CN115176021A - 用于遗传修饰和靶向的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了用于修饰和靶向基因的组合物和方法。本文还描述了用于修饰和靶向细胞或非人类哺乳动物中的基因的组合物和方法。

Description

用于遗传修饰和靶向的组合物和方法
交叉索引
本申请请求在2020年9月23日提交的PCT国际申请号PCT/CN2020/117169的权益，其整体在此通过引用并入本申请。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
背景技术
治疗和预防病毒感染和疾病是现代医学最紧迫的挑战之一。病毒感染和疾病的损害范围广泛。例如，作物和牲畜的病毒感染和疾病每年导致数十亿美元的损失。
已经利用遗传修饰来对抗病毒感染。遗传修饰可涉及基因的操纵，包括在基因组内的单个或多个基因座处添加、缺失或替换靶基因或其一部分。通过遗传修饰编码病毒用来进入细胞的蛋白质的基因，这种方法可以赋予或增强对病毒感染的抗性。然而，通过基因编辑赋予或增强对病毒感染的抗性可能是昂贵的、耗时的，有时是无效的。另外，针对一种类型的病毒感染的抗性的遗传修饰不会防止其他类型的病毒感染。
发明内容
本公开提供了细胞、组织、器官和非人类哺乳动物，其包含导致增强的对病毒感染的抗性的遗传修饰。本文还公开了细胞、组织、器官和非人类哺乳动物，其包含遗传修饰以增强对多种病毒株引起的感染的抗性。
本文描述了一种遗传修饰的细胞，其与对照细胞相比表现出增强的对病毒感染的抗性，所述遗传修饰的细胞在编码CD163的基因中包含至少一个修饰的染色体序列，其中所述至少一个染色体序列选自：外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12、内含子13、内含子14、内含子15和内含子16。在一些实施方案中，CD163的所述至少一个染色体序列选自：外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12和内含子13。在一些实施方案中，CD163的所述至少一个染色体序列选自：外显子4、内含子3和内含子4。在一些实施方案中，所述遗传修饰的细胞表现出降低的CD163表达或活性。在一些实施方案中，CD163的所述至少一个修饰的染色体序列包含移码突变。在一些实施方案中，所述包含修饰的CD163的遗传修饰的细胞表现出增强的对PRRSV和ASFV的抗性。在一些实施方案中，所述包含修饰的CD163的遗传修饰的细胞表现出增强的对PRRSV的抗性。在一些实施方案中，所述包含修饰的CD163的遗传修饰的细胞表现出增强的对ASFV的抗性。
本文描述了一种遗传修饰的非人类哺乳动物，其表现出增强的对病毒感染的抗性，所述遗传修饰的非人类哺乳动物包含本文所述的包含修饰的CD163的遗传修饰的细胞。在一些实施方案中，所述遗传修饰的非人类哺乳动物是偶蹄动物。在一些实施方案中，所述偶蹄动物是猪。在一些实施方案中，所述遗传修饰的非人类哺乳动物表现出增强的对PRRSV和ASFV的抗性。在一些实施方案中，所述包含修饰的CD163的遗传修饰的非人类哺乳动物表现出增强的对PRRSV的抗性。在一些实施方案中，所述包含修饰的CD163的遗传修饰的非人类哺乳动物表现出增强的对ASFV的抗性。
本文描述了一种遗传修饰细胞或非人类哺乳动物以诱导增强的对病毒感染的抗性的方法，所述方法包括在遗传修饰的细胞或非人类哺乳动物中生成CD163的至少一个修饰的染色体序列。在一些实施方案中，所述方法包括生成CD163的至少一个修饰的染色体序列，其中与CD163未修饰的对照细胞或非人类哺乳动物相比，在遗传修饰的细胞或非人类哺乳动物中，所述修饰的CD163增强对PRRSV和ASFV病毒感染的抗性。在一些实施方案中，所述方法包括生成CD163的至少一个修饰的染色体序列，其中与CD163未修饰的对照细胞或非人类哺乳动物相比，在遗传修饰的细胞或非人类哺乳动物中，所述修饰的CD163增强对PRRSV病毒感染的抗性。在一些实施方案中，所述方法包括生成CD163的至少一个修饰的染色体序列，其中与CD163未修饰的对照细胞或非人类哺乳动物相比，在遗传修饰的细胞或非人类哺乳动物中，所述修饰的CD163增强对ASFV病毒感染的抗性。在一些实施方案中，所述遗传修饰的细胞在编码CD163的基因中包含至少一个修饰的染色体序列，其中所述至少一个染色体序列选自下组：外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12、内含子13、内含子14、内含子15和内含子16。在一些实施方案中，CD163的所述至少一个染色体序列选自下组：外显子4、内含子3和内含子4。在一些实施方案中，所述遗传修饰的细胞表现出降低的CD163表达或活性。在一些实施方案中，CD163的所述至少一个修饰的染色体序列包含移码突变。在一些实施方案中，包含所述修饰的CD163的遗传修饰的细胞表现出增强的对PRRSV和ASFV的抗性。在一些实施方案中，包含所述修饰的CD163的遗传修饰的细胞表现出增强的对PRRSV的抗性。在一些实施方案中，所述包含修饰的CD163的遗传修饰的细胞表现出增强的对ASFV的抗性。
本文描述了一种遗传修饰的细胞，其与对照细胞相比表现出增强的对至少两个属的病毒引起的病毒感染的抗性，所述遗传修饰的细胞包含所述修饰细胞的一种或多种内源基因的修饰的遗传内容，该修饰的遗传内容赋予增强的抗性。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞包含能够靶向所述一种或多种内源基因的至少一种基因调节部分，以生成所述一种或多种内源基因的修饰的遗传内容。在一些实施方案中，编码所述至少一种基因调节部分的基因整合到遗传修饰的细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因包括第一内源基因和第二内源基因，并且其中所述至少一种基因调节部分包含(i)能够靶向所述第一内源基因的第一指导核酸分子和(ii)能够靶向所述第二内源基因的第二指导核酸分子。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因包含靶内源基因，并且其中所述至少一种基因调节部分包含(i)能够靶向所述靶内源基因的第一部分的第一指导核酸分子和(ii)能够靶向所述靶内源基因的第二部分的第二指导核酸分子。在一些实施方案中，所述修饰的遗传内容包括染色体基因或其转录物。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因编码选自下组的一种或多种蛋白质：受体蛋白、肽酶蛋白、糖基转移酶蛋白、羟化酶蛋白和干扰素刺激基因(ISG)蛋白。在一些实施方案中，所述受体蛋白是CD163。在一些实施方案中，所述肽酶蛋白是ANPEP。在一些实施方案中，所述糖基转移酶蛋白是GGTA1。在一些实施方案中，所述糖基转移酶蛋白是CMAH。在一些实施方案中，所述羟化酶蛋白是B4HALNT2。在一些实施方案中，所述ISG蛋白是RELA。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因编码选自下组的至少两种蛋白质：CD163、ANPEP、GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因编码CD163和选自下组的一种或多种蛋白质：ANPEP、GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因编码ANPEP和选自下组的一种或多种蛋白质：CD163、GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因编码选自下组的一种或多种蛋白质：GGTA1、CMAH和B4GALNT2；以及CD163或ANPEP。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因编码选自下组的一种或多种蛋白质：RELA；和CD163或ANPEP。在一些实施方案中，与所述对照细胞相比，所述遗传修饰的细胞表现出增强的对至少三个属的病毒引起的病毒感染的抗性，并且其中所述一种或多种内源基因编码CD163或ANPEP和选自下组的一种或多种基因：GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。在一些实施方案中，所述遗传修饰的细胞表现出增强的对至少两个属的病毒引起的感染的抗性，所述病毒包括选自下组的两种或更多种病毒：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Betaarterivirus，PRRSV)、甲型冠状病毒(Alphacoronavirus)(TGEV)和非洲猪瘟病病毒(Asfivirus)(ASFV)。
本文描述了一种遗传修饰的非人类哺乳动物，其表现出增强的对至少两个属的病毒引起的病毒感染的抗性，所述遗传修饰的非人类哺乳动物包含本文描述的遗传修饰的细胞。在一些实施方案中，所述遗传修饰的非人类哺乳动物是偶蹄动物。在一些实施方案中，所述偶蹄动物是猪。
本文描述了一种遗传修饰细胞或非人类哺乳动物以诱导增强的对至少两个属的病毒引起的病毒感染的抗性的方法，所述方法包括生成本文描述的修饰的遗传内容。在一些实施方案中，所述遗传修饰的细胞包含能够靶向所述一种或多种内源基因的至少一种基因调节部分，以生成所述一种或多种内源基因的修饰的遗传内容。在一些实施方案中，编码所述至少一种基因调节部分的基因整合到所述遗传修饰的细胞的基因组中。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因包含第一内源基因和第二内源基因，并且其中所述至少一种基因调节部分包含(i)能够靶向所述第一内源基因的第一指导核酸分子和(ii)能够靶向所述第二内源基因的第二指导核酸分子。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因包含靶内源基因，并且其中所述至少一种基因调节部分包含(i)能够靶向所述靶内源基因的第一部分的第一指导核酸分子和(ii)能够靶向所述靶内源基因的第二部分的第二指导核酸分子。在一些实施方案中，所述修饰的遗传内容包括染色体基因或其转录物。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因编码选自下组的一种或多种蛋白质：受体蛋白、肽酶蛋白、糖基转移酶蛋白、羟化酶蛋白和干扰素刺激基因(ISG)蛋白。在一些实施方案中，所述受体蛋白是CD163。在一些实施方案中，所述肽酶蛋白是ANPEP。在一些实施方案中，所述糖基转移酶蛋白是GGTA1。在一些实施方案中，所述糖基转移酶蛋白是CMAH。在一些实施方案中，所述羟化酶蛋白是B4HALNT2。在一些实施方案中，所述ISG蛋白是RELA。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因编码选自下组的至少两种蛋白质：CD163、ANPEP、GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因编码CD163和选自下组的一种或多种蛋白质：ANPEP、GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因编码ANPEP和选自下组的一种或多种蛋白质：CD163、GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因编码选自下组的一种或多种蛋白质：GGTA1、CMAH和B4GALNT2；以及CD163或ANPEP。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因编码选自下组的一种或多种蛋白质：RELA；和CD163或ANPEP。在一些实施方案中，与所述对照细胞相比，所述遗传修饰的细胞表现出增强的对至少三个属的病毒引起的病毒感染的抗性，并且其中所述一种或多种内源基因编码CD163或ANPEP和选自下组的一种或多种基因：GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。在一些实施方案中，所述遗传修饰的细胞表现出增强的对至少两个属的病毒引起的感染的抗性，所述病毒包括选自下组的两种或更多种病毒：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Betaarterivirus，PRRSV)、甲型冠状病毒(Alphacoronavirus)(TGEV)和非洲猪瘟病病毒(Asfivirus)(ASFV)。
本文描述了一种用于减少由至少两个科的病毒引起的病毒感染的组合物，其包含：(a)一种或多种异源多肽，其包含核酸指导的核酸酶或其片段；和(b)至少两个与所述至少两个科的病毒的病毒基因特异性结合的指导核酸，其中组分(a)和(b)形成复合物，该复合物被配置用于修饰所述病毒基因的遗传内容。在一些实施方案中，所述核酸指导的核酸酶是Cas蛋白。在一些实施方案中，所述Cas蛋白是V型Cas。在一些实施方案中，所述Cas蛋白是VI型Cas。在一些实施方案中，所述至少两个病毒科包括冠状病毒科(Coronaviridae)、动脉病毒科(Arteriviridae)或非洲猪瘟病病毒科(Asfarviridae)。在一些实施方案中，所述病毒基因包含病毒基因组或其转录物。
本文描述了一种能够减少由至少两个科的病毒引起的病毒感染的细胞或非人类哺乳动物，其包含本文描述的组合物。本文还描述了一种生成能够减少由至少两个科的病毒引起的病毒感染的细胞的方法，其包括使所述细胞与本文描述的组合物接触。
本文描述了一种指导核酸，其包含约10至30个连续核苷酸的序列，所述序列与靶病毒基因的至少两个不同区域表现出至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，所述靶病毒基因包含病毒基因组或其转录物。在一些实施方案中，所述指导核酸靶向所述靶病毒基因的相同基因内的所述至少两个不同区域。在一些实施方案中，所述指导核酸靶向所述靶病毒基因的两个不同基因中的所述至少两个不同区域。在一些实施方案中，所述指导核酸靶向选自下组的病毒基因：B602L、DP86L、DP93R、KP86R、KP93L、M1249L、G1221R、O174L和CP204L(p30)。在一些实施方案中，所述指导核酸靶向选自下组的病毒基因：B602L、DP86L、DP93R、KP86R、KP93L、M1249L、G1221R和O174L。在一些实施方案中，所述指导核酸包含与SEQID NO:6的序列片段至少90％相同的序列。在一些实施方案中，所述指导核酸包含与SEQ IDNO:7的序列片段至少90％相同的序列。在一些实施方案中，所述指导核酸与选自SEQ IDNO:10001-13274、SEQ ID NO:20001-23274和SEQ ID NO:30001-33274的序列至少90％相同。在一些实施方案中，所述指导核酸与选自SEQ ID NO:10001、10002、10433、10848、12318和12266的序列至少90％相同。在一些实施方案中，所述指导核酸与选自SEQ ID NO:20001、20002、20433、20848、22318和22266的序列至少90％相同。在一些实施方案中，所述指导核酸与选自SEQ ID NO:30001、30002、30433、30848、32318和32266的序列至少90％相同。在一些实施方案中，所述指导核酸靶向ASFV病毒基因。
本文描述了一种组合物，其包含：异源多肽，其包含核酸指导的核酸酶或其片段；和本文描述的至少一个指导核酸。在一些实施方案中，所述组合物包含至少两个指导核酸。在一些实施方案中，细胞或非人类哺乳动物包含所述组合物。在一些实施方案中，本文描述了一种减少细胞中靶病毒的感染和/或复制的方法，其包括：使所述细胞与所述组合物接触，其中在接触后，所述组合物实现靶病毒在所述细胞中减少的感染和/或复制。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述指导核酸靶向所述靶病毒基因的相同基因内的所述至少两个不同区域。在一些实施方案中，所述指导核酸靶向所述靶病毒基因的两个不同基因中的所述至少两个不同区域。在一些实施方案中，所述指导核酸靶向选自下组的病毒基因：B602L、DP86L、DP93R、KP86R、KP93L、M1249L、G1221R、O174L和CP204L(p30)。在一些实施方案中，所述指导核酸靶向选自下组的病毒基因：B602L、DP86L、DP93R、KP86R、KP93L、M1249L、G1221R和O174L。在一些实施方案中，所述指导核酸包含与SEQ ID NO:6的序列片段至少90％相同的序列。在一些实施方案中，所述指导核酸包含与SEQ ID NO:7的序列片段至少90％相同的序列。在一些实施方案中，所述指导核酸与选自SEQ ID NO:10001-13274、SEQID NO:20001-23274和SEQ ID NO:30001-33274的序列至少90％相同。在一些实施方案中，所述指导核酸与选自SEQ ID NO:10001、10002、10433、10848、12318和12266的序列至少90％相同。在一些实施方案中，所述指导核酸与选自SEQ ID NO:20001、20002、20433、20848、22318和22266的序列至少90％相同。在一些实施方案中，所述指导核酸与选自SEQID NO:30001、30002、30433、30848、32318和32266的序列至少90％相同。在一些实施方案中，所述指导核酸靶向ASFV病毒基因。
附图说明
本公开的新颖特征在所附权利要求书中具体阐述。通过参考以下对说明性实施方案加以阐述的详细描述，将会对本公开的特征和优点获得更好的理解。
图1A示出了与从野生型对照猪分离的细胞相比，从遗传修饰的猪分离的细胞中的ASFV复制减少。
图1B和图1C示出了与来自野生型对照猪产生的细胞裂解物的上清液或细胞沉淀物相比，来自遗传修饰的猪产生的细胞裂解物的上清液(图1B)或细胞沉淀物(图1C)中的ASFV拷贝数降低。
图2A示出了基因组基因座，其中诱导同源重组以引入敲入基因座。
图2B示出了PCR产物，其证实存在敲入等位基因基因座。
图2C示出了Sanger测序结果，其证实活动物在出生时具有敲入基因座。
图3A示出了通过gRNA的多重化而靶向的病毒基因组的多个区域。
图3B示出了与CRISPR/Cas9复合的gRNA在体外对PCR产物的消化。
图3C示出了如由纯化的ASFV单克隆所确定的，具有稳定的抗ASFV CRISPR/Cas9表达的经编辑的COS-7细胞中ASFV的抑制，其进一步针对COS-7细胞进行适应性修改以进行体外感染试验。
图3D示出了如由纯化的ASFV单克隆所确定的，样品之间和qPCR重复之间的复制的相对病毒滴度，其进一步针对COS-7细胞进行适应性修改以进行体外感染试验。
图3E和图3F示出了通过多重化gRNA以靶向并切割ASFV病毒基因组的多个区域而对ASFV扩增的抑制。
图4A-图4C示出了用于多重化表达本文所述gRNA和/或核酸酶的示例性载体或构建体。图4A示出了示例性的多重化自切割核酶，以将不同的gRNA序列连接在一起，以在单个启动子下表达多个gRNA序列。虚线表示自切割的位点。图4B示出了用于表达多个gRNA和核酸指导的核酸酶(例如Cas9)的示例性载体设计。这些载体中的核酸指导的核酸酶可以与核定位序列(NLS)融合。在一些情况下，该核酸指导的核酸酶没有NLS(例如pBv2-EF和pBv2-U6载体)。图4C示出了本文描述的载体和gRNA核酶的设计。
图5A示出了存在于所述克隆的转基因猪中的基因组DNA水平上的插入的Cas9转基因构建体(pBv1-U6)的片段。获自转基因猪P07、P09、P10、P11和P13的100ng基因组DNA全部显示所述转基因的片段的扩增。WT：野生型大白猪基因组DNA。PC：阳性对照(携带转基因的质粒)。
图5B示出了通过PT-qPCR的Cas9转基因的表达。从克隆的转基因猪收获猪成纤维细胞，并且从该成纤维细胞分离RNA。实施逆转录以获得cDNA。使用cDNA作为模板进行PCR以鉴定Cas9转基因的正确表达。来自转基因猪成纤维细胞(P10和P12)或来自野生型猪成纤维细胞的100ng cDNA。通过来自转基因猪成纤维细胞的cDNA的qPCR来检测Cas9表达。
图5C示出了使用检测同源介导修复(HDR)的报告基因质粒的具有活跃的切割能力的转基因猪成纤维细胞中的Cas9/sgRNA表达。使用报告基因质粒用于报告ASFV sgRNA靶位点的切割和经由同源介导修复以重构功能性的EGFP拷贝而产生EGFP(FITC通道)的阳性信号。使用报告质粒可以模仿在进入转基因猪的细胞后ASFV如何被切割的过程，确定在转基因猪成纤维细胞中切割具有ASFV sgRNA靶位点的dsDNA的Cas9/sgRNA功能。HDR-报告基因质粒被转染到转基因猪P09和P10的成纤维细胞中。在转染后48小时进行FACS以检测EGFP的表达。在P09和P10两者的猪成纤维细胞中检测Cas9/sgRNA合适切割能力。
具体实施方式
虽然本文已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，这些实施方案仅以示例的方式提供。在不脱离本公开内容的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本申请公开内容时可以采用本文所述公开内容的实施方案的各种替代方案。旨在以所附权利要求书限定本申请公开内容的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
诸如“将”、“将不”、“应”、“应不”、“必须”、“不得”、“第一”、“最初”、“下一个”、“随后”、“之前”、“之后”、“最后”和“最终”等绝对或顺序术语的使用并不意味着限制本文公开的本实施方案的范围，而是作为示例。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”也意欲包括复数形式。此外，就具体实施方式和/或权利要求书中使用的术语“包括”、“包含”、“具有(“having”、“has”、“with”)”或其变化形式而言，这些术语旨在以与术语“包含”类似的方式为包含性的。
如本文所用的，短语“至少一个”、“一个或多个”/“一种或多种”以及“和/或”是开放式表述，在操作中既可以是合取性的也可以是析取性的。例如，表述“A、B和C中的至少一个”、“A、B或C中的至少一个”、“A、B和C中的一个或多个/一种或多种”、“A、B或C中的一个或多个/一种或多种”以及“A、B和/或C”中的每一个都意指单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起，或者A、B和C一起。
本文描述的任何系统、方法和平台都是模块化的，并且不限于顺序步骤。因此，诸如“第一”和“第二”之类的术语不一定暗示优先级、重要性顺序或动作顺序。
术语“约”或“大约”意指在本领域普通技术人员测定的特定值的可接受误差范围内，该可接受误差范围将部分取决于该值如何测量或测定，例如，测量系统的局限性。例如，根据给定值的实践，“约”可以表示在1个或大于1个标准差内。在本申请和权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”应被认为意指该特定值的可接受误差范围。
本文使用术语“增加的”或“增加”通常表示增加统计学显著的量。在一些实施方案中，术语“增加的”或“增加”表示与参考水平相比增加至少10％，例如，与参考水平、标准或对照相比，增加至少约10％，至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或多达并包括增加100％，或10-100％之间的任何增加。“增加”的其他示例包括与参考水平相比增加至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或更多。
本文使用术语“降低的”或“降低”通常表示降低统计学显著的量。在一些实施方案中，“降低的”或“降低”表示与参考水平相比降低至少10％，例如，与参考水平相比降低至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％，或多达并包括降低100％(例如，与参考水平相比不存在的水平或无法检测到的水平)，或10-100％之间的任何降低。在标记或症状的语境中，这些术语表示该水平的统计学显著降低。例如，降低可以是至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选地降低到对于没有给定疾病的个体的正常范围内所接受的水平。
术语“患者”或“受试者”在本文中可互换使用，并且包括哺乳动物。哺乳动物的非限制性实例包括哺乳纲的任何成员：人，非人灵长类动物，如黑猩猩以及其他猿和猴物种；农畜，如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜，如兔、狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，如大鼠、小鼠和豚鼠，等等。
如本文所用的，“细胞”通常是指生物细胞。细胞通常是活生物体的基本结构性、功能性和/或生物学单元。细胞可以源自具有一个或多个细胞的任何生物体。一些非限制性实例包括：原核细胞、真核细胞、细菌细胞、古菌细胞、单细胞真核生物体的细胞、原生动物细胞、来自植物的细胞(例如来自植物作物、水果、蔬菜、谷物、大豆、玉米、玉蜀黍、小麦、种子、蕃茄、稻、木薯、甘蔗、南瓜、干草、马铃薯、棉花、大麻、烟草、开花植物、针叶树、裸子植物、蕨类、石松类、角苔、苔类、藓类的细胞)、藻类细胞(例如，布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、Nannochloropsis gaditana、淀粉核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)、展枝马尾藻(Sargassum patens)C.Agardh等)、海藻(例如海带)、真菌细胞(例如酵母细胞、来自蘑菇的细胞)、动物细胞、来自无脊椎动物(例如果蝇、刺胞动物、棘皮动物、线虫等)的细胞、来自脊椎动物(例如鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物)的细胞、来自哺乳动物(例如，猪、牛、山羊、绵羊、啮齿动物、大鼠、小鼠、非人灵长类动物、人类等)的细胞，等等。有时，细胞并非源自天然生物体(例如，细胞可以是合成制备的，有时也称为人造细胞)。细胞可以来源于细胞系。在一些实施方案中，细胞是猪细胞。猪细胞起源或源自的品种的非限制性实例包括以下任何猪品种：Landrace、AmericanLandrace、American Yorkshire、Aksai Black Pied、Angeln saddleback、AppalachianEnglish、Arapawa Island、Auckland Island、Australian Yorkshire、Babi Kampung、BaXuyen、Bantu、Basque、Bazna、Beijing Black、Belarus Black Pied、Belgian Landrace、Bengali Brown Shannaj、Bentheim Black Pied、Berkshire、Bisaro、Bangur、BlackSlavonian、Black Canarian、Breitovo、British Landrace、British Lop、BritishSaddleback、Bulgarian White、Cambrough、Cantonese、Celtic、Chato Murciano、ChesterWhite、Chiangmai Blackpig、Choctaw Hog、Creole、Czech Improved White、DanishLandrace、Danish Protest、Dermantsi Pied、Li Yan、Duroc、Dutch Landrace、EastLandrace、East Balkan、Essex、Estonian Bacon、Fengjing、Finnish Landrace、ForestMountain、French Landrace、Gascon、German Landrace、Gloucestershire Old Spots、Gottingen minipig、Grice、Guinea Hog、Hampshire、Hante、Hereford、Hezuo、Hogan Hog、Huntington Black Hog、Iberian、Italian Landrace、Japanese Landrace、Jeju Black、Jinhua、Kakhetian、Kele、Kemerovo、Korean Native、Krskopolje、Kunekune、Lamcombe、Large Black、Large Black-White、Large White、Latvian White、Leicoma、LithuanianNative、Lithuanian White、Lincolnshire Curly-Coated、Livny、Malhado de Alcobaca、Mangalitsa、Meishan、Middle White、Minzhu、Minokawa Buta、Mong Cai、Mora Romagnola、Moura、Mukota、Mulefoot、Murom、Myrhorod、Nero dei Nebrodi、Neijiang、New Zealand、Ningxiang、North Caucasian、North Siberian、Norwegian Landrace、NorwegianYorkshire、Ossabaw Island、Oxford Sandy and Black、Pakchong 5、Philippine Native、Pietrain、Poland China、Red Wattle、Saddleback、Semirechensk、Siberian Black Pied、Small Black、Small White、Spots、Surabaya Babi、Swabian-Hall、Swedish Landrace、Swallow Belied Mangalitza、Taihu pig、Tamworth、Thuoc Nhieu、Tibetan、Tokyo-X、Tsivilsk、Turopolje、Ukrainian Spotted Steppe、Spotted、Ukrainian White Steppe、Urzhum、Vietnamese Potbelly、Welsh、Wessex Saddleback、West French White、Windsnyer、Wuzhishanm、Yanan、Yorkshire和Yorkshire Blue and White。
