Tween 20) gegeben, welcher 200 μg/ml Proteinase K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) enthält, und gewirbelt. Die Proben werden drei Stunden lang über Nacht bei 55° bis 60° geschüttelt (250 Umdrehungen/Minute). DNA, die aus den Biopsieproben hergestellt wurde, wird auf die Gegenwart der injizierten Konstrukte durch PCR und Southern-Blotting untersucht. Das digerierte Gewebe wird heftig gewirbelt, und 5 μl Aliquote werden in 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Positive und negative Schwanzproben werden als Kontrollgruppen aufgenommen. Vierzig μl Silikonöl (BDH, Poole, UK) werden zu jedem Röhrchen hinzugefügt, und die Röhrchen werden kurz zentrifugiert. Die Röhrchen werden in dem Heizungsblock eines Thermocyclers (z. B. Omni-Gene, Hybaid, Teddington, UK) 10 Minuten lang auf 95°C inkubiert. Danach weist jedes Röhrchen ein 45 μl Aliquot von hinzugefügtem PCR-Gemisch auf, so dass die Endzusammensetzung jedes Reaktionsgemisches wie folgt aussieht: 50 mM KCl; 2 mM MgCl2; 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,3); 0,01% Gelatin; 0,1% NP40, 10% DMSO; 500 nM jeder Primer, 200 μM dNTPS; 0,02 U/μl Taq-Polymerase (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland). Die Röhrchen werden dann durch 30 wiederholte Temperaturänderungen zykliert, so wie in Zusammenhang mit den jeweiligen verwendeten Primer erforderlich. Die Primer können verschieden sein, müssen aber auf jeden Fall auf die BLG-Promotorregion abzielen. Dies ist spezifisch für die injizierten DNA-Fragmente, weil die Maus kein BLG-Gen aufweist. Zwölf μl von 5fach Ladepuffer, der einen Orange-G-Markerfarbstoff (0,25% Orange G (Sigma) 15% Ficoll-Typ 400 [Pharmacia Biosystems Ltd., Milton Keynes, UK]) enthält, wird danach zu jedem Röhrchen hinzugefügt, und die Reaktionsgemische werden auf einem 1,6% Agarose-Gel elektrophoresiert, das Ethidiumbromid (Sigma) enthält, bis der Markerfarbstoff 2/3 der Länge des Gels durchwandert hat. Das Gel wird mit einer UV-Lichtquelle visualisiert, welche eine Wellenlänge von 254 nm ausstrahlt. Transgene Mäuse, welche eines oder mehrere der injizierten DNA-Fragmente aufweisen, werden durch diesen Ansatz identifiziert.
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Positive Schwanzproben werden verarbeitet, um reine DNA zu erhalten. Die DNA-Proben werden durch Southern-Blotting mit Hilfe einer BLG-Promotorsonde (Nucleotide 2523–4253 von SEQ ID NR. 7) untersucht. Spezifische Spaltungen mit geeigneten Restriktionsenzymen (z. B. Eco RI) ermöglichen die Unterscheidung der drei Konstrukte, welche die Aα-, Bβ- und γ-Sequenzen enthalten.
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Die Southern-Blot-Analyse von transgenen Mäusen, die im Wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt wurde, zeigte, dass mehr als 50% der Nachkommen alle drei Fibrinogensequenzen enthielten. Die Prüfung von Milch aus positiven Tieren durch reduzierende SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese zeigte die Gegenwart von allen drei Proteinketten in Konzentrationen von bis zu 1 mg/ml. Die Menge an vollständig zusammengefügtem Fibrinogen wurde zu den Verhältnissen einzelner Untereinheiten in Beziehung gesetzt, die in der Milch vorhanden waren. Es wurde kein offensichtlicher Phänotyp mit hohen Konzentrationen von Humanfibrinogen in Mäusemilch assoziiert.
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Beispiel IV
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Spender-Mutterschafe werden mit einem intravaginalen progesteronimprägnierten Schwamm (CHRONOGEST Goat Sponge, Intervet, Cambridge, UK) am Tag 0 behandelt. Die Schwämme werden zehn oder zwölf Tage in situ belassen.
