CZ296382B6 - Zpusob produkce fibrinogenu transgenními zvíraty - Google Patents

Zpusob produkce fibrinogenu transgenními zvíraty Download PDF

Info

Publication number
CZ296382B6
CZ296382B6 CZ0257596A CZ257596A CZ296382B6 CZ 296382 B6 CZ296382 B6 CZ 296382B6 CZ 0257596 A CZ0257596 A CZ 0257596A CZ 257596 A CZ257596 A CZ 257596A CZ 296382 B6 CZ296382 B6 CZ 296382B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
fibrinogen
dna
ser
gly
mammal
Prior art date
Application number
CZ0257596A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ257596A3 (en
Inventor
Garner@Ian
Dalrymple@Michael
Prunkard@Donna
C. Foster@Donald
Original Assignee
Pharming Intellectual Property Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22765288&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ296382(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Pharming Intellectual Property Bv filed Critical Pharming Intellectual Property Bv
Publication of CZ257596A3 publication Critical patent/CZ257596A3/cs
Publication of CZ296382B6 publication Critical patent/CZ296382B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4717—Plasma globulins, lactoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4732—Casein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/75—Fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/103—Ovine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Predmetem resení jsou materiály a zpusoby produkce fibrinogenu transgenními savci krome cloveka. Dozárodecné linie savce krome cloveka jsou zavedenysegmenty DNA kódující retezce A.alfa., B.beta. a .gama. fibrinogenu a savec nebo jeho samicí potomstvo produkuje mléko obsahující fibrinogen exprimovaný zavedenými segmenty DNA. Dále se popisují savcí embrya, krome cloveka, a transgenní savci, kromecloveka, kterí nesou segmenty DNA kódující heterologní polypeptidové retezce fibrinogenu.

