KR20120069756A - 엠티 피코르나 바이러스 캡시드의 생성을 위한 컨스트럭트 - Google Patents

엠티 피코르나 바이러스 캡시드의 생성을 위한 컨스트럭트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 숙주 세포에서 발현될 때 엠티 바이러스 캡시드를 생성는 것이 가능한 컨스트럭트를 제공하며, 컨스트럭트는 다음을 포함한다: (i) 캡시드 전구체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; (ⅱ) 캡시드 전구체 단백질을 분할시키는 것이 가능한 프로테아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및 (ⅲ) 프로테아제의 발현을 조절하는 제어 엘레멘트 컨스트럭트가 숙주 세포 내에 존재할 때, 제어 엘레멘트는 캡시드 전구체 단백질을 분할시키는데 충분한 수준으로 발현되지만 숙주 세포에서 유의미한 독성을 유도하는데는 충분하지 않은 프로테아제를 야기한다. 또한 본 발명은 컨스트럭트 및 엠티 바이러스 캡시드를 생성하기 위한 용도를 포함하는 벡터 및 숙주 세포를 제공한다.

Description

엠티 피코르나 바이러스 캡시드의 생성을 위한 컨스트럭트{Construct for production of empty picornaviral capsids}
본 발명은 컨스트럭트에 관한 것으로, 이 컨스트럭트가 숙주 세포에서 발현될 때 엠티 바이러스 캡시드를 생성하는 것이 가능하며 특히 엠티 구제역 바이러스(foot and mouth disease virus, FMDV) 캡시드를 생성하는 것이 가능하다. 또한 본 발명은 상기 컨스트럭트를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다.
구제역 ( FMD )
FMD는 매우 전염성이 높고 경제적으로 엄청난 손실을 입히는 발굽이 갈라진 동물(우제류)의 질병으로 가축용 반추동물, 돼지 및 많은 수의 야생 동물종에 영향을 끼친다.
FMD는 전 세계에 광범위하게 퍼져있다. 북중미 대륙과 같은 개발 지역 및 남극 대륙 및 오스트레일리아 및 뉴질랜드는 FMD로부터 자유로운 반면에, 사하라 사막 이남의 아프리카, 중동, 남아시아, 동남아시아와 같은 많은 개발도상국에서 FMD는 고질적이다. 또한 FMD가 1989년에 근절되고 1991년 이후로는 예방 접종이 중지된 유럽과 같이 이 질병으로부터 자유로운 일부 지역이 있다. 그러나 PanAsian O strain (Knowles et al., (2001) Veterinary Record. 148. 258-259)으로 인한 2001 유럽/아일랜드/프랑스/네덜란드에서의 유행병 및 2007년 영국에서 혈청형(serotype) O1 BFS/1967의 발생과 같은 질병의 비정기적 습격이 발생하기도 한다.
FMD의 병원(causal agent)은 피코르나 바이러스과 패밀리의 양성 센스 방향, 단일 가닥 RNA 바이러스인 구제역 바이러스(FMDV)이다. FMDV는 7개의 항원과 관련하여 별개의 혈청형의 형태로 존재하며, 즉 각각의 혈청형 내에 많은 서브타입을 지닌 A, O, C, Asia 1 및 South African Territories (SAT) 1, 2 및 3이다.
단일-가닥 RNA의 번역은 다단백질(polyprotein)을 생성하고 이는 바이러스의 조립(assembly) 및 복제에 필요한 구조적 및 비-구조적 단백질을 생성하기 위해 바이러스-인코딩된 프로테아제에 의해 연이어 처리된다. 선도(L) 프로테아제는 P1-2A 캡시드 전구체로부터의 C 말단에서 시스 또는 트랜스로 자체적으로 분할(cleavage)된다. 2A 프로테아제는 P2로부터의 P1-2A를 분비하기 위해 C 말단에서 자체적으로 분할된다. P1-2A의 처리는 캡시드 단백질 1AB (VP0로 알려짐), 1C (VP3) 및 1D (VP1)를 생성하기 위한 3C 프로테아제에 의해 영향을 받는다. 비리온(virion)에서 1AB의 분할은 1A (VP4) 및 1B (VP2)를 생성한다.
FMDV 백신
FMD에 대한 종래의 백신은 바이너리 에틸렌이민(BEI)과 같은 아지리딘(aziridine)의 사용에 의해 일반적으로 화학적으로 불활성화된 전체 바이러스 비리온으로 구성된다.
불활성화된 전체 바이러스 백신은 FMD를 통제하고 근절시키는 활동(campaign)에서 중요한 역할을 한다. 하지만 바이러스 조직 배양으로부터 생성된 백신은 백신을 생성하는 동안 바이러스 분비의 위험과 관련이 있다. 또한 백신-관련 FMD 발병으로 이어질 수 있는 가능성을 지닌 바이러스의 불완전한 불활성화 위험성도 있다.
이런 위험성을 줄이기 위해서 FMDV의 엠티 캡시드-유사 입자 사용의 가능성이 고려된다. 이러한 입자는 FMDV의 구조 단백질을 포함하나, 이들은 RNA 게놈을 가지고 있지 않기 때문에 비-증식 및 비-전염성이다. 엠티 캡시드의 외부 구조가 야생형 바이러스와 동일해야 하므로, 엠티 캡시드는 비슷한 항원성 및 면역성을 지니게 될 것이다.
엠티 FMD 캡시드 입자를 생성하기 위한 몇몇 시도가 있었으나, 생성물의 수율 및 안정성에 관한 문제가 반복해서 발생하였다.
백신 바이러스 발현 시스템이 P1-2A-3C 카세트 (Abrahams et al (1995) J. Gen Virol. 76:3089-3098)를 발현시키기 위해서 사용되어 왔다. 카세트의 구성적 발현은 성공적이지 못하나 카세트가 박테리오파지 T7 프로모터의 통제 하에 놓여 있을 때 vv/FMDV 재조합형이 분리될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나 이러한 시스템은 시간이 지나면서 P1-2A-3C 카세트의 독성이 퍼지기 때문에 엠티 캡시드의 지속적인 발현을 위해 사용될 수 없었다. 또한 일정한 T7 Pol 발현이 P1-2A-3C의 생성을 위해 필요하다는 문제도 있다. 조직 배양과 같은 작은 스케일에서는 이것을 달성할 수도 있지만, 제조(manufacturing) 스케일에서는 이것을 실시하기 불가능할 것이다. 더욱이 백신 시스템에서 생성된 생성물은 메디컬 또는 수의학 적용에 대해 상업적으로 이용가능하지 않다.
Li et al (2008) (PLoS ONE 28:3(5) e2273)은 누에-바큐로 바이러스 발현 시스템에서 FMDV 바이러스 캡시스 단백질의 발현을 보고한다. P1-2A 및 3C의 무손상(intact) 암호 영역을 발현시키는 재조합 바이러스가 누에에게 접종시키는데 사용되었으며, 이후에 죽어가고 있는 누에로부터 헤모림프를 수집하였다. 이 "발현된 항체"의 제조용 물질은 소에서 항-FMDV-항체 반응을 일으키는 것으로 나타났다. 그러나 "발현된 항원"의 성질(nature)은 불명확하므로, 본 발명자는 엠티 캡시드에 대한 "서브유니트 백신"이라고 추정하였다.
Cao et al ((2009) Veterinary Microbiology 137:10-17)은 각각의 프로모터로부터 FMDV의 P12A 및 3C 단백질에 대한 유전자를 동시에 발현시키는 재조합 바큐로 바이러스 시스템을 기술한다. 웨스턴 블롯팅에 의해 캡시스 단백질이 3C 프로테아제에 의해 어느 정도 처리됨을 나타냈으며, 엠티 캡시드 입자는 면역 전자 현미경에 의해 관찰될 수 있다. 엠티 캡시드의 조추출액(crude extract)을 이용한 면역화(immunisation)는 면역 반응을 초래하나, FMDV-특이적 항체 및 중화 항체의 수준은 종래의 불활성화된 백신의 수준보다 낮았다. 이는 엠티 캡시드 입자의 낮은 수준으로 인한 것임이 예상된다. 곤충 세포에서 단백질 발현의 함량 및 엠티 캡시드 조립을 개선하기 위해 추가 연구가 필요하다는 결론을 내렸다.