术语“猪”、“生猪”和“豕”在本文中可互换使用，是指与家猪种Sus scrofa的各种品种有关的任何动物。猪包含本文所述的任何猪品种的猪细胞。
如本文所用的，术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸的组合。核苷酸可以是合成核苷酸。核苷酸可以是合成核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列(例如脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))的单体单元。术语核苷酸可包括核糖核苷三磷酸——三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸尿苷(UTP)、三磷酸胞嘧啶(CTP)、三磷酸鸟苷(GTP)，和脱氧核糖核苷三磷酸，如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。此类衍生物可包括，例如，[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP及核苷酸衍生物，其赋予含有它们的核酸分子核酸酶抗性。如本文所用的术语核苷酸可指双脱氧核糖核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核糖核苷三磷酸的说明性实例可包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，无论是脱氧核糖核苷酸还是核糖核苷酸，或其类似物，无论是单链、双链还是多链形式。多核苷酸对于细胞而言可以是外源的或内源的，例如异源多核苷酸。多核苷酸可以存在于无细胞的环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以行使已知或未知的任何功能。多核苷酸可包含一种或多种类似物(例如，改变的骨架、糖或核碱基)。如果存在的话，对核苷酸结构的修饰可以在聚合物装配之前或之后赋予。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉代、锁定核酸、二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、蛹虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如罗丹明或与糖连接的荧光素)、含硫醇的核苷酸、与生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷和怀俄苷。多核苷酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码区或非编码区、从连锁分析定义的基因座(多个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)在内的无细胞多核苷酸、核酸探针以及引物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。
术语“转染”或“转染的”通常是指通过非病毒方法或基于病毒的方法将核酸构建体引入细胞中。核酸分子可以是编码完整蛋白质或其功能部分的基因序列。参见，例如，Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,18.1-18.88。在一些实施方案中，转染方法用于将核酸构建体引入细胞中以生成遗传修饰的动物。这类技术可包括前核显微注射(美国专利4,873,191)、逆转录病毒介导的向种系中的基因转移(VanderPutten等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,6148-1652)、向胚胎干细胞中的基因靶向(Thompson等人(1989)Cell 56,313-321)、胚胎的电穿孔(Lo(1983)Mol.Cell.Biol.3,1803-1814)、精子介导的基因转移(Lavitrano等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99,14230-14235；Lavitrano等人(2006)Reprod.Fert.Develop.18,19-23)以及体细胞如卵丘或哺乳动物细胞或者成体、胎儿或胚胎干细胞的体外转化，及随后的核移植(Wilmut等人(1997)Nature 385,810-813；和Wakayama等人(1998)Nature 394,369-374)。
如本文所用的术语“基因”是指编码单个蛋白质或RNA的核酸区段(也称为“编码序列”或“编码区”)，其任选地与相关联的调节区如启动子、操纵子、终止子等在一起，该调节区可以位于编码序列的上游或下游。术语“基因”应被广义地理解，并且可以涵盖基因的mRNA、cDNA、cRNA和基因组DNA形式。在一些用途中，术语“基因”涵盖转录的序列，包括5'和3'非翻译区(5'-UTR和3'-UTR)、外显子和内含子。在一些基因中，转录的区域将包含编码多肽的“开放阅读框”。在该术语的一些用途中，“基因”仅包含编码多肽所必需的编码序列(例如，“开放阅读框”或“编码区”)。在一些方面，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转移RNA(tRNA)基因。在一些方面，术语“基因”不仅包括转录的序列，而且还包括非转录的区域，包括上游和下游调节区、增强子和启动子。术语“基因”可以涵盖基因的mRNA、cDNA和基因组形式。
如本文所用的术语“突变”可指序列例如核酸或氨基酸序列内的残基被另一残基置换，或序列内的一个或多个残基的缺失或插入。一种或多种突变可通过确定原始残基，随后是序列内残基的位置以及新置换的残基的身份来描述。突变可以是序列(例如，核酸序列、基因组序列、遗传序列如DNA、RNA或蛋白质序列)相对于参考序列的变化或改变。参考序列可以是野生型序列、健康或正常细胞的序列或与疾病或病症无关的序列。参考序列可以是与癌症无关的序列。突变的非限制性实例包括点突变、一个或多个核苷酸的置换、一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的插入、一个或多个核苷酸的融合、移码突变、畸变、选择性剪接、异常甲基化、错义突变、保守突变、非保守突变、无义突变、剪接变体、选择性剪接变体、转换、颠换、新生突变、有害突变、致病突变、表突变、建立者突变(foundermutation)、种系突变、体细胞突变、易感突变(predisposing mutation)、剪接位点突变或易感基因突变。该突变可以是增加个体对某种疾病或病症的易感性或倾向的致病性变异或突变。该突变可以是驱动突变(例如，可以赋予其微环境中的细胞适应优势，从而驱动细胞谱系致癌的突变)。该驱动突变可以是功能丧失突变。该突变可以是功能丧失突变。该突变可以是过客突变(例如，在基因组中与驱动突变一起发生并且可以与克隆扩充相关的突变)。如本文所用的，术语“基因”可指多核苷酸元件的组合，当以天然或重组方式可操作地连接时，其提供某种产物或功能。如本文所用的，修饰的内源基因可指内源基因的突变。
术语“敲除”(“KO”)在本文中用来指猪或其他非人类哺乳动物或者猪或其他非人类哺乳动物中的任何细胞中的修饰的内源基因，其特征在于内源基因的缺失、失活或消除。如本文所用的，KO还可指执行或已经执行内源基因或其基因座的缺失、失活、突变或消除的方法。如本文所用的，修饰的内源基因可指内源基因的KO。
术语“敲入”(“KI”)在本文中用来指猪或其他非人类哺乳动物或者猪或其他非人类哺乳动物中的任何细胞中的修饰的内源基因，其特征在于基因的核苷酸的添加、替换或突变。如本文所用的，KI还可指执行或已经执行内源基因或其基因座的添加、替换或突变的方法。如本文所用的，修饰的内源基因可指内源基因的KI。在一些实施方案中，该KI可以是内源基因。在一些实施方案中，该KI可以是异源基因。在一些实施方案中，该KI可以是异源基因的敲入以替换内源基因。
如本文所用的，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。蛋白质可指从编码开放阅读框翻译的全长多肽，或加工成其成熟形式，而多肽或肽可指仍然独特地或可鉴别地映射到特定蛋白质的蛋白质的降解片段或加工片段。多肽可以是通过相邻氨基酸残基的羧基与氨基之间的肽键键合在一起的氨基酸的单个线性聚合物链。多肽可以例如通过添加碳水化合物、磷酸化等来修饰。蛋白质可包含一种或多种多肽。多肽可以是异源多肽。
如本文所用的，术语“片段”或等同术语可指蛋白质的座位，其长度小于蛋白质的全长，并且任选地维持该蛋白质的功能。此外，当将蛋白质的座位针对该蛋白质进行BLAST比对时，该蛋白质序列的座位可以与该蛋白质序列的一部分例如以至少80％的同一性对齐。
如本文所用的术语“靶多核苷酸”、“靶病毒基因组”或“靶病毒基因”可指被本公开的异源RNA多核苷酸和基因调节部分靶向的核酸或多核苷酸。靶多核苷酸可以是DNA(例如，内源的或外源的)，例如，可用作模板以生成mRNA转录物和/或调节mRNA从DNA模板转录的各种调节区的DNA。靶多核苷酸可以是较大多核苷酸的座位，例如染色体或染色体的区域。靶多核苷酸可以是RNA。RNA可以是，例如，可用作编码蛋白质的模板的mRNA。包含RNA的靶多核苷酸可以包括调节从mRNA模板翻译蛋白质的各种调节区，或处于所述各种调节区内。靶多核苷酸可编码基因产物(例如，编码RNA转录物的DNA或编码蛋白质产物的RNA)或包含调节基因产物的表达的调节序列。靶多核苷酸可指靶核酸的单链上的核酸序列。靶多核苷酸可以是基因、调节序列、基因组DNA、包括cfDNA和/或cfRNA在内的无细胞核酸、cDNA、融合基因以及包括mRNA、miRNA、rRNA等在内的RNA的座位。当靶多核苷酸被基因调节部分靶向时，可导致基因表达改变(例如，突变基因的转录或翻译增加)和/或活性改变。靶多核苷酸可包含不能通过单核苷酸置换与核酸样品中的其他任何序列相关的核酸序列。靶多核苷酸可包含或者可以是基因序列或其调节元件的座位。靶多核苷酸可包含或者可以是外显子序列、内含子序列、外显子-内含子连接、剪接受体-剪供体位点、起始密码子序列、终止密码子序列、启动子位点、替代启动子位点、5'调节元件、增强子、5’UTR区、3’UTR区、聚腺苷酸化位点的座位，或聚合酶、核酸酶、促旋酶、拓扑异构酶、甲基化酶或甲基转移酶、转录因子、增强子或锌指的结合位点。靶多核苷酸可包含或者可以是剪接变体或替代剪接变体的座位。靶多核苷酸可以仅存在于待靶向的细胞(例如，癌细胞、病变细胞、被诸如病毒或细菌等微生物感染的细胞)中，并且可以在正常或健康细胞中不存在。靶多核苷酸可包含或者可以是微生物或诸如病毒或细菌等微生物的座位。靶多核苷酸可包含或者可以是变异多核苷酸的座位，例如剪接位点变体、点变体、致病变体、未分类变体、拷贝数变体、新生变体、表观遗传变体、建立者变体(founder variant)、移码变体、种系变体、体细胞变体、错义变体、无义变体或致病变体。靶多核苷酸可包含或者可以是由驱动突变产生的选择性剪接变体的座位。
如本文所用的术语“互补的”、“互补体”、“互补性的”和“互补性”通常是指与给定序列完全互补并可杂交的序列。在一些情况下，如果其在给定区域上的碱基序列能够互补性地结合其结合配偶体的碱基序列，例如，使得形成A-T、A-U、G-C和G-U碱基对，则与给定核酸杂交的序列被称为给定分子的“互补体”或“反向互补体”。通常，可与第二序列杂交的第一序列可特异性地或选择性地与第二序列杂交，使得在杂交反应期间，与第二序列或一组第二序列的杂交相比于与非靶序列的杂交是优选的(例如在给定的一组条件下，如严格性条件下，在热力学上更稳定)。通常，可杂交的序列在其各自长度的全部或座位上共有一定程度的序列互补性，如25％-100％的互补性，包括至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的序列互补性。例如为了评估互补性百分比，序列同一性可以通过任何合适的比对算法来测量，包括但不限于Needleman-Wunsch算法(参见，例如，可以在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html获得的EMBOSS Needle比对器(aligner)，任选地采用默认设置)、BLAST算法(参见，例如，可以在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi获得的BLAST比对工具，任选地采用默认设置)或Smith-Waterman算法(参见，例如，可以在www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html获得的EMBOSS Water比对器，任选地采用默认设置)。可以使用所选算法的任何合适的参数(包括默认参数)来评估最佳比对。
如本文所用的，术语“同一性百分比(％)”通常是指在比对所述序列并在必要时引入空位以达到最大同一性百分比(即，可以在候选序列和参考序列之一或两者中引入空位以实现最佳比对，并且为了比较目的，可以忽略非同源序列)后，候选序列中与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。旨在测定同一性百分比的比对可以以本领域技术中的各种方式来实现，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。可以通过使用BLAST将测试序列与比较序列进行比对，确定所比对的测试序列中与比较序列相同位置的氨基酸或核苷酸相同的氨基酸或核苷酸的数目，并将相同氨基酸或核苷酸的数目除以比较序列中氨基酸或核苷酸的数目，来计算这两个序列的同一性百分比。
术语“错配”通常是指在比对时两个核苷酸之间缺乏互补性。DNA中的互补碱基是A-T和G-C。RNA中的互补碱基是A-U和G-C。因此，当两个寡核苷酸序列比对时，并且在DNA中A不与T配对或G不与C配对，或者在RNA中A不与U配对或G不与C配对的一个或多个核苷酸位置处发生错配。
如本文所用的，术语“体内”可用来描述在受试者体内发生的事件。
如本文所用的，术语“离体”可用来描述在受试者体外发生的事件。不能对受试者进行“离体”测定。相反，它可以对从受试者分离的样品进行。离体可用来描述受试者体外完整细胞中发生的事件。
如本文所用的，术语“体外”可用来描述在容纳实验室试剂的容器中发生的事件，使得其与从中获得材料的活生物来源生物体分离。体外测定可涵盖采用活细胞或死细胞的基于细胞的测定。体外测定还可涵盖不采用完整细胞的无细胞测定。
“治疗”或“处理”可指治疗性处理以及预防性或防范性措施两者，其中目的在于预防或减缓(减轻)目标病理状况或病症。需要治疗者包括已患该病症者，以及易患该病症者，或者有待预防该病症者。治疗性益处可指症状或正在被治疗的潜在病症的根除或改善。另外，治疗性益处也能如下实现：根除或改善与潜在病症相关的一种或多种生理学症状，使得在受试者中观察到改善，尽管该受试者可能仍受到该潜在病症的折磨。预防性效果可包括延缓、防止或消除疾病或状况的出现，延缓或消除疾病或状况的症状发作，减慢、终止或逆转疾病或状况的进展，或其任意组合。对于预防性益处，具有发生特定疾病的风险的受试者或报告疾病的一种或多种生理学症状的受试者可接受治疗，即使可能尚未作出该疾病的诊断。
如本文可互换使用的术语“有效量”和“治疗有效量”通常是指组合物的量，例如包含含有本公开的系统的免疫细胞如淋巴细胞(例如，T淋巴细胞和/或NK细胞)的组合物的量，该量足以在施用于有需要的受试者后产生所需的活性。在本公开的上下文中，术语“治疗有效的”是指足以延迟通过本公开的方法治疗的病症的表现、阻止其进展、缓解或减轻其至少一种症状的组合物的量。
术语“药学上可接受的载体”、“药学上可接受的赋形剂”、“生理学上可接受的载体”或“生理学上可接受的赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。在与药物制剂的其他成分相容的意义上来讲，组分可以是“药学上可接受的”。它还适合与人和非人类哺乳动物的组织或器官接触使用，而没有过度的毒性、刺激、变态反应、免疫原性或其他问题或并发症，对应合理的受益/风险比。参见Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版；LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA,2005；Handbook of Pharmaceutical Excipients,第5版；Rowe等人编著,The Pharmaceutical Press and the American PharmaceuticalAssociation:2005；和Handbook of Pharmaceutical Additives,第3版；Ash and Ash编著,Gower Publishing Company:2007；Pharmaceutical Preformulation andFormulation,Gibson编著,CRC Press LLC:Boca Raton,FL,2004。
术语“药物组合物”是指本文公开的化合物与其他化学组分如稀释剂或载体的混合物。该药物组合物可以有助于将该化合物施用于生物体。本领域存在多种施用化合物的技术，包括但不限于口服、注射、气雾剂、肠胃外和局部施用。
概述
预防或治疗病毒感染仍然是农业中持续存在的挑战。因此，仍然需要产生对多种病毒株引起的病毒感染表现出增强的抗性的遗传修饰的细胞或遗传修饰的非人类哺乳动物。还需要能够预防或治疗细胞或非人类哺乳动物中由多种病毒株引起的病毒感染的组合物。
因此，本文描述了包含一种或多种遗传修饰的内源基因的遗传修饰的细胞或遗传修饰的非人类哺乳动物。该遗传修饰的基因可提高细胞或非人类哺乳动物对病毒感染的抗性或传播病毒感染的能力。例如，这类对病毒感染的易感性降低的细胞或非人类哺乳动物可用于农业或者作为可移植组织或器官的来源。内源基因可包括编码受体的基因、编码肽酶的基因、编码羟化酶的基因、编码糖基转移酶的基因或编码干扰素刺激基因(ISG)蛋白的基因。本文还描述了包含至少一种异源多肽和/或至少一种多核苷酸的组合物，以用于靶向并切割一种或多种病毒株的病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组或病毒基因的转录物。
遗传修饰的内源基因
在一些实施方案中，本文描述了与对照细胞如未修饰的细胞相比，表现出增强的对病毒感染的抗性的遗传修饰的细胞。在一些实施方案中，该遗传修饰的细胞包含一种或多种修饰的内源基因。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因包含编码所述一种或多种内源基因的修饰的染色体序列。在一些实施方案中，使用该遗传修饰的细胞来产生遗传修饰的组织、器官或非人类哺乳动物。在一些实施方案中，该遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含至少一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、10种、15种、20种、30种或更多种修饰的内源基因。在一些实施方案中，通过点突变、插入、缺失、移码、易位、重复、倒位、非同源末端连接(NHEJ)、同源性指导的修复(HDR)、灭活、破坏、切除一部分或其组合，对细胞、组织、器官或非人类哺乳动物的一种或多种内源基因进行遗传修饰。
在一些实施方案中，所述至少一种修饰的内源基因防止或减少病毒的结合以及进入遗传修饰的细胞。在一些实施方案中，所述至少一种修饰的内源基因调节由病毒感染诱导的免疫应答。在一些实施方案中，该修饰的内源基因是内源基因的敲除(KO)。在一些实施方案中，该修饰的内源基因是内源基因的敲入(KI)。在一些实施方案中，至少一种修饰的内源基因编码受体蛋白。在一些实施方案中，该受体蛋白是清道夫受体蛋白。示例性的清道夫受体蛋白可包括1型清道夫受体(SR-A1)、A类清道夫受体、B类清道夫、粘蛋白、凝集素样氧化LDL受体-1(LOX-1)、CD36、CD68和CD163。在一些情况下，该清道夫受体蛋白可包含一个或多个成员(例如，至少1、2、3、4、5个或更多个成员)，所述成员选自SR-A1、A类清道夫受体、B类清道夫、粘蛋白、LOX-1、CD36、CD68和CD163。
在一些实施方案中，所述修饰的内源基因是CD163。在一些实施方案中，所述遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物在编码CD163的内源基因中包含至少一个修饰的染色体序列。在一些实施方案中，CD163的修饰是CD163的任何一个结构域。在一些情况下，CD163的修饰在选自SRCR1、SRCR2、SRCR3、SRCR4、SRCR8和SRCR9的一个或多个结构域(例如，至少1、2、3、4、5个或更多个结构域)中。在一些实施方案中，CD163的修饰在选自外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12、内含子13、内含子14、内含子15和内含子16的一个或多个区域(例如，至少1、2、3、4、5个或更多个区域)中。在一些情况下，CD163的修饰在选自外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12、内含子13、内含子14、内含子15和内含子16的一个或多个区域(例如，至少1、2、3、4、5个或更多个区域)中。在一些实施方案中，CD163的修饰的染色体序列在选自外显子4、内含子3和内含子4的一个或多个区域(例如，1、2或3个区域)中。
在一些情况下，CD163的修饰可包括在同一结构域(例如，SRCR1、SRCR2、SRCR3、SRCR4、SRCR8或SRCR9)内或在同一区域(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12、内含子13、内含子14、内含子15或内含子16)内的多个修饰。替代地或附加地，CD163的修饰可包括位于不同结构域或不同区域中的多个修饰。
在一些实施方案中，CD163的修饰的染色体序列包含移码突变。在一些实施方案中，CD163的修饰的染色体序列包含在外显子4中引入的移码突变。在一些实施方案中，CD163的修饰包括与修饰的CD163相关的表达或生物活性降低。在一些实施方案中，CD163的修饰是CD163敲除。在一些实施方案中，CD163的修饰包括切割CD163的转录物或抑制CD163的表达。在一些实施方案中，与对照细胞、组织、器官或非人类哺乳动物相比，包含修饰的CD163的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含修饰的CD163的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对PRRSV感染和ASFV感染的抗性。在一些实施方案中，包含修饰的CD163的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对PRRSV感染的抗性。在一些实施方案中，包含修饰的CD163的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对ASFV感染的抗性。
在一些实施方案中，至少一种修饰的内源基因编码肽酶。在一些情况下，该肽酶是肽酶M1家族的成员，如氨肽酶N(ANPEP)、氨肽酶A、白三烯A4水解酶、Ape2氨肽酶、Aap1’氨肽酶、焦谷氨酰肽酶II、胞质溶胶丙氨酰氨肽酶、半胱氨酰氨肽酶、氨肽酶G、氨肽酶B、氨肽酶Ey、内质网蛋白氨肽酶1、三角相互作用因子F2、三角相互作用因子F3、精氨酰氨肽酶样1、ERAP2氨肽酶、氨肽酶、氨肽酶O或Tata结合蛋白相关因子。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因是编码ANPEP的基因。在一些情况下，该修饰在ANPEP基因的任何一个外显子中。在一些情况下，该修饰包括修饰ANPEP基因的外显子1。在一些实施方案中，修饰的ANPEP包括与修饰的ANPEP相关的表达或生物活性降低。在一些实施方案中，修饰的ANPEP是ANPEP敲除。在一些实施方案中，对ANPEP的修饰包括切割ANPEP的转录物或抑制ANPEP的表达。在一些实施方案中，与对照细胞、组织、器官或非人类哺乳动物相比，包含修饰的ANPEP的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含修饰的ANPEP的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对TGEV感染的抗性。
在一些实施方案中，至少一种修饰的内源基因编码羟化酶。在一些情况下，该羟化酶是类固醇羟化酶。在一些实施方案中，该羟化酶是脯氨酰羟化酶。在一些情况下，该羟化酶是核苷酸羟化酶，如嘌呤或嘧啶核苷酸羟化酶。在一些实施方案中，该羟化酶是胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)。在一些情况下，修饰的CMAH包括与修饰的CMAH相关的表达或生物活性降低。在一些实施方案中，修饰的CMAH是CMAH敲除。在一些实施方案中，CMAH的修饰包括切割CMAH的转录物或抑制CMAH的表达。
在一些实施方案中，至少一种修饰的内源基因编码糖基转移酶。在一些实施方案中，该糖转移酶是半乳糖转移酶。在一些情况下，该半乳转移酶是以下任一种：B3GALNT1；B3GALNT2；B3GALT1；B3GALT2；B3GALT4；B3GALT5；B3GALT6；B3GNT2；B3GNT3；B3GNT4；B3GNT5；B3GNT6；B3GNT7；B3GNT8；B4GALNT1；B4GALNT2；B4GALNT3；B4GALNT4；B4GALT1；B4GALT2；B4GALT3；B4GALT4；B4GALT5；B4GALT6；B4GALT7；GGTA1；GALNT1；GALNT2；GALNT3；GALNT4；GALNT5；GALNT6；GALNT7；GALNT8；GALNT9；GALNT10；GALNT11；GALNT12；GALNT13；GALNT14；GALNTL1；GALNTL2；GALNTL4；GALNTL5；和GALNTL6。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因是编码B4GALNT2的基因。在一些实施方案中，修饰的B4GALNT2包括与修饰的B4GALNT2相关的表达或生物活性降低。在一些实施方案中，修饰的B4GALNT2是B4GALNT2敲除。在一些实施方案中，B4GALNT2的修饰包括切割B4GALNT2的转录物或抑制B4GALNT2的表达。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因是编码GGTA1的基因。在一些情况下，修饰的GGTA1包括与修饰的GGTA1相关的表达或生物活性降低。在一些实施方案中，修饰的GGTA1是GGTA1敲除。在一些实施方案中，GGTA1的修饰是切割GGTA1的转录物或抑制GGTA1的表达。
在一些实施方案中，与对照细胞、组织、器官或非人类哺乳动物相比，包含修饰的CMAH、修饰的B4GALNT2和修饰的GGTA1的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含修饰的CMAH、修饰的B4GALNT2和修饰的GGTA1的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对ASFV感染的抗性。