Description

Vynález se týká způsobu produkce fibrinogenu transgenními savci kromě člověka. Samice savce nebo její samičí potomstvo produkuje mléko obsahující fibrinogen exprimovaný segmenty DNA, které jsou zavedeny do jejich zárodečné linie. Tyto segmenty DNA kódují řetězce Aa, Ββ a γ fibrinogenu. Předkládaný vynález dále popisuje embrya savce a produkci transgenních savců kromě člověka, kteří nesou segmenty DNA kódující heterologní polypeptidové řetězce fibrinogenu.
Dosavadní stav techniky
Závěrečným krokem kaskády plazmatické koagulace je konverze v plazmě rozpustného proteinu fibrinogenu v nerozpustný fibrin katalyzovaná trombinem. Trombin odštěpuje malý peptid (fibrinopeptid A) od jednoho ze tří řetězců (řetězec Aa) tvořících fibrinogen. Fibrinové monomery následně polymerizují a aktivovaný faktor XIII vytvořením příčných vazeb stabilizujesraženinu.
Fibrinogen je klíčová složka biologických tkáňových lepidel (viz např. patenty US 4 377 572 a 4 442 655), která napodobují tvoru přirozených krevních sraženin tím, že nastolí hemostázu a spojí poškozenou tkáň. Tkáňová lepidla poskytují doplněk nebo alternativu k šití, svorkám a jiným mechanickým prostředkům k uzavírání ran. Avšak hlavní složky těchto produktů (fibrinogen, faktor XIII a trombin) jsou připravovány z lidské plazmy sloučené od více dárců kryoprecipitací (např. patentu US 4 377 572, 4 362 567, 4 909 251) nebo etanolovou precipitací (např. patent US 4 442 655) nebo z plazmy jednotlivých dárců (např. patent US 4 627 879, spotnitz a kol., Am. surg. 55: 166-168, 1989). Výsledný přípravek fibrinogenu/faktoru XIII se těsně před použitím smíchá s bovinním trombinem, aby se fibrinogen přeměnil na fibrin a zaktivoval se faktor XIII, čímž se koagulace lepidla.
Komerčně dostupná lepidla jsou založena na plazmě sloučené od více dárců. Protože krevní deriváty jsou spojeny s přenosem viru lidské imunodeficience (HIV), viru hepatitidy a jinými etiologickými činiteli, přijatelnost a dostupnost takovýchto lepidel je omezena. V současnosti není jejich používání ve spojených státech povoleno.
Zatímco použití autologní plazmy snižuje riziko přenosu nemocí, autologní lepidla mohou být použita pouze při plánovaném chirurgickém výkonu, kdy pacient je schopen darovat potřebnou krev předem.
Jak bylo zmíněno výše, fibrinogen se skládá za tří polypeptidových řetězců, každý z nichž je v sestavené molekule přítomen ve dvou kopiích. Tyto řetězce, označené Aa, Ββ a gamma, jsou koordinovaně exprimovány, sestavovány a secemovány játry. Ačkoli by se očekávalo, že technologie rekombinantní DNA by mohla poskytnout alternativu k izolaci fibrinogenu z plazmy, zatímco tento cíl stále uniká. Tři řetězce fibrinogenu byly jednotlivě exprimovány v E. coli (Lord, DNA 4: 33-38, 1985, Bolyard a Lord, Gene 66: 183-192, 1988, Bolyard a Lord, Blood 73: 1202-1206), ale v prokaryotickém systému nebyl vytvořen funkční fibrinogen. Exprese biologicky způsobilého fibrinogenu kvasinkami nebyla publikována. K expresi biologicky aktivního fibrinogenu byly použity kultury savčích buněk podrobených transfekci (Farrel a kol. Blood 74: 55a. 1989, Hartwig a Danishefsky, J. Biol. Chem, 266: 6578-6585, 1991, Farrell a kol. Biochemistry 30: 9414—9420, 1991), ale expresní hladiny byly tak nízké, že produkce rekombinantního fibrinogenu v komerčních množstvích je neuskutečnitelná. Experimenty naznačují, že nižší rychlost transkripce v buněčných kulturách ve srovnání s játry může způsobovat dosud popisovanou nízkou rychlost exprese, ale zvýšení množství mRNA pro řetězce fibrinogenu v buňkách BHK podrobených transfekci nevyvolalo odpovídající zvýšení v sekreci fibrinoge
-1 CZ 296382 B6 nového proteinu (Prunkard a Foster, XIV. Congress of the Intemational Society on Thrombosis and Haemostasis, 1993). Tyto nedávné výsledky svědčí o tom, že řádné sestavení a zpracování molekuly fibrinogenu vyžaduje tkáňově specifický mechanismus, který není přítomný v běžných laboratorních buněčných liniích.
V oboru přetrvává potřeba najít způsoby, které by produkovaly velká množství vysoce kvalitního fibrinogenu pro použití v tkáňových lepidlech a dalších aplikacích. Dále je potřebné mít fibrinogen, který neobsahuje krví přenášené patogenní zárodky. Předkládaný vynález tyto potřeby uspokojuje a poskytuje další výhody s nimi související.
Podstata vynálezu
Záměrem předkládaného vynálezu je zajistit komerčně využitelná množství rekombinantního lidského fibrinogenu. Dalším cílem vynálezu je poskytnout materiály a způsoby pro expresi fibrinogenu v prsní tkáni transgenních zvířat, zejména hospodářských zvířat jako je dobytek, ovce, prasata a kozy.
Předkládaný vynález poskytuje způsob pro produkci fibrinogenu, kdy se: poskytne první segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený s řetězcem Aa fibrinogenu, druhý segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený s řetězcem Ββ fibrinogenu a třetí segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený s řetězcem γ fibrinogenu, kde každý segment, tj. první, druhý i třetí, je funkčně spojený s dalšími segmenty DNA, které jsou nutné pro jeho expresi v mléčné žláze hostitelské samice savce, zavedou segmenty DNA do oplodněného vejce savčích druhů kromě člověka, kde molární poměr segmentů DNA, prvního, druhého a třetího, je v rozmezí 0,5 až 1 : 0,5 až 1 : 0,5 až 1, vloží vejce do vejcovodu savčích druhů kromě člověka, nebo dělohy samice druhu, aby se získalo potomstvo nesoucí konstrukty DNA, chovají potomci pro produkci samičího potomstva, které exprimuje první, druhý a třetí segment DNA a produkuje mléko obsahující biologicky způsobilý fibrinogen kódovaný segmenty, sbírá mléko od samičího potomstva, a získá fibrinogen z mléka.
V jednom ztělesnění vynálezu je vejce obsahující zavedené segmenty po určitou dobu kultivováno před vložením do dělohy.
Dále vynález poskytuje produkci fibrinogenu obsahující kroky (a) včlenění prvního segmentu DNA kódujícího sekreční signál funkčně spojený s řetězcem Aa fibrinogenu do β-laktoglobulinového genu za vzniku první genové fúze, (b) včlenění druhého segmentu DNA kódujícího sekreční signál funkčně spojený s řetězcem Ββ fibrinogenu do β-laktoglobulinového genu za vzniku druhé genové fuze, (c) včlenění třetího segmentu DNA kódujícího sekreční signál funkčně spojený s řetězcem gamma fibrinogenu do β-laktoglobulinového genu za vzniku třetí genové fúze, (d) zavedení první, druhé a třetí genové fúze do zárodečné linie savce kromě člověka tak, že segmenty DNA jsou exprimovány v mléčné žláze savce nebo jeho samičího potomstva a biologicky způsobilý fibrinogen je secemován do mléka sace nebo jeho samičího potomstva, (e) získání mléka od savce nebo jeho samičího potomstva a (f) získání fibrinogenu z mléka. V preferovaných ztělesněních samce je ovce, prase, koza nebo hovězí dobytek.
Dále vynález poskytuje způsob produkce fibrinogenu skládající se z kroků (a) poskytnutí transgenní samice savců kromě člověka nesoucí ve své zárodečné linii heterologní segmenty DNA kódující řetězce Αα, Ββ a gamma fibrinogenu, kde segmenty DNA je secemován do mléka savce, (b) sběr mléka od savce a (c) získání fibrinogenu z mléka.
-2CZ 296382 B6
Dále vynález poskytuje embrya savců kromě člověka obsahující ve svém jádře segmenty heterologní DNA kódující řetězce Αα, Ββ a gama fíbrinogenu. V souvislosti s tím vynález poskytuje transgenní samice savců kromě člověka, které produkují ve svém mléče získatelná množství lidského fíbrinogenu.
Dále vynález poskytuje způsob produkce transgenního potomstva savce skládajícího se z kroků (a) poskytnutí prvního segmentu DNA kódujícího řetězec Αα fíbrinogenu, druhého segmentu DNA kódujícího řetězec Ββ fíbrinogenu a třetího segmentu DNA kódujícího řetězec gamma fíbrinogenu, kde každý první a druhý a třetí segment je funkčně spojen s dalšími segmenty DNA nutnými pro jeho expresi v mléčné žláze hostitelské samice savce a sekreci do mléka hostitelské samice savce, (b) zavedení segmentů DNA do oplodněného vejce savců kromě člověka, (c) vložení vejce do vejcovodu nebo dělohy samice savců kromě člověka, aby se získalo potomstvo nesoucí první, druhý a třetí segment DNA. V souvislosti s tím vynález poskytuje savce kromě člověka tvořené podle tohoto postupu.
Dále vynález poskytuje savce kromě člověka nesoucího zárodečnou linii se segmenty DNA kódujícími heterologní řetězce Αα, Ββ a gama fíbrinogenu, kde samičí potomstvo savce exprimuje segment DNA v mléčné žláze za tvorby biologicky způsobilého fíbrinogenu.
Tyto a další stránky vynálezu budou odborníkovi zjevné z následujícího detailního popisu a přiložených obrázků.
Před detailním vysvětlením vynálezu bude užitečné definovat určité termíny zde užívané:
Zde užívaný termín „biologicky způsobilý fíbrinogen“ označuje fíbrinogen, který polymerizuje, je-li ošetřen trombinem a vytváří nerozpustný fibrin.
Termín „vejce“ je použit k pojmenování neoplodněného vejce, oplodněného vejce před fúzi haploidních jader (pronukleů) nebo embrya v časném stádiu (oplodněné vejce s fúzovanými pronukley).
„Samice savce, která produkuje mléko obsahující biologicky způsobilý fíbrinogen“ je ta, která produkuje následně po těhotenství a porodu během laktaČního období mléko obsahující získatelné množství biologicky způsobilého fíbrinogenu. Odborníci vědí, že taková zvířata budou produkovat mléko, a tudíž fíbrinogen, přerušovaně.
Termín „potomstvo“ je použit ve svém obvyklém smyslu a zahrnuje děti a potomky.
Termín „heterologní“ se používá k označení genetického materiálu, který má původ z odlišného druhu než je druh, do kterého byl zaveden, nebo protein vzniklý z takového genetického materiálu.
V předkládaném vynálezu je technologie transgenních zvířat použita k tomu, aby produkovala fíbrinogen v mléčných žlázách hostitelské samice savce. Expres v mléčné žláze a následná sekrece proteinu do mléka překonává mnoho obtíží, na které se naráží při izolaci proteinů z jiných zdrojů. Mléko se snadno sbírá, je dostupné ve velkých množstvích a je biologicky dobře charakterizované. Navíc hlavní mléčné proteiny jsou v mléku přítomné ve vysokých koncentracích (od 1 do 15 g/1).
Z komerčního úhlu pohledu je jasně výhodné jako hostitele použít druh, který má velký výnos mléka. Ačkoliv mohou být použita menší zvířata jako myši a krysy (a jsou preferována ve stadiu ověřování a prokazování), v předkládaném vynálezu se preferuje použít hospodářská zvířata, savce, zahrnující prasata, kozy, ovce a hovězí dobytek, ale neomezující se pouze na ně. Ovcím se obzvláště dává přednost pro takové faktory jako jsou předchozí historie transgeneze u tohoto
-3CZ 296382 B6 druhu, výnos mléka, cena a snadná dostupnost zařízení pro sběr ovčího mléka. Pro srovnání faktorů, které mají vliv na výběr druhu hostitele viz WO 88/00239. Je všeobecně žádoucí vybrat plemeno hostitelského zvířete, které bylo pěstováno pro mléčné použití, jako ovce East Friesland, nebo zavést mléčný dobytek chovem transgenní linie později. V každém případě by měla být použita zvířata o známém dobrém zdravotním stavu.
Fibrinogen produkovaný podle předkládaného vynálezu může být fibrinogen lidský nebo fibrinogen zvířete. Pro léčebná využití se dává přednost pacientovým nativním proteinům. Předkládaný vynález tak poskytuje fibrinogen pro použití jak v lidské, tak veterinární medicíně. Klonované molekuly DNA kódující skladebné řetězce lidského fibrinogenu popsali Rixon a kol. (Biochem 22: 3237, 1983), Chung a kol. (Biochem 22: 3244, 1983), Chung a kol. (Biochem 22: 3250, 1983), Chung a kol. (Adv. Exp. Med. Biol. 281: 39-48, 1990) a Chung a kol. (Ann. NY Acad. Sci. 408: 449-456. 1983). Klony bovinního fibrinogenu popsal Brown a kol. (Nucl, Acids Res. 17: 6397, 1989) a Chung a kol. (Proč. Nati. Acad. sci, USA 78: 1466-1470, 1981). Klony fibrinogenu dalších savců jsou popsány Murakawou a kol. (Thromb. Haemost. 69: 351-360. 1993). Reprezentativní sekvence genů pro lidské řetězce Αα, Ββ a gammajsou uvedeny pod identifikačními čísly: 1, 3 a 5 v uvedeném pořadí. Odborníci vědí, že existují alelové varianty těchto sekvencí, že další varianty mohou vznikat substitucí aminokyselin, delecí, nebo inzercí, a že takové varianty jsou použitelné v předkládaném vynálezu. Všeobecně se preferuje, že jakékoliv sestrojené varianty obsahují pouze omezený počet substitucí aminokyselin, delecí nebo inzercí a že jakékoliv substituce jsou konzervativní. Dává se přednost produkci takových polypeptidů fibrinogenového řetězce, aby měly přinejmenším z 90 %, výhodně přinejmenším z 95 % a nejvýhodněji z 99 % nebo více procent sekvenci identickou s odpovídajícími nativními řetězci. Termínem „řetězec gamma“ se míní, že zahrnuje i alternativně sestřižený řetězec gamma' fibrinogenu (Chung a kol., Biochem. 23: 4232-4236, 1984). Aminokyselinová sekvence lidského řetězce gamma' je ukázána pod identifikačním číslem 6. Kratší řetězec gamma se vytváří alternativním sestřižením v nukleotidech 9511 a 10054 sekvence identifikačního čísla 5, což má za následek translaci, která je ukončena po nukleotidu 10065 sekvence identifikačního čísla 5.
Aby se dosáhlo exprese v mléčné žláze je použit transkripční promotor z genu mléčného proteinu. Geny mléčných proteinů zahrnující geny, které kódují kaseiny, beta-laktoglobulin (BLG), α-laktalbumin a kyselý protein syrovátky. Preferuje se promotor beta-laktoglobulinu. V případě genu ovčího genu-laktoglobulinu se obvykle používá oblast alespoň proximálních 406 párů bází 5' hraničních sekvence ovčího genu BLG (obsaženém mezi nukleotidy 3844 až 4257 sekvence identifikačního čísla 7). Preferují se větší části 5' hraniční sekvence až do 5 kpb (kilo párů bází). Obzvláště se preferuje větší segment DNA, který obsahuje 5' hraniční oblast promotoru a oblast kódující 5' nekódující část beta-laktoglobulinového genu (obsažené mezi nukleotidy 1 až 4257 sekvence identifikačního čísla 7). Viz Whitelaw a kol., Biochem. J. 286: 31-39, 1992. Vhodné jsou také podobné fragmenty promotorové DNA z jiných druhů.
Do konstruktů mohou být také včleněny jiné oblasti beta-laktoglobulinového genu, aby mohly být exprimovány genomové oblasti genu. Například ne v oboru všeobecně přijímáno, že konstrukty, které neobsahují introny, špatně exprimují ve srovnání s těmi, které takové sekvence DNA obsahují (viz Brinster a kol., Proč. Nati, Acad. sci. USA 85: 836-840, 1988, Palmiter a kol., Proč. Nalt. Acad. sci. USA 88: 478-482, 1991, Whitelaw a kol.., Transgenic Res. 1: 3-13, 1991, WO 89/01342, WO 91/02318). Z tohoto hlediska se všeobecně preferuje použít tam, kde je to možné, genomové sekvence, které obsahují všechny nebo některé z nativních intronů genu kódujícího protein nebo polypeptid. V jistých ztělesněních vynálezu se preferuje další zahrnutí přinejmenším několika intronů beta-laktoglobulinového genu. Jedna taková oblast je segment DNA, který zajišťuje sestřih intronů a polyadenylaci RNA ze 3' nekódující oblasti ovčího beta-laktoglobulinového genu. Je-li nahražen přirozenou 3' nekódující genovou sekvencí, tento segment ovčího beta-laktoglobulinu může jak zvyšovat, tak stabilizovat expresní hladiny proteinu nebo polypeptidu. V jiných ztělesněních je oblast obklopující iniciační ATG jedné či více fibrinogenových sekvencí nahrazena odpovídající sekvencí z genu mléčného specifického proteinu. Taková
-4CZ 296382 B6 náhrada poskytuje předpokládané tkáňové specifické proteiny. Taková náhrada poskytuje předkládané tkáňové specifické iniciační prostředí ke zvýšení exprese. Je příhodné zaměnit celý prepro řetězec fibrinogenu a 5' nekódující sekvence např. sekvencemi genu BLG, ačkoliv mohou být zaměněny menší oblasti.
Pro expresi fibrinogenu jsou segmenty DNA kódující každý ze tří dílčích polypeptidových řetězců fibrinogenu funkčně spojen s dalšími segmenty DNA, které jsou nutné pro jejich expresi, a tím se tvoří expresní jednotky. Tyto další segmenty zahrnují výše zmíněný promotor genu mléčného proteinu, jakož i sekvence, které zajišťují terminaci transkripce a polyadenylaci mRNA. Expresní jednotky dále obsahují segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený se segmentem kódujícím polypeptidový řetězec fibrinogenu. Sekreční signál může být nativní sekreční signál fibrinogenu nebo jiného proteinu, např. mléčného proteinu. Termín „sekreční signál“ se zde používá k označení té části proteinu, která jej řídí sekreční drahou z buňky do vnějšího prostředí, sekreční signály se obecně nacházejí na amino koncích proteinů. Viz např. von Heinje, Nuc. Acids Res. 14: 4683—4690, 1986 a Meade a ko., U.S. patent č. 4 873 316, zahrnuté zde v odkazech.
Konstrukce expresních jednotek se příhodně provádí vložením sekvence pro řetězec fibrinogenu do plazmidového nebo fágového vektoru, který obsahuje další segmenty DNA, ačkoliv expresní jednotky může být vytvořena v podstatě jakýmkoliv pořadím ligací. Je obzvláště vyhovující obstarat vektor, který obsahuje segment DNA kódující mléčný protein a nahradit kódující sekvenci mléčného proteinu toutéž pro řetězec fibrinogenu, (včetně sekrečního signálu), a tím vytvořit genovou fúzi, která zahrnuje sekvence genu mléčného proteinu pro řízení exprese. V každém případě klonování expresních jednotek v plazmidech nebo jiných vektorech usnadňuje amplifikaci fibrinogenových sekvencí. Amplifikace je pohodlně prováděna v bakteriálních (např. E. coli) hostitelských buňkách, tudíž vektory typicky obsahují počátek replikace a selekční markér funkční v bakteriálních hostitelských buňkách.
Vzhledem k velikosti genů pro řetězce fibrinogenu je nejpraktičtější připravit tři oddělené expresní jednotky, smísit je a zavést směs do hostitele. Odborníci vědí, že mohou být použity také jiné postupy. Například expresní jednotky pro tři řetězce mohou být individuálně zavedeny do odlišných embryí a zkombinovány později v chodu. Ve třetím přístupu tři expresní jednotky mohou být spojeny v jednom vhodném vektor, např. jako je kvasinkový arteficiální chromozom nebo klon fága Pl. Kódující sekvence pro dva nebo tři řetězce se mohou kombinovat vpolycistronických expresních jednotkách (viz např. Levinson a kol. patent US 4 713 339).
Expresní jednotka(y) je(jsou) potom vložena(y) do oplodněných vajec (včetně embryí v časném stadiu) vybraného hostitelského druhu. Zavedení heterologní DNA může být provedeno jedním z mnoha způsobů včetně mikroinjekce (např. patent US 4 873 191), retrovirové infekce (Jaenisch, science 240: 1468-1474, 1988) nebo místně cílenou integrací za použití embryonálních kmenových (ES) buněk (souhrn Bradley a kol., Bio/Technology 10: 534^-539, 1992). Vejce jsou potom implantována do vejcovodů nebo děloh falešně březích samic a je jim umožněno dozrát do porodu. Potomci nesoucí zavedenou DNA ve svých zárodečných liniích mohou předat DNA svému potomstvu normálním mendelovským způsobem umožňujícím vývoj transgenních stád. V oboru jsou známy obecné postupy pro produkci transgenních zvířat. Viz např. Hogan a kol., Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratory Manual. Cold spring Harbor Laboratory, 1986, Simon a kol., Bio/Technology 6: 179-183, 1988, Wall a kol., Biol, Reprod. 32: 645-651, 1985, Buhler a kol.., Bio/Technology 8: 140-143. 1990, Ebert a kol., Bio/Technology 9: 835-838,1991, Krimpenfort a kol, Bio/Technology 9: 844-847. 1991, Wall a kol., J. Cell. Biochem. 49: 113-120, 1992, a publikace WIPO WO 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757, a GB 87/00458, které jsou zde zahrnuty v odkazech. Techniky k zavádění cizích sekvencí DNA do savců a jejich zárodečných buněk byly původně vyvinuty na myších. Viz např. Gordon a kol.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA ΊΤ. 7380-7384, 1980, Gordon a Ruddle, Science 214: 1244-1246, 1981, Palmiter a Brinster, Cell 41: 343-345, 1985, Brinster a kol, Proč., Nati. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985, a Hogan a kol., (tamtéž). Tyto techniky byly následně adaptovány k použití z větších zvířat
-5CZ 296382 B6 včetně druhů hospodářských zvířat (viz např. publikace WIPO WO 88/00239, WO 90/05188 a WO 92/11757 a Simons a kol., Bio./Technology 6: 179-182, 1988). Souhrnem, až dosud nejúčinnějším způsobem dodnes používaným pro vytvoření transgenních myší nebo hospodářských zvířat je injekce několika set lineárních molekul DNA do jednoho z pronukleů oplodněného vejce. Může být také použita injekce DNA do cytoplazmy zygoty.
Preferuje se získání vyvážené exprese jednotlivých řetězců fibrinogenu, aby se umožnilo účinné vytváření hotového proteinu. Ideálně by pro zavádění do vajec měly být všechny tři expresní jednotky na téže molekule DNA. Avšak tento přístup může tvořit technické problémy, např. ve stádiích injekce a manipulace. Například velikost fibrinogenových expresních jednotek může nutně vyžadovat použití kvasinkových artefíciálních chromozomů (YAC) nebo fágu PÍ pro amplifikaci a manipulaci DNA před injekcemi. Při tomto přístupu by byly segmenty DNA, které mají být injikovány a obsahují všechny tři expresní jednotky, velmi velké, tudíž by vyžadovaly modifikaci injekční procedury za použití např. jehel většího kalibru. Při mnohem jednodušším přístupu je použita směs všech jednotlivých expresních jednotek. Preferuje se mísit ekvimolámí množství tří expresních jednotek, ačkoliv odborníci vědí, že tento poměr může kolísat, aby kompenzoval vlastnosti daných expresních jednotek. Určitá exprese, zpravidla redukované úrovně, se získá, když jsou použita menší molámí množství jednoho nebo dvou řetězců a účinnost exprese se snižuje přibližně proporčně k odchylce od preferovaného ekvimolámího poměru. V každém případě se dává přednost použití směsi, která má poměr expresních jednotek Aa:BP:gamma v rozmezí 0,5-1:0,5-1:0,5-1. Při poměru jiném než ekvimolámím se preferuje použití relativně více Ββ expresních jednotek. Alternativně se zavádí do jednotlivých vajec jedna nebo směs dvou expresních jednotek. Avšak zvířata získaná tímto způsobem budou exprimovat pouze jeden nebo dva řetězce fibrinogenu. Vytvoření intaktní fibrinogenové molekuly tímto způsobem vyžaduje program pro další chov navržený tak, aby sloučil v jednotlivých skupin zvířat všechny tři expresní jednotky.
Obecně je u samic vyvolaná zvýšená ovulace ošetřením hormonem stimulujícím folikuly a potom jsou samice spářeny. Oplodněná vejce se sbírají a heterologní DNA je injikována do vajec za použití známých způsobů. Viz např. patent US 4 873 191, Gordon a kol., Proč. Nati, Acad. scí, USA 77: 7380-7384, 1980, Gordon a Ruddle, science 214: 1244—1246, 1981, Palmiter aBrinster, Cell 41: 343-345, 1985, Brinster a kol., Proč. Nati, scad. sci. USA 82: 4438-4442, 1985, Hogan a kol., Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, 1986, simons a kol, Bio/Technology 6: 179-183, 1988, Wall a kol., Biol. Reprod. 32: 645-651, 1985, Buhler a kol., Bio/Technology 8: 140-142, 1990, Ebert a kol. Bio/Technology 9: 835-838, 1991, Krimpenfort a kol., Bio/Technology 9: 844—847, 1991, Wall a kol., J, Cell. Biochem. 49: 113-120, 1992, a publikace WIPO WO 88/00239, WO 90/05118, WO 92/11757, a GB 87/00458, které jsou zde zahrnuty v odkazech.
Pro injekce do oplodněných vajec jsou expresní jednotky odstraněny ze svých příslušných vektorů digescí příslušnými restrikčními enzymy. Pro pohodlnost se preferuje navrhnout vektory tak, že expresní jednotky jsou odstraněny štěpením enzymy, které neštěpí ani v expresních jednotkách ani kdekoli jinde ve vektorech. Expresní jednotky jsou získávány zpět konvenčními metodami, jako je elektroeluce následovaná fenolovou extrakcí a precipitací etanolem, odstředění v sacharózovém hustotním gradientu nebo kombinace těchto postupů.
DNA se injikuje do vajec v zásadě tak, jak je popsáno v Hoganovi a kol, tamtéž. Při typické injekci jsou vejce umístěna v nádobě s embryonálním kultivačním médiem za použití stereo mikroskopu s transfokátorem (preferuje se zvětšení 50x nebo 63x) Vhodné média zahrnují Hepes (N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonová kyselina nebo bikarbonátová pufrovaná média jsou jako M2 nebo Ml6 (dostupné od sigma Chemical Co., st. Louis, USA) nebo syntetické médium pro vejcovody (popsáno níže). Vejce jsou zadrženy a přeneseny doprostřed podložního sklíčka na injekční zařízení za použití např. kompletní Drummondovy pipety s kapilárou. V tomto stádiu se pozoruje při nižším (např. 4x) zvětšení. Za použití držící pipety injekčního zařízení jsou vejce centrálně umístěny na sklíčko. Jednotlivá vejce jsou před injekcí postupně upev
-6CZ 296382 B6 něna k držící pipetě. Pro každý injekční proces je komplex držící pipety s vejcem umístěn do centra zorného pole. Injekční jehla je poté nasměrována přesně pod vejce. Za výhodného použití objektivu Nomarského zvětšujícího 40x, jsou nastaveny obě manipulační výšky tak, aby bylo zaměřeno vejce a jehla. Pronuklea jsou lokalizována otáčením vejce a nastavováním držící pipety dle potřeby. Jakmile je lokalizován pronukleas, výška manipulátoru se změní tak, aby se zaostřilo na pronukleámí membránu. Injekční jehla se umístí pod vejce tak, že špička jehly je pod středem pronuklea. Poté se změní pozice jehly za použití manipulátoru tak, aby se jehla a pronukleas dostaly do stejné ohniskové roviny. Jehla se přenese řídicí pákou manipulátoru vpravo od vejce. Krátkým plynulým bodavým pohybem se propíchne pronukleámí membrána a špička jehly se ponechá uvnitř pronuklea. Ze skleněné stříkačky se injekční jehlou aplikuje tlak tak dlouho, dokud pronukleas nezvětší přibližně dvakrát svůj objem. V této chvíli se jehla pomalu odstraní. Při přechodu zpět na nižší zvětšení (např. 4x) se injikované vejce odstraní od odlišné oblasti sklíčka a proces se opakuje s jiným vejcem.
Poté, co se injikuje DNA, vejce se kultivují, aby se umožnilo pronuklům fúzovat za tvorby embryí jednobuněčných nebo embryí pozdního stádia. Obecně jsou vejce kultivována při přibližně tělesné teplotě použitého druhu v pufrovém médiu, které obsahuje vyvážené množství solí a sérum. Přežívající embrya jsou potom přenesena do falešně březích samic příjemkyň typicky vložením vajec do vejcovodů nebo dělohy a umožní se jim dozrát k porodu. Během embryogeneze se injikovaná DNA náhodně integruje do genomů malého počtu vyvíjejících se embryí.
Možní transgenní potomci se prozkoumávají pomocí krevních vzorků a/nebo tkáňové biopsie. Z těchto vzorků se připravuje DNA a vyšetřuje se na přítomnost injikovaného konstruktu technikami jako je polymerázová řetězová reakce (PCR, viz Mullis, patent US 4 683 202) a Southemův přenos (Southem, J. Mol, Biol., 98: 503. 1975, Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, 1982). Transgenní zvířata zakladatelské generace, neboli G0, mohou být plně transgenní, mající transgeny ve všech svých buňkách, nebo mozaiky, mající trangeny pouze v částí svých buněk, (viz např. Wilkie a kol., Develop, Biol. 118: 9-18, 1986), V druhém případě skupiny zárodečných buněk mohou být plně nebo částečně transgenní. V druhém případě počet transgenního potomstva od zakladatelského zvířete bude menší než očekávaných 50 %, která jsou předpovězena podle mendelovských zákonů. Zakladatelská G0 zvířata vyrostou do pohlaví zralosti a spáří se, aby se získalo potomstvo neboli Gl. Gl se také vyšetří na přítomnost transgenů, aby se prokázal přenos ze zakladatelských G0 zvířat. Co se týče G0 samců, ti mohou být spářeni s několika netransgenními samicemi a dát vznik mnoha potomkům. To zvyšuje šance na pozorování přenosu transgenů. Samice G0 zakladatelské generace mohou být spářeny přirozeně, mohou být uměle oplodněny anebo zvýšeně ovulovány, abys e získalo velké množství vajec, které jsou přeneseny do náhradních matek. Druhý postup dává nejlepší šanci k přenosu u zvířat, která mají omezený počet potomků. Výše zmíněné metody chovu se používají, aby se získala zvířata, která mohou předat DNA následným generacím potomků normálním mendelovským způsobem tak, aby se umožnil vývoj např. kolonií (myší) nebo stád (ovcí, prasat, koz a hovězího dobytka) transgenních zvířat.
Mléko od taktujících G0 a Gl samic se vyšetřuje na expresi heterologního proteinu za použití imunologických technik jako je ELISA (viz Harlow a Lané, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) a Wstemův přenos (Towbin a kol., Proč. Ntl. Acad. sci. USA 76: 4350-4354, 1979). Expresní hladiny heterologního proteinu jsou mezi jednotlivci dle očekávání odlišné z mnoha důvodů v oboru známých.
Vyhovující rodina zvířat by měla splňovat tři kritéria. Měla by být odvozena ze stejného zakladatelského G0 zvířete, měla by projevovat stabilní přenos transgenů a měla by projevovat stabilní expresní hladiny z generace na generaci a od laktace k laktaci jednotlivých zvířat, tyto principy byly demonstrovány a diskutovány (Carver a kol., Bio/Technology 11: 1263-1270, 1993). Zvířata z takové vhodné rodiny se nazývají linie. Nejprve jsou použity samci G0 nebo Gl ke vzniku stáda producentských zvířat přirozených nebo umělým oplozením. Tímto způsobem může
-7CZ 296382 B6 rychle vzniknout velké množství samic, u kterých je integrován tentýž transgen a od kterých se může získávat zásoba mléka.
Fibrinogen se získává z mléka za použití standardních praktik, jako je odstřeďování mléka, srážení, filtrace a techniky proteinové chromatografie.
Fibrinogen produkovaný podle předkládaného vynálezu je využitelný v lidské a veterinární medicíně, jako například součást chirurgických lepidel. Lepidla tohoto typu jsou v oboru známá. Viz např. patenty US 4 377 572, 4 442 655, 4 462 567 a 4 627 879, které jsou zde zahrnuty v odkazech. Obecně se fibrinogen a faktor ΧΙΠ slučují a vytvářejí první složku, která se smísí těsně před použitím s druhou složkou obsahující trombin. Trombin konvertuje fibrinogen na fibrin, způsobí změnu směsi na gel a aktivuje faktor XIII. Aktivovaný faktor XIII přičemž váže fibrin a posílí a sterilizuje lepivou hmotu. Taková lepivá typicky obsahující od 30 mg/ml do 100 mg/ml fibrinogenu a od 50 pg/ml do 500 pg/ml faktoru XIII. Mohou také obsahovat další složky, jako aprotinin, albumin, fibrinektin, plnidla a rozpouštědla. V oboru jsou známy způsoby produkce faktoru XIII. Viz např. patent US 5 204 447. Fibrinogen je také užitečný pro potahování povrchů polymerovaných předmět, např. syntetických cévních štěpů, jak vyznačeno v patentu US 5 272 074 (zahrnuto zde v odkazech).
Vynález je dále ilustrován následujícími neomezujícími příklady.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ilustruje subklonování sekvence DNA řetězce Aa lidského fibrinogenu.
Obr. 2 je částečná restrikční mapa vektoru Zem228. Použité symboly jsou MT-lp, promotor myšího metalothioneinu, SV40t, terminátor sV40 a sV40p, promotor sV40.
Obr. 3 ilustruje subklonování sekvence DNA řetězce Ββ lidského fibrinogenu.
Obr. 4 ilustruje subklonování sekvence DNA řetězce gamma lidského fibrinogenu.
Obr. 5 je částečná restrikční mapa vektoru Zem 219b. Použité symboly jsou MT-lp, promotor myšího metalothioneinu, hGHt, terminátor lidského růstového hormonu sV40p, promotor SV40, DHFR, gen dihydrofolátreduktázy a SV40t, terminátor sV40.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Odstranilo se mnohočetné klonování místo vektoru pUC18 (Yanisch-Perron a kol., Gene 33: 103-119, 1985) a nahradilo se syntetickým dvouvláknovým oligonukleotidem (jehož vlákna jsou ukázána v sekvencích identifikačních čísel 8 a 27), který obsahuje restrikční místa Pvu I/Mlu I/EcoR V/Xba Ι/Pvu I/Mlu I a byl ohraničen 5' přesahy kompatibilními s restrikčními místy EcoR I a Hind ΙΠ. pUC18 se štěpil oběma EcoR I a Hind III, fosfatázou z telecího střeva se odstranily 5' terminální fosfátové skupiny a oligonukleotid se zaligoval do základu vektoru. Sekvence DNA od jednoho k druhému konci spojení se potvrdila sekvenováním a nový plazmid byl nazván pUCPM.
Sekvence beta-laktoglobulinového genu (BGL) zpSSltgXS (vyznačen v publikaci WIPO WO 88/00239) byly vystřiženy jako fragment Sal I-Xba I a znovu zaklonovány do vektoru pUCPM, který byl štěpen Sal I a Xbal a vytvořil vektor pUCXS. pUCXS je tedy derivát pUC18,
-8CZ Z90J8Z B6 který obsahuje celý gen BLG od místa sal I k místu Xba I z fágu SS1 (Ali a Clark, J. Mol. Bil. 199: 415-426. 1988).
Plazmid pSSltgSE (vyznačen v publikaci WIPO WO 88/00239) obsahuje fragment BLG dlouhý 1290 párů bází (bp) ohraničený restrikčními místy pro Sph I a EcoR I, oblast pokrývající unikátní místo Not I a osamocené místo Pvu II, která leží v 5' nepřekládané vedoucí oblasti mRNA genu BLG. Do tohoto místa Pvu II byl zaligován dvouvláknový linker (spojník) o 8 bp DNA (5GGATATCC-3'), který kóduje rozeznávací místo pro enzym EcoR V. Tento plazmid byl nazván pSSltgSE/RV. Sekvence DNA vymezená restrikčními místy sph I a Not I vpSSltgSE/RV byla vystřižena enzymatickou digescí a použita k nahrazení ekvivalentního fragmentu vpUCXS. Výsledný plazmid byl nazván pUCXSRV. sekvence inzertu BLG v pUCXSRV je ukázán v sekvenci identifikačního čísla 7, s unikátním místem EcoR V v nukleotidu 4245 v 5' nepřekládané vedoucí oblasti genu BLG. Toto místo umožňuje inzerci jakýchkoliv dalších sekvencí DNA pod řízením promotoru BLG 3' k transkripčnímu iniciačnímu místu.
Za použití primerů BLGAMP3 (5'-TGG ATC CCC TGC CGG TGC CTC TGG-3', sekvence identifikačního čísla 9) a BLGAMP4 (5'-AAC GCG TCA TCC TCT GTG AGC CAG-3', sekvence identifikačního čísla 10) byl tvořen fragment PCR o přibližné velikosti 650 bp ze sekvencí bezprostředně 3' ke stopovacímu kodonu genu BLG v pUCXSRV. Fragment PCR byl navržen tak, aby měl na svém 5' konci místo BamH I a na svém 3' konci místi Mlu I a byl jako takový klonován do pGEM7zf(+) (Promega) naštěpeným BamH I a Mlu I za vzniku pDAM200(+).
pUCXSRV byl štěpen Κρη I a nejdelší pás, obsahující vektor, byl přečištěn na gelu. Tento pás obsahoval sekvence celého plazmidu pUC a některé 3' nekódující sekvence z genu BLG. Do tohoto základu byl zaligován malý fragment Κρη I z pDAM200 (+), který ve správné orientaci účinně vytvořil místo BamH I na vzdáleném 5'konci 3' hraniční oblasti BLG dlouhé 2,6 kbp. Tento plazmid byl nazván pBLAC200. Fragment Cla Ι-Xba I dlouhý 2,6 kbp z pBLAC200 byl zaligován do vektoru pSP72 (Promega) štěpeném Cla Ι-Xba I, tak se umístilo místo EcoR V bezprostředně v protisměru sekvenci BLG. Tento plazmid byl nazván pBLAC210.
Fragment EcoR V-Xba I dlouhý 2,6 kbp zpBLAC210 byl zaligován do pUCXSRV štěpeném EcoR V-Xbal za tvorby pMAD6. Toto vlastně vystřihlo z pUCXSRV všechny kódující a intronové sekvence a vytvořilo malý gen BLG skládající se z 5' promotoru o délce 4,3 kbp a sekvencí o délce 2,6 kbp 3' po směru ohraničujících unikátní místo EcoR V. Do místa EcoR vektoru pMAD6 byl vložen oligonukleotidový linker (ZC6839: ACTOCGTAGT, sekvence identifikačního čísla 11). Tato modifikace zrušila místo EcoR V a vytvořila místo SnaB I k použití pro klonovací účely. Vektor byl označen pMAD6-Sna. Messenger-RNA (mRNA) začíná v protisměru od místa SnaB I a končí po směru od místa snaB I. Prekurzorový transkript bude kódovat jednotlivý intron pocházející z BLG, intron 6, který je plně v 3' nepředkládané oblasti genu.
Příklad 2
Klony kódující jednotlivé řetězce fibrinogenu byly získány z laboratoře Dr. Earla W. Davieho, University of Washintgon, seattle. Genomický klon řetězce Aa fibrinogenu (Chung a kol., 1990, tamtéž) byl získán z plazmidu BS4. Tento plazmid obsahuje klon Aa vložený do míst Sal I a BamH I vektoru pUC18, ale postrádá kódující sekvenci pro první čtyři aminokyseliny řetězce Aa. Genomická DNA řetězce Ββ (Chung a kol., tamtéž) byla izolována z klonu fága lambda Charon 4A (označeného βλ4) jako dva fragmenty, každý o délce přibližně 5,6 kbp. Tyto dva fragmenty byly klonovány odděleně vpUC19, který byl naštěpen EcoR I a ošetřen fosfatázou z telecího střeva. Restrikční klony se prozkoumávaly digescí s restrikčním enzymem Pvu II, aby se rozlišily plazmidy s 5' a 3' inzerty Ββ (označené Bata5'Ri/puc a Beta3'Rl/puc, v příslušném pořadí). Genomické klony řetězce gamma byly izolovány, jak popsáno Rixonem a kol.
-9CZ 296382 B6 (Biochemistry 24: 2077-2086, 1985). Klon pgammal2A9 zahrnuje 5' nekódující sekvence a přibližně 4535 bp kódující sekvence pro řetězec gamma. Klon pgammal2F3 zahrnuje zbývající kódující sekvenci a 3' nekódující nukleotidy. Oba klony jsou založené na plazmidu pBR322 s fibrinogenovými sekvencemi vloženými do místa EcoR I. Tyto plazmidy byly použity jako templáty pro příslušné reakce PCR.
Kódující sekvence pro řetězce fibrinogenu byly upraveny k inzerci do expresních vektorů za použití polymerázové řetězcové reakce (PCR), jak obecně popsáno Mullisem (patent US 4 683 202). Tento postup odstranil nativní 5' a 3' nepřekládané sekvence, přidal sekvenci 9 bází (CCT GCA GCC) v protisměru prvního ATG každé kódující sekvence, poskytl první čtyři kodony sekvence řetězce Aa, odstranil vnitřní místi Mlu I v sekvenci Aa a přidal restrikční místa k usnadnění následujících klonovacích kroků.
Odvolávaje se na obr. 1,5' konec kódující sekvence Aa byl upraven reakcí PCR, která obsahovala 20 pmol každého z primerů ZC6632 (sekvence identifikačního čísla 12) a ZC6627 (sekvence identifikačního čísla 13), přibližně 10 ng plazmidu BS4 jako templátovou DNA, 10 μΐ směsi obsahující 2,5 mM každého zdNTP, 7,5 μΐ lOx DNA polymerázového pufru Pyrococcus furiosus (Pfu) č. 1 (200 mM Tris-HCl, pH 8,2, 100 mM KC1, 60 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgCl2, 1% Triton X-100, 100 μg/ml bovinního sérového albuminu bez přítomnosti nukleáz) (Stratagene, La Jolla, CA) a vodu do objemu 75 μΐ. směs byla zahřáta na 94 °C v terminálním cykleru pro DNA (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT). K zahřáté směsi se přidalo 25 μΐ směsi obsahující 2,5 μΐ lOx pufru Pfu č. 1, 22 μΐ H2O a 1 μΐ DNA-polymerázy Pfu o koncentraci 2,5 jednotek/μΐ (Stratagene). Reakce probíhaly v termálním cykleru pro DNA (Perkin-Elmer) po 5 cyklů v 94 °C, 45 s, 40 °C, 90 s, 72 °C, 120 s, po 20 cyklů 94 °C, 45 s, 45 °C, 90 s, 72 °C, 120 s, pak byly inkubovány v 72 °C po 7 minut. 5' fragment vytvořený PCR byl štěpen BamH I a Hind III a fragment BamH I-Hind ΙΠ byl potom spojen s vnitřním fragmentem Hind ΙΠ-Xba I o délce 2,91 kbp as vektorem pUC18 štěpeným BamH I, Xba I. Exonové sekvence vzniklé PCR byly sekvenovány.
Odvolávaje se opět na obr. 1, 3' konec kódující sekvence Aa byl upraven sérií kroků, ve kterých bylo místo Mlu I 563 bp v protisměru od stopovacího kodonu sekvence Aa změněno za použití PCR s překrývajícím se prodloužením řetězců (Ho a ko., Gene 77: 51-59, 1989). V první reakci bylo v reakční směsi, jak je popsána výše, smícháno 40 pmol každého z primerů ZC6521 (sekvence identifikačního čísla 14) ZC6520 (sekvence identifikačního čísla 15) a přibližně lOng plazmidu BS4 s templátovou DNA. Reakce probíhala 5 cyklů v 94 °C, 45 s, 40 °C, 60 s, 72 °C, 120 s, 15 cyklů v 94 °C, 45 s, 45 °C, 60 s, 72 °C, 120 s a pak inkubace v 72 °C po 7 minut. Druhá reakce byla uskutečněna stejným způsobem za použití 40 pmol každého z primerů ZC6519 (sekvence identifikačního Čísla 16) a ZC6518 (sekvence identifikačního čísla 17) a BS4 jako templátu. DNA fragmenty vzniklé první a druhou reakcí PCR byly izolovány gelovou elektroforézo aelucí z gelu. Přibližně 1/10 každého znovu získaného reakčního produktu byla smíchána se 40 pmol každého z primerů ZC6521 (sekvence identifikačního čísla 14) aZC6518 (sekvence identifikačního čísla 17) v reakci PCR, ve které se komplementární 3' konce každého fragmentu (obsahující změnu jedné fáze) spojily a složily jako primer k extenzi komplementárního vlákna ve směru 3'. PCR se prováděla za použití stelných reakčních podmínek jako v prvním a druhém kroku 3' PCR. Reakční produkt byl potom naštěpen Xba I a BamH I a tento fragment Xba IBamH I byl klonován do vektoru pUC18 štěpeného Xba I a BamH I. Exony vzniklé PCR byly sekvenovány.
Jak je ukázáno na obr. 1, 5' fragment BamH Ι-Xba I (3,9 kbp) a 3' fragment Xba Ι-BamH I (1,3 kbp) byly vloženy do místa BamH I vektoru Zem228. Zem228 je odvozen od pUC18 obsahujícího klonovací místo BamH I mezi myším promotorem MT-1 a terminátorem SV40 a markér pro neomycinovou rezistenci ohraničený promotorem SV40 a terminačními sekvencemi. Viz European patent Office Publication EP 119 944 a obr. 2. Celá kódující sekvence Aa byla izo
-10CZ 296382 B6 lována z vektoru Zem228 jako fragment SnaB I, který byl vložen do místa SnaB I plazmidu pMAD6-Sna.
Odvolávaje se na obr. 3, 5' konec řetězce Ββ byl upraven PCR za použití oligonukleotidů ZC6629 (sekvence identifikačního čísla 18), ZC6630 (sekvence identifikačního čísla 19) a ZC6625 (sekvence identifikačního čísla 19) a ZC6625 (sekvence identifikačního čísla 20). Tyto primery byly použity v párových kombinacích (ZC6629 + ZC6625 nebo ZC6630 + ZC6625), aby vznikly kódující sekvence Ββ začínající v prvním ATG kodonu (pozice 470 v sekvenci identifikačního čísla 3) (označené NI-Beta) nebo ve třetím ATG kodonu (pozice 512 v sekvenci identifikačního čísla 3) (označené N3-Beta). Přibližně 5 ng templátové DNA Beta5'RI/puc se smíchalo s 20pmol každého primeru (Nl-Beta. ZC6629, sekvence identifikačního čísla 18 + ZC6625, sekvence identifikačního čísla 2 nebo N3-Beta: ZC6630, sekvence identifikačního čísla + ZC6625, sekvence identifikačního čísla 20) v reakční směsi, jak popsáno výše, směsi byly inkubovány po 5 cyklů 94 °C, 45 s, 40 °C, 120 s, (Nl-Beta) nebo 90 s (N3-Beta), 72 °C, 120 s, cyklů 94 °C, 45 s, 45 °C, 120 s, (Nl-Beta) nebo 90 s (N3-Beta), 72 °C, 120 s, pak inkubovány v 72 °C po 7 minut. Tyto dva reakční produkty (NI, 555 bp, nebo N3, 510 bp) byly štěpeny Eco RI a Bgl II a fragmenty byly zaligovány do vnitřního fragmentu Bgl II-Xba I a vektoru pUC19 naštěpeného EcoR I + Xba I. 3' konec sekvence Ββ byl upraven v reakční směsi, jak je popsána výše, za použití oligonukleotidových primerů ZC6626 (sekvence identifikačního čísla 21) a ZC6624 (sekvence identifikačního čísla 22) a přibližně 5 ng templátu Beta3'RI/puc. Směsi byly inkubovány po 5 cyklů 94 °C, 45 s, 40 °C, 90 s, 72 °C, 120 s, 15 cyklů 94 °C, 45 s, 45 °C, 90 s, 72 °C, 120 s, pak inkubovány v 72 °C po 7 minut. Byl izolován fragment Bgl Π-EcoR I dlouhý 990 bp. Tento 3' fragmenty byl spojen se sousedním kódujícím fragmentem (340 bp, sph Ι-Bgl Π) as vektorem pUC19 naštěpeným Sph I + EcoR I. 3' a 5' epoxy vzniklé PCR byly sekvenovány. Třetí přechodný vektor byl vytvořen spojením dvou vnitřních fragmentů (Xba Ι-EcoR I, dlouhý 4285 bp a EcoR Ι-Sph I, dlouhý 383 bp) ve vzniku pUC19 naštěpeném Xba I + Sph I. Veškerá kódující sekvence Ββ (dvě formy) byla potom sestavena ligací jednoho z 5' fragmentů EcoR Ι-Xba I, vnitřního fragmentu Xba Ι-Sph I, z 3' fragmentu sph Ι-EcoR I vektoru pUC19 naštěpeného EcoR I. sekvence Ββ byla potom izolována jako fragment Sna BI dlouhý
7,6 kbp a vložena do místa SnaB I vektoru pMAD6-Sna.
Odvolávaje se na obr. 4, 5' konec sekvence pro řetězec gamma byl upraveny PCR za použití oligonukleotidových primerů ZC6514 (sekvence identifikačního čísla 23) a ZC6517 (sekvence identifikačního čísla 24) a přibližně 50 ng plazmidu pgamma 12A9 jako templátu. Reakce probíhala za použití 40 pM každého primeru, jak je popsáno výše. Reakce probíhala 5 cyklů v 94 °C, 45 s, 40 °C, 60 s, 72 °C, 120 s, následováno 15 cykly v 94 °C, 45 s, 45 °C, 60 s, 72 °C, 120 s. Výsledný fragment dlouhý 213 bp byl štěpen BamH I aspe I a výsledný restrikční fragment byl spojen se sousedním po směru fragmentem spe Ι-EcoR I, dlouhým 4,4 kbp a vektorem pUC19 naštěpením BamH I + EcoR I. 3' konec sekvence řetězce gamma byl upraven za použití oligonukleotidových primerů ZC6516 (sekvence identifikačního čísla 25) a ZC6515 (sekvence identifikačního čísla 26), 40 pmol každého primeru, přibližně 50 ng templátu pgamma 12F3 a stejného schématu pro termální cykly, jak bylo použito pro 5' fragment. Výsledný fragment dlouhý 500 bp byl štěpen Spe I a BamH I a výsledný restrikční fragment byl spojen s protisměrným fragmentem EcoR I-Spe I dlouhý, 2,77 kbp a vektorem pUC19 naštěpeným EcoR I + BamH I. Všechny exony vzniklé PCR byly sekvenována. Celá kódující sekvence řetězce gamma' byla potom sestavena ligací 5' fragmentu BamH Ι-EcoR I o délce 4,5 kbp, vnitřního fragmentu EcoR I-Pst I o délce 1,1 kbp a 3' fragmentu Pst Ι-Xba I o délce 2,14 kbp s vektorem Zem219b naštěpeným BamH I + Xba I. Zem 219b je vektor odvozený od pUC18 obsahující promotor myšího metalothioneinu a selektivní markér DHFR funkčně spojený s promotorem sV40 (obr. 5). Plazmid Zem 219b byl uložen v Američan Type Culture Collection jako E. coli XLl-modrá transformanta pod přístupovým číslem 68979. Celá kódující sekvence řetězce gamma' byla poté izolována jako fragment SnaB I dlouhý 7,8 kbp a vložena do místa SnaB I vektoru pMAD6-Sna.
-11 CZ 296382 B6
Příklad 3
Myši pro počáteční chovné kmeny (C57BL6J, CBACA) byly získány od Harlan Olac Ltd. (Bicester, UK). Byly spárovány a produkovaly F1 hybridní chov (B6CBAF1) na příjemkyně, superovulovaná samice, chovné samce a vazektomované samce. Všechna zvířata byla držena při cyklu 14 hodin světlo/10 hodin tma a krmena vodou a jídlem (Speciál Diet services, RM3, Edinburgh, scotland) ad libitum.
Transgenní myši vznikaly v podstatě jak popsáno v Hoganovi a kol., Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, 1986, což je ve své celistvosti zahrnuto zde v odkazech. U samic B6CBAF1 byla vyvolána zvýšená ovulace ve 4 až 5 týdnech věku i.p. (intraperitoneální) injekcí sérového gonadotropinu od březí klisny (FOLLIGON, VetDrug, Falkirk, scotliand) (5 m.j.), která byla o 45 hodin později následována i.p. injekcí lidského choriogonadotropinu (CHORULON), Vet-Drug, Falkirk, scotland) (5 m.j.). Poté byly spářeny přes noc s chovným samcem. Samice byly potom vyšetřeny na přítomnost kopulačních zátek. Ty, které zabřezly, byly usmrceny a jejich vejce byla shromážděna pro mikroinjekce.
Do oplodněných vajec byla injikována DNA, jak je popsáno v Hoganovi a kol. (taktéž). Ve stručnosti, každý z vektorů obsahující expresní jednotky Αα, Ββ a gamma byl naštěpen Mlu I a expresní jednotky byly izolovány odstředěním v sacharózovém hustotním gradientu. Všechny použité chemikálie byly reagenčního stupně čistoty „reagent grade“ (Sigma Chemicals Cl., st. Louis, MO, U.S.A) a všechny roztoky byly sterilní a neobsahovaly nukleázy. Roztoky 20 % a 40 % sacharózy v 1 m NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM EDTA byly připraveny za použití vody o ultravysokém stupni čistoty a sterilizovány filtrací. 30% roztok sacharózy byl připraven smísením stejných objemů 20% a 40% roztoků. Gradient byl připraven vrstvením 0,5 ml stupňů 40 %, 30 % a 20 % roztoků sacharózy do 2 ml polyalomerové kyvety a ponechán stát po dobu jedné hodiny. 100 μΐ roztoku DNA (max. 8 μg DNA) bylo na vrstveno na vrchol gradientu a gradient se odstřeďoval 17 až 20 hodin ve 26 000 rpm, 15 °C v ultracentrifuze Beckman TLI00 za použití rotoru TLS-55 (Beckman Instruments, Fullerton, CA, USA). Gradienty byly rozděleny do frakcí propíchnutím dna zkumavky jehlou č. 20 a sbíráním kapek do mikrotitrační destičky s 96 jamkami. Poměrné objemy 3 μΐ se analyzovaly na 1% agarózovém minigelu. Frakce obsahující požadovaný fragment DNA byly sloučeniny a precipitovány etanolem v 0,3 M Na-acetátu přes noc v -20 °C. Pelety DNA byly resuspendovány v 50 až 100 μΐ vody o ultravysokém stupni čistoty a kvantifikovány fluorimetrií. Expresní jednotky byly naředěny v Dulbeccově fosfátovém pufrovaném fyziologickém roztoku bez kalcia a magnézia (obsahující na litr 0,2 g KC1, 0,2 g KH2PO4, 8,0 g NaCl, 1,15 g Na2HPO4), smíchány (za použití buď Nl-Beta, nebo N3-Beta expresní jednotky) vmolámím poměru 1:1:1, koncentrace byla nastavena na 6 pg/ml a injikovaly se do vajec (~2 pl roztoku celkové DNA na vejce).
Samice příjemkyně staré 6 až 8 týdnů se připravují spářením samic B6CBAF1 v přirozeném estru s vazektomovanými samci. Samice, u kterých se vyskytnou kopulační zátky, jsou poté chovány pro přenos vejce.
Potenciálním transgenním zvířatům se čtyři týdny po narození odebírají biopsie z ocasů v celkové anestezii. Vzorky tkáně se umístí do 2 ml pufru pro ocasní biopsie (0,3 M Na acetát, 50 mM HC1, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, 0,5 % NP40, 0,5 % Tween 20), který obsahuje 200 pg/ml proteinázy K (Boehringer Mannheim, Mannheim, SRN), a promíchají se (vortex). Vzorky se protřepávají (250 rpm) v 55 až 60 °C po dobu od 3 hodin až přes noc. DNA připravená z bioptických vzorků se vyšetřuje na přítomnost injikovaných konstruktů metodami PCR a Southemova přenosu. Natrávená tkáň je důkladně promíchána a poměrné objemy po 5 μΐ jsou přeneseny do mikrocentrifugačních zkumavek o objemu 0,5 ml. Jako kontroly jsou zahrnuty pozitivní a negativní vzorky z ocasní biopsie. Do každé zkumavky se přidá 40 μΐ silikonového oleje (BDH, Poole, UK) a zkumavky se krátce stočí. Zkumavky se inkubují v zahřívacím bloku
-12CZ 296382 B6 termálního cykléru (např. Omni-gene, Hybaid, Teddington, UK) na 95 °C po 10 minut. Poté jsou do každé zkumavky přidány poměrné objemy po 45μ1 směsi PCR tak, že konečná koncentrace každé reakční směsi je: 50 mM KC1, 2 mM MgCL, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 0,01% želatina, 0,01% NP40, 10% DMSO, 500 nM každého primeru, 200 μΜ každého zdNTP, 0,02 U/μΙ polymerázy Taq (Boehringer Mannheim, Mannheim, SRN). Zkumavky potom probíhají cykly s 30 opakovanými teplotními změnami, jak je vyžadují konkrétní použité primery. Primery se mohou různit, ale ve všech případech musí cílit na promotorovou oblast BLG. Tato je specifická pro fragmenty injikované DNA, neboť myš nemá gen BLG. Poté je do každé zkumavky přidáno 12 μΐ 5x nanášecího pufru obsahujícího značkovací barvu Orange G (0,25% Orange G [Sigma] 15% Ficcol typ 400 [Pharmacia Biosystems Ltd., Milton Keynes, VB]) a reakční směsi jsou děleny elektroforézou v 1,6% agarózovém gelu obsahujícím ethidien bromid (Sigma) dokud značkovací barva nedorazí do 2/3 délky gelu. Gel je vizualizován zdrojem UV světla vysílajícím o vlnové délce 254 nm. Tímto přístupem jsou identifikovány transgenní myši, které mají jeden nebo více fragmentů injikované DNA.
Pozitivní vzorky ocasní biopsie jsou dále zpracovávány pro získání čisté DNA. Vzorky DNA jsou prozkoumávány metodou southemova přenosu za použití sondy pro promotor genu GLB (nukleotidy 2523-4253 sekvence identifikačního čísla 7). Specifická štěpení s příslušnými restrikčními enzymy (např. EcoR I) umožní rozlišení tří konstruktů obsahujících sekvence Αα, Ββ a gamma.
Analýzy transgenních myší Southemovým přenosem připravená v podstatě tak, jak popsána výše, dokázala, že více než 50 % potomstva obsahovalo všechny tři sekvence fibrinogenu. Vyšetření mléka pozitivních zvířat elektroforézou v redukujícím polyakrylamidovém gelu s SDS ukázalo přítomnosti všech tří proteinových řetězců v koncentracích až 1 mg/ml. Množství plně sestaveného fibrinogenu bylo ve vztahu k poměru jednotlivých podjednotek přítomných v mléce. S vysokými koncentracemi lidského fibrinogenu v myším mléce nebyl spojen žádný zjevný fenotyp.
Příklad 4
