JP2023545132A - ジストロフィン機能を修復するためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓをベースにした塩基編集組成物 - Google Patents

Abstract

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集組成物、及びジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法が本明細書中に開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれその全体で本明細書中に参考として組み込まれる、２０２０年１０月１２日に出願の米国仮特許出願第６３／０９０，６８５号、２０２０年１０月１４日に出願の米国仮特許出願第６３／０９１，８８０号、及び２０２１年５月３日に出願の米国仮特許出願第６３／１８３，５４５号の優先権を主張するものである。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、政府支援で、国立衛生研究所によって授与された契約番号第Ｒ０１ＡＲ０６９０８５号の下で行われた。米国政府が本発明の特定の権利を有する。
本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集組成物、及びジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法に向けられる。

序論
デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、典型的にはジストロフィン遺伝子からの１個又は複数個のエクソンの欠失によって引き起こされ、リーディングフレームの破壊がもたらされる。ジストロフィンタンパク質の発現は、１個又は複数個の追加のエクソンの排除を誘導することによってリーディングフレームを補正することによって、修復することができる。ｍＲＮＡスプライシング中のイントロンの除去及び選択されたエクソンの包含は正常遺伝子機能にとって重大であり、遺伝子障害においてしばしば誤調節されている。ｍＲＮＡプロセッシング及びエクソンスキッピング手法などのエクソン選択を変調する技術を使用して、これらの疾患を研究及び処置し得る。エクソンスキッピングは、スプライセオソームによるスプライシング配列の認識を遮断して隣接イントロンと共に特定のエクソンの除去をもたらすことによって、正しいリーディングフレームを修復する又は選択的スプライシングを誘導することを目的とする。研究により、Ｃａｓ９をエクソンのスプライスアクセプターに標的化することによって、ＤＮＡ修復中に生じるインデルがスプライシング部位を破壊し、エクソンを排除する場合があることが示されている。しかし、ジストロフィン機能を完全に及び／又は部分的に修復するためにジストロフィン遺伝子中のスプライシング部位を正確に変更する能力の必要性が残っている。

一態様では、本開示は、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムに関する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むことができ、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号２１～２３若しくは４３又はその相補鎖若しくは断片の少なくとも１個を含む配列を標的化し、及び／又はｇＲＮＡは、配列番号２４～２６若しくは４４又はその相補鎖若しくは断片から選択される配列を含む。
さらなる一態様では、本開示は、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムに関する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むことができ、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、塩基編集ドメインは、配列番号４５～５２から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は配列番号５３～６０から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２７～３４から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は配列番号３５～４２から選択される配列を含むポリペプチドによってコードされる。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更することは、ＲＮＡ転写物中の少なくとも１個のエクソン配列の排除又は包含をもたらす。
本開示の別の態様は、対象においてジストロフィン機能を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むことができ、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号２１～２３若しくは４３又はその相補鎖若しくは断片の少なくとも１個を含む配列を標的化し、及び／又はｇＲＮＡは、配列番号２４～２６若しくは４４又はその相補鎖若しくは断片から選択される配列を含む。
本開示の別の態様は、対象においてジストロフィン機能を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含むことができ、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、塩基編集ドメインは、配列番号４５～５２から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は配列番号５３～６０から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２７～３４から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は配列番号３５～４２から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、対象は変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、対象の変異したジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とする。一部の実施形態では、対象へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの投与は、少なくとも１個のエクソン配列が対象のジストロフィン遺伝子のＲＮＡ転写物から排除又はその中に包含されること、及び対象中のジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修復されることをもたらす。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９を含み、Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を除去する少なくとも１個のアミノ酸変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のアミノ酸変異は、配列番号２又は３に対応するアミノ酸配列中のＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、又はそれらの組合せのうちの少なくとも１個である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号４又は５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、塩基編集ドメインは、（ｉ）シチジンデアミナーゼドメイン及び（ｉｉ）少なくとも１個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインはＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインはラットＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のＵＧＩドメインは、ＵＤＧ活性を阻害することができるドメインを含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のＵＧＩドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列、又は配列番号６若しくは配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、塩基編集ドメインは、１個のＵＧＩドメイン又は２個のＵＧＩドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造：ＮＨ₂－［ＡＢＥ］－［Ｃａｓタンパク質］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号（ｉｎｓｔａｎｃｅ）は任意選択のリンカーを含む）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造：ＮＨ₂－［Ｃａｓタンパク質］－［ＡＢＥ］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は核移行配列（ＮＬＳ）をさらに含む。

本開示の別の態様は、本明細書中に詳述するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている単離したポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードしている第１のポリヌクレオチド及びｇＲＮＡをコードしている第２のポリヌクレオチドを含む。本開示の別の態様は、単離したポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、単離したポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む。本開示の別の態様は、単離したポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。

本開示の別の態様は、本明細書中に詳述するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含む、変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物を提供する。
本開示の別の態様は、本明細書中に詳述するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム、本明細書中に詳述する単離したポリヌクレオチド、本明細書中に詳述するベクター、本明細書中に詳述する細胞、又は本明細書中に詳述する組成物を含むキットを提供する。
本開示の別の態様は、変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞又は対象においてジストロフィン機能を修復するための方法を提供する。方法は、細胞又は対象を、本明細書中に詳述するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムと接触させることを含み得る。一部の実施形態では、変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４５中の「ＡＧ」スプライスアクセプターは「ＧＧ」配列へと変換され、ジストロフィン機能はエクソン４５スキッピングによって修復される。一部の実施形態で対象は、デュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている。
本開示は、以下の詳細な説明及び添付の図面に照らして明らかであろう他の態様及び実施形態を提供する。

Ｃａｓ９構成要素が化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）などの様々な種に由来することができる、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした塩基エディター設計（Komor et al., Nature 2016, 533, 420-424）を示す図である。一部の実施形態では、塩基エディター設計は、シチジンデアミナーゼ、リンカー、ｎＣａｓ９、及びウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含む。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼはＵ：Ｇ→Ｃ：Ｇの復帰変異を触媒する。一部の実施形態では、塩基エディター設計は、ラットシチジンデアミナーゼ、たとえばｒＡＰＯＢＥＣ１などのシチジンデアミナーゼを含む。一部の実施形態では、塩基エディター設計はＸＴＥＮリンカー（１６ａａ）を含む。一部の実施形態では、塩基エディター設計はｎＣａｓ９（ＲＮＡにガイド及び促進された、未編集のＧを有する鎖上のミスマッチ修復）を含む。一部の実施形態では、塩基エディター設計は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージＰＢＳ１由来のＵＧＩなどのＵＧＩを含む。 代替のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした塩基エディター設計を示す図である（Koblan et al., Nature Biotech. (2018) 36(9):843-846）。ＢＥ４ｍａｘ設計では、二分核移行シグナルをＮ及びＣ末端にさらに付加した。８個のコドン使用頻度を試験した。ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ設計では、ＡＰＯＢＥＣに対する祖先配列再構築を使用した。一部の実施形態では、Ｃａｓ９構成要素は、化膿性連鎖球菌及び黄色ブドウ球菌などの様々な種に由来することができる。 プロトスペーサーの位置４～８の５ｂｐウィンドウ中のＣ→Ｔ（又はＧ→Ａ）の塩基編集を示す図である。 塩基切除修復の機構を示す図である。 塩基エディターによるＲ－ループ形成及びシチジンデアミナーゼ酵素とｓｓＤＮＡとの間の相互作用を示す模式図を示す図である。 スプライスアクセプターを塩基編集するためのｇＲＮＡを設計するための模式図、及び「ＡＧ」スプライスアクセプターがＰＡＭの利用可能性（これはＣａｓ９の種に応じて変化し、「Ｓｐ」は化膿性連鎖球菌であり、「Ｓａ」は黄色ブドウ球菌である）によって決定される編集ウィンドウ内に入るための厳密な要件を示す図である。 ｇ１及びＧ２が塩基編集のために標的とされる、エクソン４４及び４５（並びに他の多くのもの）のスプライスアクセプター設計戦略を示す図である。 ５’－ＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＡＡＡＡＧＣＡＴＡ－３’（配列番号９）のエクソン４４ ｇＲＮＡを使用した、エクソン４４のスプライスアクセプター部位での％Ｇ＞Ａ塩基編集（Ｎ＝３）を示す図である。 ５’－ＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＡ－３’（配列番号１）に対応するエクソン４５ ｇＲＮＡを使用した、エクソン４５のスプライスアクセプター部位での％Ｇ＞Ａ塩基編集（Ｎ＝３）を示す図である。 ジストロフィン遺伝子のエクソン４１～５０の模式図を示す図である。 エクソン４４の欠失からもたらされるであろうジストロフィン遺伝子の予想される配列を示す図である。その結果、イントロン４３はイントロン４４内に直接移行するであろう。 エクソン４４が欠失したジストロフィン遺伝子の配列を示す図である。挿入又は欠失は、エクソン４４の欠失の後にイントロン４３とイントロン４４との接合部に存在し得る。 エクソン４４中に欠失を有さないクローンｃ２と比較した、クローンｃ１１中のジストロフィン遺伝子のエクソン４４の欠失の確認を示す図である。 ｉＰＳＣの筋原性分化の模式図を示す図である。 Δ４４変異がジストロフィンタンパク質を切断する、ｉＰＳＣの筋原性分化を示す図である。 Δ４４ ｉＰＳＣ編集のアウトラインを示す図である。 ＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の％Ｇ＞Ａ塩基編集事象を示す図である。 ＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の全てのｇＶＧ０３ ｄ１２編集事象を示す図である。 ＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の％Ｇ＞Ａ塩基編集事象を示す図である。 ＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の全てのｇＶＧ０３ ｄ１２編集事象を示す図である。 ＢＥ４ｍａｘ及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用した１２日後のΔ４４ ｉＰＳＣ編集を示す図である。 編集した細胞のＭｙｏＤ分化のＲＴ－ＰＣＲを示す図である。 ７日目（Ｄ７）及び１４日目（Ｄ１４）にレンチウイルスによって送達したＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の％非Ｇ塩基編集事象を示す図である。 ７日目（Ｄ７）及び１４日目（Ｄ１４）に電気穿孔によって送達したＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の％非Ｇ塩基編集事象を示す図である。 ジストロフィン遺伝子の野生型（ＷＴ）、Δ４４、及びΔ４４～４５バージョンの模式図（左）、並びにＡｎｃＢＥ４ｍａｘ及びエクソン４５ ｇＲＮＡで編集したＭｙｏＤ分化したΔ４４ ｉＰＳＣ細胞のウエスタンブロット（右）を示す図である。 使用した４個のアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）の模式図である（実施例２を参照）。 エクソンスキッピングのために編集されたスプライスアクセプター標的である、Ａ３を示す図である。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において実施した形質移入実験の結果を示す図である。ｇＶＧ５６とＡＢＥ８ｅは、Ｇが優位に編集される、非Ａ塩基へのスプライスアクセプターＡ３の３８．６％の変換を可能にした。 それぞれのエディターで試験した３個の同じｇＲＮＡと、４個の追加のＡＢＥ変異体の拡大パネルで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において実施した形質移入実験の結果を示す図である。試験した全ての変異体にわたり、ｇＲＮＡ ｇＶＧ５６は、ｇＶＧ５５及びｇＶＧ５６と比較してエクソン４５スプライスアクセプター（Ａ３）を編集する最大の能力を示した。 ＳｐＣａｓ９をベースにしたＡＢＥでのｈＤＭＤエクソン４５スプライスアクセプターの「Ａ」を編集するｇＲＮＡ設計の模式図である。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｇ０１、ｇ０２、又はｇ０３ ｇＲＮＡと共にＡＢＥのパネルでのエクソン４５スプライスアクセプターの塩基編集（アデニンＡ３をＣ、Ｇ又はＴに変換）を示すグラフである（ｎ＝３、エラーバーはＳＥＭを表す）。「Ａ」から離れたあらゆる編集が、「ＡＧ」スプライスアクセプターを破壊するはずである。ＡＢＥ８ｅ及びＡＢＥ８．１７は、ｇ０２と対にした場合、この位置で最も効果的な編集を示した。 ＳｐＣａｓ９をベースにしたＡＢＥでのｈＤＭＤ エクソン４５スプライスアクセプターの「Ｇ」を編集するように設計したｇＲＮＡの模式図である。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｇ０４ ｇＲＮＡとＡＢＥのパネルでのエクソン４５スプライスアクセプターの塩基編集（グアニンＧ１をＣ、Ａ又はＴに変換）を示すグラフである（ｎ＝３、エラーバーはＳＥＭを表す）。 ＡＢＥ８ｅでの隣接するＡのバイスタンダー編集を示すグラフである。バイスタンダー編集はスプライス部位の破壊又はコード配列と緩衝するとは考えられない。 ＡＢＥ８．１７ｍでの隣接するＡのバイスタンダー編集を示すグラフである。バイスタンダー編集はスプライス部位の破壊又はコード配列と緩衝するとは考えられない。 ｇ０２でのＡＢＥ８ｅ及びＡＢＥ８．１７ｍ産物の純度を示すグラフである。 Δ４４ヒトｉＰＳＣ株の作成のための模式図である。ＳｐＣａｓ９及び２個のｇＲＮＡを使用してエクソン４４を切除し、ジストロフィンをアウトオブフレームにシフトする。Δ４４細胞におけるリーディングフレームは、エクソン４５をスキッピングすることによって修復され得る。 ｉＰＳＣ編集及び分化のためのレンチウイルスコンストラクトを示す模式図である。Δ４４ ｉＰＳＣは、ＡＢＥ８ｅ又はＡＢＥ８．１７ｍのいずれかで形質導入し、安定株を作成するために選択した。０日目に、ｇ０２又はスクランブルした対照のいずれかを形質導入したが、選択しなかった。ジストロフィン発現を達成するため、ＡＢＥ＋ｇＲＮＡ細胞は、骨格筋培地（ＳＭＭ）中で培養し、構成的ＭｙｏＤ ｃＤＮＡを有するレンチウイルスコンストラクトで形質導入し、低血清条件でさらに分化させた。 ｇＲＮＡ形質導入の４日後、Δ４４ ｉＰＳＣにおいて、ＡＢＥ８ｅ＋ｇ０２が、８８．６％のスプライスアクセプターの塩基編集を示したことを示すグラフである（ｇＲＮＡレンチについては選択なし）。ＭｙｏＤ分化の間にＤＮＡ編集の最小限の増加が観察された。 Δ４４ ｉＰＳＣ＋ＡＢＥ＋ｇＲＮＡ＋ＭｙｏＤ分化の２８日目由来のｃＤＮＡのＲＴ－ＰＣＲ産物を示すゲルである。ＡＢＥ８ｅ＋ｇ０２で観察された高レベルのエクソン４５スプライスアクセプターの塩基編集は、エクソン４５をスキッピングしている転写物に対する強いシフトと対応した。 ｄｄＰＣＲによる２８日目のｃＤＮＡエクソンスキッピングの定量を示すグラフである。ＡＢＥ８ｅ＋ｇ０２は、９６．６％のエクソン４５のスキッピングを示した。 スプライスアクセプターの塩基編集によるジストロフィンタンパク質発現の修復を示すウエスタンブロットである。ＡＢＥ８ｅ＋ｇ０２は、未編集のΔ４４ ｉＰＳＣには存在しないジストロフィンタンパク質発現をレスキューした。 イントロン－エクソン境界を描写する基準のスプライス部位の模式図である。アデニン塩基エディターとシトシン塩基エディターの両方を使用して、スプライスアクセプターを破壊及びエクソンスキッピングを強制し得る。 ｈＤＭＤエクソン４３～４６のリーディングフレームの模式図である。エクソン４４の欠失は、リーディングフレームを破壊し、それはエクソン４５スプライスアクセプターの編集及びその後のエクソン４５のスキッピングによってレスキューされ得る。ｉＰＳＣ由来の心筋細胞（ＣＭ）におけるこの編集を達成するため、ＡＢＥ８ｅ及びＡＢＥ８．１７ｍは、レンチウイルスコンストラクト中で送達された。 選択せずに、塩基エディター及びｇＲＮＡレンチウイルスの形質導入の５日後のΔ４４ ｉＰＳＣ由来のＣＭにおける塩基編集を示すグラフである。編集ウィンドウ内の全てのアデニンを示し、Ａ３に主なスプライスアクセプター標的を有する。ＡからＣ、Ｇ又はＴの変換を有するリードのパーセントを、インデル（黒）を含有するリードのパーセントと共に、プロットした（ｎ＝３、エラーバーはＳＥＭを表す）。 エクソン４２及び４６においてプライマーで増幅した塩基編集したＣＭ由来のＲＮＡにおけるエンドポイントＲＴ－ＰＣＲからの産物を示すゲルである。 塩基編集したＣＭにおけるエクソンスキッピングのｄｄＰＣＲ定量を示すグラフである。編集頻度は、編集及び未編集の転写物の合計によって割られた、編集した転写物として算出した（ｎ＝３、エラーバーはＳＥＭを表す）。 ジストロフィン（ＭＡＮＤＹＳ１０６）及びＧＡＰＤＨを染色した、塩基編集したＣＭのウエスタンブロットである。

本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集組成物、及びジストロフィン機能を修復することによってデュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を処置する方法を提供する。ＤＭＤは、典型的には、リーディングフレームを破壊するジストロフィン遺伝子中の欠失によって引き起こされる。内部で切断されたジストロフィンタンパク質は部分的に機能的であり続けることができることが示されているため、ＤＭＤを処置するための多くの戦略は、追加のエクソンを除去又はスキップすることによってリーディングフレームを修復することを目的としている。哺乳動物遺伝子中に、イントロンとエクソンとの間の境界を印す保存された配列が存在する。１個の重要なスプライシング部位は、エクソンに先行し、スプライスアクセプターと呼ばれる「ＡＧ」である。完全ヌクレアーゼＣａｓ９を使用して、ジストロフィンエクソンのスプライスアクセプターを標的としてスキッピングを強制しており、それによって、スプライシング部位を切断するために、ＤＮＡ修復プロセス中に形成されたセミランダムインデルに依存している。本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、「ＡＧ」スプライスアクセプターを、エクソンスキッピングを促進する「ＡＡ」又は「ＧＧ」へと確かに変換するための、より正確な塩基編集方法を可能にする。慣用のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムによって生じたセミランダムインデルとは対照的に、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導せずに単一塩基対の正確な改変のために、塩基編集技術が開発されている。塩基エディターは、Ｃを直接Ｔに、又は逆鎖上のＧをＡに変えることができ、これらは、ｍＲＮＡスプライシングを変調するために様々なエクソンのスプライスドナー「ＧＴ」及びアクセプター「ＡＧ」の両方を標的とし得る。

１．定義
別段に定義しない限りは、本明細書中において使用する全ての技術及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合は、定義を含めた本文書が支配する。好ましい方法及び材料は以下に記載されているが、本明細書中に記載のものと同様又は均等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができる。本明細書中で言及する全ての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体で参考として組み込まれている。本明細書中に開示する材料、方法、及び例は、例示的のみであり、限定することを意図しない。