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Superovulation wird durch Behandlung von Spender-Mutterschafen mit insgesamt einer Einheit von Schaffollikel-stimulierendem Hormon (OFSH) (OVAGEN, Horizon Animal Reproduction Technology Pty. Ltd., Neuseeland) behandelt, verabreicht in acht intramuskulären Injektionen von 0,125 Einheiten pro Injektion, beginnend um 17 Uhr am Tag –4 und endend um 8 Uhr am Tag 0. Den Spendern werden intramuskulär 0,5 ml eines luteolytischen Wirkstoffes (ESTRUMATE, Vet-Drug) am Tag –4 injiziert, um eine Regression des Corpus luteum herbeizuführen, um die Rückkehr zu Östrus und Ovulation zu ermöglichen. Um die Ovulation zu synchronisieren, werden den Spendertieren intramuskulär 2 ml eines synthetischen Freisetzungshormonanalogs (RECEPTAL, Vet-Drug) um 17 Uhr am Tag 0 injiziert.
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Den Spender werden mindestens 12 Stunden vor der künstlichen Besamung (A. I.) keine Nahrung und Wasser zugeführt. Die Tiere werden durch Intrauterinlaparoskopie unter Sedierung und Lokalanästhesie am Tag 1 künstlich besamt. Entweder Xylazine (ROMPUN, Veterinärmedikament) in einer Dosisrate von 0,05–0,1 ml pro 10 kg Körpergewicht oder ACP-Injektion von 10 mg/ml (Veterinärmedikament) in einer Dosisrate von 0,1 ml pro 10 kg Körpergewicht werden ungefähr fünfzehn Minuten vor der A. I. intramuskulär injiziert, um eine Sedierung herbeizuführen. Die A. I. wird unter Verwendung von frisch gesammelten Samen aus einem Poll-Dorset-Widder durchgeführt. Der Samen wird mit gleichen Teilen von gefilterter phosphatgepufferter Salzlösung verdünnt, und 0,2 ml des verdünnten Samens werden über den Gebärmutterzipfel injiziert. Unmittelbar vor oder nach der A. I. erhalten die Spender eine intramuskuläre Injektion von AMOXYPEN (Veterinärmedikament).
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Befruchtete Eier werden am Tag 2 gewonnen, nach der Aushungerung der Spender mit Nahrung und Wasser beginnend mit 17 Uhr am Tag 1. Die Gewinnung wird unter allgemeiner Anästhesie durchgeführt, die durch eine intravenöse Injektion von 5% Thipentonnatrium (INTRAVAL SODIUM, Veterinärmedikament) in einer Dosisrate von 3 ml pro 10 kg Körpergewicht herbeigeführt wird. Die Anästhesie wird durch Inhalieren von 1–2% Halothan/O2/N2O nach der Intubation aufrechterhalten. Um die befruchteten Eier zu gewinnen, wird ein Laparotomieschnitt durchgeführt und die Gebärmutter nach außen gelegt. Die Eier werden durch Retrograd-Spülung der Eileiter mit Ovum-Kulturmedium gewonnen (Advanced Protein Products, Brierly Hill, West Midlands, UK), ergänzt durch Rinderserumalbumin neuseeländischen Ursprungs. Nach dem Spülen wird die Gebärmutter in den Abdomen rückgeführt und der Schnitt geschlossen. Den Spender wird erlaubt, sich postoperativ zu erholen oder sie werden euthanisiert. Spender, denen erlaubt wird, sich zu erholen, erhalten eine intramuskuläre Injektion von Amoxypen L. A. in der vom Hersteller empfohlenen Dosisrate unmittelbar vor oder nach der Operation.
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Plasmide, welche die drei Fibrinogenkettenexpressionseinheiten enthalten, werden mit Mlu I digeriert, und die Expressionseinheitsfragmente werden gewonnen und auf Sucrosedichtegradienten gereinigt. Die Fragmentkonzentrationen werden durch Fluorimetrie bestimmt und in Dulbecco's phosphatgepufferter Salzlösung ohne Kalzium und Magnesium verdünnt, wie oben beschrieben. Die Konzentration wird auf 6 μg/ml eingestellt, und ungefähr 2 pl des Gemischs werden in einen Pronucleus von jedem befruchtetem Ei mit sichtbaren Pronuclei mikroinjiziert.