在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因编码干扰素刺激基因(ISG)蛋白。此类ISG蛋白是由JAK-STAT途径介导的I、II或II型干扰素信号级联反应中的任何一个诱导的。在一些实施方案中，该ISG是视黄酸诱导型基因1(RIG-1)样受体(RLR)，AIM2样受体(ALR)，核苷酸结合寡聚化域样受体(NLR)，Toll样受体(TLR)1、2、3、4、7和9，寡聚腺苷酸合成酶(OAS)，潜在内切核糖核酸酶(RNA酶L)，蛋白激酶R(PKR)，环GMP-AMP(cGAMP)合酶(cGAS)，IFN基因刺激物(STING)，线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS，也称为VISA、IPS-1或Cardif)，SOCS蛋白，USP18，NF-κB蛋白如RELA，粘液病毒抗性(Mx)，胆固醇-25-羟化酶(CH25H)，IFITM蛋白，TRIM蛋白，锌指抗病毒蛋白(ZAP)，具有三十四肽重复序列的IFN诱导蛋白(IFIT)家族，ISG15，UBE2L6，HERC5，HERC6，UBE1LA，蝰蛇毒素(Viperin)，束缚蛋白(Tetherin)，ADAR，APOBEC3，C6orf150(MB21D1)，CD74，DDIT4，DDX58(RIG-I)，DDX60，GBP1，GBP2，HPSE，IRF1，IRF7，ISG20，MAP3K14(NIK)，MOV10，MS4A4A，NAMPT(PBEF1)，NT5C3，P2RY6，PHF15，RTP4，SLC15A3，SLC25A28，SSBP3，TREX1，SUN2(UNC84B)或ZC3HAV1(ZAP)。在一些实施方案中，修饰的ISG蛋白是RELA。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因是编码RELA的基因。
在一些情况下，修饰的RELA包含与修饰的RELA相关的表达或生物活性降低。在一些情况下，修饰的RELA包含与修饰的RELA相关的表达或生物活性不变。在一些实施方案中，修饰的RELA是RELA的敲除。在一些实施方案中，RELA的修饰包括切割RELA的转录物或抑制RELA的表达。在一些实施方案中，修饰的RELA是RELA敲入。在一些实施方案中，内源RELA包含SEQ ID NO:1的核酸序列(表1)。在一些实施方案中，RELA包含SEQ ID NO:1的变体，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核酸置换、添加或缺失。在一些实施方案中，RELA敲入包含与SEQ ID NO:1至少约60％、70％、80％、90％、95％或99％相同的核酸序列。在一些实施方案中，RELA敲入在SEQ ID NO:1中包含核酸置换A1342G。在一些实施方案中，RELA敲入在SEQ ID NO:1中包含核酸置换T1453C。在一些实施方案中，RELA敲入在SEQ ID NO:1中包含核酸置换T1591。在一些实施方案中，RELA敲入在SEQ ID NO:1中包含核酸置换A1342G、T1453C和/或T1591。
在一些实施方案中，内源RELA包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(表1)。在一些实施方案中，RELA敲入包括遗传修饰SEQ ID NO:2以引入至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个或更多个氨基酸置换。在一些实施方案中，RELA敲入包含与SEQID NO:2至少约60％、70％、80％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，RELA敲入的置换是SEQ ID NO:2中的T448A置换。在一些实施方案中，RELA敲入的置换是SEQID NO:2中的S485P置换。在一些实施方案中，RELA敲入的置换是SEQ ID NO:2中的S531P置换。SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，RELA敲入包含SEQ ID NO:2中的T448A、S485P或S531P置换氨基酸中的至少一个。在一些实施方案中，RELA敲入包含SEQ ID NO:2中的所有三个T448A、S485P或S531P氨基酸置换。
表1.内源RELA的序列
Figure GDA0003740138930000281
Figure GDA0003740138930000291
在一些实施方案中，RELA敲入包括用同源RELA或其片段置换内源RELA。在一些实施方案中，同源RELA或其片段包含与NCBI登录号FN999989.1(SEQ ID NO:3，表2)至少60％、70％、80％、90％、95％或99％相同的核酸序列。在一些实施方案中，同源RELA包含与SEQ IDNO:4(表2)至少60％、70％、80％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，同源RELA或其片段包含与SEQ ID NO:5(表2)至少60％、70％、80％、90％、95％或99％相同的核酸序列。在一些实施方案中，同源RELA或其片段是外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、外显子11、外显子12或外显子13中的一种或多种。在一些实施方案中，同源RELA或其片段包含外显子13。在一些实施方案中，同源RELA包含与SEQ ID NO:1至少60％、70％、80％、90％、95％或99％相同的核酸序列。在一些实施方案中，同源RELA或其片段包含与SEQ ID NO:2至少60％、70％、80％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，同源RELA与内源RELA的区别在于至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，同源RELA与内源RELA的区别在于SEQ ID NO:2的氨基酸位置448、485或531中的任何一个。在一些实施方案中，同源RELA与内源RELA之间的差别包括SEQ ID NO:2的T448A、S485P或S531P氨基酸置换。
表2.同源RELA的序列
Figure GDA0003740138930000301
Figure GDA0003740138930000311
在一些实施方案中，与对照细胞、组织、器官或非人类哺乳动物相比，包含修饰的RELA的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含修饰的RELA的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对ASFV感染的抗性。
在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因包含修饰的遗传内容。在一些实施方案中，修饰的遗传内容包括本文所述的修饰的内源基因。在一些实施方案中，修饰的遗传内容包括改变本文所述的内源基因的转录物或表达水平。在一些实施方案中，修饰的遗传内容包括靶向并切割1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20种或更多种本文描述的内源基因的转录物。在一些情况下，与未修饰的相同内源基因的转录物相比，所述一种或多种修饰的内源基因的转录物减少了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％。
在一些实施方案中，修饰的遗传内容包括减少或抑制1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20种或更多种本文描述的内源基因的表达。在一些情况下，与未修饰的相同内源基因的表达相比，所述一种或多种修饰的内源基因的表达降低了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因的表达被抑制。
在一些实施方案中，与对照细胞、组织、器官或非人类哺乳动物(即，不具有所述一种或多种修饰的内源基因或修饰的遗传内容的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物)相比，所述一种或多种修饰的内源基因可以增强遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中对病毒感染的抗性，如通过病毒感染性或病毒滴度的测量所确定的。病毒抗性或病毒感染性的示例性测量可包括病毒噬斑测定、荧光聚焦测定(FFA)和终点稀释测定(TCID50)。这三种测定中的每一种都可以依靠添加到细胞中的系列病毒稀释液来测量病毒感染性。用于确定病毒抗性的其他示例性测量可以包括用于量化感染一组细胞所必需的病毒基因组或颗粒量的qPCR或ELISA。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因可增强对本文所述的任何病毒引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因可增强对由至少两个科的病毒引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因可增强对由至少三个科的病毒引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因可增强对由至少两个属的病毒引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因可增强对由至少三个属的病毒引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因可增强对由至少两个病毒株引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，所述一种或多种修饰的内源基因可以增强对由至少三个病毒株引起的病毒感染的抗性。
遗传修饰的细胞
在一些实施方案中，本文描述了携带本文所述的一种或多种内源基因的遗传修饰的遗传修饰的细胞。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞用来生成遗传修饰的组织、器官或非人类动物。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含本文所述的一种或多种修饰的内源基因的多个拷贝。例如，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含一种或更多修饰的内源基因中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30个或更多个。
在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是原代细胞。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是体细胞。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是出生后细胞。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是成体细胞。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是胎儿细胞。在一些情况下，遗传修饰的细胞是胚胎细胞(例如，胚胎卵裂球)。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是祖细胞。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是间充质干细胞。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是种系细胞。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是卵母细胞。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是合子。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是干细胞。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是胚胎干细胞。在一些情况下，遗传修饰的细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞来源于细胞系。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞来自原代细胞系。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞是肌肉细胞、皮肤细胞、血细胞或免疫细胞。用于产生遗传修饰的细胞的其他示例性细胞可包括淋巴样细胞，如B细胞、T细胞(细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节性T细胞、T辅助细胞)、自然杀伤细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞；髓样细胞，如粒细胞(嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞/超细分嗜中性粒细胞)、单核细胞/巨噬细胞、红细胞(网织红细胞)、肥大细胞、血小板/巨核细胞、树突细胞；来自内分泌系统的细胞，包括甲状腺(甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞)、甲状旁腺(甲状旁腺主细胞、Oxyphil细胞)、肾上腺(嗜铬细胞)、松果体(松果体细胞)细胞；神经系统的细胞，包括神经胶质细胞(星形胶质细胞、小神经胶质细胞)、大细胞神经分泌细胞、星状细胞、Boettcher细胞和垂体(促性腺激素细胞、促皮质激素细胞、促甲状腺素细胞、促生长激素细胞、催乳激素细胞)；呼吸系统的细胞，包括肺细胞(I型肺细胞、II型肺细胞)、克拉拉细胞、杯状细胞、尘细胞；循环系统的细胞，包括心肌细胞、周细胞；消化系统的细胞，包括胃(胃主细胞、壁细胞)、杯状细胞、Paneth细胞、G细胞、D细胞、ECL细胞、I细胞、K细胞、S细胞；肠内分泌细胞，包括肠嗜铬细胞、APUD细胞，肝脏(肝细胞、枯否细胞)，软骨/骨/肌肉；骨细胞，包括成骨细胞、骨细胞、破骨细胞、牙齿(成牙骨质细胞、成釉细胞)；软骨细胞，包括成软骨细胞、软骨细胞；皮肤细胞，包括滋养细胞(Trichocyte)、角质形成细胞、黑素细胞(痣细胞)；肌肉细胞，包括肌细胞；泌尿系统细胞，包括足细胞、近肾小球细胞、球内肾小球系膜细胞/球外肾小球系膜细胞、肾近端肾小管刷缘细胞、致密斑细胞；生殖系统细胞，包括精子、Sertoli细胞、Leydig细胞、卵子；和其他细胞，包括脂肪细胞、成纤维细胞、腱细胞、表皮角质形成细胞(分化表皮细胞)、表皮基底细胞(干细胞)、指甲和趾甲的角质形成细胞、甲床基底细胞(干细胞)、髓质毛干细胞、皮质毛干细胞、表皮毛干细胞、表皮毛根鞘细胞、Huxley层的发根鞘细胞、Henle层的发根鞘细胞、外发根鞘细胞、毛基质细胞(干细胞)、湿分层屏障上皮细胞，角膜、舌、口腔、食道、肛管、尿道远端和阴道的分层鳞状上皮的表面上皮细胞，角膜、舌、口腔、食道、肛管、尿道远端和阴道的上皮的基底细胞(干细胞)，尿道上皮细胞(内衬在膀胱和尿道内)、外分泌分泌性上皮细胞、唾液腺黏液细胞(富含多糖的分泌物)、唾液腺浆液细胞(富含糖蛋白酶的分泌物)、舌头的Von Ebner腺细胞(味蕾洗液)、乳腺细胞(乳汁分泌物)、泪腺细胞(泪液分泌物)、耳中的耵聍腺细胞(蜡分泌物)、外泌汗腺暗细胞(糖蛋白分泌物))、外泌汗腺透明细胞(小分子分泌物)、顶泌汗腺细胞(有气味的分泌物，对性激素敏感)、眼睑中的Moll细胞腺(特化的汗腺)、皮脂腺细胞(富集脂质的皮脂分泌物)、鼻腔鲍曼腺细胞(嗅上皮洗液)、十二指肠中的Brunner腺细胞(酶和碱性粘液)、精囊细胞(分泌精液成分，包括用于精子泳动的果糖)、前列腺腺细胞(分泌精液成分)、尿道球腺细胞(粘液分泌物)、Bartholin腺细胞(阴道润滑物分泌物)、Littre腺细胞(粘液分泌物)、子宫内膜细胞(碳水化合物分泌物)、呼吸道和消化道的分离的杯状细胞(粘液分泌物)、胃粘膜细胞(粘液分泌物)、胃腺产酶细胞(胃蛋白酶原分泌物)、胃腺泌酸细胞(盐酸分泌物)、胰腺腺泡细胞(碳酸氢盐和消化酶分泌物)、小肠Paneth细胞(溶菌酶分泌物)、肺的II型肺细胞(表面活性剂分泌物)、肺的克拉拉细胞、激素分泌细胞、垂体前叶细胞、促生长激素细胞、催乳激素细胞、促甲状腺素细胞、促性腺激素细胞、促皮质激素细胞、中间垂体细胞、大细胞神经分泌细胞、肠和呼吸道细胞、甲状腺细胞、甲状腺上皮细胞、滤泡旁细胞、甲状旁腺细胞、甲状旁腺主细胞、Oxyphil细胞、肾上腺细胞、嗜铬细胞、睾丸Ley dig细胞、卵巢卵泡内膜细胞、破裂卵泡的黄体细胞、粒层细胞、泡膜黄体细胞、近肾小球细胞(肾素分泌物)、肾脏致密斑细胞、新陈代谢和储藏细胞、屏障功能细胞(肺、肠、外分泌腺和泌尿生殖道)、肾脏、I型肺细胞(肺内衬空气空间)、胰管细胞(泡心细胞)、非横纹导管细胞(汗腺、唾液腺、乳腺等的)、导管细胞(精囊、前列腺等的)、内衬于封闭内腔的上皮细胞、具有推进功能的纤毛细胞、细胞外基质分泌细胞、收缩细胞；骨骼肌细胞、干细胞、心肌细胞、血液和免疫系统细胞、红细胞(红细胞)、巨核细胞(血小板前体)、单核细胞、结缔组织巨噬细胞(各种类型)、表皮朗格汉斯细胞、破骨细胞(骨骼中)、树突细胞(淋巴组织中)、小神经胶质细胞(中枢神经系统中)，血液和免疫系统(各种类型)的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、网织红细胞、干细胞和定型祖细胞，多能干细胞、全能干细胞、诱导多能干细胞、成年干细胞、感觉传感器细胞、自主神经元细胞、感觉器官和外周神经元支持细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、晶状体细胞、色素细胞、黑素细胞、视网膜色素上皮细胞、生殖细胞、卵原细胞/卵母细胞、精细胞、精母细胞、精原细胞(精母细胞干细胞)、精子、营养细胞、卵泡细胞、Sertoli细胞(睾丸中)、胸腺上皮细胞、间质细胞和间质肾细胞。
在一些实施方案中，本文所述的遗传修饰的细胞包含一种或多种遗传修饰的内源基因。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞用来产生遗传修饰的组织或器官。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞用来产生遗传修饰的非人类哺乳动物。在一些实施方案中，该遗传修饰的非人类哺乳动物是遗传修饰的偶蹄动物(有蹄类动物，如猪、绵羊或牛)。该遗传修饰的偶蹄动物可包括建立者以及建立者的后代、后代的后代等等，条件是后代保留了修饰的内源基因。在一些实施方案中，该遗传修饰的偶蹄动物是遗传修饰的猪。在一些实施方案中，该遗传修饰的猪是本文所述的猪的任何品种，例如农业猪品种。
在一些实施方案中，本文所述的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含一种或多种修饰的内源基因的修饰的染色体序列，所述内源基因编码本文所述的任何受体蛋白、肽酶蛋白、糖基转移酶蛋白、羟化酶蛋白和ISG蛋白。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含一种或多种修饰的CD163、ANPEP、GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的CD163。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的ANPEP。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的GGTA1。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的CMAH。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的B4GALNT2。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的GGTA1、CMAH和B4GALNT2。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的RELA。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的CD163、修饰的ANPEP、修饰的GGTA1、修饰的CMAH、修饰的B4GALNT2和修饰的RELA。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的CD163、修饰的ANPEP、修饰的GGTA1、修饰的CMAH和修饰的B4GALNT2。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的CD163、修饰的ANPEP和修饰的RELA。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的CD163和修饰的ANPEP。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的CD163、修饰的GGTA1、修饰的CMAH和修饰的B4GALNT2。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的CD163和修饰的RELA。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的ANPEP、修饰的GGTA1、修饰的CMAH和修饰的B4GALNT2。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的ANPEP和修饰的RELA。
在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含CD163敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含ANPEP敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含GGTA1敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含CMAH敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含B4GALNT2敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含RELA敲入。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含CD163敲除、ANPEP敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除、B4GALNT2敲除和RELA敲入。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含CD163敲除、ANPEP敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含CD163敲除、ANPEP敲除和RELA敲入。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含CD163基因敲除和ANPEP基因敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含CD163敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含CD163敲除和RELA敲入。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含ANPEP敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含ANPEP敲除和RELA敲入。
在一些实施方案中，遗传修饰的非人类哺乳动物是本文所述的任何猪品种的遗传修饰的猪。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的CD163。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的ANPEP。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的GGTA1。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的CMAH。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的B4GALNT2。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的GGTA1、修饰的CMAH和修饰的B4GALNT2。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的RELA。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的CD163、修饰的ANPEP、修饰的GGTA1、修饰的CMAH、修饰的B4GALNT2和修饰的RELA。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的CD163、修饰的ANPEP、修饰的GGTA1、修饰的CMAH和修饰的B4GALNT2。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的CD163、修饰的ANPEP和修饰的RELA。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的CD163和修饰的ANPEP。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的CD163、修饰的GGTA1、修饰的CMAH和修饰的B4GALNT2。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的CD163和修饰的RELA。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的ANPEP、修饰的GGTA1、修饰的CMAH和修饰的B4GALNT2。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含修饰的ANPEP和修饰的RELA。
在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含CD163敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含ANPEP敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含GGTA1敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含CMAH敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含B4GALNT2敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含GGTA1敲除、CMA敲除和B4GALNT2敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含RELA敲入。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含CD163敲除、ANPEP敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除、B4GALNT2敲除和RELA敲入。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含CD163敲除、ANPEP敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含CD163敲除、ANPEP敲除和RELA敲入。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含CD163敲除和ANPEP敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含CD163敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含CD163敲除和RELA敲入。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含ANPEP敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除。在一些实施方案中，遗传修饰的猪包含ANPEP敲除和RELA敲入。