本明細書中で使用する用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」、及びその変形は、追加の動作又は構造の可能性を排除しない、開放型の移行句、用語、又は単語であることを意図する。単数形「ａ」、「ａｎｄ」、及び「ｔｈｅ」は、内容により明らかにそうでないと指示されない限りは、複数形の参照物を含む。また、本開示は、明確に記載されているかどうかにかかわらず、本明細書中に提示する実施形態又は要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
本明細書中の数値範囲の列挙については、それらの間のそれぞれの介在する数値が同じ度合の精度で明確に企図される。たとえば、６～９の範囲では、６及び９の数値に加えて７及び８が企図され、６．０～７．０の範囲では、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０の数値が明確に企図される。

本明細書中で使用する用語「およそ」又は「約」とは、目的の１個若しくは複数個の値に適用される場合、記載した参照値に類似している値をいう。用語「およそ」又は「約」とは、当業者によって決定された特定の値について許容される誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。たとえば、「およそ」は、当分野における実施に従って、３以内又は３を超える標準偏差を意味することができる。或いは、「およそ」は、所定の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、さらにより好ましくは１％までの範囲を意味することができる。或いは、特に生物系又は生物学的過程に関して、この用語は、値の１０倍以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。ある特定の態様では、用語「およそ」は、他に記載しない限り又は文脈から他に明らかではない限り、記載した参照値のいずれかの方向（より大きいか又はより小さい）で、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％又はそれ以下以内にある値の範囲をいう（そのような数が可能値の１００％を超える場合を除く）。

本明細書中で互換性があるように使用される「アデノ随伴ウイルス」又は「ＡＡＶ」とは、ヒト及び一部の他の霊長類種に感染する、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科のディペンドウイルス（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）属に属する小さなウイルスをいう。ＡＡＶは現在、疾患を引き起こすことは知られておらず、したがって、このウイルスは非常に緩和な免疫応答を引き起こす。
本明細書中で使用する「アミノ酸」とは、天然に存在する及び天然に存在しない合成のアミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるものである。アミノ酸は、その一般的に知られている三文字表記によって、又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される一文字標記によってのどちらかで、本明細書中で言及することができる。アミノ酸は側鎖及びポリペプチド主鎖部分を含む。

本明細書中で使用する「結合領域」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムによって認識されてそれと結合する、標的領域内の領域をいう。
本明細書中で使用する「クロマチン」とは、ヒストンに関連する染色体ＤＮＡの組織的な複合体をいう。
本明細書中で互換性があるように使用される「クラスター化された定期間隔の短い回文構造反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）」及び「ＣＲＩＳＰＲ」とは、配列決定された細菌の約４０％及び配列決定された古細菌の９０％のゲノム中に見つかる、複数の短い直接反復を含有する座位をいう。

本明細書中で使用する「コード配列」又は「コードしている核酸」とは、タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ分子）を意味する。コード配列は、プロモーター及びポリアデニル化シグナルを含めた調節要素と作動可能に連結された、核酸を投与する個体又は哺乳動物の細胞中において発現を指示することができる、開始及び終止シグナルをさらに含むことができる。調節要素は、たとえば、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、ストップコドン、又はポリアデニル化シグナルを含み得る。コード配列はコドン最適化されていてよい。
核酸に関して本明細書中で使用する「相補体」又は「相補物」とは、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（たとえばＡ－Ｔ／Ｕ及びＣ－Ｇ）又はフーグスティーン塩基対合を形成することができる核酸を意味する。「相補性」とは、互いに逆平行にアラインメントされた際にそれぞれの位置でのヌクレオチド塩基が相補的となるような、２個の核酸配列間で共有される特性をいう。

用語「対照」、「参照レベル」、及び「参照」は、本明細書中で互換性があるように使用される。参照レベルは、測定した結果をそれに対して評価するためのベンチマークとして使用する、事前に決定された値又は範囲であり得る。本明細書中で使用する「対照群」とは、対照対象の群をいう。事前に決定されたレベルは対照群からのカットオフ値であり得る。事前に決定されたレベルは対照群からの平均であり得る。カットオフ値（又は事前に決定されたカットオフ値）は、適応的指標モデル（ＡＩＭ）方法によって決定し得る。カットオフ値（又は事前に決定されたカットオフ値）は、患者群の生体試料からの受信者動作曲線（ＲＯＣ）分析によって決定し得る。生物分野において一般に知られているＲＯＣ分析は、たとえば、ＣＲＣを有する患者の同定においてそれぞれのマーカーの性能を決定するための、１つの状態を別の状態から識別するための試験の能力の決定である。ＲＯＣ分析の説明は、その開示がその全体で本明細書中に参考として組み込まれているP.J. Heagerty et al. (Biometrics 2000, 56, 337-44)中に提供されている。或いは、カットオフ値は、患者群の生体試料の四分位数分析によって決定し得る。たとえば、カットオフ値は、２５～７５パーセンタイルの範囲内の任意の値に対応する値、好ましくは、２５パーセンタイル、５０パーセンタイル、又は７５パーセンタイル、より好ましくは７５パーセンタイルに対応する値を選択することによって決定し得る。そのような統計分析は、当分野で知られている任意の方法を使用して行ってよく、任意数の市販のソフトウェアパッケージ（たとえば、Ａｎａｌｙｓｅ－ｉｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｌｔｄ．、英国Ｌｅｅｄｓ、ＳｔａｔａＣｏｒｐ ＬＰ、テキサス州Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｓｔａｔｉｏｎ、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州Ｃａｒｙのもの）によって実装することができる。標的について、又はタンパク質活性についての健康又は正常なレベル又は範囲は、標準の実施に従って定義し得る。対照は、本明細書中に詳述するコンストラクト又はシステムを有さない対象又は細胞であり得る。対照は、その病状が既知である対象、又はそれ由来の試料であり得る。対象、又はそれ由来の試料は、健康、疾患状態、疾患状態で処置前、疾患状態で処置中、若しくは疾患状態で処置後、又はその組合せであり得る。

本明細書中で互換性があるように使用される「デュシェンヌ筋ジストロフィー」又は「ＤＭＤ」とは、筋変性及び最終的には死をもたらす、劣性の致命的なＸ連鎖の障害をいう。ＤＭＤは、５０００人に１人の男性に起こる、一般的な遺伝性の一遺伝子的疾患である。ＤＭＤは、ナンセンス又はフレームシフトのジストロフィン遺伝子中の変異を引き起こす遺伝性又は自発性の変異の結果である。ＤＭＤを引き起こすジストロフィン変異の大多数は、リーディングフレームを破壊し、ジストロフィン遺伝子の未熟な翻訳終止を引き起こす、エクソンの欠失である。ＤＭＤ患者、典型的には、小児期中に自身を物理的に支持する能力を失い、ティーンエージ期中に進行的に脆弱になり、その二十代に亡くなる。
本明細書中で使用する「ジストロフィン」とは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、桿形状の細胞質タンパク質をいう。ジストロフィンは、筋肉細胞の完全性及び機能の調節を司っている細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。本明細書中で互換性があるように使用されるジストロフィン遺伝子又は「ＤＭＤ遺伝子」は、座位Ｘｐ２１で２．２メガ塩基である。一次転写物ではおよそ２，４００ｋｂが測定され、成熟ｍＲＮＡはおよそ１４ｋｂである。７９個のエクソンは、３５００個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている。

本明細書中で使用する「エクソン４５」とは、ジストロフィン遺伝子の４５エクソンをいう。エクソン４５は、ＤＭＤ患者中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接しており、オリゴヌクレオチドをベースにしたエクソンスキッピングについて臨床治験で標的とされている。
本明細書中で使用する「エンハンサー」とは、複数の活性化因子及びリプレッサー結合部位を含有する非コードＤＮＡ配列をいう。エンハンサーは、２００ｂｐ～１ｋｂの長さの範囲であり、近位、すなわち、プロモーターの５’上流側若しくは調節される遺伝子の第１のイントロン内、又は遠位、すなわち、隣接遺伝子のイントロン若しくは座位からかなり離れた遺伝子間領域中のいずれかであり得る。ＤＮＡルーピングを通じて、活性エンハンサーは、コアＤＮＡ結合モチーフプロモーターの特異性に依存的に、プロモーターと接触する。４～５個のエンハンサーが１個のプロモーターと相互作用し得る。同様に、エンハンサーは、連結の制限なしに複数の遺伝子を調節する場合があり、より遠位のものを調節するために隣接遺伝子を「スキップ」する場合がある。転写調節は、プロモーターが存在するものとは異なる染色体中に位置する要素に関与していてもよい。隣接遺伝子の近位エンハンサー又はプロモーターは、より遠位の要素を動員するためのプラットフォームとして役割と果たし得る。
本明細書中で互換性があるように使用される「フレームシフト」又は「フレームシフト変異」は、１個若しくは複数個のヌクレオチドの付加又は欠失が、ｍＲＮＡのコドンのリーディングフレームにおけるシフトを引き起こす遺伝子変異の型をいう。リーディングフレームにおけるシフトは、タンパク質翻訳でのアミノ酸配列の変更、たとえばミスセンス変異又は未熟なストップコドンをもたらし得る。

本明細書中で使用する「機能的」及び「完全に機能的」とは、生物活性を有するタンパク質を説明する。「機能的遺伝子」とは、ｍＲＮＡへと転写される遺伝子をいい、これが機能的タンパク質へと翻訳される。
本明細書中で使用する「融合タンパク質」とは、元は別々のタンパク質をコードしていた２個以上の遺伝子を結合させることによって作製した、キメラタンパク質をいう。融合遺伝子の翻訳は、元のタンパク質のそれぞれに由来する機能的特性を有する単一のポリペプチドをもたらす。
本明細書中で使用する「遺伝子コンストラクト」とは、タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子をいう。コード配列は、プロモーター及びポリアデニル化シグナルを含めた調節要素と作動可能に連結された、核酸分子を投与する個体の細胞中において発現を指示することができる、開始及び終止シグナルを含む。本明細書中で使用する用語「発現可能な形態」とは、個体の細胞中に存在する場合にコード配列が発現されるように、タンパク質をコードしているコード配列と作動可能に連結されている、必要な調節要素を含有する遺伝子構築物をいう。調節要素は、たとえば、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、ストップコドン、又はポリアデニル化シグナルを含み得る。

本明細書中で使用する「ゲノム編集」とは、完全長の機能的又は部分的に完全長の機能的タンパク質発現が得られるように、機能不全タンパク質若しくはトランケートタンパク質をコードするか、又はタンパク質を全くコードしない変異遺伝子を変えることをいう。ゲノム編集は、変異遺伝子を補修又は修復することを含み得る。ゲノム編集は、スプライスアクセプター部位又はスプライスドナー配列を変更するための塩基編集を含み得る。ゲノム編集、たとえば塩基編集は、目的遺伝子を変えることによって疾患を処置する又は筋肉修復を増強させるために使用し得る。一部の実施形態では、本明細書中に詳述する組成物及び方法は、体細胞での使用のためであり、生殖系列細胞ではない。
本明細書中で使用する用語「異種」とは、自然においては互いに同じ関係性では見つからない２個以上の部分配列を含む核酸をいう。たとえば、組換え産生させた核酸は、典型的には、合成的に配置されて新しい機能的核酸を作る、関連性のない遺伝子由来の２個以上の配列、たとえば、１個の供給源由来のプロモーター及び別の供給源由来のコード領域を有する。したがって、２個の核酸は、この文脈において互いに異種である。細胞に加えた際は、組換え核酸も細胞の内在遺伝子に対して異種となるであろう。したがって、染色体中において、異種核酸は、染色体内に組み込まれた非ネイティブ（天然に存在しない）核酸、又は非ネイティブ（天然に存在しない）染色体外核酸を含むであろう。同様に、異種タンパク質は、タンパク質が、自然においては互いに同じ関係性では見つからない２個以上の部分配列（たとえば、２個の部分配列が単一の核酸配列によってコードされる「融合タンパク質」）を含むことを示す。

２個以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において本明細書中で使用する「同一」又は「同一性」とは、配列が、指定された領域にわたって同じである、指定された残基百分率を有することを意味する。百分率は、２個の配列を最適にアラインメントすること、２個の配列を指定された領域にわたって比較すること、両方の配列中で同一の残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を指定された領域中の位置の総数で除算すること、及び結果を１００で乗算して配列同一性の百分率を得ることによって計算し得る。２個の配列が異なる長さのものである、又はアラインメントにより１個又は複数個のねじれ型末端が生じ、指定された比較領域が単一の配列のみを含む場合は、単一配列の残基を計算の分母には含めるが分子には含めない。ＤＮＡ及びＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）は均等物としてみなし得る。同一性は、手動で、又はＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって行い得る。

本明細書中で互換性があるように使用される「変異遺伝子」又は「変異した遺伝子」とは、検出可能な変異を受けた遺伝子をいう。変異遺伝子は、遺伝子の正常な伝達及び発現に影響を与える、遺伝物質の喪失、獲得、又は交換などの変化を受けている。本明細書中で使用する「破壊された遺伝子」とは、未熟なストップコドンの原因となる変異を有する変異遺伝子をいう。破壊された遺伝子産物は、完全長の破壊されていない遺伝子産物と比較して切断されている。
本明細書中で使用する「正常遺伝子」とは、遺伝物質の喪失、獲得、又は交換などの変化を受けていない遺伝子をいう。正常遺伝子は正常な遺伝子伝達及び遺伝子発現を受ける。たとえば、正常遺伝子は野生型遺伝子であり得る。
本明細書中で使用する「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」とは、一緒に共有結合された少なくとも２個のヌクレオチドを意味する。単鎖の描写は相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸は、示した単鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くの変異体を同じ目的で所定の核酸として使用し得る。したがって、核酸は、実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。単鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブも包含する。

核酸は、一本鎖若しくは二本鎖であり得るか、又は、二本鎖及び一本鎖の配列の両方の一部分を含有し得る。核酸は、ＤＮＡ（ゲノム及びｃＤＮＡの両方）、ＲＮＡ、又はハイブリッドであってよく、核酸は、デオキシリボ－及びリボ－ヌクレオチドの組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、及びイソグアニンを含めた塩基の組合せを含有し得る。核酸は、化学合成方法によって又は組換え方法によって得られ得る。

「オープンリーディングフレーム」は、開始コドンで始まり、ストップコドンで終わるコドンのストレッチをいう。複数のエクソンを有する真核生物の遺伝子では、イントロンが除去され、次いでエクソンが転写後に接続され、タンパク質翻訳のための最終ｍＲＮＡが生じる。オープンリーディングフレームは、コドンの連続するストレッチであり得る。一部の実施形態では、オープンリーディングフレームは、タンパク質の発現のため、ゲノムＤＮＡではなく、スプライスされたｍＲＮＡにのみ適用する。
本明細書中で使用する「作動可能に連結される」とは、遺伝子の発現が、それが空間的に接続されるプロモーターの制御下にあることを意味する。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）又は３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子における、プロモーターとそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能の喪失なしに適応され得る。

核酸又はアミノ酸配列は、互いに機能的関係に配置されている場合に、「作動可能に連結される」（又は「稼働可能に連結される」）。たとえば、プロモーター又はエンハンサーは、コード配列の転写を調節する、又はその変調に寄与する場合に、コード配列と作動可能に連結される。作動可能に連結されるＤＮＡ配列は典型的には連続的であり、作動可能に連結されるアミノ酸配列は、典型的には連続的であり、かつ同じリーディングフレーム中にある。しかし、エンハンサーは、一般に、プロモーターから数キロ塩基まで、又はそれより多く隔てられている場合に機能し、イントロン配列は可変の長さであってよいため、一部のポリヌクレオチド要素は作動可能に連結されるが連続的ではない場合がある。同様に、一次ポリペプチド配列中で非連続的である特定のアミノ酸配列は、たとえばポリペプチド鎖の折り畳みのおかげで、依然として作動可能に連結される場合がある。融合ポリペプチドに関して、用語「稼働可能に連結される」及び「作動可能に連結される」とは、構成要素のそれぞれが、他の構成要素と連結されて、そのように連結されていないかのように、同じ機能を行うことをいうことができる。
本明細書中で使用する「部分的に機能的」とは、変異遺伝子によってコードされており、機能的タンパク質よりも低いが非機能的タンパク質よりも高い生物活性を有するタンパク質を説明する。

「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結された２個以上のアミノ酸の連結配列である。ポリペプチドは、天然、合成、若しくは改変、又は天然と合成の組合せであることができる。ペプチド及びポリペプチドとしては、結合タンパク質、受容体、及び抗体などのタンパク質が挙げられる。用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」は、本明細書中で互換性があるように使用される。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に秩序付けられた三次元構造をいう。これらの構造は、一般的に、ドメイン、たとえば、酵素ドメイン、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ポアドメイン、及び細胞質側末端ドメインとして知られる。「ドメイン」とは、コンパクトなポリペプチドユニットを形成し、典型的には１５～３５０個のアミノ酸の長さである、ポリペプチドの一部分である。例示的なドメインとしては、酵素活性又はリガンド結合活性を有するドメインが挙げられる。典型的なドメインは、ベータシート及びアルファヘリックスの区間などの、より組織性の低いセクションからなる。「三次構造」とは、ポリペプチド単量体の完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次ユニットの非共有的会合によって形成された三次元構造をいう。「モチーフ」とは、ポリペプチド配列の一部分であり、少なくとも２個のアミノ酸を含む。モチーフは、たとえば、２～２０、２～１５、又は２～１０個のアミノ酸の長さであり得る。一部の実施形態では、モチーフは３、４、５、６、又は７個の連続的なアミノ酸を含む。ドメインは、一連の同じ種類のモチーフからなり得る。

本明細書中で互換性があるように使用される「未熟なストップコドン」又は「アウトオブフレームストップコドン」とは、野生型遺伝子中には通常見つからない位置にストップコドンをもたらす、ＤＮＡの配列中のナンセンス変異をいう。未熟なストップコドンは、タンパク質の完全長バージョンと比較してタンパク質が切断される又は短くなることを引き起こし得る。
本明細書中で使用する「プロモーター」とは、細胞中の核酸の発現を与える、活性化する、又は増強させることができる、合成又は天然由来の分子を意味する。プロモーターは、発現をさらに増強させるため、並びに／又はその空間的発現及び／若しくは時間的発現を変更するために、１個又は複数個の特定の転写調節配列を含み得る。また、プロモーターは、遠位のエンハンサー又はリプレッサー要素も含んでいてよく、これは、転写の開始部位から数千塩基対もの場所に位置していてよい。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含めた供給源に由来し得る。プロモーターは、構成的に、又は発現が起こる細胞、組織、若しくは臓器に関して発現が起こる発生段階に関して示差的に、又は生理的ストレス、病原体、金属イオン、若しくは誘導剤などの外部刺激に応答して、遺伝子構成要素の発現を調節し得る。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、又はＳＶ４０後期プロモーター、ヒトＵ６（ｈＵ６）プロモーター、及びＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。筋肉特異的幹細胞を標的とするプロモーターとしては、ＣＫ８プロモーター、Ｓｐｃ５－１２プロモーター、及びＭＨＣＫ７プロモーターが挙げられ得る。