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Alle befruchteten Eier, welche die pronucleare Mikroinjektion überleben, werden in vitro bei 38,5°C in einer Atmosphäre von 5% CO2:5% O2:90% N2 und bei ungefähr 100% Feuchtigkeit in einem bicarbonatgepuffertem synthetischem Eileitermedium (siehe Tabelle) kultiviert, ergänzt mit 20% v/v Serum eines vasektomierten Widders. Das Serum kann 30 Minuten lang bei 56°C hitzedeaktiviert und vor der Verwendung bei –20°C gefriergelagert werden. Die befruchteten Eier werden für einen angemessenen Zeitraum kultiviert, um das Auftreten von früher Embryomortalität zu ermöglichen (verursacht durch die Manipulationstechniken). Diese toten oder arretierten Embryos werden verworfen. Embryos, welche sich zu 5 oder 6 Zellteilungen entwickelt haben, werden auf synchronisierten Empfänger-Mutterschafe übertragen.
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Tabelle
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Tabelle
Synthetisches Eileitermedium |
Stock A (hält 3 Monate) |
NaCl
KCl
KH2PO4
MgSO4·7H2O
Penicillin
Natriumlactat 60% Sirup
Super H2O | 6,28 g
0,534 g
0,162 g
0,182 g
0,06 g
0,6 mls
99,4 mls |
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Stock B (hält 2 Wochen) |
NaHCO3
Phenolrot
Super H2O | 0,21 g
0,001 g
10 mls |
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Stock C (hält 2 Wochen) |
Natriumpyruvat
Super H2O | 0,051 g
10 mls |
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Stock D (hält 3 Monate) |
CaCl2·2H2O
Super H2O | 0,262 g
10 mls |
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Stock E (hält 3 Monate) |
Hepes
Phenolrot
Super H2O | 0,651 g
0,001 g
10 mls |
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Um 10 mls von bicarbonatgepuffertem Medium herzustellen |
Stock A
Stock B
Stock C
Stock D
Super H2O | 1 ml
1 ml
0,07 ml
0,1 ml
7,83 ml |
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Die Osmolarität sollte 265–285 mOsm betragen. 2,5 ml hitzedeaktiviertes Schafserum hinzufügen und filtersterilisieren. | |
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Um 10 mls HEPES-gepuffertes Medium herzustellen |
Stock A
Stock B
Stock C
Stock D
Stock E | 1 ml
0,2 ml
0,07 ml
0,1 ml
0,8 ml |
Stock E (hält 3 Monate) |
Super H2O | 7,83 ml |
Die Osmolarität sollte 265–285 mOsm betragen. 2,5 ml hitzedeaktiviertes Schafserum hinzufügen und filtersterilisieren. | |
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Die empfangenden Mutterschafe werden mit einem intravaginalen progesteronimprägnierten Schwamm (Chronogest Ewe Sponge oder Chronogest Ewe-Lamb Sponge, Intervet) behandelt, der 10 oder 12 Tage in situ belassen wird. Den Mutterschafen werden intramuskulär 1,5 ml (300 iu) eines follikelstimulierenden Hormonsubstituts (P. M. S. G., Intervet) und 0,5 ml eines luteolytischen Wirkstoffes (Estrumate, Coopers Pitman-Moore) bei Schwammentfernung am Tag –1 injiziert. Die Mutterschafe werden auf Östrus mit einem vasektomierten Widder zwischen 8 Uhr und 17 Uhr an den Tagen 0 und 1 getestet.
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Embryos, welche in der in vitro Kultur überleben, werden den Empfängern (die von 17 Uhr an am Tag 5 oder 6 ausgehungert wurden) am Tag 6 oder 7 zurückgegeben. Der Embryotransfer erfolgt unter allgemeiner Anästhesie, wie oben beschrieben. Die Gebärmutter wird mit Hilfe eines Laparotomieschnitts mit oder ohne Laparoskopie nach außen gelegt. Die Embryos werden in einen oder beide Gebärmutterzipfel zurückgeführt, jedoch nur in Mutterschafe, welche mindestens einen geeigneten corpora lutea aufweisen. Nach Rückführung der Gebärmutter wird der Abdomen geschlossen, und den Empfängern wird erlaubt, sich zu erholen. Die Tiere erhalten eine intramuskuläre Injektion von Amoxypen L. A. in der vom Hersteller empfohlenen Dosisrate unmittelbar vor oder nach der Operation.