在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含含有至少一种异源多核苷酸和/或至少一种异源多肽的组合物。在一些实施方案中，该异源多核苷酸编码至少一种异源多肽。在一些实施方案中，该异源多核苷酸编码至少一个指导核酸。在一些实施方案中，该异源多核苷酸整合到染色体中。在一些实施方案中，所述外源多核苷酸没有整合到染色体中。在一些实施方案中，该异源多肽包含基因调节部分。在一些实施方案中，该基因调节部分与至少一个指导核酸复合以修饰如本文所述的一种或多种内源基因的染色体序列。在一些实施方案中，该基因调节部分与至少一个指导核酸复合以靶向本文所述的一种或多种内源基因。在一些实施方案中，该基因调节部分与至少一个指导核酸复合以靶向一种或多种内源基因的转录物。在一些实施方案中，该基因调节部分与至少一个指导核酸复合以调节一种或多种内源基因的表达。
在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含修饰的遗传内容。在一些实施方案中，修饰的遗传内容包括本文所述的一种或多种内源基因的修饰的染色体序列。在一些实施方案中，修饰的遗传内容包括改变本文所述的一种或多种内源基因的转录物或表达水平。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含一种或多种包含基因调节部分的异源多肽。在一些实施方案中，该基因调节部分是核酸指导的核酸酶。在一些实施方案中，该核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割本文所述的任何一种内源基因的转录物。在一些实施方案中，该核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割本文所述的至少两种内源基因的转录物。在一些实施方案中，该核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割本文所述的至少三种内源基因的转录物。在一些实施方案中，该核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割本文所述的至少四种内源基因的转录物。在一些实施方案中，该核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割本文所述的至少五种内源基因的转录物。在一些实施方案中，该核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20种或更多种本文所述的内源基因的转录物。在一些实施方案中，该核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割一种或多种内源基因的转录物。在一些实施方案中，与不被核酸指导的核酸酶靶向并切割的一种或多种内源基因的转录物相比，所述一种或多种内源基因的转录物被核酸指导的核酸酶靶向、切割并减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％。
在一些情况下，将第一核酸指导的核酸酶与第一指导核酸复合以靶向并切割第一转录物，而将第二核酸指导的核酸酶与第二指导核酸复合以靶向并切割第二转录物。如本文提供的，第一核酸指导的核酸酶和第二核酸指导的核酸酶可以是相同类型或不同类型的核酸酶。第一指导核酸和第二指导核酸可以相同或不同。第一转录物和第二转录物可以是相同内源基因或不同内源基因的部分。在一些实例中，细胞可以包含或表达第一指导核酸和第二指导核酸两者，例如，用于多重化靶向一种或多种靶内源基因。
在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割任何一种CD163、ANPEP、GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA的转录物。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割CD163的转录物。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割ANPEP的转录物。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割GGTA1的转录物。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割CMAH的转录物。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割B4GALNT2的转录物。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割RELA的转录物。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割CD163的转录物，以赋予遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中增强的对PRRSV引起的感染的抗性。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割CD163的转录物，以赋予遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中增强的对ASFV引起的感染的抗性。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割CD163的转录物，以赋予遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中增强的对PRRSV和ASFV引起的感染的抗性。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割CD163和ANPEP的转录物，以赋予遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中增强的对PRRSV和TGEV引起的感染的抗性。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割CD163和ANPEP的转录物，以赋予遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中增强的对PRRSV和TGEV引起的感染的抗性。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割CD163和ANPEP的转录物，以赋予遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中增强的对PRRSV、ASFV和TGEV引起的感染的抗性。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割CD163、GGTA1、CMAH和B4GALNT2的转录物，以赋予遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中增强的对PRRSV和ASFV引起的感染的抗性。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割CD163和RELA的转录物，以赋予遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中增强的对PRRSV和ASFV引起的感染的抗性。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割ANPEP、GGTA1、CMAH和B4GALNT2的转录物，以赋予遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中增强的对TGEV和ASFV引起的感染的抗性。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割ANPEP和RELA的转录物，以赋予遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中增强的对TGEV和ASFV引起的感染的抗性。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割CD163、ANPEP、GGTA1、CMAH和B4GALNT2的转录物，以赋予遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中增强的对PRRSV、TGEV和ASFV引起的感染的抗性。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合以靶向并切割CD163、ANPEP和RELA的转录物，以赋予遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中增强的对PRRSV、TGEV和ASFV引起的感染的抗性。
核酸指导的核酸酶的实例可包括1类CRISPR相关(Cas)多肽、2类Cas多肽、I型Cas多肽、II型Cas多肽、III型Cas多肽、IV型Cas多肽、V型Cas多肽、VI型Cas多肽、CRISPR相关的RNA结合蛋白或其功能片段。适用于本公开的Cas多肽可包括Cas9、Cas12、Cas13、Cpf1(或Cas12a)、C2C1、C2C2(或Cas13a)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2C3、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Csnl、Csxl2、Cas10、Cas10d、CaslO、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4或Cul966；其任何衍生物；其任何变体；或其任何片段。在一些实施方案中，Cas13可以包括但不限于Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas 13d(例如，CasRx)。CRISPR/Cas是切割DNA和/或RNA的，或表现出降低的切割活性。
在一些情况下，核酸指导的核酸酶是失活的核酸酶，其中核酸指导的核酸酶的核酸酶活性至少部分失活。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与本文所述的另一种基因调节部分融合。在一些实施方案中，该基因调节部分可以减少或抑制本文所述的一种或多种内源基因的表达。在一些实施方案中，该基因调节部分可以减少或抑制本文所述的至少两种内源基因的表达。在一些实施方案中，该基因调节部分可以减少或抑制本文所述的至少三种内源基因的表达。在一些实施方案中，该基因调节部分可以减少或抑制本文所述的至少四种内源基因的表达。在一些实施方案中，该基因调节部分可以减少或抑制本文所述的至少五种内源基因的表达。在一些实施方案中，该基因调节部分可以减少或抑制本文所述的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20种或更多种内源基因的表达。在一些实施方案中，该基因调节部分可以减少或抑制本文所述的一种或多种内源基因的表达。在一些实施方案中，与不被基因调节部分靶向的一种或多种内源基因的表达相比，所述一种或多种内源基因的表达被基因调节部分靶向并降低了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％。在一些实施方案中，所述一种或多种内源基因的表达被基因调节部分抑制。
在一些实施方案中，所述至少一种异源多核苷酸编码至少一个指导核酸，所述指导核酸可以靶向本文所述的任何一种病毒的病毒基因组、病毒基因，或者病毒基因组或病毒基因的转录物。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含含有异源多肽的组合物，该异源多肽包含与至少一个指导核酸复合的核酸指导的核酸酶，以靶向并切割本文所述的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20种或更多种病毒的病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组或病毒基因的转录物。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合，以靶向并切割至少一种病毒的病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组或病毒基因的转录物。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合，以靶向并切割至少两种病毒的病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组或病毒基因的转录物。在一些实施方案中，核酸指导的核酸酶与至少一个指导核酸复合，以靶向并切割至少三种病毒的病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组或病毒基因的转录物。在一些实施方案中，与未被核酸指导的核酸酶靶向并切割的相同病毒基因组、病毒基因的转录物或者病毒基因组或病毒基因的转录物或相比，病毒基因组、病毒基因的转录物或者病毒基因组或病毒基因的转录物被核酸指导的核酸酶靶向、切割并减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或99.9％。
在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物包含组合物，该组合物包含与至少一个指导核酸复合以减少或抑制本文所述的一种或多种病毒的病毒基因组或病毒基因表达的基因调节部分。在一些实施方案中，基因调节部分可以减少或抑制本文所述的至少两种病毒的表达。在一些实施方案中，基因调节部分可以减少或抑制本文所述的至少三种病毒的表达。在一些实施方案中，基因调节部分可以减少或抑制本文所述的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20种或更多种病毒的表达。在一些实施方案中，与不被基因调节部分靶向的相同的一种或多种病毒的表达相比，所述一种或多种病毒的表达被基因调节部分靶向并降低了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、95％、99％或99.9％。在一些实施方案中，所述一种或多种病毒的表达被基因调节部分抑制。
在一些实施方案中，如通过病毒感染性或病毒滴度的测量所确定的，与对照细胞、组织、器官或非人类哺乳动物相比，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的病毒抗性。病毒抗性或病毒感染性的示例性测量可包括病毒噬斑测定、荧光聚焦测定(FFA)和终点稀释测定(TCID50)。这三种测定中的每一种都可以依靠添加到细胞中的系列病毒稀释液来测量病毒的感染性。用于确定病毒抗性的其他示例性测量可包括用于量化感染一组细胞所必需的病毒基因组或颗粒量的qPCR或ELISA。
在一些实施方案中，与对照细胞、组织、器官或非人类哺乳动物相比，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强至少约0.1倍至约10,000倍的对病毒感染的抗性。在一些实施方案中，与对照细胞、组织、器官或非人类哺乳动物相比，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对病毒感染的抗性，该增强是至少约0.1倍至约0.2倍、约0.1倍至约0.5倍、约0.1倍至约1倍、约0.1倍至约2倍、约0.1倍至约5倍、约0.1倍至约10倍、约0.1倍至约50倍、约0.1倍至约100倍、约0.1倍至约500倍、约0.1倍至约1,000倍、约0.1倍至约10,000倍、约0.2倍至约0.5倍、约0.2倍至约1倍、约0.2倍至约2倍、约0.2倍至约5倍、约0.2倍至约10倍、约0.2倍至约50倍、约0.2倍至约100倍、约0.2倍至约500倍、约0.2倍至约1,000倍、约0.2倍至约10,000倍、约0.5倍至约1倍、约0.5倍至约2倍、约0.5倍至约5倍、约0.5倍至约10倍、约0.5倍至约50倍、约0.5倍至约100倍、约0.5倍至约500倍、约0.5倍至约1,000倍、约0.5倍至约10,000倍、约1倍至约2倍、约1倍至约5倍、约1倍至约10倍、约1倍至约50倍、约1倍至约100倍、约1倍至约500倍、约1倍至约1,000倍、约1倍至约10,000倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约50倍、约2倍至约100倍、约2倍至约500倍、约2倍至约1,000倍、约2倍至约10,000倍、约5倍至约10倍、约5倍至约50倍、约5倍至约100倍、约5倍至约500倍、约5倍至约1,000倍、约5倍至约10,000倍、约10倍至约50倍、约10倍至约100倍、约10倍至约500倍、约10倍至约1,000倍、约10倍至约10,000倍、约50倍至约100倍、约50倍至约500倍、约50倍至约1,000倍、约50倍至约10,000倍、约100倍至约500倍、约100倍至约1,000倍、约100倍至约10,000倍、约500倍至约1,000倍、约500倍至约10,000倍或约1,000倍至约10,000倍。在一些实施方案中，与对照细胞、组织、器官或非人类哺乳动物相比，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强至少约0.1倍、约0.2倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍的对病毒感染的抗性。在一些实施方案中，与对照细胞、组织、器官或非人类哺乳动物相比，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强至少约0.1倍、约0.2倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约50倍、约100倍、约500倍或约1000倍的对病毒感染的抗性。在一些实施方案中，与对照细胞、组织、器官或非人类哺乳动物相比，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强至少至多约0.2倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约50倍、约100倍、约500倍、约1,000倍或约10,000倍的对病毒感染的抗性。
在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由来自至少一个病毒科的病毒引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，该病毒感染是由来自至少两个病毒科的病毒引起的。在一些实施方案中，该病毒感染是由来自至少三个病毒科的病毒引起的。在一些实施方案中，该病毒感染是由来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个病毒科的病毒引起的。病毒科的非限制性实例可包括阿比索病毒科(Abyssoviridae)、阿克曼病毒科(Ackermannviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、甲弯曲病毒科(Alphaflexiviridae)、Alphasatellitidae、Alphatetraviridae、Alvernaviridae、Amalgaviridae、Amnoonviridae、Ampullaviridae、指环病毒科(Anelloviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、动脉病毒科(Arteriviridae)、Artoviridae、鳞翅目昆虫病毒科(Ascoviridae)、非洲猪瘟病病毒科(Asfarviridae)、Aspiviridae、星状病毒科(Astroviridae)、鳄梨白斑类病毒科(Avsunviroidae)、Bacilladnaviridae、杆状病毒科(Baculoviridae)、杆状RNA病毒科(Barnaviridae)、Belpaoviridae、Benyviridae、Betaflexiviridae、Bicaudaviridae、Bidnaviridae、Birnaviridae、Bornaviridae、Botourmiaviridae、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、嵌杯病毒科(Caliciviridae)、Carmotetraviridae、花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)、Chrysoviridae、Chuviridae、圆环病毒科(Circoviridae)、Clavaviridae、线形病毒科(Closteroviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、被脂病毒科(Corticoviridae)、Cruliviridae、囊病毒科(Cystoviridae)、Deltaflexiviridae、Dicistroviridae、Endornaviridae、Euroniviridae、纤丝病毒科(Filoviridae)、Fimoviridae、黄病毒科(Flaviviridae)、福塞尔噬菌体科(Fuselloviridae)、Gammaflexiviridae、双粒病毒科(Geminiviridae)、Genomoviridae、Globuloviridae、古老病毒科(Guttaviridae)、Hantaviridae、嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)、Hepeviridae、Herelleviridae、疱疹病毒科(Herpesviridae)、减毒病毒科(Hypoviridae)、Hytrosaviridae、Iflaviridae、丝杆病毒科(Inoviridae)、虹膜病毒科(Iridoviridae)、Kitaviridae、Lavidaviridae、Leishbuviridae、轻病毒科(Leviviridae)、脂毛病毒科(Lipothrixviridae)、Lispiviridae、黄矮病毒科(Luteoviridae)、Malacoherpesviridae、Marnaviridae、Marseilleviridae、Matonaviridae、Medioniviridae、Megabirnaviridae、Mesoniviridae、转座病毒科(Metaviridae)、轻病毒科(Microviridae)、Mimiviridae、Mononiviridae、Mymonaviridae、肌病毒科(Myoviridae)、Mypoviridae、Nairoviridae、矮缩病毒科(Nanoviridae)、裸露RNA病毒科(Narnaviridae)、Nimaviridae、野田村病毒科(Nodaviridae)、Nudiviridae、Nyamiviridae、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、Ovaliviridae、Papillomaviridae、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、分体病毒科(Partitiviridae)、微小病毒科(Parvoviridae)、Peribunyaviridae、Permutotetraviridae、Phasmaviridae、Phenuiviridae、Phycodnaviridae、Picobirnaviridae、细小RNA病毒科(Picornaviridae)、Plasmaviridae、Pleolipoviridae、肺泡病毒科(Pneumoviridae)、短尾病毒科(Podoviridae)、Polycipiviridae、多DNA病毒科(Polydnaviridae)、多瘤病毒科(Polyomaviridae)、Portogloboviridae、马铃薯纺锤形块茎类病毒科(Pospiviroidae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、假病毒科(Pseudoviridae)、Qinviridae、Quadriviridae、呼肠病毒科(Reoviridae)、逆转录病毒科Retroviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、杆状套病毒科(Roniviridae)、棒状DNA病毒科(Rudiviridae)、Sarthroviridae、Secoviridae、管状病毒科(Siphoviridae)、Smacoviridae、Solemoviridae、Solinviviridae、Sphaerolipoviridae、Spiraviridae、Sunviridae、覆盖层病毒科(Tectiviridae)、Tobaniviridae、披膜病毒科(Togaviridae)、Tolecusatellitidae、蕃茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、Tospoviridae、全病毒科(Totiviridae)、Tristromaviridae、Turriviridae、芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)、Virgaviridae、Wupedeviridae、Xinmoviridae或Yueviridae。
在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由来自至少一个病毒属的病毒引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，该病毒感染是由来自至少两个病毒属的病毒引起的。在一些实施方案中，该病毒感染是由来自至少三个病毒属的病毒引起的。在一些实施方案中，该病毒感染是由来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个病毒属的病毒引起的。病毒属的非限制性实例可包括Aalivirus、Abidjanvirus、Abouovirus、Acadianvirus、Actinovirus、Agatevirus、Ageyesisatellite、Agnathovirus、Agricanvirus、Agtrevirus、Ahduovirus、Ailurivirus、Albetovirus、Alcyoneusvirus、Alefpapillomavirus、苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)、青葱病毒属(Allexivirus)、异轻病毒属(Allolevivirus)、Almendravirus、Alphaabyssovirus、Alphaarterivirus、甲型杆状病毒属(Alphabaculovirus)、Alphacarmotetravirus、Alphacarmovirus、Alphachrysovirus、Alphacoronavirus、Alphaendornavirus、Alphaentomopoxvirus、Alphafusellovirus、Alphaguttavirus、Alphainfluenzavirus、Alphaletovirus、Alphamesonivirus、Alphamononivirus、Alphanecrovirus、Alphanemrhavirus、Alphanodavirus、Alphanudivirus、Alphaovalivirus、α乳头状瘤病毒属(Alphapapillomavirus)、Alphapartitivirus、Alphapermutotetravirus、Alphapleolipovirus、Alphapolyomavirus、Alphaportoglobovirus、Alpharetrovirus、Alphasphaerolipovirus、Alphaspiravirus、Alphatectivirus、甲型细环病毒属(Alphatorquevirus)、Alphatrevirus、Alphatristromavirus、Alphaturrivirus、甲病毒属(Alphavirus)、Amalgavirus、Ambidensovirus、Amdoparvovirus、Amigovirus、葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)、Ampivirus、Ampullavirus、Anativirus、Anatolevirus、Andromedavirus、Anphevirus、Antennavirus、Anulavirus、Aparavirus、Aphroditevirus、口蹄疫病毒属(Aphthovirus)、苹果北美疤类病毒属(Apscaviroid)、水生生物双片段RNA病毒属(Aquabirnavirus)、Aqualcavirus、Aquamavirus、Aquaparamyxovirus、水生动物呼肠孤病毒属(Aquareovirus)、Arequatrovirus、Arlivirus、鳞翅目昆虫病毒属(Ascovirus)、非洲猪瘟病病毒属(Asfivirus)、Asteriusvirus、鸟类腺病毒属(Atadenovirus)、Attisvirus、Aumaivirus、金病毒属(Aureusvirus)、Aurivirus、Avastrovirus、燕麦病毒属(Avenavirus)、Aveparvovirus、禽腺病毒属(Aviadenovirus)、禽双片段RNA病毒属(Avibirnavirus)、禽嗜肝DNA病毒属(Avihepadnavirus)、Avihepatovirus、禽痘病毒属(Avipoxvirus)、Avisivirus、Avsunviroid、Avunavirus、Babusatellite、香蕉顶束病毒属(Babuvirus)、Bacillarnavirus、Badnavirus、Bafinivirus、巴尔的摩病毒属(Baltimorevirus)、Bantamvirus、Banyangvirus、Barnavirus、Barnyardvirus、Bastillevirus、Batrachovirus、Bavovirus、Baxtervirus、Bcepmuvirus、Bdellomicrovirus、Becurtovirus、Beetrevirus、菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)、Beidivirus、Bendigovirus、甜菜坏死黄脉病毒属(Benyvirus)、Bequatrovirus、Berhavirus、Bernalvirus、猪繁殖与呼吸综合征病毒、乙型杆状病毒属(Betabaculovirus)、Betacarmovirus、Betachrysovirus、Betacoronavirus、Betaendornavirus、Betaentomopoxvirus、Betafusellovirus、Betaguttavirus、Betainfluenzavirus、Betalipothrixvirus、Betanecrovirus、Betanodavirus、Betanudivirus、Betapapillomavirus、Betapartitivirus、Betapleolipovirus、β多瘤病毒属(Betapolyomavirus)、β逆转录病毒属(Betaretrovirus)、Betasatellite、Betasphaerolipovirus、Betatectivirus、Betatetravirus、Betatorquevirus、Betterkatzvirus、Bevemovirus、Bicaudavirus、双生浓核病毒属(Bidensovirus)、Bifseptvirus、Bignuzvirus、Bingvirus、Biquartavirus、Biseptimavirus、Bixzunavirus、Bjornvirus、Blosnavirus、Blunervirus、Bocaparvovirus、Bolenivirus、Bongovirus、Bopivirus、Bostovirus、Botoulivirus、Botrexvirus、Botybirnavirus、Bovismacovirus、Bovispumavirus、Bowservirus、茧蜂病毒属(Bracovirus)、Brambyvirus、短颈浓核病毒属(Brevidensovirus)、Britbratvirus、雀麦草花叶病毒属(Bromovirus)、Bronvirus、Brujitavirus、Brunovirus、Brussowvirus、Bruynoghevirus、Busanvirus、Buttersvirus、大麦黄化花叶病毒属(Bymovirus)、Caeruleovirus、Cafeteriavirus、Caligrhavirus、Camvirus、毛状病毒属(Capillovirus)、山羊痘病毒属(Capripoxvirus)、Capulavirus、Carbovirus、心病毒属(Cardiovirus)、Cardoreovirus、石竹隐潜病毒属(Carlavirus)、Casadabanvirus、花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)、Cavemovirus、Cbastvirus、Cecivirus、Ceduovirus、Ceetrepovirus、Centapoxvirus、Cepunavirus、Cequinquevirus、Certrevirus、Cervidpoxvirus、Cetovirus、Chakrabartyvirus、Charlievirus、Charybnivirus、Chenonavirus、Cheoctovirus、Cheravirus、Chiangmaivirus、Chipapillomavirus、Chipolycivirus、Chivirus、衣原体微小噬菌体属(Chlamydiamicrovirus)、绿色虹彩病毒属(Chloriridovirus)、绿藻病毒属(Chlorovirus)、Chordovirus、Chungbukvirus、Chunghsingvirus、Cilevirus、Cimpunavirus、Cinunavirus、圆环病毒属(Circovirus)、柑橘病毒属(Citrivirus)、Clavavirus、Clecrusatellite、线形病毒属(Closterovirus)、Clostunsatellite、Cocadviroid、颗石藻病毒属(Coccolithovirus)、Coetzeevirus、Coguvirus、Colecusatellite、锦紫苏类病毒属(Coleviroid)、科蜱病毒属(Coltivirus)、豇豆花叶病毒属(Comovirus)、Coopervirus、Copiparvovirus、Corndogvirus、Cornellvirus、被脂病毒属(Corticovirus)、Cosavirus、Cosmacovirus、线性病毒属(Crinivirus)、Cripavirus、Crocodylidpoxvirus、Crohivirus、Cronusvirus、Crustavirus、隐孢子病毒属(Cryspovirus)、黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)、Cuevavirus、Cultervirus、Curiovirus、曲顶病毒属(Curtovirus)、Cyclovirus、质型多角体病毒属(Cypovirus)、Cyprinivirus、囊状病毒属(Cystovirus)、巨细胞病毒属(Cytomegalovirus)、质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)、Decapodiridovirus、Decurrovirus、Delepquintavirus、Deltaarterivirus、丁型杆状病毒属(Deltabaculovirus)、Deltacoronavirus、Deltaflexivirus、Deltainfluenzavirus、Deltalipothrixvirus、Deltapapillomavirus、Deltapartitivirus、Deltapolyomavirus、δ逆转录病毒属(Deltaretrovirus)、Deltasatellite、Deltatorquevirus、δ病毒属(Deltavirus)、Demosthenesvirus、Dependoparvovirus、Detrevirus、Dhakavirus、Dhillonvirus、香石竹病毒属(Dianthovirus)、Diatodnavirus、Dichorhavirus、Dicipivirus、Diegovirus、Dinodnavirus、Dinornavirus、Dinovernavirus、Dismasvirus、Divavirus、Doucettevirus、Dragsmacovirus、Drosmacovirus、Drulisvirus、Dyochipapillomavirus、Dyodeltapapillomavirus、Dyoepsilonpapillomavirus、Dyoetapapillomavirus、Dyoiotapapillomavirus、Dyokappapapillomavirus、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在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由来自至少一个病毒株的病毒引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，该病毒感染是由来自至少两个病毒株的病毒引起的。在一些实施方案中，该病毒感染由来自至少三个病毒株的病毒引起。在一些实施方案中，该病毒感染是由来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个病毒株的病毒引起的。病毒株的非限制性实例可包括非洲猪瘟病毒(ASFV)、古典猪瘟病毒、口蹄疫病毒、戊型肝炎病毒、流感病毒、甲型流感病毒、副流感病毒、猪环状病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传播性胃肠炎病毒(TGEV)、猪疱疹病毒1、水疱性口炎病毒(VSV)、Nipah病毒、肠病毒、猪小泡病病毒、日本乙型脑炎病毒、疱疹病毒、输血传播病毒(torque teno virus)(TTV1和TTV2)、副粘病毒、Ebola Reston病毒、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV)、巨细胞病毒、狂犬病病毒、猪水疱性疱疹病毒、瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、脑心肌炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒、猪Teschen病毒、假性狂犬病病毒、Getah病毒、Menangle病毒、猪sapelovirus、猪rubulavirus、Seneca Valley病毒、猪细小病毒、猪三角冠状病毒、猪副流感1型病毒、非典型猪瘟病毒、丙型流感病毒、猪呼吸道冠状病毒、脑心肌炎病毒、猪腺病毒、猪嵴病毒、正呼肠病毒、仙台病毒、猪巨细胞病毒、猪札幌病毒、切昆贡亚病毒、猪博卡病毒、猪星状病毒、猪痘病毒、轮环曲病毒或猪乳头瘤病毒。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由PRRSV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出对增强的由ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由TGEV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由PRRSV、ASFV和TGEV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由PRRSV和ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由PRRSV和TGEV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由ASFV和TGEV引起的病毒感染的抗性。
在一些实施方案中，遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由至少一种病毒株引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除、ANPEP敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由PRRSV、TGEV和ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除、ANPEP敲除和RELA敲入的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由PRRSV、TGEV和ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由PRRSV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由PRRSV和ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除和ANPEP敲除的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由PRRSV和TGEV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除和ANPEP敲除的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由ASFV和TGEV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除和ANPEP敲除的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由PRRSV、ASFV和TGEV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由PRRSV和ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除和RELA敲入的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对PRRSV和ASFV的抗性。在一些实施方案中，包含ANPEP敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由TGEV和ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含ANPEP敲除和RELA敲入的遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物表现出增强的对由TGEV和ASFV引起的病毒感染的抗性。
在一些实施方案中，包含CD163敲除、ANPEP敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除的遗传修饰的猪表现出增强的对由PRRSV、TGEV和ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除、ANPEP敲除和RELA敲入的遗传修饰的猪表现出增强的对由PRRSV、TGEV和ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除的遗传修饰的猪表现出增强的对由PRRSV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除的遗传修饰的猪表现出增强的对由ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除的遗传修饰的猪表现出增强的对由PRRSV和ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除和ANPEP敲除的遗传修饰的猪表现出增强的对由PRRSV和TGEV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除和ANPEP敲除的遗传修饰的猪表现出增强的对由ASFV和TGEV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除和ANPEP敲除的遗传修饰的猪表现出增强的对由PRRSV、ASFV和TGEV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包括CD163敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除的遗传修饰的猪表现出增强的对由PRRSV和ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含CD163敲除和RELA敲入的遗传修饰的猪表现出增强的对PRRSV和ASFV的抗性。在一些实施方案中，包含ANPEP敲除、GGTA1敲除、CMAH敲除和B4GALNT2敲除的遗传修饰的猪表现出增强的对由TGEV和ASFV引起的病毒感染的抗性。在一些实施方案中，包含ANPEP敲除和RELA敲入的遗传猪表现出增强的对由TGEV和ASFV引起的病毒感染的抗性。
用于修饰内源基因的组合物
在一些实施方案中，本文描述了用于修饰一种或多种内源基因的组合物。在一些实施方案中，本文还描述了用于靶向并切割一种或多种本文所述的内源基因或一种或多种内源基因的转录物的组合物。在一些实施方案中，该组合物可以减少或抑制本文所述的一种或多种内源基因的表达。在一些实施方案中，本文还描述了用于靶向并切割病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组和病毒基因的转录物的组合物。在一些实施方案中，该组合物降低或抑制病毒基因组或病毒基因的表达。在一些实施方案中，靶向、切割或降解的病毒基因组、病毒基因或病毒转录物是脱氧核糖核酸(DNA)。在一些情况下，该DNA是单链或双链的。在一些实施方案中，靶向、切割或降解的病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组和病毒基因的转录物是核糖核酸(RNA)。在一些情况下，该RNA是mRNA、rRNA、SRP RNA、tRNA、tmRNA、snRNA、snoRNA、gRNA、aRNA、crRNA、lncRNA、miRNA、ncRNA、piRNA、siRNA或shRNA。在一些实施方案中，靶RNA是mRNA。
在一些实施方案中，本文所述的组合物可以靶向并结合靶基因组、基因或转录物的至少一个位点。在一些实施方案中，该组合物可通过点突变、插入、缺失、移码、易位、重复、倒位、非同源末端连接(NHEJ)、同源性指导的修复(HDR)、灭活、破坏、切除一部分或其组合，修饰一种或多种内源基因的染色体序列。在一些实施方案中，本文所述的组合物可靶向并结合靶基因组、基因或转录物的至少一个基因座，以进行切割或降解。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法靶向并结合的内源基因、病毒基因组或病毒基因的染色体序列的基因座在5nt至100nt之间。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法靶向并结合的基因组、基因或转录物的基因座为5个核苷酸(nt)至10nt、5nt至15nt、5nt至20nt、5nt至25nt、5nt至30nt、5nt至40nt、5nt至50nt、5nt至60nt、5nt至70nt、5nt至80nt、5nt至100nt、10nt至15nt、10nt至20nt、10nt至25nt、10nt至30nt、10nt至40nt、10nt至50nt、10nt至60nt、10nt至70nt、10nt至80nt、10nt至100nt、15nt至20nt、15nt至25nt、15nt至30nt、15nt至40nt、15nt至50nt、15nt至60nt、15nt至70nt、15nt至80nt、15nt至100nt、20nt至25nt、20nt至30nt、20nt至40nt、20nt至50nt、20nt至60nt、20nt至70nt、20nt至80nt、20nt至100nt、25nt至30nt、25nt至40nt、25nt至50nt、25nt至60nt、25nt至70nt、25nt至80nt、25nt至100nt、30nt至40nt、30nt至50nt、30nt至60nt、30nt至70nt、30nt至80nt、30nt至100nt、40nt至50nt、40nt至60nt、40nt至70nt、40nt至80nt、40nt至100nt、50nt至60nt、50nt至70nt、50nt至80nt、50nt至100nt、60nt至70nt、60nt至80nt、60nt至100nt、70nt至80nt、70nt至100nt或80nt至100nt。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法靶向并结合的基因组、基因或转录物的基因座包含至少约5nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、40nt、50nt、60nt、70nt、80nt、100nt或更多。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法靶向并结合的病毒基因组或病毒基因的基因座包含约5nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、40nt、50nt、60nt、70nt或80nt。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法靶向并结合的病毒基因组或病毒基因的基因座包含至多约100nt、90nt、80nt、70nt、60nt、50nt、40nt、30nt、25nt、20nt、15nt、10nt、5nt或更少。
在一些实施方案中，所述组合物包含至少一种异源多肽。在一些情况下，该异源多肽包含至少一种基因调节部分，以调节一种或多种内源基因的表达。在一些实施方案中，本文所述的组合物包含基因调节部分，以调节一种或多种病毒基因组或病毒基因的表达。在一些实施方案中，该基因调节部分包含CRISPR-Cas多肽。在一些实施方案中，该基因调节部分可以是例如1类CRISPR相关(Cas)多肽、2类Cas多肽、I型Cas多肽、II型Cas多肽、III型Cas多肽、IV型Cas多肽、V型Cas多肽、VI型Cas多肽、CRISPR相关的RNA结合蛋白或其功能片段。适用于本公开的Cas多肽可包括Cas9、Cas12、Cas13、Cpf1(或Cas12a)、C2C1、C2C2(或Cas13a)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2C3、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Csnl、Csxl2、Cas10、Cas10d、CaslO、CaslOd、CasF、CasG、CasH、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4或Cul966；其任何衍生物；任何变体；或其任何片段。在一些实施方案中，Cas13可包括但不限于Cas13a、Cas13b、Cas13c和Cas 13d(例如，CasRx)。CRISPR/Cas可以是切割DNA和/或RNA的，或者可以表现出降低的切割活性。基因调节部分可以被配置为与至少一种异源RNA多核苷酸复合。基因调节部分可以被配置为与至少一个指导核酸复合。基因调节部分可以被配置为与至少一个指导核酸复合以靶向并切割本文所述的一种或多种内源基因的转录物。基因调节部分可以被配置为与至少一个指导核酸复合以靶向并切割本文所述的一种或多种病毒基因组或病毒基因的转录物。在一些情况下，基因调节部分可以与转录激活物或转录阻抑物融合。
任何合适的核酸酶(例如，内切核酸酶)都可以用作基因调节部分。合适的核酸酶包括但不限于CRISPR相关的(Cas)蛋白或Cas核酸酶，包括I型CRISPR相关(Cas)多肽、II型CRISPR相关(Cas)多肽、III型CRISPR相关(Cas)多肽、IV型CRISPR相关(Cas)多肽、V型CRISPR相关(Cas)多肽和VI型CRISPR相关(Cas)多肽；锌指核酸酶(ZFN)；转录激活物样效应核酸酶(TALEN)；大范围核酸酶RNA结合蛋白(RBP)；CRISPR相关RNA结合蛋白；重组酶；翻转酶；转座酶；Argonaute(Ago)蛋白(例如原核Argonaute(pAgo)、古菌Argonaute(aAgo)、真核Argonaute(eAgo)和格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAgo))；作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)；CIRT、PUF、归巢内切核酸酶，或其任何功能片段、其任何衍生物；其任何变体；及其任何片段。
在一些实施方案中，本文公开的核酸指导的核酸酶可以是缺乏核酸切割活性的失活的核酸酶。在一些情况下，Cas蛋白可以是无效的Cas蛋白。无效的Cas蛋白可以是缺乏核酸切割活性的蛋白质。Cas蛋白可包含野生型Cas蛋白的修饰形式。野生型Cas蛋白的修饰形式可包含降低Cas蛋白的核酸切割活性的氨基酸变化(例如，缺失、插入或置换)。例如，Cas蛋白的修饰形式可具有野生型Cas蛋白(例如，酿脓链球菌的Cas9)的小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％的核酸切割活性。Cas蛋白的修饰形式可以不具有实质的核酸切割活性。当Cas蛋白是没有实质的核酸切割活性的修饰形式时，其可以被称为无酶活性和/或“无效的”(缩写为“d”)。无效的Cas蛋白(例如dCas、dCas9)可以与靶多核苷酸结合，但不能切割靶多核苷酸。在一些方面，无效的Cas蛋白可以是无效的Cas9蛋白。
在一些实施方案中，dCas(例如，dCas9)多肽可以与单个向导RNA(sgRNA)缔合以激活或抑制靶DNA的转录。可以将sgRNA引入表达工程化嵌合受体多肽的细胞中。在一些情况下，此类细胞包含靶向相同核酸的一种或多种不同的sgRNA。在其他情况下，sgRNA靶向细胞中的不同核酸。
在一些实施方案中，基因调节部分可包含无催化活性的Cas多肽，其中Cas多肽的核酸酶活性被消除或基本消除。
在一些情况下，基因调节部分可包含无催化活性的Cas9(dCas9)、其任何衍生物；其任何变体；或其任何片段。
在一些情况下，基因调节部分可包含无催化活性的Cas12(dCas12)、其任何衍生物；其任何变体；或其任何片段。
在一些情况下，基因调节部分可包含无催化活性的Cas13(dCas13)、其任何衍生物；其任何变体；或其任何片段。
如本文公开的基因调节部分可以偶联(例如，连接或融合)至不参与调节基因表达的其他肽序列，例如接头序列、靶向序列等。如本文所用的术语“靶向序列”是指编码靶向多肽的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，所述靶向多肽介导蛋白质定位(或保留)至亚细胞位置，例如质膜或给定细胞器的膜、细胞核、胞质溶胶、线粒体、内质网(ER)、高尔基体、叶绿体、质外体、过氧化物酶体或其他细胞器。例如，靶向序列可以利用核定位信号(NLS)将蛋白质(例如，受体多肽或衔接子多肽)引导至细胞核；利用核输出信号(NES)引导至细胞核外部，例如细胞质；利用线粒体靶向信号引导至线粒体；利用ER保留信号引导至内质网(ER)；利用过氧化物酶体靶向信号引导至过氧化物酶体；利用膜定位信号引导至质膜；或其组合。
本文公开的基因调节部分可以是融合构建体(例如，融合蛋白)的一部分。如本文所用的，“融合体”可指包含一种或多种非天然序列(例如，部分)的蛋白质和/或核酸。融合体可包含一种或多种相同的非天然序列。融合体可包含一种或多种不同的非天然序列。融合体可以是嵌合体。融合体可包含核酸亲和标签。融合体可包含条形码。融合体可包含肽亲和标签。融合体可提供位点定向多肽的亚细胞定位(例如，用于靶向细胞核的核定位信号(NLS)；用于靶向线粒体的线粒体定位信号；用于靶向叶绿体的叶绿体定位信号；内质网(ER)保留信号；等等)。融合体可以提供可用来追踪或纯化的非天然序列(例如，亲和标签)。融合体可以是小分子，如生物素或染料，如Alexa fluor染料、Cyanine3染料、Cyanine5染料。
融合体可指具有功能效应的任何蛋白质。例如，融合蛋白可包含甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性(例如，逆转录酶活性)、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性、乙酰基转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、脱泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷酸化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性、肉豆蔻酰化活性、重塑活性、蛋白酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂合酶活性、异构酶活性、合酶活性、合成酶活性或脱肉豆蔻酰化活性。效应蛋白可以修饰基因组基因座。融合蛋白可以是Cas蛋白中的融合体。融合蛋白可以是Cas蛋白中的非天然序列。
在一些实施方案中，基因调节部分可以与一个或多个转录阻抑物结构域、激活物结构域、表观遗传结构域、重组酶结构域、转座酶结构域、翻转酶结构域、切口酶结构域或其任意组合融合。活化物结构域可包括一个或多个位于蛋白质羧基末端的串联激活结构域。在一些情况下，基因调节部分包括一个或多个位于蛋白质羧基末端的串联阻遏物结构域。非限制性示例性激活结构域包括GAL4、单纯疱疹激活结构域VP16、VP64(单纯疱疹激活结构域VP16的四聚体)、NF-κB p65亚单位、EB病毒R反式激活蛋白(Rta)，并在Chavez等人,NatMethods,2015,12(4):326-328和公开号为20140068797的美国专利申请中描述。非限制性示例性阻抑结构域包括Kox1的KRAB(与Kruppel相关的盒)结构域、Mad mSIN3相互作用域(SID)、ERF阻抑物结构域(ERD)，并且在Chavez等人,Nat Methods,2015,12(4):326-328和公开号为20140068797的美国专利申请中描述。在一些实施方案中，基因调节部分包括一个或多个位于蛋白质的氨基末端的串联阻抑物结构域。在一些实施方案中，基因调节部分可减少或抑制本文所述的一种或多种内源基因的表达。
在一些实施方案中，本文描述了包含至少一种异源多核苷酸的组合物。在一些实施方案中，基因调节部分可与本文所述的至少一种异源多核苷酸复合。在一些实施方案中，所述至少一种异源多核苷酸可以是异源DNA多核苷酸或异源RNA多核苷酸。在一些实施方案中，所述至少一种异源多核苷酸可编码至少一个指导核酸。在一些实施方案中，所述至少一种异源多核苷酸可编码至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个指导核酸。在一些实施方案中，基因调节部分可与至少一个指导核酸复合。在一些实施方案中，所述至少一个指导核酸可与病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组和病毒基因的转录物的至少一个基因座结合。在一些情况下，所述至少一个指导核酸能够与基因调节部分形成复合物，以指导基因调节部分靶向病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组和病毒基因的转录物的基因座。在一些实施方案中，所述至少一个指导核酸能够与基因调节部分形成复合物，以靶向基因调节部分靶向病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组和病毒基因的转录物的基因座，以用于切割或降解。在一些情况下，所述至少一个指导核酸能够与基因调节部分形成复合物，以指导基因调节部分减少或抑制病毒基因组或病毒基因的靶向基因座的表达。
在一些情况下，与所述至少一个指导核酸的复合可将基因调节部分引导并靶向至内源基因、内源基因的转录物、病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组或病毒基因的转录物的基因座。在一些情况下，与所述至少一个指导核酸的复合可将基因调节部分引导并靶向至内源基因、内源基因的转录物、病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组或病毒基因的转录物的基因座，其靶向是为了切割或降解。在一些情况下，与所述至少一个指导核酸的复合可将基因调节部分引导并靶向至内源基因、内源基因的转录物、病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组或病毒基因的转录物的基因座，其中基因调节部分减少或抑制遗传修饰的细胞中内源基因、病毒基因组或病毒基因的表达。
在一些实施方案中，至少一个指导核酸可与基因调节部分复合。在一些实施方案中，至少两个指导核酸可与基因调节部分复合。在一些实施方案中，至少三个指导核酸可与基因调节部分复合。在一些实施方案中，至少四个指导核酸可与基因调节部分复合。在一些实施方案中，至少五个指导核酸可与基因调节部分复合。在一些实施方案中，至少六个指导核酸可与基因调节部分复合。
一些实施方案中，基因调节部分可以减少或抑制本文所述的一种或多种内源基因的表达。在一些情况下，基因调节部分可以减少或抑制本文所述的病毒基因组或病毒基因的表达。在一些实施方案中，基因调节部分可将病毒基因组或病毒基因的表达减少约0.1倍至约10,000倍之间。在一些实施方案中，基因调节部分可将病毒基因组或病毒基因的表达减少约0.1倍至约0.2倍、约0.1倍至约0.5倍、约0.1倍至约1倍、约0.1倍至约2倍、约0.1倍至约5倍、约0.1倍至约10倍、约0.1倍至约20倍、约0.1倍至约50倍、约0.1倍至约100倍、约0.1倍至约1,000倍、约0.1倍至约10,000倍、约0.2倍至约0.5倍、约0.2倍至约1倍、约0.2倍至约2倍、约0.2倍至约5倍、约0.2倍至约10倍、约0.2倍至约20倍、约0.2倍至约50倍、约0.2倍至约100倍、约0.2倍至约1,000倍、约0.2倍至约10,000倍、约0.5倍至约1倍、约0.5倍至约2倍、约0.5倍至约5倍、约0.5倍至约10倍、约0.5倍至约20倍、约0.5倍至约50倍、约0.5倍至约100倍、约0.5倍至约1,000倍、约0.5倍至约10,000倍、约1倍至约2倍、约1倍至约5倍、约1倍至约10倍、约1倍至约20倍、约1倍至约50倍、约1倍至约100倍、约1倍至约1,000倍、约1倍至约10,000倍、约2倍至约5倍、约2倍至约10倍、约2倍至约20倍、约2倍至约50倍、约2倍至约100倍、约2倍至约1,000倍、约2倍至约10,000倍、约5倍至约10倍、约5倍至约20倍、约5倍至约50倍、约5倍至约100倍、约5倍至约1,000倍、约5倍至约10,000倍、约10倍至约20倍、约10倍至约50倍、约10倍至约100倍、约10倍至约1,000倍、约10倍至约10,000倍、约20倍至约50倍、约20倍至约100倍、约20倍至约1,000倍、约20倍至约10,000倍、约50倍至约100倍、约50倍至约1,000倍、约50倍至约10,000倍、约100倍至约1,000倍、约100倍至约10,000倍或约1,000倍至约10,000倍。在一些实施方案中，基因调节部分可将病毒基因组或病毒基因的表达减少约0.1倍、约0.2倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约1,000倍或约10,000倍。在一些实施方案中，基因调节部分可将病毒基因组或病毒基因的表达减少至少约0.1倍、约0.2倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍或约1,000倍。在一些实施方案中，基因调节部分可将病毒基因组或病毒基因的表达减少至多约0.2倍、约0.5倍、约1倍、约2倍、约5倍、约10倍、约20倍、约50倍、约100倍、约1,000倍或约10,000倍。
在一些情况下，本文所述的组合物包含至少一种异源多核苷酸。在一些情况下，本文所述的组合物包含多种异源多核苷酸。在一些实施方案中，该多核苷酸是脱氧核糖核酸(DNA)。在一些情况下，该DNA序列为单链或双链的。在一些实施方案中，所述至少一种异源多核苷酸是核糖核酸(RNA)。
在一些实施方案中，基因调节部分与至少一种异源多核苷酸复合。在一些实施方案中，基因调节部分与由异源多核苷酸编码的至少一个指导核酸复合。所述至少一种异源RNA多核苷酸或指导核酸可包含核酸靶向区域，其包含与诸如靶向内源基因、靶向病毒基因组、靶向病毒基因或者病毒基因组或病毒基因的靶向转录物等靶多核苷酸上的核酸序列互补的序列，以赋予基因调节部分依赖性靶向的序列特异性。在一些实施方案中，所述至少一种异源RNA多核苷酸是指导核酸(或指导RNA)，其包含两个分开的核酸分子，其被称为双指导核酸，或者包含单个核酸分子，其被称为单指导核酸(例如，sgRNA)。在一些实施方案中，指导核酸是包含融合的CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)的单指导核酸。在一些实施方案中，指导核酸是包含crRNA的单指导核酸。在一些实施方案中，指导核酸是包含crRNA但缺乏tracRNA的单指导核酸。在一些实施方案中，指导核酸是包含非融合的crRNA和tracrRNA的双指导核酸。示例性的双指导核酸可包含crRNA样分子和tracrRNA样分子。示例性的单指导核酸可包含crRNA样分子。示例性的单指导核酸可包含融合的crRNA样分子和tracrRNA样分子。
crRNA可包含指导核酸的核酸靶向区段(例如，间隔区)和一段核苷酸，这段核苷酸可形成指导核酸的Cas蛋白结合区段的双链的双链体的一半。
tracrRNA可包含一段核苷酸，这段核苷酸形成gRNA的Cas蛋白结合区段的双链的双链体的另一半。crRNA的一段核苷酸可以与tracrRNA的一段核苷酸互补并杂交，以形成指导核酸的Cas蛋白结合域的双链的双链体。
crRNA和tracrRNA可以杂交以形成指导核酸(例如gRNA)。crRNA还可以提供与靶核酸识别序列(例如，前间隔区)杂交的单链核酸靶向区段(例如，间隔区)。可以将包括间隔区的crRNA的序列或tracrRNA分子设计为对将要在其中使用指导核酸的物种具有特异性。
在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度可以是18至72个核苷酸。指导核酸的核酸靶向区域(例如，间隔区)的长度可以是约12个核苷酸至约100个核苷酸。例如，指导核酸的核酸靶向区域(例如，间隔区)的长度可以是约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约40nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约12nt至约18nt、约12nt至约17nt、约12nt至约16nt或约12nt至约15nt。或者，DNA靶向区段的长度可以是约18nt至约20nt、约18nt至约25nt、约18nt至约30nt、约18nt至约35nt、约18nt至约40nt、约18nt至约45nt、约18nt至约50nt、约18nt至约60nt、约18nt至约70nt、约18nt至约80nt、约18nt至约90nt、约18nt至约100nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt、约20nt至约60nt、约20nt至约70nt、约20nt至约80nt、约20nt至约90nt或约20nt至约100nt。核酸靶向区域的长度可以是至少5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。核酸靶向区域(例如，间隔区序列)的长度可以是至多5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30个或更多个核苷酸。
在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域(例如，间隔区)的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度为18个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度为17个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度为16个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，指导核酸的核酸靶向区域的长度为22个核苷酸。
与靶核酸的核苷酸序列(靶序列)互补的指导核酸的核苷酸序列可具有例如至少约12nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt的长度。与靶核酸的核苷酸序列(靶序列)互补的指导核酸的核苷酸序列可具有约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约45nt、约12nt至约40nt、约12nt至约35nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt或约20nt至约60nt的长度。
在一些实施方案中，本文所述的组合物包含与本文所述的核酸指导的核酸酶复合的至少一个指导核酸(gRNA)。在一些实施方案中，该组合物包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、30个、50个或更多个gRNA。在一些情况下，可对gRNA进行多重化。例如，可将多个gRNA装配到载体中并在启动子的转录控制下。在一些情况下，gRNA的侧翼可以是自切割核酶。gRNA序列的侧翼可以是在gRNA序列5’端的自切割锤头状核酶，以及在gRNA序列3’端的自切割HDV核酶。5’和3’端核酶会自切割以生成成熟的gRNA，该gRNA可与核酸指导的核酸酶复合，并可将核酸指导的核酸酶引导至靶向核酸序列。图4A示出了示例性的多重化载体设计，其显示了多个gRNA，每个gRNA在gRNA的5’和3’端分别侧接核酶。核酶的自切割可生成成熟的gRNA。
在一些情况下，可以通过至少一种本文所述的核酸指导的核酸酶的表达使gRNA的表达多重化。在一些情况下，多重化的gRNA和核酸指导的核酸酶可以在相同或不同的启动子下。如图4B所示，pBv1-EF载体描绘了分别在人EF1α(hEF1α)启动子和小鼠EF1α(mEF1α)启动子的转录控制下的六个gRNA和核酸指导的核酸酶(Cas9)。图4B显示了pBv1-U6载体，其在U6启动子下具有六个gRNA的表达，而核酸指导的核酸酶(Cas9)的表达在mEF1α启动子的转录控制下。在一些情况下，该启动子可以是细胞特异性启动子(图4B的pBv1)。在一些情况下，Cas9表达由hEF1α启动子驱动。在一些情况下，U6或mEF1a启动子可以驱动本文所述的任一个gRNA的表达。在一些情况下，这些载体中的核酸指导的核酸酶可与核定位序列(NLS)融合。在一些情况下，核酸指导的核酸酶没有标签并且没有NLS(例如，图4B的pBv2-EF和pBv2-U6载体)以增加核酸指导的核酸酶的细胞质定位。在一些情况下，图4B中描绘的载体可在单个载体中表达Cas9和本文所述的单个或多个gRNA中的任一个。在一些实施方案中，可通过使用Piggybac系统将本文所述的载体插入细胞的基因组中。图4C示出了示例性的骨架载体和gRNA核酶设计，其中示出了核酶和Golden Gate连接的序列。类似于图4B，图4C示出了可以在单个载体中表达cas9和gRNA的载体。在一些情况下，图4C的载体可以通过使用Piggybac系统被引入细胞的基因组中。在一些情况下，图4C的载体包含hEF1a启动子以驱动Cas9表达。在一些情况下，图4C的载体包含U6或mEF1a启动子，以驱动本文所述的任一个gRNA的表达。在一些情况下，可通过用于Golden Gate Assembly的连接点对载体进行装配。在一些情况下，首先通过Gibson装配来装配包含多重gRNA的载体，以生成载体的骨架，随后进行Golden Gate装配来生成本文所述的载体。每个gRNA可以单独地克隆到载体中。最终装配可以通过以线性顺序组装多个DNA片段的IIS型限制酶(例如，通过IIS型限制酶Bsal的组装)来完成。可以通过任何递送系统将载体递送至细胞中，包括使用人工染色体系统，例如将本文所述的载体递送至具有包含PiggyBac转座子元件的细菌人工染色体(BAC)的细胞中。图5A示出了存在于所述克隆转基因猪中的基因组DNA水平上插入的Cas9转基因构建体(pBv1-U6)的片段。获自转基因猪P07、P09、P10、P11和P13的100ng基因组DNA全部显示所述转基因的片段的扩增。WT：野生型大白猪基因组DNA。PC：阳性对照(携带转基因的质粒)。图5B示出了通过PT-qPCR的Cas9转基因的表达。从克隆转基因猪收获猪成纤维细胞，并且从该成纤维细胞分离RNA。实施逆转录以获得cDNA。使用cDNA作为模板进行PCR以鉴定Cas9转基因的正确表达。来自转基因猪成纤维细胞(P10和P12)或来自野生型猪成纤维细胞的100ngcDNA。通过来自转基因猪成纤维细胞的cDNA的qPCR来检测Cas9表达。图5C示出了使用检测同源介导修复(HDR)的报告基因质粒的具有活跃的切割能力的转基因猪成纤维细胞中的Cas9/sgRNA表达。使用报告基因质粒用于报告ASFV sgRNA靶位点的切割和经由同源介导修复以重构功能性的EGFP拷贝而产生EGFP(FITC通道)的阳性信号。使用报告质粒可以模仿在进入转基因猪的细胞后ASFV如何被切割的过程，确定在转基因猪成纤维细胞中切割具有ASFV sgRNA靶位点的dsDNA的Cas9/sgRNA功能。HDR-报告基因质粒被转染到转基因猪P09和P10的成纤维细胞中。在转染后48小时进行FACS以检测EGFP的表达。在P09和P10两者的猪成纤维细胞中检测Cas9/sgRNA合适切割能力。
在一些实施方案中，所述至少一个指导核酸是互补的，并与本文所述的任何一种病毒的病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组和病毒基因的转录物结合。在一些实施方案中，所述至少一个指导核酸是互补的，并且与ASFV的病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组和病毒基因的转录物结合。在一些实施方案中，所述至少一个指导核酸是互补的，并且与表3中的SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的ASFV病毒基因组结合。在一些实施方案中，该指导核酸包含SEQ ID NO:10001-13274、SEQ ID NO:20001-23274和SEQ ID NO:30001-33274(表4)中的任何一个的核酸序列。在一些实施方案中，该指导核酸包含SEQ ID NO:10001、10002、10433、10848、12318和12266(表5)中的任何一个的核酸序列。在一些实施方案中，该指导核酸包含SEQ ID NO:20001、20002、20433、20848、22318和22266(表5)中的任何一个的核酸序列。在一些实施方案中，该指导核酸包含SEQ ID NO:30001、30002、30433、30848、32318和32266(表5)中的任何一个的核酸序列。在一些实施方案中，所述至少一个指导核酸是互补的，并且与TGEV的病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组和病毒基因的转录物结合。在一些实施方案中，所述至少一个指导核酸是互补的，并且与PRRSV的病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组和病毒基因的转录物结合。在一些实施方案中，一个指导核酸是互补的，并且与病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组或病毒基因的转录物的多个区域结合。
在一些实施方案中，所述指导核酸是互补的，并且与本文所述的任何病毒的靶病毒基因结合。在一些实施方案中，靶病毒基因是选自下组的ASFV病毒基因：DP93R、B602L、DP86L、KP93L、B475L、KP86R、DP93R、KP360L、KP177R、L356L、L270L、U104L、XP124L、V82L、Y118L、X69R、J268L、J154R、J328L、J319L、A125L、A489R、A280R、A505R、A498R、A528R、A506R、A542R、A240L、A118R、A276R、A238L、A859L、A179L、A137R、F317L、F334L、F778R、F1055L、K205R、K78R、K196R、K145R、K421R、EP1242L、EP84R、EP424R、EP152R、EP153R、EP402R、EP364R、M1249L、M448R、C129R、C717R、C105R、C257L、C475L、C315R、C147L、C62L、C962R、B962L、B119L、B318L、B438L、B169L、B354L、B385R、B646L、B117L、B407L、B175L、B263R、B66L、G1340L、G1211R、CP123L、CP2475L、CP204L、CP530R、CP312R、O174L、O61R、NP1450L、NP419L、NP868R、D250R、D129L、D339L、D1133L、D117L、D205R、D345L、S183L、S273R、P1192R、H359L、H171R、H124R、H339R、H108R、H233R、H240R、R298L、Q706L、QP509L、QP383R、E184L、E183L、E423R、E301R、E146L、E199L、E165R、E248R、E120R、E296R、I267L、I226R、I243L、I329L、I215L、I177L、I196L、DP238L、DP311R、DP63R、DP542L、DP146L、DP148R、DP71L、DP96R、DP363R、DP60R、DP141L、E111R、D79L、CP80R、B125R、F165R、A151R、A104R、A224L和KP362L。
在一些实施方案中，指导核酸(例如间隔区)的核酸靶向区域包含与SEQ ID NO:6的片段(表3)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％相同的序列。在一些实施方案中，指导核酸(例如间隔区)的核酸靶向区域包含与SEQ ID NO:7的片段(表3)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％相同的序列。在一些情况下，指导核酸(例如间隔区)的核酸靶向区域包含与SEQ ID NO:10001-13274、SEQ ID NO:20001-23274和SEQ ID NO:30001-33274(表4)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％相同的序列。在一些实施方案中，指导核酸(例如间隔区)的核酸靶向区域包含与SEQ ID NO:10001、10002、10433、10848、12318、12266、20001、20002、20433、20848、22318、22266、30001、30002、30433、30848、32318或32266(表4和表5)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％相同的序列。
在一些实施方案中，指导核酸是互补的，并且与靶病毒基因组的至少两个不同区域结合。在一些实施方案中，指导核酸是互补的，并且与靶病毒基因的至少两个不同区域结合。在一些实施方案中，指导核酸是互补的，并且与至少两种靶病毒基因的至少两个不同区域结合。
靶向多核苷酸的前间隔区序列可以通过鉴定感兴趣区域内的前间隔区相邻基序(PAM)并选择PAM上游或下游所需大小的区域作为前间隔区来鉴定。在一些实施方案中，PAM序列被来自酿脓链球菌的Cas9识别。通过确定前间隔区的互补序列来设计相应的间隔区序列。
间隔区序列可以使用计算机程序(例如，机器可读代码)来鉴别。该计算机程序可以使用这样的变量，如预测的解链温度、二级结构形成和预测的退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可及性、％GC、基因组出现的频率、甲基化状态、SNP的存在等。
核酸靶向序列(例如，本文公开的至少一种异源多肽的间隔区序列)与靶核酸(例如，本文公开的一种或多种靶病毒基因的前间隔区序列)之间的互补性百分比可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。超过约20个连续核苷酸上，核酸靶向序列与靶核酸之间的互补性百分比可以是至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
指导核酸的Cas蛋白结合区段可包含彼此互补的两段核苷酸(例如，crRNA和tracrRNA)。彼此互补的这两段核苷酸(例如，crRNA和tracrRNA)可以通过间插核苷酸(例如，在单指导核酸的情况下为接头)共价连接。彼此互补的这两段核苷酸(例如，crRNA和tracrRNA)可以杂交以形成Cas蛋白结合区段的双链RNA双链体或发夹，从而产生茎-环结构。crRNA与tracrRNA可以通过crRNA的3’端和tracrRNA的5’端共价连接。或者，tracrRNA和crRNA可以通过tracrRNA的5’端和crRNA的3’端共价连接。
指导核酸的Cas蛋白结合区段的长度可以是约10个核苷酸至约100个核苷酸，例如，约10个核苷酸(nt)至约20nt、约20nt至约30nt、约30nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt或约90nt至约100nt。例如，指导核酸的Cas蛋白结合区段的长度可以是约15个核苷酸(nt)至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt的长度。
指导核酸的Cas蛋白结合区段的dsRNA双链体可具有约6个碱基对(bp)至约50bp的长度。例如，该蛋白结合区段的dsRNA双链体的长度可以是约6bp至约40bp、约6bp至约30bp、约6bp至约25bp、约6bp至约20bp、约6bp至约15bp、约8bp至约40bp、约8bp至约30bp、约8bp至约25bp、约8bp至约20bp或约8bp至约15bp。例如，Cas蛋白结合区段的dsRNA双链体的长度可以是约8bp至约10bp、约10bp至约15bp、约15bp至约18bp、约18bp至约20bp、约20bp至约25bp、约25bp至约30bp、约30bp至约35bp、约35bp至约40bp或约40bp至约50bp。
在一些实施方案中，Cas蛋白结合区段的dsRNA双链体的长度可以是36个碱基对。杂交以形成蛋白结合区段的dsRNA双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比可以是至少约60％。例如，杂交以形成蛋白结合区段的dsRNA双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比可以是至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％。在一些情况下，杂交以形成蛋白结合区段的dsRNA双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比为100％。
接头(例如，在单指导核酸中连接crRNA与tracrRNA的接头)的长度可以是约3个核苷酸至约100个核苷酸。例如，接头的长度可以是约3个核苷酸(nt)至约90nt、约3个核苷酸(nt)至约80nt、约3个核苷酸(nt)至约70nt、约3个核苷酸(nt)至约60nt、约3个核苷酸(nt)至约50nt、约3个核苷酸(nt)至约40nt、约3个核苷酸(nt)至约30nt、约3个核苷酸(nt)至约20nt或约3个核苷酸(nt)至约10nt。例如，接头的长度可以是约3nt至约5nt、约5nt至约10nt、约10nt至约15nt、约15nt至约20nt、约20nt至约25nt、约25nt至约30nt、约30nt至约35nt、约35nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt或约90nt至约100nt。在一些实施方案中，DNA靶向性RNA的接头为4nt。
异源多核苷酸或指导核酸可包括提供另外的所需特征(例如，改变的或调节的稳定性；亚细胞靶向；用荧光标记追踪；蛋白质或蛋白质复合物的结合位点；等等)的修饰或序列。此类修饰的实例包括，例如，5’帽(7-甲基鸟苷酸帽(m7G))；3’聚腺苷酸化尾(3’聚(A)尾)；核糖开关序列(例如，以允许蛋白质和/或蛋白质复合物的调节的稳定性和/或调节的可及性)；稳定性控制序列；形成dsRNA双链体(发夹)的序列)；将RNA靶向至亚细胞位置(例如，细胞核、线粒体、叶绿体等)的修饰或序列；提供追踪的修饰或序列(例如，与荧光分子直接缀合、与促进荧光检测的部分缀合、允许荧光检测的序列等)；提供蛋白质(例如，作用于DNA的蛋白质，包括转录激活物、转录阻抑物、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰酶及其组合)结合位点的修饰或序列。