たとえば、細胞、又は核酸、タンパク質、若しくはベクターを参照して使用する用語「組換え」とは、細胞、核酸、タンパク質、又はベクターが、異種核酸若しくはタンパク質の導入又はネイティブ核酸若しくはタンパク質の変更によって改変されている、或いは、細胞が、そのように改変した細胞に由来することを示す。したがって、たとえば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（天然に存在する）形態内に見つからない遺伝子を発現する、或いは、そうでなければ正常若しくは異常に発現される、過少発現される、又は全く発現されない、ネイティブ遺伝子の第２のコピーを発現する。
本明細書中で使用する「骨格筋」とは、体性神経系の制御下にあり、腱として知られるコラーゲン線維の束によって骨に付着している、横紋筋の一種をいう。骨格筋は、筋細胞、又は「筋肉細胞」として知られ、場合によっては口語的に「筋線維」と呼ばれる、個々の構成要素からなる。筋細胞は、筋形成として知られるプロセスにおける、発達筋芽細胞（筋肉細胞を生じさせる胚性前駆細胞の一種）の融合から形成される。これらの長い、円柱状、多核の細胞は筋原線維とも呼ばれる。

本明細書中で使用する「試料」又は「試験試料」は、標的の存在及び／又はレベルが検出されるか若しくは決定されるあらゆる試料、又は本明細書中で詳述するＤＮＡ標的化若しくは遺伝子編集システム若しくはその成分を含むあらゆる試料を意味し得る。試料は、液体、溶液、エマルジョン、又は懸濁液を含み得る。試料は、医学的試料を含み得る。試料は、あらゆる生体液又は組織、たとえば血液、全血、血漿及び血清などの血液の画分、筋肉、間質液、汗、唾液、尿、涙、滑液、骨髄、脳脊髄液、鼻汁、痰、羊水、気管支肺胞洗浄液、胃洗浄、嘔吐、排泄物、肺組織、末梢血単核細胞、総白血球、リンパ節細胞、脾臓細胞、扁桃細胞、がん細胞、腫瘍細胞、胆汁、消化液、皮膚、又はこれらの組合せを含み得る。一部の実施形態では、試料はアリコットを含む。他の実施形態では、試料は生体液を含む。試料は、当技術分野で公知のあらゆる手段によって得られ得る。試料は、患者から得られたように直接使用され得るか、又は、たとえば濾過、蒸留、抽出、濃縮、遠心分離、干渉する成分の不活性化、試薬の添加等によって前処置され、本明細書中で議論するのと同じ方法で、又はそうでなければ当技術分野で公知のように試料の特徴を改変し得る。

本明細書中で使用する「骨格筋状態」とは、筋ジストロフィー、加齢、筋変性、創傷治癒、及び筋力低下又は萎縮などの、骨格筋に関連する状態をいう。
本明細書中で互換性があるように使用される「対象」及び「患者」とは、それだけには限定されないが、哺乳動物を含めた、任意の脊椎動物をいう。対象は、ヒト又は非ヒトであり得る。対象は、脊椎動物であり得る。対象は、哺乳動物であり得る。哺乳動物は、霊長類又は非霊長類であり得る。哺乳動物は、非霊長類、たとえば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ハリネズミ、アリクイ、カモノハシ、ゾウ、アルパカ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、及びマウスであり得る。哺乳動物は、霊長類、たとえばヒトであり得る。哺乳動物は、非ヒト霊長類、たとえば、サル、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジー、ゴリラ、オランウータン、及びテナガザルであり得る。対象又は患者は、他の形態の処置を受けていてもよい。対象は、たとえば、成人、青年、又は０～２歳、２～４歳、２～６歳、又は６～１２歳などの小児、又は０～１歳などの乳児などの、あらゆる年齢又は発生段階のものであり得る。対象は雄であり得る。対象は雌であり得る。一部の実施形態では、対象は特定の遺伝子マーカーを有する。

「実質的に同一」は、第１及び第２のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列が、それぞれ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００アミノ酸又はヌクレオチドの領域にわたり、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であることを意味し得る。
本明細書中で使用する「標的遺伝子」は、公知又は推定の遺伝子産物をコードするあらゆるヌクレオチド配列をいう。標的遺伝子は、遺伝性疾患に関与する変異した遺伝子であり得る。標的遺伝子は、補修されることが意図されるか又はそのためにその発現が調節されることが意図される、公知又は推定の遺伝子産物をコードし得る。ある特定の実施形態では、標的遺伝子は、ジストロフィン遺伝子である。本明細書中で使用する「標的領域」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした遺伝子編集又は標的化システムが結合するように設計された標的遺伝子の領域をいう。

「転写調節要素」又は「調節要素」は、核酸配列の発現を制御し得る、たとえば、発現を活性化、エンハンサー、若しくは減少させるか又は、核酸配列の空間的及び／又は一時的な発現を変更する遺伝要素をいう。調節要素の例としては、たとえば、プロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、及び終結シグナルが挙げられる。調節要素は、それが作動可能に連結される遺伝子に関して、「内因性」、「外因性」、又は「異種性」であり得る。「内因性」調節要素は、ゲノム中の所与の遺伝子と自然に連結されるものである。「外因性」又は「異種性」調節要素は、通常、所与の遺伝子に連結されていないが、遺伝子操作によって遺伝子と作動可能な連結に置かれるものである。

「処置する」、「処置すること」、又は「処置」とは、本明細書中でそれぞれ互換性があるように使用され、そのような用語が適用される疾患、又はそのような疾患の１種若しくは複数種の症状の進行を逆転、軽減、又は阻害することを説明する。対象の状態に応じて、この用語は疾患を防止することもいい、疾患の発症を防止すること、又は疾患に関連する症状を防止することを含む。処置は、急性又は慢性の様式のどちらかで行い得る。この用語はまた、疾患又はそのような疾患に関連する症状の重篤度を、疾患を罹患する前に低下させることもいう。そのような疾患の重篤度の、罹患前の防止又は低下とは、本発明の抗体又は医薬組成物を、投与時に疾患を患っていない対象に投与することをいう。「防止すること」とは、疾患又はそのような疾患に関連する１種若しくは複数種の症状の再発を防止することもいう。「処置」及び「治療上」とは、上記定義した「処置すること」のように処置する行為をいう。

核酸に関して本明細書中で使用する「変異体」とは、（ｉ）参照したポリヌクレオチド配列の一部分若しくは断片、（ｉｉ）参照したポリヌクレオチド配列若しくはその一部分の相補体、（ｉｉｉ）参照した核酸若しくはその相補体と実質的に同一である核酸、又は（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で、参照した核酸、その相補体、若しくはそれと実質的に同一である配列とハイブリダイズする核酸を意味する。
アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１種の生物活性を保持している、ペプチド又はポリペプチドに関する「変異体」。また、変異体は、参照したタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有しており、少なくとも１種の生物活性を保持しているアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。アミノ酸の保存的置換、たとえば、アミノ酸を、同様の特性（たとえば、親水性、荷電領域の度合及び分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、当分野において、典型的には軽微な変化に関与するとして認識されている。これらの軽微な変化は、当分野において理解されるようにアミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することによって、部分的に同定し得る。（Kyte et al., J. Mol. Biol. 1982, 157, 105-132）。アミノ酸の疎水性親水性指標は、その疎水性及び荷電の考慮に基づく。同様の疎水性親水性指標のアミノ酸を置換しても、依然としてタンパク質機能を保持し得ることが、当分野で知られている。一態様では、±２の疎水性親水性指標を有するアミノ酸を置換する。また、アミノ酸の親水性を使用して、生物学的機能を保持しているタンパク質をもたらす置換も明らかにし得る。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行い得る。アミノ酸の疎水性指標及び親水性値はどちらも、そのアミノ酸の具体的な側鎖によって影響を受ける。この観察と一貫して、生物学的機能と適合性のあるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、荷電、大きさ、及び他の特性によって明らかにされる、アミノ酸の相対的類似度、具体的にはこれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解されている。

本明細書中で使用する「ベクター」とは、複製起点を含有する核酸配列を意味する。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、又は酵母人工染色体であり得る。ベクターはＤＮＡ又はＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製する染色体外ベクターであってよく、好ましくはＤＮＡプラスミドである。たとえば、ベクターは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、たとえば、配列番号７若しくは配列番号８、及び／又は配列番号１若しくは配列番号２１～２６若しくは４３～４４の１つの少なくとも１個のｇＲＮＡポリヌクレオチド配列を含む、本明細書中に記載するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードし得る。

２．ジストロフィンを修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを本明細書中で提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更するために使用し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、ジストロフィン遺伝子機能の修復において使用するためのものであり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み得る。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡが、配列番号２１～２３若しくは４３、又はその相補鎖若しくは変異体若しくは断片の少なくとも１個を含む配列を標的化し、及び／又は少なくとも１個のｇＲＮＡが、配列番号２４～２６若しくは４４、又はその相補鎖若しくは変異体若しくは断片から選択される配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１のポリヌクレオチド配列によってコードされる。融合タンパク質は２個の異種ポリペプチドドメインを含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含む。一部の実施形態では、塩基編集ドメインは、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２７～３４から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は配列番号３５～４２から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、ａ）配列番号１の断片、ｂ）配列番号１の相補体、又はその断片、ｃ）配列番号１と実質的に同一である核酸、又はその相補体、或いはｄ）ストリンジェントな条件下で配列番号１とハイブリダイズする核酸、その相補体、又はそれに実質的に同一な配列に対応するポリヌクレオチド配列と結合し、それを標的とする。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１に対応するポリヌクレオチド配列、又はその変異体を含む。

ａ．ジストロフィン遺伝子
ジストロフィンは、筋線維の細胞骨格を、周囲の細胞外基質を通じて細胞膜に接続させるタンパク質複合体の一部である、棹形状の細胞質タンパク質である。ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体に構造的安定性をもたらす。ジストロフィン遺伝子は、座位Ｘｐ２１で２．２メガ塩基である。一次転写物ではおよそ２，４００ｋｂが測定され、成熟ｍＲＮＡはおよそ１４ｋｂである。７９個のエクソンは３５００個のアミノ酸を超えるタンパク質をコードしている。正常な骨格筋組織は少量のみのジストロフィンを含有するが、異常発現によるジストロフィンの非存在は重篤かつ不治の症状の発生をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の変異は、罹患患者において欠損ジストロフィンの産生及び重篤なジストロフィー表現型をもたらす。ジストロフィン遺伝子中の一部の変異は、罹患患者において、部分的に機能的なジストロフィンタンパク質及びはるかにより緩和なジストロフィー表現型をもたらす。

ＤＭＤは、ジストロフィン遺伝子中のナンセンス又はフレームシフトの変異を引き起こす遺伝性又は自発性の変異の結果である。天然に存在する変異及びその結果は、ＤＭＤについて比較的よく理解されている。桿状ドメイン内に含有されるエクソン４５～５５領域中に起こるインフレーム欠失が、高度に機能的なジストロフィンタンパク質を産生することができ、多くのキャリアは無症候性であるか、緩和な症状を表示することが知られている。さらに、６０％を超える患者が、理論的には、ジストロフィン遺伝子のこの領域中のエクソンを標的化することによって処置し得る。ｍＲＮＡスプライシング中に非必須エクソンをスキップすること（たとえばエクソン４５スキッピング）して、内部欠失であるが機能的なジストロフィンタンパク質を生じさせることによって、ＤＭＤ患者中の破壊されたジストロフィンリーディングフレームを修復する努力がなされている。内部ジストロフィンエクソンの欠失（たとえばエクソン４５の欠失）は、適切なリーディングフレームを保持しており、内部的に切断されているが部分的に機能的なジストロフィンタンパク質を生じることができる。ジストロフィンのエクソン４５～５５の間の欠失は、ＤＭＤと比較してはるかにより緩和な表現型をもたらす。

ヒトＤＭＤエクソン４５は、スキップされた場合に２番目に大きなＤＭＤ患者群（８．１％）を処置する可能性があるエクソンであるため、ＤＭＤエクソンスキッピングへの塩基編集の適用を実証するための魅力的なエクソンであり得る。ある特定の実施形態では、リーディングフレームを修復するためのエクソン４５の切除は、欠失変異を有するＤＭＤ対象を含めたＤＭＤ対象において表現型を寛解させる。ある特定の実施形態では、ジストロフィン遺伝子のエクソン４５とは、ジストロフィン遺伝子の４５番目のエクソンをいう。エクソン４５は、ＤＭＤ患者中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接しており、オリゴヌクレオチドをベースにしたエクソンスキッピングについて臨床治験において標的とされている。

本明細書中に詳述するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更するために使用し得る。一部の実施形態では、ゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更することは、ＲＮＡ転写物中の少なくとも１個のエクソン配列の排除又は包含をもたらす。本明細書中に詳述するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、対象におけるジストロフィン機能を修復するために使用し得る。一部の実施形態では、対象は変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、対象の変異したジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とする。一部の実施形態では、対象へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの投与は、少なくとも１個のエクソン配列が対象のジストロフィン遺伝子のＲＮＡ転写物から排除又はその中に包含されること、及び対象中のジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修復されることをもたらす。

本明細書中に開示するシステム及びベクターは、ジストロフィン遺伝子、たとえばヒトジストロフィン遺伝子中のエクソン４５でスプライスアクセプター部位を変更することができる。スプライスアクセプター部位の変更は、エクソン４５がジストロフィンタンパク質産物から欠失すること（すなわちエクソン４５スキッピング）をもたらす可能性があり、コードされるジストロフィンタンパク質の機能若しくは活性を増加させる、又は対象の病状の改善をもたらす可能性がある。ある特定の実施形態では、エクソン４５スキッピングは、ジストロフィンリーディングフレームを修復することができる。一部の実施形態では、エクソン４５でのスプライスアクセプター部位は、配列番号１のポリヌクレオチド配列を含む配列内にある。一部の実施形態では、エクソン４５のスプライスアクセプター部位は、配列番号２１～２３及び４３から選択されるポリヌクレオチド配列を含む配列内である。
本明細書中に開示するシステム又は遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ジストロフィン遺伝子（たとえばヒトジストロフィン遺伝子）の高効率のエクソン４５スキッピングを媒介することができる。本明細書中に開示するシステム又は遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ＤＭＤ患者由来の細胞中におけるジストロフィンタンパク質発現を修復し得る。エクソン４５は、ＤＭＤ中においてフレームを破壊する欠失にしばしば隣接している。エクソンスキッピングによるジストロフィン転写物からのエクソン４５の除去を使用して、全ＤＭＤ患者の約８％を処置することができる。本明細書中に開示するシステム又は遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）を、ヒトＤＭＤ細胞内に形質移入させ、正しいリーディングフレームへの効率的な遺伝子の改変及び変換を媒介し得る。タンパク質修復はフレーム修復と同時であってよく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムで処置した細胞のバルク集団中において検出する。

ｂ．融合タンパク質
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、融合タンパク質又は融合タンパク質をコードしている核酸配列を含む。融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はＤＮＡである。一部の実施形態では、融合タンパク質をコードしている核酸配列はＲＮＡである。
ｉ）Ｃａｓタンパク質
Ｃａｓタンパク質はｇＲＮＡの３’末端と複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲをベースにしたシステムの特異性は２個の要因、すなわち標的化配列及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に依存する。標的化又は認識配列はｇＲＮＡの５’末端に位置しており、プロトスペーサーとして知られている正しいＤＮＡ配列で、宿主ＤＮＡ上の塩基対（標的核酸又は標的ＤＮＡ）と対合するように設計されている。単にｇＲＮＡの認識配列を交換することによって、Ｃａｓタンパク質を新しいゲノム標的に向けることができる。ＰＡＭ配列は変更したいＤＮＡ上に位置しており、Ｃａｓタンパク質によって認識される。Ｃａｓタンパク質のＰＡＭ認識配列は種特異的であることができる。

一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、触媒的に死んだｄＣａｓ９などのＣａｓ９タンパク質を含み得る。Ｃａｓ９タンパク質は核酸を切断するエンドヌクレアーゼであり、ＣＲＩＳＰＲ座位によってコードされており、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関与している。Ｃａｓ９分子は、１個又は複数個のｇＲＮＡ分子と相互作用することができ、ｇＲＮＡ分子と協同して、標的ドメイン、ある特定の実施形態ではＰＡＭ配列を含む部位に局在化する。ＰＡＭ配列を認識するＣａｓ９分子の能力は、たとえば以前に記載されている形質転換アッセイ（Jinek 2012）を使用して決定することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は化膿性連鎖球菌に由来する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は配列番号２のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は黄色ブドウ球菌に由来する。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は配列番号３のポリペプチド配列を含む。

一部の実施形態では、ヌクレアーゼ活性が低下又は失活するように、Ｃａｓ９タンパク質を変異させ得る。立体障害によって遺伝子発現をサイレンシングするために、エンドヌクレアーゼ活性を有さない失活したＣａｓ９タンパク質（「ｉＣａｓ９」、「ｄＣａｓ９」とも呼ばれる）を、ｇＲＮＡによって、細菌、酵母、及びヒト細胞中の遺伝子に標的化してよい。化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９配列を参照した、ヌクレアーゼ活性を低下又は失活させるための例示的な変異としては、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／又はＤ９８６Ａが挙げられる。黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９配列を参照とした、ヌクレアーゼ活性を失活させるための例示的な変異としては、Ｄ１０Ａ及びＮ５８０Ａが挙げられる。一部の実施形態では、化膿性連鎖球菌由来の失活したＣａｓ９タンパク質（ｉＣａｓ９、「ｄＣａｓ９」とも呼ばれる、配列番号５）を使用し得る。本明細書中で使用する「ｉＣａｓ９」及び「ｄＣａｓ９」はどちらも、アミノ酸置換Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａを有しており、そのヌクレアーゼ活性が失活しているＣａｓ９タンパク質を指し得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、アミノ酸置換Ｄ１０Ａを有する変異Ｃａｓ９タンパク質であることができる（「ｎＣａｓ９」と呼ばれ、ニッカーゼ活性を有する、たとえば配列番号４）。

Ｃａｓ９タンパク質又は変異Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、又は髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）などの、任意の細菌又は古細菌の種由来であり得る。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質又は変異Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバシラス属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクター属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ）、スッテレラ属（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フィリファクター属（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、フラビイボラ属（Ｆｌａｖｉｉｖｏｌａ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スフェロヘータ属（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター属（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ロゼブリア属（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ）、パルビバキュラム属（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ）、スタフィロコッカス属、ニトラチフラクター属（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、又はカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）の細菌属に由来するＣａｓ９タンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質又は変異Ｃａｓ９タンパク質は、それだけには限定されないが、化膿性連鎖球菌、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、ユーバクテリウム・ベントリオスム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｅｎｔｒｉｏｓｕｍ）、ストレプトコッカス・パステリアヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、スフェロヘータ・グロバス（Ｓｐｈａｅｒｏｃｈａｅｔａ ｇｌｏｂｕｓ）、アゾスピリルム属（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアトロフィカス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ロゼブリア・インテスティナリス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、パルビバキュラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、ニトラチフラクター・サルスギニス（Ｎｉｔｒａｔｉｆｒａｃｔｏｒ ｓａｌｓｕｇｉｎｉｓ）、及びカンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）を含めた群から選択される。

ある特定の実施形態では、標的核酸と相互作用してそれを切断する、Ｃａｓ９分子又は変異Ｃａｓ９タンパク質の能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は標的核酸中の配列である。ある特定の実施形態では、標的核酸の切断はＰＡＭ配列から上流で起こる。様々な細菌種由来のＣａｓ９分子は、様々な配列モチーフ（たとえばＰＡＭ配列）を認識することができる。ある特定の実施形態では、化膿性連鎖球菌のＣａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＧＧ（配列番号１０）を認識する（たとえばMali 2013を参照）。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝Ａ又はＧ）（配列番号１２）を認識する。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝Ａ又はＧ）（配列番号１３）を認識する。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝Ａ又はＧ）（配列番号１４）を認識する。ある特定の実施形態では、黄色ブドウ球菌のＣａｓ９分子は、標的核酸配列の切断を、その配列から１～１０、たとえば３～５ｂｐ上流で指示する、配列モチーフＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｖ＝Ａ又はＣ又はＧ）（配列番号１５）を認識する。前述の実施形態では、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、たとえば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちの任意のものであることができる。Ｃａｓ９分子を操作して、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更することができる。

一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質又は変異Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列ＮＧＧ（配列番号１０）又はＮＧＡ（配列番号１９）を認識することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質又は変異Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列ＮＮＮＲＲＴ（配列番号１１）を認識することができる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質又は変異Ｃａｓ９タンパク質は黄色ブドウ球菌のＣａｓ９タンパク質であり、配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝Ａ若しくはＧ）（配列番号１２）、ＮＮＧＲＲＮ（Ｒ＝Ａ若しくはＧ）（配列番号１３）、ＮＮＧＲＲＴ（Ｒ＝Ａ若しくはＧ）（配列番号１４）、又はＮＮＧＲＲＶ（Ｒ＝Ａ若しくはＧ）（配列番号１５）を認識する。前述の実施形態では、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、たとえば、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴのうちの任意のものであることができる。Ｃａｓ９分子を操作して、Ｃａｓ９分子のＰＡＭ特異性を変更することができる。
それに加えて又はその代わりに、Ｃａｓ９分子又はＣａｓ９ポリペプチドをコードしている核酸は核移行配列（ＮＬＳ）を含み得る。核移行配列は当分野で知られている。一部の実施形態では、ＮＬＳは、それぞれ、配列番号６９～７２のポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号６５～６８から選択されるアミノ酸配列を含む。

ｉｉ）塩基編集ドメイン
融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含む。塩基編集は、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を必要とせずに、標的ゲノム座位での、特定のＤＮＡ塩基から別の塩基への直接的な不可逆的変換を可能にする。図１Ｄは塩基エディターの１個の設計プロセスを示す。塩基編集ドメインは、活性のための配列要求性を有する。２０ヌクレオチドのプロトスペーサーでは、標的塩基は、ＰＡＭ遠位末端から４～８ヌクレオチド以内であり得る。例示的なスプライスアクセプターは、エクソンの直前の「ＡＧ」であり、例示的なスプライスドナーは、エクソンの直後の「ＧＴ」である。異なる種由来のＣａｓ９分子は、異なるＰＡＭを使用してもよく、それにより編集するための塩基の選択においていくらかの柔軟性を提供する。基準のスプライス部位の破壊は、エクソンスキッピング又は隠れたスプライス部位の活性化をもたらし得る。アデニン塩基エディターとシトシン塩基エディターの両方が、「ＡＧ」スプライスアクセプターを破壊し、それをそれぞれ「ＧＧ」又は「ＡＡ」のいずれかに変換することができる（図２０）。一部の実施形態では、変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４５における「ＡＧ」スプライスアクセプターは、塩基編集ドメイン、たとえばアデニン塩基エディターによって「ＧＧ」配列へと変換され、ジストロフィン機能はエクソン４５のスキッピングによって修復される。

融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質及び１個又は複数個の塩基編集ドメインを含み得る。一部の実施形態では、塩基編集ドメインは、アデニン塩基エディター（ＡＢＥ）を含む。融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質及び１個又は複数個のアデニン塩基エディタードメインを含み得る。アデニン塩基エディターは、たとえば、野生型及びその変異体を含む、ｅｃＴａｄＡを含み得る。ｅｃＴａｄＡアデニン塩基エディターの例は、配列番号２７～３４の融合タンパク質に含まれる（そのアノテーションした配列は本明細書中に含まれる）。アデニン塩基エディターは、そのそれぞれが参照により本明細書中に組み込まれているGaudelli et al. (Nature 2017, 551, 464-471)、Koblan et al. (Nature Biotech. 2018, 36, 843-846)、Richter et al. (Nature Biotech. 2020, 38, 883-891)、及びGaudelli et al. (Nature Biotech. 2020, 38, 892-900)に記載され得る。ＡＢＥは、配列番号４５～５２から選択されるポリペプチドを含み得る。ＡＢＥは、配列番号５３～６０から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ得る。一部の実施形態では、ＡＢＥは、配列番号５３のポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号４５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＢＥは、配列番号５４のポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号４６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＢＥは、配列番号５５のポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号４７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＢＥは、配列番号５６のポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号４８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＢＥは、配列番号５７のポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号４９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＢＥは、配列番号５８のポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号５０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＢＥは、配列番号５９のポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号５１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＢＥは、配列番号６０のポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、上記の少なくとも１個の核移行配列（ＮＬＳ）をさらに含むことができる。少なくとも１個のＮＬＳは、融合タンパク質のＮ末端、タンパク質のＣ末端、又はそれらの組合せにあり得る。

一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２７～３４から選択されるポリペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３５～４２から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３５を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３６を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号２８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３７を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号２９のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３８を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３９を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号３１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４０を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号３２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４１を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４２を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。

一部の実施形態では、塩基編集ドメインは（ｉ）シチジンデアミナーゼドメイン及び（ｉｉ）少なくとも１個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインを含む。シチジンデアミナーゼドメインは、ＤＮＡ塩基シトシンをウラシルへと変換することができる（図１Ｃ参照）。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼを含むことができる。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼ、又はその組合せを含むことができる。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインはＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼドメインはラットＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼ酵素（たとえばｒＡＰＯＢＥＣ１）をｄＣａｓのＮ末端と融合させて、ＢＥ１と命名される塩基編集酵素を生じることができる。

一部の実施形態では、少なくとも１個のＵＧＩドメインは、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）活性を阻害することができるドメインを含む。ＵＤＧ活性は、Ｎ－グリコシド結合を切断することによってウラシルを核酸から除去することを含み得る。ＵＤＧ活性は塩基切除修復（ＢＥＲ）経路を開始し得る。ＵＤＧ活性を阻害することができるＵＧＩドメインは、続くＵ：ＧミスマッチがＣ：Ｇ塩基対へと修復されて戻ることを防止し、したがって、細胞ＤＮＡ修復プロセスを操作して所望の結果（たとえばＴ：Ａ塩基対）の収率を増加させることができる。一部の実施形態では、少なくとも１個のＵＧＩドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、少なくとも１個のＵＧＩドメインは、配列番号６又は配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、塩基編集ドメインは、１個のＵＧＩドメイン又は２個のＵＧＩドメインを含む。複数個のＵＧＩドメインが塩基編集ドメイン中に存在する場合、ＵＧＩドメインのわずかに異なる又は変異の配列を使用して、２つの同一配列が同じコンストラクト上で互いに隣接している場合にそれらが組み換える傾向を回避し得る。一部の実施形態では、ＵＧＩを、ｄＣａｓのＮ末端と融合したシチジンデアミナーゼ酵素（たとえばｒＡＰＯＢＥＣ１）と融合させて、ＢＥ２と命名される塩基編集酵素を生じることができる。一部の実施形態では、２個のＵＧＩを、ｄＣａｓのＮ末端と融合したシチジンデアミナーゼ酵素（たとえばｒＡＰＯＢＥＣ１）と融合させて、ＢＥ４と命名される塩基編集酵素を生じることができる。

一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造：ＮＨ₂－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓタンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号（instance）は任意選択のリンカーを含む）を含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造：ＮＨ₂－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓタンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－［ＵＧＩドメイン］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造：ＮＨ₂－［ＡＢＥ］－［Ｃａｓタンパク質］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造：ＮＨ₂－［Ｃａｓタンパク質］－［ＡＢＥ］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造：ＮＨ₂－［ＡＢＥ］－［ＡＢＥ］－［Ｃａｓタンパク質］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含むことができる。リンカーは任意のアミノ酸配列であり得る。リンカーは、たとえば、およそ２～１０、およそ５～１０、およそ５～２０、又はおよそ１０～２５個のアミノ酸の長さであり得る。リンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０個のアミノ酸の長さであり得る。リンカーは、３０個未満、２９個未満、２８個未満、２７個未満、２６個未満、２５個未満、２４個未満、２３個未満、２２個未満、２１個未満、２０個未満、１９個未満、１８個未満、１７個未満、１６個未満、１５個未満、１４個未満、１３個未満、１２個未満、１１個未満、又は１０個未満個のアミノ酸の長さであり得る。一部の実施形態では、リンカーはＸＴＥＮリンカー（１６個のアミノ酸）を含む。一部の実施形態では、リンカーは、それぞれ配列番号６３又は配列番号６４のポリヌクレオチド配列によってコードされる、配列番号６１又は配列番号６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は核移行配列（ＮＬＳ）をさらに含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造：ＮＨ₂－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓ９タンパク質］－［ＵＧＩドメイン］－［ＮＬＳ］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造：ＮＨ₂－［ＮＬＳ］－［ＡＢＥ］－［Ｃａｓタンパク質］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造：ＮＨ₂－［ＮＬＳ］－［ＡＢＥ］－［Ｃａｓタンパク質］－［ＮＬＳ］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含むことができる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７若しくは配列番号８若しくは配列番号２７～３４のいずれかによってコードされる又はそれに対応するアミノ酸配列を含むことができる。

ｃ．ｇＲＮＡ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは少なくとも１個のｇＲＮＡを含み得る。ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子を標的とし得る。ｇＲＮＡはジストロフィン遺伝子の一部分と結合し、それを標的とし得る。ｇＲＮＡは、ジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とし得る。ｇＲＮＡは、変異したジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とし得る。ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの標的化をもたらす。ｇＲＮＡは、２個の非コードＲＮＡ、すなわちｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの融合物である。ｇＲＮＡは、標的化特異性を与える２０ｂｐのプロトスペーサーをコードしている配列を、相補的塩基対合によって、所望のＤＮＡ標的と交換することによって、任意の所望のＤＮＡ配列を標的とし得る。ｇＲＮＡは、ＩＩ型エフェクターシステムに関与している天然に存在するｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣する。たとえば４２個のヌクレオチドのｃｒＲＮＡ及び７５個のヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡを含み得るこの二重鎖は、Ｃａｓ９のガイドとして役割を果たす。

「標的領域」又は「標的配列」又は「プロトスペーサー」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした遺伝子編集システムが標的として結合する標的遺伝子の領域をいう。ゲノム中の標的配列を標的とするｇＲＮＡの部分は、「標的化配列」又は「標的化部分」又は「標的化ドメイン」ともいうことができる。「プロトスペーサー」又は「ｇＲＮＡスペーサー」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした遺伝子編集システムが標的として結合する標的遺伝子の領域をいうことができる。「プロトスペーサー」又は「ｇＲＮＡスペーサー」は、ゲノム中の標的配列に相補的であるｇＲＮＡの部分もいうことができる。ｇＲＮＡは、ｇＲＮＡ足場を含むことができる。ｇＲＮＡ足場は、ｇＲＮＡへのＣａｓ９の結合を促進し、エンドヌクレアーゼ活性を促進することができる。ｇＲＮＡ足場は、ｇＲＮＡが標的とする配列に対応するｇＲＮＡの部分に続くポリヌクレオチド配列である。合わせて、ｇＲＮＡ標的化部分及びｇＲＮＡ足場は１個のポリヌクレオチドを形成する。ｇＲＮＡの定常領域は、配列番号７３を含む配列（ＤＮＡ）によってコードされる、配列番号７４の配列（ＲＮＡ）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした遺伝子編集システムは、少なくとも１個のｇＲＮＡを含むことができ、ｇＲＮＡは異なるＤＮＡ配列を標的とする。標的ＤＮＡ配列はオーバーラップしていてもよい。ｇＲＮＡは、それが適切なプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に続く場合、その５’末端に、たとえば、標的遺伝子の標的領域のおよそ１０～およそ２０ヌクレオチドにハイブリダイズできるように標的領域に十分に相補的である標的化ドメインを含むことができる。標的領域又はプロトスペーサーは、ゲノム中のプロトスペーサーの３’末端で、ＰＡＭ配列に続く。異なるＴｙｐｅＩＩシステムは、詳述した異なるＰＡＭ要求性を有する。

ｇＲＮＡの標的化ドメインは、標的ＤＮＡの標的領域と完全に相補的である必要はない。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの標的化ドメインは、たとえば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチドの長さにわたり、標的領域と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は少なくとも９９％相補的である（又は、それと比較して１、２又は３個のミスマッチを有する）。たとえば、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化ドメインは、標的領域の少なくとも１８ヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％相補的であり得る。標的領域は、標的ＤＮＡのいずれかの鎖であり得る。

一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、標的領域を標的としてそれと結合し得る。一部の実施形態では、１～２０個のｇＲＮＡを、標的遺伝子を変更する、たとえばスプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。たとえば、１個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～５個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～５個のｇＲＮＡ、５個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、５個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、又は５個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム中に含めて、スプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも３個のｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも６個のｇＲＮＡ、少なくとも７個のｇＲＮＡ、少なくとも８個のｇＲＮＡ、少なくとも９個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも１１個のｇＲＮＡ、少なくとも１２個のｇＲＮＡ、少なくとも１３個のｇＲＮＡ、少なくとも１４個のｇＲＮＡ、少なくとも１５個のｇＲＮＡ、又は少なくとも２０個のｇＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム中に含めて、スプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。一部の実施形態では、２０個未満のｇＲＮＡ、１９個未満のｇＲＮＡ、１８個未満のｇＲＮＡ、１７個未満のｇＲＮＡ、１６個未満のｇＲＮＡ、１５個未満のｇＲＮＡ、１４個未満のｇＲＮＡ、１３個未満のｇＲＮＡ、１２個未満のｇＲＮＡ、１１個未満のｇＲＮＡ、１０個未満のｇＲＮＡ、９個未満のｇＲＮＡ、８個未満のｇＲＮＡ、７個未満のｇＲＮＡ、６個未満のｇＲＮＡ、５個未満のｇＲＮＡ、４個未満のｇＲＮＡ、又は３個未満のｇＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム中に含めて、スプライスアクセプター部位を変更するために使用し得る。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、様々な配列及び長さのｇＲＮＡを使用し得る。ｇＲＮＡは、配列番号１若しくは配列番号２１～２３若しくは４３の１つを含む標的配列、又は配列番号１若しくは配列番号２１～２３若しくは４３の１つを含む標的配列の相補的ポリヌクレオチド配列などの、標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてＮＧＧを含み得る。ｇＲＮＡは、相補的ポリヌクレオチド配列の５’末端に「Ｇ」を含み得る。ｇＲＮＡは、５～４０塩基対、５～３５塩基対、５～３０塩基対、１０～３５塩基対、又は１０～３０塩基対の、標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてＮＧＧを含み得る。ｇＲＮＡは、少なくとも１０塩基対、少なくとも１１塩基対、少なくとも１２塩基対、少なくとも１３塩基対、少なくとも１４塩基対、少なくとも１５塩基対、少なくとも１６塩基対、少なくとも１７塩基対、少なくとも１８塩基対、少なくとも１９塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも２１塩基対、少なくとも２２塩基対、少なくとも２３塩基対、少なくとも２４塩基対、少なくとも２５塩基対、少なくとも３０塩基対、又は少なくとも３５塩基対の標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてＮＧＧを含み得る。ｇＲＮＡは、４０塩基対未満、３５塩基対未満、３０塩基対未満、２５塩基対未満、２４塩基対未満、２３塩基対未満、２２塩基対未満、２１塩基対未満、２０塩基対未満、１９塩基対未満、１８塩基対未満、１７塩基対未満、１６塩基対未満、又は１５塩基対未満の、標的ＤＮＡ配列の相補的ポリヌクレオチド配列、続いてＮＧＧを含み得る。ｇＲＮＡは、標的遺伝子のプロモーター領域、エンハンサー領域、又は転写された領域のうちの少なくとも１個を標的とし得る。

少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１を含む核酸配列を標的とすることができる。一部の実施形態では、少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号１を含む核酸配列によってコードされる。ｇＲＮＡは、配列番号２１～２３又は４３又はその相補鎖、その変異体、又はその断片の少なくとも１個を含む配列を標的とすることができる。ｇＲＮＡは、配列番号２４～２６又は４４又はその相補鎖、その変異体、又はその断片から選択される配列を含むことができる。ｇＲＮＡは、配列番号１、その相補体、その変異体、又はその断片のうちの少なくとも１種に対応する核酸配列を含み得る。

３．ジストロフィン機能を修復するための組成物
本発明は、エクソン４５のスプライスアクセプター部位を変更又は除去することによってジストロフィン機能を修復するための組成物に向けられている。組成物は上述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含み得る。組成物はウイルス送達系も含み得る。たとえば、ウイルス送達系は、アデノ随伴ウイルスベクター又は改変レンチウイルスベクターを含み得る。
核酸を宿主細胞内に導入する方法は当分野で知られており、任意の既知の方法を使用して核酸（たとえば発現コンストラクト）を細胞内に導入することができる。適切な方法としては、たとえば、ウイルス又はバクテリオファージ感染、形質移入、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、リポフェクション、電気穿孔、ヌクレオフェクション、免疫リポソーム、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性形質移入、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性形質移入、リポソーム媒介性形質移入、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マクロ注入、ナノ粒子媒介性核酸送達などが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡ送達及びリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体送達によって送達し得る。

ａ．コンストラクト及びプラスミド
上述の組成物は、本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミド又は発現ベクターなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸及び／又はｇＲＮＡのうちの少なくとも１個を含み得る。上述の組成物は、改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、及び本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、上述の組成物は、改変アデノウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクト、及び本明細書中に開示するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸を含み得る。上述の組成物は、改変レンチウイルスベクターをコードしている遺伝子コンストラクトを含み得る。プラスミドなどの遺伝子コンストラクトは、融合タンパク質をコードしている核酸及び少なくとも１個のｇＲＮＡを含み得る。遺伝子コンストラクトは、機能的な染色体外分子として細胞中に存在し得る。遺伝子コンストラクトは、セントロメア、テロメア、又はプラスミド、又はコスミドを含めた直鎖状のミニ染色体であり得る。
また、遺伝子コンストラクトは、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、及び組換えアデノウイルス関連ウイルスを含めた組換えウイルスベクターのゲノムの一部であり得る。遺伝子コンストラクトは、弱毒化した生きた微生物中の遺伝物質の一部又は細胞中に生きる組換え微生物ベクターであり得る。遺伝子コンストラクトは、核酸のコード配列の遺伝子発現のための調節要素を含み得る。調節要素は、プロモーター、エンハンサー、開始コドン、ストップコドン、又はポリアデニル化シグナルであり得る。

核酸配列は、ベクターであり得る遺伝子コンストラクトを構成し得る。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムなどの融合タンパク質を哺乳動物の細胞中で発現させることができ得る。ベクターは組換えであり得る。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムなどの融合タンパク質をコードしている異種核酸を含み得る。ベクターはプラスミドであり得る。ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸で細胞を形質移入するために有用である場合があり、形質転換させた宿主細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの発現が起こる条件下で培養及び維持する。
コード配列は、安定性及び高い発現レベルのために最適化し得る。一部の例では、コドンは、分子内結合が原因で形成されるものなどの、ＲＮＡの二次構造形成を減らすように選択される。

ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている異種核酸を含んでいてよく、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムのコード配列の上流であり得る開始コドン、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムのコード配列の下流であり得るストップコドンをさらに含んでいてよい。開始及び終止コドンは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムのコード配列とインフレームであり得る。また、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムのコード配列と作動可能に連結されるプロモーターも含み得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは、空間及び時間における塩基編集のダイナミック制御を可能にするために、光誘導性又は化学誘導性の制御下であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムのコード配列と作動可能に連結されるプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血症ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。また、プロモーターは、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はヒトメタロチオネインなどの、ヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。また、プロモーターは、天然又は合成の、筋肉又は皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、その内容がその全体で本明細書中に組み込まれている米国特許出願公開ＵＳ２００４０１７５７２７号に記載されている。

ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの下流であり得るポリアデニル化シグナルも含み得る。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、又はヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム又はｓｇＲＮＡの上流にエンハンサーも含み得る。エンハンサーはＤＮＡ発現に必要であり得る。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又は、ＣＭＶ、ＨＡ、ＲＳＶ、若しくはＥＢＶ由来のものなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、それぞれの内容が参考として完全に組み込まれている、米国特許第５，５９３，９７２号、第５，９６２，４２８号、及びＷＯ９４／０１６７３７号に記載されている。ベクターは、ベクターを染色体外に維持し、細胞中でベクターの複数コピーを生じるために、哺乳動物複製起点も含み得る。ベクターは、ベクターを投与した哺乳動物又はヒト細胞中での遺伝子発現によく適している場合がある調節配列も含み得る。また、ベクターは、緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）などのレポーター遺伝子及び／又はハイグロマイシン（「Ｈｙｇｒｏ」）などの選択マーカーを含んでいてもよい。

ベクターは、参考として完全に組み込まれているSambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor (1989)を含めた、ルーチン技法及び容易に入手可能な出発物質によってタンパク質を産生させるための発現ベクター又はシステムであり得る。一部の実施形態では、ベクターは、融合タンパク質をコードしている核酸配列と、配列番号１の核酸配列、その相補体、その変異体、又はその断片を含む、少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている核酸配列とを含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている核酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、組成物は、ｍＲＮＡ及びタンパク質／ＲＮＡ複合体（リボ核タンパク質（ＲＮＰ））によって送達する。たとえば、精製融合タンパク質をガイドＲＮＡと組み合わせてＲＮＰ複合体を形成することができる。

ｂ．改変レンチウイルスベクター
エクソン４５のスプライスアクセプター部位を変更するための組成物は、改変レンチウイルスベクターを含み得る。改変レンチウイルスベクターは、融合タンパク質コードしている第１のポリヌクレオチド配列及び少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている第２のポリヌクレオチド配列を含む。第１のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、又は調節可能プロモーターであり得る。
第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のｇＲＮＡをコードしている。たとえば、第２のポリヌクレオチド配列は、１個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡ、１個のｇＲＮＡ～５個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡ、２個のｇＲＮＡ～５個のｇＲＮＡ、５個のｇＲＮＡ～２０個のｇＲＮＡ、５個のｇＲＮＡ～１５個のｇＲＮＡ、又は５個のｇＲＮＡ～１０個のｇＲＮＡをコードしていてよい。第２のポリヌクレオチド配列は、少なくとも１個のｇＲＮＡ、少なくとも２個のｇＲＮＡ、少なくとも３個のｇＲＮＡ、少なくとも４個のｇＲＮＡ、少なくとも５個のｇＲＮＡ、少なくとも６個のｇＲＮＡ、少なくとも７個のｇＲＮＡ、少なくとも８個のｇＲＮＡ、少なくとも９個のｇＲＮＡ、少なくとも１０個のｇＲＮＡ、少なくとも１１個のｇＲＮＡ、少なくとも１２個のｇＲＮＡ、少なくとも１３個のｇＲＮＡ、少なくとも１４個のｇＲＮＡ、少なくとも１５個のｇＲＮＡ、少なくとも１６個のｇＲＮＡ、少なくとも１７個のｇＲＮＡ、少なくとも１８個のｇＲＮＡ、少なくとも１９個のｇＲＮＡ、又は少なくとも２０個のｇＲＮＡをコードしていてよい。第２のポリヌクレオチド配列は、２０個未満のｇＲＮＡ、１９個未満のｇＲＮＡ、１８個未満のｇＲＮＡ、１７個未満のｇＲＮＡ、１６個未満のｇＲＮＡ、１５個未満のｇＲＮＡ、１４個未満のｇＲＮＡ、１３個未満のｇＲＮＡ、１２個未満のｇＲＮＡ、１１個未満のｇＲＮＡ、１０個未満のｇＲＮＡ、９個未満のｇＲＮＡ、８個未満のｇＲＮＡ、７個未満のｇＲＮＡ、６個未満のｇＲＮＡ、５個未満のｇＲＮＡ、４個未満のｇＲＮＡ、又は３個未満のｇＲＮＡをコードしていてよい。第２のポリヌクレオチド配列は、プロモーターと作動可能に連結されていてよい。プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーター、又は調節可能プロモーターであり得る。少なくとも１個のｇＲＮＡは、エクソン４５のスプライスアクセプター部位を含む標的領域などの標的遺伝子又は座位と結合し得る。

ｃ．アデノ随伴ウイルスベクター
ＡＡＶは、様々なコンストラクト立体配置を使用して組成物を細胞に送達するために使用し得る。たとえば、ＡＡＶは、融合タンパク質及びｇＲＮＡ発現カセットを別々のベクター上で送達し得る。或いは、融合タンパク質及び２個までのｇＲＮＡ発現カセットの両方を、単一のＡＡＶベクター中で４．７ｋｂのパッケージング限界内で組み合わせ得る。
上述の組成物は改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。改変ＡＡＶベクターは、哺乳動物の細胞中において部位特異的ヌクレアーゼを送達及び発現させることでき得る。たとえば、改変ＡＡＶベクターはＡＡＶ－ＳＡＳＴＧベクターであり得る（Piacentino et al. (2012) Human Gene Therapy 23:635-646）。改変ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９を含めたいくつかのカプシド型のうちの１種又は複数種に基づき得る。改変ＡＡＶベクターは、全身性及び局所的な送達によって骨格筋又は心筋に効率的に形質導入する、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、及びＡＡＶ／ＳＡＳＴＧベクターなどの代替筋肉向性ＡＡＶカプシドを有するＡＡＶ２偽型に基づき得る（Seto et al. Current Gene Therapy 2012, 12, 139-151）。

４．変異ジストロフィン遺伝子を有する対象においてジストロフィン機能を修復する方法
ＤＭＤを患っている及び／又は変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞及び／又は対象において、ジストロフィン機能（たとえば、変異ジストロフィン遺伝子、たとえば変異ヒトジストロフィン遺伝子）を修復する方法を、本明細書中に提供する。また、それを必要としている対象において、デュシェンヌ筋ジストロフィーを処置する方法も、本明細書中に提供する。また、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更する方法も、本明細書中に提供する。本方法は、本明細書中に詳述する、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システム、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムをコードしているポリヌクレオチド若しくはベクター、又は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９をベースにした遺伝子編集システムの組成物を、細胞又は対象若しくはその細胞に投与することを含むことができる。一部の実施形態では、対象はデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている。

本方法は、上述の本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又はそれを含む組成物を、細胞又は対象に投与することを含むことができる。本方法は、対象の骨格筋又は心筋に、上述の骨格筋又は心筋中のゲノム編集、たとえば塩基編集のための本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又はそれを含む組成物を投与することを含むことができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを骨格筋又は心筋に送達するための、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又はそれを含む組成物の使用は、完全に機能的又は部分的に機能的なタンパク質の発現を修復し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システム、功を奏したかつ効率的な遺伝子改変の率が高いことで、高度なゲノム編集の利点を有する。
本方法は、融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列、及び／又は、配列番号１、その相補体、その変異体、若しくはその断片を含む、若しくはそれによってコードされる、若しくはそれに対応する、少なくとも１個のｇＲＮＡを投与することなど、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムを投与することを含み得る。

５．医薬組成物
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムは医薬組成物中であり得る。医薬組成物は、およそ１ｎｇ～およそ１０ｍｇの、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしているＤＮＡを含み得る。本発明による医薬組成物は、使用する投与様式に従って配合する。医薬組成物が注射用医薬組成物である場合、これらは無菌的であり、発熱物質を含まず、粒子を含まない。等張配合物を好ましくは使用する。一般に、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを挙げ得る。一部の事例では、リン酸緩衝生理食塩水などの等張溶液が好ましい。安定化剤としてはゼラチン及びアルブミンが挙げられる。一部の実施形態では、血管狭窄剤を配合物に加える。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含有する医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、又は希釈剤などの機能的分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は形質移入促進剤であってよく、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含めたＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレン及びスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、若しくはナノ粒子、又は他の既知の形質移入促進剤を挙げ得る。

形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めたポリカチオン、又は脂質である。形質移入促進剤はポリ－Ｌ－グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ－Ｌ－グルタミン酸は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含有する医薬組成物中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。形質移入促進剤は、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの界面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含めたＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、並びにスクアレン及びスクアレンなどの小胞も含んでいてよく、また、ヒアルロン酸も遺伝子コンストラクトと併せて投与して使用し得る。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしているＤＮＡベクターは、脂質、レシチンリポソーム若しくは当分野で知られている他のリポソームなどのリポソームをＤＮＡ－リポソーム混合物として（たとえばＷ０９３２４６４０号を参照）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、若しくはナノ粒子、又は他の既知の形質移入促進剤などの形質移入促進剤も含み得る。好ましくは、形質移入促進剤は、ポリアニオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含めたポリカチオン、又は脂質である。

６．送達方法
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの遺伝子コンストラクト及び／又はタンパク質を提供するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの医薬配合物を送達する方法を、本明細書中に提供する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの送達は、細胞中に発現されて細胞の表面へと送達される１個又は複数個の核酸分子としての、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの形質移入又は電気穿孔であり得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムタンパク質を細胞に送達し得る。核酸分子は、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌ若しくはＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩｂ装置又は他の電気穿孔装置を使用して電気穿孔し得る。ＢｉｏＲａｄ電気穿孔溶液、Ｓｉｇｍａリン酸緩衝生理食塩水製品番号Ｄ８５３７（ＰＢＳ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（ＯＭ）、又はＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｎ．Ｖ．）を含めたいくつかの異なる緩衝液を使用し得る。形質移入は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００などの形質移入試薬を含み得る。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムタンパク質をコードしているベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、及び／又は組換えベクターを用いた又は用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）によって、哺乳動物に送達し得る。組換えベクターは、任意のウイルス様式によって送達し得る。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、及び／又は組換えアデノ随伴ウイルスであり得る。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを細胞内に導入して、標的遺伝子の遺伝子発現を誘導し得る。たとえば、標的遺伝子に向けられたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている１個又は複数個のポリヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞内に導入し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを細胞に、その結果ベクターを哺乳動物の細胞に送達した際、形質移入した細胞はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを発現する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを哺乳動物に投与して、哺乳動物における標的遺伝子の遺伝子発現を誘導又は変調し得る。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、又はニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、又はニワトリであり得る。

本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト又は組成物を組織に、その結果ベクターを哺乳動物の細胞内に送達した際、形質移入した細胞はｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子を発現する。遺伝子コンストラクト又は組成物を哺乳動物に投与して、遺伝子発現を変更し得る、又はゲノムを再操作若しくは変更し得る。たとえば、遺伝子コンストラクト又は組成物は、哺乳動物においてジストロフィン機能を修復するために、哺乳動物に投与し得る。哺乳動は、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、水牛、ウシ科動物、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、又はニワトリ、好ましくはヒト、ウシ、ブタ、又はニワトリであり得る。
ｇＲＮＡ分子及びＣａｓ９分子をコードしている遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、及び／又は組換えベクターを用いた又は用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）によって、哺乳動物に送達することができる。組換えベクターは、任意のウイルス様式によって送達することができる。ウイルス様式は、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、及び／又は組換えアデノ随伴ウイルスであることができる。

本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又はそれを含む組成物を細胞内に導入して、ジストロフィン遺伝子（たとえばヒトジストロフィン遺伝子）のジストロフィン機能を遺伝子修復することができる。ある特定の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又はそれを含む組成物をＤＭＤ患者由来の筋芽細胞内に導入する。ある特定の実施形態では、遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又はそれを含む組成物をＤＭＤ患者由来の繊維芽細胞内に導入し、遺伝子補正した繊維芽細胞をＭｙｏＤで処置して筋芽細胞への分化を誘導することができ、補正されたジストロフィンタンパク質が機能的であるかを検証するため、及び／又は対象を処置するために、これを対象の損傷筋肉などの対象内に移植することができる。改変細胞は、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３⁺細胞、中血管芽細胞、及びＭｙｏＤ若しくはＰａｘ７で形質導入した細胞、又は他の筋原性前駆細胞などの幹細胞であることもできる。たとえば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、人工多能性幹細胞の神経性又は筋原性の分化を引き起こし得る。

７．投与経路
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム及びその組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、外用、吸入を介する、頬側投与を介する、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、及び関節内、又はその組合せを含めた様々な経路によって、対象に投与し得る。獣医学的使用には、組成物は、通常の獣医学的実施に従った適切に許容される配合物として投与し得る。獣医師が、具体的な動物に最も適切である投薬レジメン及び投与経路を容易に決定し得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム及びその組成物は、従来のシリンジ、無針注入装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、又は電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、若しくは超音波などの他の物理的方法によって投与し得る。組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、及び組換えアデノウイルス関連ウイルスなどの組換えベクターを用いた又は用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含めたいくつかの技術によって哺乳動物に送達し得る。

本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又はそれを含む組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、外用、吸入を介する、頬側投与を介する、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、及び関節内、又はその組合せを含めた様々な経路によって、対象に投与し得る。ある特定の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又は組成物は、筋肉内、静脈内、又はその組合せで対象（たとえばＤＭＤを患っている対象）に投与する。獣医学的使用には、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又は組成物は、通常の獣医学的実施に従った適切に許容される配合物として投与し得る。獣医師が、具体的な動物に最も適切である投薬レジメン及び投与経路を容易に決定し得る。組成物は、従来のシリンジ、無針注入装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、又は電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、若しくは超音波などの他の物理的方法によって投与し得る。

本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又は組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ電気穿孔、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルス、及び組換えアデノウイルス関連ウイルスなどの組換えベクターを用いた又は用いないＤＮＡ注入（ＤＮＡワクチン接種とも呼ばれる）を含めたいくつかの技術によって哺乳動物に送達し得る。組成物は、骨格筋又は心筋内に注射し得る。たとえば、組成物は、前脛骨筋又は尾部内に注射し得る。
一部の実施形態では、本明細書中に開示する遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又はその組成物は、１）成体マウス内への尾部静脈注入（全身性）、２）成体マウスへの筋肉内注射、たとえば、ＴＡ若しくは腓腹筋などの筋肉内への局所注入、３）Ｐ２マウス内への腹腔内注射、又は４）Ｐ２マウス内への顔面静脈注入（全身性）によって投与する。

８．細胞種
これらの送達方法及び／又は投与経路のうちの任意のものを、本明細書中に記載した（ｄｅｓｃｉｂｅｄ）塩基編集システムを無数の細胞種に送達するために利用することができる。たとえば、細胞種としては、それだけには限定されないが、野生型及びＤＭＤ患者由来の株などの不死化筋芽細胞、一次ＤＭＤ真皮線維芽細胞、人工多能性幹細胞、骨髄由来前駆体、骨格筋前駆体、ＤＭＤ患者由来のヒト骨格筋芽細胞、ＣＤ１３３⁺細胞、中血管芽細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、間葉前駆細胞、造血幹細胞、平滑筋細胞、及びＭｙｏＤ若しくはＰａｘ７で形質導入した細胞、又は他の筋原性前駆細胞が挙げられ得る。ヒト筋原細胞の不死化は、遺伝子補正した筋原細胞のクローン誘導に使用することができる。ゲノム中のタンパク質コード領域中に遺伝子補正又は修復されたジストロフィン遺伝子を含み、他のヌクレアーゼで導入された変異を含まない不死化ＤＭＤ筋芽細胞のクローン集団を単離及び拡大するために、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで改変することができる。或いは、非ウイルス性若しくは非組込み型ウイルス遺伝子移入による、又は精製タンパク質及び細胞透過モチーフを含有するｇＲＮＡの直接送達による、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにしたシステムの一過性ｉｎ ｖｉｖｏ送達は、外因性ＤＮＡの組込みのリスクが最小限又はない、特異性の高いｉｎ ｓｉｔｕの補正及び／又は修復を可能にし得る。

９．キット
変異したジストロフィン遺伝子を補正する及び／又はジストロフィン機能を修復するために使用し得るキットを本明細書中に提供する。キットは、ジストロフィン機能を修復するための、配列番号１のポリヌクレオチド配列、その相補体、その変異体、又はその断片と結合し、それを標的とする、又はそれによってコードされる、又はそれに対応する、少なくとも１個のｇＲＮＡと、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした編集システムを使用するための指示とを含む。また、骨格筋又は心筋中のジストロフィン遺伝子の塩基編集に使用し得るキットも本明細書中に提供する。キットは、上述の骨格筋又は心筋中のゲノム編集、たとえば塩基編集のための遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又はそれを含む組成物、及び前記組成物を使用するための指示を含む。