따라서 본 발명이 해결하려는 과제는 상당한 수율로 면역성, 안정한 생성물을 생성하는 엠티 바이러스 캡시드를 생성하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 역사적으로 FMDV 엠티 캡시드 생성과 관련된 낮은 수율에 대한 이유가 3C 프로테아제의 수준이 숙주 세포에서 너무 높아 독성을 일으키기 때문이라는 것을 발견하였다. 높은 수율로 엠티 캡시드 입자를 생성하기 위해서, 3C 프로테아제의 발현 및/또는 균형을 조절하는 것이 필요하며, 캡시드 단백질 전구체를 분할(cleavage)시키기 위해 충분히 발현/활성시켜야 하지만 숙주 세포에서 독성을 유도하는 수준으로 발현/활성시켜서는 안 된다.
따라서 첫 번째 관점에서, 본 발명은 숙주 세포에서 발현될 때 엠티 바이러스 캡시드를 생성하는 것이 가능한 컨스트럭트를 제공하며, 컨스트럭트는 다음을 포함한다:
(i) 캡시드 전구체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
(ⅱ) 캡시드 전구체 단백질을 분할시키는 것이 가능한 프로테아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
(ⅲ) 프로테아제의 발현을 조절하는 제어 엘레멘트
컨스트럭트가 숙주 세포 내에 존재할 때, 제어 엘레멘트는 캡시드 전구체 단백질을 분할시키는데 충분한 수준으로 발현되지만 숙주 세포에서 유의미한 독성을 유도하는데는 불충분한 프로테아제를 유발시킨다.
제어 엘레멘트는 레트로 바이러스로부터 유래되고, 특히 제어 엘레멘트는 HIV-1 프레임 이동(frameshift) 사이트와 같은 레트로 바이러스 프레임 이동 사이트이다. HIV-1 프레임 이동 사이트는 번역된 mRNAs의 약 5%에서 프레임 이동을 초래한다.
컨스트럭트가 번역될 때 프레임 이동 사이트는 캡시드 전구체 단백질을 코드화한 뉴클레오티드 서열과 프로테아제를 코드화한 뉴클레오티드 서열 사이에 위치한다:
(1) 리보솜에서 프레임 이동이 일어나지 않는다면 절단된 생성물(캡시드 전구체 단백질을 포함하나 프로테아제는 포함하지 않는)을 생성할 것이다; 그러나
(2) 리보솜에서 프레임 이동이 일어난다면, 캡시드 전구체 단백질과 프로테아제는 모두 번역된다.
본 발명의 첫 번째 관점의 컨스트럭트에서, 프로테아제의 활성도 감소된다. 예를 들면 프로테아제는 캡시드 전구체 단백질 분할 활성을 감소시키는 적어도 하나 이상의 변이를 포함한다.
프로테아제(예를 들면 변이 프로테아제)는 야생형 프로테아제보다 약 3배정도 낮은 캡시드 전구체 단백질 분할 활성을 지닌다.
본 발명의 첫 번째 관점에 따른 컨스트럭트를 포함하는 숙주세포에 의해 생성된 엠티 캡시드는 구제역 바이러스(FMDV) 캡시드와 같은 피코르나 바이러스 캡시드이다.
엠티 FMDV 캡시드를 생성하기 위해서, 전구체 단백질은 P1이고, 프로테아제는 3C이다. 3C 프로테아제의 활성을 감소시키기 위해서, 예를 들면 Cys142에서 변이를 포함한다.
두 번째 관점에서 본 발명은 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 제공한다. 예를 들면 벡터는 바큐로 바이러스 전달 벡터; DNA 벡터, 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 것이다.
세 번째 관점에서 본 발명은 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 컨스트럭트를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 첫 번째 실시태양에서 숙주 세포는 본 발명의 두 번째 관점에 따른 벡터를 생성하는 것이 가능하다. 두 번째 실시태양에서 숙주 세포는 엠티 바이러스 캡시드를 생성하는 가능하다.
예를 들면 숙주 세포는 곤충 세포 또는 포유류 세포일 것이다.
본 발명의 추가 관점은 하기에 관한 것이다:
(i) 숙주 세포에서 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 컨스트럭트를 발현시킴으로써 엠티 바이러스 캡시드를 생성하고 숙주 세포에 의해 생성된 엠티 바이러스 캡시드를 수집하기 위한 방법;
(ⅱ) 상기의 방법에 의해 엠티 바이러스 캡시드를 생성하고 백신에 엠티 바이러스 캡시드를 포함시킴으로써 백신의 생성을 위한 방법;
(ⅲ) 엠티 캡시드는 체내에서 생성되며, 피험체에서 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 컨스트럭트를 발현시킴으로써 피험체의 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법;
(ⅳ) 질병을 예방 및/또는 치료하는데 사용하기 위한 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 컨스트럭트 또는 본 발명의 두 번째 관점에 따른 벡터;
(ⅴ) 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 약물의 제조에 있어서 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 컨스트럭트 또는 본 발명의 두 번째 관점에 따른 벡터의 용도;
(ⅵ) 피코르나 바이러스 단백질의 발현을 조절하는 레트로 바이러스 제어 엘레멘트의 용도; 및
(ⅶ) 레트로 바이러스 제어 엘레멘트의 통제 하에서 피코르나 바이러스 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 컨스트럭트
"엠티 캡시드"-기반 백신은 제조를 위해 높은-보안의 취급 시설을 필요로 하지 않기 때문에 전통적인 불활성화된 전체-병원체(pathogen) 백신(예를 들면 FMD) 보다 이득이 되며, 따라서 바이러스 "이탈"의 위험을 완화시킨다. 또한 이들은 비-감염성이며, 다루는 것이 쉽고, (본 발명의 견해에서) 제조하는 것이 쉽고, 비싸지 않다.
도 1은 발현 벡터 pOPINE5949-FS에 관한 것이다. 벡터는 상업 벡터 pTriEx1.1 (EMD Sciences)의 유도체이나 무봉합(seamless) 클로닝을 위해 수정되었다. 진단 제한 부위의 벡터 및 사이트의 특징을 나타내었다. FMD 엠티 캡시드의 성공적인 발현을 위해 필요한 중요한 단계는 특별한 NotI 및 Bsu36I 제한 부위 사이의 3C 암호 영역의 앞에 위치하는 HIV-1 프레임 이동 사이트를 인코딩하는 서열의 도입이다.
결과적으로 p10 또는 CMV 프로모터에서 유래하는 모든 mRNAs는 P1 전구체 단백질을 번역하나, 서브세트는 오직 3C 프로테아제만을 번역한다. 재조합 바큐로 바이러스를 형성하기 위해 사용될 때, ORF603에서 시계방향으로 ORF1629까지의 서열은 바이러스 게놈과 재조합된다. 그 다음에 P10 프로모터는 감염된 세포에서 재조합 생성물을 생성하는 바큐로 바이러스 감염성 사이클의 일부로서 활성화된다.
도 2는 P1-2A-3B3-3C(오른쪽 트랙) 또는 P1-2A-3B3-3C163S(왼쪽 트랙)를 코드화한 재조합 바큐로 바이러스간의 발현 수준의 비교를 나타낸 것이다. 3C 활성의 불활성화는 P1의 충분한(abundant) 합성을 보완한다.
도 3은 P1-3C 정션(junction)에서 프레임 이동을 초래하기 위해 사용되는 서열에 관한 것이다. 중요한 특징은 우라실(밑줄 그은)의 런(run)이며 그 다음 유사 매듭(pseudoknot)에 의해 리보솜을 정지시키고 슬립을 촉진시키는 슬리피지(slippage)가 발생한다.
도 4는 FMDV로의 HIV-1 프레임 이동 서열의 도입을 나타낸 것이다. P1 해독프레임은 2의 상부이며 삽입은 빨간색으로 표시한 종결 코돈에서 번역된 생성물의 절단을 초래한다. 삽입된 서열(오렌지색 박스)의 개시점에서 A -1 프레임 이동은 3C 번역을 포함하는 해독프레임(아래쪽 프레임)의 수정을 초래한다.
도 5는 시험관에서 잔기 142에서 변이된 3C 프로테아제의 활성 측정을 나타낸 것이다. 142T 및 142S 모두는 모 서열과 비교시 감소된 활성을 보인다.
도 6은 피코르나 바이러스 계통 발생을 나타낸 것이다. 밀접하게 관련된 패밀리는 공동의 코딩 전략(strategy) 및 복제 사이클(cycle)을 공유한다; 폴리오 바이러스(PV) 및 구제역 바이러스(FMDV)와 같이 잘 연구된 바이러스에 관해 관찰된 내용은 다른 멤버에도 적용된다.