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Lämmer werden durch Ohrklemmen identifiziert und zur Aufzucht bei ihren Muttertieren belassen. Die Mutterschafe und Lämmer werden entweder im Stall untergebracht und erhalten Volldiätkonzentrate und andere Ergänzungen und/oder ad lib. Heu oder werden zum Grasen hinaus gelassen.
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Innerhalb der ersten Lebenswoche (oder so bald danach wie möglich, ohne die Gesundheit zu beeinträchtigen) wird jedes Lamm auf das Vorhandensein der heterologen DNA durch zwei Probeentnahmeverfahren untersucht. Eine 10 ml Blutprobe wird von der Jugularvene entnommen und in einen EDTA-Vacutainer gegeben. Sollten sie kräftig genug sein, wird den Lämmern auch eine zweite 10 ml Blutprobe innerhalb einer Woche nach der ersten Probenentnahme entnommen. Mit Hilfe einer Schwanzbiopsie werden so schnell wie möglich, nachdem der Schwanz nach dem Auftragen eines Gummi-Elastratorrings an seinem proximalen Drittel (für gewöhnlich innerhalb von 200 Minuten nach dem „Schwanzvorgang”) desensibilisiert worden ist, Gewebeproben entnommen. Das Gewebe wird sofort in eine Lösung von Tallpuffer gegeben. Schwanzproben werden bei Raumtemperatur gehalten und am Tag des Sammelns analysiert. Alle Lämmer erhalten eine intramuskuläre Injektion von Amoxypen L. A. in der vom Hersteller empfohlenen Dosisrate unmittelbar nach der Biopsie, und das geschnittene Ende des Schwanzes wird mit einem antibiotischen Spray besprüht.
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Die DNA wird aus dem Schafblut durch erstes Abtrennen weißer Blutzellen extrahiert. Eine 10-ml-Blutprobe wird in 20 ml Hanks gepufferter Salzlösung verdünnt (HBS; erhalten von Sigma Chemical Co.). Zehn ml des verdünnten Bluts werden auf 5 ml Histopaque (Signa) in jede von zwei 15-ml-Röhrchen mit Schraubverschluss geschichtet. Die Röhrchen werden mit 3000 Umdrehungen/Minute (2000 × g max.) mit Schwachbremsung-Einstellung 15 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Schnittstellen weißer Zellen werden entfernt und in ein sauberes 15-ml-Röhrchen gegeben und auf 15 ml in HBS verdünnt. Die verdünnten Zellen werden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 3000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert, und das Zellpellet wird gewonnen und in 2–5 ml Schwanzpuffer resuspendiert.
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Um DNA aus den weißen Zellen zu extrahieren, wird 10% SDS zu den resuspendierten Zellen zu einer Endkonzentration von 1% hinzugefügt, und das Röhrchen wird auf den Kopf gestellt, um die Lösung zu mischen. Ein mg frischer Proteinase-K-Lösung wird hinzugefügt und das Gemisch über Nacht bei 45°C inkubiert. DNA wird unter Verwendung eines gleichen Volumens von Phenol/Chloroform (x3) und Chloroform/Isoamylalkohl (x1) extrahiert. Die DNA wird danach durch Zugabe von 0,1 Volumen von 3 M NaOAc und 2 Volumina Ethanol ausgefällt und das Röhrchen auf den Kopf gestellt, um ein Vermischen herbeizuführen. Die ausgefällte DNA wird unter Verwendung eines sauberen Glasstabs mit einem versiegelten Ende ausgespult. Die Spule wird in 70% Ethanol gewaschen und der DNA wird ermöglicht, teilweise zu trocknen, danach wird sie in TE wieder aufgelöst (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 7,4).
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DNA-Proben aus dem Blut und dem Schwanz werden durch Southern-Blotting unter Verwendung von Sonden für die BLG-Promotorregion und die Fibrinogenketten-Codierungsregionen analysiert.
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Aus den zuvor gemachten Angaben wird erkannt werden, dass trotz der Tatsache, dass spezifische Ausführungsformen der Erfindung hierin zu Zwecken der Veranschaulichung beschrieben wurden, verschiedene Modifizierungen durchgeführt werden können. Infolgedessen ist die Erfindung ausschließlich durch die beiliegenden Ansprüche beschränkt. SEQUENZPROTOKOLL: