CN118147052A - 分离、培养鸡原始生殖干细胞并构建基因修饰鸡的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离、培养鸡原始生殖干细胞并构建基因修饰鸡的方法。在优化培养体系下,体外短期培养可获得百万级别细胞并稳定建系,且能够在体外培养200天以上并维持迁移能力。体外建系的PGCs基因修饰后,通过血管注射方法可以获得基因修饰鸡;同时,注射到鸡胚血管的PGCs在孵化第七天分选出来,在体外再培养后再注射到鸡胚血管中,可以提高构建基因修饰鸡的效率。本发明还涉及到PGCs冷冻,复苏存活率达到80%以上,可以对分离获得或是基因修饰后的PGCs进行长期保存。本发明具有分离、培养效率高的优点,同时两次血管注射的方法可以提高构建基因修饰鸡的效率,本发明在鸡PGCs体外分离、培养、建系、冷冻保种及构建基因修饰鸡等方面具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术与农业动物遗传育种与繁殖领域,具体涉及一种分离、培养鸡原始生殖干细胞并构建基因修饰鸡的方法。
背景技术
鸡是一种非常重要的经济动物,不仅可以满足人类对禽肉的需求,还能为人类提供丰富的蛋类。随着全球人口的增加,人类对禽类产品的需求也不断的增加。然而,环境的改变和禽类疾病的肆虐,已严重影响家禽产业的发展。因此,改善家禽的生产性状,提高其抵抗疾病的能力显得非常重要。
在哺乳动物基因编辑操作过程中最常见,最有力的方法是原核注射和体细胞克隆,可直接获取基因编辑动物。然而,禽类由于其生殖特点的特殊性,借助传统的基因编辑方法很难对其进行基因编辑并传递到下一代。与哺乳动物卵母细胞相比,禽类卵母细胞胞质大,与卵黄相连,导致细胞化不完全,进行原核注射操作十分困难。此外,禽类蛋卵黄含量高,透明度差,卵母细胞的细胞核难以识别,因此,要进行体细胞克隆是不可能的。但由于禽类胚胎可体外发育的特点,在其体外发育过程中容易观察和操作,便于细胞的追踪,因此,常见于各类研究中。
在先前的研究中,鸡的转基因是通过胚盘期注射携带外源基因的病毒或质粒实现的。直接注射外源质粒的方法,效率非常低,而注射携带外源基因的逆转录病毒,则效率要高很多。通过注射逆转录病毒的方法,成功的构建出很多转基因的鸡和鸟等。然而,由于病毒的包装能力有限,要进行大片段或是复杂的转基因则比较困难。除用病毒的方法进行转基因,还有其它一些传统的方法,如脂质体转染方法等,但这些效率都非常低。除此之外,刚生出来的受精蛋已经经过了一段时间的发育,已发育到4-6万个细胞,这个时期进行转基因,不仅效率低,而且生殖嵌合更难。
发明内容
基于现有技术中构建基因修饰鸡方法复杂、效率低的现状,本发明提供一种分离、培养鸡原始生殖干细胞并构建基因修饰鸡的方法。
具体地,本发明涉及到鸡原始生殖干细胞(也称之为胚胎期的生殖干细胞,Primordial Germ Cells,以下简称为PGCs)的快速、高效分离、培养建系及冷冻复苏的方法,以及进一步构建基因修饰鸡的方法。本发明的方法可以用于品系资源保种和构建基因修饰鸡。
鸡的PGCs可以从血液或性腺中分离获得,通过在体外培养可以获得较大数量的细胞。血液中由于PGCs的数量很少,建系的成功率很低,而且建系的时间很长。而从生殖腺中分离PGCs数量较多,利用本发明优化的培养基可以快速、高效的建系,同时冷冻培养基可以对PGCs进行长期保存,且复苏后能较快的获得大量的PGCs。通过这些优化的方法可以构建基因修饰鸡,同时利用PGCs二次注射的方法可以提高体外长期培养的PGCs的生殖嵌合能力,进一步提高构建基因修饰鸡的效率。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
本发明首先提供一种用于鸡原始生殖干细胞培养的PGCs培养基,其组成成份为:基础培养基为KO-DMEM,2%(v/v)鸡血清,20%(v/v)胎牛血清,100×丙酮酸钠(即丙酮酸钠按100倍稀释配制培养基,下同),100×GlutaMax,100×NEAA,1×GS nucleosidesupplement,0.1mMβ-巯基乙醇,4ng/ml FGF2,6ng/ml SCF。
本发明还进一步提供一种快速、高效分离、培养建系鸡PGCs的方法,包括以下步骤:
(1)鸡胚的准备:将受精种蛋在孵化箱内进行孵化,孵化至5-10天时取用;
(2)PGCs的分离:从孵化箱中取出孵化5-10天鸡胚,分离出性腺,用事先准备的预热的PBS清洗三次,以每个鸡胚的一对性腺为一组,转移至装有50μL0.05%的胰酶的1.5ml离心管中,37℃水浴消化8分钟,加入1ml的PGCs培养基终止消化,并轻轻吹打至性腺组织块成为细胞悬液;
(3)PGCs的纯化:将细胞悬液利用差速贴壁法纯化PGCs;
(4)PGCs的原代培养:用PGCs培养基培养,每天更换培养基,每3-4天传代一次,更换Feeder饲养层;
(5)PGCs传代培养和建系:将步骤(4)培养所得的原始生殖干细胞在培养至第8天时,以1:3的比例传代至含有新的Feeder饲养层的12孔板培养基中,每天更换培养基,获得建系后PGCs。
在本发明的一个实施方式中,步骤(3)中,将细胞悬液利用差速贴壁法纯化PGCs的方法为:将细胞悬液转移至12孔板中,置于37℃,5%CO2的培养箱中培养3h,收集未贴壁细胞转移至铺有Feeder饲养层的12孔板中继续培养,每个鸡胚的一对性腺为一组单独培养。
在本发明的一个实施方式中,步骤(4)中,所述的Feeder饲养层为用10μg/ml的丝裂霉素C处理鼠胚胎成纤维细胞2h制备而成,在PGCs培养过程中每3-4天更换一次Feeder饲养层;
本发明还进一步提供建系后PGCs冷冻与复苏的方法,包括以下具体步骤:
(1)PGCs冷冻:培养的PGCs用0.05%的胰酶消化,再用PGCs培养基终止反应,转入15ml离心管中200g离心4分钟,吸去上清,用PGCs冷冻液重悬,得到细胞重悬液,每个冻存管加入500μl的细胞重悬液,每个冻存管冻存的细胞数量约为10-20万个。再将冻存管放入冻存盒中,置于-80℃冰箱中过夜,第二天转移至液氮中,可长期保存;
(2)PGCs复苏:从液氮中取出冻存管,于37℃水浴锅中迅速解冻,之后在生物安全柜中将解冻的细胞转移至15ml离心管中,加入PGCs培养基,离心,再用PGCs培养基重悬,转至事先铺好Feeder的12孔中培养。
在本发明的一个实施方式中,步骤(1)中所述PGCs包括鸡胚性腺分离获得的PGCs且在体外培养半个月以上,或是体外培养的不同时间段的PGCs,或是经过基因修饰体外扩增起来的PGCs。
在本发明的一个实施方式中,步骤(1)中所述PGCs冷冻液为:10%(v/v)DMSO,10%(v/v)FBS,80%(v/v)PGCs培养基。
本发明还进一步提供一种构建基因修饰PGCs细胞系的方法,包括以下具体步骤:
从鸡胚性腺中分离PGCs并在体外培养扩增,之后对PGCs中基因进行基因修饰,所述基因修饰包括转基因、基因敲除和基因敲入等,得到基因修饰PGCs细胞系,基因修饰的PGCs在体外培养,培养条件与PGCs的培养条件相同。
针对本发明提供的构建基因修饰PGCs细胞系的方法,下面以构建tdTomato转基因PGCs细胞系为例,具体说明其操作步骤:
(1)从鸡胚性腺中分离PGCs并在体外培养扩增,待PGCs数量约为10-20万个时用Lonza电转仪进行电转,电转质粒为PB-CAG-tdTomato和PB转座酶,电转后继续在体外培养,培养条件与PGCs的培养条件相同;
(2)流式分选:将步骤(1)中电转后的PGCs在体外培养8-12天后进行流式分选,获得tdTomato阳性的PGCs,然后继续在体外进行培养扩增;
(3)将扩增起来的tdTomato阳性PGCs进行冷冻。
本发明还进一步提供一种构建基因修饰鸡的方法,包括以下具体步骤:
(1)将基因修饰PGCs细胞系通过外周血管注射的方法注射到发育50-52h的鸡胚中并继续孵化,注射细胞量为每个胚胎注射2000-3000个;
(2)嵌合体鸡胚的鉴定:将步骤(1)的鸡胚继续孵化,在孵化的第7,10,15天通过荧光或是PCR鉴定判断其是否为嵌合体,具体方法为:将步骤(1)的鸡胚继续孵化,在孵化的第7,10,15天时取出部分鸡胚,分离性腺观察荧光;或是分离性腺PGCs消化提取基因组,根据基因修饰PGCs细胞系中的基因设计引物,通过特定引物进行PCR鉴别判断其是否为嵌合体,是嵌合体说明基因修饰的PGCs能够嵌到生殖系中,不是嵌合体说明基因修饰的PGCs不能生殖嵌合;
(3)孵化的嵌合公鸡发育至成年后,采精提取基因组,使用构建基因修饰PGCs细胞系时的特定引物进行PCR鉴定或观察荧光,确定体外培养并进行基因修饰的PGCs可以正常发育为精子,若能检测到基因修饰的精子说明基因修饰鸡构建成功,反之则基因修饰鸡构建失败。
下面以构建tdTomato转基因鸡为例进行具体的操作说明,其它基因修饰鸡包括转基因、基因敲除和基因敲入等的构建与该方法相类似,包括以下具体步骤:
(1)将转tdTomato基因修饰的PGCs细胞系通过外周血管注射的方法注射到发育50-52h的鸡胚中并继续孵化,注射细胞量为每个胚胎注射2000-3000个;
(2)嵌合体鸡胚的鉴定:将步骤(1)的鸡胚继续孵化,在孵化的第7,10,15天通过荧光判断其是否为嵌合体,具体方法为:将步骤(1)的鸡胚继续孵化,在孵化的第7,10,15天时取出部分鸡胚,分离性腺观察荧光,若有红色荧光则为嵌合体鸡胚,是嵌合体说明基因修饰的PGCs能够嵌到生殖系中,不是嵌合体说明基因修饰的PGCs不能生殖嵌合;
(3)孵化的嵌合公鸡发育至成年后,采精观察荧光,确定体外培养转tdTomato的PGCs可以正常发育为精子,若能检测到发红色荧光的精子说明基因修饰鸡构建成功,反之则基因修饰鸡构建失败。
本发明还进一步提供一种基于PGCs二次血管注射的方法构建基因修饰鸡的方法,可提高构建基因修饰鸡的效率,将得到的基因修饰PGCs细胞通过外周血管注射的方法注射到发育50-52h的鸡胚中并继续孵化,注射细胞量为每个胚胎注射2000-3000个,注射完后在体外继续孵化到第七天,分离鸡胚性腺,获得PGCs,筛选出基因修饰的PGCs在体外继续培养扩增,扩增到一定数量后第二次将基因修饰的PGCs通过外周血管注射的方法注射到发育50-52h的鸡胚中并继续孵化,最终获得基因修饰鸡。
以下以通过二次血管注射的方法构建tdTomato转基因鸡为例说明其具体操作方法,包含以下步骤:
(1)将tdTomato阳性PGCs通过外周血管注射的方法注射到发育50-52h的鸡胚中并继续孵化,注射细胞量为每个胚胎注射2000-3000个,注射完后继续孵化至第七天,分离鸡胚性腺,获得PGCs;
(2)流式分选:将步骤(1)分离获得在PGCs在体外培养4-8天后进行流式分选,分选出tdTomato阳性的PGCs,在体外继续培养;
(3)PGCs二次血管注射:分选获得的tdTomato阳性PGCs在体外培养到一定数量后将其通过外周血管注射的方法注射到发育50-52h的鸡胚中并继续孵化,并获得转tdTomato基因的转基因鸡。PGCs二次血管注射的方法可以提高生殖嵌合能力,提高获得基因修饰鸡的效率。
针对现有鸡PGCs分离、建系、冷冻保存、体外培养、构建基因修饰鸡及生殖嵌合效率等方面的问题,本发明建立了一种鸡胚性腺PGCs快速、高效分离、稳定建系的方法,可从孵化5-10天鸡胚的性腺中分离、纯化PGCs,利用优化的培养基及细胞冷冻体系,可实现快速扩增建系和细胞冷冻长期保存。同时可以应用在构建基因修饰鸡中,并通过二次鸡胚血管注射的方法提高生殖嵌合能力,提高构建基因修饰鸡的效率。试验表明,本发明的方法成功率高、时间短、稳定高效,建系的PGCs表达生殖干细胞特异性标记,并保持良好的性腺迁移能力,同时能够构建基因修饰鸡,并且二次鸡胚血管注射的方法可以提高构建基因修饰鸡的效率。
本发明克服了现有技术中的缺点,通过优化的培养体系,提供一种快速、时间短、稳定高效的从孵化5-10天鸡胚性腺中快速分离与建系的方法,以及PGCs冷冻液氮长期保存的方法。并将这些方法应用到品系资源保存和构建基因修饰鸡中,同时通过二次血管注射PGCs的方法提高体外长期培养PGCs的生殖嵌合能力,优化构建基因修饰鸡的效率。
对鸡原始生殖干细胞进行基因组改造效率更高,是构建基因修饰鸡的一种可靠方法。
具体而言,本发明的突出优势在于:
(1)本发明中的PGCs来源于孵化5-10天鸡胚性腺中,时间跨度长,可操作性灵活,操作简单,重复性好;
(2)本发明具有速度快、分离效率高、建系时间短的特点,且在体外培养半个月可扩增获得百万级别的细胞;
(3)本发明优化的培养体系可以稳定、高效的建立PGCs细胞系,建系成功率达到80%以上,且在体外培养200多天的PGCs仍保持原始生殖干细胞的特性,具有良好的性腺迁移能力;
(4)本发明中优化的细胞冷冻配方具有配制简单、效率高、适用性广等优点,复苏后细胞存活率达到80%以上;
(5)本发明通过此方法构建了转tdTomato的PGCs细胞系及通过鸡胚血管注射构建tdTomato转基因鸡,且在孵化的第7、10、15天能够观察到生殖嵌合以及嵌合体转基因鸡,后续将构建更多的基因修饰鸡;
(6)本发明通过二次鸡胚血管注射的方法,提高生殖嵌合能力,使得体外长期培养或是经过基因编辑长时间筛选的PGCs更具有生殖嵌合能力,提高构建基因修饰鸡的效率。
附图说明
图1是本发明从E7-E10天鸡胚中分离纯化后的原始生殖干细胞;
图2是本发明分离纯化后在体外培养16天的原始生殖干细胞;
图3是本发明建立的转tdTomato基因的原始生殖干细胞;
图4是本发明建立的tdTomato转基因原始生殖干细胞系通过血管注射后迁移到E7天鸡胚性腺中定居;
图5是本发明建立的tdTomato转基因原始生殖干细胞系通过血管注射后迁移到E7天鸡胚性腺中定居后再分离纯化tdTomato阳性PGCs建系;
图6是本发明分离纯化获得的tdTomato转基因原始生殖干细胞系通过二次血管注射后迁移到E7天鸡胚性腺中定居。
图7是原始生殖干细胞SSEA1染色鉴定。
具体实施方式
以下实施例中所用种蛋来源于京白蛋鸡。
实施例1
提供一种快速、高效分离、培养建系鸡PGCs的方法,包括以下步骤:
(1)种蛋孵化
刚产下的京白蛋鸡种蛋运回实验室,用75%的酒精擦拭表面,晾干后将种蛋放入孵化箱,以38℃,60%湿度条件进行孵化,到第5-10天时取用。
(2)PGCs的分离
将孵化5-10天的种蛋取出到无菌操作室,用75%的酒精擦拭种蛋表面,用无菌弯镊在蛋的大端开口,取出5-10天胚龄鸡胚,置于加了PBS的100mm的细胞培养皿中,清洗三遍,转入新的100mm培养皿盖子上。在体视显微镜下解剖鸡胚,用精细尖镊去掉尾部,撕开腹部,去掉内脏,并可看到性腺,再用两把尖镊轻轻将性腺刮离,转移到事先准备的预热50μL的PBS液滴中清洗,重复清洗三次后,以1对性腺为一组,转移到装有50μL 0.05%的胰酶1.5mL的离心管中,37℃水浴消化8分钟,之后在生物安全柜中打开盖子,加入1mL预热的PGCs培养基终止消化,并用1mL枪头轻轻吹打至性腺组织块成为细胞悬液。
(3)PGCs的纯化
将细胞悬液转移至12孔板中,置于37℃,5%CO2的培养箱中培养3h,收集未贴壁细胞(图1)转移至铺有Feeder的12孔板中继续培养。每个鸡胚的一对性腺为一组单独培养。
(4)PGCs的原代培养
用PGCs培养基(KO-DMEM,2%鸡血清,20%胎牛血清,100×丙酮酸钠,100×GlutaMax,100×NEAA,1×GS nucleoside supplement,0.1mMβ-巯基乙醇,4ng/ml FGF2,6ng/ml SCF)培养,每天更换培养基,每3-4天传代一次,更换Feeder饲养层;
(5)PGCs传代培养和建系
将以上培养的PGCs在培养至第8天时,以1:3的比例传代至含有新饲养层的12孔板培养基中,每天更换培养基。当细胞在体外能够稳定传代培养半个月后即建系成功(图2)。
实施例2
本实施例进一步提供实施例1中建系后PGCs冷冻与复苏的方法,包括以下具体步骤:
(1)PGCs冷冻:培养的PGCs用0.05%的胰酶消化,再用PGCs培养基终止反应,转入15ml离心管中200g离心4分钟,吸去上清,用PGCs冷冻液(10%DMSO,10%FBS,80%PGCs培养基)重悬,每个冻存管加入500μl的细胞重悬液,每个冻存管冷冻的细胞数约为10-20万个,再将冻存管放入冻存盒中,置于-80℃冰箱中过夜,第二天转移至液氮中,可长期保存;
(2)PGCs复苏:从液氮中取出冻存管,于37℃水浴锅中迅速解冻,之后在生物安全柜中将解冻的细胞转移至15ml离心管中,加入PGCs培养基,离心,再用PGCs培养基重悬,转至事先铺好Feeder的12孔中培养。
其中,本实施例提供的冷冻与复苏的方法中,步骤(1)中所述PGCs还包括鸡胚性腺分离获得的PGCs且在体外培养半个月以上,或是体外培养的不同时间段的PGCs,或是经过基因修饰体外扩增起来的PGCs。
实施例3
本实施例提供一种构建tdTomato转基因PGCs细胞系的方法,包括以下具体步骤:
(1)从孵化七天的鸡胚性腺中分离PGCs并在体外培养扩增,待PGCs数量约10-20万个时进行电转,电转质粒为PB-CAG-tdTomato和PB转座酶,电转质粒的量分别为6μg和3μg,电转后继续在体外培养;
(2)流式分选:将步骤(1)中电转后的PGCs在体外培养8-12天后进行流式分选,获得tdTomato阳性的PGCs,然后继续在体外进行培养扩增(图3);
(3)将扩增起来的tdTomato阳性PGCs进行冷冻或是断续开展下一步实验。
实施例4
本实施例提供一种构建基因修饰鸡的方法,包括以下具体步骤:
体外培养扩增起来的PGCs通过外周血管注射的方法注射到发育50-52h的鸡胚中并继续孵化,注射细胞量为每个胚胎注射2000-3000个;然后在孵化的第7,10,15天通过荧光(图4)判断其是否为嵌合体,这里指的是基因修饰带有荧光的情况,通过荧光来判断,如观察红光,绿光等;如果不带荧光,则通过基因修饰的基因设计特异性引物,用PCR方法进行鉴定;待孵化的公鸡发育至成年后,采精提取基因组,使用特异性引物进行PCR鉴定或观察荧光,确定体外培养并进行基因修饰的PGCs可以正常发育为精子。
PGCs二次血管注射:
将鸡PGCs通过外周血管注射的方法注射到发育50-52h的鸡胚中并继续孵化,注射细胞量为每个胚胎注射2000-3000个。孵化到第七天,分离鸡胚性腺,获得PGCs,筛选出阳性PGCs(图5)在体外继续培养扩增,扩增到一定数量后再将阳性PGCs通过外周血管注射的方法注射到发育50-52h的鸡胚中并继续孵化(图6)。通过二次注射的方法可以提高阳性PGCs的生殖嵌合能力。
PGCs免疫荧光染色鉴定
将体外培养的PGCs抹涂在载玻片上,晾干再用4%多聚甲醛进行固定,之后用TritonX-100透化,BSA进行封闭,一抗染过夜,第二天用二抗进行染色,用DAPI对细胞核进行染色,观察结果,可见分离得到的PGCs的细胞膜中表达SSEA1原始生殖细胞特异性标记,细胞核为DAPI染色(图7)。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于鸡原始生殖干细胞培养的PGCs培养基,其特征在于,其组成成份为:基础培养基为KO-DMEM,2%(v/v)鸡血清,20%(v/v)胎牛血清,100×丙酮酸钠,100×GlutaMax,100×NEAA,1×GS nucleoside supplement,0.1mMβ-巯基乙醇,4ng/ml FGF2,6ng/ml SCF。
2.一种分离、培养建系鸡PGCs的方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)鸡胚的准备:将受精种蛋在孵化箱内进行孵化,孵化5-10天时取用;
(2)PGCs的分离:从孵化箱中取出孵化5-10天鸡胚,分离出性腺,用预热的PBS清洗,以每个鸡胚的一对性腺为一组,并吹打至性腺组织块成为细胞悬液;
(3)PGCs的纯化:将细胞悬液利用差速贴壁法纯化PGCs;
(4)PGCs的原代培养:用权利要求1所述的用于鸡原始生殖干细胞培养的PGCs培养基培养,每天更换培养基,每3-4天传代一次,更换Feeder饲养层;
(5)PGCs传代培养和建系:将步骤(4)培养所得的原始生殖干细胞在培养至第8天时,以1:3的比例传代至含有新饲养层的12孔板培养基中,每天更换培养基,获得建系后PGCs。
3.根据权利要求2所述的一种分离、培养建系鸡PGCs的方法,其特征在于,步骤(3)中,将细胞悬液利用差速贴壁法纯化PGCs的方法为:将细胞悬液转移至12孔板中,置于37℃,5%CO2的培养箱中培养,收集未贴壁细胞转移至铺有Feeder的12孔板中继续培养,每个鸡胚的一对性腺为一组单独培养。
4.根据权利要求2所述的一种分离、培养建系鸡PGCs的方法,其特征在于,步骤(4)中,所述的Feeder饲养层为鼠胎儿成纤维细胞用10μg/ml的丝裂霉素C处理2h制备而成,在PGCs培养过程中每3-4天更换一次Feeder饲养层。
5.一种建系后PGCs冷冻与复苏的方法,其特征在于,包括以下具体步骤:
(1)PGCs冷冻:将按照权利要求2所述方法建系成功的PGCs进行冷冻,先用0.05%的胰酶消化,再用PGCs培养基终止反应,转入15ml离心管中200g离心4分钟,吸去上清,用PGCs冷冻液重悬细胞,每个冻存管加入500μl的细胞重悬液,将冻存管放入冻存盒中,置于-80℃冰箱中过夜,第二天转移至液氮中,可长期保存;
(2)PGCs复苏:从液氮中取出冻存管,于37℃水浴锅中迅速解冻,之后在生物安全柜中将解冻的细胞转移至离心管中,加入PGCs培养基,离心,再用PGCs培养基重悬,转至事先铺好Feeder的12孔中培养。
6.根据权利要求5所述的一种建系后PGCs冷冻与复苏的方法,其特征在于,步骤(1)中所述PGCs冷冻液为:10%(v/v)DMSO,10%(v/v)FBS,80%(v/v)PGCs培养基。
7.一种构建基因修饰PGCs细胞系的方法,其特征在于,包括以下具体步骤:采用权利要求2所述的分离、培养建系鸡PGCs的方法,从鸡胚性腺中分离PGCs并在体外培养扩增,之后对PGCs中基因进行基因修饰,所述基因修饰包括转基因、基因敲除和基因敲入,得到基因修饰PGCs细胞系,培养条件与PGCs的培养条件相同。
8.一种构建基因修饰鸡的方法,其特征在于,包括以下具体步骤:
(1)将采用权利要求7所述方法得到的基因修饰PGCs细胞系通过外周血管注射的方法注射到发育50-52h的鸡胚中并继续孵化,注射细胞量为每个胚胎注射2000-3000个;
(2)嵌合体鸡胚的鉴定:将步骤(1)的鸡胚继续孵化,在孵化的第7,10,15天通过荧光或是PCR鉴定判断其是否为嵌合体,具体方法为:将步骤(1)的鸡胚继续孵化,在孵化的第7,10,15天时取出部分鸡胚,分离性腺观察荧光;或是分离性腺PGCs消化提取基因组,根据基因修饰PGCs细胞系中的基因设计引物,通过特定引物进行PCR鉴别判断其是否为嵌合体,是嵌合体说明基因修饰的PGCs能够嵌到生殖系中,不是嵌合体说明基因修饰的PGCs不能生殖嵌合;
(3)孵化的嵌合公鸡发育至成年后,采精提取基因组,使用构建基因修饰PGCs细胞系时的特定引物进行PCR鉴定或观察荧光,确定体外培养并进行基因修饰的PGCs可以正常发育为精子,若能检测到基因修饰的精子说明基因修饰鸡构建成功,反之则基因修饰鸡构建失败。
9.一种基于PGCs二次血管注射方法构建基因修饰鸡的方法,其特征在于,将采用权利要求7所述方法得到的基因修饰PGCs细胞系通过外周血管注射的方法注射到发育50-52h的鸡胚中并继续孵化,注射完后在体外继续孵化到第七天,分离鸡胚性腺,获得PGCs,筛选出基因修饰的PGCs在体外继续培养扩增,扩增到一定数量后第二次将基因修饰的PGCs通过外周血管注射的方法注射到发育50-52h的鸡胚中并继续孵化,最终获得基因修饰鸡。
10.根据权利要求9所述的一种基于PGCs二次血管注射方法构建基因修饰鸡的方法,其特征在于,注射细胞量为每个胚胎注射2000-3000个。
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