异源多核苷酸或指导核酸可包含一种或多种修饰(例如，碱基修饰、骨架修饰)，从而为核酸提供新的或增强的特征(例如，改善的稳定性)。指导核酸可包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖的组合。核苷酸的碱基位点可以是杂环碱基，例如嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是进一步包含与核苷的糖位点共价连接的磷酸基团的核苷。对于包含呋喃戊糖基(pentofuranosyl)糖的那些核苷，磷酸基团可以与该糖的2’、3’或5’羟基部分连接。在形成指导核酸时，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接，以形成直链聚合化合物。进而，该直链聚合化合物的各自末端可以进一步连接以形成环状化合物；然而，直链化合物可以是合适的。另外，直链化合物可具有内部核苷酸碱基互补性，因此可以以产生完全或部分双链化合物的方式折叠。此外，在指导核酸内，磷酸基团可被称为形成指导核酸的核苷间骨架。指导核酸的连接或骨架可以是3’至5’磷酸二酯键。
异源多核苷酸或指导核酸可包含修饰的骨架和/或修饰的核苷间键。修饰的骨架可包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。在其中含有磷原子的合适的修饰的核酸骨架可包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(如3’-亚烷基膦酸酯、5’-亚烷基膦酸酯)、手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、二氨基磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒磷酸酯和硼烷磷酸酯，其具有正常的3’-5’键，2’-5’连接的类似物，以及其中一个或多个核苷酸间键是3’至3’、5’至5’或2’至2’键的具有反向极性的那些。合适的具有反向极性的指导核酸可以在最3’的核苷酸间键处包含单个3’至3’键(诸如，其中核碱基缺失或具有代替其的羟基的单个反向核苷残基)。还可包括各种盐(例如，氯化钾或氯化钠)、混合盐和游离酸形式。
异源多核苷酸或指导核酸可包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷间键、特别是-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(亚甲基(甲基亚氨基)或称MMI骨架)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯核苷酸间键被表示为-O-P(＝O)(OH)-O-CH2-)。
异源多核苷酸或指导核酸可包含吗啉代骨架结构。例如，核酸可包含6元吗啉代环来代替核糖环。在一些这样的实施方案中，二氨基磷酸酯或其他非磷酸二酯核苷间键代替磷酸二酯键。
异源多核苷酸或指导核酸可包含由短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的多核苷酸骨架。这些可包括具有以下部分的那些：吗啉代键(部分由核苷的糖位点形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；核糖乙酰基骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸和磺酰胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他那些。
异源多核苷酸或指导核酸可包含核酸模拟物。术语“模拟物”可以旨在包括其中仅呋喃糖环或者呋喃糖环和核苷酸间键都被非呋喃糖基团代替的多核苷酸，仅呋喃糖环的替代也可被称为糖替代物。可以保持杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分，以供与适当的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖骨架可以被含有酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架代替。核苷酸可以被保留并且与骨架的酰胺座位的氮杂氮原子直接或间接地结合。PNA化合物中的骨架可包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这给予了PNA含酰胺的骨架。杂环碱基部分可与骨架的酰胺座位的氮杂氮原子直接或间接地结合。
异源多核苷酸或指导核酸可包含具有连接到吗啉代环上的杂环碱基的连接的吗啉代单元(即吗啉代核酸)。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。基于吗啉代的非离子寡聚化合物可具有少的不期望的与细胞蛋白质的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是指导核酸的非离子模拟物。吗啉代类别中的各种化合物可以使用不同的连接基团连接。另一类多核苷酸模拟物可被称为环己烯核酸(CeNA)。通常存在于核酸分子中的呋喃糖环可以用环己烯基环代替。可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体，并将其用于使用亚磷酰胺化学方法的寡聚化合物合成。将CeNA单体并入核酸链中可提高DNA/RNA杂合体的稳定性。CeNA寡腺苷酸可以与核酸互补体形成复合物，其稳定性与天然复合物类似。进一步的修饰可包括锁核酸(LNA)，其中2’-羟基与糖环的4’碳原子连接，从而形成2’-C,4’-C-氧基亚甲基连接，从而形成双环糖部分。该连接可以是亚甲基(-CH2-)，即桥接2’氧原子和4’碳原子的基团，其中n为1或2。LNA和LNA类似物可以展现出非常高的与互补核酸的双链体热稳定性(Tm＝+3至+10℃)、对3’-核酸外切降解的稳定性和良好的溶解性性质。
异源多核苷酸或指导核酸可包含一个或多个取代的糖部分。合适的多核苷酸可包含选自以下的糖取代基：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中该烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。特别合适的是O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nCH3)2，其中n和m为1至约10。糖取代基可选自：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善指导核酸的药代动力学性质的基团，或用于改善指导核酸的药效学性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。合适的修饰可包括2’-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2 CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE，烷氧基烷氧基)。其他合适的修饰可包括2’-二甲基氨基氧基乙氧基(O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2’-DMAOE)和2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(也称为2’-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2’-DMAEOE)、2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
其他合适的糖取代基可包括甲氧基(-O-CH3)、氨基丙氧基(--OCH2 CH2NH2)、烯丙基(-CH2-CH＝CH2)、-O-烯丙基(--O--CH2—CH＝CH2)和氟代(F)。2’-糖取代基可位于阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置。合适的2’-阿拉伯糖修饰是2’-F。还可以在寡聚化合物的其他位置，特别是在3’末端核苷上的糖的3’位置或者5’末端核苷酸的2’-5’连接的核苷酸中以及5’位置，进行类似的修饰。寡聚化合物还可以具有糖模拟物如环丁基部分以代替呋喃戊糖基糖。
异源多核苷酸或指导核酸还可包括核碱基(或“碱基”)修饰或置换。如本文所用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基可包括嘌呤碱基(例如，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))和嘧啶碱基(例如，胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。修饰的核碱基可包括其他合成的和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基(-C＝C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可包括三环嘧啶，如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)；G夹，如取代的吩噁嗪胞苷(例如，9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3’,2’:4,5)吡咯并(2,3-d)嘧啶-2-酮)。
杂环碱基部分可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环代替的那些部分，例如7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。核碱基可用于增加多核苷酸化合物的结合亲和力。这些可包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代可以使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃，并且可以是合适的碱基取代(例如，当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时)。
异源多核苷酸或指导核酸的修饰可包括将能够增强指导核酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物以化学方式连接至指导核酸。这些部分或缀合物可包括与诸如伯羟基或仲羟基等官能团共价结合的缀合物基团。缀合物基团可包括但不限于嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效学性质的基团和可增强寡聚物的药代动力学性质的基团。缀合物基团可包括但不限于胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。增强药效学性质的基团包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或增强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。可以增强药代动力学性质的基团包括改善核酸的摄取、分布、代谢或排泄的基团。缀合物部分可包括但不限于脂质部分如胆固醇部分、胆酸、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、巯基胆固醇、脂肪链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋甘油或三乙铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋甘油-3-H-膦酸酯)、聚胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、棕榈基部分，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。
药物组合物
如本文所用的药物组合物是指本文所述的组合物的混合物，其通过靶向并切割病毒基因组、病毒基因或者病毒基因组或病毒基因的转录物来预防或治疗细胞或非人类哺乳动物中由一种或多种病毒株引起的病毒感染。在一些实施方案中，该药物组合物包含本文所述的组合物作为活性成分。在一些实施方案中，该组合物包含本文所述的异源多肽。在一些情况下，该异源多肽包含本文所述的基因调节部分。在一些情况下，该组合物包含本文所述的异源多核苷酸。在一些实施方案中，该异源多核苷酸编码本文所述的异源多肽。在一些实施方案中，该异源多核苷酸编码本文所述的一种或多种指导核酸。在一些实施方案中，所述一种或多种指导核酸包含本文公开的任何一个SEQ ID NO的核酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种指导核酸包含表4或表5中的任何一个SEQ ID NO的核酸序列。
本文所述的药物组合物可进一步包含其他化学组分(即，药学上可接受的非活性成分)，如载体、赋形剂、粘合剂、填充剂、悬浮剂、调味剂、甜味剂、崩解剂、分散剂、表面活性剂、润滑剂、着色剂、稀释剂、增溶剂、湿润剂、增塑剂、稳定剂、渗透促进剂、润湿剂、消泡剂、抗氧化剂、防腐剂或它们的一种或多种组合。任选地，所述组合物包括本文所讨论的两种或更多种组合物(例如，一种或多种组合物和一种或更多种额外的药剂)。在实施本文提供的治疗或使用方法时，将治疗有效量的本文所述的组合物以药物组合物的形式施用于具有病毒感染、病毒性疾病或者与病毒感染或病毒性疾病相关的症状或状况的非人类哺乳动物。在一些实施方案中，该非人类哺乳动物是偶蹄动物。在一些情况下，该偶蹄动物是猪。治疗有效量可根据病毒感染或病毒性疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用组合物的效力以及其他因素而在很大范围内变化。所述组合物可以单独使用或作为混合物的组分与一种或多种组合物联合使用。
本文所述的药物制剂通过合适的给药途径施用于受试者，所述给药途径包括但不限于静脉内、动脉内、口服、肠胃外、颊部、局部、透皮、直肠、肌肉内、皮下、骨内、经粘膜、吸入或腹膜内给药途径。本文所述的药物制剂包括但不限于水性液体分散体、自乳化分散体、固溶体、脂质体分散体、气雾剂、固体剂型、粉末、立即释放制剂、控制释放制剂、速熔制剂、片剂、胶囊、丸剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、多颗粒制剂，以及立即释放和控制释放混合型制剂。
遗传修饰方法
在一些实施方案中，本文描述了遗传修饰细胞以增强对病毒感染的抗性的方法。在一些实施方案中，该细胞可以是任何类型的胚胎、胎儿或成体细胞；生殖细胞，如卵母细胞或卵；成体或胚胎干细胞；原生殖细胞；肾细胞、肝细胞或成纤维细胞。在一些实施方案中，该细胞是体细胞。在一些实施方案中，该细胞是干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，该细胞是间充质干细胞或祖细胞。在一些实施方案中，该细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，该细胞是肌肉细胞、皮肤细胞、血细胞或免疫细胞。在一些实施方案中，该细胞可以是胚胎、胎儿或成体偶蹄动物细胞。在一些实施方案中，该偶蹄动物细胞是猪细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与组合物接触。在一些实施方案中，该组合物可包含至少一种本文所述的异源多肽。在一些情况下，该组合物可包含至少一种本文所述的异源多核苷酸。在一些情况下，该组合物可包含本文所述的异源多肽和异源多核苷酸中的至少一种。在一些实施方案中，可以通过本文所述的任何转染方法将编码基因调节部分和/或指导核酸的异源多核苷酸递送至细胞中。在一些实施方案中，可以通过使用表达载体将编码基因调节部分和/或指导核酸的异源多核苷酸递送至细胞中。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入本文所述的细胞中。例如，表达载体可以通过物理、化学或生物学手段转移到细胞中。
用于将异源多核苷酸引入细胞中的物理方法可包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、基因枪、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法适用于本文的方法(参见，例如，Sambrook等人,2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第1-4卷,Cold Spring Harbor Press,NY)。用于将多核苷酸引入宿主细胞中的一种方法是磷酸钙转染。
用于将感兴趣的异源多核苷酸引入细胞中的生物学方法可包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体，已成为用于将基因插入非人类哺乳动物细胞中的最广泛使用的方法。在一些实施方案中，其他病毒载体衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺相关病毒等。示例性的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、痘病毒载体、细小病毒载体、杆状病毒载体、麻疹病毒载体或单纯疱疹病毒载体(HSV)。在一些情况下，逆转录病毒载体包括γ-逆转录病毒载体，如衍生自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV、MMLV、MuLV或MLV)或鼠干细胞病毒(MSCV)基因组的载体。在一些情况下，逆转录病毒载体还包括慢病毒载体，如衍生自人类免疫缺陷病毒(HIV)基因组的载体。在一些情况下，AAV载体包括AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9血清型。在一些情况下，病毒载体是嵌合病毒载体，其包含来自两种或更多种病毒的病毒部分。在另外的情况下，病毒载体是重组病毒载体。
用于将异源多核苷酸引入细胞中的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的示例性胶体系统是脂质体(例如，人造膜囊泡)。现有技术的核酸靶向递送的其他方法是可用的，例如采用靶向纳米颗粒或其他合适的亚微米大小递送系统的多核苷酸递送。
在利用非病毒递送系统的情况下，示例性递送媒介物是脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞(在体外、离体或体内)。在另一方面，所述核酸与脂质缔合。在一些实施方案中，与脂质缔合的核酸被包封在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层内、经由与脂质体和寡核苷酸二者缔合的连接分子附接于脂质体、包埋在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液包含在脂质中、包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体相关的组合物不限于在溶液中的任何特定结构。例如，在一些实施方案中，它们以双层结构、作为胶束或与“坍缩”结构一起存在。或者，它们简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，在一些实施方案中，其可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪小液滴，以及含有长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛。
适合使用的脂质从商业来源获得。例如，在一些实施方案中，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)从Sigma,St.Louis,Mo.获得；在一些实施方案中，双十六烷基磷酸酯(“DCP”)从K&K Laboratories(Plainview,N.Y.)获得；在一些实施方案中，胆固醇(“Chol”)从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质通常从AvantiPolar Lipids,Inc.(Birmingham,Ala.)获得。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液通常在约-20℃下储存。将氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其包括通过生成封闭的脂质双层或聚集体而形成的多种单层和多层脂质媒介物。脂质体的特征通常在于具有囊泡结构，该囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质隔开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，多层脂质体自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自重排，并在脂质双层之间捕获水和溶解的溶质(Ghosh等人,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，还包括在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，在一些实施方案中，脂质呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还可预期脂质转染胺(lipofectamine)-核酸复合物。
在一些情况下，可以将本文所述的组合物包装并通过细胞外囊泡递送至细胞。细胞外囊泡可以是任何膜结合的颗粒。在一些实施方案中，细胞外囊泡可以是由至少一个细胞分泌的任何膜结合的颗粒。在一些情况下，细胞外囊泡可以是在体外合成的任何膜结合的颗粒。在一些情况下，细胞外囊泡可以是在没有细胞的情况下合成的任何膜结合的颗粒。在一些情况下，细胞外囊泡可以是外来体、微囊泡、逆转录病毒样颗粒、凋亡小体、凋亡体、癌瘤体(oncosomes)、exophers、包膜病毒、exomeres或其他非常大的细胞外囊泡。
在一些情况下，可通过使用通过将所述组合物首先引入同种异体或自体细胞中而生成的遗传工程细胞，将本文所述的组合物施用于有需要的受试者。所述遗传工程细胞可将所述组合物的治疗效果赋予具有病毒感染或病毒性疾病的受试者。
在一些实施方案中，可将所述组合物递送至细胞以减少或消除病毒基因的表达，其中随后可将这些细胞施用于有需要的受试者以用于治疗目的。在一些情况下，这些细胞可以是自体的(即，使用受试者自己的细胞进行移植)或同种异体的。
产生遗传修饰的非人类哺乳动物的方法
在一些实施方案中，用本文所述的组合物转染或与之接触的细胞用来产生遗传修饰的组织、器官或非人类哺乳动物。在一些实施方案中，该遗传修饰的非人类哺乳动物包含本文所述的遗传修饰的细胞、组织或器官。在一些实施方案中，用本文所述的组合物转染或与之接触的遗传修饰的细胞用来产生遗传修饰的组织、器官或非人类哺乳动物。在一些实施方案中，该遗传修饰的非人类哺乳动物是遗传修饰的偶蹄动物。在一些实施方案中，该遗传修饰的偶蹄动物是遗传修饰的猪。在一些实施方案中，该遗传修饰的猪可包括建立者遗传修饰的猪、该遗传修饰的猪的后代以及后代的后代等。产生遗传修饰的非人类哺乳动物的方法可包括建立建立者的方法。这样的方法可包括，例如，前核显微注射、逆转录病毒介导的向种系中的基因转移、向胚胎干细胞中的基因靶向、体细胞核转移、胚胎的电穿孔、精子介导的基因转移和体细胞的体外转化。对于体细胞核转移，可将诸如胚胎卵裂球、胎儿成纤维细胞或成体成纤维细胞等遗传修饰的细胞(例如，遗传修饰的猪细胞)引入去核卵母细胞中。在一些实施方案中，卵母细胞可通过在极体附近进行局部分区解剖，然后在解剖区域压出细胞质而去核。在一些实施方案中，使用具有尖锐斜面尖端的注射移液管将遗传修饰的细胞注入停滞于减数分裂2期的去核卵母细胞中。停滞于减数分裂2期的卵母细胞通常被称为“卵”。在一些实施方案中，通过融合并激活卵母细胞产生胚胎。这样的胚胎在本文中可被称为“遗传修饰的胚胎”。在一些实施方案中，将遗传修饰的胚胎转移至雌性受体猪的输卵管。在一些实施方案中，在激活后20至24小时，将遗传修饰的胚胎转移至雌性受体猪的输卵管。参见，例如，Cibelli 1998和美国专利6,548,741。在一些实施方案中，可以在遗传修饰的胚胎转移后约20-21天检查雌性受体的妊娠。在一些实施方案中，使遗传修饰的胚胎生长成出生后遗传修饰的非人类哺乳动物。在一些实施方案中，该出生后遗传修饰的非人类哺乳动物是新生遗传修饰的非人类哺乳动物。
在一些实施方案中，所述遗传修饰的非人类哺乳动物是具有一种或多种修饰的内源基因并且在妊娠后至少一个月、至少6个月、至少1年、至少5年、至少10年内保持该修饰的内源基因的相同或相似水平的表达或失活的非人类哺乳动物。
在一些情况下，育种技术可以产生对于遗传修饰的内源基因而言为纯合的后代。在一些情况下，育种技术可以产生包含本文所述组合物的后代。在一些实施方案中，可以用Southern印迹法、PCR、qPCR或Western印迹法筛选遗传修饰的内源基因或组合物在遗传修饰的细胞、组织、器官或非人类哺乳动物中的存在或表达水平。
治疗方法
在一些实施方案中，本文公开了在非人类哺乳动物受试者中治疗病毒感染或疾病或者病毒感染或疾病的症状的方法，其包括向该受试者施用治疗有效量的本文所述组合物或药物组合物。在一些实施方案中，该受试者可以是偶蹄动物。在一些情况下，该受试者可以是猪。在一些实施方案中，该方法减少细胞中一种或多种内源基因、靶病毒基因组或靶病毒基因的表达，其包括以下步骤：使细胞与本公开所述的组合物接触；在所述接触后，所述组合物降低所述细胞中所述一种或多种内源基因或靶病毒基因的表达。在一些实施方案中，该接触在体内、离体或体外发生。在一些实施方案中，可通过向所述细胞中递送编码所述组合物的异源多核苷酸而在所述细胞中表达所述组合物。在一些实施方案中，该组合物或可以直接施用于受试者。
在一些实施方案中，可以将所述组合物单独施用于受试者(例如，独立治疗)。在一些实施方案中，该组合物与额外的药剂联合施用。在一些实施方案中，该组合物是用于疾病或病况的一线治疗。在一些实施方案中，该组合物是用于病毒感染或病毒性疾病的二线、三线或四线治疗。在一些实施方案中，该组合物可用于治疗本文公开的病毒感染或病毒性疾病，或者病毒感染或病毒性疾病的症状。
在一些实施方案中，所述组合物可包含基因调节部分和至少一个指导核酸。在一些实施方案中，该组合物可包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、20个、30个或更多个指导核酸。在一些实施方案中，每个指导核酸可以是互补的并且与靶病毒基因组的至少两个不同区域结合。在一些实施方案中，该指导核酸可以是互补的并且与靶病毒基因组的至少两个不同区域结合。在一些实施方案中，该指导核酸可以是互补的并且与至少两种靶病毒基因的至少两个不同区域结合。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，该病毒基因组或病毒基因可以来自本文描述的任何病毒。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割至少两个病毒科的病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割至少三个病毒科的病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割至少两个病毒属的病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割至少三个病毒属的病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割至少两个病毒株的病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割至少三个病毒株的病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割PRRSV、TGEV和ASFV的病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割PRRSV和TGEV的病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割PRRSV和ASFV的病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割TGEV和ASFV的病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割PRRSV病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割TGEV病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。在一些实施方案中，包含至少一个指导核酸的组合物可以靶向并切割ASFV病毒基因组或病毒基因的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30个或更多个区域。