완벽한 계통 발생 및 논의는 다음에서 찾아볼 수 있었다: Hughes AL. (2004) Phylogeny of the Picornaviridae and differential evolutionary divergence of picornavirus proteins. Infect Genet Evol. 4:143-52.
도 7은 도 1 및 이들의 가능한 번역 생성물에서 발현 카세트의 선형 맵을 나타낸 것이다. P1 및 P1-2A-3B-FS-3C 생성물에 대한 번역의 제안된 상대 수준은 문헌에서 인용하였으며, 실험적으로 측정되지는 않았다.
도 8은 3C 프로테아제의 독성을 나타낸 것이다. 곤충 세포는 3C와 커플링된 FMDV P1을 발현시키는 재조합 바큐로 바이러스에 감염되었다. A에서 트랙 1은 잔기 163에서 활성 부위 Cys의 변이주(mutant)이며 P1로 자발적으로 분해하는 P1-3C 융합 단백질의 충분한 합성은 분명한 것이다. A의 트랙 2는 야생형 프로테아제이다; 성숙한 캡시드 단백질 VP1의 P1의 아주 적은 합성임이 분명하다. B에서 재조합 바이러스 발현 P1(트랙 1) 및 약화된 3C와 커플링된 P1(트랙 2)이 비교되었다. 현재 높은 수준의 합성이 유지되며 P1 전구체는 성숙한 캡시드 단백질 VP1으로 세포 조직 생리적으로 전환된다. 세포 용해물은 10% SDS-PAGE에 의해 용해되며, 웨스턴 블롯은 다가 FMDV 항혈청으로 프로브되었으며 가장 큰 반응성은 VP1에 대한 것이다. VP0 및 VP3의 몰량이 존재하나 이 혈청에서 나타나지는 않았다.
도 9는 엠티 FMDV 캡시드의 조립을 나타낸 것이다. 3C 프로테아제 활성의 변형이 이루어진 재조합 바큐로 바이러스 감염된 곤충 세포로부터의 발현 생성물의 수크로오스 그라디언트 분석을 나타낸 것이다. 아마 응집되어 있는 일부 처리되지 않은 P1 전구체는 그라디언트의 아래쪽에 위치하나 반면에 VP1 분할 생성물은 35-45% 수크로오스 분획(fraction)에서 강하고 넓은 피크를 형성한다.
이 그라디언트에서 일부는 조립된 입자에 대해 예상된 것이나, 용해성 항원에 대해서는 아니다.
도 10은 바큐로 바이러스 발현에 의해 엠티 FMDV A 혈청형 캡시드의 시각화를 나타낸 것이다. 수크로오스 그라디언트로부터의 피크 분획이 모아졌고 탄소 코딩된 포름바르(formvar) 그리드로 흡수되기 전에 농축되었으며 우라실 아세테이트로 음성적으로(negatively) 염색되었다. 25nm의 지름을 지닌 약간의 입자를 나타낸다(두개의 화살표). 이들의 입자의 빈 공간에서 보여지는 안쪽으로 염색된 부분을 주목하라.
정20면체 구조와 일관된 특히 좋은 앵글 형태(angular definition)를 보여주는 입자는 빨간색 화살표로 나타내었다.
도 11은 바큐로 바이러스 발현에 의해 생성된 엠티 FMDV O 혈청형 캡시드의 시각화를 나타낸 것이다.
도 12는 합성 캡시드를 지닌 예방 접종에 반응하여 기니아 피그에서 특이적 항체의 도입을 입증하는 그래프이다. 항체의 역가는 (A) 바이러스 중화 시험 및 (B) 액상 블록킹 ELISA를 이용하여 측정되었다. 합성 A 혈청형 캡시드를 지닌 기니아 피그의 면역화는 이전의 연구에서 보호하는 것으로 증명된 수준과 일관된 항체 역가의 도입을 초래한다.
컨스트럭트
본 발명의 첫 번째 관점에서 본 발명은
(i) 캡시드 전구체 단백질을 코드화한 뉴클레오티드 서열;
(ⅱ) 캡시드 전구체 단백질을 분할시키는 것이 가능한 프로테아제를 코드화한 뉴클레오티드 서열; 및
(ⅲ) 프로테아제의 발현을 조절하는 제어 엘레멘트
를 포함하는 컨스트럭트를 제공한다.
"뉴클레오티드 서열"이라는 용어는 RNA 또는 DNA 서열을 포함한다. 이것은 단일 또는 이중 가닥이다. 이것은 예를 들면 게놈, 재조합, mRNA 또는 cDNA이다.
컨스트럭트는 아마도 연속적으로 상기의 뉴클레오티드 서열 (i) 및 (ⅱ)을 포함하는 뉴클레오티드 서열일 것이다. 뉴클레오티드 서열 (i) 및 (ⅱ) 사이에 있는 서열 섹션일 수 있다. 제어 엘레멘트는 서열의 섹션에 존재하고 이는 프로테아제의 발현을 조절하지만 캡시드 전구체 단배질의 발현을 조절하거나 영향을 끼치지는 않는다.
컨스트럭트는 플라스미드, 전달 벡터 또는 숙주 세포 게놈의 일부로 존재한다(하기를 참고).
제어 엘레멘트
본 발명의 첫 번째 관점의 컨스트럭트는 프로테아제의 발현을 조절하는 제어 엘레멘트를 포함한다. 예를 들면 제어 엘레멘트는 적어도 프로테아제의 전사 및/또는 발현을 부분적으로 조절한다.
특히, 제어 엘레멘트는 캡시드 전구체 단백질을 분할시키기에 충분한 그러나 숙주 세포에서 독성을 유도하기에는 충분하지 않은 수준으로 발현되는 프로테아제를 유도한다.
캡시드 전구체 단백질의 분할은 당분야에 공지된 기술을 이용하여 분석된다. 예를 들면 숙주 세포로부터의 재조합 단백질 추출물은 겔-전기영동에 의해 분리되며 분리된 단백질은 웨스턴 블롯팅을 위해 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 이동되었다. 항-바이러스 항체로 웨스턴 블롯팅은 프로테아제-매개 분할의 정도(degree) 및 규모(extent)를 밝혀내야 한다.
예를 들면 FMDV를 위해, 처리되지 않은 캡시드 전구체 단백질(P1-P2A)은 81 kDa 밴드로서 나타났고, 분할(cleavage)은 VP31 (47kDa), VP3 (24kDa) 및/또는 VP1 (24 kDa)을 생성한다.
또한 캡시드 전구체 단백질의 분할은 엠티 캡시드의 생성에 의해 유도할 수 있다.
프로테아제에 의해 도입된 숙주 세포에서 세포독성의 정도는 당분야에 공지된 기술을 사용하여 분석된다. 예를 들면 트립판 블루 배제(trypan blue exclusion)가 세포와 0.4% 트립판 블루를 동일한 부피로 혼합하고 Countess 자동 세포 측정기(Invitrogen)에 의해 측정되는 생존도를 정의하는데 사용되었다.
숙주 세포의 10% , 5% 또는 2% 이하가 프로테아제에 의해 생존 억제된다면 독성 수준은 "유의미하게(significant)"하게 고려되지 않는다. 3C 단백질의 보조발현의 부재시 캡시드 전구체 단백질의 발현이 숙주 세포에서 80, 90 또는 95% 수준에서 발현할 수 있다면 독성 수준은 "유의미하게(significant)"하게 고려되지 않는다(프로테아제에 의한 캡시드 전구체 단백질의 분할 효과를 무시).
제어 엘레멘트는 제어 엘레멘트가 없을 때 초래되는 발현 수준과 비교하면 3C 프로테아제의 발현을 감소시킨다.
제어 엘레멘트는 mRNA를 해독할 때 적어도 하나 이상의 염기를 스킵(또는 반복)하는 리보솜 내의 번역 프레임 이동 사이트일 수 있다. 프레임 이동 과정에서 리보솜 내의 번역은 전사체의 일정 지점에서 전방 또는 후방으로 하나의 뉴클레오티드의 슬라이드를 야기시킬 수 있다. 따라서 단백질 합성은 각각의 리딩 프레임에 따라 +1 또는 -1 연달아 진행되게 된다.