キット中に含められる指示は、梱包材料に貼り得る、又は添付文書として含められ得る。指示は典型的には文書又は印刷された物体であるが、これらはそれに限定されない。そのような指示を記憶し、それらを最終使用者に伝達することができる任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体としては、それだけには限定されないが、電子記憶媒体（たとえば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学的媒体（たとえばＣＤ ＲＯＭ）などが挙げられる。本明細書中で使用する用語「指示」としては、指示を提供するインターネットサイトのアドレスを挙げ得る。
骨格筋又は心筋中のジストロフィン機能を修復するための遺伝子コンストラクト（たとえばベクター）又はそれを含む組成物は、ジストロフィン遺伝子の一領域と特異的に結合してそれを切断する、上述のｇＲＮＡ分子及び融合タンパク質を含む改変ＡＡＶベクターを含み得る。上述のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした遺伝子編集システムは、変異したジストロフィン遺伝子中の特定の領域、たとえばエクソン４５スプライスアクセプター含有領域と特異的に結合し、それを標的とするために、キットに含め得る。

１０．実施例
前述の記載は、例示目的で提示し、本発明の範囲を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって、より良好に理解させ得る。以下の非限定的な例によって例示されるように本発明は複数の態様を有する。

（実施例１）
ＰＡＭの利用可能性に基づいてスプライスアクセプターを塩基編集するように、ｇＲＮＡを設計した（図２Ａ及び図２Ｂ参照）。化膿性連鎖球菌及び黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９タンパク質の両方を有するＤＮＡ塩基エディターシステム（図１Ａ及び図１Ｂ）を、エクソン４５～５５の間のＤＭＤ遺伝子欠失のホットスポット中のヒトジストロフィンエクソンに標的化するように、ｇＲＮＡを設計した。図１Ｂに記載したＢＥ４ｍａｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１１２０９３）及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１１２０９４）の設計は、発現レベルが限定されていた図１Ａにおける設計よりも低い濃度でより良好に作動した。ＢＥ４ｍａｘ及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘの設計は同様の性能であった。ｇＲＮＡは、全ての設計間で一定であるＣａｓ９部分と結合するため、同じｇＲＮＡを複数世代の塩基エディターを通して使用することができる（Ｃａｓ９種が同じままである限り）。

４００ｎｇのｇＲＮＡプラスミド及び４００ｎｇのＢＥ４ｍａｘ又はＡｎｃＢＥ４ｍａｘプラスミドを用いた、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプラスミド形質移入（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）によって、スプライスアクセプターＧ＞Ａ塩基編集を様々なジストロフィンエクソンでアッセイした。ＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用した標的部位のディープシーケンシングを行って、％Ｇ＞Ａ塩基編集を決定した。表１を参照されたい。一部のエクソンは乏しい編集効率（すなわち＜０．１％の編集）を示した一方で、対立遺伝子の７～８％が、５’－ＧＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＡ－３’（配列番号１）のエクソン４５ ｇＲＮＡ配列を使用してエクソン４５で編集されたことが観察された。エクソン４５は、その除去が２番目に大きなＤＭＤ患者群（約８％）を処置する可能性があるジストロフィンエクソンである（Aartsma-Rus et al. Human Mutation 2009, 30, 293-299）。

４００ｎｇのｇＲＮＡプラスミド及び４００ｎｇ又は１０００ｎｇのＢＥ４ｍａｘプラスミドを用いた、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞のプラスミド形質移入（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００）によって、スプライスアクセプターＧ＞Ａ塩基編集をエクソン４４及び４５でアッセイした。ＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用した標的部位のディープシーケンシングを行って、％Ｇ＞Ａ塩基編集を決定した。塩基編集を増加するためにＢＥ３ｍａｘプラスミドの量を増加することによって、形質移入条件を最適化した。図３Ｂ及び図３Ｃに示すように、塩基編集はエクソン４５ ｇＲＮＡで７～８％まで増加した。図３Ａに示すようにＧ１及びＧ２の両方を編集することで、適切なエクソンスキッピングが提供され得る。
エクソンスキッピングに対するスプライシング部位の破壊の効果を試験するために、ジストロフィンエクソン４４の欠失を保有するヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株を作製した。図４Ａ～４Ｄを参照されたい。この多能性細胞株は、エクソン４５の除去によって補正可能な、ＤＭＤ遺伝子の破壊されたリーディングフレームを有する遺伝性のＤＭＤ変異をモデリングしている。ｉＰＳＣはジストロフィンを発現しないため、編集したエクソンがスキップされているかどうかを決定するのは困難である。ｉＰＳＣ中のＭｙｏＤの過剰発現を使用してジストロフィンを発現させて、ＲＮＡ及びタンパク質レベルを分析した（図５）。

ＭｙｏＤ ｃＤＮＡのレンチウイルス形質導入によるこのΔ４４ ｉＰＳＣ株の筋原性分化により、変異がジストロフィンタンパク質発現を除去することが確認される。図６を参照されたい。化膿性連鎖球菌ｄＣａｓ９をベースにしたＡｎｃＢＥ４ｍａｘ及びｇＲＮＡカセットを、これらの細胞にレンチウイルス形質導入によって送達した。図７に手順のアウトラインを示す。２００μＬの２０×ウイルスをＢＥ４ｍａｘ及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘの形質導入に使用した。図８Ａ及び図９Ａは、それぞれＢＥ４ｍａｘ及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘの％Ｇ＞Ａ塩基編集事象を示す。図８Ｂ及び図９Ｂは、それぞれＢＥ４ｍａｘ及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘの全てのｇＶＧ０３ ｄ１２編集事象を示す。コンストラクト設計中のＡＰＯＢＥＣ酵素はＧ＞Ａを変換するはずであるが、場合によってはＧ＞Ｔ又はＧ＞Ｃの事象も起こる。Ｇの除去をもたらすこれらの事例のうちの任意のものがスプライシングを破壊するはずであり、したがって、「非Ｇ」事象の合計は有効編集率を与える。図１０は、ＢＥ４ｍａｘ及びＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用した１２日後のΔ４４ ｉＰＳＣ編集（任意の他の塩基へと編集されたＧを有するリードの％）を示す。ディープシーケンシングにより、スプライスアクセプターの２２％が１２日後に破壊されたことが示された。図１２は、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｒｕｓ）によって送達した、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の％非Ｇ塩基編集事象を示す。図１３は、電気穿孔によって送達した、ＡｎｃＢＥ４ｍａｘを使用したΔ４４ ｉＰＳＣ中の％非Ｇ塩基編集事象を示す。細胞は、ｇＲＮＡレンチウイルスで７日間（Ｄ７）及び１４日間（Ｄ１４）処置した後に収集した。

この編集したΔ４４ ｉＰＳＣ株中でのＭｙｏＤの過剰発現、続いてＲＴ－ＰＣＲにより、スプライスアクセプター塩基編集がエクソン４５のスキッピングをもたらし、これがジストロフィンリーディングフレームを修復することが確認された。ＡｎｃＢＥ４ｍａｘがより高い編集を示したため、これらの編集した細胞をＭｙｏＤで分化させ、ＲＮＡを収集してスキッピングを探した。図１１は、以下のプライマーを用いた３５回の増幅サイクル後のＲＴ－ＰＣＲ結果を示す：５’－ＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧ－３’（配列番号１６）及び５’－ＴＴＣＴＣＡＧＧＴＡＡＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣ－３’（配列番号１７）。エクソン４５の頑強なスキッピングが、エクソン４５ ｇＲＮＡで処置した細胞において観察されたが、ｇＲＮＡなしの対照では観察されなかった。
この編集したΔ４４ ｉＰＳＣ株中でのＭｙｏＤの過剰発現、続いてウエスタンブロット分析により、スプライスアクセプター塩基編集がエクソン４５のスキッピングをもたらし、これがジストロフィンリーディングフレームを修復することがさらに確認された。ＡｎｃＢＥ４ｍａｘレンチウイルス及びｇＲＮＡレンチウイルス、又はＷＴ ｉＰＳＣで形質導入したΔ４４ ｉＰＳＣ細胞を、上記図１１のようにＭｙｏＤで分化させた。細胞溶解液を収集し、ジストロフィンタンパク質及びＧＡＰＤＨに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。ウエスタンブロット（図１４）は、未処置のΔ４４ ｉＰＳＣ細胞は、特に最も大きなアイソフォームではるかに低下したジストロフィンタンパク質発現を有していたが、塩基編集（ｇＲＮＡあり）が一部のジストロフィンタンパク質発現を修復することができたことを示す。

（実施例２）
ｍＲＮＡスプライシング中のイントロンの除去及び選択したエクソンの包括は、通常の遺伝子機能に重要であり、遺伝障害において誤制御されていることが多い。エクソンスキッピングアプローチなどのｍＲＮＡプロセシング及びエクソン選択を調節する技術は、これらの疾患を研究及び処置するために使用され得る。エクソンスキッピングは、正確なリーディングフレームを補修すること又はスプライソソームによるスプライシング配列の認識を遮断することによる代替のスプライシングを誘導し、隣接するイントロンと共に特定のエクソンの除去をもたらすことを目的とする。たとえば、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、典型的には、ジストロフィン遺伝子からの１個又は複数個のエクソンの欠失によって引き起こされ、リーディングフレームの破壊をもたらす。ジストロフィンタンパク質の発現は、１個又は複数個のさらなるエクソンの除外を誘導することによってリーディングフレームを補修することにより修復され得る。エクソンのスプライスアクセプターへとＣａｓ９を標的化することにより、ＤＮＡ修復中に産生されたインデルは、スプライス部位を破壊し、エクソンの排除を誘導することができる。慣用のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって生じたセミランダムインデルとは対照的に、二本鎖ＤＮＡ切断を誘導せずに単一塩基対の正確な改変のために、塩基編集技術が開発されている。アデニン塩基エディターは、Ａを直接Ｇに、又は逆鎖上のＴをＣに変えることができ、これらは、ｍＲＮＡスプライシングを変調するために様々なエクソンのスプライスアクセプター「ＡＧ」を標的とする。

ガイドＲＮＡは、ヒトジストロフィンエクソン４５のスプライスアクセプター（ＳＡ）を標的化する、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９上に構築されたアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）の４バージョン設計された（ｇＲＮＡ：表２）。エクソン４５のスキッピングは、２番目に大きなＤＭＤ患者群（８％）の処置に適用可能であり、ジストロフィン修復への塩基編集の効果は細胞株及びマウスモデルで試験することができる。使用した４個のＡＢＥは、ＴａｄＡ酵素の２つの異なる変異体（ＡＢＥ７．９及びＡＢＥ７．１０；Gaudelli et al. Nature 2017, 551, 464-471）、ＡＢＥ７．１０のコドン及びＮＬＳ最適化変異体（ＡＢＥｍａｘ； Koblan et al. Nature Biotech. 2018, 36, 843-846）、及びＡＢＥｍａｘの次世代進化（ＡＢＥ８e； Richter et al. Nature Biotech. 2020, 38, 883-891）（図１５Ａ）であった。これら３個のｇＲＮＡの編集ウィンドウ内に入る多くのアデニン（Ａ）があるが、エクソンスキッピングのために編集されたスプライスアクセプター標的はＡ３であった（図１５Ｂ）。形質移入実験は、７５０ｎｇのＡＢＥプラスミド及び２５０ｎｇのｇＲＮＡプラスミドにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において実施した。３００００個のＨＥＫ２９３細胞を、４８ウェルにプレートした。翌日、7５０ｎｇの塩基編集プラスミド及び２５０ｎｇのｇＲＮＡプラスミド又はｐｍａｘＧＦＰを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００によって形質移入した。Ｑｕｉｃｋ ｅｘｔｒａｃｔを形質移入の３日後に収集し、編集をディープシークエンシング及びｃｒｉｓｐｒｅｓｓｏ２によって決定した。結果は、３日後に、ｇＶＧ５６を伴うＡＢＥ８ｅは、Ｇが優位に編集されている、非Ａ塩基へのスプライスアクセプターＡ３の３８．６％の変換を可能にしたことを示した（図１５Ｃ）。次に、この実験は、４個の追加のＡＢＥ変異体の拡大パネルで、またそれぞれのエディターで試験した３個の同じｇＲＮＡで繰り返した（Gaudelli et al. Nature Biotech. 2020, 38, 892-900）（図１６）。３００００個のＨＥＫ２９３細胞を４８ウェルにプレートした。翌日、７５０ｎｇの塩基編集プラスミド及び２５０ｎｇのｇＲＮＡプラスミド又はｐｍａｘＧＦＰを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００によって形質移入した。Ｑｕｉｃｋ ｅｘｔｒａｃｔを形質移入の３日後に収集し、編集をディープシークエンシング及びｃｒｉｓｐｒｅｓｓｏ２によって決定した。試験した全ての変異体にわたり、ｇＲＮＡ ｇＶＧ５６は、ｇＶＧ５５及びｇＶＧ５６と比較してエクソン４５スプライスアクセプター（Ａ３）を編集する最大の能力を示した。これらの実験で使用したＡＢＥは、配列番号２７～３４の融合タンパク質に含まれる。この編集戦略は、エクソン４５が欠失したｉＰＳ細胞株並びにエクソン４４が欠失したヒトジストロフィン遺伝子を含有するマウスに適用され、エクソン４５スプライスアクセプターの塩基編集がエクソンをスキップし、ジストロフィン発現を修復することを示す。

（実施例３）
ＡＢＥ８は、ＨＥＫ２９３Ｔにおいて効果的なエクソン４５スプライスアクセプター編集を可能にする
実施例２のｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ：表２、ｇ０１、ｇ０２、及びｇ０３と名前を変更した）及びｇ０４は、ヒトジストロフィンエクソン４５のスプライスアクセプター（ＳＡ）を標的化する化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９上に構築したアデニン塩基エディター（ＡＢＥ）の追加のバージョンと試験した。使用したＡＢＥは、ＴａｄＡ酵素の２つの異なる変異体（ＡＢＥ７．９及びＡＢＥ７．１０；Gaudelli et al. Nature 2017, 551, 464-471）、ＡＢＥ７．１０のコドン及びＮＬＳ最適化変異体（ＡＢＥｍａｘ； Koblan et al. Nature Biotech. 2018, 36, 843-846）、ＡＢＥｍａｘの次世代進化（ＡＢＥ８e； Richter et al. Nature Biotech. 2020, 38, 883-891）、ＡＢＥ８．８ｍ、ＡＢＥ８．１３ｍ、ＡＢＥ８．１７ｍ、及びＡＢＥ８．２０ｍであった。エクソンスキッピングのために編集されたスプライスアクセプター標的はＡ３であった（図１７Ａ、図１７Ｃ）。形質移入実験は、７５０ｎｇのＡＢＥプラスミド及び２５０ｎｇのｇＲＮＡプラスミド又はｐｍａｘＧＦＰにより、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において実施した。ＨＥＫ２９３細胞を、４８ウェルにプレートした（３００００個の細胞／ウェル）。翌日、7５０ｎｇの塩基編集プラスミド及び２５０ｎｇのｇＲＮＡプラスミド又はｐｍａｘＧＦＰを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００によって形質移入した。Ｑｕｉｃｋ ｅｘｔｒａｃｔを形質移入の３日後に収集し、スプライスアクセプター周辺の領域をＰＣＲによって増幅し、アンプリコンをディープシークエンシングにかけ、データを、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏソフトウェアを使用して解析し、各位置での編集の割合を決定した。結果は、３日後に、ｇ０２と対にした場合、ＡＢＥ８ｅ及びＡＢＥ８．１７ｍが、この位置で最も効率的な編集を示したことを示した（図１７Ｂ、図１７Ｄ）。試験した全てのＡＢＥが、編集ウィンドウ内の少なくとも１個のアデニンの高レベルの編集を示したが（データは示さない）、広い編集ウィンドウを有する第８世代のエディター（ＡＢＥ８ｅ、ＡＢＥ８．８ｍ、ＡＢＥ８．１３ｍ、ＡＢＥ８．１７ｍ、及びＡＢＥ８．２０ｍ）のみが、スプライスアクセプター（Ａ３）のアデニンを効率的に編集することができた。上位２つの条件の編集効率、ＡＢＥ８ｅとｇ０２では５２．３７％、ＡＢＥ８．１７ｍとｇ０２では５１．１１％は、類似の実験がＣＢＥのパネル及びエクソン４５スプライスアクセプターを標的化することができる１個のｇＲＮで実施された場合に観察されるよりも１０倍高かった（図１７Ｂ、図１７Ｄ）。結果として、これら２つの高性能ＡＢＥ条件を選択して、エクソンスキッピングへの塩基編集の効果を研究した。

この実験は、ＡＢＥ８ｅ（図１７Ｅ）及びＡＢＥ１７ｍ（図１７Ｆ）での隣接するＡのバイスタンダー編集を調べるために繰り返した。この適用のため、バイスタンダー編集は、スプライス部位破壊又はコード配列と干渉してはならない。次に、ｇ０２と対にしたＡＢＥ８ｅ及びＡＢＥ８．１７ｍによって形成された産物の純度を調べた（図１７Ｇ）。これらの実験で使用したＡＢＥは、配列番号２７～３４の融合タンパク質に含まれる。ＡＢＥ８ｅは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてｈＤＭＤエクソン４５のスプライスアクセプターの高効率の塩基編集を可能にする。

（実施例４）
エクソンスキッピングの評価のためのΔ４４ ｉＰＳＣの編集及び分化
ジストロフィン遺伝子からエクソン４４が欠失したヒトｉＰＳＣ細胞株を作成し、Δ４４という（図１８Ａ）。ＳｐＣａｓ９及び２個のｇＲＮＡを使用して、エクソン４４を切除し、ジストロフィン遺伝子をアウトオブフレームにシフトする。Δ４４細胞中のリーディングフレームは、エクソン４５をスキッピングすることにより修復することができる。図１８Ｂに示すのは、ｉＰＳＣ編集及び分化のために使用されるレンチウイルスコンストラクトの模式図である。Δ４４ ｉＰＳＣは、ＡＢＥ８ｅ又はＡＢＥ８．１７ｍのいずれかで形質導入し、安定株を作成するために選択した。０日目に、ｇ０２又はスクランブルした対照のいずれかを形質導入したが、選択しなかった。ジストロフィン発現を達成するため、ＡＢＥ＋ｇＲＮＡ細胞は、骨格筋培地（ＳＭＭ）中で培養し、構成的ＭｙｏＤ ｃＤＮＡを有するレンチウイルスコンストラクトで形質導入し、低血清条件でさらに分化させた。図１８Ｃに示すように、ＡＢＥ８ｅとｇ０２は、ｇＲＮＡ形質導入の４日後、Δ４４ ｉＰＳＣにおいて、８８．６％のスプライスアクセプターの塩基編集を示した（ｇＲＮＡレンチについては選択なし）。ＭｙｏＤ分化の間にＤＮＡ編集の最小限の増加があった。ＡＢＥ８ｅは、ｉＰＳＣ細胞においてｈＤＭＤエクソン４５スプライスアクセプターの高効率の塩基編集を可能にした。

（実施例５）
エクソン４５スプライスアクセプターの編集は、エクソンスキッピング及びタンパク質修復を引き起こす
Δ４４ ｉＰＳＣ細胞におけるＡＢＥ８ｅ又はＡＢＥ８．１７ｍでのエクソン４５スプライスアクセプターの編集を調べた。Δ４４ ｉＰＳＣ＋ＡＢＥ＋ｇＲＮＡ＋ＭｙｏＤ分化細胞から２８日目に抽出したｃＤＮＡを、ＲＴ－ＰＣＲによって増幅した（図１９Ａ）。ＡＢＥ８ｅ＋ｇ０２で観察された高レベルのエクソン４５スプライスアクセプターの塩基編集は、エクソン４５をスキッピングする転写物に対する強いシフトと対応した。次いで、２８日目のｃＤＮＡをｄｄＰＣＲによって定量し（図１９Ｂ）、ＡＢＥ８ｅ＋ｇ０２は、９６．６％のエクソン４５スキッピングを示した。ジストロフィン発現の修復は、ウエスタンブロット解析によって調べ（図１９Ｃ）、ＡＢＥ８ｅ＋ｇ０２が、未編集のΔ４４ ｉＰＳＣには存在しないジストロフィンタンパク質発現をレスキューしたことを示している。塩基編集したΔ４４ ｉＰＳＣの筋分化は、ジストロフィンタンパク質修復をもたらすスプライス部位編集後のエクソンスキッピングを実証した。

ｇＲＮＡ依存的ＤＮＡオフターゲット活性は、ＣＨＡＮＧＥ－ｓｅｑ解析を使用して予測されるであろう。あらゆるオフターゲットＲＮＡ編集をＲＮＡ－ｓｅｑによって解析し、スプライシング結果が同定及び定量されるであろう。Ｓｐｌｉｔ－ｉｎｔｅｉｎ ＡＡＶ－ＡＢＥ８ｅを使用して、新しいｈＤＭＤΔ４４／ｍｄｘマウスを編集し、スプライスアクセプター編集の機能的な利点を評価し、編集産物を調べた。

（実施例６）
エクソン４５のスキッピングのための塩基編集
ジストロフィンは、非筋肉組織では低発現し、そのため、ｉＰＳＣ由来の心筋細胞（ＣＭ）をｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとして適用し、エクソン４５スプライスアクセプターの塩基編集がどのようにＤＭＤスプライシングに影響するか調べた。ＤＮＤ患者の変異を補修する場合に予想される転写及びタンパク質修復をモデル化するため、ＳｐＣａｓ９及び２個のｇＲＮＡを使用して、雄の野生型ｉＰＳ細胞株からエクソン４４を切除し、次いで編集したΔ４４クローンを選択した。ＤＭＤ遺伝子型を有するこの細胞株においてエクソン４５がスキップされる場合、リーディングフレームは修復され、内部はトランケートされているが機能的なジストロフィンタンパク質を生じた（図２１Ａ）。野生型及びΔ４４ ｉＰＳＣは、１１日間の低分子プロトコールによってＣＭへと分化した後、無グルコース条件で４日間選択した。１６日目に、細胞を置き換え、２個のレンチウイルス、ＡＢＥ（ＡＢＥ８ｅ又はＡＢＥ８．１７ｍ）を含有するものとＵ６－ｇＲＮＡを供給するもの（エクソン４５のスプライスアクセプターを標的化するｇ０２又は非ターゲティング対照のいずれか）によって形質導入した（図２１Ａ）。形質導入の５日後、レンチウイルスによる形質導入を選択せずに細胞を収集し、ＲＮＡ及びタンパク質を単離した。ｇＤＮＡのディープシークエンシングは、ＡＢＥ８ｅが、標的化ｇＲＮＡと対にした場合にのみ、スプライスアクセプターアデニンの３２．４７％の変換を可能にしたことを示した（図２１Ｂ）。ＡＢＥ８ｅは、広いウィンドウを有するエディターであり、それは、Ａ２が最も顕著である、隣接するＡも編集される観察と一致する。Ａ１、Ａ２、及びＡ３はイントロンであり、Ａ４、Ａ５、及びＡ６はスキップされるはずのエクソン内であるため、これらのバイスタンダー編集が有害作用を持つとは予期されなかった。特に、ＡＢＥ８．１７ｍは、ＨＥＫ２９３Ｔ形質移入（図２１Ｂ）とＣＭにおけるＡＢＥ８ｅの両方と比較して、ＣＭにおいてずっと弱かった。これは、初期のバージョンと比較して、低レベルの核発現を生じるこのコンストラクトからのＮ末端双節型ＮＬＳの除去により得る。

エクソン４２及び４６のプライマーによるエンドポイントＲＴ－ＰＣＲは、ＡＢＥ８ｅ＋ｇ０２試料におけるエクソンスキッピングの明確なパターンを実証した（図２１Ｃ）。このエクソンスキッピングは、エクソン４３～４５ジャンクションにわたるプライマープローブセットによって測定された未編集の転写物（細胞はΔ４４）、及びエクソン４３～４６ジャンクションによる編集した転写物でのｄｄＰＣＲによって定量した。編集した転写物の画分は、編集した濃度を編集と未編集の転写物の合計によって割ることにより、算出した。ＡＢＥ８ｅ＋ｇ０２は、転写物の５５．７２％でエクソン４５をスキッピングさせた（図２１Ｄ）。ＲＮＡレベルでのこの編集率は、ＤＮＡレベルで観察された３２．４７％よりも高かった。これは、効果を増幅するリーディングフレーム修復によるＤＭＤ転写物の安定化によるようであり、実際、編集したＣＭにおける転写物レベルは、ｄｄＰＣＲにより、Δ４４対照よりも高いことが観察された（データは示さない）。高レベルのエクソン４５スキッピングは、野生型レベルに匹敵するジストロフィンタンパク質の修復へと翻訳されることが観察された（図２１Ｅ）。

特定の態様の前述の記載は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにし、その他は、当技術分野内の知識を適用することにより、実験を繰り返すことなく、本開示の一般概念から逸脱することなく、そのような特定の態様を容易に改変及び／又は様々な適用に適応させることができる。したがって、そのような適応及び改変は、本明細書中に提示した教示及びガイダンスに基づき、開示した態様の等価物の意味及び範囲内にあることが意図される。本明細書中の語句及び用語は、説明目的であり、限定を意図せず、本明細書の用語又は語句は、教示及びガイダンスに照らして当業者によって解釈されることが理解されるであろう。

本開示の幅及び範囲は、上記のあらゆる例示的な態様によって限定されないが、以下の請求項及びそれらの等価物に従ってのみ定義される。
本明細書中に引用した全ての論文、特許、特許明細書、及び／又は他の文献は、それぞれの論文、特許、特許明細書、及び／又は他の文献が、個々に全ての目的のために参照によって組み込まれることを示されたように、同程度まで全ての目的のためにその全体で参考として組み込まれる。
完全性の理由のため、本発明の様々な態様を以下の付番した条項中に記載する：

条項１．融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムであって、前記融合タンパク質はＣａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、前記少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号２１～２３若しくは４３又はその相補鎖若しくは断片の少なくとも１個を含む配列を標的化し、及び／又は、前記ｇＲＮＡは、配列番号２４～２６若しくは４４又はその相補鎖若しくは断片から選択される配列を含む、塩基編集システム。
条項２．融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムであって、前記融合タンパク質はＣａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、前記塩基編集ドメインは、配列番号４５～５２から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は、配列番号５３～６０から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、塩基編集システム。
条項３．融合タンパク質が、配列番号２７～３４から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は配列番号３５～４２から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、条項２に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項４．ゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更することが、ＲＮＡ転写物中の少なくとも１個のエクソン配列の排除又は包含をもたらす、条項１～３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項５．融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、対象においてジストロフィン機能を修復するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムであって、前記融合タンパク質はＣａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、前記少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号２１～２３若しくは４３又はその相補鎖若しくは断片の少なくとも１個を含む配列を標的化し、及び／又は、前記ｇＲＮＡは、配列番号２４～２６若しくは４４又はその相補鎖若しくは断片から選択される配列を含む、塩基編集システム。

条項６．融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、対象においてジストロフィン機能を修復するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムであって、前記融合タンパク質はＣａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、前記塩基編集ドメインは、配列番号４５～５２から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は、配列番号５３～６０から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、塩基編集システム。
条項７．融合タンパク質が、配列番号２７～３４から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は配列番号３５～４２から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、条項６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項８．対象が変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、対象の変異したジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とする、条項５～７のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項９．対象へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの投与が、少なくとも１個のエクソン配列が対象のジストロフィン遺伝子のＲＮＡ転写物から排除又はその中に包含されること、及び対象中のジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修復されることをもたらす、条項８に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１０．Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９を含み、Ｃａｓ９が、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を除去する少なくとも１個のアミノ酸変異を含む、条項１～９のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。

条項１１．少なくとも１個のアミノ酸変異が、配列番号２又は３に対応するアミノ酸配列中のＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、又はその組合せのうちの少なくとも１個である、条項１０に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１２．Ｃａｓタンパク質が、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９タンパク質である、条項１～１１のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１３．Ｃａｓタンパク質が、配列番号４又は５のアミノ酸配列を含む、条項１～１２のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１４．塩基編集ドメインが、（ｉ）シチジンデアミナーゼドメイン及び（ｉｉ）少なくとも１個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインをさらに含む、条項１～１３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１５．シチジンデアミナーゼドメインが、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）デアミナーゼを含む、条項１４に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。

条項１６．シチジンデアミナーゼドメインがＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む、条項１４又は１５に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１７．シチジンデアミナーゼドメインがラットＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む、条項１６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１８．少なくとも１個のＵＧＩドメインが、ＵＤＧ活性を阻害することができるドメインを含む、条項１４～１７のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項１９．少なくとも１個のＵＧＩドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列、又は配列番号６若しくは配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、条項１８に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２０．塩基編集ドメインが、１個のＵＧＩドメイン又は２個のＵＧＩドメインを含む、条項１４～１９のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。

条項２１．融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ₂－［ＡＢＥ］－［Ｃａｓタンパク質］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、条項１～２０のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２２．融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ₂－［Ｃａｓタンパク質］－［ＡＢＥ］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、条項１～２０のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２３．融合タンパク質が核移行配列（ＮＬＳ）をさらに含む、条項１～２２のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
条項２４．条項１～２３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードしている単離したポリヌクレオチド。
条項２５．ポリヌクレオチドが、融合タンパク質をコードしている第１のポリヌクレオチド及びｇＲＮＡをコードしている第２のポリヌクレオチドを含む、条項２４に記載の単離したポリヌクレオチド。

条項２６．条項２４若しくは２５に記載の単離したポリヌクレオチドを含むベクター。
条項２７．ベクターが、単離したポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、条項２６に記載のベクター。
条項２８．条項２４若しくは２５に記載の単離したポリヌクレオチド又は条項２６若しくは２７に記載のベクターを含む細胞。
条項２９．条項１～２３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含む、変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物。
条項３０．条項１～２３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム、条項２４若しくは２５に記載の単離したポリヌクレオチド、条項２６若しくは２７に記載のベクター、条項２８に記載の細胞、又は条項２９に記載の組成物を含む、キット。

条項３１．細胞又は対象を、条項１～２３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムと接触させることを含む、変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞又は対象においてジストロフィン機能を修復するための方法。
条項３２．変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４５中の「ＡＧ」スプライスアクセプターが「ＧＧ」配列へと変換され、ジストロフィン機能がエクソン４５スキッピングによって修復される、条項３１に記載の方法。
条項３３．対象がデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている、条項３１又は３２に記載の方法。

配列
エクソン４５ ｇＲＮＡの標的配列（配列番号１）
gttcctgtaagataccaaaa

化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（配列番号２）
MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９分子（配列番号３）
MKRNYILGLDIGITSVGYGIIDYETRDVIDAGVRLFKEANVENNEGRRSKRGARRLKRRRRHRIQRVKKLLFDYNLLTDHSELSGINPYEARVKGLSQKLSEEEFSAALLHLAKRRGVHNVNEVEEDTGNELSTKEQISRNSKALEEKYVAELQLERLKKDGEVRGSINRFKTSDYVKEAKQLLKVQKAYHQLDQSFIDTYIDLLETRRTYYEGPGEGSPFGWKDIKEWYEMLMGHCTYFPEELRSVKYAYNADLYNALNDLNNLVITRDENEKLEYYEKFQIIENVFKQKKKPTLKQIAKEILVNEEDIKGYRVTSTGKPEFTNLKVYHDIKDITARKEIIENAELLDQIAKILTIYQSSEDIQEELTNLNSELTQEEIEQISNLKGYTGTHNLSLKAINLILDELWHTNDNQIAIFNRLKLVPKKVDLSQQKEIPTTLVDDFILSPVVKRSFIQSIKVINAIIKKYGLPNDIIIELAREKNSKDAQKMINEMQKRNRQTNERIEEIIRTTGKENAKYLIEKIKLHDMQEGKCLYSLEAIPLEDLLNNPFNYEVDHIIPRSVSFDNSFNNKVLVKQEENSKKGNRTPFQYLSSSDSKISYETFKKHILNLAKGKGRISKTKKEYLLEERDINRFSVQKDFINRNLVDTRYATRGLMNLLRSYFRVNNLDVKVKSINGGFTSFLRRKWKFKKERNKGYKHHAEDALIIANADFIFKEWKKLDKAKKVMENQMFEEKQAESMPEIETEQEYKEIFITPHQIKHIKDFKDYKYSHRVDKKPNRELINDTLYSTRKDDKGNTLIVNNLNGLYDKDNDKLKKLINKSPEKLLMYHHDPQTYQKLKLIMEQYGDEKNPLYKYYEETGNYLTKYSKKDNGPVIKKIKYYGNKLNAHLDITDDYPNSRNKVVKLSLKPYRFDVYLDNGVYKFVTVKNLDVIKKENYYEVNSKCYEEAKKLKKISNQAEFIASFYNNDLIKINGELYRVIGVNNDLLNRIEVNMIDITYREYLENMNDKRPPRIIKTIASKTQSIKKYSTDILGNLYEVKSKKHPQIIKKG

化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａを有する）（配列番号４）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ、Ｈ８４９Ａを有する）（配列番号５）
MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD

ＵＧＩ－１をコードしているポリヌクレオチド（配列番号６）
actaatctgagcgacatcattgagaaggagactgggaaacagctggtcattcaggagtccatcctgatgctgcctgaggaggtggaggaagtgatcggcaacaagccagagtctgacatcctggtgcacaccgcctacgacgagtccacagatgagaatgtgatgctgctgacctctgacgcccccgagtataagccttgggccctggtcatccaggattctaacggcgagaataagatcaagatgctg

ｐＣＭＶ＿ＢＥ４ｍａｘ配列（配列番号７）

ｐＣＭＶ＿ＡｎｃＢＥ４ｍａｘ配列（配列番号８）

エクソン４４ ｇＲＮＡの標的配列（配列番号９）
cgcctgcaggtaaaagcata

ＰＡＭ（配列番号１０）
NGG

ＰＡＭ（配列番号１１）
NNNRRT

ＰＡＭ（配列番号１２）
NNGRR（R＝A又はG）

ＰＡＭ（配列番号１３）
NNGRRN（R＝A又はG）

ＰＡＭ（配列番号１４）
NNGRRT（R＝A又はG）

ＰＡＭ（配列番号１５）
NNGRRV（R＝A又はG、V＝A、C、又はG）

ＲＴ－ＰＣＲプライマー（配列番号１６）
CTACAACAAAGCTCAGGTCG

ＲＴ－ＰＣＲプライマー（配列番号１７）
TTCTCAGGTAAAGCTCTGGAAAC

ＵＧＩ－２をコードしているポリヌクレオチド（配列番号１８）
accaacctgtctgacatcatcgagaaggagacaggcaagcagctggtcatccaggagagcatcctgatgctgcccgaagaagtcgaagaagtgatcggaaacaagcctgagagcgatatcctggtccataccgcctacgacgagagtaccgacgaaaatgtgatgctgctgacatccgacgccccagagtataagccctgggctctggtcatccaggattccaacggagagaacaaaatcaaaatgctg

ＰＡＭ（配列番号１９）
NGA

ＵＧＩポリペプチド（配列番号２０）
TNLSDIIEKETGKQLVIQESILMLPEEVEEVIGNKPESDILVHTAYDESTDENVMLLTSDAPEYKPWALVIQDSNGENKIKML

ＡＢＥ７．９
（Gaudelli et al. Nature 2017, 551, 464-471）
ＡＢＥ７．９（ｅｃＴａｄＡ（ｗｔ）－リンカー（３２ａａ）－ｅｃＴａｄＡ^*（７．９）－リンカー（３２ａａ）－Ｃａｓ９ニッカーゼ－ＮＬＳ）：
小文字の二重下線＝ｅｃＴａｄＡ（ｗｔ）、単量体２の１
小文字、下線＝リンカー
大文字の下線＝太字で強調した変異を有する、進化したｅｃＴａｄＡ^*内部単量体２の２
大文字＝Ｃａｓ９ニッカーゼ（下線を引いたＤ１０Ａ変異）
小文字＝ＮＬＳ

タンパク質（配列番号２７）：

ＤＮＡ（配列番号３５）：

ＡＢＥ７．１０
（Gaudelli et al. Nature 2017, 551, 464-471）
ＡＢＥ７．１０（ｅｃＴａｄＡ（ｗｔ）－リンカー（３２ａａ）－ｅｃＴａｄＡ^*（７．１０）－リンカー（３２ａａ）－Ｃａｓ９ニッカーゼ－ＮＬＳ）：
小文字の二重下線＝ｅｃＴａｄＡ（ｗｔ）、単量体２の１
小文字、下線＝リンカー
大文字の下線＝太字で強調した変異を有する、進化したｅｃＴａｄＡ^*内部単量体２の２
大文字＝Ｃａｓ９ニッカーゼ（下線を引いたＤ１０Ａ変異）
小文字＝ＮＬＳ

タンパク質（配列番号２８）：

ＤＮＡ（配列番号３６）：

ＡＢＥｍａｘ
（Koblan et al. Nature Biotech. 2018, 36, 843-846）
ＡＢＥｍａｘ（ＮＬＳ－ｅｃＴａｄＡ（ｗｔ）－リンカー（３２ａａ）－ｅｃＴａｄＡ^*（７．１０）－リンカー（３２ａａ）－Ｃａｓ９ニッカーゼ－リンカー－ＮＬＳ）：
小文字の二重下線＝ｅｃＴａｄＡ（ｗｔ）、単量体２の１
小文字、下線＝リンカー
大文字の下線＝進化したｅｃＴａｄＡ^*内部単量体２の２
大文字＝Ｃａｓ９ニッカーゼ（下線を引いたＤ１０Ａ変異）
小文字＝ＮＬＳ