Bahnice dárkyně jsou v den 0 ošetřeny intravaginální houbou napuštěnou protesteronem (CHRONOGEST Goat Sponge, Intervet, Cambridge, VB). Houby jsou ponechány in šitu deset nebo dvanáct dní.
Zvýšená ovulace je navozena ošetřením bahnic dárkyň celkem jednou jednotkou ovčího hormonu stimulujícího folikuly (OFSH) (OVAGEN, Horizon Animal Reproduction Technology Pty. Ltd., Nový Zéland) podané v osmi intramuskulámích injekcích o 0,125 jednotky na injekci, začínající v 17,00 dne -4 a končící v 8,0 dne 0. Dárkyně jsou injikovány intramuskulámě 0,5 ml luteolytického činidla (ESTRUMATE, Vet-Drug) dne -4, aby došlo k regresi corpus luteum a umožnil se návrat k esteru a ovulaci. Aby se ovulace synchronizovala, jsou zvířata dárkyně v den 0 v 17,00 intramuskulámě injikována 2,0 ml syntetického analogu uvolňujícího hormonu (RECEPTAL, Vet-Drug).
Dárkyně hladoví a žízní alespoň dvanáct hodin před umělým oplodněním (U.O.). Zvířata jsou uměle oplodněna v den 1 intrauterinní laparoskopií při sedativech a lokální anestezii. Pro zajištění zklidnění se intramuskulámě injikuje přibližně patnáct minut před umělým oplodněním buď xylazin (ROMPUN, Vet-Drug) v dávce 0,05 až 0,1 ml na 10 kg tělesné váhy, nebo injekce ACP 10 mg/ml (Vet-Drug) v dávce 0,1 ml na 10 kg tělesné váhy. Umělé oplodnění je provedené za použití čerstvě odebraného semene od berana Poli Dorset. Semeno je naředěno stejným objemem filtrovaného fyziologického roztoku pufrovaného fosfáty a do každého děložního rohu se injikuje po 0,2 ml naředěného semene. Okamžitě před nebo po umělém oplodnění je dárkyním podána intramuskulámí injekce AMOXYPENU (Vet-Drug).
-13CZ 296382 B6
Oplodněná vejce jsou získána v den 2, poté co dárkyně od 17,00 den 1 hladověly a žíznily. Získání vajec je provedeno v celkové anestezii navozené intravenózní injekcí 5% thiopenton natria (INTAVAL SODIUM, Vet-Drug) v dávce 3 ml na 10 kg tělesné váhy. Anestezie je udržována inhalací směsi 1 až 2% halotanu/O2/N2O po intubaci. Aby se získala oplodněná vejce, je provedena laparotomická incize a děloha je vyňata ven z dutiny břišní. Vejce se získají retrográdním výplachem vejcovodů kultivačním médiem pro vejce (Ovum Culture Medium, Advanced Protein Products, Brierly Hill, West Midlands, VB) doplněným bovinním sérovým albuminem novozélandského původu. Po výplachu se děloha vrátila do břicha a incize byla uzavřena. Dárkyním bylo po operaci buď dovoleno zotavit se, nebo na nich byla provedena eutanazie. Dárkyním, které se zotavovaly, byla okamžitě před nebo po operaci podána intramuskulámí injekce Amoxypenu L.A. v dávce doporučené výrobcem.
Plazmidy obsahující tři expresní jednotky řetězců fibrinogenu jsou štěpeny s Mlu I a fragmenty expresních jednotek jsou získány nazpět a čistí se na sacharózových hustotních gradientech. Koncentrace fragmentů se určují fluorimetricky a ředí se Dulbeccovým fyziologickým roztokem pufrovaným fosfáty bez kalcia a magnézia, jak popsáno výše. Koncentrace je upravena na 6 pg/ml a přibližně 2 pl směsi jsou mikroinjikovány do jednoho pronuklea každého oplodněného vejce s viditelnými pronukley.
Všechna oplodněná vejce, která přežijí pronukleámí mikroinjekci jsou kultivována in vitro v 38,5 °C v atmosféře 5% CO2: 5% O2: 90% N2 a ~100% vlhkosti v syntetickém vejcovodovém médiu pufrovaném bikarbonáty (viz tabulka) doplněném 20% v/v sérem vazektomovaného berana. Sérum může být inaktivováno teplem v 56 °C po 30 minut a před použitím uskladněno zmražené v -20 °C. Oplodněná vejce jsou kultivována po dobu přiměřenou k tomu, aby se mohla projevit časná mortalita embryí (způsobená manipulačními technikami). Tato mrtvá nebo zastavená embrya jsou vyřazena. Embrya projevující 5 nebo 6 buněčných dělení jsou přenesena do synchronizovaných bahnic příjemkyň.
Tabulka
Syntetické vejcovodové médium
Zásobní roztok A (trvanlivost 3 měsíce)
NaCl 6,29 g
KC1 0,534 g
KH2PO4 0,162 g
MgSO4.H2O 0,182 g
Penicilín 0,06 g
60% sirup natrium laktátu 0,6 ml
H2O (v čistotě pro TK) 99,4 ml
Zásobní roztok B (trvanlivost 2 týdny)
NaHCO3
Fenolová červeň
H2O (v čistotě pro TK)
0,21 g
0,001 g ml
Zásobní roztok C (trvanlivost 2 týdny)
Natrium pyruvát
H2O (v čistotě pro TK)
0,051 g ml
-14CZ 296382 B6
Zásobní roztok D (trvanlivost 3 měsíce)
CaCl2.2H2O 0,262 g
H2O (v čistotě pro TK)10 ml
Zásobní roztok E (trvanlivost 3 měsíce)
Hepes 0,651 g
Fenolová červeň 0,001 g
H2O (v čistotě pro TK)10 ml ml média pilířovaného bikarbonáty
Zásobní roztok A1 ml
Zásobní roztok Β1 ml
Zásobní roztok C 0,07 ml
Zásobní roztok D 0,1 ml
H2O (v čistotě pro TK) 7,83 ml
Osmolarita by měla být 265-285 mOsm.
Přidej 2,5 ml teplem inaktivovaného ovčího séra a sterilizuj filtrací.
ml média pufřováného HEPES
Zásobní roztok A 1 ml
Zásobní roztok B 0,2 ml
Zásobní roztok C 0,07 ml
Zásobní roztok D 0,1 ml
Zásobní roztok E 0,8 ml
H2O (v čistotě pro TK) 7,83 ml
Osmolarita byl měla být 265-285 mOsm.
Přidej 2,5 ml teplem inaktivovaného ovčího séra a sterilizuj filtrací.
Bahnice příjemkyně jsou ošetřeny intravaginální houbou napuštěnou progesteronem (Chronogest Ewe Sponge nebo Chronogest Ewe-Lamb Sponge, Intervet) ponechanou insitu deset nebo dvanáct dní. Bahnicím je v den odstranění houby (den -1) intramuskulámě injikováno 1,5 ml (300 m.j.) substituentu hormonu stimulujícího folikuly (P.M.S.G., Intervet) a 0,5 ml Luteolytického činidla (Estrumate, Coopers Pitman-Moore). Bahnice jsou testovány na estrus vazektomovaným beranem ve dnech 0 a 1 mezi 8. a 17. hodinou.
Embrya přežívající kultivaci in vitro jsou vrácena příjemkyním (hladovějícím od 17. hodiny den 5 nebo 6) v den 6 nebo 7. Přes embrya je prováděn v celkové anestezii, jak je popsáno výše. Děloha je vyňata z dutiny břišní laparotomickou incizí s nebo bez laparoskopie. Embrya jsou vrácena do jednoho nebo obou rohů děložních pouze bahnicím s alespoň jedním vhodným žlutým tělískem. Po vrácení dělohy na místo je břicho zavřeno a příjemkyním je umožněno se zotavit. Zvířatům jsou okamžitě před nebo po operaci podány intramuskulámí injekce Amoxypenu L.A. v dávce doporučené výrobcem.
Jehňata jsou označena ušními visačkami a ponechána matkám na výchovu. Bahnice a jehňata jsou buď ustájena a krmena kompletními dietními koncentráty a dalšími doplňky anebo senem ad libitum, nebojsou ponechána venku na pastvě.
-15CZ 296382 B6
Během prvního týdne života (nebo tak brzy, jak je možné bez ublížení na zdraví) je každé jehně testováno na přítomnost heterologní DNA dvěma odběry vzorků. Zjugulámí žíly se odebírá 10 ml krve do podtlakové odběrové zkumavky s EDTA. Jsou-li zdravá, mají jehňata také druhý odběr 10 ml krve, kteiý je odebraný během jednoho týdne od prvního. Vzorky tkáně se odebírají biopsií ocasu co nejdříve poté, co byl ocas znecitlivěn gumovým kroužkem v jeho proximální třetině (obvykle během 200 minut po „ocasení“). Tkáň je okamžitě umístěna v roztoku pufru pro ocasní biopsie. Vzorky ocásku jsou drženy v teplotě místnosti a analyzovány v den odběru. Všem jehňatům byla podána intramuskulámí injekce Amoxypenu L.A. v dávce doporučené výrobcem a naříznutý konec ocasu byl ošetřen antibiotickým sprejem.
Při extrakci DNA z ovčí krve se nejdříve oddělí bílé krevní buňky. 10 ml vzorek krve se naředí ve 20 ml Hankova pufrovaného fyziologického roztoku (HBS, získaný na sigma Chemical Co.). Deset ml naředěné krve se navrství přes 5 ml Histopaque (Sigma) do dvou 15 ml zkumavek se šroubovacím uzávěrem. Zkumavky se odstřeďují v 3000 rpm (max. 2000 x g), s pomalým brzděním po 15 minut při teplotě místnosti. Mezi vrstvy bílých buněk jsou přeneseny do čisté 15 ml zkumavky a naředěny na 15 ml HBS. Naředěné buňky se stačí 10 minut ve 3000 rpm při teplotě místnosti a získaná peleta buněk je resuspendována ve 2 až 5 ml pufru pro ocasní biopsie.
Aby se z bílých buněk extrahovala DNA, přidá se k resuspendovaným buňkám 10% SDS do konečné 1% koncentrace a zkumavka se převrací, aby se roztok promíchal. Přidá se 1 mg čerstvého roztoku proteinázy K a směs se inkubuje přes noc ve 45 °C. DNA se extrahuje za použití roztoku fenolu a chloroformu (3x) o stejných objemech a roztokem chloroformu/izoamylalkoholu (lx). Poté se DNA precipituje přidáním 0,1 objemu 3 M NaAc a 2 objemů atanolu a zkumavka se převrací, aby se roztok promíchal. Precipitovaná DNA je navinuta na čistou skleněnou tyčinku se zataveným koncem. Navinutá DNA je omyta v 70% etanolu, ponechá s částečně uschnout a pak je znovu rozpuštěna v TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4).
Vzorky DNA z krve a ocasu jsou analyzovány metodou Southemova přenosu za použití sond na promotorovou oblast BLG a oblasti kódující řetězce fibrinogenu.
Z předchozího vyplývá, že ačkoliv zde po ilustrativní účely byla popsána specifická ztělesnění vynálezu, mohou být učiněny různé modifikace bez odchylky od ducha a rámce vynálezu. Proto vynález není omezen jinak než připojenými patentovými nároky.
Průmyslová využitelnost
V oblasti medicíny, lidské i veterinární trvá potřeba najít způsoby, které by produkovaly velká množství vysoce kvalitního fibrinogenu pro použití v tkáňových lepidlech a dalších aplikacích. Dále je potřebné mít fibrinogen, který neobsahuje krví přenášené patogenní zárodky. Záměrem předkládaného vynálezu je zajistit komerčně využitelná množství rekombinantního lidského fibrinogenu. Dalším cílem vynálezu je poskytnout materiály a způsoby pro expresi fibrinogenu v první tkáni transgenních zvířat, zejména hospodářských zvířat jak oje dobytek, ovce, prasata a kozy.
-16CZ 296382 B6
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 5943 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: Řetězce Aa lidského fíbrinogenu (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: spoj. (31..84, 1154..1279, 1739..1922, 3055..3200, 3786..5210) (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 1:
GTCTAGGAGC CAGCCCCACC CTTAGAAAAG ATG TTT TCC ATG AGG ATC GTC TGC54
Met Phe Ser Met Arg IIe Val Cys
CTA GTT CTA AGT GTG GTG GGC ACA GCA TGG GTATGGCCCT TTTCATTTTT104
Leu Val Leu Ser Val Val Gly Thr Ala Trp
1015
TCTTCTTGCT TTCTCTCTGG TGTTTATTCC ACAAAGAGCC TGGAGGTCAG AGTCTACCTG164
CTCTATGTCC TGACACACTC TTAGCTTTAT GACCCCAGGC CTGGGAGGAA ATTTCCTGGG224
TGGGCTTGAC ACCTCAAGAA TACAGGGTAA TATGACACCA AGAGGAAGAT CTTAGATGGA284
TGAGAGTGTA CAACTACAAG GGAAACTTTA GCATCTGTCA TTCAGTCTTA CCACATTTTG344
TTTTGTTTTG TTTTAAAAAG GGCAAGAATT ATTTGCCATC CTTGTACCTA TAAAGCCTTG404
GTGCATTATA ATGCTAGTTA ATGGAATAAA ACATTTTATG GTAAGATTTG TTTTCTTTAG464
TTATTAATTT CTTGCTACTT GTCCATAATA AGCAGAACTT TTAGTGTTAG TACAGTTTTG524
CTGAAAGGTT ATTGTTGTGT TTGTCAAGAC AGAAGAAAAA GCAAACGAAT TATCTTTGGA584
AATATCTTTG CAGTATCAGA AGAGATTAGT TAGTAAGGCA ATACGCTTTT CCGCAGTAAT644
- 17CZ 296382 B6
GGTATTCTTT TAAATTATGA ATCCATCTCT AAAGGTTACA TAGAAACTTG AAGGAGAGAG704
GAACATTCAG TTAAGATAGT CTAGGTTTTT CTACTGAAGC AGCAATTACA GGAGAAAGAG764
CTCTACAGTA GTTTTCAACT TTCTGTCTGC AGTCATTAGT AAAAATGAAA AGGTAAAATT824
TAACTGATTT TATAGATTCA AATAATTTTC CTTTTAGGAT GGATTCTTTA AAACTCCTAA884
TATTTATCAA ATGCTTATTT AAGTGTCACA CACAGTTAAG AAATTTGTAC ACCTTGTCTC944
CTTTAATTCT CATAACAACT CCATAAAATG GGTCCTAGGA TTTCCATTTG AAGATAAGAA1004
ACCTGAAGCT TGCCGAAGCC CTGTGTCTGC TCTCCTTAAT CTCTGTGAGA GTGCCATCTC1064
TTCCTGGGGA CTTGTAGGCA TGCCACTGTC TCCTCTTCTG GCTAACATTG CTGTTGCTCT1124
CTTTTGTGTA TGTGAATGAA TCTTTAAAG ACT GCA GAT AGT GGT GAA GGT GAC 1177
Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Asp
2025
TTT CTA GCT GAA GGA GGA GGC GTG CGT GGC CCA AGG GTT GTG GAA AGA1225
Phe Leu Ala Glu Gly Gly Gly Val Arg Gly Pro Arg Val Val GluArg
3540
CAT CAA TCT GCC TGC AAA GAT TCA GAC TGG CCC TTC TGC TCT GAT GAA1273
His Gin Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser AspGlu
5055
GAC TGG GTAAGCAGTC AGCGGGGGAA GCAGGAGATT CCTTCCCTCT GATGCTAGAG1329
Asp Trp
GGGCTCACAG GCTGACCTGA TTGGTCCCAG AAACTTTTTT AAATAGAAAA TAATTGAATA1389
GTTACCTACA TAGCAAATAA AGAAAAGGAA CCTACTCCCA AGAGCACTGT TTATTTACCT1449
CCCCAACTCT GGATCATTAG TGGGTGAACA GACAGGATTT CAGTTGCATG CTCAGGCAAA1509
ACCAGGCTCC TGAGTATTGT GGCCTCAATT TCCTGGCACC TATTTATGGC TAAGTGGACC1569
CTCATTCCAG AGTTTCTCTG CGACCTCTAA CTAGTCCTCT TACCTACTTT TAAGCCAACT1629
TATCTGGAAG AGAAAGGGTA GGAAGAAATG GGGGCTGCAT GGAAACATGC AAAATTATTC1689
TGAATCTGAG AGATAGATCC TTACTGTAAT TTTCTCCCTT CACTTTCAG AAC TAC1744
Asn Tyr
- 18CZ 296382 B6
AAA TGC CCT TCT GGC TGC AGG ATG AAA GGG TTG ATT GAT GAA GTC AAT1792
Lys Cys Pro Ser Gly Cys Arg Met Lys Gly Leu IIe Asp Glu Val Asn
7075
CAA GAT TTT ACA AAC AGA ATA AAT AAG CTC AAA AAT TCA CTA TTT GAA1840
Gin Asp Phe Thr Asn Arg Ile Asn Lys Leu Lys Asn Ser Leu Phe Glu
8590
TAT CAG AAG AAC AAT AAG GAT TCT CAT TCG TTG ACC ACT AAT ATA ATG1888
Tyr Gin Lys Asn Asn Lys Asp Ser His Ser Leu Thr Thr Asn Ile Met
100 105110
GAA ATT TTG AGA GGC GAT TTT TCC TCA GCC AAT A GTAAGTATTA1932
Glu Ile Leu Arg Gly Asp Phe Ser Ser Ala Asn
115120
CATATTTACT TCTTTGACTT TATAACAGAA ACAACAAAAA TCCTAAATAA ATATGATATC1992
CGCTTATATC TATGACAATT TCATCCCAAA GTACTTAGTG TAGAAACACA TACCTTCATA2052
ATATCCCTGA AAATTTTAAG AGGGAGCTTT TGTTTTCGTT ATTTTTTCAA AGTAAAAGAT2112
GTTAACTGAG ATTGTTTAAG GTCACAAAAT AAGTCAGAAT TTTGGATTAA AACAAGAATT2172
TAAATGTGTT CTTTTCAACA GTATATACTG AAAGTAGGAT GGGTCAGACT CTTTGAGTTG2232
ATATTTTTGT TTCTGCTTTG TAAAGGTGAA AACTGAGAGG TCAAGGAACT TGTTCAAAGA2292
CACAGAGCTG GGAATTCAAC TCCCAGACTC CACTGAGCTG ATTAGGTAGA TTTTTAAATT2352
TAAAATATAG GGTCAAGCTA CGTCATTCTC ACAGTCTACT CATTAGGGTT AGGAAACATT2412
GCATTCACTC TGGGCATGGA CAGCGAGTCT AGGGAGTCCT CAGTTTCTCA AGTTTTGCTT2472
TGCCTTTTTA CACCTTCACA AACACTTGAC ATTTAAAATC AGTGATGCCA ACACTAGCTG2532
GCAAGTGAGT GATCCTGTTG ACCCAAAACA GCTTAGGAAC CATTTCAAAT CTATAGAGTT2592
AAAAAGAAAA GCTCATCAGT AAGAAAATCC AATATGTTCA AGTCCCTTGA TTAAGGATGT2652
TATAAAATAA TTGAAATGCA ATCAAACCAA CTATTTTAAC TCCAAATTAC ACCTTTAAAA2712
TTCCAAAGAA AGTTCTTCTT CTATATTTCT TTGGGATTAC TAATTGCTAT TAGGACATCT2772
TAACTGGCAT TCATGGAAGG CTGCAGGGCA TAACATTATC CAAAAGTCAA ATGCCCCATA2832
- 19CZ 296382 B6
GGTTTTGAAC TCACAGATTA AACTGTAACC AAAATAAAAT TAGGCATATT TACAAGCTAG2892
TTTCTTTCTT TCTTTTTTCT CTTTCTTTCT TTCTTTCTTT CTTTCTTTCT TTCTTTCTTT2952
CTTTCTTTCT TTCTCCTTCC TTCCTTTCTT CCTTTCTTTT TTGCTGGCAA TTACAGACAA3012
ATCACTCAGC AGCTACTTCA ATAACCATAT TTTCGATTTC AG AC CGT GAT AAT3065
Asn Arg Asp Asn
125
ACC TAC AAC CGA GTG TCA GAG GAT CTG AGA AGC AGA ATT GAA GTC CTG3113
Thr Tyr Asn Arg Val Ser Glu Asp Leu Arg Ser Arg Ile Glu ValLeu
130 135140
AAG CGC AAA GTC ATA GAA AAA GTA CAG CAT ATC CAG CTT CTG CAG AAA3161
Lys Arg Lys Val Ile Glu Lys Val Gin His Ile Gin Leu Leu GinLys
145 150155
AAT GTT AGA GCT CAG TTG GTT GAT ATG AAA CGA CTG GAG GTAAGTATGT 3210
Asn Val Arg Ala Gin Leu Val Asp Met Lys Arg Leu Glu
160 165170
GGCTGTGGTC CCGAGTGTCC TTGTTTTTGA GTAGAGGGAA AAGGAAGGCG ATAGTTATGC3270
ACTGAGTGTC TACTATATGC AGAGAAAAGT GTTATATCCA TCATCTACCT AAAAGTAGGT3330
ATTATTTTCC TCACTCCACA GTTGAAGAAA AAAAAATTCA GAGATATTAA GTAAATTTTC3390
CAACGTACAT AGATAGTAAT TCAAAGCAAT GTTCAGTCCC TGTCTATTCC AAGCCATTAC3450
ATCACCACAC CTCTGAGCCC TCAGCCTGAG TTCACCAAGG ATCATTTAAT TAGCGTTTCC3510
TTTGAGAGGG AATAGCACCT TACTCTTGAT CCATTCTGAG GCTAAGATGA ATTAAACAGC3570
ATCCATTGCT TATCCTGGCT AGCCCTGCAA TACCCAACAT CTCTTCCACT GAGGGTGCTC3630
GATAGGCAGA AAACAGAGAA TATTAAGTGG TAGGTCTCCG AGTCAAAAAA AATGAAACCA 3690 GTTTCCAGAA GGAAAATTAA CTACCAGGAA CTCAATAGAC GTAGTTTATG TATTTGTATC3750
TACATTTTCT CTTTATTTTT CTCCCCTCTC TCTAG GTG GAC ATT GAT ATT AAG3803
Val Asp Ile Asp Ile Lys
175
-20CZ 296382 B6
3851
ATC Ile CGA TCT TGT CGA GGG TCA Ser TGC Cys AGT AGG GCT TTA GCT CGT GAA GTA
Arg Ser Cys Arg 180 Gly Ser 185 Arg Ala Leu Ala Arg 190 G1U Val
GAT CTG AAG GAC TAT GAA GAT CAG CAG AAG CAA CTT GAA CAG GTC ATT
Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Gin Gin Lys Gin Leu Glu Gin Val Ile
195 200 205
GCC AAA GAC TTA CTT CCC TCT AGA GAT AGG CAA CAC TTA CCA CTG ATA
Ala Lys Asp Leu Leu Pro Ser Arg Asp Arg Gin His Leu Pro Leu Ile
210 215 220
AAA ATG AAA CCA GTT CCA GAC TTG GTT CCC GGA AAT TTT AAG AGC CAG
Lys Met Lys Pro Val Pro Asp Leu Val Pro Gly Asn Phe Lys Ser Gin
225 230 235 240
CTT CAG AAG GTA CCC CCA GAG TGG AAG GCA TTA ACA GAC ATG CCG CAG
Leu Gin Lys Val Pro Pro Glu Trp Lys Ala Leu Thr Asp Met Pro Gin
245 250 255
ATG AGA ATG GAG TTA GAG AGA CCT GGT GGA AAT GAG ATT ACT CGA GGA
Met Arg Met Glu Leu Glu Arg Pro Gly Gly Asn Glu lle Thr Arg Gly
260 265 270
GGC TCC ACC TCT TAT GGA ACC GGA TCA GAG ACG GAA AGC CCC AGG AAC
Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Thr Gly Ser Glu Thr Glu Ser Pro Arg Asn
275 280 285
CCT AGC AGT GCT GGA AGC TGG AAC TCT GGG AGC TCT GGA CCT GGA AGT
Pro Ser Ser Ala Gly Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Ser
290 295 300
ACT GGA AAC CGA AAC CCT GGG AGC TCT GGG ACT GGA GGG ACT GCA ACC
Thr Gly Asn Arg Asn Pro Gly Ser Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr
305 310 315 320
TGG AAA CCT GGG AGC TCT GGA CCT GGA AGT GCT GGA AGC TGG AAC TCT
Trp Lys Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Ser Ala Gly Ser Trp Asn Ser
325 330 335
GGG AGC TCT GGA ACT GGA AGT ACT GGA AAC CAA AAC CCT GGG AGC CCT
Gly Ser Ser Gly Thr Gly Ser Thr Gly Asn Gin Asn Pro Gly Ser Pro
340 345 350
AGA CCT GGT AGT ACC GGA ACC TGG AAT CCT GGC AGC TCT GAA CGC GGA
Arg Pro Gly Ser Thr Gly Thr Trp Asn Pro Gly Ser Ser Glu Arg Gly
355 360 365
3899
3947
3995
4043
4091
4139
4187
4235
4283
4331
4379
-21 CZ 296382 B6
AGT GCT GGG CAC TGG ACC TCT GAG AGC TCT GTA TCT GGT AGT ACT GGA 4427
Ser Ala Gly His Trp Thr Ser Glu Ser Ser Val Ser Gly Ser Thr Gly
370 375 380
CAA T6G CAC TCT GAA TCT GGA AGT TTT AGG CCA GAT AGC CCA GGC TCT 4475
Gin Trp His Ser Glu Ser Gly Ser Phe Arg Pro Asp Ser Pro Gly Ser
385 390 395 400
GGG AAC GCG AGG CCT AAC AAC CCA GAC TGG GGC ACA TTT GAA GAG GTG 4523
Gly Asn Ala Arg Pro Asn Asn Pro Asp Trp Gly Thr Phe Glu Glu Val
405 410 415
TCA GGA AAT GTA AGT CCA GGG ACA AGG AGA GAG TAC CAC ACA GAA AAA 4571
Ser Gly Asn Val Ser Pro Gly Thr Arg Arg Glu Tyr His Thr Glu Lys
420 425 430
CTG GTC ACT TCT AAA GGA GAT AAA GAG CTC AGG ACT GGT AAA GAG AAG 4619
Leu Val Thr Ser Lys Gly Asp Lys Glu Leu Arg Thr Gly Lys Glu Lys
435 440 445
GTC ACC TCT GGT AGC ACA ACC ACC ACG CGT CGT TCA TGC TCT AAA ACC 4667
Val Thr Ser Gly Ser Thr Thr Thr Thr Arg Arg Ser Cys Ser Lys Thr
450 455 460
GTT ACT AAG ACT GTT ATT GGT CCT GAT GGT CAC AAA GAA GTT ACC AAA 4715
Val Thr Lys Thr Val Ile Gly Pro Asp Gly His Lys Glu Val Thr Lys
465 470 475 480
GAA GTG GTG ACC TCC GAA GAT GGT TCT GAC TGT CCC GAG GCA ATG GAT 4763
Glu Val Val Thr Ser Glu Asp Gly Ser Asp Cys Pro Glu Ala Met Asp
485 490 495
TTA GGC ACA TTG TCT GGC ATA GGT ACT CTG GAT GGG TTC CGC CAT AGG 4811
Leu Gly Thr Leu Ser Gly Ile Gly Thr Leu Asp Gly Phe Arg His Arg
500 505 510
CAC CCT GAT GAA GCT GCC TTC TTC GAC ACT GCC TCA ACT GGA AAA ACA 4859
His Pro Asp Glu Ala Ala Phe Phe Asp Thr Ala Ser Thr Gly Lys Thr
515 520 525
TTC CCA GGT TTC TTC TCA CCT ATG TTA GGA GAG TTT GTC AGT GAG ACT 4907
Phe Pro Gly Phe Phe Ser Pro Met Leu Gly Glu Phe Val Ser Glu Thr
530 535 540
-22CZ 296382 B6
GAG TCT AGG GGC TCA GAA TCT GGC ATC TTC ACA AAT ACA AAG GAA TCC 4955
Glu Ser Arg Gly Ser Glu Ser Gly Ile Phe Thr Asn Thr Lys Glu Ser
545 550 555 560
AGT TCT CAT CAC CCT GGG ATA GCT GAA TTC CCT TCC CGT GGT AAA TCT 5003
Ser Ser His His Pro Gly Ile Ala Glu Phe Pro Ser Arg Gly Lys Ser
565 570 575
TCA AGT TAC AGC AAA CAA TTT ACT AGT AGC ACG AGT TAC AAC AGA GGA 5051
Ser Ser Tyr Ser Lys Gin Phe Thr Ser Ser Thr Ser Tyr Asn Arg Gly
580 585 590
GAC TCC ACA TTT GAA AGC AAG AGC TAT AAA ATG GCA GAT GAG GCC GGA 5099
Asp Ser Thr Phe Glu Ser Lys Ser Tyr Lys Met Ala Asp Glu Ala Gly
595 600 605
AGT GAA GCC GAT CAT GAA GGA ACA CAT AGC ACC AAG AGA GGC CAT GCT 5147
Ser Glu Ala Asp His Glu Gly Thr His Ser Thr Lys Arg Gly His Ala
610 615 620
AAA TCT CGC CCT GTC AGA GGT ATC CAC ACT TCT CCT TTG GGG AAG CCT 5195
Lys Ser Arg Pro Val Arg Gly Ile His Thr Ser Pro Leu Gly Lys Pro
625 630 635 640
TCC CTG TCC CCC TAGACTAAGT TAAATATTTC TGCACAGTGT TCCCATGGCC 5247
Ser Leu Ser Pro
645
CCTTGCATTT CCTTCTTAAC TCTCTGTTAC ACGTCATTGA AACTACACTT TTTTGGTCTG 5307 TTTTTGTGCT AGACTGTAAG TTCCTTGGGG GCAGGGCCTT TGTCTGTCTC ATCTCTGTAT 5367 TCCCAAATGC CTAACAGTAC AGAGCCATGA CTCAATAAAT ACATGTTAAA TGGATGAATG 5427 AATTCCTCTG AAACTCTATT TGAGCTTATT TAGTCAAATT CTTTCACTAT TCAAAGTGTG 5487 TGCTATTAGA ATTGTCACCC AACTGATTAA TCACATTTTT AGTATGTGTC TCAGTTGACA 5547 TTTAGGTCAG GCTAAATACA AGTTGTGTTA GTATTAAGTG AGCTTAGCTA CCTGTACTGG 5607 TTACTTGCTA TTAGTTTGTG CAAGTAAAAT TCCAAATACA TTTGAGGAAA ATCCCCTTTG 5667 CAATTTGTAG GTATAAATAA CCGCTTATTT GCATAAGTTC TATCCCACTG TAAGTGCATC 5727 CTTTCCCTAT GGAGGGAAGG AAAGGAGGAA GAAAGAAAGG AAGGGAAAGA AACAGTATTT 5787 GCCTTATTTA ATCTGAGCCG TGCCTATCTT TGTAAAGTTA AATGAGAATA ACTTCTTCCA 5847
ACCAGCTTAA
AGACTGTGAT
GATGTCCTCC AAACACATCC TTCAGGTACC
5907
CAAAGTGGCA TTTTCAATAT CAAGCTATCC GGATCC
5943
-23 CL 296382 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 644 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 2:
Met Phe Ser Met Arg Ile Val Cys Leu Val Leu Ser Val Val Gly Thr
1 5 10 15
Ala Trp Thr Ala Asp Ser Gly Glu Gly Asp Phe Leu Ala Glu Gly Gly
20 25 30
Gly Val Arg Gly Pro Arg Val Val Glu Arg His Gin Ser Ala Cys Lys
35 40 45
Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys Ser Asp Glu Asp Trp Asn Tyr Lys Cys
50 55 60
Pro Ser Gly Cys Arg Met Lys Gly Leu Ile Asp Glu Val Asn Gin Asp
65 70 75 80
Phe Thr Asn Arg Ile Asn Lys Leu Lys Asn Ser Leu Phe Glu Tyr Gin
85 90 95
Lys Asn Asn Lys Asp Ser His Ser Leu Thr Thr Asn Ile Met Glu Ile
100 105 110
Leu Arg Gly Asp Phe Ser Ser Ala Asn Asn Arg Asp Asn Thr Tyr Asn
115 120 125
Arg Val Ser Glu Asp Leu Arg Ser Arg Ile Glu Val Leu Lys Arg Lys
130 135 140
Val Ile Glu Lys Val Gin His Ile Gin Leu Leu Gin Lys Asn Val Arg
145 150 155 160
-24CZ ZVOJSZ B6
Ala Gin Leu Val Asp 165 Met Lys Arg Leu Glu Val Asp Ile 170 Asp Ile 175 Lys
Ile Arg Ser Cys Arg Gly Ser Cys Ser Arg Ala Leu Ala Arg Glu Val
180 185 190
Asp Leu Lys Asp Tyr Glu Asp Gin Gin Lys Gin Leu Glu Gin Val Ile
195 200 205
Ala Lys Asp Leu Leu Pro Ser Arg Asp Arg Gin His Leu Pro Leu Ile
210 215 220
Lys Met Lys Pro Val Pro Asp Leu Val Pro Gly Asn Phe Lys Ser Gin
225 230 235 240
Leu Gin Lys Val Pro Pro Glu Trp Lys Ala Leu Thr Asp Met Pro Gin
245 250 255
Met Arg Met Glu Leu Glu Arg Pro Gly Gly Asn Glu Ile Thr Arg Gly
260 265 270
Gly Ser Thr Ser Tyr Gly Thr Gly Ser Glu Thr Glu Ser Pro Arg Asn
275 280 285
Pro Ser Ser Ala Gly Ser Trp Asn Ser Gly Ser Ser Gly Pro Gly Ser
290 295 300
Thr Gly Asn Arg Asn Pro Gly Ser Ser Gly Thr Gly Gly Thr Ala Thr
305 310 315 320
Trp Lys Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Ser Ala Gly Ser Trp Asn Ser
325 330 335
Gly Ser Ser Gly Thr Gly Ser Thr Gly Asn Gin Asn Pro Gly Ser Pro
340 345 350
Arg Pro Gly Ser Thr Gly Thr Trp Asn Pro Gly Ser Ser Glu Arg Gly
355 360 365
Ser Ala Gly His Trp Thr Ser Glu Ser Ser Val Ser Gly Ser Thr Gly
370 375 380
Gin Trp His Ser Glu Ser Gly Ser Phe Arg Pro Asp Ser Pro Gly Ser
385 390 395 400
Gly Asn Ala Arg Pro Asn Asn Pro Asp Trp Gly Thr Phe Glu Glu Val
405 410 415
-25CZ 296382 B6
Ser Gly Asn Val Ser Pro Gly Thr Arg Arg filu Tyr His Thr Glu Lys
420 425 430
Leu Val Thr Ser Lys Gly Asp Lys Glu Leu Arg Thr Gly Lys Glu Lys
435 440 445
Val Thr Ser Gly Ser Thr Thr Thr Thr Arg Arg Ser Cys Ser Lys Thr
450 455 460
Val Thr Lys Thr Val Ile Gly Pro Asp Gly His Lys Glu Val Thr Lys
465 470 475 480
Glu Val Val Thr Ser 485 Glu Asp Gly Ser Asp Cys Pro 490 Glu Ala Met 495 Asp
Leu Gly Thr Leu Ser Gly Ile Gly Thr Leu Asp Gly Phe Arg His Arg
500 505 510
His Pro Asp Glu Ala Ala Phe Phe Asp Thr Ala Ser Thr Gly Lys Thr
515 520 525
Phe Pro Gly Phe Phe Ser Pro Met Leu Gly Glu Phe Val Ser Glu Thr
530 535 540
Glu Ser Arg Gly Ser Glu Ser Gly Ile Phe Thr Asn Thr Lys Glu Ser
545 550 555 560
Ser Ser His His Pro Gly Ile Ala Glu Phe Pro Ser Arg Gly Lys Ser
565 570 575
Ser Ser Tyr Ser Lys Gin Phe Thr Ser Ser Thr Ser Tyr Asn Arg Gly
580 585 590
Asp Ser Thr Phe Glu Ser Lys Ser Tyr Lys Met Ala Asp Glu Ala Gly
595 600 605
Ser Glu Ala Asp His Glu Gly Thr His Ser Thr Lys Arg Gly His Ala
610 615 620
Lys Ser Arg Pro Val Arg Gly Ile His Thr Ser Pro Leu Gly Lys Pro
625 630 635 640
Ser Leu Ser Pro
-26CZ 296382 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 8878 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: Řetězec Ββ lidského fibrinogenu (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: misc-RNA (B) POZICE: 1...469 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 470...583 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: intron (B) POZICE: 584...3257 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 3258...3449 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: intron (B) POZICE: 3450...3938 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 3939...4122 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: intron (B) POZICE: 4123...5042 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 5043...5270
-27CZ 296382 B6 (ιχ) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: intron (B) POZICE: 5271...5830 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 5831...5944 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: intron (B) POZICE: 5945...6632 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 6633...6758 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: intron (B) POZICE: 6759...6966 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 6967...7252 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: intron (B) POZICE: 7253...7870 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: exon (B) POZICE: 7871...8102 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: 3'UTR (B) POZICE: 8103...8537 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: misc-RNA (B) POZICE: 8538...8878 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: spoj (470...583, 3258...3449, 3939..4122, 5043...5270, 5831..5944,