프로그램화된 -1 리보솜 프레임 이동 신호는 잘 특성화되었으며 일부 박테리아 -1 프레임 이동 이벤트도 보고되었다. 진핵세포를 감염시키는 많은 수의 바이러스는 프로그램화된 -1 리보솜 프레임 이동을 이용하고 있고, 이는 프레임 이동 처리에 관련된 cis 엘레멘트가 진핵생물 내에서 작동된다는 것을 나타내고 있다. 바이러스 시스템에서, 프레임 이동의 효율은 합성된 바이러스 단백질 생성물의 화학량론의 측정에 필수적이며, 이는 바이러스의 효율적 증식을 위해 엄격하게 유지되어야만 한다.
인간 면역결핍 바이러스(HIV) -1은 Gag 및 Gag-Pol 다단백질의 요구되는 비율을 만들기 위해 리보솜 프레임 이동을 사용한다. 프레임 이동 신호의 스템-루프(stem-loop) 구조는 리보솜의 진행을 지연시키는 것으로 생각되며 5' 방향에서 슬리피지를 야기시키며, 이는 -1 프레임 이동과 번역을 유발하여, 새로운 프레임 내에서 번역을 지속시킨다(도 3을 참고).
제어 엘레멘트는 번역된 mRNAs의 1?20%, 1-10%, 3?7% 정도 또는 약 5%에서 프레임 이동을 일으킨다.
프레임 이동 서열은 약 6개의 유라실 런(run)을 포함하며, 여기서 슬리피지가 발생하며 그 다음에 서열은 리보솜을 정지시키는 유사매듭을 형성하는 것이 가능하며 이는 슬립을 촉진시킨다.
제어 엘레멘트는 프로테아제-인코딩 뉴클레오티드 서열의 업스트림 및 캡시드 전구체 단백질 인코딩 서열의 다운스트림이다.
엠티 캡시드
"엠티 캡시드"는 바이러스의 단백질 쉘을 포함하나 RNA 또는 DNA 게놈이 없는 독립체이다. 엠티 캡시드는 야생형 백신과 동일한 구조의 에피토프를 지니기 때문에 야생형 백신과 같은 방법의 항원성 및 면역성을 지니나 게놈이 없기 때문에 감염을 일으키지는 않는다.
엠티 캡시드의 생성은 수크로오스 밀도 원심분리 또는 전자 현미경과 같은 당 분야에 공지된 기술을 이용하여 측정 또는 확인되었다(Abrahams et al (1995) as above).
단일 클론 항체는 엠티 캡시드의 항원성이 유지되는지 여부를 측정하기 위해서 야생형 바이러스 상에서 형태 에피토프에 대해 특이적으로 사용되었다.
프로테아제
프로테아제는 캡시드의 생성 및 조립의 단계로서 캡시드 전구체 단백질을 분할시키는 바이러스 프로테아제이다.
상기에 언급한 바와 같이, FMDV과 같은 피코르나 바이러스에 대해, VP0 (VP2 플러스 VP4), VP3 및 VP1로 전구체 P1의 단백질 분해 처리는 바이러스 프로테아제 3C 또는 이들의 전구체 3CD를 이용하여 발생한다.
FMDV 타입 A 스트레인으로부터의 FMDV 야생형 3C 프로테아제 서열은 하기와 같다:
Figure pct00001

3C 프로테아제의 결정 구조가 해석되었으며 변이원성(mutagenic) 분석이 활성 부위 상의 정보를 제공하기 위해 수행되었다(Sweeney et al (2007) J. Virol. 81:115-124).
본 발명의 첫 번째 관점의 컨스트럭트는 캡시드 전구체 단백질 분할 활성을 감소시키는 적어도 하나 이상의 변이를 포함한다.
예를 들면 변이는 프로테아제의 활성 부위에 위치한다. 잔기 163, 46 및 84로 구성된 활성 부위에서 촉매 트라이어드(triad)가 있을 것이라고 생각된다. 변이는 이들 잔기의 하나 또는 그 이상의 결실 또는 치환을 포함한다. 변이는 캡시드 전구체 단백질 분할 활성을 감소시켜야 하지만 정지시키지는 않는다.
3C 프로테아제의 결정 구조는 펩타이드-결합 클레프트(cleft)에 맞춰 폴딩시키고 기질 인식에 기여하는 β-리본이 있다는 것을 나타내었다(상기와 같이 Sweeney et al (2007)). 예를 들면 변이는 β-리본에 위치하고 있을 것이다(잔기 138?150). 예를 들면 변이는 잔기 142에 있는 치환일 것이다. 변이는 C142V, C142A 또는 C142T 변이일 것이다. 변이는 C142T 변이일 것이다.
변이는 2배?3배 또는 1,5배?3배 정도 효소에 대한 특이성을 감소시킨다. 예를 들면 야생형 효소에 대한 특이성 상수가 990 kcat/Km이라면, 변이 효소에 대한 특이성 상수는 330?495 또는 330?660 kcat/Km 사이에 있다.
변이 프로테아제는 야생형 프로테아제의 캡시드 전구체 단백질 분할 활성의 10-50%, 20-40% 또는 약 30% 정도이다.
캡시드 전구체 단백질
캡시드 전구체 단백질은 P1이며(피코르나 바이러스에 대해), 이는 3C 프로테아제에 의해 VP0, VP3 및 VP1로 분할된다.
또한 캡시드 전구체 단백질은 P1-2A이다. 2A 프로테아제는 P2로부터 P1-2A를 분비하기 위해 C 말단에서 자체적으로 분할된다.
캡시드 전구체 단백질은 엠티 캡시드(의 일부)를 형성하기 위해 프로테아제에 의해 분할된다. 전구체 단백질은 엠티 캡시드를 형성하기 위해 필요한 단백질의 모든 타입을 포함하며, 이는 프로테아제 분할에 의해 생성될 수 있다.
벡터
두 번째 관점에서, 본 발명은 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 컨스트럭트를 포함하는 벡터를 제공한다.
예를 들면 벡터는 플라스미드 또는 바큐로 바이러스 전달 벡터, DNA 벡터 또는 바이러스 벡터이다.
벡터는 숙주 세포에서 컨스트럭트를 이동시키는 것이 가능하다.
벡터는 식물, 곤충 또는 동물 세포에서 컨스트럭트를 이동시키는 것이 가능하다.
바큐로 바이러스 발현 시스템은 바이러스 생성 및 바이러스-유사 입자를 위해 광범위하게 사용된다.
예를 들면 본 발명의 벡터는 세포(예를 들면 E. coli 세포)를 형질전환시키기 위해 사용되는 하나 또는 그 이상의 트랜스퍼 플라스미드이며, 트랜스퍼 플라스미드 벡터에서 바큐로 바이러스 셔틀 벡터가 증식된다.
본 발명의 첫 번째 관점의 컨스트럭트는 전달 벡터 DNA를 바큐로 바이러스 셔틀 벡터(bacmid)로 자리-지정 전위시킴으로써 생성된 재조합 바큐로 바이러스 DNA를 포함한다. 이 DNA는 재조합 바큐로 바이러스를 생성하기 위해 곤충 세포로 트랜스펙트된다.
본 발명의 벡터는 그 결과로 생긴 재조합 바큐로 바이러스이다.
그 밖의 다른 바이러스 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로 바이러스 벡터(렌티 바이러스 벡터를 포함)를 포함하나 이들로 한정되는 것은 아니다.
레트로 바이러스는 유전자 치료 접근법에서 흔히 사용된다. 말로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus)와 같은 재조합 레트로 바이러스는 안정한 형태(fashion)에서 숙주 게놈으로 통합(integrate)되는 능력을 가지고 있다. 그들은 숙주 게놈으로 통합을 가능케 하는 역전사 효소를 포함한다. 레트로 바이러스 벡터는 SCID-X1 시험과 같은 많은 수의 FDA-승인 임상 시험에 사용된다.
말로니 레트로 바이러스와 같은 레트로 바이러스 사용의 근본적인 문제점은 형질 도입을 위해 활성적으로 분할되는 세포를 필요로 한다는 것이다. 결과적으로 뉴런과 같은 세포는 레트로 바이러스에 의해 감염 및 형질 도입에 매우 저항성이 있다.
렌티 바이러스는 레트로 바이러스의 서브클래스이다. 이들은 비-분열 세포의 게놈에 통합하는 능력으로 인해 유전자 전달 운반체(벡터)로 최근에 조정되었다. 바이러스가 DNA를 생성하기 위해서 세포로 들어올 때 RNA의 형태에서 바이러스 게놈이 역전사되며, 그 다음에 바이러스 인테그라제 효소(integrase enzyme)에 의해 임의의 위치에서 게놈으로 삽입된다. 현재는 프로 바이러스라고 불리는 벡터는 게놈으로 남아 있으며, 분열되면 벡터가 세포의 자손에 전달된다.
안전상의 문제로 렌티 바이러스 벡터는 복제를 위해 요구되는 유전자를 운반하지 못한다. 렌티 바이러스를 생산하기 위해서, 몇몇의 플라스미드는 흔히 패키지 세포 주(packaging cell line)로 불리는 HEK 293로 트랜스펙트된다. 일반적으로 패키지 플라스미드라고 하는 하나 또는 그 이상의 플라스미드는 캡시드 및 역전사 효소와 같은 비리온(virion) 단백질을 코드화한다. 또 하나의 플라스미드는 벡터에 의해 전달되는 유전 물질을 포함한다. 이 플라스미드는 단일-가닥 RNA 바이러스 게놈을 생성하기 위해서 전사되며, ψ 서열의 존재에 의해 표시된다. 이 서열은 비리온으로 게놈을 패키지하기 위해 사용된다
렌티 바이러스와는 대조적으로 아데노 바이러스 DNA는 게놈으로 통합되지 않으며 세포 분할 동안 복제되지 않는다. 이들의 주요한 적용은 유전자 치료 및 예방 접종이다. 사람은 호흡기관, 위장 및 눈의 감염을 일으키는 아데노 바이러스와 흔히 접촉하기 때문에, 이들은 잠재적으로 위험한 결과를 지닌 급성 면역 반응을 일으킨다. 이 문제를 극복하기 위해서, 과학자들은 현재 면역력이 없는 사람에게서 아데노 바이러스를 연구하고 있다.
아데노-관련 바이러스(AAV)는 인간 및 다른 영장류의 일부를 감염시키는 작은 바이러스이다. AAV는 질병을 일으키는 것으로 알려지지는 않았으며, 그 결과 바이러스는 아주 온화한 면역 반응을 일으킨다. AAV는 분열되거나 분열되지 않는 세포 모두를 감염시킬 수 있으며, 숙주 세포의 게놈에 AAV의 게놈을 포함시킨다. 이들 특징은 AAV를 유전자 치료에 대한 바이러스 벡터를 제조하기 위한 아주 매력적인 후보자로 만든다.
숙주 세포
또한 본 발명은 본 발명의 첫 번째 관점의 컨스트럭트를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
숙주 세포는 본 발명의 두 번째 관점에 따른 벡터(바이러스 벡터와 같은)를 생성하는 것이 가능하다.
숙주 세포는 패키지 세포 또는 생산자 세포이며, 바이러스 벡터를 생성하는 것이 가능하다.
숙주 세포는 Sf9 곤충 세포이며, 본 발명의 두 번째 관점에 따른 재조합 바큐로 바이러스를 생성하는 것이 가능하다.
숙주 세포는 엠티 바이러스 캡시드를 생성하는 것이 가능하다.
숙주 세포는 박테리아, 곤충, 식물 또는 동물 세포이다.
생성 방법
또한 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 엠티 바이러스 캡시드를 생성하기 위한 방법을 제공한다:
(i) 숙주 세포에서 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 컨스트럭트를 발현시키는 단계; 및
(ⅱ) 숙주 세포에 의해 생성된 엠티 바이러스 캡시드를 포집하는 단계
본 발명의 컨스트럭트는 예를 들면 본 발명의 두 번째 관점의 벡터를 이용하여 트랜스펙션 또는 형질 도입에 의해 숙주 세포에 도입될 것이다.
엠티 바이러스 캡시드가 숙주 세포 밖에서 발현되면, 이들은 상등액으로부터 포집된다.
엠티 바이러스 캡시드가 숙주 세포 안에서 발현되면 이들은 예를 들면
(ⅰ) 숙주 세포의 용해 (예를 들면 동결-융해); 및 선택적으로
(ⅱ) 농축 (예를 들면 PEG-침전) 및/또는
(ⅲ) 정제
에 의해 포집된다.
또한 본 발명은 백신의 생성을 위한 방법을 제공하며, 이러한 방법에 의해 엠티 바이러스 캡시드를 생성하고 백신에서 엠티 바이러스 캡시드를 포함시키는 단계를 포함한다.
또한 백신은 약제학적으로 허용 가능한 희석액, 애쥬번트 또는 첨가제(excipient)를 포함한다.
바이러스
본 발명은 특정한 바이러스의 엠티 캡시드의 생성에 관한 것이다.
예를 들면 바이러스는 피코르나 바이러스일 것이다.
피코르나 바이러스 속, 종 및 혈청형의 예는 표 1에 나타내었다:
Figure pct00002

세코비리대(Secoviridae) 수퍼 패밀리로 분류되는 식물 피코르나 바이러스에는 다음과 같은 패밀리를 포함하고 있다. 즉 코모비리대(Comoviridae)(코모 바이러스 속, 파바 바이러스 속 및 네포 바이러스 속), 세퀴비리대(Sequiviridae)(세퀴 바이러스 속 및 와이카 바이러스 속) 패밀리 및 많은 수의 할당되지 않은 속(체라 바이러스, 사드와 바이러스 및 토라도 바이러스(토마토 토라도 바이러스 종 타입))을 들 수 있다.
바이러스는 이스라엘 급성 마비 바이러스; 캐시미어 벌 바이러스; 카쿠고 바이러스; 꿀벌 응애 바이러스; 낭충봉아부패병(Sacbrood Virus); 날개기형 바이러스와 같은 벌 바이러스일 것이다. 이러한 바이러스는 모두 봉(bee) 콜로니의 손실과 관련되어 있으며, 콜로니 손실의 원인을 찾아내는 진단 검사가 필요하다.
바이러스는 FMDV 또는 돼지 수포병 바이러스와 같은 동물 병원체일 것이다. 바이러스는 엔테로 바이러스 71(설사를 일으킨다); 콕사키 바이러스 B 바이러스 (당뇨병 및 심근염을 일으킨다) 또는 폴리오 바이러스와 같은 인간 병원체일 것이다.
자연적인 상태에서 인간 또는 동물 병원체로 작용하는 바이러스에 관한 엠티 캡시드의 생성은 백신 및 치료용 조성물의 생성을 위해 중요하다.
백신
본 명세서에서 사용된 '백신'이라는 용어는 제제에 관한 것이며, 피험체에게 투여시 보호적 면역 반응을 유도 또는 자극한다. 백신은 특정한 질병에 대한 유기체 면역을 제공할 수 있다.
상기 백신은 기존의 감염을 치료하기 위해 치료용으로 사용되거나; 또는 감염의 가능성을 차단하거나 감소시키기 위해서 및/또는 질병과의 접촉 가능성을 예방하거나 감소시키기 위한 예방용으로 사용된다.
백신은 하나 또는 그 이상의 면역 엔티티(vaccinating entity) 및 하나 또는 그 이상의 보조제(adjuvant), 부형제(excipient), 캐리어 및 희석제(diluent)를 선택적으로 포함한다.
상기 백신은 또한 예를 들면 면역 엔티티-유도 후천성 면역 반응 이전에 초기 보호를 자극하는 또 다른 활성제를 포함하거나 발현시키는 것이 가능하다. 활성제는 타입 I 인터페론과 같은 항바이러스제일 것이며, 또한 활성제는 과립-대식세포 집락 자극인자(GM-CSF)일 것이다.
면역 엔티티는 예를 들면 본 발명의 첫 번째 관점의 컨스트럭트, 본 발명의 두 번째 관점의 벡터 또는 본 발명의 세 번째 관점의 숙주 세포에 의해 생성되는 엠티 캡시드에 의한 것이다.
DNA 예방 접종은 단백질-기반 백신보다 장점을 지니다. 예를 들면 DNA 백신은 체내에서 항원의 내인성 발현을 초래하며, MHC 클래스 Ⅰ 및 Ⅱ 경로를 통해 면역계에 제시되는 항원 펩타이드를 허용하며, 그로 인해 CD4+ T-세포뿐만 아니라 CD8+ T-세포도 감작(prime)시킨다. 따라서 DNA 백신은 체액성 및 강한 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다. 백신으로서 플라스미드 DNA의 사용은 박테리아 플라스미드 백본 및 톨-유사 수용체(Toll-like receptor) 9(TLR9)에서 메틸화되지 않은 CpG 모티프를 통해 숙주에서 선천성 면역계를 촉발시킬 수 있다.
상기 백신은 하향-조절 MHC 및 사이토카인 분비(Moffat et al., (2005) J Virol. 79. 4382-95 and Moffat et al., (2007) J Virol. 81. 1129-39)에 의해 세포성 면역 반응을 방해하는 유전자 2B 및 2C를 코딩하는 비-구조 단백질을 지니지 않는다.
많은 상업적으로 이용 가능한 FMD 백신은 상이한 FMD 혈청형에 대한 커버(cover)를 제공하는 다면적 가치를 지니고 있다. 그런 이유로 본 발명의 백신은 수많은 면역 엔티티를 포함하며, 각각 상이한 혈청형 및/또는 주어진 혈청형 내에서 상이한 서브 타입을 겨냥한다.
질병의 치료/예방
또한 본 발명은 이러한 백신의 효과적인 양을 투여함으로써 피험체의 질병을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
'예방'이라는 용어는 질병을 축소시키는 방지(averting), 지연(delaying), 방해(impeding) 또는 저해(hindering)와 관련된 것이다. 상기 백신은 예를 들면 세포로 들어가는 감염성 바이러스의 가능성을 예방하거나 감소시킨다.
본 명세서에서 사용된 '치료'라는 용어는 질병의 증상을 개선, 치유 또는 감소 또는 질병의 진행을 감소 또는 정지시키기 위해 질병에 걸린 피험체를 돌보는 것과 관련된 것이다. 또한 바이러스에 감염된 피험체를 비-감염성인 다른 피험체로 전환시키는 처지에 관한 것이다.
피험체는 질병에 민감한 동물 또는 식물이다. 피험체는 인간, 곤충(벌과 같은), 식물, 포유동물 또는 다른 동물이다.
FMD에 대해 피험체는 발굽이 갈라진 동물이다. FMD 민감성 동물은 카멜리드(카멜, 라마, 알파카, 과나코 및 비쿠냐)뿐만 아니라 가축 중에서 소, 양, 돼지 및 염소를 포함한다. 고슴도치, 뉴트리아와 같은 일부 야생 동물 및 사슴과 같은 다른 야생의 발굽이 갈라진 동물 및 코끼리를 포함하는 동물원 사육동물 역시 FMD와 접촉할 수 있다.
투여
비-바이러스 유전자 전달 방법은 물리적(캐리어-없는 유전자 전달) 및 화학적 접근(합성 벡터-기반 유전자 전달)을 이용하는 것을 포함한다. 주사바늘, 전기천공법, 유전자총, 초음파 및 유체역학 전달을 포함하는 물리적 접근은 세포막에 침투하고 세포 내 유전자 전달을 가능케 하는 물리력(physical force)을 사용한다. 화학적 접근은 세포로 뉴클레오티드 서열을 전달하는 캐리어로서 합성 또는 자연적으로 발생하는 화합물을 이용한다.
가장 적절한 전달 방법은 타켓 세포로 뉴클레오티드 서열을 전달하기 위해 사용되는 전달 시스템에 의존한다. 예를 들면 플라스미드 투여에 대해, 플라스미드 제제는 근육 내로, 피부층 사이로 또는 상기의 조합으로 투여된다.
바이러스 벡터는 직접 분사와 같은 당분야에 공지된 방법에 의해 피험체에게 투여된다.
피코르나 바이러스 단백질의 레트로 바이러스 조절
본 발명은 피코르나 바이러스 단백질의 발현을 조절하는 레트로 바이러스 제어 엘레멘트의 용도에 관한 것이며, 또한 레트로 바이러스 제어 엘레멘트의 조절 하에서 피코르나 바이러스 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 컨스트럭트에 관한 것이다.
레트로 바이러스 제어 엘레멘트는 바이러스 내에서 Gag 및 Gag-pol 발현을 조절하는 HIV-1 프레임 이동 부위로부터 유래되는 프레임 이동 부위와 같은 레트로 바이러스 프레임 이동 부위이다.
피코르나 바이러스 단백질은 프로테아제와 같은 비-구조적 단백질이다. 피코르나 단백질은 캡시드 전구체 단백질을 분할시키는 것이 가능하다. 피코르나 바이러스 단백질은 피코르나 바이러스 또는 이의 전구체 3CD로부터의 3C 프로테아제이다.
본 발명은 실시예에 의해 상세히 기술될 것이며 이는 본 발명을 수행함에 있어서 당업자에게 유리할 것이며 본 발명의 범위를 어떤 방법으로도 제한하는 것을 의도하지 않는다.
(실시예 1) p10의 조절 하에 발현되는 벡터에서 프로테아제 3C의 변이 분석
바큐로 바이러스 전달 벡터 pOPINE5949는 FMDV 캡시드 전구체 단백질 P1을 코드화하며 연이어 FMDV 3C 프로테아제는 강한 p10 바큐로 바이러스 프로모터의 조절 하에서 짧은 스페이서 영역(2A-3B3)에 의해 연결시킨다(도 1). FMDV 게놈 나머지의 대부분은 없어졌다. 재조합 바큐로 바이러스를 생성하기 위해 사용될 때, 이론적인 결과는 성숙 캡시드 단백질 VP1-4(P1에 의해 코드화됨)를 생성하고 바이러스 캡시드로 조립하기 위해서 자가-분할되는 P1-2A-3B3-3C 융합 단백질의 발현이다. 이러한 재조합 바큐로 바이러스에 의한 감염의 실제 결과는 아주 적은 생성물이 생성된다는 것이다.
생성물의 양이 적은 것은 3C 독성의 결과이다. 이는 pOPINE5949 내의 3C 활성 부위 시스테인(Cys 163)의 점 돌연변이의 포함은 P1-2A-3B3-3C 융합 단백질의 충분한 양의 발현을 가능케 한다는 사실에 의해 증명되었다(도 2). 이는 3C 활성이 재조합 FMDV 합성의 제어 특징이라는 것을 공식적으로 증명한다.
방법
Cys 163 변이는 표준 위치 지정 돌연변이에 의해 유도되었으며, 연속하여 변이 카세트가 재-발현되었다.
웨스턴 블롯팅
단백질 샘플은 프리-캐스트 10% Tris.HCl SDS-폴리아크릴아미드 겔(BioRad)상에서 분리되었으며 세미-건조 블로터를 이용하여 이뮤노빌리언-P 막(Millipore)으로 이동되었다. 0.1% v/v Tween-20 (TBS-T), 5% w/v 분유를 포함하는 TBS를 이용하여 실온에서 한시간 동안 필터를 차단시킨다. FMDV 타입 A 바이러스에 대한 초기 기니아 피그 항체는 실온에서 1시간 동안 PBS-T에서 5% w/v 분유로 1:1000으로 희석하여 사용하였다. 연이어 TBS-T로 몇 번 세척하고 막은 HRP-컨쥬게이트된 항-기니아 피그 항체와 1시간 동안 배양되었으며 결합 항체가 BM 화학발광(Roche)에 의해 검출되었다.
(실시예 2) 3C 프로테아제 활성 및 발현이 감소되는 컨스트럭트의 생성
이 두 극단 사이의 3C 프로테아제 활성을 조정하기 위해서, 다음과 같은 두 접근법을 결합하여 사용한다.
1) 합성되는 3C 양을 감소시키는 P1 및 3C를 코드화하는 서열 사이의 3B 링커 부위에서 프레임 이동 엘레멘트의 도입; 및
2) Cys142인 3C 잔기의 변이는 따라서 3C 활성을 감소시킨다.
프레임 이동 엘레멘트는 mRNA를 해독하는 경우의 비율로 염기를 스킵하는 리보솜 내의 번역을 유도하는 서열의 섹션이다. 잘 표현된 프레임 이동 엘레멘트는 번역된 mRNAs의 약 5%에서 -1 프레임 이동을 유도하는 레트로 바이러스 HIV-1에 대해 기술되었다. 본 발명자들은 Dinman et al., (PNAS April 16, 2002 vol. 99 no. 8 5331-5336 (도 3)에 정의된 서열을 사용하였다.
벡터 pOPINE5949-FS는 이 위치에서 해독프레임을 종결시키기 위해서 이러한 방법으로 3B3 링커 부위에서 삽입된 프레임 이동 서열과 컨스트럭트되었다. 프레임 이동 서열의 삽입은 P1-2A-3B3-3C mRNA의 연속성을 방해하여 번역된 생성물은 3B3 부위에서 절단되었으며 3C는 생성되지 않았다(메세지에 존재하는 것을 인코딩하는 다운스트림 서열에도 불구하고). 하지만 이 부위에서 리보솜에 의한 -1 프레임 이동은 리보솜에 관한 mRNAs의 서브세트에 의해 P1-2A-3B3-3C 융합 단백질 발현을 초래한다(도 4). 프레임 이동 발생 빈도가 포유류 세포에서 측정된 것과 곤충세포가 동일하면, 번역 생성물은 95% P1-2A이고 5% P1-2A-3B3-3C일 것이다. 따라서 3C 프로테아제 합성은 비례적으로 낮은 수준으로 존재한다.
pOPINE5949-FS 서열을 사용하여 컨스트럭트된 재조합 바큐로 바이러스는 3C 프로테아제의 낮은 수준의 발생과 일치하는 분할 패턴을 나타냈다(자료에는 나타내지 않음). 하지만 합성의 전반적인 수준은 여전히 약간의 세포 독성을 나타냈으며, 3C의 활성은 효소 활성 역할을 하는 위치 Cys 142에서 3C 서열의 위치 지정 돌연변이에 의해 더욱 감소되었다(Sweeney et al (2007 - 상기와 같음)) (도 5).
(실시예 3) 분할된 VP1 생성물 및 FMDV 엠티 캡시드의 생성
재조합 바큐로 바이러스에서 142T의 프레임 이동 및 변이의 조합은 P1 및 3C의 원하는 수준을 생성하였으며, 엠티 FMDV 캡시드를 형성하기 위해 다른 분할 생성물과 조립되는 상당한 양의 분할된 VP1 생성물을 초래하였다.
상기 명세서 내에 언급된 모든 문헌은 본 출원에 참고문헌으로 포함된다. 본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변동은 본 발명의 범위 및 정신에 위배됨 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 관련하여 기재되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정 실시태양에 부당하게 한정되지 않아야 함이 이해되어야 한다. 실제로 바이러스학, 분자 생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기재된 방법의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 포함된다.
<110> Institute for Animal Health <120> CONSTRUCT <130> P036411KR <140> PCT/GB2010/001807 <141> 2010-09-24 <150> GB 0918375.7 <151> 2009-10-20 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 213 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 1 Ser Gly Ala Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys Met Val Met Gly Asn Thr 1 5 10 15 Lys Pro Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys Thr Val Ala Ile Cys Cys 20 25 30 Ala Thr Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu Val Pro Arg His Leu Phe 35 40 45 Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp Gly Arg Thr Met Thr Asp 50 55 60 Ser Asp Tyr Arg Val Phe Glu Phe Glu Ile Lys Val Lys Gly Gln Asp 65 70 75 80 Met Leu Ser Asp Ala Ala Leu Met Val Leu His Arg Gly Asn Arg Val 85 90 95 Arg Asp Ile Thr Lys His Phe Arg Asp Val Ala Arg Met Lys Lys Gly 100 105 110 Thr Pro Val Val Gly Val Ile Asn Asn Ala Asp Val Gly Arg Leu Ile 115 120 125 Phe Ser Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Lys Asp Ile Val Val Cys Met Asp 130 135 140 Gly Asp Thr Met Pro Gly Leu Phe Ala Tyr Lys Ala Ala Thr Lys Ala 145 150 155 160 Gly Tyr Cys Gly Gly Ala Val Leu Ala Lys Asp Gly Ala Glu Thr Phe 165 170 175 Ile Val Gly Thr His Ser Ala Gly Gly Asn Gly Val Gly Tyr Cys Ser 180 185 190 Cys Val Ser Arg Ser Met Leu Phe Lys Met Lys Ala His Ile Asp Pro 195 200 205 Glu Pro His His Glu 210 <210> 2 <211> 52 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence used to cause a frameshift at the P1-3C junction <400> 2 uuuuuuaggg aagaucuggc cuucccacaa ggggaggcca gggaauuuuc uu 52 <210> 3 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Introduction of HIV-1 frameshift sequence into FMDV sequence <400> 3 ctacaccgcg ccacaccgcg tgttggcaac agtgtacaac gggacgagca agtactccgc 60 aggtggtacg ggcagacggg gcgacctagg gcctctcgcg gcgagggtcg ccgctcagct 120 tcctgcttct ttcaactttg gtgcaattca agccacgacc atccacgagc tcctcgtgcg 180 catgaagcgt gccgaactct actgccccag accactgttg gcagtggagg tgtcgtctca 240 agacagacac aaacagaaga tcattgcacc tgcaaaacaa cttttgaact tcgatttgct 300 caagttggca ggagacgttg agtccaaccc cgggcccagc ggccgcggac cttttttagg 360 gaagatctgg ccttcctaca agggaaggcc agggaatttt cttacgaggg accggtgaag 420 aagcctgtcg ctttgaaagt gaaagctaag aacttgattg tcactgagag tggagcccca 480 ccgaccgact tgcaaaagat ggtcatgggc aacaccaagc ctgttgagct catcctcgac 540 gggaagacgg tggccatttg ttgtgctacc ggagtgtttg gcactgcgta cctcgtgcct 600 cgtcatcttt ttgcagaaaa atatgacaag atcatgctgg acggcagagc catgacagac 660 660 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Ala Gly Gly Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Arg 1 5 10 15 Val Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Gln Ala 20 25 30 Thr Thr Ile His Glu Leu Leu Val Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr 35 40 45 Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val Glu Val Ser Ser Gln Asp Arg His 50 55 60 Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala Lys Gln Leu Leu Asn Phe Asp Leu 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro Ser Gly Arg 85 90 95 Gly Pro Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser Tyr Lys Gly Arg Pro Gly 100 105 110 Asn Phe Leu Thr Arg Asp Arg 115 <210> 5 <211> 660 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Introduction of HIV-1 frameshift sequence into FMDV sequence <400> 5 ctacaccgcg ccacaccgcg tgttggcaac agtgtacaac gggacgagca agtactccgc 60 aggtggtacg ggcagacggg gcgacctagg gcctctcgcg gcgagggtcg ccgctcagct 120 tcctgcttct ttcaactttg gtgcaattca agccacgacc atccacgagc tcctcgtgcg 180 catgaagcgt gccgaactct actgccccag accactgttg gcagtggagg tgtcgtctca 240 agacagacac aaacagaaga tcattgcacc tgcaaaacaa cttttgaact tcgatttgct 300 caagttggca ggagacgttg agtccaaccc cgggcccagc ggccgcggac cttttttagg 360 gaagatctgg ccttcctaca agggaaggcc agggaatttt cttacgaggg accggtgaag 420 aagcctgtcg ctttgaaagt gaaagctaag aacttgattg tcactgagag tggagcccca 480 ccgaccgact tgcaaaagat ggtcatgggc aacaccaagc ctgttgagct catcctcgac 540 gggaagacgg tggccatttg ttgtgctacc ggagtgtttg gcactgcgta cctcgtgcct 600 cgtcatcttt ttgcagaaaa atatgacaag atcatgctgg acggcagagc catgacagac 660 660 <210> 6 <211> 102 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 6 Phe Arg Glu Asp Leu Ala Phe Leu Gln Gly Lys Ala Arg Glu Phe Ser 1 5 10 15 Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Lys Ala Lys 20 25 30 Asn Leu Ile Val Thr Glu Ser Gly Ala Pro Pro Thr Asp Leu Gln Lys 35 40 45 Met Val Met Gly Asn Thr Lys Pro Val Glu Leu Ile Leu Asp Gly Lys 50 55 60 Thr Val Ala Ile Cys Cys Ala Thr Gly Val Phe Gly Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Val Pro Arg His Leu Phe Ala Glu Lys Tyr Asp Lys Ile Met Leu Asp 85 90 95 Gly Arg Ala Met Thr Asp 100

Claims (26)

  1. (i) 캡시드 전구체 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열;
    (ⅱ) 캡시드 전구체 단백질을 분할(cleavage)시키는 것이 가능한 프로테아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열; 및
    (ⅲ) 프로테아제의 발현을 조절하는 제어 엘레멘트
    를 포함하는 숙주 세포에서 발현될 때 엠티 바이러스 캡시드의 생성이 가능한 컨스트럭트에 있어서,
    상기 컨스트럭트는 숙주 세포 내에 존재할 때 제어 엘레멘트는 캡시드 전구체 단백질을 분할시키는데 충분한 수준이나, 숙주 세포 내에 유의미한 독성을 유도하기는 불충분한 프로테아제를 발현시킴을 특징으로 하는 컨스트럭트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 제어 엘레멘트는 레트로바이러스로부터 유래됨을 특징으로 하는 컨스트럭트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 제어 엘레멘트는 레트로바이러스 프레임 이동 사이트임을 특징으로 하는 컨스트럭트.

  4. 제 3항에 있어서, 제어 엘레멘트는 HIV-1 프레임 이동 사이트임을 특징으로 하는 컨스트럭트.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 프레임 이동 사이트는 컨스트럭트가 번역될 때 캡시드 전구체 단백질을 코드화한 뉴클레오티드 서열과 프로테아제를 코드화한 뉴클레오티드 서열 사이에 위치하며, 만약 리보솜에서 프레임 이동이 일어나지 않는다면 캡시드 전구체 단백질을 포함하나 프로테아제를 포함하지 않는 절단된(truncated) 생성물을 생성하고, 만약 리보솜에서 프레임 이동이 일어난다면 캡시드 전구체 단백질과 프로테아제는 모두 번역됨을 특징으로 하는 컨스트럭트.
  6. 제 3항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어 엘레멘트는 번역된 mRNAs의 약 5% 내에서 프레임 이동을 초래함을 특징으로 하는 컨스트럭트.
  7. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 프로테아제는 캡시드 전구체 단백질 분할 활성을 감소시키는 적어도 하나 이상의 변이를 포함함을 특징으로 하는 컨스트럭트.
  8. 제 7항에 있어서, 변이 프로테아제는 야생형 프로테아제보다 약 3배정도 낮은 캡시드 전구체 단백질 분할 활성을 지님을 특징으로 하는 컨스트럭트.
  9. 상기 어느 한 항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 숙주 세포에서 발현될 때 피코르나(picorna) 바이러스 캡시드의 생성이 가능함을 특징으로 하는 컨스트럭트.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 숙주 세포에서 발현될 때 엠티 구제역 바이러스(FMDV) 캡시드의 생성이 가능함을 특징으로 하는 컨스트럭트.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 캡시드 전구체 단백질은 P1이고, 프로테아제는 3C임을 특징으로 하는 컨스트럭트.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 Cys142에서 변이를 지니는 3C 프로테아제 변이를 포함함을 특징으로 하는 컨스트럭트.
  13. 상기 어느 한 항에 따른 컨스트럭트를 포함하는 벡터.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 벡터는 바큐로 바이러스 전달 벡터; DNA 벡터, 플라스미드 또는 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 벡터.
  15. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 컨스트럭트를 포함하는 숙주 세포.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 숙주 세포는 제 13항 또는 제 14항에 따른 벡터의 생성이 가능함을 특징으로 하는 숙주 세포.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 숙주 세포는 엠티 바이러스 벡터의 생성이 가능함을 특징으로 하는 숙주 세포.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서, 상기 숙주 세포는 곤충 세포 또는 포유류 세포임을 특징으로 하는 숙주 세포.
  19. (i) 숙주 세포에서 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 컨스트럭트를 발현시키는 단계; 및
    (ⅱ) 숙주 세포에 의해 생성된 엠티 바이러스 캡시드를 포집하는 단계
    를 포함하는 엠티 바이러스 캡시드의 생성 방법.
  20. 제 19항에 따른 방법에 의한 엠티 바이러스 캡시드를 생성하는 단계를 포함하고, 백신 내에 엠티 바이러스 캡시드가 통합되는 단계를 포함하는 백신의 제조 방법.
  21. 엠티 캡시드는 체내에서 생성되며, 피험체에서 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 컨스트럭트를 발현시키는 단계를 포함하는 피험체의 질병을 치료 및/또는 예방 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 컨스트럭트는 DNA 예방 접종 또는 바이러스 벡터를 이용하여 피험체에게 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  23. 질병의 예방 및/또는 치료에 사용되기 위한 제 1항 내지 제 12항에 따른 컨스트럭트 및 제 13항 또는 제 14항에 따른 벡터.
  24. 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조시 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 컨스트럭트 또는 제 13항 또는 제 14항에 따른 벡터의 용도.
  25. 피코르나 바이러스 단백질의 발현을 조절하는 레트로 바이러스 제어 엘러멘트의 용도.
  26. 레트로 바이러스 제어 엘러멘트 조절 하에서 피코르나 바이러스 단백질을 코드화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 컨스트럭트.
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201111183D0 (en) 2011-06-30 2011-08-17 Animal Health Inst Peptide
MX363409B (es) * 2011-11-03 2019-03-20 Sentinext Therapeutics Sdn Bhd Antigenos y vacunas dirigidos contra enterovirus hunanos.
NZ705488A (en) 2012-09-05 2018-05-25 Medicago Inc Picornavirus-like particle production in plants
US10294277B2 (en) 2013-03-26 2019-05-21 The Pirbright Institute Stabilised FMDV capsids
KR20170068410A (ko) * 2014-04-29 2017-06-19 내셔날 헬스 리서치 인스티튜트 엔테로바이러스 감염증에 대항하는 아데노바이러스 벡터-기반 백신
CA2987159A1 (en) * 2015-06-15 2016-12-22 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) foot and mouth disease virus (fmdv) vaccine
US9975926B2 (en) 2015-12-08 2018-05-22 The United States of America, as Represented by the Secretary of Homeland Security Methods of making and using vaccines utilizing minicircle DNA expression vectors for production of foot-and-mouth-disease virus proteins and virus-like particles
US10435695B2 (en) 2016-09-08 2019-10-08 The Government of the United States of America, as represented by the Secretary of Homeland Security Fusion protein comprising Gaussia luciferase, translation interrupter sequence, and interferon amino acid sequences
US10385319B2 (en) 2016-09-08 2019-08-20 The Governement of the United States of America, as represented by the Secretary of Homeland Security Modified foot-and-mouth disease virus 3C proteases, compositions and methods thereof
US10308927B2 (en) * 2017-01-17 2019-06-04 The United States of America, as Represented by the Secretary of Homeland Security Processing of a modified foot-and-mouth disease virus P1 polypeptide by an alternative protease
WO2019092027A1 (en) * 2017-11-09 2019-05-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Sapelovirus immunogenic compositions and uses thereof
GB201812474D0 (en) 2018-07-31 2018-09-12 Autolus Ltd Nucleic acid construct
JPWO2020067027A1 (ja) * 2018-09-28 2021-08-30 一般財団法人阪大微生物病研究会 Ｖｌｐ発現ｃｈｏ細胞株の構築
WO2022084426A1 (en) * 2020-10-22 2022-04-28 Intervet International B.V. Baculovirus expression vector
US20230390380A1 (en) 2020-10-22 2023-12-07 Intervet Inc. Baculovirus expression vector
WO2023020738A1 (en) 2021-08-20 2023-02-23 The Pirbright Institute Fmdv virus-like particle with double stabilizing mutation
IL310905A (en) 2021-08-20 2024-04-01 Intervet Int Bv A method for producing a virus-like particle for foot-and-mouth disease virus
CN117897170A (zh) 2021-08-20 2024-04-16 英特维特国际股份有限公司 具有稳定化突变的fmdv病毒样颗粒
IL310903A (en) 2021-08-20 2024-04-01 Intervet Int Bv A method for producing a virus-like particle for foot-and-mouth disease virus

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19712899C1 (de) 1997-03-27 1998-12-10 Christian Dr Probst Verfahren zur Herstellung nichtinfektiöser rekombinanter Picornavirus-Partikel
RU2143921C1 (ru) * 1999-04-21 2000-01-10 Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных Вакцина против ящура типа а и способ ее изготовления
FR2810888B1 (fr) 2000-06-29 2004-07-30 Merial Sas Vaccin contre la fievre aphteuse
ES2307345B1 (es) * 2004-01-21 2009-11-13 Consejo Sup. Investig. Cientificas Capsidas vacias quimericas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones.
EP1632247A1 (en) 2004-09-03 2006-03-08 Consejo Superior De Investigaciones Cientificas Nucleic acid sequences encoding FMDV proteins capable of associating into a virus-like particle
NZ542111A (en) 2005-08-30 2008-04-30 Otago Innovation Ltd Novel assay

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