タンパク質（配列番号２９）：

ＤＮＡ（配列番号３７）：

ＡＢＥ８ｅ
（Richter et al. Nature Biotech. 2020, 38, 883-891）
ＡＢＥ８ｅ（ＮＬＳ－ｅｃＴａｄＡ^*（８ｅ）－リンカー（３２ａａ）－Ｃａｓ９ニッカーゼ－リンカー－ＮＬＳ）：
小文字、下線＝リンカー
大文字の下線＝進化したｅｃＴａｄＡ^*
大文字＝Ｃａｓ９ニッカーゼ（下線を引いたＤ１０Ａ変異）
小文字＝ＮＬＳ

タンパク質（配列番号３０）：

ＤＮＡ（配列番号３８）：

ＡＢＥ８．８ｍ
（Gaudelli et al. Nature Biotech. 2020, 38, 892-900）
ＡＢＥ８．８ｍ（ｅｃＴａｄＡ^*（８．８）－リンカー（３２ａａ）－Ｃａｓ９ニッカーゼ－ＮＬＳ）：
小文字、下線＝リンカー
大文字の下線＝進化したｅｃＴａｄＡ^*
大文字＝Ｃａｓ９ニッカーゼ（下線を引いたＤ１０Ａ変異）
小文字＝ＮＬＳ

タンパク質（配列番号３１）：

ＤＮＡ（配列番号３９）：

ＡＢＥ８．１３ｍ
（Gaudelli et al. Nature Biotech. 2020, 38, 892-900）
ＡＢＥ８．１３ｍ（ｅｃＴａｄＡ^*（８．１３）－リンカー（３２ａａ）－Ｃａｓ９ニッカーゼ－ＮＬＳ）：
小文字、下線＝リンカー
大文字の下線＝進化したｅｃＴａｄＡ^*
大文字＝Ｃａｓ９ニッカーゼ（下線を引いたＤ１０Ａ変異）
小文字＝ＮＬＳ

タンパク質（配列番号３２）：

ＤＮＡ（配列番号４０）：

ＡＢＥ８．１７ｍ
（Gaudelli et al. Nature Biotech. 2020, 38, 892-900）
ＡＢＥ８．１７ｍ（ｅｃＴａｄＡ^*（８．１７）－リンカー（３２ａａ）－Ｃａｓ９ニッカーゼ－ＮＬＳ）：
小文字、下線＝リンカー
大文字の下線＝進化したｅｃＴａｄＡ^*
大文字＝Ｃａｓ９ニッカーゼ（下線を引いたＤ１０Ａ変異）
小文字＝ＮＬＳ

タンパク質（配列番号３３）：

ＤＮＡ（配列番号４１）：

ＡＢＥ８．２０ｍ
（Gaudelli et al. Nature Biotech. 2020, 38, 892-900）
ＡＢＥ８．２０ｍ（ｅｃＴａｄＡ^*（８．２０）－リンカー（３２ａａ）－Ｃａｓ９ニッカーゼ－ＮＬＳ）：
小文字、下線＝リンカー
大文字の下線＝進化したｅｃＴａｄＡ^*
大文字＝Ｃａｓ９ニッカーゼ（下線を引いたＤ１０Ａ変異）
小文字＝ＮＬＳ

タンパク質（配列番号３４）：

ＤＮＡ（配列番号４２）：

配列番号４３
ｇ０４ ｇＲＮＡをコードするＤＮＡ
gttcctgtaagataccaaa

配列番号４４
ｇ０４ ｇＲＮＡ
guuccuguaagauaccaaa

配列番号４５
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ野生型、タンパク質
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRAWDEREVPVGAVLVHNNRVIGEGWNRPIGRHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTLEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGARDAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLSDFFRMRRQEIKAQKKAQSSTD

配列番号４６
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ^*７．９、タンパク質
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRALDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECNALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD

配列番号４７
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊７．１０、タンパク質
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRQVFNAQKKAQSSTD

配列番号４８
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊８ｅ、タンパク質
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN

配列番号４９
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊８．８、タンパク質
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLCRFFRMPRRVFNAQKKAQSSTD

配列番号５０
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊８．１３、タンパク質
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLYDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLCRFFRMPRRVFNAQKKAQSSTD

配列番号５１
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊８．１７、タンパク質
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYSTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHYPGMNHRVEITEGILADECAALLCYFFRMPRRVFNAQKKAQSSTD

配列番号５２
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊８．２０、タンパク質
ｅｃＴａｄＡ＊８．２０
SEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLYDATLYSTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGVRNAKTGAAGSLMDVLHHPGMNHRVEITEGILADECAALLCRFFRMPRRVFNAQKKAQSSTD

配列番号５３
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ野生型、ＤＮＡ
tctgaagtcgagtttagccacgagtattggatgaggcacgcactgaccctggcaaagcgagcatgggatgaaagagaagtccccgtgggcgccgtgctggtgcacaacaatagagtgatcggagagggatggaacaggccaatcggccgccacgaccctaccgcacacgcagagatcatggcactgaggcagggaggcctggtcatgcagaattaccgcctgatcgatgccaccctgtatgtgacactggagccatgcgtgatgtgcgcaggagcaatgatccacagcaggatcggaagagtggtgttcggagcacgggacgccaagaccggcgcagcaggctccctgatggatgtgctgcaccaccccggcatgaaccaccgggtggagatcacagagggaatcctggcagacgagtgcgccgccctgctgagcgatttctttagaatgcggagacaggagatcaaggcccagaagaaggcacagagctccaccgac

配列番号５４
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊７．９、ＤＮＡ
tccgaagtcgagttttcccatgagtactggatgagacacgcattgactctcgcaaagagggctctcgatgaacgcgaggtgcccgtgggggcagtactcgtgctcaacaatcgcgtaatcggcgaaggttggaatagggcaatcggactccacgaccccactgcacatgcggaaatcatggcccttcgacagggagggcttgtgatgcagaattatcgacttatcgatgcgacgctgtacgtcacgtttgaaccttgcgtaatgtgcgcgggagctatgattcactcccgcattggacgagttgtattcggtgttcgcaacgccaagacgggtgccgcaggttcactgatggacgtgctgcattacccaggcatgaaccaccgggtagaaatcacagaaggcatattggcggacgaatgtaacgcgctgttgtgttacttttttcgcatgcccaggcaggtctttaacgcccagaaaaaagcacaatcctctactgac

配列番号５５
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊７．１０、ＤＮＡ
tccgaagtcgagttttcccatgagtactggatgagacacgcattgactctcgcaaagagggctcgagatgaacgcgaggtgcccgtgggggcagtactcgtgctcaacaatcgcgtaatcggcgaaggttggaatagggcaatcggactccacgaccccactgcacatgcggaaatcatggcccttcgacagggagggcttgtgatgcagaattatcgacttatcgatgcgacgctgtacgtcacgtttgaaccttgcgtaatgtgcgcgggagctatgattcactcccgcattggacgagttgtattcggtgttcgcaacgccaagacgggtgccgcaggttcactgatggacgtgctgcattacccaggcatgaaccaccgggtagaaatcacagaaggcatattggcggacgaatgtgcggcgctgttgtgttacttttttcgcatgcccaggcaggtctttaacgcccagaaaaaagcacaatcctctactgac

配列番号５６
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊８ｅ、ＤＮＡ
tctgaggtggagttttcccacgagtactggatgagacatgccctgaccctggccaagagggcacgggatgagagggaggtgcctgtgggagccgtgctggtgctgaacaatagagtgatcggcgagggctggaacagagccatcggcctgcacgacccaacagcccatgccgaaattatggccctgagacagggcggcctggtcatgcagaactacagactgattgacgccaccctgtacgtgacattcgagccttgcgtgatgtgcgccggcgccatgatccactctaggatcggccgcgtggtgtttggcgtgaggaactcaaaaagaggcgccgcaggctccctgatgaacgtgctgaactaccccggcatgaatcaccgcgtcgaaattaccgagggaatcctggcagatgaatgtgccgccctgctgtgcgatttctatcggatgcctagacaggtgttcaatgctcagaagaaggcccagagctccatcaac

配列番号５７
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊８．８、ＤＮＡ
tccgaagtcgagttttcccatgagtactggatgagacacgcattgactctcgcaaagagggctcgagatgaacgcgaggtgcccgtgggggcagtactcgtgctcaacaatcgcgtaatcggcgaaggttggaatagggcaatcggactccacgaccccactgcacatgcggaaatcatggcccttcgacagggagggcttgtgatgcagaattatcgacttatcgatgcgacgctgtacgtcacgtttgaaccttgcgtaatgtgcgcgggagctatgattcactcccgcattggacgagttgtattcggtgttcgcaacgccaagacgggtgccgcaggttcactgatggacgtgctgcatcatccaggcatgaaccaccgggtagaaatcacagaaggcatattggcggacgaatgtgcggcgctgttgtgtcgtttttttcgcatgcccaggcgggtctttaacgcccagaaaaaagcacaatcctctactgactctggtggttcttctggtggttctagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagttctggtggttcttctggtggttct

配列番号５８
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊８．１３、ＤＮＡ
tccgaagtcgagttttcccatgagtactggatgagacacgcattgactctcgcaaagagggctcgagatgaacgcgaggtgcccgtgggggcagtactcgtgctcaacaatcgcgtaatcggcgaaggttggaatagggcaatcggactccacgaccccactgcacatgcggaaatcatggcccttcgacagggagggcttgtgatgcagaattatcgactttatgatgcgacgctgtacgtcacgtttgaaccttgcgtaatgtgcgcgggagctatgattcactcccgcattggacgagttgtattcggtgttcgcaacgccaagacgggtgccgcaggttcactgatggacgtgctgcatcatccaggcatgaaccaccgggtagaaatcacagaaggcatattggcggacgaatgtgcggcgctgttgtgtcgtttttttcgcatgcccaggcgggtctttaacgcccagaaaaaagcacaatcctctactgac

配列番号５９
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊８．１７、ＤＮＡ
tccgaagtcgagttttcccatgagtactggatgagacacgcattgactctcgcaaagagggctcgagatgaacgcgaggtgcccgtgggggcagtactcgtgctcaacaatcgcgtaatcggcgaaggttggaatagggcaatcggactccacgaccccactgcacatgcggaaatcatggcccttcgacagggagggcttgtgatgcagaattatcgacttatcgatgcgacgctgtactcgacgtttgaaccttgcgtaatgtgcgcgggagctatgattcactcccgcattggacgagttgtattcggtgttcgcaacgccaagacgggtgccgcaggttcactgatggacgtgctgcattacccaggcatgaaccaccgggtagaaatcacagaaggcatattggcggacgaatgtgcggcgctgttgtgttacttttttcgcatgcccaggcgtgtctttaacgcccagaaaaaagcacaatcctctactgac

配列番号６０
ＡＢＥ ｅｃＴａｄＡ＊８．２０、ＤＮＡ
tccgaagtcgagttttcccatgagtactggatgagacacgcattgactctcgcaaagagggctcgagatgaacgcgaggtgcccgtgggggcagtactcgtgctcaacaatcgcgtaatcggcgaaggttggaatagggcaatcggactccacgaccccactgcacatgcggaaatcatggcccttcgacagggagggcttgtgatgcagaattatcgactttatgatgcgacgctgtactcgacgtttgaaccttgcgtaatgtgcgcgggagctatgattcactcccgcattggacgagttgtattcggtgttcgcaacgccaagacgggtgccgcaggttcactgatggacgtgctgcatcatccaggcatgaaccaccgggtagaaatcacagaaggcatattggcggacgaatgtgcggcgctgttgtgtcgtttttttcgcatgcccaggcgggtctttaacgcccagaaaaaagcacaatcctctactgac

配列番号６１
リンカー、アミノ酸
SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS

配列番号６２
リンカー、アミノ酸
SGGS

配列番号６３
リンカー、ＤＮＡ
tctggtggttcttctggtggttctagcggcagcgagactcccgggacctcagagtccgccacacccgaaagttctggtggttcttctggtggttct

配列番号６４
リンカー、ＤＮＡ
tctggtggttct

配列番号６５
ＮＬＳ、アミノ酸
PKKKRKV

配列番号６６
ＮＬＳ、アミノ酸
KRTADGSEFEPKKKRKV

配列番号６７
ＮＬＳ、アミノ酸
KRTADGSEFESPKKKRKV

配列番号６８
ＮＬＳ、アミノ酸
EGADKRTADGSEFESPKKKRKV

配列番号６９
ＮＬＳ、ＤＮＡ
ccc aag aag aag agg aaa gtc

配列番号７０
ＮＬＳ、ＤＮＡ
aaa aga acc gcc gac ggc agc gaa ttc gag ccc aag aaｇ aag agg aaa
gtc

配列番号７１
ＮＬＳ、ＤＮＡ
aaa cgg aca gcc gac gga agc gag ttc gag tca cca aag aag aag cgg
aaa gtc

配列番号７２
ＮＬＳ、ＤＮＡ
gag gga gct gat aag cgc acc gcc gat ggt tcc gag ttc gaa agc ccc
aag aag aag agg aaa gtc

配列番号７３
ｇＲＮＡ定常領域のＤＮＡ配列
gtttaagagctatgctggaaacagcatagcaagtttaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgc

配列番号７４
ｇＲＮＡ定常領域のＲＮＡ配列
Guuuaagagcuaugcuggaaacagcauagcaaguuuaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugc

Claims (33)

1. 融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムであって、前記融合タンパク質はＣａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、
   前記少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号２１～２３若しくは４３又はその相補鎖若しくは断片の少なくとも１個を含む配列を標的化し、及び／又は、前記ｇＲＮＡは、配列番号２４～２６若しくは４４又はその相補鎖若しくは断片から選択される配列を含む、塩基編集システム。
2. 融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、対象のゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムであって、前記融合タンパク質はＣａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、
   前記塩基編集ドメインは、配列番号４５～５２から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は、配列番号５３～６０から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、塩基編集システム。
3. 融合タンパク質が、配列番号２７～３４から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は、配列番号３５～４２から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項２に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
4. ゲノムＤＮＡ中にコードされるＲＮＡスプライシング部位を変更することが、ＲＮＡ転写物中の少なくとも１個のエクソン配列の排除又は包含をもたらす、請求項１～３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
5. 融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、対象においてジストロフィン機能を修復するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムであって、前記融合タンパク質はＣａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、
   前記少なくとも１個のｇＲＮＡは、配列番号２１～２３若しくは４３又はその相補鎖若しくは断片の少なくとも１個を含む配列を標的化し、及び／又は、前記ｇＲＮＡは、配列番号２４～２６若しくは４４又はその相補鎖若しくは断片から選択される配列を含む、塩基編集システム。
6. 融合タンパク質及び少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、対象においてジストロフィン機能を修復するための、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムであって、前記融合タンパク質はＣａｓタンパク質及び塩基編集ドメインを含み、
   前記塩基編集ドメインは、配列番号４５～５２から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は、配列番号５３～６０から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、塩基編集システム。
7. 融合タンパク質が、配列番号２７～３４から選択されるポリペプチドを含み、及び／又は、配列番号３５～４２から選択される配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
8. 対象が変異したジストロフィン遺伝子を有しており、少なくとも１個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、対象の変異したジストロフィン遺伝子中のＲＮＡスプライシング部位を標的とする、請求項５～７のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
9. 対象へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムの投与が、少なくとも１個のエクソン配列が対象のジストロフィン遺伝子のＲＮＡ転写物から排除又はその中に包含されること、及び対象中のジストロフィン遺伝子のリーディングフレームが修復されることをもたらす、請求項８に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
10. Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９を含み、Ｃａｓ９が、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を除去する少なくとも１個のアミノ酸変異を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
11. 少なくとも１個のアミノ酸変異が、配列番号２又は３に対応するアミノ酸配列中のＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、又はその組合せのうちの少なくとも１個である、請求項１０に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
12. Ｃａｓタンパク質が、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質又は黄色ブドウ球菌Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１～１１のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
13. Ｃａｓタンパク質が、配列番号４又は５のアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
14. 塩基編集ドメインが、（ｉ）シチジンデアミナーゼドメイン及び（ｉｉ）少なくとも１個のウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインをさらに含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
15. シチジンデアミナーゼドメインが、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）デアミナーゼを含む、請求項１４に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
16. シチジンデアミナーゼドメインがＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む、請求項１４又は１５に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
17. シチジンデアミナーゼドメインがラットＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼを含む、請求項１６に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
18. 少なくとも１個のＵＧＩドメインが、ＵＤＧ活性を阻害することができるドメインを含む、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
19. 少なくとも１個のＵＧＩドメインが、配列番号２０のアミノ酸配列、又は配列番号６若しくは配列番号１８のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
20. 塩基編集ドメインが、１個のＵＧＩドメイン又は２個のＵＧＩドメインを含む、請求項１４～１９のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
21. 融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ₂－［ＡＢＥ］－［Ｃａｓタンパク質］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
22. 融合タンパク質が以下の構造：ＮＨ₂－［Ｃａｓタンパク質］－［ＡＢＥ］－ＣＯＯＨ（式中、「－」のそれぞれの記号は任意選択のリンカーを含む）を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
23. 融合タンパク質が核移行配列（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム。
24. 請求項１～２３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムをコードする単離したポリヌクレオチド。
25. ポリヌクレオチドが、融合タンパク質をコードする第１のポリヌクレオチド及びｇＲＮＡをコードする第２のポリヌクレオチドを含む、請求項２４に記載の単離したポリヌクレオチド。
26. 請求項２４又は２５に記載の単離したポリヌクレオチドを含むベクター。
27. ベクターが、単離したポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、請求項２６に記載のベクター。
28. 請求項２４若しくは２５に記載の単離したポリヌクレオチド又は請求項２６若しくは２７に記載のベクターを含む細胞。
29. 請求項１～２３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムを含む、変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞においてジストロフィン機能を修復するための組成物。
30. 請求項１～２３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システム、請求項２４若しくは２５に記載の単離したポリヌクレオチド、請求項２６若しくは２７に記載のベクター、請求項２８に記載の細胞、又は請求項２９に記載の組成物を含むキット。
31. 細胞又は対象を、請求項１～２３のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースにした塩基編集システムと接触させることを含む、変異ジストロフィン遺伝子を有する細胞又は対象においてジストロフィン機能を修復するための方法。
32. 変異ジストロフィン遺伝子のエクソン４５中の「ＡＧ」スプライスアクセプターが「ＧＧ」配列へと変換され、ジストロフィン機能がエクソン４５スキッピングによって修復される、請求項３１に記載の方法。
33. 対象がデュシェンヌ筋ジストロフィーを患っている、請求項３１又は３２に記載の方法。

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