6633..6758, 6967..7252, 7871..8102).
-28CZ 296382 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 3:
GAATTCATGC CCCTTTTGAA ATAGACTTAT GTCATTGTCA GAAAACATAA GCATTTATGG60
TATATCATTA ATGAGTCACG ATTTTAGTGG TTGCCTTGTG AGTAGGTCAA ATTTACTAAG120
CTTAGATTTG TTTTCTCACA TATTCTTTCG GAGCTTGTGT AGTTTCCACA TTAATTTACC180
AGAAACAAGA TACACACTCT CTTTGAGGAG TGCCCTAACT TCCCATCATT TTGTCCAATT240
AAATGAATTG AAGAAATTTA ATGTTTCTAA ACTAGACCAA CAAAGAATAA TAGTTGTATG300
ACAAGTAAAT AAGCTTTGCT GGGAAGATGT TGCTTAAATG ATAAAATGGT TCAGCCAACA360
AGTGAACCAA AAATTAAATA TTAACTAAGG AAAGGTAACC ATTTCTGAAG TCATTCCTAG420
CAGAGGACTC AGATATATAT AGGATTGAAG ATCTCTCAGT TAAGTCTAC ATG AAA475
Met Lys
AGG ATG GTT TCT TGG AGC TTC CAC AAA CH AAA ACC ATG AAA CAT CTA523
Arg Met Val Ser Trp Ser Phe H1s Lys Leu Lys Thr Met Lys HisLeu
1015
TTA TTG CTA CTA TTG TGT GTT TTT CTA GTT AAG TCC CAA GGT GTC AAC571
Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Phe Leu Val Lys Ser Gin Gly ValAsn
2530
GAC AAT GAG GAG GTGAATTTTT TAAAGCATTA TTATATTATT AGTAGTATTA623
Asp Asn Glu Glu
TTAATATAAG ATGTAACATA ATCATATTAT GTGCTTATTT TAATGAAATT AGCATTGCTT683
ATAGTTATGA AATGGAATTG TTAACCTCTG ACTTATTGTA TTTAAAGAAT GTTTCATAGT743
ATTTCTTATA TAAAAACAAA GTAATTTCTT GTTTTCTAGT TTATCACCTT TGTTTTCTTA803
AGATGAGGAT GGCTTAGCTA ATGTAAGATG TGTTTTTCTC ACTTGCTATT CTGAGTACTG863
TGATTTTCAT TTACTTCTAG CAATACAGGA TTACAATTAA GAGGACAAGA TCTGAAAATC923
TCACAAACTA TAAAATAATA AAAGAGCAGA ATTTTAAGAT AAAAGAAACT GGTGGTAGGT983
AGATTGTTCT TTGGTGAAGG AAGGTAATAT ATATTGTTAC TGAGATTACT ATTTATAAAA1043
ATTATAACTA AGCCTAAAAG CAAAATACAT CAAGTGTAAT GATAGAAAAT GAAATATTGC1103
-29CZ 296382 B6
TTTTTTCAGA TGAAAAGTTC AAAHAGAGT TAGTGTGTAT ΤβπΑΠΑΤΤ AATAGHATG 1163 AAACACGGTT CAGTCTAATT ΤΑΓΠΑΓΠΌ TAGAACAGTT TGTCCTCAAC TATTATTTTT 1223 GCTGACnAT TGCTGTTAAT TTGCAGTTAC TAAAAATACA GAAATGCAn TAGGACAATG 1283 GATATTTAAG AAATTTAAAT TTTATCATCA AACGTATCAT GGCCAAATTT CTTACATATA 1343 GCATAGTATC AHAAACTAG AAATAAGAAT ACACAATAAT ATTTAAATGA AGTGATTCAT 1403 TTCGGATCAT TATTGAGTTT CAAGGGAACT TGAGTGTTGT ACTTATCAGA CTCTACATGT 1463 AAGAACATAT AGTTAATCTG GTTGTGTGTG TAAAAACATA TGGTTAATCT GGTTAAGTCT 1523 GGTTAATCAT ATTAGGTAAG AAAAATGTAA AGAATGTGTA AGACGAAATT TTTGTAAAGT 1583 ACTCTGCAAA GCACTTTCAC ATTTCTGCTT ATCAACTAAA CCTCACAGAG ATAGTTTAAT 1643 AGTTTAGGCT TTAAAATGGA TTTTGATTAT TCAACAAGTG GCCTTCATAA TTTCTTTAAG 1703 TGTTTTICTT TAAGTATATA CmCTTTAA ΑΤΑΤΤΠΤΓΑ AAATTTCCTT TTCTCTAGTA 1763 AAGCCAGACC ATCCATGCTA CCTCTCTAGT GGCACTCTGA AATAAAAAGA AAATAGTTTT 1823 CTCTGTTATA ATTGTATTTG TAATAAGCAG ATGAATCACA TTTCTTAAAA TTTGTTTTAG 1883 AGAGGGTAAG CTCTGACTAG GACCATGACT TCAATGTGAA ATATGTATAT ATCCTCCGAA 1943 TCTTTACATA TTAAGAATGT ATATAGTCAA CTGGTTAAAC AGGAAAATCT GGAACAGCCT 2003 GGCTGGGTTT TAATCTTAGC ACCATCCTAC TAAATGTTAA ATAATATTAT AATCTAATGA 2063 ATAAATGACA ATGCAATTCC AAATAGAGTT CATCTGATGA CTTCTAGACT CACAAAATTG 2123 CAAGAGAGCT CAGTTGTTGC TCAGTTGTTC CAAATCATGT CGTTTGTTAA TTTGTAATTA 2183 AGCTCCAAAG GATGTATAGC TACTGACAAA AAAAAAAATG AGAATGTAGT TAATCCAAAT 2243 CAAAACTTTC CTATTGCAAT GCGTATTTTC TGCTTCATTA TCCTTTAATA ΤΑΑΤΑΤΤΠΑ 2303 AGTTAGCAAG TAATTTTAAT TACAATGCAC AAGCCTTGAG AATTATTTTA AATATAAGAA 2363 AATCATAATG TTTGATAAAG AAATCATGTA AGAAATTTCA AGATAATGGT TTAACAAATA 2423 ATTTTGTTGA TAGAAGATAA GACTAAAAGT GAAATTCGAA GTGGAGAGGA CACTTAAACT 2483 GTAGTACTTG TTATGTGTGA TTCCAGTAAA AATAGTAATG AGCACTTATT ATTGCCAAGT 2543
-30CZ 296382 B6
ACTGTTCTGA GGGTACCATA TGCAATAAGT TATTTAATCC TTACAATAAT CTTGTAAGGC2603
AGATTCAAAC TATCATTACA CTTATTTTAC AGATGAGAAA ACTGGGGCAC AGATAAAGCA2663
ACTTGCCCAA GGTCTCATAG CTGTAAGTCA ACCCTACGGT CAAGACCTAC AAGTAGCCGA2723
GCTCCAGAGT ACATTATGAG GGTCAAAGAT TGTCTTATTA CAAATAAATT CCAAGTAGAA2783
TCAACCTTTA ATAAGTCTTT AATGTCTCTT AAATATGTTT ATATAGGAGT CTAATCACCA2843
ATTCACAAAA ATGAAAGTAG GGAAATGATT AACAATAATC ATAGGAATCT AACAATCCAA2903
GTGGCTTGAG AATATTCATT CTTCTTGACA GTATAGATTC TTTACAATTT CGTAAGTTCC2963
AATGTATGTT TTAGGAATAT GAGGTCATTA CTATTCATAA TCTGATACAG CTTTATCCTA3023
AGGCCTCTCT TTAAAAACTA CACTGCATCA TAGCTTTTTT GTGCAGTTGG TCTTTCTACT3083
GTTACTGAAC AGTAAGCAAC CTACAGATTC ACTATCACCA ACCAGCCAGT TGATGGATCT3143
TAAGCAAATT ATCAAGCTTG TGATAACCTA AATTATAAAA TGAGGGTGTT GGAATAGTTA3203
CATTCCAAAT CTTCTATAAC ACTCTGTATT ATATTTCTGC CTCATTCCTT GTAG GGT3260
Gly
TTC TTC AGT GCC CGT GGT CAT CGA CCC CTT GAC AAG AAG AGA GAA GAG3308
Phe Phe Ser Ala Arg Gly His Arg Pro Leu Asp Lys Lys Arg GluGlu
45 5055
GCT CCC AGC CTG AGG CCT GCC CCA CCG CCC ATC AGT GGA GGT GGC TAT3356
Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro Pro IIe Ser Gly Gly GlyTyr
6570
CGG GCT CGT CCA GCC AAA GCA GCT GCC ACT CAA AAG AAA GTA GAA AGA3404
Arg Ala Arg Pro Ala Lys Ala Ala Ala Thr Gin Lys Lys Val GluArg
8085
AAA GCC CCT GAT GCT GGA GGC TGT CTT CAC GCT GAC CCA GAC CTG3449
Lys Ala Pro Asp Ala Gly Gly Cys Leu His Ala Asp Pro Asp Leu
95100
GTGGGTGCAC TGATGTTTCT TGCAGTGGTG GCTCTCTCAT GCAGAGAAAG CCTGTAGTCA3509
TGGCAGTCTG CTAATGTTTC ACTGACCCAC ATTACCATCA CTGTTATTTT GTTTGTTTAT3569
-31 CZ 296382 B6
TTTGGAAATA AAATTCAAAA CATAAACATA TTGGGCCTTT GGTTTAGGCT TTCTTTCTTG3629
TTTTCTTTGG TCTGGGCCCA AAATTTCAAA TTAGGATATG TGGGTGCCAC CTTTCCATTT3689
GTATTTTGCC ACTGCCTTTG TTTAGTTGGT AAAATTTTCA TAGCCCAATT ATATTTTTTC3749
TGGGGTAAGT ΑΑΤΑΤΠΤΑΑ ATCTCTATGA GAGTATGATG ATGACTTTCG AATTTCTGGT3809
CTTACAGAAA ACCAAATAAT AAATTTTTAT GTTGGCTAAT CGTATCGCTG AATTTTCCTA3869
TGTGCTATTT TAACAAATGT CCATGACCCA AATCCTTCAT CTAATGCCTG CTATTTTCTT3929
TGTTTTTAG GGG GTG TTG TGT CCT ACA GGA TGT CAG TTG CAA GAG GCT3977
Gly Val Leu Cys Pro Thr Gly Cys Gin Leu Gin Glu Ala
105 110115
TTG CTA CAA CAG GAA AGG CCA ATC AGA AAT AGT GTT GAT GAG TTA AAT4025
Leu Leu Gin Gin Glu Arg Pro IIe Arg Asn Ser Val Asp Glu Leu Asn
120 125130
AAC AAT GTG GAA GCT GTT TCC CAG ACC TCC TCT TCT TCC TTT CAG TAC4073
Asn Asn Val Glu Ala Val Ser Gin Thr Ser Ser Ser Ser Phe GinTyr
135 140145
ATG TAT TTG CTG AAA GAC CTG TGG CAA AAG AGG CAG AAG CAA GTA AAA G 4122
Met Tyr Leu Leu Lys Asp Leu Trp Gin Lys Arg Gin Lys Gin ValLys
150 155160
GTAGATATCC TTGTGCTTTC CATTCGATTT TCAGCTATAA AATTGGAACC GTTAGACTGC4182
CACGAGAATG CATGGTTGTG AGAAGATTAA CATTTCTGGG TTAGTGAATA GCATTCATAC4242
GCTTTTGGGC ACCTTCCCCT GCAACTTGCC AGATAAGCAC TATTCAGCTC TTATTCCCAG4302
TCTGACATCA GCAAGTGTGA TTTTCTATGA AAAATTCTAC TATGACTCCT TATTTTAAGT4362
ATACAAGAAA CTTGTGACTC AGAAGATAAT ATTTACAGAG TGGAAAAAAA CCCCTAGCAT4422
TTATAGTTTT AACATTTGAG GTTTTGAATG AGAGAGTTAT CCATAATATA TTCAATTGTG4482
TTGTGGATAA TGACACCTAA CCTGTGAATC TTGAGGTCAG AATGTTGAGT GCTGTTGACT4542
TGGTGGTCAG GAAACAGCTA GTGCGTGAGC CTGGCACAGG CATCTCAGTG AGTAGCATAC4602
CCACAGTTGG AAATTTTTCA AAGAAATCAA AGGAATCATG ACATCTTATA AATTTCAAGG4662
TTCTGCTATA CTTATGTGAA ATGGATAAAT AAATCAAGCA TATCCACTCT GTAAGATTGA4722
-32DO
ACTTCTCAGA TGGAAGACCC CAATACTGCT TTCTCCTCTT TTCCCTCACC AAAGAAATAA4782
ACAACCTATT TCATTTATTA CTGGACACAA TCTTTAGCGT ATACCTATGG TAAATTACTA4842
GTATGGTGGT TAGGATTTAT GTTAATTTGT ATATGTCATG CGCCAAATCA TTTCCACTAA4902
ATATGACTAT ATATCATAAC TGCTTGGTGA TAGCTCAGTG TTTAATAGTT TATTCTCAGA4962
AAATCAAAAT TGTATAGTTA AATACATTAG TTTTATGAGG CAAAAATGCT AACTATTTCT5022
ACATAATTTC ATTTTTCCAG AT AAT GAA AAT GTA GTC AAT GAG TAC TCC5071
Asp Asn Glu Asn Val Val Asn Glu Tyr Ser
165170
TCA GAA CTG GAA AAG CAC CAA TTA TAT ATA GAT GAG ACT GTG AAT AGC5119
Ser Glu Leu Glu Lys His Gin Leu Tyr IIe Asp Glu Thr Val AsnSer
175 180185
AAT ATC CCA ACT AAC CTT CGT GTG CTT CGT TCA ATC CTG GAA AAC CTG5167
Asn Ile Pro Thr Asn Leu Arg Val Leu Arg Ser Ile Leu Glu AsnLeu
190 195 200205
AGA AGC AAA ATA CAA AAG TTA GAA TCT GAT GTC TCA GCT CAA ATG GAA5215
Arg Ser Lys Ile Gin Lys Leu Glu Ser Asp Val Ser Ala Gin MetGlu
210 215220
TAT TGT CGC ACC CCA TGC ACT GTC AGT TGC AAT ATT CCT GTG GTG TCT5263
Tyr Cys Arg Thr Pro Cys Thr Val Ser Cys Asn Ile Pro Val ValSer
225 230235
GGC AAA G GTAACTGATT CATAAACATA TTTTTAGAGA GTTCCAGAAG AACTCACACA 5320
Gly Lys
CCAAAAATAA GAGAACAACA ACAACAACAA AAATGCTAAG TGGATTTTCC CAACAGATCA5380
TAATGACATT ACAGTACATC ATAAAAATAT CCTTAGCCAG TTGTGTTTTG GACTGGCCTG5440
GTGCATTTGC TGGTTTTGAT GAGCAGGATG GGGCACAGGT AGTCCCAGGG GTGGCTGATG5500
TGTGCATCTG CGTACTGGCT TGAACAGATG GCAGAACCAC AGATAGATGT AGAAGTTTCT5560
CCATTTTGTG TGTTCTGGGA GCTCATGGAT ATTCCAGGAC ACAAAAGGTG GAGAAGAGCT5620
TTGTTCATCC TCTTAGCAGA TAAACGTCCT CAAAACTGGG TTGGACTTAC TAAAGTAAAA5680
-33CZ 296382 B6
TGAAAATCTA ATATTTGTTA TATTATTTTC AAAGGTCTAT AATAACACAC TCCTTAGTAA 5740 CTTATGTAAT GTTATTTTAA AGAATTGGTG ACTAAATACA AAGTAATTAT GTCATAAACC 5800 CCTGAACATA ATGTTGTCTT ACATTTGCAG AA TGT GAG GAA ATT ATC AGG AAA 5853
Glu Cys Glu Glu Ile Ile Arg Lys
240245
GGA GGT GAA ACA TCT GAA ATG TAT CTC ATT CAA CCT GAC AGT TCT GTC5901
Gly Gly Glu Thr Ser Glu Met Tyr Leu Ile Gin Pro Asp Ser SerVal
250 255260
AAA CCG TAT AGA GTA TAC TGT GAC ATG AAT ACA GAA AAT GGA G5944
Lys Pro Tyr Arg Val Tyr Cys Asp Met Asn Thr Glu AsnGly
265 270275
GTAAGCTTTC GACAGTTGTT GACCTGTTGA TCTGTAATTA TTTGGATACC GTAAAATGCC6004
AGGAAACAAG GCCAGGTGTG GTGGCTCATA CCTGTAATTC CAGCACCTTG GGAGGCCAAA6064
GTGGGCTGAT AGCTTGAGCC TAGGAGTTTG AAACTAGCCT GGGCAACATA ATGAGACCCT6124
AACTCTACAA AAAAAAAAAA AATACCAAAA AAAAAAAAAA AATCAGCTGT GTTGGTAGTA6184
TGTGCCTGTA GTCCCAGCTA TCCAGGAGGC TGAGATGGGA GATCACCTGA GCCCACAACC6244
TGGAGTCTTG ATCATGCTAC TGAACTGTAG CCTGGGCAAC AGAGGATAGT GAGATCCTGT6304
CTCAAAAAAA AAAATTAATT AAAAAGCCAG GAAACAAGAC TTAGCTCTAA CATCTAACAT6364
AGCTGACAAA GGAGTAATTT GATGTGGAAT TCAACCTGAT ATTTAAAAGT TATAAAATAT6424
CTATAATTCA CAATTTGGGG TAAGATAAAG CACTTGCAGT TTCCAAAGAT TTTACAAGTT6484
TACCTCTCAT ATTTATTTCC TTATTGTGTC TATTTTAGAG CACCAAATAT ATACTAAATG6544
GAATGGACAG GGGATTCAGA TATTATTTTC AAAGTGACAT TATTTGCTGT TGGTTAATAT6604
ATGCTCTTTT TGTTTCTGTC AACCAAAG GA TGG ACA GTG ATT CAG AAC CGT 6655
Gly Trp Thr Val Ile Gin Asn Arg
280285
CAA GAC GGT AGT GTT GAC TTT GGC AGG AAA TGG GAT CCA TAT AAA CAG6703
Gin Asp Gly Ser Val Asp Phe Gly Arg Lys Trp Asp Pro Tyr Lys Gin
290 295300
-34VZ ÍVOJOi co
GGA TTT GGA AAT GTT GCA ACC AAC ACA GAT GGG AAG AAT TAC TGT GGC6751
Gly Phe Gly Asn Val Ala Thr Asn Thr Asp Gly Lys Asn Tyr Cys Gly
305 310315
CTA CCA G GTAACGAACA GGCATGCAAA ATAAAATCAT TCTATTTGAA ATGGGATTTT 6808 Leu Pro
TTTTAATTAA AAAACATTCA TTGTTGGAAG CCTGTTTTAG GCAGTTAAGA GGAGTTTCCT6868
GACAAAAATG TGGAAGCTAA AGATAAGGGA AGAAAGGCAG TTTTTAGTTT CCCAAAATTT6928
TATTTTTGGT GAGAGATTTT ATTTTGTTTT TCTTTTAG GT GAA TAT TGG CTT6980
Gly Glu Tyr Trp Leu 320
GGA AAT GAT AAA ATT AGC CAG CTT ACC AGG ATG GGA CCC ACA GAA CTT 7028
Gly Asn Asp Lys Ile Ser Gin Leu Thr Arg Met Gly Pro Thr Glu Leu
325 330 335 340
TTG ATA GAA ATG GAG GAC TGG AAA GGA GAC AAA GTA AAG GCT CAC TAT 7076
Leu Ile Glu Met Glu Asp Trp Lys Gly Asp Lys Val Lys Ala His Tyr
345 350 355
GGA GGA TTC ACT GTA CAG AAT GAA GCC AAC AAA TAC CAG ATC TCA GTG 7124
Gly Gly Phe Thr Val Gin Asn Glu Ala Asn Lys Tyr Gin Ile Ser Val
360 365 370
AAC AAA TAC AGA GGA ACA GCC GGT AAT GCC CTC ATG GAT GGA GCA TCT 7172
Asn Lys Tyr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Ala Leu Met Asp Gly Ala Ser
375 380 385
CAG CTG ATG GGA GAA AAC AGG ACC ATG ACC ATT CAC AAC GGC ATG TTC 7220
Gin Leu Met Gly Glu Asn Arg Thr Met Thr Ile His Asn Gly Met Phe
390 395 400
TTC AGC ACG TAT GAC AGA GAC AAT GAC GGC TG GTATGTGTGG 7262
Phe Ser Thr Tyr Asp Arg Asp Asn Asp Gly Trp
405 410 415
CACTCTTTGC TCCTGCTTTA AAAATCACAC TAATATCATT ACTCAGAATC ATTAACAATA7322
TTTTTAATAG CTACCACTTC CTGGGCACTT ACTGTCAGCC ACTGTCCTAA GCTCTTTATG7382
CATCACTCGA AAGCATTTCA ACTATAAGGT AGACATTCTT ATTCTCATTT TACAGATGAG7442
ATTTAGAGAG ATTACGTGAT TTGTCCAATG TCACACAACT ACCCAGAGAT AAAACTAGAA7502
-35CZ 296382 B6
TTTGAGCACA
GTTACTTTCT GAATAATGAG CATTTAGATA AATACCTATA TCTCTATATT
7562
CTAAAGTGTG
TGTGAAAACT TTCATTTTCA TTTCCAGGGT TCTCTGATAC TAAGGGTTGT
7622
AAAAGCTATT
ATTCCAGTAT AAAGTAACAA ACACAGTCCC TAGATGGATT GCCACAAAGG
7682
CCCAGTTATC
TCTCTTTCTT GCTATAGGGC ACAGGA6GTC TTTGGTGTAT TAGTGTGACT
7742
CTATGTATAG
CACCCAAAGG AAAGACTACT GTGCACACGA GTGTAGCAGT CTTTTATGGG
7802
TAATCTGCAA AACGTAACTT GACCACCGTA GTTCTGTTTC TAATAACGCC AAACACATTT
7862
TCTTTCAG G TTA ACA TCA GAT CCC AGA AAA CAG TGT TCT AAA GAA GAC Leu Thr Ser Asp Pro Arg Lys Gin Cys Ser Lys Glu Asp 420
7910
425
GGT GGT GGA TGG TGG TAT AAT AGA TGT CAT GCA GCC AAT CCA AAC
Gly Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Arg Cys His Ala Ala Asn Pro Asn
430 435 440
AGA TAC TAC TGG GGT GGA CAG TAC ACC TGG GAC ATG GCA AAG CAT
Arg Tyr Tyr Trp Gly Gly Gin Tyr Thr Trp Asp Met Ala Lys His
445 450 455
ACA GAT GAT GGT GTA GTA TGG ATG AAT TGG AAG GGG TCA TGG TAC
Thr Asp Asp Gly Val Val Trp Met Asn Trp Lys Gly Ser Trp Tyr
465 470 475
ATG AGG AAG ATG AGT ATG AAG ATC AGG CCC TTC TTC CCA CAG CAA
8109
Met Arg Lys Met Ser Met Lys Ile Arg Pro Phe Phe Pro Gin Gin
TAGTCCCCAA
485
490
480
GGC
Gly
GGC Gly
460
TCA
Ser
7958
8006
8054
TACGTAGATT
TTTGCTCTTC TGTATGTGAC AACATTTTTG
TACATTATGT TATTGGAATT
8169
TTCTTTCATA
CATTATATTC CTCTAAAACT CTCAAGCAGA
CGTGAGTGTG ACTTTTTGAA
8229
AAAAGTATAG
GATAAATTAC ATTAAAATAG CACATGATTT
TCTTTTGTTT TCTTCATTTC
8289
TCTTGCTCAC
CCAAGAAGTA ACAAAAGTAT AGTTTTGACA
GAGTTGGTGT TCATAATTTC
8349
AGTTCTAGTT GATTGCGAGA ATTTTCAAAT AAGGAAGAGG
GGTCTTTTAT CCTTGTCGTA
8409
GGAAAACCAT GACGGAAAGG AAAAACTGAT GTTTAAAAGT
CCACTTTTAA AACTATATTT
8469
ATTTATGTAG GATCTGTCAA AGAAAACTTC CAAAAAGATT TATTAATTAA ACCAGACTCT
8529
-36\_.L· DO
GTTGCAATAA GTTAATGTTT TCTTGTTTTG TAATCCACAC ATTCAATGAG TTAGGCTTTG
8589
CACTTGTAAG GAAGGAGAAG CGTTCACAAC CTCAAATAGC TAATAAACCG GTCTTGAATA 8649
TTTGAAGATT TAAAATCTGA CTCTAGGACG GGCACGGTGG CTCACGACTA TAATCCCAAC 8709
ACTTTGGGAG GCTGAGGCGG GCGGTCACAA GGTCAGGAGT TCAAGACCAG CCTGACCAAT
ATGGTGAAAC CCCATCTCTA CTAAAAATAC AAAAATTAGC CAGGCGTGGT GGCAGGTGCC
TGTAGGTCCC AGCTAGCCTG TGAGGTGGAG ATTGCATTGA GCCAAGATC
8769
8829
8878 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 491 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární o
(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 4:
Met Lys Arg Met Val Ser Trp Ser Phe His Lys Leu Lys Thr Met Lys
1 5 10 15
His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys Val Phe Leu Val Lys Ser Gin Gly
20 25 30
Val Asn Asp Asn Glu Glu Gly Phe Phe Ser Ala Arg Gly His Arg Pro
35 40 45
Leu Asp Lys Lys Arg Glu Glu Ala Pro Ser Leu Arg Pro Ala Pro Pro
50 55 60
Pro Ile Ser Gly Gly Gly Tyr Arg Ala Arg Pro Ala Lys Ala Ala Ala
65 70 75 80
Thr Gin Lys Lys Val Glu Arg Lys Ala Pro Asp Ala Gly Gly Cys Leu
85 90 95
His Ala Asp Pro Asp Leu Gly Val Leu Cys Pro Thr Gly Cys Gin Leu
100 105 110
-37CZ 296382 B6
Gin Glu Ala Leu Leu Gin Gin Glu Arg Pro Ile Arg Asn Ser Val Asp
115 120 125
Glu Leu Asn Asn Asn Val Glu Ala Val Ser Gin Thr Ser Ser Ser Ser
130 135 140
Phe Gin Tyr Met Tyr Leu Leu Lys Asp Leu Trp Gin Lys Arg Gin Lys
145 150 155 160
Gin Val Lys Asp Asn Glu Asn Val Val Asn Glu Tyr Ser Ser Glu Leu
165 170 175
Glu Lys His Gin Leu Tyr Ile Asp Glu Thr Val Asn Ser Asn Ile Pro
180 185 190
Thr Asn Leu Arg Val Leu Arg Ser Ile Leu Glu Asn Leu Arg Ser Lys
195 200 205
Ile Gin Lys Leu Glu Ser Asp Val Ser Ala Gin Met Glu Tyr Cys Arg
210 215 220
Thr Pro Cys Thr Val Ser Cys Asn Ile Pro Val Val Ser Gly Lys Glu
225 230 235 240
Cys Glu Glu Ile Ile Arg Lys Gly Gly Glu Thr Ser Glu Met Tyr Leu
245 250 255
Ile Gin Pro Asp Ser Ser Val Lys Pro Tyr Arg Val Tyr Cys Asp Met
260 265 270
Asn Thr Glu Asn Gly Gly Trp Thr Val Ile Gin Asn Arg Gin Asp Gly
275 280 285
Ser Val Asp Phe Gly Arg Lys Trp Asp Pro Tyr Lys Gin Gly Phe Gly
290 295 300
Asn Val Ala Thr Asn Thr Asp Gly Lys Asn Tyr Cys Gly Leu Pro Gly
305 310 315 320
Glu Tyr Trp Leu Gly Asn Asp Lys Ile Ser Gin Leu Thr Arg Met Gly
325 330 335
Pro Thr Glu Leu Leu Ile Glu Met Glu Asp Trp Lys Gly Asp Lys Val
340 345 350
Lys Ala His Tyr Gly Gly Phe Thr Val Gin Asn Glu Ala Asn Lys Tyr
355 360 365
-38ΌΖ. iyVJOÍ DO
Gin Ile Ser Val Asn Lys Tyr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Ala Leu Met
370 375 380
Asp Gly Ala Ser Gin Leu Met Gly Glu Asn Arg Thr Ket Thr Ile His
385 390 395 400
Asn Gly Met Phe Phe Ser Thr Tyr Asp Arg Asp Asn Asp Gly Trp Leu
405 410 415
Thr Ser Asp Pro Arg Lys Gin Cys Ser Lys Glu Asp Gly Gly Gly Trp
420 425 430
Trp Tyr Asn Arg Cys His Ala Ala Asn Pro Asn Gly Arg Tyr Tyr Trp
435 440 445
Gly Gly Gin Tyr Thr Trp Asp Met Ala Lys His Gly Thr Asp Asp Gly
450 455 460
Val Val Trp Met Asn Trp Lys Gly Ser Trp Tyr Ser Met Arg Lys Met
465 470 475 480
Ser Met Lys Ile Arg Pro Phe Phe Pro Gin Gin
485 490
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 10564 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: Řetězec τ lidského fibrinogenu (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: spoj. (1799..1876, 1973..2017, 2207..2390, 2513..2603, 4211..4341, 4645, 4778, 5758..5942, 7426..7703, 9342..9571).
-39CZ 296382 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 5:
CTACACACTT CTTGAAGGCA AAGGCAATGC TGAAGTCACC TTTCATGTTC AAATCATATT60
AAAAAGTTAG CAAGATGTAA TTATCAGTGT ACTATGTAAA TCTTTGTGAA TGATCAATAA120
TTACATATTT TCATTATATA TATTnAGTA GATAATATTT ATATACATTC AACATTCTAA180
ATATAGAAAG TTTACAGAGA AAAATAAAGC CTTTTTTTCC AATCCTGTCC TCCACCTCTG240
CATCCCATTC TTCTTCACAG AGGCAACTGA TTCAAGTCAT TACATAGTTA TTGAGTGHA300
ACTACAACTA TGTTAAGTAC AGCTATATAT GTTAGATGCC GTAGCCACAG AAATCAGTTT360
ACAATCTAAT GCAGTGGATA CAGCATGTAT ACATATAATA TAAGGTTGCT ACAAATGCTA420
TCTGAGGTAG AGCTGTTTGA AAGAATACTA ATACTTAAAT GTTTAATTCA ACTGACTTGA480
TTGACAACTG ATTAGCTGAG TGGAAAAGAT GGATGAGAAA GATTGTGAGA CTTAATTGGC540
TGGTGGTATG GTGATATGAT TGACAATAAC TGCTAAGTCA GAGAGGGATA TAHAAGGAG600
GAGAAGAAAA GCAACAAATC TGGTTTTGAT GTGTTCACTT TGTTATAATT ATTGATTAn660
TACTGAATAT GAATATTTAT CTTTGTTTTT GAGTCAATAA ATATACCTTT GTAAAGACAG720
AATTAAAGTA TTAGTATTTC TTTCAAACTG GAGGCATTTC TCCCACTAAC ATATTTCATC780
AAAACTTATA ATAAGCTTGG TTCCAGAGGA AGAAATGAGG GATAACCAAA AATAGAGACA840
TTAATAATAG TGTAACGCCC AGTGATAAAT CTCAATAGGC AGTGATGACA GACATGTTTT900
CCCAAACACA AGGATGCTGT AAGGGCCAAA CAGAAATGAT GGCCCCTCCC CAGCACCTCA960
TTTTGCCCCT TCCTTCAGCT ATGCCTCTAC TCTCCTTTAG ATACAAGGGA GGTGGATTTT1020
TCTCTTCTCT GAGATAGCTT GATGGAACCA CAGGAACAAT GAAGTGGGCT CCTGGCTCTT1080
TTCTCTGTGG CAGATGGGGT GCCATGCCCA CCTTCAGACA AAGGGAAGAT TGAGCTCAAA1140
AGCTCCCTGA GAAGTGAGAG CCTATGAACA TGGTTGACAC AGAGGGACAG GAATGTATTT1200
CCAGGGTCAT TCATTCCTGG GAATAGTGAA CTGGGACATG GGGGAAGTCA GTCTCCTCCT1260
GCCACAGCCA CAGATTAAAA ATAATAATGT TAACTGATCC CTAGGCTAAA ATAATAGTGT1320
TAACTGATCC CTAAGCTAAG AAAGTTCTTT TGGTAATTCA GGTGATGGCA GCAGGACCCA1380
-4047UJOÁ DO
TCTTAAGGAT AGACTAGGTT TGCTTAGTTC GAGGTCATAT CTGTTTGCTC TCAGCCATGT1440
ACTGGAAGAA GTTGCATCAC ACAGCCTCCA GGACTGCCCT CCTCCTCACA GCAATGGATA1500
ATGCTTCACT AGCCTTTGCA GATAATTTTG GATCAGAGAA AAAACCTTGA GCTGGGCCAA1560
AAAGGAGGAG CTTCAACCTG TGTGCAAAAT CTGGGAACCT GACAGTATAG GTTGGGGGCC1620
AGGATGAGGA AAAAGGAACG GGAAAGACCT GCCCACCCTT CTGGTAAGGA GGCCCCGTGA1680
TCAGCTCCAG CCATTTGCAG TCCTGGCTAT CCCAGGAGCT TACATAAAGG GACAATTGGA1740
GCCTGAGAGG TGACAGTGCT GACACTACAA GGCTCGGAGC TCCGGGCACT CAGACATC1798
ATG AGT TGG TCC TTG CAC CCC CGG AAT TTA ATT CTC TAC TTC TAT GCT1846
Met Ser Trp Ser Leu His Pro Arg Asn Leu IIe Leu Tyr Phe TyrAla
1015
CTT TTA TTT CTC TCT TCA ACA TGT GTA GCA GTAAGTGTGC TCTTCACAAA1896
Leu Leu Phe Leu Ser Ser Thr Cys ValAla
2025
ACGTTGTTTA AAATGGAAAG CTGGAAAATA AAACAGATAA TAAACTAGTG AAATTTTCGT 1956
ATTTTTTCTC TTTTAG TAT GTT GCT ACC AGA GAC AAC TGC TGC ATC TTA2005
Tyr Val Ala Thr Arg Asp Asn Cys Cys Ile Leu
3035
GAT GAA AGA TTC GTAAGTAGTT TTTATGTTTC TCCCTTTGTG TGTGAACTGG2057
Asp Glu Arg Phe
AGAGGGGCAG AGGAATAGAA ATAATTCCCT CATAAATATC ATCTGGCACT TGTAACTTTT2117
TAAAAACATA GTCTAGGTTT TACCTATTTT TCTTAATAGA TTTTAAGAGT AGCATCTGTC2177
TACATTTTTA ATCACTGTTA TATTTTCAG GGT AGT TAT TGT CCA ACT ACC TGT2230
Gly Ser Tyr Cys Pro Thr Thr Cys
GGC ATT GCA GAT TTC CTG TCT ACT TAT CAA ACC AAA GTA GAC AAG GAT2278
Gly Ile Ala Asp Phe Leu Ser Thr Tyr Gin Thr Lys Val Asp LysAsp
55 6065
-41 CZ 296382 B6
CTA CAG TCT KG GAA GAC ATC TTA CAT CAA GTT GAA AAC AAA ACA TCA2326
Leu Gin Ser Leu Glu Asp Ile Leu H1s Gin Val Glu Asn Lys ThrSer
7580
GAA GTC AAA CAG CTG ATA AAA GCA ATC CAA CTC ACT TAT AAT CCT GAT2374
Glu Val Lys Gin Leu Ile Lys Ala Ile Gin Leu Thr Tyr Asn ProAsp
9095
GAA TCA TCA AAA CCA A GTGAGAAAAT AAAGACTACT GACCAAAAAA2420
Glu Ser Ser Lys Pro
100
TAATAATAAT AATCTGTGAA GTTCTTTTGC TGTTGTTTTA GTTGTTCTAT TTGCTTAAGG2480
ATTTTTATGT CTCTGATCCT ATATTACAG AT ATG ATA GAC GCT GCT ACT TTG2532
Asn Met Ile Asp Ala Ala Thr Leu 105110
AAG TCC AGG ATA ATG TTA GAA GAA ATT ATG AAA TAT GAA GCA TCG ATT2580
Lys Ser Arg Ile Met Leu Glu Glu Ile Met Lys Tyr Glu Ala SerIle
115 120125
TTA ACA CAT GAC TCA AGT ATT CG GTAAGGATTT TTGTTTTAAT TTGCTCTGCA2633
Leu Thr His Asp Ser Ser IleArg
130
AGACTGATTT AGTTTTTATT TAATATTCTA TACTTGAGTG AAAGTAATTT TTAATGTGTT2693
TTCCCCATTT ATAATATCCC AGTGACATTA TGCCTGATTA TGTTGAGCAT AGTAGAGATA2753
GAAGTTTTTA GTGCAATATA AATTATACTG GGTTATAATT GCTTATTAAT AATCACATTG2813
AAGAAAGATG TTCTAGATGT CTTCAAATGC TAGTTTGACC ATATTTATCA AAAATTTTTT2873
CCCCATCCCC CATTTATCTT ACAACATAAA ATCAATCTCA TAGGAATTTG GGTGTTGAAA2933
ATAAAATCCT CTTTATAAAA ATGCTGACAA ATTGGTGGTT AAAAAAATTA GCAAGCAGAG2993
GCATAGTAAG GATTTTGGCT CCTAAAGTAA ATTATATTGA ATGTGGAGCA GGAAGAAACA3053
TGTCTTGAGA GACTAAGTGT GGCAAATATT GCAAAGCTCA TATTGATCAT TGCAGAATGA3113
ACCTGCATAG TCTCTTCCCT TCATTTGGAA GTGAATGTCT CTGTTAAAGC TTCTCAGGGA3173
CTCATAAACT TTCTGAACAT AAGGTCTCAG ATACAGTTTT AATATTTTTC CCCAATTTTT3233
TTTTCTGAAT TTTTCTCAAA GCAGCTTGAG AAATTGAGAT AAATAGTAGC TAGGGAGAAG3293
-42A7UJOii< £>U
TGGCCCAGGA AAGATTTCTC CTCTTTTTGC TATCAGAGGG CCCTTGTTAT TATTGTTATT3353
ATTATTACTT GCATTATTAT TGTCCATCAT TGAAGTTGAA GGAGGTTATT GTACAGAAAT3413
TGCCTAAGAC AAGGTAGAGG GAAAACGTGG ACAAATAGTT TGTCTACCCT TTTTTACTTC3473
AAAGAAAGAA CGGTTTATGC ATTGTAGACA GTTTTCTATC ATTTTTGGAT ATTTGCAAGC3533
CACCCTGTAA GTAACTACAA AAGGAGGGTT TTTACTTCCC CCAGTCCATT CCCAAAGCTA3593
TGTAACCAGA AGCATTAAAG AAGAAAGGGG AAGTATCTGT TGTTTTATTT TACATACAAT3653
AACGTTCCAG ATCATGTCCC TGTGTAAGTT ATATTTTAGA TTGAAGCTTA TATGTATAGC3713
CTCAGTAGAT CCACAAGTGA AAGGTATACT CCTTCAGCAC ATGTGAATTA CTGAACTGAG3773
CTTTTCCTGC TTCTAAAGCA TCAGGGGGTG TTCCTATTAA CCAGTCTCGC CACTCTTGCA3833
GGTTGCTATC TGCTGTCCCT TATGCATAAA GTAAAAAGCA AAATGTCAAT GACATTTGCT3893
TATTGACAAG GACTTTGTTA TTTGTGTTGG GAGTTGAGAC AATATGCCCC ATTCTAAGTA3953
AAAAGATTCA GGTCCACATT GTATTCCTGT TTTAATTGAT TTTTTGATTT GTTTTTCTTT4013
TTCAAAAAGT TTATAATTTT AATTCATGTT AATTTAGTAA TATAATTTTA CATTTTCCTC4073
AAGAATGGAA TAATTTATCA GAAAGCACTT CTTAAGAAAA TACTTAGCAG TTTCCAAAGA4133
AAATATAAAA TTACTCTTCT GAAAGGAATA CTTATTTTTG TCTTCTTATT TTTGTTATCT4193
TATGTTTCTG TTTGTAG A TAT TTG CAG GAA ΑΤΑ TAT AAT TCA AAT AAT CAA4244
Tyr Leu Gin Glu Ile Tyr Asn Ser Asn Asn Gin
135 140145
AAG ATT GTT AAC CTG AAA GAG AAG GTA GCC CAG CTT GAA GCA CAG TGC4292
Lys Ile Val Asn Leu Lys Glu Lys Val Ala Gin Leu Glu Ala GinCys
150 155160
CAG GAA CCT TGC AAA GAC ACG GTG CAA ATC CAT GAT ATC ACT GGG AAA G 4341
Gin Glu Pro Cys Lys Asp Thr Val Gin Ile His Asp Ile Thr GlyLys
165 170175
GTAACTGATG AAGGTTATAT TGGGATTAGG TTCATCAAAG TAAGTAATGT AAAGGAGAAA 4401 GTATGTACTG GAAAGTATAG GAATAGTTTA GAAAGTGGCT ACCCATTAAG TCTAAGAATT 4461
-43 CZ 296382 B6
TCAGTTGTCT AGACCTTTCT TGAATAGCTA AAAAAAACAG TTTAAAAGGA ATGCTGATGT4521
GAAAAGTAAG AAAATTATTC TTGGAAAATG AATAGTTTAC TACATGTTAA AAGCTATTTT4581
TCAAGGCTGG CACAGTCTTA CCTGCATTTC AAACCACAGT AAAAGTCGAT TCTCCTTCTC4641
TAG AT TGT CAA GAC ATT GCC AAT AAG GGA GCT AAA CAG AGC GGG CTT4688
Asp Cys Gin Asp Ile Ala Asn Lys Gly Ala Lys Gin Ser Gly Lěu
180 185190
TAC TTT ATT AAA CCT CTG AAA GCT AAC CAG CAA TTC TTA GTC TAC TGT4736
Tyr Phe Ile Lys Pro Leu Lys Ala Asn Gin Gin Phe Leu Val TyrCys
195 200205
GAA ATC GAT GGG TCT GGA AAT GGA TGG ACT GTG TTT CAG AAG4778
Glu Ile Asp Gly Ser Gly Asn Gly Trp Thr Val Phe GinLys
210 215220
GTAATTTTTT CCCCACCATG TGTATTTAAT AAATTCCTAC ATTGTTTCTG CCATATGGCA4838
GATACTTTTC TAAGCACCTT GTGAACCGTA GCTCATTTAA TCCTTGCAAT AGCCCTAAGA4898
GGAAGGTACT TCTGTTACTC CTATTTACAG AAAAGGAAAC TGAGGCACAC AAGGTTAAAT4958
AACTTGCCCA AGACCACATA ACTAATAAGC AACAGAGTCA GCATTTGAAC CTAGGCAGTA5018
TAGTTTCAGA GTTTGTGACT TGACTCTATA TTGTACTGGC ACTGACTTTG TAGATTCATG5078
GTGGCACATA ATCATAGTAC CACAGTGACA AATAAAAAGA AGGAAACTCT TTTGTCAGGT5138
AGGTCAAGAC CTGAGGTTTC CCATCACAAG ATGAGGAAGC CCAACACCAC CCCCCACCAC5198
CCCACCACCA TCACCACCCT TTCACACACC AGAGGATACA CTTGGGCTGC TCCAAGACAA5258
GGAACCTGTG TTGCATCTGC CACTTGCTGA TACCCACTAG GAATCTTGGC TCCTTTACTT5318
TCTGTTTACC TCCCACCACT GTTATAACTG TTTCTACAGG GGGCGCTCAG AGGGAATGAA5378
TGGTGGAAGC ATTAGTTGCC AGACACCGAT TGAGCAATGG GTTCCATCAT AAGTGTAAGA5438
ATCAGTAATA TCCAGCTAGA GTTCTGAAGT CGTCTAGGTG TCTTTTTAAT ATTACCACTC5498
ATTTAGAATT TATGATGTGC CAGAAACCCT CTTAAGTATT TCTCTTATAT TCTCTCTCAT5558
GATCCTTGCA GCAACCCTAA GAAGTAACCA TCATTTTTCC TATTTGATAC ATGAGGAAAC5618
TGAGGTAGCT TGGCCAAGAT CACTTAGTTG GGAGTTGATA GAACCAGTGC TCTGTATTTT5678
-44CZ ZVOJOZ t50
TGACAAAATG TTGACAGCAT TCTCTTTACA TGCATTGATA GTCTATTTTC TCCTTTTGCT 5738
CTTGCAAATG TGTAATTAG AGA CTT GAT GGC AGT GTA GAT TTC AAG AAA AAC5790
Arg Leu Asp Gly Ser Val Asp Phe Lys Lys Asn
225230
TGG ATT CAA TAT AAA GAA GGA TTT GGA CAT CTG TCT CCT ACT GGC ACA5838
Trp Ile Gin Tyr Lys Glu Gly Phe Gly His Leu Ser Pro Thr Gly Thr
235 240245
ACA GAA TTT TGG CTG GGA AAT GAG AAG ATT CAT TTG ATA AGC ACA CAG5886
Thr Glu Phe Trp Leu Gly Asn Glu Lys Ile His Leu Ile Ser ThrGin
250 255 260265
TCT GCC ATC CCA TAT GCA TTA AGA GTG GAA CTG GAA GAC TGG AAT GGC5934
Ser Ala Ile Pro Tyr Ala Leu Arg Val Glu Leu Glu Asp Trp AsnGly
270 275280
AGA ACC AG GTACTGTTTT GAAATGACTT CCAACTTTTT ATTGTAAAGA5982
Arg Thr Ser
TTGCCTGGAA TGTGCACTTT CCAACTATCA ATAGACAATG GCAAATGCAG CCTGACAAAT6042
GCAAACAGCA CATCGAGCCA CCATTTTCTC CAGGAGTCTG TTTGGTTCTT GGGCAATCCA6102
AAAAGGTAAA TTCTATTCAG GATGAATCTA AGTGTATTGG TACAATCTAA TTACCCTGGA6162
ACCATTCAGA GTAATAGCTA ATTACTGAAC TTTTAATCAG TCCCAGGAAT TGAGCATAAA6222