通常，本文公开的方法可包括通过口服给药来施用组合物。然而，在一些情况下，方法可包括通过腹膜内注射施用组合物。在一些情况下，方法可包括以肛门栓剂的形式施用组合物。在一些情况下，方法可包括通过静脉内(“i.v.”)给药来施用组合物。可以想到，还可以通过其他途径来施用本文公开的组合物，如皮下注射、肌肉内注射、皮内注射、透皮注射、经皮给药、鼻内给药、淋巴管内注射、直肠给药、胃内给药或其他任何合适的肠胃外给药。在一些实施方案中，与全身性途径相比，更靠近损伤或炎症部位的局部递送途径是优选的。可以调整给药途径、剂量、时间点和持续时间。在一些实施方案中，在疾病或病况的急性和慢性症状之一或两者的发作之前或之后施用治疗剂。
用来预防或治疗本文公开的病毒感染或病毒性疾病的组合物的有效量和剂量由观察到的与病毒感染或病毒性疾病或者病毒感染或病毒性疾病的症状有关的有益反应来定义。在一些情况下，有益反应包括通过本文所述方法确定的病毒基因组或病毒基因的表达的减少。另外的有益反应包括预防、减轻、阻止或治愈病毒感染或病毒性疾病，或者病毒感染或病毒性疾病的症状。如本文所用的“改善”是指细胞中或从受试者获得的样品中病毒基因组或病毒基因的表达的减少。在组合物在治疗上无效或不能充分缓解疾病或病况或者疾病或病况的症状的情况下，可以改变剂量和/或给药途径，或者可以与组合物一起向受试者施用额外的药剂。在一些实施方案中，当受试者从组合物的方案开始时，该受试者也停止(例如，逐步减少剂量)第二治疗方案。
施用于受试者的合适的剂量取决于以下因素，包括但不限于具体组合物、疾病状况及其严重程度、需要治疗的受试者的特性(例如体重、性别、年龄)，并且可以根据病例的具体情况进行确定，包括例如所施用的具体药剂、给药途径、所治疗的病况和所治疗的受试者。
在一些实施方案中，所述组合物的施用是每小时一次、每2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年或5年或10年一次。可以根据受试者对治疗的反应来调整有效剂量范围。与其他途径相比，某些给药途径将需要更高浓度的有效量的治疗剂。
在受试者的状况没有改善的某些实施方案中，经医生判断，需长期进行组合物的给药，即持续延长的一段时间，包括受试者的整个生命期，以便改善或以其他方式控制或限制受试者的疾病或病况的症状。在受试者的状态得到改善的某些实施方案中，所施用的组合物的剂量可以暂时减少或暂时中止某个时间长度(即“休药期”)。在具体的实施方案中，休药期的长度为2天至1年之间，仅举例而言，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天或超过28天。仅举例而言，休药期期间的剂量减少为10％-100％，仅举例而言，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％。在某些实施方案中，正在施用的药物的剂量可暂时减少或暂时中断某个时间长度(即，“药物转换(drug diversion)”)。在具体的实施方案中，药物转换的长度为2天至1年，仅举例而言，包括2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、12天、15天、20天、28天或超过28天。仅举例而言，药物转换期间的剂量减少为减少10％-100％，仅举例而言，包括10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和100％。在适当的时间长度后，任选地恢复正常的给药时间表。
在一些实施方案中，一旦受试者的状况已发生改善，如有必要，施用维持剂量。随后，在特定实施方案中，根据症状，将给药剂量或频率或两者降低至疾病、病症或病况的改善得以保持的水平。然而，在某些实施方案中，在任何症状复发时，受试者需要长期的间歇治疗。
此类治疗方案的毒性和治疗功效通过在细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，包括但不限于LD50和ED50的确定。毒性作用与治疗效果之间的剂量比为治疗指数，并且将其表示为LD50与ED50之间的比值。在某些实施方案中，使用从细胞培养试验和动物研究中获得的数据来制定用于包括人类在内的哺乳动物的治疗有效的每日剂量范围和/或治疗有效的单位剂量。在一些实施方案中，本文所述的组合物的每日剂量处于包括具有最小毒性的ED50的循环浓度的范围内。在某些实施方案中，每日剂量范围和/或单位剂量根据采用的剂型和使用的给药途径在该范围内变化。
组合物可以单独使用或与额外的药剂联合使用。在一些情况下，如本文所用的“额外的药剂”单独施用。该组合物和额外的药剂可以一起或顺序施用。联合疗法可以在同一天内施用，或者可以相隔一天或多天、数周、数月或数年施用。
试剂盒
在一些实施方案中，本文公开了包含本文所述的组合物或药物组合物的试剂盒。在一些实施方案中，本文公开的试剂盒可用来治疗受试者中的病毒感染或病毒性疾病；或者选择受试者以用于治疗和/或监测本文公开的治疗。在一些实施方案中，该试剂盒包含可用来执行本文所述方法的本文所述的组合物。试剂盒包含材料或组分的集合，包括至少一种组合物。因此，在一些实施方案中，试剂盒包含组合物，包括药物组合物，以用于治疗病毒感染或病毒性疾病。在其他实施方案中，试剂盒包含进行检测并测量病毒标志物的测定所必需的和/或足以进行该测定的所有组分，包括所有对照、关于进行测定的指导以及用于分析和呈现结果的任何必要软件。
在一些情况下，本文描述的试剂盒包含用于检测本文所述的靶核酸和/或蛋白质的存在、不存在和/或量的组分。在一些实施方案中，试剂盒包含本文所述的组合物(例如，引物、探针、抗体)。本公开提供了适用于诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)、PCR和qPCR等测定的试剂盒。试剂盒中配置的组分的确切性质取决于其预期用途。例如，一些试剂盒可被配置用于在受试者中治疗本文公开的疾病或病况的目的。在一些实施方案中，试剂盒可被特别配置用于治疗哺乳动物受试者的目的。在一些实施方案中，试剂盒可被特别配置用于治疗非人类受试者的目的。在进一步的实施方案中，试剂盒可被配置用于兽医应用，从而治疗受试者，诸如但不限于农场动物、家养动物和实验室动物。在一些实施方案中，试剂盒可被配置用于针对治疗剂(如本文公开的那些)选择受试者。在一些实施方案中，试剂盒被配置用于针对病毒感染或病毒性疾病的治疗选择受试者。
在一些情况下，所述试剂盒中可包含使用说明书。任选地，该试剂盒还包含其他有用的组分，如稀释剂、缓冲液、药学上可接受的载体、注射器、导管、涂抹器、移液或测量工具、包扎材料或其他有用的用具。组装在试剂盒中的材料或组分可以以保持其可操作性和实用性的任何方便且合适的方式提供给从业者。例如所述组分可以是溶解的、脱水的或冻干的形式；它们可以在室温、冷藏或冷冻温度下提供。这些组分通常包含在合适的包装材料中。如本文所用的，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒的内容物如组合物等的一种或多种物理结构。例如，可构建包装材料，以优选地提供无菌、无污染的环境。试剂盒中采用的包装材料是在基因表达试验中和治疗施用中惯常使用的那些包装材料。如本文所用的，术语“包装”是指能够容纳各个试剂盒组分的合适的固体基质或材料，如玻璃、塑料、纸、箔等。因此，例如，包装可以是用来容纳适量的药物组合物的玻璃小瓶或预填充注射器。包装材料具有指示试剂盒的内容物和/或目的及其组分的外部标签。
实施例
以下说明性实施例代表本文所述的刺激、系统和方法的实施方案，而并不意味着以任何方式进行限制。
实施例1.遗传修饰的猪表现出增强的对ASFV的抗性
检查了包含三种内源基因(CMAH、GGTA1和B4GALNT2)的敲除的遗传修饰的猪对ASFV的抗性。从遗传修饰的三敲除猪(3KO组)和未修饰的对照(WT组)中分离出猪肺泡巨噬细胞。将猪肺泡巨噬细胞接种在聚赖氨酸包被的平板上，然后以各种稀释度用ASFV感染攻击。ASFV感染后，收集上清液和细胞沉淀物，并检查ASFV病毒复制。图1A示出了在采用降低的病毒滴度(10-2)的第2天，与WT对照组相比，在3KO组中ASFV复制显著减少。通过qPCR测量上清液和肺泡巨噬细胞沉淀物中的ASFV病毒拷贝数。图1B示出了从3KO组获得的上清液在72小时内表现出较低的ASFV病毒拷贝数。图1B还示出了3KO组表现出感染的延迟阶段。图1C示出了与从WT对照组获得的肺泡巨噬细胞细胞沉淀物相比，从3KO组获得的肺泡巨噬细胞细胞沉淀物具有较低的ASFV积累。共同地，图1示出了与WT对照相比，包含CMAH敲除、GGTA1敲除和B4GALNT2敲除的遗传修饰的猪表现出增强的对ASFV的抗性。
实施例2.遗传修饰内源RELA基因
为了增强对ASFV引起的病毒感染的抗性，在猪中对内源RELA基因进行了遗传修饰。图2A的上图示出了通过CRISPR/Cas9指导的同源重组将修饰的RELA等位基因引入其中的基因座(外显子13)。修饰的RELA等位基因对应于ASFV抗性疣猪RELA等位基因，并在5’和3’端侧接1.5kb同源臂(例如第一个1.5kb同源臂，随后是修饰的等位基因，随后是第二个1.5kb同源臂)。图2A的下图示出了针对gRNA 1和gRNA 2的指导核酸(gRNA)靶向和结合位点。将供体质粒中的gRNA靶位点改变为同义密码子。图2B示出了具有双等位基因修饰的RELA敲入的候选克隆的筛选。琼脂糖凝胶中显示的PCR产物对应于敲入RELA等位基因的存在。图2C示出了从两个出生即具有修饰的RELA等位基因敲入的仔猪获得的Sanger测序结果。色谱图显示三个核苷酸的改变：A1342G、T1453C和T1591，证实了敲入RELA的存在。核苷酸改变A1342G导致氨基酸改变T448A。核苷酸改变T1453C导致氨基酸改变S485P。核苷酸改变T1591C导致氨基酸改变S531P。得到的两只仔猪包含与疣猪RELA序列相对应的RELA等位基因，其赋予了对由ASFV引起的感染的抗性。
实施例3.靶向ASFV病毒基因组的多个区域以供切割和降解
为了有效地对抗病毒感染，设计了指导核酸(gRNA)以用于病毒基因组的多重靶向。由于病毒基因组中的突变，这类多重化降低了病毒基因组逃脱切割的可能性。还设计了gRNA，以避免宿主细胞的基因组序列的靶向和结合。其他设计标准包括靶向ASFV编码区和保守区。gRNA被设计为可被来自酿脓链球菌的Cas9识别，后者识别PAM序列5′-NGG-3′(其中“N”可以是任何核苷酸碱基)作为gRNA的一部分。GC含量在20％至80％之间的靶标具有高优先级；避免U核苷酸的均聚物；并避免与宿主细胞的基因组有最多两个错配的脱靶切割。
gRNA被设计为靶向表3中所示的序列。SEQ ID NO:6是ASFV基因组的核酸序列。SEQID NO:7是SEQ ID NO:6的互补核酸序列。表4列出了基于本文所述标准设计的gRNA，它们靶向表3的ASFV病毒基因组的核酸序列。
图3A示出了选自表4或表5的6个gRNA如何进行多重化以靶向ASFV病毒基因组的至少13个区域。六个gRNA中的两个各自靶向ASFV病毒基因组的多达5个区域。gRNA还靶向ASFV基因组的两条链。表5列出了可以多重化的从表4中选择的gRNA。通过将gRNA作为本文所述的组合物或药物组合物的一部分施用，可以将gRNA与Cas9复合以靶向并切割ASFV基因组的多个区域，从而赋予ASFV抗性或治疗ASFV感染。如图3B所示，当与CRISPR/Cas9复合时，gRNA在体外消化试验中消化了ASFV基因组的PCR产物。
图3C示出了在具有稳定的抗ASFV CRISPR/Cas9表达的经编辑的COS-7细胞中对ASFV的抑制。左上图总结了本文所述的细胞系、Cas9构建体和sgRNA启动子。图3C的右上图示出了在五天(D0、D1、D2、D3、D4和D5)内通过qPCR测定的在来自多个细胞系的上清液中检测到的ASFV DNA的量。图3C的左下图示出了在五天(D0、D1、D2、D3、D4和D5)内通过qPCR测定的在来自多个细胞系的上清液和细胞裂解物中检测到的ASFV DNA的量。图3C的右下图示出了与Cas9表达水平正相关的抑制水平。抑制作用与Cas9表达更相关，而与编辑类型相关性较低。如图3C所示，纯化并适应后保持稳定的ASFV DNA和Cas9表达。在图3C中还示出，与U6启动子相比，EF1a启动子驱动的sgRNA阵列的表达增加。但是，在非NLS-Cas9中，U6启动子比EF1a启动子更好地驱动sgRNA阵列的表达。图3D示出了样品之间以及qPCR之间的复制的相对病毒滴度。
为了进一步证实多重化gRNA在指导CRISPR/Cas9靶向并切割ASFV基因组中的功效，将CRISPR转基因盒引入COS7细胞中。图3E的上图示出了在COS7细胞克隆中的Cas9表达，其中FY是包含具有6个gRNA(SEQ ID NO:10001、10002、10433、10848、12318和12266)的CRISPR载体的克隆，而FZ是包含没有gRNA的CRISPR载体的克隆。图3E的下图显示了上图所示的Cas9表达与对ASFV的抗性如何正相关。通过两种病毒滴度确定，Cas9(FY10)的高表达水平，与6个gRNA组合，抑制了ASFV复制。在FY克隆中未观察到ASFV抑制。图3F的上图示出了各种COS7克隆中的Cas9表达水平。COS7是没有CRISPR/Cas9转基因盒的对照。FY10和FY12是包含CRISPR载体的克隆，该载体具有6个gRNA(SEQ ID NO:10001、10002、10433、10848、12318和12266)以及具有驱动这6个gRNA的表达的U6启动子。FZ是包含没有gRNA的CRISPR载体的克隆。GC17和GC49是包含CRISPR载体的克隆，该载体具有相同的6个gRNA并且具有驱动这6个gRNA表达的EF1a启动子。图3F的下图示出了时程实验，其中克隆在4天内被ASFV感染。通过对克隆的细胞裂解物进行qPCR确定ASFV积累。COS7对照细胞用ASFV的10倍稀释液感染。如图3F所示，具有较高Cas9表达的克隆GC49和FY10，与6个gRNA组合，具有较低的ASFV积累。具有较低Cas9表达的克隆(FY12和GC17)或没有6个gRNA的表达的克隆(FZ12)具有增加的ASFV积累。图3说明，使用多重化gRNA和CRISPR/Cas9靶向ASFV基因组切割了ASFV的病毒基因组并减少了ASFV在细胞中的积累，从而赋予增强的对由ASFV引起的感染的抗性。
实施例4.在猪成纤维细胞中插入构建体
自大白猪耳分离的原代猪成纤维细胞被培养至40％的细胞集合(confluence)，并且通过TrypLETM Express Enzyme(Thermo Fisher,Cat#12604039)从培养皿上脱离。利用Neon转染系统(Thermo Fisher,Cat#MPK5000)对4X105细胞使用250ng编码PiggyBac转座酶的质粒和250ng具有侧接由PiggyBac转座酶识别的ITR序列的转基因的供体质粒。该转基因经由PiggyBac介导的随机整合有机会整个到转染的细胞的基因组DNA中。转染的细胞被单细胞分选(sorted)并生长为单细胞克隆。通过基因组DNA提取和PCR以检查Cas9基因序列的存在来检测携带转基因的细胞克隆，并将携带转基因的细胞克隆用于进一步的实验。
图4示出了演示本申请所述的构建体(pBv1-U6)中的一种插入活猪的基因组DNA中的示例性实验。图4A示出了示例性的多重化自切割核酶，以将不同的gRNA序列连接在一起，以在单个启动子下表达多种gRNA序列。虚线表示自切割的位点。图4B示出了用于表达多种gRNA和核酸指导的核酸酶(例如Cas9)的示例性载体设计。这些载体中的核酸指导的核酸酶可以与核定位序列(NLS)融合。在一些情况下，该核酸指导的核酸酶没有NLS(例如pBv2-EF和pBv2-U6载体)。图4C示出了本文描述的载体和gRNA核酶的设计。
图5A示出了存在于所述克隆转基因猪中的基因组DNA水平上的插入的Cas9转基因构建体(pBv1-U6)的片段。获自转基因猪P07、P09、P10、P11和P13的100ng基因组DNA全部显示所述转基因的片段的扩增。WT：野生型大白猪基因组DNA。PC：阳性对照(携带转基因的质粒)。图5B示出了通过RT-qPCR的Cas9转基因的表达。从克隆转基因猪收获猪成纤维细胞，并且从该成纤维细胞分离RNA。实施逆转录以获得cDNA。使用cDNA作为模板进行PCR以鉴定Cas9转基因的正确表达。来自转基因猪成纤维细胞(P10和P12)或来自野生型猪成纤维细胞的100ng cDNA。通过来自转基因猪成纤维细胞的cDNA的qPCR来检测Cas9表达。图5C示出了使用检测同源介导修复(HDR)的报告基因质粒的具有活跃的切割能力的转基因猪成纤维细胞中的Cas9/sgRNA表达。使用报告基因质粒用于报告ASFV sgRNA靶位点的切割和经由同源介导修复以重构功能性的EGFP拷贝而产生EGFP(FITC通道)的阳性信号。使用报告质粒可以模仿在进入转基因猪的细胞后ASFV如何被切割的过程，确定在转基因猪成纤维细胞中切割具有ASFV sgRNA靶位点的dsDNA的Cas9/sgRNA功能。HDR-报告基因质粒被转染到转基因猪P09和P10的成纤维细胞中。在转染后48小时进行FACS以检测EGFP的表达。在P09和P10两者的猪成纤维细胞中检测Cas9/sgRNA合适切割能力。
表3.ASFV基因组的序列
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表4：用于靶向ASFV病毒基因组的gRNA序列
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表5.用于靶向ASFV基因组的多重gRNA设计
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虽然出于清楚和理解的目的已经相当详细地描述了前述公开内容，但通过阅读本公开内容，本领域技术人员将会明白，在不脱离本公开的真实范围的情况下，可进行形式和细节上的各种改变。例如，上述所有技术和设备可以以多种组合的方式使用。本申请中引用的所有出版物、专利、专利申请和/或其他文件均为了所有目的通过引用而整体并入，其程度犹如单独且分别地指出每个单独的出版物、专利、专利申请和/或其他文件均为了所有目的通过引用而并入。

Claims (61)

1.一种遗传修饰的细胞，其与对照细胞相比表现出增强的对病毒感染的抗性，所述遗传修饰的细胞在编码CD163的基因中包含至少一个修饰的染色体序列，其中所述至少一个染色体序列选自：外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、外显子14、外显子15、外显子16、外显子17、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12、内含子13、内含子14、内含子15和内含子16。
2.根据权利要求1所述的遗传修饰的细胞，其中所述至少一个染色体序列选自：外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子10、外显子11、外显子12、外显子13、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子9、内含子10、内含子11、内含子12和内含子13。
3.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的细胞，其中所述至少一个染色体序列选自：外显子4、内含子3和内含子4。
4.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细胞表现出降低的CD163表达或活性。
5.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的细胞，其中所述至少一个修饰的染色体序列包含移码突变。
6.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细胞表现出增强的对PRRSV和ASFV的抗性。
7.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细胞表现出增强的对PRRSV的抗性。
8.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细胞表现出增强的对ASFV的抗性。
9.一种遗传修饰的非人类哺乳动物，其表现出增强的对病毒感染的抗性，所述遗传修饰的非人类哺乳动物包含前述权利要求中任一项的遗传修饰的细胞。
10.根据权利要求9所述的遗传修饰的非人类哺乳动物，其中所述遗传修饰的非人类哺乳动物是偶蹄动物。
11.根据权利要求10所述的遗传修饰的非人类哺乳动物，其中所述偶蹄动物是猪。
12.一种遗传修饰细胞或非人类哺乳动物以诱导增强的对病毒感染的抗性的方法，所述方法包括生成权利要求1-8中任一项的至少一个修饰的染色体序列。
13.一种遗传修饰的细胞，其与对照细胞相比表现出增强的对至少两个属的病毒引起的病毒感染的抗性，所述遗传修饰的细胞包含所述修饰细胞的一种或多种内源基因的修饰的遗传内容，该修饰的遗传内容赋予增强的抗性。
14.根据权利要求13所述的遗传修饰的细胞，其包含能够靶向所述一种或多种内源基因的至少一种基因调节部分，以产生所述一种或多种内源基因的修饰的遗传内容。
15.根据权利要求14所述的遗传修饰的细胞，其中编码所述至少一种基因调节部分的基因整合到所述遗传修饰的细胞的基因组中。
16.根据权利要求14所述的遗传修饰的细胞，其中所述一种或多种内源基因包括第一内源基因和第二内源基因，并且其中所述至少一种基因调节部分包括(i)能够靶向所述第一内源基因的第一指导核酸分子和(ii)能够靶向所述第二内源基因的第二指导核酸分子。
17.根据权利要求14所述的遗传修饰的细胞，其中所述一种或多种内源基因包括靶内源基因，并且其中所述至少一种基因调节部分包括(i)能够靶向所述靶内源基因的第一部分的第一指导核酸分子和(ii)能够靶向所述靶内源基因的第二部分的第二指导核酸分子。
18.根据权利要求13所述的遗传修饰的细胞，其中所述修饰的遗传内容包括染色体基因或其转录物。
19.根据权利要求13所述的遗传修饰的细胞，其中所述一种或多种内源基因编码选自下组的一种或多种蛋白质：受体蛋白、肽酶蛋白、糖基转移酶蛋白、羟化酶蛋白和干扰素刺激基因(ISG)蛋白。
20.根据权利要求19所述的遗传修饰的细胞，其中所述受体蛋白是CD163。
21.根据权利要求19所述的遗传修饰的细胞，所述肽酶蛋白是ANPEP。
22.根据权利要求19所述的遗传修饰的细胞，所述糖基转移酶蛋白是GGTA1。
23.根据权利要求19所述的遗传修饰的细胞，所述糖基转移酶蛋白是CMAH。
24.根据权利要求19所述的遗传修饰的细胞，所述羟化酶蛋白是B4HALNT2。
25.根据权利要求19所述的遗传修饰的细胞，所述ISG蛋白是RELA。
26.根据权利要求13所述的遗传修饰的细胞，其中所述一种或多种内源基因编码选自下组的至少两种蛋白质：CD163、ANPEP、GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。
27.根据权利要求13所述的遗传修饰的细胞，其中所述一种或多种内源基因编码CD163和选自下组的一种或多种蛋白质：ANPEP、GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。
28.根据权利要求13所述的遗传修饰的细胞，其中所述一种或多种内源基因编码ANPEP和选自下组的一种或多种蛋白质：CD163、GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。
29.根据权利要求13所述的遗传修饰的细胞，其中所述一种或多种内源基因编码选自下组的一种或多种蛋白质：
a.GGTA1、CMAH和B4GALNT2；以及
b.CD163或ANPEP。
30.根据权利要求13所述的遗传修饰的细胞，其中所述一种或多种内源基因编码选自下组的一种或多种蛋白质：
a.RELA；和
b.CD163或ANPEP。
31.根据权利要求13所述的遗传修饰的细胞，其中与所述对照细胞相比，所述遗传修饰的细胞表现出增强的对至少三个属的病毒引起的病毒感染的抗性，并且其中所述一种或多种内源基因编码CD163或ANPEP和选自下组的一种或多种基因：GGTA1、CMAH、B4GALNT2和RELA。
32.根据权利要求13所述的遗传修饰的细胞，其中所述至少两个属的病毒包括选自下组的两种或更多种病毒：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Betaarterivirus，PRRSV)、甲型冠状病毒(TGEV)和非洲猪瘟病病毒(ASFV)。
33.一种遗传修饰的非人类哺乳动物，其表现出增强的对至少两个属的病毒引起的病毒感染的抗性，所述遗传修饰的非人类哺乳动物包含权利要求13-32中任一项的遗传修饰的细胞。
34.根据权利要求33所述的遗传修饰的非人类哺乳动物，其中所述遗传修饰的非人类哺乳动物是偶蹄动物。
35.根据权利要求34所述的遗传修饰的非人类哺乳动物，其中所述偶蹄动物是猪。
36.一种遗传修饰细胞或非人类哺乳动物以诱导增强的对至少两个属的病毒引起的病毒感染的抗性的方法，所述方法包括生成权利要求13-32中任一项的修饰的遗传内容。
37.一种用于减少由至少两个科的病毒引起的病毒感染的组合物，其包含：
(a)一种或多种异源多肽，其包含核酸指导的核酸酶或其片段；和
(b)至少两个与所述至少两个科的病毒的病毒基因特异性结合的指导核酸，
其中组分(a)和(b)形成复合物，该复合物被配置用于修饰所述病毒基因的遗传内容。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述核酸指导的核酸酶是Cas蛋白。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述Cas蛋白是V型Cas。
40.根据权利要求38所述的组合物，其中所述Cas蛋白是VI型Cas。
41.根据权利要求37所述的组合物，其中所述至少两个病毒科包括冠状病毒科、动脉病毒科或非洲猪瘟病病毒科。
42.根据权利要求37所述的组合物，其中所述病毒基因包含病毒基因组或其转录物。
43.一种能够减少由至少两个科的病毒引起的病毒感染的细胞或非人类哺乳动物，其包含权利要求37-42中任一项的组合物。
44.一种生成能够减少由至少两个科的病毒引起的病毒感染的细胞的方法，其包括使所述细胞与权利要求37-42中任一项的组合物接触。
45.一种指导核酸，其包含约10至30个连续核苷酸的序列，所述序列与靶病毒基因的至少两个不同区域表现出至少90％的序列同一性。
46.根据权利要求45所述的指导核酸，其中靶病毒基因包含病毒基因组或其转录物。
47.根据权利要求45所述的指导核酸，其中所述至少两个不同区域在所述靶病毒基因的相同基因内。
48.根据权利要求45所述的指导核酸，其中所述至少两个不同区域在所述靶病毒基因的两个不同基因内。
49.根据权利要求45所述的指导核酸，其中所述靶病毒基因选自：B602L、DP86L、DP93R、KP86R、KP93L、M1249L、G1221R、O174L和CP204L(p30)。
50.根据权利要求49所述的指导核酸，其中所述靶病毒基因选自：B602L、DP86L、DP93R、KP86R、KP93L、M1249L、G1221R和O174L。
51.根据权利要求45所述的指导核酸，其中所述序列与SEQ ID NO:6的序列片段具有至少90％的序列同一性。
52.根据权利要求45所述的指导核酸，其中所述序列与SEQ ID NO:7的序列片段具有至少90％的序列同一性。
53.根据权利要求45所述的指导核酸，其中所述序列与选自SEQ ID NO:10001-13274、SEQ ID NO:20001-23274和SEQ ID NO:30001-33274的序列具有至少90％的序列同一性。
54.根据权利要求45所述的指导核酸，其中所述序列与选自SEQ ID NO:10001、10002、10433、10848、12318和12266的序列具有至少90％的序列同一性。
55.根据权利要求45所述的指导核酸，其中所述序列与选自SEQ ID NO:20001、20002、20433、20848、22318和22266的序列具有至少90％的序列同一性。
56.根据权利要求45所述的指导核酸，其中所述序列与选自SEQ ID NO:30001、30002、30433、30848、32318和32266的序列具有至少90％的序列同一性。
57.根据权利要求45所述的指导核酸，其中所述靶病毒基因来自ASFV。
58.一种组合物，其包含：
a.异源多肽，其包含核酸指导的核酸酶或其片段；和
b.权利要求45-57中任一项的至少一种指导核酸。
59.根据权利要求58所述的组合物，其中所述组合物包含至少两个指导核酸。
60.一种细胞或非人类哺乳动物，其包含权利要求58或59的组合物。
61.一种减少细胞中靶病毒的感染和/或复制的方法，其包括：
使所述细胞与权利要求58或59的组合物接触，其中在接触后，所述组合物实现靶病毒在所述细胞中减少的感染和/或复制。
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