ATTATAATTT TATCTAGTCT AAATTACTAT TTCATGAAGC AGGTATTATT ATTAATCCCA6282
TTTTATAGAT TAACTTGCTC AAAGTCACAT TGCTGATAAG TGGTAGAGGT AGAATTCAGA6342
CTCAAGTAGT TTAACTTTAG AGCCTGTCCT CTTAACAACT ATCCTGGTTG AAAAGCAAAT6402
ACAGCCTCTT CAGACTTCTC AGTGCCTTGA TGGCCATTTA TTCTGTCAAA TCATGAGCTA6462
CCCTAAAAGT AAACCAGCTA GCTCTTTTGA TGATCTAGAG GCTTCTTTTT GCTTGAGATA6522
TTTGAAGGTT TTAAGCATTG TTACCTAATT AAAATGCAGA AAAATATCCA ACCCTCTTGT6582
TATGTTTAAG GAATAGTGAA ATATATTGTC TTCAAACACA TGGACTTTTT TTTATTGCTT6642
GGTTGGTTTT TAATCCAGAA AGTGCTATAG TCAGTAGACC TTCTTCTAGG AAAGGACCTT6702
-45CZ 296382 B6
CCATTTCCCA GCCACTGGAG ATTAGAAAAT AAGCTAAATA TTTTCTGGAA ATTTCTGTTC6762
ATTCATTAAG GCCCATCCTT TCCCCCACTC TATAGAAGTG TTGTCCACTT GCACAATTTT6822
TTCCAGGAAA GAATCTCTCT AACTCCTTCA GCTCACATGC TTTGGACCAC ACAGGGAAGA6882
CTTTGATTGT GTAATGCCCT CAGAAGCTCT CCTTCTTGCC ACTACCACAC TGATTTGAGG6942
AAGAAAATCC CTTTAGCACC TAACCCTTCA GGTGCTATGA GTGGCTAATG GAACTGTACC7002
TCCTTCAAGT TTTGTGCAAT AATTAAGGGT CACTCACTGT CAGATACTTT CTGTGATCTA7062
TGATAATGTG TGTGCAACAC ATAACATTTC AATAAAAGTA GAAAATATGA AATTAGAGTC7122
ATCTACACAT CTGGATTTGA TCTTAGAATG AAACAAGCAA AAAAGCATCC AAGTGAGTGC7182
AATTATTAGT TTTCAGAGAT GCTTCAAAGG CTTCTAGGCC CATCCCGGGA AGTGTTAATG7242
AGCTGTGGAC TGGTTCACAT ATCTATTGCC TCTTGCCAGA TTTGCAAAAA ACTTCACTCA7302
ATGAGCAAAT TTCAGCCTTA AGAAACAAAG TCAAAAATTC CAAGGAAGCA TCCTACGAAA7362
GAGGGAACTT CTGAGATCCC TGAGGAGGGT CAGCATGTGA TGGTTGTATT TCCTTCTTCT7422
CAG T ACT GCA GAC TAT GCC ATG TTC AAG GTG GGA CCT GAA GCT GAC7468
Thr Ala Asp Tyr Ala Met Phe Lys Val Gly Pro Glu Ala Asp
285 290295
AAG TAC CGC CTA ACA TAT GCC TAC TTC GCT GGT GGG GAT GCT GGA GAT7516
Lys Tyr Arg Leu Thr Tyr Ala Tyr Phe Ala Gly Gly Asp Ala GlyAsp
300 305310
GCC TTT GAT GGC TTT GAT TTT GGC GAT GAT CCT AGT GAC AAG TTT TTC7564
Ala Phe Asp Gly Phe Asp Phe Gly Asp Asp Pro Ser Asp Lys PhePhe
315 320 325330
ACA TCC CAT AAT GGC ATG CAG TTC AGT ACC TGG GAC AAT GAC AAT GAT7612
Thr Ser His Asn Gly Met Gin Phe Ser Thr Trp Asp Asn Asp AsnAsp
335 340345
AAG TTT GAA GGC AAC TGT GCT GAA CAG GAT GGA TCT GGT TGG TGG ATG7660
Lys Phe Glu Gly Asn Cys Ala Glu Gin Asp Gly Ser Gly Trp TrpMet
350 355360
AAC AAG TGT CAC GCT GGC CAT CTC AAT GGA GTT TAT TAC CAA G7703
Asn Lys Cys His Ala Gly His Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Gin
365 370375
-46GTATGTTTTC CTTTCTTAGA TTCCAAGTTA ATGTATAGTG TATACTATTT TCATAAAAAA7763
TAATAAATAG ATATGAAGAA ATGAAGAATA ATTTATAAAG ATAGTAGGGA TTTTATCATG7823
TTCTTTATTT CAACTAAGTT CTTTGAAACT GGAAGTGGAT AATACCAAGT TCATGCCTAA7883
AATTAGCCCT TCTAAAGAAA TCCACCTGCT GCAAAATATC CAGTAGTTTG GCATTATATG7943
TGAAACTATC ACCATCATAG CTGGCACTGT GGGHGTGGG ATCTCCTHA GACATACAAC8003
ATAAATGATC TGGATGGATT AACATTACTA CATGGATGCT TGTTGACACA TTAACCTGGC8063
TTCCCATGAG CTTTGTGTCA GATACACGCA GTGAACAGGT GTTTGGAGGA ACAGAATAAA8123
GAGAAGGCAA GCACTGGTAA GGGCAGGGGT TTGTGAAAGC TTGAGAGAAG AGACCAGTCT8183
GAGGACAGTA GACACTTATT TTAGGATGGG GGTTGGATGA GGAGGCTATA GTTTGCTATA8243
AGCTTGGAAT GGTTTGGAAC ACTGGTTTCA CTCACCTACC CAGCAGTTAT GTGTGGGGAA8303
GCCTTACCGA TGCTAAAGGA TCCATGTTAC AATAATGGCA TTATTTGGAA ATCCCAGTGG8363
TATTCCATGA ATAAAACCAC TATGAAGATA ATCCCACTCA ACAGACTCTC CGTTGGAGAA8423
GGACAGCAAC ACCACCCTGG GAAAGCCAAA CAGTCAGACC AGACCTGTTT AGCATCAGTA8483
GGACTTCCCT ACCATATCTG CTGGGTAGAT GAGTGAAACC AGTGTTCCAA ACCACTCCGG8543
GCTTGTAGCA AACCATAGTC TCCTCATCTA CCAAGATGAG CAACCTTACC TCCTGATGTC8603
CTAGCCAATC ACCAACTAGG AAACTTTGCA CAGTTTATTT AAAGTAACAG TTTGATTTTC8663
ACAATATTTT TAAATTGGAG AAACATAACT TATCTTTGCA CTCACAAACC ACATAATGAG8723
AAGAAACTCT AAGGGAAAAT GCTTGATCTG TGTGACCCGG GGCGCCATGC CAGAGCTGTA8783
GTTCATGCCA GTGTTGTGCT CTGACAAGCC TTTTACAGAA TTACATGAGA TCTGCTTCCC8843
TAGGACAAGG AGAAGGCAAA TCAACAGAGG CTGCACTTTA AAATGGAGAC ATAAAATAAC8903
ATGCCAGAAC CATTTCCTAA AGCTCCTCAA TCAACCAACA AAATTGTGCT TTCAAATAAC8963
CTGAGTTGAC CTCATCAGGA ATTTTGTGGC TCCTTCTCTT CTAACCTGCC TGAAGAAAGA9023
TGGTCCACAG CAGCTGAGTC CGGGATGGAT AAGCTTAGGG ACAGAGGCCA ATTAGGGAAC9083
-47CZ 296382 B6
TTTGGGTTTC TAGCCCTACT AGTAGTGAAT AAATTTAAAG TGTGGATGTG ACTATGAGTC9143
ACAGCACAGA TGTTGTTTAA TAATATGTTT ΑΤΠΤΑΤΑΑΑ TTGATATTTT AGGAATCTTT9203
GGAGATATTT TCAGTTAGCA GATAATACTA TAAATTTTAT GTAACTGGCA ATGCACTTCG9263
TAATAGACAG CTCTTCATAG ACTTGCAGAG GTAAAAAGAT TCCAGAATAA TGATATGTAC9323
ATCTACGACT TGTTTTAG GT GGC ACT TAC TCA AAA GCA TCT ACT CCT AAT 9373
Gly Gly Thr Tyr Ser Lys Ala Ser Thr Pro Asn
380 385
GGT TAT GAT AAT GGC ATT ATT TGG GCC ACT TGG AAA ACC CGG TGG TAT 9421
Gly Tyr Asp Asn Gly Ile Ile Trp Ala Thr Trp Lys Thr Arg Trp Tyr
390 395 400
TCC ATG AAG AAA ACC ACT ATG AAG ATA ATC CCA TTC AAC AGA CTC ACA 9469
Ser Met Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro Phe Asn Arg Leu Thr
405 410 415
ATT GGA GAA GGA CAG CAA CAC CAC CTG GGG GGA GCC AAA CAG GTC AGA 9517
Ile Gly Glu Gly Gin Gin His His Leu Gly Gly Ala Lys Gin Val Arg
420 425 430 435
CCA GAG CAC CCT GCG GAA ACA GAA TAT GAC TCA CTT TAC CCT GAG GAT 9565
Pro Glu His Pro Ala Glu Thr Glu Tyr Asp Ser Leu Tyr Pro Glu Asp
440 445 450
GAT TTG TAGAAAATTA ACTGCTAACT TCTATTGACC CACAAAGTTT CAGAAATTCT 9621
Asp Leu
CTGAAAGTTT CTTCCTTTTT TCTCTTACTA TATTTATTGA TTTCAAGTCT TCTATTAAGG 9681 ACATTTAGCC TTCAATGGAA ATTAAAACTC ATTTAGGACT GTATTTCCAA ATTACTGATA 9741 TCAGAGTTAT TTAAAAATTG TTTATTTGAG GAGATAACAT TTCAACTTTG TTCCTAAATA 9801 TATAATAATA AAATGATTGA CTTTATTTGC ATTTTTATGA CCACTTGTCA TTTATTTTGT 9861 CTTCGTAAAT TATTTTCATT ATATCAAATA TTTTAGTATG TACTTAATAA AATAGGAGAA 9921 CATTTTAGAG TTTCAAATTC CCAGGTATTT TCCTTGTTTA TTACCCCTAA ATCATTCCTA 9981 TTTAATTCTT CTTTTTAAAT GGAGAAAATT ATGTCTTTTT AATATGGTTT TTGTTTTGTT 10041 ATATATTCAC AGGCTGGAGA CGTTTAAAAG ACCGTTTCAA AAGAGATTTA CTTTTTTAAA 10101
-48 ΌΖ. 4VOJO4 DO
GGACTTTATC TGAACAGAGA GATATAATAT TTTTCCTATT GGACAATGGA CTTGCAAAGC 10161 TTCACTTCAT TTTAAGAGCA AAAGACCCCA TGTTGAAAAC TCCATAACAG TTTTATGCTG 10221 ATGATAATTT ATCTACATGC ATTTCAATAA ACCTTTTGTT TCCTAAGACT AGATACATGG 10281 TACCTTTATT GACCATTAAA AAACCACCAC TTTTTGCCAA TTTACCAATT ACAATTGGGC 10341 AACCATCAGT AGTAATTGAG TCCTCATTTT ATGCTAAATG TTATGCCTAA CTCTTTGGGA 10401 GTTACAAAGG AAATAGCAAT TATGGCTTTT GCCCTCTAGG AGATACAGGA CAAATACAGG 10461 AAAATACAGC AACCCAAACT GACAATACTC TATACAAGAA CATAATCACT AAGCAGGAGT 10521 CACAGCCACA CAACCAAGAT GCATAGTATC CAAAGTGCAG CTG 10564 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 453 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární o
(ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 6:
Met 1 Ser Trp Ser Leu His 5 Pro Arg Asn Leu 10 Ile Leu Tyr Phe Tyr 15 Ala
Leu Leu Phe Leu Ser Ser Thr Cys Val Ala Tyr Val Ala Thr Arg Asp
20 25 30
Asn Cys Cys Ile Leu Asp Glu Arg Phe Gly Ser Tyr Cys Pro Thr Thr
35 40 45
Cys Gly Ile Ala Asp Phe Leu Ser Thr Tyr Gin Thr Lys Val Asp Lys
50 55 60
Asp Leu Gin Ser Leu Glu Asp Ile Leu His Gin Val Glu Asn Lys Thr
65 70 75 80
Ser Glu Val Lys Gin Leu Ile Lys Ala Ile Gin Leu Thr Tyr Asn Pro
85 90 95
-49CL 296382 B6
Asp Glu Ser Ser Lys Pro Asn Met Ile Asp Ala Ala Thr Leu Lys Ser
100 105 110
Arg Ile Met Leu Glu Glu Ile Met Lys Tyr Glu Ala Ser Ile Leu Thr
115 120 125
His Asp Ser Ser Ile Arg Tyr Leu Gin Glu Ile Tyr Asn Ser Asn Asn
130 135 140
Gin Lys Ile Val Asn Leu Lys Glu Lys Val Ala Gin Leu Glu Ala Gin
145 150 155 160
Cys Gin Glu Pro Cys Lys Asp Thr Val Gin Ile His Asp Ile Thr Gly
165 170 175
Lys Asp Cys Gin Asp Ile Ala Asn Lys Gly Ala Lys Gin Ser Gly Leu
180 185 190
Tyr Phe Ile Lys Pro Leu Lys Ala Asn Gin Gin Phe Leu Val Tyr Cys
195 200 205
Glu Ile Asp Gly Ser Gly Asn Gly Trp Thr Val Phe Gin Lys Arg Leu
210 215 220
Asp Gly Ser Val Asp Phe Lys Lys Asn Trp Ile Gin Tyr Lys Glu Gly
225 230 235 240
Phe Gly His Leu Ser Pro Thr Gly Thr Thr Glu Phe Trp Leu Gly Asn
245 250 255
Glu Lys Ile His Leu Ile Ser Thr Gin Ser Ala Ile Pro Tyr Ala Leu
260 265 270
Arg Val Glu Leu Glu Asp Trp Asn Gly Arg Thr Ser Thr Ala Asp Tyr
275 280 285
Ala Met Phe Lys Val Gly Pro Glu Ala Asp Lys Tyr Arg Leu Thr Tyr
290 295 300
Ala Tyr Phe Ala Gly Gly Asp Ala Gly Asp Ala Phe Asp Gly Phe Asp
305 310 315 320
Phe Gly Asp Asp Pro Ser Asp Lys Phe Phe Thr Ser His Asn Gly Met
325 330 335
Gin Phe Ser Thr Trp Asp Asn Asp Asn Asp Lys Phe Glu Gly Asn Cys
340 345 350
-5047UJO4 DO
Ala Glu Gin Asp Gly Ser Gly Trp Trp Met Asn Lys Cys His Ala Gly
355 360 365
His Leu Asn Gly Val Tyr Tyr Gin Gly Gly Thr Tyr Ser Lys Ala Ser
370 375 380
Thr Pro Asn Gly Tyr Asp Asn Gly Ile Ile Trp Ala Thr Trp Lys Thr
385 390 395 400
Arg Trp Tyr Ser Met Lys Lys Thr Thr Met Lys Ile Ile Pro Phe Asn
405 410 415
Arg Leu Thr Ile Gly Glu Gly Gin Gin His His Leu Gly Gly Ala Lys
420 425 430
Gin Val Arg Pro Glu His Pro Ala Glu Thr Glu Tyr Asp Ser Leu Tyr
435 440 445
Pro Glu Asp Asp Leu 450 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 10807 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité ío (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ovčí beta-laktoglobulin (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 7:
ACGCGTGTCG ACCTGCAGGT CAACGGATCT CTGTGTCTGT TTTCATGTTA GTACCACACT60
GTTTTGGTGG CTGTAGCTTT CAGCTACAGT CTGAAGTCAT AAAGCCTGGT ACCTCCAGCT120
CTGTTCTCTC TCAAGATTGT GTTCTGCTGT TTGGGTCTTT AGTGTCTCCA CACAATTTTT180
AGAATTGTTT GTTCTAGTTC TGTGAAAAAT GATGCTGGTA TTTTGATAAG GATTGCATTG240
AATCTGTAAA GCTACAGATA TAGTCATTGG GTAGTACAGT CACTTTAACA ATATTAACTC300
-51 CZ 296382 B6
TTCACATCTG TGAGCATGAT ATATTTTCCC CCTCTATATC ATCTTCAATT CCTCCTATCA360
GTTTCTTTCA TTGCAGTTTT CTGAGTACAG GTCnACACC TCCTTGGTTA GAGTCATTCC420
TCAGTATTTT ATTCCTTTGA TACAATTGTG AATGAGGTAA TTTTCTTAGT TTCTCTTTCT480
GATAGCTCAT TGHAGTGTA TATATAGAAA AGCAACAGAT TTCTATGTAT TAATTTTGTA540
TCCTGCAACA GATTTCTATG ΤΑΤΤΑΑΊΤΓΤ GTATCCTGCT ACTTTACGGA ATTCACTTAT600
TAGCTTTTTG GTGACATCTT GAGGATTTTC TGAAGAAAAT GGCATGGTAT GGTAGGACAA660
GGTGTCATGT CATCTGCAAA CAGTGGCAGT TTTCCTTCn CCCTTCCAAC CTGGATTTCT720
TTGATTTCTT TCTGTCTGAG TACGACTAGG ATTCCCAATA CTATACCGAA TAAAAGTGGC780
AAGAGTGGAC ATCCTTGTCT TATTTTTCTG ACCTTAGAGG AAATGCTTTC AGTTTTTCAC840
CATTAATTAT AATGTTTACT GTGGGCTTGT CATATGTGGC CTTCATTATA TGGAGGTCTA900
TTCCCTCTAT ACCCACCTTG TTGAGAGTTT TTATCATAAA AGTATGHGA ATTTTGTCAA960
AAGTTTTTCC TGCATCTATT GAGATGATTT TTACTCTTCA ATTCAHAAT GATTTTTATT1020
CTTCATTTTG TTAATGATTT CCATTCTTCA ATTTGTTAAC GTGGTATATC ACATTGATTG1080
ATTTGTGGAT ACCTTTGTAT CCCTGGGATA AACCTCACTT GATCATGAGC TTTCAATGTA1140
TTTTTGAATT CACTTTGCTA ATATTCTGTT GGGTATTTTT GCATCTCTAT TCATCAATGA1200
TATTGGCCTA AGAAAGGTTT TGTCTGGTTT TAGTATCAGG GTGATGCTGG CCTCATAGAG1260
AGAGTTTAGA AGCATTTCCT CCTCTTTGAT TTTTCGGAAT AGTTTGAGTA GGATAGGTAT1320
TAACTCTTCT TTAAATGTTT GGGGACTTCC CTGGTGAGCC GGTGGTTGAG AATCCGCCTC1380
AGGGATGTGG GTTTGATCCC TGGTCAGGGA ACCATTAATA AGATCCCACA TGCTGCAGGC1440
AACAAGCCCC CAAGCTGCAA CCACTGAGCT GCAACCGCTG CAGTGCCCAC AGGCCACGAC1500
CAGAGAAAGC CCACATACAG CAGGGAAGAC CCAGCACAAC CGGAAAAAGG AGTTTGGTGG1560
AATACAGCTG TGAAGCCGTC TGGTCCTGGA CTCCTGCTTG AGGGAATTTT ΤΤΑΑΑΑΑΠΑ1620
TTGATTCAAT TTCAITACTG GTAACTGGTC TGTTCATATT TTCTATTTCT TCCGGGTTCA1680
GTCTTGGGAG ATTGTACATG CCTAGGAATG TGTCCGTTTC TTCTAGGTTG TCCATTTTAT1740
-52TGGACATGCA TGGGAGCACA CAGCACCGAC CAGCGAGACT CATGCTGGCT TCCTGGGGCC 1800 AGGCTGGGGC CCCAAGCAGC ATGGCATCCT AGAGTGTGTG AAAGCCCACT GACCCTGCCC 1860 AGCCCCACAA TTTCATTCTG AGAAGTGATT CCTTGCTTCT GCACHACAG GCCCAGGATC 1920 TGACCTGCTT CTGAGGAGCA GGGGTTTTGG CAGGACGGGG AGATGCTGAG AGCCGACGGG 1980 GGTCCAGGTC CCCTCCCAGG CCCCCCTGTC TGGGGCAGCC CTTGGGAAAG ATTGCCCCAG 2040 TCTCCCTCCT ACAGTGGTCA GTCCCAGCTG CCCCAGGCCA GAGCTGCTTT ATTTCCGTCT 2100 CTCTCTCTGG ATGGTATTCT CTGGAAGCTG AAGGTTCCTG AAGTTATGAA TAGCTTTGCC 2160 CTGAAGGGCA TGGTTTGTGG TCACGGTTCA CAGGAACTTG GGAGACCCTG CAGCTCAGAC 2220 GTCCCGAGAT TGGTGGCACC CAGATTTCCT AAGCTCGCTG GGGAACAGGG CGCTTGTTTC 2280 TCCCTGGCTG ACCTCCCTCC TCCCTGCATC ACCCAGTTCT GAAAGCAGAG CGGTGCTGGG 2340 GTCACAGCCT CTCGCATCTA ACGCCGGTGT CCAAACCACC CGTGCTGGTG TTCGGGGGGC 2400 TACCTATGGG GAAGGGCTTC TCACTGCAGT GGTGCCCCCC GTCCCCTCTG AGATCAGAAG 2460 TCCCAGTCCG GACGTCAAAC AGGCCGAGCT CCCTCCAGAG GCTCCAGGGA GGGATCCTTG 2520 CCCCCCCGCT GCTGCCTCCA GCTCCTGGTG CCGCACCCTT GAGCCTGATC TTGTAGACGC 2580 CTCAGTCTAG TCTCTGCCTC CGTGTTCACA CGCCTTCTCC CCATGTCCCC TCCGTGTCCC 2640 CGTTTTCTCT CACAAGGACA CCGGACATTA GATTAGCCCC TGTTCCAGCC TCACCTGAAC 2700 AGCTCACATC TGTAAAGACC TAGATTCCAA ACAAGATTCC AACCTGAAGT TCCCGGTGGA 2760 TGTGAGTTCT GGGGCGACAT CCTTCAACCC CATCACAGCT TGCAGTTCAT CGCAAAACAT 2820 GGAACCTGGG GTTTATCGTA AAACCCAGGT TCTTCATGAA ACACTGAGCT TCGAGGCTTG 2880 TTGCAAGAAT TAAAGGTGCT AATACAGATC AGGGCAAGGA CTGAAGCTGG CTAAGCCTCC 2940 TCTTTCCATC ACAGGAAAGG GGGGCCTGGG GGCGGCTGGA GGTCTGCTCC CGTGAGTGAG 3000 CTCTTTCCTG CTACAGTCAC CAACAGTCTC TCTGGGAAGG AAACCAGAGG CCAGAGAGCA 3060 AGCCGGAGCT AGTTTAGGAG ACCCCTGAAC CTCCACCCAA GATGCTGACC AGCCAGCGGG 3120
-53CZ 296382 B6
CCCCCTGGAA AGACCCTACA GTTCAGGGGG GAAGAGGGGC TGACCCGCCA GGTCCCTGCT 3180 ATCAGGAGAC ATCCCCGCTA TCAGGAGATT CCCCCACCTT GCTCCCGTTC CCCTATCCCA 3240 ATACGCCCAC CCCACCCCTG TGATGAGCAG THAGTCACT TAGAATGTCA ACTGAAGGCT 3300 TTTGCATCCC CTTTGCCAGA GGCACAAGGC ACCCACAGCC TGCTGGGTAC CGACGCCCAT 3360 GTGGATTCAG CCAGGAGGCC TGTCCTGCAC CCTCCCTGCT CGGGCCCCCT CTGTGCTCAG 3420 CAACACACCC AGCACCAGCA TTCCCGCTGC TCCTGAGGTC TGCAGGCAGC TCGCTGTAGC 3480 CTGAGCGGTG TGGAGGGAAG TGTCCTGGGA GATTTAAAAT GTGAGAGGCG GGAGGTGGGA 3540 GGTTGGGCCC TGTGGGCCTG CCCATCCCAC GTGCCTGCAT TAGCCCCAGT GCTGCTCAGC 3600 CGTGCCCCCG CCGCAGGGGT CAGGTCACTT TCCCGTCCTG GGGTTAHAT GACTCTTGTC 3660 ATTGCCATTG CCATTTTTGC TACCCTAACT GGGCAGCAGG TGCTTGCAGA GCCCTCGATA 3720 CCGACCAGGT CCTCCCTCGG AGCTCGACCT GAACCCCATG TCACCCnGC CCCAGCCTGC 3780 AGAGGGTGGG TGACTGCAGA GATCCCTTCA CCCAAGGCCA CGGTCACATG GTTTGGAGGA 3840 GCTGGTGCCC AAGGCAGAGG CCACCCTCCA GGACACACCT GTCCCCAGTG CTGGCTCTGA 3900 CCTGTCCTTG TCTAAGAGGC TGACCCCGGA AGTGTTCCTG GCACTGGCAG CCAGCCTGGA 3960 CCCAGAGTCC AGACACCCAC CTGTGCCCCC GCTTCTGGGG TCTACCAGGA ACCGTCTAGG 4020 CCCAGAGGGG ACTTCCTGCT TGGCCTTGGA TGGAAGAAGG CCTCCTATTG TCCTCGTAGA 4080 GGAAGCCACC CCGGGGCCTG AGGATGAGCC AAGTGGGATT CCGGGAACCG CGTGGCTGGG 4140 GGCCCAGCCC GGGCTGGCTG GCCTGCATGC CTCCTGTATA AGGCCCCAAG CCTGCTGTCT 4200 CAGCCCTCCA CTCCCTGCAG AGCTCAGAAG CACGACCCCA GGGATATCCC TGCAGCCATG 4260 AAGTGCCTCC TGCTTGCCCT GGGCCTGGCC CTCGCCTGTG GCGTCCAGGC CATCATCGTC 4320 ACCCAGACCA TGAAAGGCCT GGACATCCAG AAGGTTCGAG GGTTGGCCGG GTGGGTGAGT 4380 TGCAGGGCGG GCAGGGGAGC TGGGCCTCAG AGAGCCAAGA GAGGCTGTGA CGTTGGGTTC 4440 CCATCAGTCA GCTAGGGCCA CCTGACAAAT CCCCGCTGGG GCAGCTTCAA CCAGGCGTTC 4500 ACTGTCTTGC ATTCTGGAGG CTGGAAGCCC AAGATCCAGG TGTTGGCAGG GCTGGCTTCT 4560
-54CCTGCGGCCG TTCCTCTTCC CGACCTTTGT TTAGTGGGAC CCAGCCATGT TCTTTGGGK ATCTCAGGGC TCCCACCCCC GGCTATGGCG CGTGGAGGAG GGCGTCTCTC GGTGCAGGAG GGCGCTCCAC GATGCTTCAG GGGGAGATAA ATTCTGAATT TCATCATTTC GCAGTGTGGG CTCAAGCAGT AGCTGGATGG GCCTGTGGTC CATCCACCCG CTGGCTCCTA
CTCTCTGGGG TGTGAGGCCA CATCTCTTTA ACAGTTCAGC CTCCCCAAGA CAGTGTGAGT TGCCCAGGCC AGAGTGCAAC GCCAGCGACA CTGAAGCCCA CCCAACATGG GGACCAGGGC CCAAGGCTGC AACATCATCA AATCCTCTGA CCCTGTTAGT TAGTCTGAAC GATAGGCCCG TCCCGCTACC GTGTGGGGGC AAGGCTCTCC GTCCCCTGTG TGCCCATGCC
AGCAGACGGC CCAGGCCTGC AAGGCCATGT CCCTAAAAGA TCCAAATGTT CTGGGGAGAG GGGGTGGGAC TCAAGGTCCC TCTCCCTGCT CCCCCGAGGG AACCCCCACT CCCAGGGCTG CCACCCAGGG AACAAATGAA AGTGGAAATG CTGAGGATTA ACCTCAGTAT TGTGAAGGCT AGCCCTGTCC AGAGATGGGG CTGACCTTTT GCCTGAGGTG ACCCCCCTCC
CGTCTTCTCC TGGAAACACG CTCCAGAGTC GTCTCTCTGC GCTACATGTG CATTCCCCAG AGAGAGCCCA TCTCCAGGTG GGATGCCCAG CAACCTGGAG CCCCAGGGCT GGGAAGAGGG CTTTTTTTTT CATAAAACAT CATAGCAAAG CAAGTGTATT CTAAAATGAA GCTGGGAGGC ACCTCAGACG ACCTGAACCC CTCTCTGGCT ACAGTGAGTG AGCCCTCCTG
AGTCCTCTGC CCTGCCTGCG ATGTGTTGAA CCCTCAAATT GGGGGGCTCA GGTGCAGAGT CTGTGGGGCT GCGGGGACTT AGTGCCCCCC ATCCTGCTGC GTGGACCCCC CTCAGAGTTT TTTTAAACTT TCATTTTTGT ATACATACAA TGAGCAACAG CAAGAAGTCC AGCAGACCTG GGGGTCAGGG CAGGGCTGCC TCATCTGACT CGCCGAGGCT GGCCAGCTTC
GCGCCCTGAT CAGCTTCACA GTTCTGGGGG TTCCCCACCT TCTGGGTCCC TGGGGGGAGT GGGGGCCCCT GGCACTCCTT TGAGAGTGTA AGAAATGGTG CGGGGGGTGG ACTGGTACCC TTATTAATTT TTACTTGGAA TGAGGCAGGT AGAGACATTT TGGAAACGAA GGTCTTCGGG TGCAGGAGAG TTTTGGGGGT TCTCCTGGCC AGTTGGCCAG TGCCCCTGGC
4620
4680
4740
4800
4860
4920
4980
5040
5100
5160
5220
5280
5340
5400
5460
5520
5580
5640
5700
5760
5820
5880
5940
-55CZ 296382 B6
CCTCAGTTCA TCCTGATGAA AATGGTCCAT GCCAATGGCT CAGAAAGCAG CTGTCTTTCA 6000 GGGAGAACGG CGAGTGTGCT CAGAAGAAGA TTATTGCAGA AAAAACCAAG ATCCCTGCGG 6060 TGTTCAAGAT CGATGGTGAG TCCGGGTCCC TGGGGGACAC CCACCACCCC CGCCCCCGGG 6120 GACTGTGGAC AGGTICAGGG GGCTGGCGTC GGGCCCTGGG ATGCTAAGGG ACTGGTGGTG 6180 ATGAAGACAC TGCCTTGACA CCTGCTTCAC TTGCCTCCCC TGCCACCTGC CCGGGGCCTT 6240 GGGGCGGTGG CCATGGGCAG GTCCCGGCTG GCGGGCTAAC CCACCAGGGT GACACCCGAG 6300 CTCTCTTTGC TGGGGGGCGG GCGGTGCTCT GGGCCCTCAG GCTGAGCTCA GGAGGTACCT 6360 GTGCCCTCCC AGGGGTAACC GAGAGCCGTT GCCCACTCCA GGGGCCCAGG TGCCCCACGA 6420 CCCCAGCCCG CTCCACAGCT CCTTCATCTC CTGGAGACAA ACTCTGTCCG CCCTCGCTCA 6480 TTCACTTGTT CGTCCTAAAT CCGAGATGAT AAAGCT7CGA GGGGGGGTTG GGGTTCCATC 6540 AGGGCTGCCC TTCCGCCGGG CAGCCTGGGC CACATCTGCC CnGGCCCCC TCAGGACTCA 6600 CTCTGACTGG AGGCCCTGCA CTGACTGACG CCAGGGTGCC CAGCCCAGGG TCTCTGGCGC 6660 CATCCAGCTG CACTGGGTTT GGGTGCTGGT CCTGCCCCCA AGCTGCCCGG ACACCACAGG 6720 CAGCCGGGGC TGCCCACTGG CCTCGGTCAG GGTGAGCCCC AGCTGCCCCC GCTCAGGGCT 6780 TGCCCCGACA ATGACCCCAT CCTCAGGACG CACCCCCCTT CCCTTGCTGG GCAGTGTCCA 6840 GCCCCACCCG AGATCGGGGG AAGCCCTATT TCTTGACAAC TCCAGTCCCT GGGGGAGGGG 6900 GCCTCAGACT GAGTGGTGAG TGTTCCCAAG TCCAGGAGGT GGTGGAGGGT CCTGGCGGAT 6960 CCAGAGTTGA CAGTGAGGGC TTCCTGGGCC CCATGCGCCT GGCAGTGGCA GCAGGGAAGA 7020 GGAAGCACCA TTTCAGGGGT GGGGGATGCC AGAGGCGCTC CCCACCCCGT CTTCGCCGGG 7080 TGGTGACCCC GGGGGAGCCC CGCTGGTCGT GGAGGGTGCT GGGGGCTGAC TAGCAACCCC 7140 TCCCCCCCCG TTGGAACTCA CTTTTCTCCC GTCTTGACCG CGTCCAGCCT TGAATGAGAA 7200 CAAAGTCCTT GTGCTGGACA CCGACTACAA AAAGTACCTG CTCTTCTGCA TGGAAAACAG 7260 TGCTGAGCCC GAGCAAAGCC TGGCCTGCCA GTGCCTGGGT GGGTGCCAAC CCTGGCTGCC 7320 CAGGGAGACC AGCTGCGTGG TCCTTGCTGC AACAGGGGGT GGGGGGTGGG AGCTTGATCC 7380
-56CZ, ZVOJOZ DO
CCAGGAGGAG GAGGGGTGGG GGGTCCCTGA GTCCCGCCAG GAGAGAGTGG TCGCATACCG 7440 GGAGCCAGTC TGCTGTGGGC CTGTGGGTGG CTGGGGACGG GGGCCAGACA CACAGGCCGG 7500 GAGACGGGTG GGCTGCAGAA CTGTGACTGG TGTGACCGTC GCGATGGGGC CGGTGGTCAC 7560 TGAATCTAAC AGCCTTTGTT ACCGGGGAGT TTCAATTATT TCCCAAAATA AGAACTCAGG 7620 TACAAAGCCA TCTTTCAACT ATCACATCCT GAAAACAAAT GGCAGGTGAC ATTTTCTGTG 7680 CCGTAGCAGT CCCACTGGGC ATTTTCAGGG CCCCTGTGCC AGGGGGGCGC GGGCATCGGC 7740 GAGTGGAGGC TCCTGGCTGT GTCAGCCGGC CCAGGGGGAG GAAGGGACCC GGACAGCCAG 7800 AGGTGGGGGG CAGGCTTTCC CCCTGTGACC TGCAGACCCA CTGCACTGCC CTGGGAGGAA 7860 GGGAGGGGAA CTAGGCCAAG GGGGAAGGGC AGGTGCTCTG GAGGGCAAGG GCAGACCTGC 7920 AGACCACCCT GGGGAGCAGG GACTGACCCC CGTCCCTGCC CCATAGTCAG GACCCCGGAG 7980 GTGGACAACG AGGCCCTGGA GAAATTCGAC AAAGCCCTCA AGGCCCTGCC CATGCACATC 8040 CGGCTTGCCT TCAACCCGAC CCAGCTGGAG GGTGAGCACC CAGGCCCCGC CCTTCCCCAG 8100 GGCAGGAGCC ACCCGGCCCC GGGACGACCT CCTCCCATGG TGACCCCCAG CTCCCCAGGC 8160 CTCCCAGGAG GAAGGGGTGG GGTGCAGCAC CCCGTGGGGG CCCCCTCCCC ACCCCCTGCC 8220 AGGCCTCTCT TCCCGAGGTG TCCAGTCCCA TCCTGACCCC CCCATGACTC TCCCTCCCCC 8280 ACAGGGCAGT GCCACGTCTA GGTGAGCCCC TGCCGGTGCC TCTGGGGTAA GCTGCCTGCC 8340 CTGCCCCACG TCCTGGGCAC ACACATGGGG TAGGGGGTCT TGGTGGGGCC TGGGACCCCA 8400 CATCAGGCCC TGGGGTCCCC CCTGTGAGAA TGGCTGGAAG CTGGGGTCCC TCCTGGCGAC 8460 TGCAGAGCTG GCTGGCCGCG TGCCACTCTT GTGGGTGACC TGTGTCCTGG CCTCACACAC 8520 TGACCTCCTC CAGCTCCTTC CAGCAGAGCT AAGGCTAAGI GAGCCAGAAT GGTACCTAAG 8580 GGGAGGCTAG CGGTCCTTCT CCCGAGGAGG GGCTGTCCTG GAACCACCAG CCATGGAGAG 8640 GCTGGCAAGG GTCTGGCAGG TGCCCCAGGA ATCACAGGGG GGCCCCATGT CCATTTCAGG 8700 GCCCGGGAGC CTTGGACTCC TCTGGGGACA GACGACGTCA CCACCGCCCC CCCCCCATCA 8760
-57CZ 296382 B6
GGGGGACTAG AAGGGACCAG GACTGCAGTC ACCCTTCCTG GGACCCAGGC CCCTCCAGGC 8820 CCCTCCTGGG GCTCCTGCTC TGGGCAGCTT CTCCTTCACC AATAAAGGCA TAAACCTGTG 8880 CTCTCCCTTC TGAGTCTTTG CTGGACGACG GGCAGGGGGT GGAGAAGTGG TGGGGAGGGA 8940 GTCTGGCTCA GAGGATGACA GCGGGGCTGG GATCCAGGGC GTCTGCATCA CAGTCTTGTG 9000 ACAACTGGGG GCCCACACAC ATCACTGCGG CTCTTTGAAA CTTTCAGGAA CCAGGGAGGG 9060 ACTCGGCAGA GACATCTGCC AGTTCACTTG GAGTGTTCAG TCAACACCCA AACTCGACAA 9120 AGGACAGAAA GTGGAAAATG GCTGTCTCTT AGTCTAATAA ATATTGATAT GAAACTCAAG 9180 TTGCTCATGG ATCAATATGC CTTTATGATC CAGCCAGCCA CTACTGTCGT ATCAACTCAT 9240 GTACCCAAAC GCACTGATCT GTCTGGCTAA TGATGAGAGA TTCCCAGTAG AGAGCTGGCA 9300 AGAGGTCACA GTGAGAACTG TCTGCACACA CAGCAGAGTC CACCAGTCAT CCTAAGGAGA 9360 TCAGTCCTGG TGTTCAnGG AGGACTGATG TTGAAGCTGA AACTCCAATG CTTTGGCCAC 9420 CTGATGTGAA GAGCTGACTC ATTTGAAAAG ACCCTGATGC TGGGAAAGAT TGAGGGCAGG 9480 AGGAGAAGGG GACGACAGAG GATGAGATGG TTGGATGGCA TCACCAACAC AATGGACATG 9540 GGTTTGGGTG GACTCCAGGA GTTGGTGATG GACAGGGAGG CCTGGCGTGC TACGGAAGCG 9600 GTTTATGGGG TCACAAAGAC TGAGTGACTG AACTGAGCTG AACTGAATGG AAATGAGGTA 9660 TACAGCAAAG TGGGGATTTT TTAGATAATA AGAATATACA CATAACATAG TGTATACTCA 9720 TATTTTTATG CATACCTGAA TGCTCAGTCA CTCAGTCGTA TCTGACTCTG TGACCTATGG 9780 ACCGTAGCCT TCCAGGTTTC TTCTGTCCAC AGAATTCTCC AAGGCAAGAA TACTGGAGTG 9840 GGTAGCCATT TCCTCCTCCA GGGGATCCTC CCGACCCAGG GATTGAACCG GCATCTCCTG 9900 TATTGGCAGG TGGATTCTTT ACCACTGTGC CACCAGGGAA GCCCGTGTIA CTCTCTATGT 9960 CCCACTTAAT TACCAAAGCT GCTCCAAGAA AAAGCCCCTG TGCCCTCTGA GCTTCCCGGC 10020 CTGCAGAGGG TGGTGGGGGT AGACTGTGAC CTGGGAACAC CCTCCCGCTT CAGGACTCCC 10080 GGGCCACGTG ACCCACAGTC CTGCAGACAG CCGGGTAGCT CTGCTCTTCA AGGCTCATTA 10140 TCTTTAAAAA AAACTGAGGT CTATTTTGTG ACTTCGCTGC CGTAACTTCT GAACATCCAG 10200
-58ΌΛ 470004 DO
TGCGATGGAC AGGACCTCCT CCCCAGGCCT TGAGTCACCA GACACTCGGG GGTGGCCCCG CCTGATCAAA GAGCAAGACC AATGACTTCT AGGTTCACCA GAGCTGAGCT GTCCTTTTGA CTCTTTAATC TGGATTTAAG GCCTACTTGC CCCAGGACAG CCACTCGGTG GCATCCGAGG ATTAATCGGT CCAAACTGGA CAAAAACCTT CATCCTGCTT TGACCACCCT GCATCTTTTT ΤΑΤΑΤΑΤΤΓΤ TTTTTTTTTC ATTTTTTGGC CAGGCTTCTC TCTAGTTTCT CTCTAGTCTT GACGCGT
CA6GGGCTTC AGGGAGCCAG CCTTCACCTA 10260
CCTTCAGGGT GCTCACAGTC TTCCCATCGT 10320
TAGGAGCAAG CAGACACCCA CAGGACACTG 10380
ACCTAAAGAC ACACAGCTCT CGAAGGTTTT 10440
CCCTCAAGAG GGAAGACAGT CCTGCATGTC 10500
CCACTTAGTA TTATCTGACC GCACCCTGGA 10560
GGTGGGAAGT TTCATCCCAG AGGCCTCAAC 10620
TTCTTTTATG TGTATGCATG TATATATATA 10680
TGTGCTGGCT GTTCGTTGCA GTTCGGTGCG 10740
CTCTTATCAC AGAGCAGTCT CTAGACGATC 10800
10807
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 47 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché ío (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 8:
AATTCCGATC GACGCGTCGA CGATATACTC TAGACGATCG ACGCGTA 47
-59CZ 296382 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ (B) KLON: BLGAMP3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 9:
TGGATCCCCT GCCGGTGCCT CTGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: BLGAMP4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 10:
AACGCGTCAT CCTCTGTGAG CCAG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 10 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6839 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 11:
ACTACGTAGT
-60ÍJ\)JOÍ DO (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 42 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6632 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 12:
CGACGCGGAT CCTACGTACC TGCAGCCATG TTTTCCATGA GG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6627 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 13:
AGGGCTTCGG CAAGCTTCAG G (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6521 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 14:
GCCAAAGACT TACTTCCCTC TAGA
-61 CZ 296382 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6520 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 15:
GCATGAACGT CGCGTGGTGG TTGTGCTACC 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6519 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 16:
ACCACGCGAC GTTCATGCTC TAAAACCGTT 30 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6518 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 17:
GCTGCGGGAT CCTACGTACT AGGGGGACAG GGAAGG 36
-62(2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 45 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6629 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 18:
CGACGCGAAT TCTACGTACC TGCAGCCATG AAAAGGATGG TTTCT 45 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 45 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6630 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 19:
CGACGCGAAT TCTACGTACC TGCAGCCATG AAACATCTAT TATTG 45 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6625 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 20:
GTGAGATTTT CAGATCTTGT C
-63CZ 296382 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6626 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 21:
AAGAATTACT GTGGCCTACC A (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 33 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6624 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 22:
GCTGCGGAAT TCTACGTACT ATTGCTGTGG GAA 33 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 45 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6514 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 23:
CGACGCGGAT CCTACGTACC TGCAGCCATG AGTTGGTCCT TGCAC 45
-64(2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6517 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 24:
GTCTCTGGTA GCAACATACT A 21 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B)KLON: ZC6516 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 25:
GGGTTTCTAG CCCTACTAGT AG Z2 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6515 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 26:
GGGTTTCTAG CCCTACTAGT AG 22
-65CZ 296382 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 47 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(B) KLON: ZC6515 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA 27:
AAGCTACGCG TCGATCGTCT AGAGTATATC GTCGACGCGT CGATCGG
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (23)

1. Způsob produkce fibrinogenu, v y z n a č u j í c í se tím, že se:
poskytne první segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený s řetězcem Aa fibrinogenu, druhý segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený s řetězcem Ββ fibrinogenu a třetí segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený s řetězcem y fibrinogenu, kde každý segment, tj. první, druhý i třetí, je funkčně spojený s dalšími segmenty DNA, které jsou nutné pro jeho expresi v mléčné žláze hostitelské samice savce, zavedou segmenty DNA do oplodněného vejce savčích druhů kromě člověka, kde molární poměr segmentů DNA, prvního, druhého, a třetího, je v rozmezí 0,5 až 1 : 0,5, až 1 : 0,5 až 1, vloží vejce do vejcovodu savčích druhů kromě člověka, nebo dělohy samice druhu, aby se získalo potomstvo nesoucí konstrukty DNA, chovají potomci pro produkci samičího potomstva, které exprimuje první, druhý a třetí segment DNA a produkuje mléko obsahující biologicky způsobilý fibrinogen kódovaný segmenty, sbírá mléko od samičího potomstva, a získá fibrinogen z mléka.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že druh savce se vybere ze skupiny skládající se z ovcí, prasat, koz a hovězího dobytka.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že každý segment DNA, tj. první, druhý a třetí, obsahuje intron.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že každý segment DNA, tj. první, druhý a třetí, je funkčně spojen s transkripčním promotorem vybraným ze skupiny skládající se z promotorů genů kaseinu, β-laktoglobulinu, α-laktalbuminu a kyselého proteinu syrovátky.
5. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že exprese každého segmentu DNA, tj. prvního, druhého a třetího, se řídí promotorem B-laktoglobulinu.
6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zaváděcí krok zahrnuje injekci prvního, druhého a třetího segmentu DNA do pronuklea oplodněného vejce.
7. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že fibrinogen je lidský fibrinogen.
8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že druhý segment DNA obsahuje sekvenci nukleotidů, jak je uvedena v sekvenci identifikačního čísla 3 od nukleotidu 470 do nukleotidu 8100.
9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že druhý segment DNA obsahuje sekvenci nukleotidů, jak je uvedena v sekvenci identifikačního čísla 3 od nukleotidu 512 do nukleotidu 8100.
10. Způsob produkce fíbrinogenu podle nároku 1,vyznačující se tím, že se:
včlení první segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený s řetězcem Aafíbrinogenu do β-laktoglobulinového genu za vzniku první genové fúze, včlení druhý segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený s řetězcem Ββ fíbrinogenu do β-laktoglobulinového genu za vzniku druhé genové fůze, včlení tření segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený s řetězcem γ fíbrinogenu do β-laktoglobulinového genu za vzniku třetí genové fuze, zavede první, druhá a třetí genová fúze do zárodečné linie savce kromě člověka, kde molámí poměr segmentů DNA, prvního, druhého a třetího, je v rozmezí 0,5 až 1 : 0,5 až 1 : 0,5 až 1 tak, že segmenty DNA jsou exprimovány v mléčné žláze savce nebo jeho samičího potomstva a biologicky způsobilý fibrinogen je sekretován do mléka savce nebo jeho samičího potomstva, získávání mléka od savce nebo jeho samičího potomstva a získávání fíbrinogenu zmléka.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že savec je ovce, prase, koza nebo hovězí dobytek.
12. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že každá genová fuze, tj. první, druhá a třetí, obsahuje intron.
13. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že zaváděcí krok zahrnuje injekci první, druhé a třetí genové fúze do pronuklea oplodněného vejce a vložení vejce do vejcovodu falešně březí samice, aby se produkovalo samičí potomstvo nesoucí v zárodečné linii genové fuze.
14. Způsob produkce savčího embrya, kromě člověka, obsahujícího v jádře heterologní segmenty DNA kódující řetězce Αα, Ββ a γ fíbrinogenu, vyznačující se tím, že se:
poskytne první segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený s řetězcem Αα fíbrinogenu, druhý segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený s řetězcem Ββ fíbrinogenu a třetí segment DNA kódující sekreční signál funkčně spojený s řetězcem γ fíbrinogenu, kde každý segment, tj. první, druhý a třetí, je funkčně spojen s dalšími segmenty DNA nutnými pro jeho expresi v mléčné žláze hostitelské samice savce a sekreci do mléka hostitelské samice savce, kde molámí poměr segmentů DNA, prvního, druhého a třetího, je v rozmezí až 1 : 0,5 až 1 : 0,5 až 1, zavedou segmenty DNA do oplodněného vejce savčích druhů kromě člověka,
-67CZ 296382 B6 vloží vejce do vejcovodu nebo dělohy samice druhu kromě člověka, aby se získalo potomstvo nesoucí první, druhý a třetí segmenty DNA.
15. Způsob přípravy podle nároku 14, vyznačující se tím, že potomek je samice.
16. Způsob přípravy podle nároku 14, vyznačující se tím, že potomek je samec.
17. Savec kromě člověka, který je vytvořen způsobem podle nároku 14.
18. Savec kromě člověka podle nároku 17, který je samice.
19. Samice kromě člověka podle nároku 18, která produkuje mléko obsahující biologicky způsobilý fibrinogen kódovaný segmenty DNA.
20. Savec kromě člověka podle nároku 17, který je samec.
21. Savec kromě člověka, který nese ve své zárodečné linii segmenty DNA kódující řetězce Aa, Ββ a γ fibrinogenu, kdy samičí potomstvo savce exprimuje segmenty DNA v mléčné žláze za produkce biologicky způsobilého fibrinogenu.
22. Savec podle nároku 21, který je samice.
23. Savec podle nároku 21, který je samec.
CZ0257596A 1994-03-03 1995-03-01 Zpusob produkce fibrinogenu transgenními zvíraty CZ296382B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/206,176 US5639940A (en) 1994-03-03 1994-03-03 Production of fibrinogen in transgenic animals

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ257596A3 CZ257596A3 (en) 1997-06-11
CZ296382B6 true CZ296382B6 (cs) 2006-03-15

Family

ID=22765288

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0257596A CZ296382B6 (cs) 1994-03-03 1995-03-01 Zpusob produkce fibrinogenu transgenními zvíraty

Country Status (20)

Country Link
US (2) US5639940A (cs)
EP (1) EP0748386B9 (cs)
JP (1) JPH09509839A (cs)
CN (1) CN1079433C (cs)
AT (1) ATE298801T1 (cs)
AU (1) AU685250B2 (cs)
BR (1) BR9506944A (cs)
CA (1) CA2184004C (cs)
CZ (1) CZ296382B6 (cs)
DE (1) DE69534295T4 (cs)
DK (1) DK0748386T4 (cs)
ES (1) ES2245453T5 (cs)
FI (1) FI963419A0 (cs)
HU (1) HU224550B1 (cs)
NO (1) NO329072B1 (cs)
NZ (1) NZ282601A (cs)
PL (1) PL186074B1 (cs)
PT (1) PT748386E (cs)
SK (1) SK111896A3 (cs)
WO (1) WO1995023868A1 (cs)

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU709134B2 (en) * 1994-05-02 1999-08-19 E.R. Squibb & Sons, Inc. Recombinant fibrin chains, fibrin and fibrin-homologs
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
GB9715064D0 (en) * 1997-07-17 1997-09-24 Ppl Therapeutics Scotland Ltd Protein expression
AU3066699A (en) 1998-03-03 1999-09-20 Johns Hopkins University, The Smallpox inhibitor of complement enzymes (spice) protein and methods of inhibiting complement activation
ATE385805T1 (de) * 1998-05-27 2008-03-15 Hadasit Med Res Service Neue peptide
US7122620B1 (en) 1998-05-27 2006-10-17 Medical Research Services And Development Ltd. Haptotactic peptides
DE69931645T2 (de) * 1998-09-24 2007-05-16 Pharming Intellectual Property Bv Reinigung von fibrinogen aus flüssigkeiten mittels ausfällung und hydrophobischer-interaktion-chromatographie
EP1130961B1 (en) 1998-11-19 2009-04-08 Pharming Intellectual Property BV Stabilisation of milk from transgenic animals
GB9825374D0 (en) * 1998-11-19 1999-01-13 Ppl Therapeutics Scotland Ltd Method
US7208576B2 (en) * 1999-01-06 2007-04-24 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Non-glycosylated human alpha-fetoprotein, methods of production, and uses thereof
DE60037397T2 (de) 1999-01-06 2008-06-05 Merrimack Pharmaceuticals, Inc., Cambridge Expression von ausgeschiedenem, menschlichem alpha-fetoprotein in transgenen tieren
US6183803B1 (en) 1999-06-11 2001-02-06 Biosante Pharmaceuticals, Inc. Method for processing milk
WO2001026455A1 (en) * 1999-10-14 2001-04-19 Genzyme Transgenics Corporation Methods of producing a target molecule in a transgenic animal and purification of the target molecule
EP1287013A2 (en) * 1999-12-27 2003-03-05 Curagen Corporation Nucleic acids containing single nucleotide polymorphisms and methods of use thereof
IL152697A0 (en) * 2000-05-13 2003-06-24 Bioacta Ltd Anti-angiogenic polypeptides
WO2002018440A1 (en) * 2000-09-01 2002-03-07 Bioacta Limited Anti-angiogenic peptides
US7312325B2 (en) 2000-09-26 2007-12-25 Duke University RNA aptamers and methods for identifying the same
ATE503012T1 (de) * 2000-11-17 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Expression von xenogenen (humanen) immunglobulinen in klonierten, transgenen huftieren
US20020073441A1 (en) 2000-12-13 2002-06-13 Ross Brian D. Compositions and methods for detecting proteolytic activity
CA2481411C (en) 2002-04-19 2016-06-14 Diversa Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7226771B2 (en) 2002-04-19 2007-06-05 Diversa Corporation Phospholipases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DE10261126A1 (de) * 2002-08-13 2004-03-04 Aventis Behring Gmbh Lagerungsstabile, flüssige Fibrinogen-Formulierung
IL152609A0 (en) * 2002-11-03 2003-06-24 Hapto Biotech Inc Liposomal compositions comprising haptotactic peptides and uses thereof
AU2003290689A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Transgenic ungulates having reduced prion protein activity and uses thereof
JP4196948B2 (ja) * 2002-12-24 2008-12-17 日東紡績株式会社 肝臓疾患診断用マーカー蛋白質およびそれを利用した肝臓疾患診断方法
EP3508578A1 (en) 2003-03-06 2019-07-10 BASF Enzymes, LLC Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DK2853593T3 (en) 2003-03-07 2018-01-08 Dsm Ip Assets Bv Hydrolases, nucleic acids encoding them, and processes for their preparation and use
WO2004090099A2 (en) 2003-04-04 2004-10-21 Diversa Corporation Pectate lyases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US7514593B2 (en) * 2003-05-30 2009-04-07 The University Of North Carolina At Chapel Hill Animal model for chronic obstructive pulmonary disease and cystic fibrosis
US7960148B2 (en) 2003-07-02 2011-06-14 Verenium Corporation Glucanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2535526C (en) 2003-08-11 2015-09-29 Diversa Corporation Laccases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CN1871252A (zh) * 2003-09-05 2006-11-29 Gtc生物治疗学公司 在转基因哺乳动物奶中生产融合蛋白的方法
US20050186608A1 (en) * 2004-02-19 2005-08-25 Olsen Byron V. Method for the production of transgenic proteins useful in the treatment of obesity and diabetes
DE102004009400A1 (de) 2004-02-24 2005-09-08 Zlb Behring Gmbh Fibrinogen Reinigung
US7420099B2 (en) 2004-04-22 2008-09-02 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Transgenic animals and uses thereof
CN103173282A (zh) 2004-06-16 2013-06-26 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 对叶绿素进行酶促脱色的组合物和方法
US20090038023A1 (en) 2005-03-10 2009-02-05 Verenium Corporation Lyase Enzymes, Nucleic Acids Encoding Them and Methods For Making and Using Them
EP2333561A3 (en) * 2005-03-10 2014-06-11 Gen-Probe Incorporated System for performing multi-formatted assays
JP5343212B2 (ja) 2005-03-15 2013-11-13 ヴェレニウム コーポレイション セルラーゼ、それらをコードする核酸、並びにそれらを作製及び使用する方法
WO2007092314A2 (en) 2006-02-02 2007-08-16 Verenium Corporation Esterases and related nucleic acids and methods
MY160710A (en) 2006-02-10 2017-03-15 Verenium Corp Cellulolytic enzymes, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2638801C (en) 2006-02-14 2016-12-13 Verenium Corporation Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
CA2644926A1 (en) 2006-03-06 2007-09-13 Humagene, Inc. A method for the preparation of recombinant human thrombin and fibrinogen
KR101622894B1 (ko) 2006-03-07 2016-05-19 바스프 엔자임스 엘엘씨 알돌라제, 이것을 코딩하는 핵산과 그 제조 방법 및 사용 방법
CN101437954B (zh) 2006-03-07 2015-09-09 嘉吉公司 醛缩酶和编码醛缩酶的核酸以及它们的制备和使用方法
US8124831B2 (en) * 2006-07-06 2012-02-28 Duke University Transgenic mice carrying functional single nucleotide polymorphisms in brain-specific tryptophan hydroxylase
CN101528766A (zh) 2006-08-04 2009-09-09 维莱尼姆公司 葡聚糖酶、编码它们的核酸及制备和使用它们的方法
MX2009003034A (es) 2006-09-21 2009-11-18 Verenium Corp Fosfolipasas, acidos nucleicos que las codifican, y metodos de hacerlas y usarlas.
EP2617818B1 (en) 2006-09-21 2016-03-23 BASF Enzymes LLC Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
DK2479266T3 (en) 2006-12-21 2016-06-20 Basf Enzymes Llc Amylases and glucoamylases, nucleic acids encoding them, and methods of making and using the same
ES2714007T3 (es) 2007-04-09 2019-05-24 Univ Florida Composiciones de vectores rAAV que tienen proteínas de la cápside modificadas en tirosina y métodos para su uso
NZ601191A (en) 2007-10-03 2014-01-31 Verenium Corp Xylanases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US20110038924A1 (en) * 2007-10-29 2011-02-17 Goomer Randal S Osteoarthritis gene therapy
DK2238261T3 (da) 2008-01-03 2014-02-10 Verenium Corp Isomeraser, nukleinsyrer der koder for dem og fremgangsmåder til fremstilling og anvendelse deraf
CN104651381A (zh) 2008-01-03 2015-05-27 巴斯夫酶有限责任公司 转移酶和氧化还原酶、编码它们的核酸以及其制备和应用方法
EP2285400B1 (en) 2008-05-02 2015-10-28 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Treatment of bleeding with low half-life fibrinogen
EP2310411B2 (en) * 2008-07-09 2019-03-20 ProFibrix BV Recombinant fibrinogen
US8153391B2 (en) 2008-08-29 2012-04-10 Bunge Oils, Inc. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US8198062B2 (en) 2008-08-29 2012-06-12 Dsm Ip Assets B.V. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US8357503B2 (en) 2008-08-29 2013-01-22 Bunge Oils, Inc. Hydrolases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
AU2009290563A1 (en) 2008-09-15 2010-03-18 Genentech, Inc. Compositions and methods for regulating cell osmolarity
WO2010135588A2 (en) 2009-05-21 2010-11-25 Verenium Corporation Phytases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them
US20100304873A1 (en) * 2009-05-28 2010-12-02 Lipa Markowitz Bowling Ball and Football Game Controller
UA111708C2 (uk) 2009-10-16 2016-06-10 Бандж Ойлз, Інк. Спосіб рафінування олії
UA109884C2 (uk) 2009-10-16 2015-10-26 Поліпептид, що має активність ферменту фосфатидилінозитол-специфічної фосфоліпази с, нуклеїнова кислота, що його кодує, та спосіб його виробництва і застосування
EP2521566B1 (en) 2010-01-08 2014-09-03 ProFibrix BV Fibrinogen preparations enriched in fibrinogen with an extended alpha chain
EP2547337A1 (en) 2010-03-17 2013-01-23 Pharming Intellectual Property B.V. Use of anticoagulants in the production of recombinant proteins in the milk of transgenic animals
EA202091105A1 (ru) 2010-04-23 2020-12-30 Юниверсити Оф Флорида Рисерч Фаундейшн, Инк. Композиции гуанилатциклазы и способы лечения врожденного амавроза лебера типа 1 (lca1)
CN105263319A (zh) 2013-02-13 2016-01-20 法国化学与生物科技实验室 具有经修饰的糖基化的蛋白及其生产方法
BR112015019341A2 (pt) 2013-02-13 2017-08-22 Lab Francais Du Fractionnement Anticorpo anti-tnf-alfa, composição que compreende o anticorpo, método para produzir uma população de anticorpos, células epiteliais da glândula mamária, mamífero não humano transgênico, e, composição de anticorpo anti-tnf monoclonal
EP3086636A4 (en) * 2013-12-24 2017-10-25 LFB USA, Inc. Transgenic production of heparin
CN103995077B (zh) * 2014-05-21 2016-01-27 中国计量科学研究院 一种测定奶粉中β-乳球蛋白含量的方法
FR3032621A1 (fr) 2015-02-13 2016-08-19 Lab Francais Du Fractionnement Colle biologique et son utilisation comme medicament
BR112017020008A8 (pt) * 2015-03-20 2023-05-02 Hopitaux Paris Assist Publique Peptídeos isolados e seus fragmentos a partir do fibrinogênio para uso como fármacos, particularmente em doenças inflamatórias da pele
KR101841587B1 (ko) 2016-01-12 2018-05-14 주식회사 녹십자홀딩스 피브리노겐의 정제방법
AU2017292711A1 (en) 2016-07-06 2019-02-07 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Stable liquid fibrinogen
CA3066167C (en) * 2018-04-24 2021-05-04 Fibriant B.V. Therapeutic uses of fibrinogen gamma prime variants
JP2023500896A (ja) 2019-11-05 2023-01-11 ヴァーシティ ブラッド リサーチ インスティテュート ファウンデーション， インコーポレイテッド 胎児／新生児同種抗体血小板減少症のマウスモデル
US11266129B2 (en) 2019-11-05 2022-03-08 Versiti Blood Research Institute Foundation, Inc. Murine model of fetal/neonatal alloimmune thrombocytopenia

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT359653B (de) 1979-02-15 1980-11-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung eines gewebekleb- stoffes
AT359652B (de) 1979-02-15 1980-11-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung eines gewebekleb- stoffes
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4442655A (en) 1981-06-25 1984-04-17 Serapharm Michael Stroetmann Fibrinogen-containing dry preparation, manufacture and use thereof
US4462567A (en) 1982-10-28 1984-07-31 Helmut Habicht Discharge valve for granular materials
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US4627879A (en) 1984-09-07 1986-12-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fibrin adhesive prepared as a concentrate from single donor fresh frozen plasma
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5366894A (en) 1986-06-30 1994-11-22 Pharmaceutical Proteins Limited Peptide production
GB8615942D0 (en) * 1986-06-30 1986-08-06 Animal & Food Research Council Peptide production
EP0832981A1 (en) * 1987-02-17 1998-04-01 Pharming B.V. DNA sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
US4873316A (en) * 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
CA1340740C (en) 1987-12-08 1999-09-14 Eileen R. Mulvihill Co-expression in eukaryotic cells
AT397203B (de) 1988-05-31 1994-02-25 Immuno Ag Gewebeklebstoff
US5087353A (en) 1988-11-03 1992-02-11 Ecological Engineering Associates Solar aquatic apparatus for treating waste
GB8826446D0 (en) * 1988-11-11 1988-12-14 Agricultural & Food Res Peptide production
US5204447A (en) 1988-11-14 1993-04-20 Zymogenetics, Inc. Purification of factor xiii
DE3928628C1 (cs) 1989-08-30 1990-10-11 Kurt 5060 Bergisch Gladbach De Munny
EP0502976B1 (en) * 1989-12-01 1996-07-03 Pharming B.V. Production of recombinant polypeptides by bovine species and transgenic methods
GB9028062D0 (en) * 1990-12-24 1991-02-13 Agricultural & Food Res Production of transgenic animals
CA2099562C (en) * 1991-01-11 2010-04-20 William N. Drohan Expression of active human protein c in mammary tissue of transgenic animals
US5272074A (en) 1992-04-23 1993-12-21 Mcmaster University Fibrin coated polymer surfaces

Also Published As

Publication number Publication date
SK111896A3 (en) 1997-07-09
ES2245453T3 (es) 2006-01-01
EP0748386B1 (en) 2005-06-29
PL186074B1 (pl) 2003-10-31
HU224550B1 (hu) 2005-10-28
HU9602404D0 (en) 1996-10-28
NO329072B1 (no) 2010-08-16
DE69534295T2 (de) 2006-04-27
PT748386E (pt) 2005-11-30
PL316115A1 (en) 1996-12-23
CN1144539A (zh) 1997-03-05
EP0748386B9 (en) 2010-08-04
FI963419A (fi) 1996-09-02
DK0748386T4 (da) 2010-02-15
AU1977095A (en) 1995-09-18
FI963419A0 (fi) 1996-09-02
CA2184004A1 (en) 1995-09-08
NZ282601A (en) 1997-06-24
ES2245453T5 (es) 2010-04-28
CN1079433C (zh) 2002-02-20
NO963651D0 (no) 1996-09-02
DE69534295T4 (de) 2011-03-03
WO1995023868A1 (en) 1995-09-08
CA2184004C (en) 2000-08-01
USRE42704E1 (en) 2011-09-13
JPH09509839A (ja) 1997-10-07
HUT75552A (en) 1997-05-28
ATE298801T1 (de) 2005-07-15
EP0748386A1 (en) 1996-12-18
DK0748386T3 (da) 2005-10-24
DE69534295T3 (de) 2010-07-01
NO963651L (no) 1996-11-01
CZ257596A3 (en) 1997-06-11
US5639940A (en) 1997-06-17
BR9506944A (pt) 1997-09-09
AU685250B2 (en) 1998-01-15
DE69534295D1 (de) 2005-08-04
EP0748386B2 (en) 2009-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU685250B2 (en) Production of fibrinogen in transgenic animals
US6222094B1 (en) Transgenic non-human mammal expressing the DNA sequence encoding kappa casein mammary gland and milk
CA2398707C (en) C1 inhibitor produced in the milk of transgenic mammals
US5648243A (en) Human serum albumin expression construct
EP0599978A1 (en) Gene encoding a human beta-casein process for obtaining the protein and use thereof in an infant formula
JP4068516B2 (ja) トランスジェニック哺乳動物およびクローン哺乳動物
US6545198B1 (en) Transgenically produced prolactin
WO1997020043A1 (en) Protein c production in transgenic animals
KR20030060772A (ko) 형질전환법으로 생성된 데코린
AU4401199A (en) Human bile salt-stimulated lipase (bssl) obtainable from transgenic sheep
CA2309891A1 (en) Production of fibrinogen in transgenic animals
AU784724B2 (en) C1 inhibitor produced in the milk of transgenic mammals
AU2006203549B2 (en) C1 inhibitor produced in the milk of transgenic mammals
WO1998058051A1 (en) Transgenically produced prolactin
EP0874898A1 (en) Protein c production in transgenic animals

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20070301